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Identifizierung und Charakterisierung von IFNJ regulierten
Effektormolekülen (mGBP7, SSPII) in der antimikrobiellen
Immunantwort
Inaugural Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Dipl. Biol.
Cornelia Beuter-Gunia
aus Herdecke
Düsseldorf 2008
aus dem Institut für
Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referent:
Prof. Dr. Klaus Pfeffer
Koreferent:
Prof. Dr. Heinz Mehlhorn
Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2008
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I
Abbildungsverzeichnis
V
Tabellenverzeichnis
VII
Abkürzungsverzeichnis
VIII
1
Einleitung ____________________________________________________________ 1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.2
1.2.1
1.2.2
1.3
Mechanismen des angeborenen Immunsystem ________________________________ 2
Pathogenerkennung über konservierte Rezeptoren ____________________________________ 2
Toll-like Rezeptoren ___________________________________________________________ 4
Zytokine ________________________________________________________________ 9
Interferon J __________________________________________________________________ 9
Tumor Nekrose Faktor_________________________________________________________ 13
Antimikrobielle und antivirale Effektorsysteme ______________________________ 15
1.3.1
Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffintermediate _____________________________________
Antimikrobielle Peptide (AMPs) _________________________________________________
1.3.2
Die Familie der Interferon induzierten GTPasen_____________________________________
1.3.3
Mx Proteine ____________________________________________________________
1.3.3.1
p47 GTPasen, IRGs ______________________________________________________
1.3.3.2
p65 Guanylat-bindende Proteine ____________________________________________
1.3.3.3
1.4
2
15
16
19
21
22
24
Zielsetzung der Arbeit ___________________________________________________ 26
Material und Methoden ________________________________________________ 27
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
Bezugsquellennachweis __________________________________________________ 27
Chemikalien_________________________________________________________________
Antikörper/-seren_____________________________________________________________
Enzyme ____________________________________________________________________
Radiochemikalien ____________________________________________________________
Reagenzien und Verbrauchsmaterial ______________________________________________
27
29
29
30
30
2.2
Geräte_________________________________________________________________ 30
2.3
Medien und Puffer ______________________________________________________ 31
2.3.1
2.3.2
2.3.3
Stammlösungen und Puffer _____________________________________________________ 31
Zellkulturmedien _____________________________________________________________ 35
Medien für die Bakterienkultur __________________________________________________ 35
2.4
Antibiotika_____________________________________________________________ 36
2.5
Bakterien-, Toxoplasmenstämme und Zelllinien ______________________________ 36
2.5.1
2.5.2
Bakterien- und Toxoplasmenstämme _____________________________________________ 36
Zellen/Zelllinien _____________________________________________________________ 36
2.6
Versuchstiere___________________________________________________________ 37
2.7
Primer ________________________________________________________________ 37
2.8
Plasmidvektoren ________________________________________________________ 41
2.8.1
2.8.2
2.9
2.9.1
2.9.2
2.9.3
Ausgangsvektoren ____________________________________________________________ 41
Erstellte Plasmide ____________________________________________________________ 42
Tierversuche ___________________________________________________________ 42
Superovulation_______________________________________________________________ 42
Generierung chimärer Mäuse ___________________________________________________ 42
Infektion von Mäusen mit Listeria monocytogenes___________________________________ 43
Inhaltsverzeichnis
2.9.4
2.10
Organentnahme ______________________________________________________________ 43
Zellbiologische Methoden_________________________________________________ 43
2.10.1
2.10.2
2.10.3
2.10.4
2.10.5
2.10.6
2.10.7
2.10.8
2.10.9
2.10.10
2.10.11
2.11
Isolierung von Plasmid-DNS _________________________________________________
Isolierung von chromosomaler DNS aus 96-well Platten ____________________________
Isolierung chromosomaler DNS aus Zellen oder Schwanzbiopsien ____________________
Agarosegelelektrophorese____________________________________________________
Restriktionsverdau von DNS _________________________________________________
Dephosphorylierung von DNS ________________________________________________
Ligation von DNS-Molekülen ________________________________________________
Transformation von E. coli Bakterien___________________________________________
Southern Blot Analyse ______________________________________________________
Isolierung gesamtzellulärer RNS ______________________________________________
Northernblot-Analyse _______________________________________________________
cDNS Synthese aus gesamtzellulärer RNS _______________________________________
Amplifikation von DNS-Molekülen mittels PCR __________________________________
SMART-RACE-PCR _______________________________________________________
Real-time PCR ____________________________________________________________
Mutagenese-PCR __________________________________________________________
47
48
48
48
49
49
50
50
50
52
52
53
53
54
54
55
Extraktion von Proteinen aus Organen __________________________________________
Bestimmung der Proteinkonzentration __________________________________________
Western Blot Analyse _______________________________________________________
Immunpräzipitation_________________________________________________________
56
56
56
57
Computerprogramme____________________________________________________ 57
2.13.1
2.13.2
2.13.3
3
43
44
45
45
45
45
46
46
47
47
47
Protein-biochemische Methoden ___________________________________________ 56
2.12.1
2.12.2
2.12.3
2.12.4
2.13
Kultivierung embryonaler Stammzellen und Fibroblasten ___________________________
Kultivierung von Zelllinien___________________________________________________
Kultivierung von Knochenmarksmakrophagen (BMDM) ___________________________
Transfektion von 293T Zellen mittels Kalzium-Phosphat ___________________________
Transfektion von 264.7 RAW Makrophagen durch Elektroporation ___________________
Lentivirale Transduktion zur Herstellung stabiler Zelllinien _________________________
Stimulation von Zellen ______________________________________________________
Immunfluoreszenz-Färbung __________________________________________________
In vitro Infektion mit Listeria monocytogenes ____________________________________
Kultivierung von avirulenten Toxoplasmen (ME49) _______________________________
In vitro Infektion mit Toxoplasma gondii ________________________________________
Molekularbiologische Arbeitsmethoden _____________________________________ 47
2.11.1
2.11.2
2.11.3
2.11.4
2.11.5
2.11.6
2.11.7
2.11.8
2.11.9
2.11.10
2.11.11
2.11.12
2.11.13
2.11.14
2.11.15
2.11.16
2.12
II
Klonierungsstrategien _______________________________________________________ 57
Sequenzvergleiche _________________________________________________________ 57
Real-time PCR ____________________________________________________________ 57
Ergebnisse ___________________________________________________________ 59
3.1
3.1.1
3.1.2
mGBP7________________________________________________________________ 59
Einführung__________________________________________________________________
Etablierung der Real-time PCR für die Genfamilie der murinen 65 kDa Guanylat-bindenden
Proteine ____________________________________________________________________
Induzierbarkeit der mGBP Familie in Ana-1 Makrophagen ____________________________
3.1.3
Regulation von mGBP7 durch den Transkriptionsfaktor IRF-1 _________________________
3.1.4
IRF-1-Abhängigkeit der mGBP Expression in embryonalen Fibroblasten ____________
3.1.4.1
IRF-1-Abhängigkeit der mGBP Expression in Knochenmarksmakrophagen __________
3.1.4.2
In vivo Expression der 65kDa GTPasen ___________________________________________
3.1.5
Infektion mit Listeria monocytogenes ________________________________________
3.1.5.1
mGBP7 Expression nach Infektion mit Toxoplasma gondii _______________________
3.1.5.2
Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 ____________________________________________
3.1.6
Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach Infektion mit L. monocytogenes in vitro ___
3.1.6.1
Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach Infektion mit Toxoplasma gondii in vitro __
3.1.6.2
Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach Phagozytose von Latexkugeln___________
3.1.6.3
Lokalisation von mGBP7 Mutanten__________________________________________
3.1.6.4
Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 Mutanten nach Infektion mit Toxoplasma gondii
3.1.6.5
in vitro ________________________________________________________________
59
59
61
64
64
66
69
69
71
72
73
74
77
78
80
Inhaltsverzeichnis
3.1.7
3.2
III
Vorarbeiten zur Erstellung einer mGBP7 defizienten Mauslinie ________________________ 82
AW112010-SSPII _______________________________________________________ 84
3.2.1
In silico Charakterisierung von AW112010-SSPII ___________________________________ 84
Protein-Vorhersagen _____________________________________________________ 85
3.2.1.1
SSPII in anderen Spezies __________________________________________________ 88
3.2.1.2
Expressionsanalyse von SSPII___________________________________________________ 89
3.2.2
Expression in Ana-1 und Knochenmarks-Makrophagen __________________________ 89
3.2.2.1
Expression von SSPII in der Infektion ________________________________________ 92
3.2.2.2
Nachweis der Sekretion in vitro _________________________________________________ 97
3.2.3
Subzelluläre Lokalisation von SSPII ______________________________________________ 98
3.2.4
Gene Targeting: Inaktivierung des SSPII Gens der Maus _____________________________ 102
3.2.5
4
Diskussion__________________________________________________________ 105
4.1
mGBP7 in der Infektionsabwehr__________________________________________ 105
4.1.1
Expression der murinen 65 kDa GTPasen in vitro und in vivo _________________________
Expression von mGBP7 in Ana-1 Makrophagen und in vivo _____________________
4.1.1.1
Expressionsanalyse von mGBP7 in Wt und IRF-1 defizienten Fibroblasten und BMDM ____
4.1.2
Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 ___________________________________________
4.1.3
Lokalisation von mGBP7 in infizierten Zellen ________________________________
4.1.3.1
Veränderte Lokalisation von mGBP7 G-Domänen-Mutanten _____________________
4.1.3.2
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.3
105
107
108
110
111
113
SSPII in der Infektabwehr _______________________________________________ 115
SSPII: Identifizierung und Charakterisierung als potentiell sekretorisches Protein _________
Subzelluläre Lokalisation von SSPII _____________________________________________
SSPII Expression in vitro _____________________________________________________
SSPII in der Infektionsabwehr__________________________________________________
115
116
117
118
Ausblick ______________________________________________________________ 121
5
Zusammenfassung ___________________________________________________ 123
6
Anhang ____________________________________________________________ 127
7
Literaturverzeichnis __________________________________________________ 129
8
Tabellarischer Lebenslauf _____________________________________________ 147
9
Danksagung ________________________________________________________ 149
Abbildungsverzeichnis
V
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: MyD88 abhängiger und MyD88 unabhängige TLR Signalweg.
7
Abb. 1.2: JAK-STAT Signalweg des IFNJ Rezeptors.
11
Abb. 1.3: TNF/TNFR1 Signalweg.
14
Abb. 1.4: ROI und RNI Produktion durch die Enzyme Phox und iNOS.
16
Abb. 1.5: Die Domänenstruktur der humanen Dynamin Superfamilie.
20
Abb. 1.6: Die GTP-Bindungs-Motive der G-Domäne.
20
Abb. 1.7: Phylogenetischer Baum der murinen GBP-Familie.
24
Abb. 3.1: Test der Primer- und Sonden-Kombination für mGBP9 mittels real-time PCR.
61
Abb. 3.2: Induktion der murinen GBPs in Ana-1 Makrophagen durch IFNJ.
62
Abb. 3.3: Real-time Analyse der Expression der murinen GBPs 1 bis 10 in Ana-1 Makrophagen
nach 16 h Stimulation mit verschiedenen Zytokinen und TLR-Liganden.
63
Abb. 3.4: Expression von mGBP7 und mGBP2 in mEF von IRF-1 ko und Wt.
65
Abb. 3.5: Westernblotanalyse von mGBP2 und mGBP7 in Wt und IRF-1 ko mEF.
65
Abb. 3.6: Real-time Analyse von cDNS generiert aus stimulierten BMDM von Wt und IRF-1 ko
67
Makrophagen.
Abb. 3.7: Westernblotanalyse von Proteinlysaten aus BMDM von Wt und IRF-1 ko Mäusen. 68
Abb. 3.8: Expression der mGBP-Familie in a) Milz und b) Leber von Listerien infizierten
C57BL/6 Mäusen.
70
Abb. 3.9: Expression des mGBP7-Proteins in der Milz und in der Leber nach Listerien-Infektion.
71
Abb. 3.10: Proteinexpression von mGBP7 in Toxoplasma gondii infizierten C57BL/6 Mäusen in
71
der Milz und der Lunge.
Abb. 3.11: Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 in Makrophagen (RAW 264.7) im
Konfokalmikroskop.
73
Abb. 3.12: Lokalisation von mGBP7 in der Infektion mit Listeria monocytogenes.
74
Abb. 3.13: Kolokalisation von mGBP7 mit der PV von T. gondii in RAW 264.7 Makrophagen.
75
Abb. 3.14: Lokalisation von GFP-mGBP7 Fusionsprotein mit Toxoplasma gondii in der stabil
76
transduzierten murinen Fibroblasten-Zelllinie 3T3.
Abb. 3.15: Lokalisation von eGFP-mGBP7 Fusionsprotein und phagozytierten Latexkugeln.
77
Abb. 3.16: Lokalisation der mGBP7 Mutanten in transfizierten RAW-Makrophagen und Einfluß
von IFNJ auf die subzelluläre Distribution.
79
Abb. 3.17: Lokalisation der mGBP7 Mutanten R48-A, K51-A, S52-N, T75-A, E99-A und D182-R
in RAW 264.7 Makrophagen nach Infektion mit T. gondii (ME49).
81
Abb. 3.18: Schematische Darstellung der Rekombinationsstrategie des mGBP7 Lokus.
83
Abbildungsverzeichnis
VI
Abb. 3.19: Sondentest der 5´flankierenden Southernsonde.
83
Abb. 3.20: Nachweis und Größenbestimmung der AW112010 mRNS in Ana-1 Makrophagen im
Northernblot.
84
Abb. 3.21: RACE-PCR Ergebnis von AW112010 oder SSPII.
85
Abb. 3.22: Signalpeptid-Vorhersage mit dem Programm SignalP 3.0.
87
Abb. 3.23: Vergleich der Nukleotidsequenzen von SSPII (Maus) und XM_579948 (Ratte)
88
Abb. 3.24: Vergleich der Proteinsequenz von SSPII (Maus) und Ratte XP_579948.
89
Abb. 3.25: Northernblot-Analyse von SSPII mRNS und E-Aktin in Ana-1 Makrophagen.
90
Abb. 3.26: SSPII-Expression in IFNJ stimulierten Makrophagen.
90
Abb. 3.27: SSPII Induktion durch verschiedene Stimuli (16h) in Knochenmarksmakrophagen
91
aus C57BL/6 Mäusen.
Abb. 3.28: SSPII Induktion durch verschiedene Stimulationen (16h) in Knochenmarksmakrophagen aus IFNJR-/- Mäusen.
92
Abb. 3.29: Northernblot-Analyse, SSPII mRNS in Milz und Leber nach Infektion mit Listeria
monocytogenes.
93
Abb. 3.30: Transkriptionsmenge von a) SSPII und b) iNOS induziert durch Listerien-Infektion in
verschiedenen Organen.
94
Abb. 3.31: Immunpräzipitation von SSPII Protein verschiedener Organlysate nach ListerienInfektion.
95
Abb. 3.32: Expression von SSPII, iNOS und IFNJ Transkripten (real-time-PCR) in Milz und Lunge
95
von Toxoplasma gondii infizierten C57BL/6 Mäusen.
Abb. 3.33: mRNS Expression von SSPII, iNOS, IFNJ und IL-12p40 während der Trypanosoma
96
cruzi Infektion in der Milz von C57BL/6 Mäusen.
Abb. 3.34: Sekretionsnachweis von SSPII-6xHis Fusionsprotein.
97
Abb. 3.35: Subzelluläre Lokalisation von SSPII-DsRed Fusionsproteinen in 264.7 RAWMakrophagen.
98
Abb. 3.36: SSPII Kolokalisation mit subzellulären Kompartimenten.
100
Abb. 3.37: SSPII-Lokalisation in Toxoplasma gondii infizierten RAW Makrophagen.
101
Abb. 3.38: Schematische Darstellung der Rekombinationsstrategie des SSPII Lokus.
102
Abb. 3.39: Southernblot-Analyse zum Nachweis der homologen Rekombination im SSPII Lokus
und der einmaligen Integration der Neomycin Resistenz Kassette.
103
Abb. 3.40: Southernblot-Analyse zur Typisierung der Keimbahnmaus.
104
Abb. 6.1: Expression von SSPII in lymphatischen Zellen und Mikroglia.
127
Tabellenverzeichnis
VII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1.1: Toll-like Rezeptoren und bekannte Liganden.
5
Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien.
35
Tabelle 2.2: Zusammensetzung des Bakterienkulturmediums.
35
Tabelle 2.3: Verwendete Antibiotika.
36
Tabelle 2.4: Verwendete Bakterien- und Toxoplasmenstämme.
36
Tabelle 2.5: Verwendete Zelllinien.
36
Tabelle 2.6: Oligo-Nukleotide zur Klonierung von DsRed und eGFP Fusionskonstrukten.
37
Tabelle 2.7: Oligo-Nukleotide zur Klonierung von pWPXL-GFP Fusionskonstrukten.
38
Tabelle 2.8: Mutageneseprimer für Klonierung in pDsRed-Monomer-N1 Vektoren.
38
Tabelle 2.9: Oligo-Nukleotide zur Klonierung des mGBP7 Rekombinationsvektors, sowie die
Sonden zur Detektion positiver Klone.
39
Tabelle 2.10: Oligo-Nukleotide zur Klonierung des SSPII Rekombinationsvektors, sowie die
Sonden zur Detektion positiver Klone.
39
Tabelle 2.11: Sequenzen von Oligo-Nukleotiden und Sonden für real-time RT-PCR.
40
Tabelle 2.12: Verwendete Ausgangsvektoren.
41
Tabelle 2.13: Im Rahmen dieser Arbeit hergestellte Plasmide.
42
Tabelle 3.1: Voranalyse der AW112010-Protein-Sequenz.
86
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest.
AS
ATP
bp
Bq
BAC
BMDM
BSA
cDNS
d
DEPC
DMSO
DNS
dNTP
EDTA
EF-Zellen
EP
ES-Zellen
EtOH
FKS
GTP
h
H 2 O bidest
IFN
IL
KA
kb
ko
kDa
LA
LIF
LPS
LTA
M
min
MCS
mRNS
ORF
p.i.
PBS
PCR
PFA
poly (I:C)
RNS
RT
RT-PCR
Aqua bidestillatum, zweifach destilliertes Wasser
Aminosäure
Adenosintriphosphat
Basenpaar(e)
Bequerel
bacterial artificial chromosome
aus Knochenmarkszellen gereifte Makrophagen
Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
DNS-Kopie der mRNS (komplementäre DNS)
Tag
Diethylpyrocarbonat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
DesoxyriboNukleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Ethylendiamintetraessigsäure
embryonale Fibroblasten
Elektroporation
embryonale Stammzellen
Ethanol
Fötales Kälberserum
Guanosintriphosphat
Stunde(n)
zweifach destilliertes oder Milli-Q- (Millipore) Wasser
Interferon
Interleukin
kurzer Arm
Kilobasenpaare
knock-out
Kilodalton
langer Arm
leukemia inhibitory factor
Lipopolysaccharid
Lipoteichonsäure
Molar
Minute(n)
multiple cloning site
Boten-RNS
offener Leserahmen
nach Infektion (post infection)
Phosphat-gepufferte Saline
Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
Paraformaldehyd
Polyinosin-polycytidin-Säure
Ribonukleinsäure
Raumtemperatur
reverse Transkription und PCR
VIII
Abkürzungsverzeichnis
SDS
SSC
TNF
ü/N
ÜS
UpM
UTR
WB
v/v
w/v
w/w
Wt
Sodium-Dodecylsulfat
Sodiumchlorid-Sodiumcitrat Lösung
Tumor Nekrose Faktor
über Nacht
Überstand
Umdrehungen pro Minute
untranslatierte Region
Westernblot
Volumen/Volumen
Gewicht/Volumen
Gewicht/Gewicht
Wildtyp
IX
Einleitung
1
1 Einleitung
Das Immunsystem der Säugetiere hat sich im Laufe der Evolution zu einem komplexen System
entwickelt, um eindringende Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten wirkungsvoll
zu bekämpfen. Zunächst schützt sich der intakte Körper durch anatomische Barrieren, wie Haut
(Epidermis/Dermis) und Mucosa vor dem Eindringen fremder Organismen. Ein niedriger pH Wert
der Haut verhindert die Ansiedlung von Pathogenen; sezernierte Proteine wie Defensine und
Lysozyme stellen vor allem in den Schleimhäuten erste Effektormechanismen gegen fremde
Erreger dar. Gelangen dennoch Pathogene durch z.B. Verletzungen in den Körper, so steht diesen
Pathogenen eine Reihe von Abwehrmechanismen gegenüber. Hierbei unterscheidet man
zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem.
Während die angeborene Immunität in der frühen Phase einer Infektion zum Tragen kommt,
greift die adaptive oder erlangte Immunität erst in der späten Phase einer Infektion ein. Das
adaptive
Immunsystem
(T-
und
B-Zellen)
ist
durch
die
hohe
Spezifität
gegen
Pathogenbestandteile (Antigene) charakterisiert, welche sie durch ungerichtete Umordnung der
Rezeptorgene in Lymphozyten (somatische Rekombination) und, nach Kontakt mit dem
Pathogen, gerichtete klonale Expansion dieser Zellen erreicht. Ein weiteres Merkmal der
adaptiven Immunität ist der Aufbau eines immunologischen Gedächtnisses, welches bei einer
Zweitinfektion mit demselben Pathogen schneller diesem entgegenwirken kann („memory“ Tund B-Zellen). Da der Aufbau der primären adaptiven Immunität mehrere Tage benötigt, muss
der Körper in der Lage sein, die Ausbreitung des Erregers zu verhindern oder zumindest zu
verlangsamen.
In der frühen Phase einer Infektion kommt daher zunächst das angeborene Immunsystem zum
Tragen. Hierzu gehört das Komplementsystem, welches aus einer hohen Anzahl verschiedener
löslicher Proteine besteht und die Aufgaben hat, Pathogene über die Komplementkaskade direkt
zu lysieren oder für Phagozyten zu kennzeichnen (Opsonisierung). Das Komplementsystem
übernimmt auch die wichtige Rolle inflammatorische Zellen zum Pathogen zu rekrutieren
(Chemoattraktion). Neben den löslichen Komponenten haben die zellulären Komponenten eine
zentrale Funktion in der angeborenen Immunität. Diese Zellen sind in der Lage, über konservierte
Rezeptoren fremde von körpereigenen Bestandteilen zu unterscheiden. Zu diesen Zellen gehören
vor allem die Phagozyten, natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und weitere inflammatorische
Zellen. Diese können bereits vor Aufbau einer adaptiven Immunabwehr potente antimikrobielle
Effektormechanismen aufbauen und tragen somit zusätzlich dazu bei, Erreger zu eliminieren oder
die Infektionsausbreitung zu verzögern. Phagozyten sind außerdem die entscheidenden
Vermittler zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Diese Vermittlung wird
über lösliche Proteine, den Zytokinen und Chemokinen, gesteuert, welche durch exakt geregelte
transkriptionelle und posttranskriptionelle Mechanismen sezerniert werden, und als Signalstoffe
Einleitung
2
die Immunantworten akkurat regeln können. Somit hat sich im Laufe der Evolution durch
ständige Anpassung an das sich ändernde Erregerrepertoire das Immunsystem der Säugetiere zu
einem hoch komplexen System entwickelt. Das Studium dieser, durch Interaktionen von Wirt
und Pathogen entstandenen, genetischen und molekularen Bestandteile des Immunsystems soll zu
mehr Verständnis dieser Mechanismen führen.
1.1 Mechanismen des angeborenen Immunsystem
1.1.1 Pathogenerkennung über konservierte Rezeptoren
Die angeborene Immunität ist nicht vollständig unspezifisch, sondern kann zuverlässig zwischen
„Selbst“ und einer Vielzahl von Pathogenen unterscheiden (Hoffmann et al., 1999; Janeway, Jr.
and Medzhitov, 2002). Die Oberflächen von Mikroorganismen tragen in der Regel
Wiederholungsmuster von molekularen Strukturen, sog. Pathogen-assoziierte molekulare Muster
pathogen-aassociated molecular patterns, PAMPs) (Janeway, Jr. and Medzhitov, 2002). Das
(p
angeborene Immunsystem erkennt solche Pathogene mithilfe von Rezeptoren, die an bestimmte
Strukturmerkmale dieser regelmäßigen Muster binden können. Diese Rezeptoren erkennen
PAMPs und werden PRRs (p
pathogen-rrecognition receptors) genannt. PRRs sind im Genom eines
Organismus festgelegt und werden innerhalb einer Klasse von Zellen identisch exprimiert. Durch
ihre genomische Konservierung unterscheiden sich diese Rezeptoren grundsätzlich von den
hochspezifischen und durch somatische Rekombination und Hypermutation entstehenden T- und
B-Zell Rezeptoren der adaptiven Immunantwort.
PRRs kommen vor allem auf Zelloberflächen von Makrophagen, Neutrophilen und dendritischen
Zellen vor sowie in intrazellulären Kompartimenten und werden in den Blutkreislauf oder in
Gewebeflüssigkeiten sekretiert (Medzhitov and Janeway, Jr., 1997). Wichtige sezernierte
Pathogenrezeptoren sind das Mannan-bindende Lektin (MBL), das C-reaktive Protein (CRP) und
das Serum Amyloid Protein (SAP), welche bereits in der frühen Phase der Infektion von der Leber
produziert werden (Gewurz et al., 1982; Schwalbe et al., 1992; Fraser et al., 1998). CRP und SAP
gehören zur Familie der Pentraxine, und wirken opsonisierend durch Bindung von
Phosphorylcholin auf bakteriellen Oberflächen. Außerdem sind sie durch Bindung des C1q
Proteins in der Lage, das klassische Komplementsystem zu aktivieren (Agrawal et al., 2001).
MBL gehört zur Familie der Kollektine, welche durch das Vorkommen einer Kollagenartigen
Region und einer C-Typ Lektin (zuckerbindende) Domäne charakterisiert ist (Epstein et al., 1996;
Holmskov, 2000). MBL ist in der Lage, Mannose-Reste zu binden, die auf Mikroorganismen in
hohen Mengen zu finden sind. Nach Assoziation von MBL mit speziellen Serinproteasen können
diese die Komplement Proteine C2 und C4 spalten, und somit das Lektin-abhängige
Komplementsystem aktivieren (Fraser et al., 1998). Zwei weitere Mitglieder der Kollektin-Familie
sind die Surfactant Proteine A und D (Sp-A, SP-D), welche vor allem in der Lunge vorkommen,
dort mit Pathogenen assoziieren und die Phagozytose einleiten. Ein Defekt von SP-A oder SP-D
Einleitung
3
im Mausmodell führt zu erhöhter Suszeptibilität gegenüber Lungenpathogenen (LeVine et al.,
1998; van Rozendaal et al., 2000; Linke et al., 2001).
Auch auf der Zelloberfläche von Phagozyten kommen membranständige PRRs vor und erkennen
konservierte Oberflächenmoleküle von Pathogenen. Die Bindung dieser Liganden führt vor allem
zur Phagozytose der gebundenen Erreger. Wichtige Rezeptoren sind CD14, Makrophagen
Mannose Rezeptor (MMR), Makrophagen Scavenger Rezeptor (MSR) und MARCO. CD14,
welches LPS und Peptidoklykane bindet, dient vor allem als Korezeptor für Toll like Rezeptoren
(Wright et al., 1990). MMR gehört zur Familie der C-Typ Lektine und interagiert mit einer
Vielzahl von gram-negativen und gram-positiven Bakterien sowie mit Pilzpathogenen (Fraser et
al., 1998). Eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunität spielt der Makrophagen Scavanger
Rezeptor. MSR besitzt eine außergewöhnlich breite Spezifität für polyanionische Liganden,
darunter doppelsträngige RNS, LPS und Lipoteichonsäure (LTA) (Pearson, 1996). MSR defiziente
Mäuse zeigen eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber Infektionen mit Listeria monocytogenes,
Herpes Simplex Virus und Malaria (Suzuki et al., 1997; Thomas et al., 2000). Neben MSR gehört
auch MARCO (macrophage receptor with collagenous structure) zu den cysteinreichen
Scavenger-Rezeptoren. MARCO ist in der Lage, bakterielle Zellwandkomponenten zu binden und
die Phagozytose einzuleiten (Elomaa et al., 1995).
Eine Reihe von Erregern wie alle Viren, einige Bakterien (z.B.: Mykobakterien, Listerien,
Salmonellen) und auch einzellige Parasiten (z.B.: T.gondii, T.cruzi, u.a.) können Zugang zu
intrazellulären Kompartimenten der Wirtszellen erlangen, wie zum Beispiel das Zytosol, um sich
dort zu replizieren und zu persistieren. Es konnten intrazelluläre PRRs identifiziert werden,
welche vor allem intrazelluläre virale und/ oder bakterielle Bestandteile erkennen, und die
Hemmung der Pathogenreplikation initiieren können. Die Protein Kinase R (PKR) wird durch
Bindung von doppelsträngiger RNS, die während viraler Replikation gebildet wird, aktiviert. Dies
führt zur Phosphorylierung und Inaktivierung des Translationsinitiationsfaktors eIF2D und
schließlich zum Abbruch der viralen und zellulären Proteinsynthese (Clemens and Elia, 1997).
Aktivierte PKR ist außerdem in der Lage, den NF-NB und MAP-Kinase Signalwege zu aktivieren,
was wiederum zur Induktion von antiviralen Typ I Interferonen führt (Williams, 1999).
Doppelsträngige virale RNS führt ebenfalls zur Aktivierung des 2’-5’-oligoadenylat Synthase
(OAS)/RNAseL Signalwegs, welches zum Abbau von sowohl viraler als auch zellulärer RNS führt
und somit zur Apoptose der infizierten Zelle (Kumar and Carmichael, 1998). Weitere PRRs dieser
Klasse sind RIG-I und LGP-2 (Saito et al., 2007).
Eine weitere wichtige Klasse von intrazellulären PRRs stellen die NOD (n
nucleotide-binding
oligomerization domain) Proteine dar. Diese bestehen aus einer aminoterminalen CARD (ccaspase
recruitment domain) Domäne, einer Nukleotid-bindenden Domäne (NBD) und einer
carboxyterminalen LRR (leucin-rrich repeat) Region. Die CARD Domäne von NOD1 und NOD2
assoziiert mit einer Protein Kinase, RIP2, welche wiederum NF-NB und MAP-Kinase Signalwege
aktiviert (Bertin et al., 1999; Inohara et al., 1999; Ogura et al., 2001). NOD1 und NOD2 Proteine
Einleitung
4
sind in der Lage – vermutlich durch Bindung an die LRR Regionen – bakterielle Zellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide (LPS) und Peptidoglykane (PGN) zu erkennen (Inohara et al.,
2001; Strober et al., 2006).
Die meisten PRRs, welche auf Zelloberflächen exprimiert werden, findet man auf
phagozytierenden Zellen, insbesondere auf Makrophagen. Durch Erkennung konservierter
Moleküle vorwiegend auf den Oberflächen der Pathogene, führen diese Rezeptoren zur
Phagozytose des Mikroorganismus und sind somit entscheidend beim Aufbau einer effektiven
Immunantwort beteiligt.
1.1.2 Toll-like Rezeptoren
Eine Familie von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die das Vorliegen von mikrobiellen
Bestandteilen (PAMP) erkennt, ist die Familie der Toll-like Rezeptoren. Der Toll-Rezeptor wurde
erstmals in der Taufliege Drosophila melanogaster entdeckt, in der er während der Embryogenese
bei der Festlegung des dorsoventralen Körpermusters eine Rolle spielt (Hashimoto et al., 1988).
Später konnte außerdem gezeigt werden, dass die Signalwege, die durch dToll aktiviert werden,
bemerkenswerte Ähnlichkeiten zum mammalischen Interleukin 1 (IL-1) Signalweg zeigen,
welches zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-NB führt, ein Molekül, das wichtige
Funktionen während der Immunantwort übernimmt. Auffälligerweise sind die zytoplasmatischen
Domänen des dToll und des IL-1 Rezeptors hoch konserviert, und werden folglich als Toll/IL-1
Rezeptor (TIR) Domänen bezeichnet. Später konnte auch gezeigt werden, dass der dToll
Signalweg in der antifungalen Immunantwort der Taufliege eine Rolle spielt, da Mutationen in
diesem Signalweg zu einer erhöten Suszeptibilität der mutanten Fliegen bei Pilzinfektionen
führen (Lemaitre et al., 1996). Bisher konnten insgesamt elf zu dToll homologe mammalische
Gene identifiziert werden, welche als Toll-like Rezeptoren (TLRs) bezeichnet werden und
wichtige Bedeutungen in der Pathogenerkennung und -abwehr besitzen (Medzhitov et al., 1997;
Akira and Takeda, 2004). Dabei sind TLR1-9 im Menschen und der Maus homolog und
funktionell, während TLR10 in der Maus eine C-terminale nicht verwandte Sequenz aufweist, die
das Maus TLR10 in seiner funktionellen Eigenschaft zerstört (Takeda and Akira, 2005). TLR11
hingegen – in der Maus funktionell – weist im menschlichen TLR11 Gen ein Stopp-Kodon auf,
welches zum Fehlen eines funktionellen TLR11 Proteins im Menschen führt (Zhang et al., 2004).
Die Mitglieder der TLR-Familie sind in der Lage, PAMPs, wie Lipoproteine, Carbohydrate,
Peptide und Nukleinsäurestrukturen, von verschiedenen Mikroorganismen zu erkennen. Die
bisher identifizierten Liganden für die verschiedenen TLRs sind in Tabelle 1.1 zusammengefasst.
In ihrer Struktur weisen die TLRs eine extrazelluläre LRR (lleucin-rrich repeats) Domäne und eine
intrazelluläre TIR Domäne auf. Die TIR Domäne der TLRs, wie auch des IL-1 Rezeptors, ist von
entscheidender Bedeutung bei der Signalweiterleitung innerhalb der Zelle. C3H/HeJ Mäuse, die
eine Mutation in der TIR Domäne des TLR4 Gens besitzen, zeigen Defekte in ihrer Fähigkeit auf
Einleitung
5
LPS zu reagieren (Poltorak et al., 1998). Die LRR Domäne hingegen scheint direkt für die
Interaktion mit Bestandteilen von Pathogenen verantwortlich zu sein.
Tabelle 1.1: Toll-like Rezeptoren und bekannte Liganden. N.D.: nicht determiniert. Überarbeitet
nach Akira und Takeda, 2004.
Rezeptor
TLR1
Ligand
Triacyl Lipopeptide
lösliche Faktoren
Ursprung des Liganden
Bakterien und Mykobakterien
Neisseria meningitidis
TLR2
Lipoproteine / Lipopeptide
Peptidoglykan
Lipoteichonsäure
Lipoarabinomannan
Phenol-lösliches Modulin
Glykoinositolphospholipide
Glykolipide
Porine
atypische Lipopolysaccharide
atypische Lipopolysaccharide
Zymosan
Heat-shock Protein 70
doppelstränginge RNS
Diverse Pathogene
Gram-positive Bakterien
Gram-positive Bakterien
Mykobakterien
Staphylococcus epidermidis
Trypanosoma cruzi
Treponema maltophilum
Neisseria
Leptospira interrogans
Porphyromonas gingivalis
Pilze
Wirt
Viren
Lipopolysaccharide
Taxol
Hüllenproteine
Heat-shock Protein 60
Heat-shock Protein 70
Typ III Repeat Extra Domäne
Oligosaccharide von Hyaluronsäure
Polysaccharid Fragmente von Heparansulfat
Fibrinogen
Flagellin
Gram-negative Bakterien
Pflanzen
Viren
Chlamydia pneumoniae
Wirt
Wirt
Wirt
Wirt
Wirt
Bakterien
TLR9
Diacyl Lipopeptide
Lipoteichonsäure
Zymosan
Imidazolquinolin
Loxoribin
Bropirimin
Einzelsträngige RNS
Imidazolquinolin
Einzelsträngige RNS
CpG enthaltende DNS
Mykoplasma
Gram-positive Bakterien
Pilze
Synthetische Verbindungen
Synthetische Verbindungen
Synthetische Verbindungen
Viren
Synthetische Verbindungen
Viren
Viren
TLR10
N.D.
-
TLR11
N.D.
Profilin
Uropathogene Bakterien
Toxoplasma gondii
TLR3
TLR4
TLR5
TLR6
TLR 7
TLR8
Trotz hoher Sequenzkonservierung der verschiedenen LRR Domänen, sind die unterschiedlichen
TLRs in der Lage, eine Vielfalt nicht verwandter PAMPs zu detektieren (Janeway, Jr. and
Medzhitov, 2002; Akira and Takeda, 2004). Das TLR4 Protein wurde als erstes beschrieben und
detektiert LPS von gram-negativen Bakterien (Medzhitov et al., 1997; Hoshino et al., 1999). Die
Detetkion von LPS ist jedoch nur möglich, wenn LPS zunächst von im Serum gelöstem LPSbindendem Protein (LBP) gebunden wird. Dieser Komplex wird dann von CD14 erkannt, ein
durch Glykosylphosphatidylinositol (GPI) an der Zellmembran verankertes Molekül, das primär
von Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen Zellen exprimiert wird. LPS Stimulation der
Zellen resultiert in erhöhter Proximität von CD14 und TLR4, was für eine Interaktion beider
Moleküle bei der LPS Erkennung spricht (Jiang et al., 2000). Ein weiteres Molekül, welches sich
an der Erkennung von LPS durch TLR4 verantwortlich zeichnet, ist MD-2. Dieses kleine Molekül
Einleitung
6
weist keine Transmembrandomäne auf, wird jedoch an der Zelloberfläche exprimiert und
assoziiert mit der Ektodomäne von TLR4 und ist essentiell für die Erkennung von LPS (Shimazu et
al., 1999).
TLR2 erkennt eine Vielzahl mikrobieller Komponenten wie Lipoproteine/Lipopeptide von
verschiedenen Pathogenen, Peptidoglykan und Lipoteichonsäuren gram-positiver Bakterien,
Lipoarabinomannan von Mykobakterien, Glykosylphosphatidylinositol-Anker von Trypanosoma
cruzi, sowie Zymosan von Pilzen und einige virale Proteine von VMV (Visna-Maedi Virus) und
HCV (Hepatitis-C Virus). Dabei wurde beobachtet, dass TLR2 zur Ausbildung eines potenten
Signals koordiniert mit anderen TLRs insbesondere TLR1 und TLR6 interagiert (Ozinsky et al.,
2000; Takeda et al., 2003), wobei TLR1 und TLR6 strukturell mit TLR2 verwandt sind. Die
Heterodimerbildung mit diesen TLRs sowie mit anderen Rezeptoren ist wahrscheinlich auch der
Grund dafür, dass TLR2 in der Lage ist, so viele verschiedene Liganden zu erkennen. So zeigen
Makrophagen von TLR6-defizienten Mäusen keine Produktion von inflammatorischen Zytokinen
nach Stimulation mit Triacyl-Lipopeptiden von gram-negativen Bakterien. Andererseits erkennen
TLR1-defiziente Makrophagen Diacyl-Lipopeptide von Mycoplasmen, zeigen sich aber nicht
responsiv gegenüber Triacyl-Lipopeptiden (Takeuchi et al., 2001; Takeuchi et al., 2002). In beiden
Fällen wurde die Heterodimerbildung mit TLR2 nachgewiesen. Dies zeigt, dass TLR2 in
Assoziation mit TLR1 oder TLR6 zwischen verschiedenen mikrobiellen Komponenten
unterscheiden kann. Desweiteren ist TLR2 in der Lage, zusammen mit Dectin-1, einem Rezeptor
der Lektin-Familie, E-Glycane des Zymosans, einem Zellwandbestandteil der Hefe, zu erkennen.
Die Aktivierung von NF-NB über TLR2 wird dabei durch Anwesenheit von Dectin-1 verstärkt
(Gantner et al., 2003).
Für das TLR5 Protein wurde gezeigt, dass es das Flagellin Protein von Bakterien – dem
Hauptbestandteil der Flagellen, welche aus der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien
herausragen – binden kann. (Hayashi et al., 2001). Bemerkenswert bei der Expression von TLR5
ist vor allem, dass es basolateral und nicht auf der apikalen Seite von Epithelzellen des Darms
vorkommt. Somit wird hier nur Flagellin von pathogenen Bakterien, wie Salmonella
typhimurium, die das Epithel durchdringen, erkannt (Lyons et al., 2004). Kommensalen, wie E.
coli, lösen, obwohl auch sie Flagellin besitzen, keine proinflammatorische Genexpression aus, da
sie nicht zur basolaterale Seite gelangen (Gewirtz et al., 2001).
Während TLR1, 2, 4, 5, 6, 10 und 11 an der äußeren Zellmembran exprimiert werden, kommen
TLR3, 7, 8 und 9 hauptsächlich intrazellulär im Endoplasmatischen Retikulum (ER) oder in
endosomalen Membranen vor, wo sie mikrobielle Nukleinsäuren detektieren (Wagner and Bauer,
2006; Trinchieri and Sher, 2007). Für TLR3 wird vermutet, dass es doppelsträngige RNS, welche in
der Zelle bei viralen Infektionen auftritt, und synthetische Analogons, wie poly(I:C), detektieren
kann (Alexopoulou et al., 2001). TLR9 bindet an unmethylierten CpG Motiven doppelsträngiger
DNS, die zwar selten in mammalischen Genomen zu finden sind, jedoch häufige Bestandteile
bakterieller DNS darstellen; aber auch virale CpG haltige DNS wird über TLR9 erkannt (Hemmi et
Einleitung
7
al., 2000; Lund et al., 2003). Die Erkennung der CpG Motive erfolgt dabei vermutlich intrazellulär
in Endosomen nach unspezifischer Aufnahme in die Zelle (Wagner, 1999). TLR7 und TLR8 sind
zu TLR9 hoch homolog. Nachdem lange Zeit nur synthetische Produkte gefunden werden
konnten, welche von TLR7 und TLR8 erkannt werden, konnte kürzlich einzelsträngige RNS als
natürlicher Stimulus identifiziert werden (Diebold et al., 2004; Heil et al., 2004). Die Liganden von
TLR10 und TLR11 sind bislang unbekannt, jedoch konnte für murines TLR11 gezeigt werden, dass
uropathogene Bakterien sowie T. gondii Profilin über diesen Rezeptor erkannt werden (Zhang et
al., 2004; Yarovinsky et al., 2005).
Die Stimulation der TLRs durch mikrobielle Komponenten löst die Expression von Genen der
Immunantwort aus. Die Erkennung der Liganden führt zur Dimerisierung der TLRs. TLR2 bildet,
wie schon erwähnt, Heterodimere mit TLR1 oder TLR6, die weiteren TLRs bilden hingegen
Homodimere (Akira and Takeda, 2004). Die Signalwege, die von aktivierten TLRs eingeschaltet
werden, sind, wie ebenfalls schon erwähnt, hoch homolog zum IL-1 Rezeptor (IL-1R) Signalweg.
Sowohl TLRs als auch IL-1R besitzen eine intrazelluläre TIR Domäne, welche mit dem
Adapterprotein MyD88 (myeloid differentiation primary-response protein 88) interagiert. Nach
Stimulation kann MyD88 eine Serin/Threonin Kinase, die IL-1R-assoziierte Kinase (IRAK4),
rekrutieren und phosphorylieren, welche wiederum die Kinaseaktivität von IRAK1 induziert.
Aktivierte IRAK1 autophosphoriliert und führt zur Bindung des Adapterproteins TRAF6. Dieser
Komplex führt im Folgenden zur Aktivierung zweier für das Immunsystem wichtiger Signalwege:
JNK (JUN N-terminale kinase) und NF-NB (Takeda et al., 2003; Carmody and Chen, 2007)
(Abbildung 1.1).
Abb. 1.1 MyD88 abhängiger Signalweg am Beispiel von TLR4 und der MyD88 unabhängige TLR Signalweg am Beispiel
von TLR3. Abbildung nach Carmody und Chen, 2007.
Einleitung
8
Zum einen führt dabei aktiviertes TRAF6 zur Aktivierung von IKK. IKK wiederum phosphoryliert
INBD, den NF-NB-Inhibitor, der dadurch für den proteasomalen Abbau markiert wird und den
aktiven dimeren Transkriptionsfaktor NF-NB freisetzt. Zum anderen führt TRAF6 zur Aktivierung
der MAP-Kinase Kaskade, die zur Translokation des Transkriptionsfaktors AP-1 in den Zellkern
führt. Neben dem beschriebenen MyD88 abhängigen Signalweg, konnte jedoch auch ein MyD88
unabhängiger Signalweg beschrieben werden. MyD88 defiziente Mäuse zeigen weiterhin eine
Responsivität nach LPS Stimulation über TLR4, jedoch mit verzögerten Kinetiken der JNK und
NF-NB Aktivierung (Kawai et al., 1999). Der MyD88-unabhängige Signalweg wurde weiter
charakterisiert bei der Untersuchung der Genexpression in MyD88 defizienten Makrophagen, die
mit LPS stimuliert wurden. Einige Gene wurden dabei identifiziert, die als IFN-induzierte Gene
bekannt sind, wie IRG1 (immunoresponsive Gene 1) und CXCL10 (CXC-Chemokin Ligand 10). Im
Gegensatz dazu werden die inflammatorischen Zytokine, wie TNF, IL-6 und IL-1E in
Abwesenheit von MyD88 nicht mehr exprimiert. In TLR4 defizienten Makrophagen konnte
dagegen gezeigt werden, dass die IFN induzierten Gene, IRG1 und CXCL10 nicht mehr produziert
werden und daher diese Gene TLR4 abhängig aber MyD88-unabhängig nach LPS Stimulation
induziert werden (Toshchakov et al., 2002). Obwohl auch für TLR3 der MyD88 abhängige
Signalweg beschrieben wurde (Alexopoulou et al., 2001), läuft die Signaltransduktion hier
hauptsächlich über den MyD88 unabhängigen Signalweg ab, da nach poly (I:C) Stimulation in
MyD88 defizienten Mäusen eine normale Produktion inflammatorischer Zytokine beobachtet
wurde (Akira and Takeda, 2004). Der MyD88 unabhängige Signalweg wird auch als TRIFabhängig bezeichnet, da er zusätzlich in der Lage ist den Transkriptionsfaktor IRF3 zu aktivieren,
und somit die Expression von Typ-I Interferonen zu induzieren (Akira and Takeda, 2004;
Carmody and Chen, 2007).
Die Bedeutung der TLR vermittelten Antwort auf Fremdorganismen erstreckt sich deutlich über
das Einleiten von Phagozytose hinaus. Durch Aktivierung von NF-NB, MAP Kinasen und IRF3
wird die Expression einer Vielzahl immunrelevanter Gene induziert, welche sowohl großen
Einfluss auf die unmittelbare, angeborene Immunantwort haben, als auch adaptive Immunantworten regulieren können.
Einleitung
9
1.2 Zytokine
1.2.1 Interferon J
Interferone (IFN) sind wichtige Zytokine, die in der immunologischen Abwehr des Organismus
gegen Pathogene von außerordentlicher Bedeutung sind. Ursprünglich wurden Interferone als
Agenzien entdeckt, die mit der viralen Replikation interferieren. Man unterscheidet aufgrund
ihrer Homologien zwischen Typ-I Interferonen, mit 23 Vertretern von IFND und einem Vertreter
von IFNE, und Typ-II Interferon, auch IFNJ genannt. Dabei wird den Typ-I Interferonen vor
allem besondere Bedeutung in der antiviralen Immunabwehr zugeschrieben, und obwohl von den
meisten Zellen in niedrigen Mengen exprimiert, gelten hematopoetische Zellen und Fibroblasten
als die Hauptproduzenten von IFND und IFNE (Schroder et al., 2004). IFNJ ist der einzige
Vertreter des Typ-II Interferons und strukturell nicht mit den Typ-I Interferonen verwandt. Es
bindet an einen anderen Rezeptor und ist außerdem auf einem seperaten chromosomalen Lokus
kodiert. Anfänglich nahm man an, dass die einzigen Produzenten von IFNJ CD4 T-Zellen, CD8
cytotoxische T-Zellen und NK-Zellen sind. Mittlerweile konnten auch B-Zellen, NKT-Zellen und
professionell Antigen präsentierende Zellen (APCs) als IFNJ sekretierende Zellen identifiziert
werden (Yoshimoto et al., 1998; Carnaud et al., 1999; Frucht et al., 2001). IFNJ produziert durch
APCs (Makrophagen/Monozyten, dendritische Zellen), wirkt dabei lokal und autokrin sowie
parakrin auf die benachbarten Zellen. Während die Produktion durch NK-Zellen und APCs
wichtig bei der frühen Immunantwort gegen Pathogene ist, sind T-Zellen die Hauptquelle der
IFNJ Produktion der adaptiven Immunantwort (Frucht et al., 2001; Sen, 2001). Die Produktion
von IFNJ wird durch Zytokine, vor allem IL-12 und IL-18, welche von APCs sekretiert werden,
kontrolliert. Diese Zytokine dienen dabei als Bindeglied zwischen Infektion und IFNJ Produktion
in der angeborenen Immunantwort. Makrophagen, die über PRRs Pathogene erkennen,
sezernieren daraufhin IL-12 und Chemokine (z.B. macrophage-inflammatory protein 1D (MIP1D)) (Salazar-Mather et al., 2000). NK-Zellen werden durch die Chemokine zum Ort der Infektion
gelockt (Chemoattraktion), IL-12 führt dann zur Induktion der IFNJ-Produktion in diesen Zellen.
In Makrophagen, NK und T-Zellen wird durch die Kombination von IL-12 und IL-18 die IFNJ
Produktion dann weiter verstärkt (Munder et al., 1998; Akira, 2000; Schindler et al., 2001; Fukao
et al., 2001). Um einer überschießenden Entzündungsreaktion entgegen zu wirken, wird die IFNJ
Produktion negativ reguliert von den Zytokinen IL-4, IL-10, TGF-E (transforming growth factorE) sowie außerdem von Glucocorticoiden (Fukao et al., 2000; Sen, 2001; Schindler et al., 2001).
IFNJ interagiert mit einem spezifischen Oberflächenrezeptor, der ubiquitär auf allen kernhaltigen
Zellen vorkommt. Allerdings wird er unterschiedlich quantitativ exprimiert (200-25000 x pro
Zelle) (Farrar and Schreiber, 1993). Der IFNJ Rezeptor (IFNGR) besteht aus einem Tetramer,
aufgebaut aus zwei mal zwei Untereinheiten, den 90 kDa D-Ketten (IFNGR1) mit einer hohen
Bindeaffinität für IFNJ sowie den 35 kDa E-Ketten (IFNGR2), welche für die Signalweiterleitung
Einleitung
10
zuständig sind. Die Aufklärung des IFN-Signalweges führte zur Entdeckung des JAK-STATSignalweges (Darnell, Jr. et al., 1994; Schindler and Darnell, Jr., 1995; Ihle, 1995). Das
zugrundeliegende Prinzip der Aktivierung von spezifischen Mitgliedern der zwei Protein
Familien, JAKs (Janus Kinasen) und STATs (signal transducers and activators of transcription),
werden dabei von mehr als 50 Mitgliedern der Zytokin-Rezeptor Superfamilie genutzt (Ihle,
1996). Prinzipiell werden dabei nach Zytokinbindung die rezeptorständigen Tyrosinkinasen der
Janus-Kinase-Familie aktiviert. Die Kinasen phosphorylieren anschließend die STATs, welche
daraufhin aufgrund von Wechselwirkungen mit ihrer SH2-Domänen Homo- und Heterodimere
bilden. Die STAT-Dimere können dann in den Zellkern verlagert werden, wo sie an GAS
Elemente (gamma interfern activation sites) der Promotorregionen binden und damit die
Expression von Genen induzieren. Für den IFNGR im Speziellen läuft die Signalvermittlung wie
folgt ab: An den Rezeptor Untereinheiten sind spezifische Janus Kinasen (JAK) konstitutiv
gebunden, JAK1 an den IFNGR1 Ketten und JAK2 an den IFNGR2 Ketten. Nach Ligandenbindung
erfahren die intrazellulären Rezeptordomänen gewisse Konformationsänderungen, welche zur
Auto-phosphorylierung und Aktivierung von JAK2 führen. Aktiviertes JAK2 führt wiederum zu
Transphosphorylierung der JAK1 Moleküle, die nun in der Lage sind, spezifische Tyrosinreste der
IFNGR1 Ketten zu phosphorylieren. Dies führt zur Entstehung von spezifischen Bindestellen für
SH2 Domänen der latenten zytosolischen STAT1 Moleküle. Diese werden wiederum
phosphoryliert, vermutlich durch JAK2, und bilden aktive Homodimere, welche schließlich vom
Rezeptor dissoziieren und in den Nukleus translozieren. Die STAT1 Homodimere, auch GAF
(ggamma-interferon activation factor) genannt, können nun durch Bindung an spezifische GAS
(gamma activated site) und ISRE (iinterferon stimulated response element) Konsensussequenzen
die Transkription einer Vielzahl von Genen regulieren (Boehm et al., 1997; Schroder et al., 2004)
(Abbildung 1.2). Dabei werden diese Gene als primär-responsive Gene bezeichnet, und werden
häufig bereits 15 bis 30 Minuten nach IFNJ Behandlung induziert (Kerr and Stark, 1991). Dazu
gehören einige Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel IRF-1, die ihrerseits weitere Gene in
ihrer Transkription regulieren. Hier spricht man von sekundär-responsiven Genen. Neben der
Homodimerisierung von STAT1 kommt es jedoch auch zu STAT1-STAT2 Heteromerbildung
sowie zu Heterotirimeren bestehend aus z.B. STAT1-STAT1-IRF-9 oder STAT1-STAT2-IRF9
während der IFNJ induzierten Signalkaskade. STAT2 ist das einzige STAT-Protein ohne DNABindemotiv. Der STAT1-STAT2-IRF-9 Komplex (ISGF3) ist ein typischer Typ I Interferon
Transkriptionsfaktor. Mittlerweile gibt es jedoch Beweise dafür, dass Typ I Interferone primär
über ISGF3 signalisieren, jedoch auch STAT1 Homodimere gebildet werden. Vice versa werden
bei der Typ II Interferon Signalkaskade primär STAT1 Homodimere gebildet, jedoch führt auch
die Komplexbildung von ISGF3 zur Transkription von Genen, welche über ISRE Elemente
reguliert werden (Matsumoto et al., 1999). Dies erklärt den überlappenden Effekt auf die
Genregulation von Typ I und II Interferonen in der Pathogenabwehr.
Einleitung
11
Abb. 1.2 JAK-STAT Signalweg des IFNJJ Rezeptors. Abbildung nach Schroder et al., 2004.
Die IFNJinduzierte Signalkaskade unterliegt einer Negativ-Regulation, um einem Überschießen
der Inflammation entgegen zu wirken. So konnte beobachtet werden, dass die STAT1 Aktivierung
schon nach 1 h IFNJ Behandlung der Zellen inhibiert wird, trotz des kontinuierlichen
Vorhandenseins von extrazellulärem IFNJ Dafür sind Mechanismen verantwortlich, welche
direkt auf die einzelnen Stufen der IFNJ Signalkaskade einwirken (Darnell, Jr., 1997; Stark et al.,
1998). So wird der IFNJ-IFNGR1 Komplex zunächst internalisiert und gelangt in den
endosomalen Abbauprozess, wo dieser Komplex dissoziiert (Schreiber and Farrar, 1993). In
einigen Zelltypen gelangt der IFNGR1 dann wieder ungebunden an die Zelloberfläche, während
der Ligand, IFNJ, abgebaut wird (Anderson et al., 1983; Celada and Schreiber, 1987; Farrar and
Schreiber, 1993). Aber auch der internalisierte Rezeptor kann abgebaut werden und ein
quantitativer Rückgang von membranständigem IFNGR1 führt somit zur verminderten
Responsivität der Zelle gegenüber extrazellulärem IFNJ. Weiterhin werden durch IFNJ
verschiedene Proteine exprimiert, welche an unterschiedlichen Stellen der IFNJR-Signalkaskade
interferieren und die Signalweiterleitung hemmen. So genannte SOCS (suppressors of cytokine
signaling) Proteine, insbesondere SOCS-1 und SOCS-3, sind für die Regulation des Interferon
Signalweges verantwortlich. Hierbei assoziieren SOCS-1/3 mit JAK1/2 durch Interferenz mit der
Tyrosin Kinase Domäne und inhibieren dadurch die nachgeschaltete Phosphorylierung der STAT
Proteine. Zusätzlich agieren SOCS Proteine als Adaptoren, die aktivierte Signalmoleküle für den
proteasomalen Degradationsweg markieren (Zhang et al., 1999). Neben der Regulation durch
Einleitung
12
SOCS Proteine kann der Signalweg auch durch Protein-Tyrosin Phophatasen (PTPs) beeinflußt
werden. Hierbei dephosphorylieren die PTPs Shp1 und Shp2 aktiviertes JAK1/2 (Haque et al.,
1997; You et al., 1999). Auch die STAT1 Phosphorylierung wird durch Dephosphorylierung im
Kern reguliert. Dabei wird STAT1 durch PTPs nach Bindung an die DNA dephosphoryliert, die
DNA-Bindung dabei aufgelöst, und inaktiviertes STAT1 transloziert in einem Ran-GTPase
abhängigen Weg ins Zytoplasma (Mowen and David, 2000; McBride et al., 2006). Eine weitere
Beeinflussung der Transkription von IFNJ regulierten Genen wird dadurch erreicht, dass IRF-1
sowie ISGF3 mit dem Repressormolekül IRF-2 um das ISRE oder IRF-E Bindemotiv konkurriert.
Die Bindung von IRF-2 führt dabei zu keiner Genexpression (Harada et al., 1994).
Die zellulären Effekte von IFNJ sind sehr vielfältig und beeinflussen sowohl die angeborene als
auch die adaptive Immunantwort. So werden durch IFNJ mehrere Gene induziert, welche für die
MHC Klasse I vermittelte Antigenpräsentation wichtig sind. Dabei werden die MHC I Komplexe,
– bestehend aus der schweren und leichten Kette – durch IFNJ induziert, was für die Präsentation
von intrazellulären Pathogenbestandteilen wichtig ist (Shirayoshi et al., 1988). Durch Induktion
einiger proteasomaler Untereinheiten, welche als „Immunproteasom-“ Untereinheiten bezeichnet
werden und kompetitiv einige konstitutiv exprimierten Proteasomen-Untereinheiten ersetzen,
wird die Quantität, Qualität und das Repertoire an Peptiden, welche auf MHC I Molekülen
geladen werden, entschieden erhöht, was wiederum zu erhöhter und effektiverer Klasse I
Antigenpräsentation beiträgt (Groettrup et al., 2001; Schroder et al., 2004). Zusätzlich wird durch
IFNJ die Antigenpräsentation über MHC II erhöht, was zur Peptid spezifischen Aktivierung von
CD4+ T-Zellen führt (Mach et al., 1996). IFNJ induziert dabei in professionellen APCs, wie BZellen, DCs und Makrophagen, die Expression von Klasse II MHC Molekülen und kann somit die
Klasse II Antigenpräsentation verstärken (Mach et al., 1996). Durch IFNJ wird zusätzlich die
adaptive Immunantwort in Richtung T H 1 Antwort verschoben. Dabei wird die Differenzierung
von CD4+ T-Zellen zu T H 1 Zellen gefördert, und T H 1 typische Effektormechanismen induziert,
wie Aktivierung von NK Zellen, Förderung spezifischer zytotoxischer Immunität und Aktivierung
von Makrophagen (Boehm et al., 1997).
IFNJ übt außerdem antiproliferative Effekte auf eine Vielzahl von Zellen aus, indem es Einfluss
auf den Zellzyklus nimmt und Apoptose induzieren kann. Des Weiteren beeinflusst IFNJ den
Isotyp Wechsel von B-Zellen zu IgG2a, übernimmt chemoattraktive Funktionen durch Regulation
einiger Chemokine wie IP-10, MIG, MIP-1 und RANTES, und verstärkt die TLR4 vermittelte
Immunantwort auf LPS, indem es die Expression von TLR4, MyD88 und IRAK induziert (Boehm
et al., 1997; Schroder et al., 2004).
Die bedeutsamsten antiviralen Mechanismen, die von IFNJ gesteuert werden, führen zur
Hemmung der Proteinsynthese und somit zur Inhibierung der viralen Replikation. Dabei wird die
Transkription von drei wichtigen Genen durch IFNJ induziert: die bereits in Abschnitt 1.1.1
erwähnte PKR und OAS/RNAseL, sowie auch die doppelsträngige RNS spezifische Adenosin
Deaminase (dsRAD), welche die Desaminierung von Adenosin zu Inosin in doppelsträngiger RNS
Einleitung
13
katalysiert, und damit die Synthese funktioneller viraler Proteine verhindern kann (Boehm et al.,
1997). Ferner konnte für einige IFNJ-induzierte 65 kDa Guanylat-bindende Proteine (GBPs) eine
antivirale Wirkung gezeigt werden (Anderson et al., 1999; Carter et al., 2005).
Einer der wichtigsten Effekte von IFNJ auf Makrophagen besteht in der Aktivierung von
antimikrobiellen Effektorfunktionen. Durch IFNJ aktivierte Makrophagen zeigen eine erhöhte
Pinozytose und Rezeptor-vermittelte Phagozytose sowie eine erhöhte mikrobizide Aktivität.
Letztere wird insbesondere durch Induktion von iNOS und NADPH Oxidase bewirkt, Enzyme,
die zur Produktion reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffintermediate benötigt werden (RNI und
ROI) (Boehm et al., 1997; Schroder et al., 2004). Darüber hinaus führt IFNJ in humanen Zellen
lokal zur Tryptophandepletion durch die Induktion der Indolamin 2,3 Dioxygenase (IDO), ein
Mechanismus, dem beim Menschen antiparasitäre und antibakterielle Effekte zugeschrieben
werden (Daubener and MacKenzie, 1999).
1.2.2 Tumor Nekrose Faktor
Der Tumor Nekrose Faktor ist ein essentielles proinflammatorisches Zytokin, und gehört zu einer
großen Familie verwandter Proteine, die als TNF Superfamilie bezeichnet wird. Diese
übernehmen in Säugetieren essentielle biologische Funktionen (Locksley et al., 2001; Hehlgans
and Pfeffer, 2005). Dabei binden die Mitglieder der TNF Superfamilie an einen oder mehrere
spezifische membrangebundene oder auch lösliche Rezeptoren, welche zusammen die TNF
Rezeptor (TNFR) Superfamilie bilden (Hehlgans and Pfeffer, 2005). Die Aktivierung der
TNF/TNFR Superfamilie führt zu einer Vielzahl an biologischen Effekten. Dazu zählen wichtige
Funktionen bei der Organogenese von sekundären lymphatischen Organen, während der
Entzündung sowie der protektiven Immunantwort. Allerdings werden auch schädigende Effekte,
wie Sepsis, Fieber, Kachexie und Autoimmun-Erkrankungen, auf die Aktivität der TNF/TNFR
Superfamilie zurückgeführt. Es sind mehr als 40 Mitglieder der TNF/TNFR Superfamilie bekannt
und viele von ihnen sind wichtige Ziele therapeutischer Behandlung (Hehlgans and Pfeffer, 2005).
TNF ist ein membrangebundenes trimeres Molekül, welches durch proteolytische Spaltung auch
in gelöster Form vorkommt; beide Formen sind biologisch aktiv (Idriss and Naismith, 2000). TNF
bindet an zwei verschiedene Rezeptoren: TNFR1 und TNFR2. Beide Rezeptoren besitzen die für
die
TNFR
Superfamilie
charakteristische
cysteninreiche
Domäne
(CRD)
und
bilden
selbstassemblierende Homotrimere (Chan et al., 2000). Bindet TNF an den TNFR1 so wird über
zytosolische „death Domänen“ (DD) das Adaptermolekül TRADD (T
TNFR
R associated death domain)
rekrutiert (Abbildung 1.3.). Wird dieser Komplex internalisiert, so führt die TRADD Bindung über
weitere Komplexierung mit dem Molekül FADD und der Pro-Caspase 8 zur Aktivierung der
R
Kaspase-Kaskade und zur Apoptose. Alternativ interagiert TRADD mit TRAF1 und TRAF2 (TNFR
associated factor) sowie mit RIP (rreceptor interacting protein), was andererseits zur Aktivierung
der Transkriptionsfaktoren NF-NB und AP1 führt. Durch die Einleitung der Gentranskription
werden unter anderem Apoptose-inhibierende Gene induziert. Daraus folgt, dass das TNFR1
Einleitung
14
vermittelte Signal erst bei fehlender Proteinsynthese zur Apoptose führt. Im Gegensatz zu Fas,
Fas associated
einem weiteren Mitglied der TNFR Superfamilie, welches durch Bindung an FADD (F
death domain) direkt zur Kaspasen-Aktivierung und Apoptose-Einleitung führt (Hehlgans and
Pfeffer, 2005).
Abb. 1.3 TNF/TNFR1 Signalweg. Abbildung nach Hehlgans und Pfeffer, 2005.
Der TNFR2 wird nach Bindung an den Liganden proteolytisch gespalten; zusätzlich existieren
sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre lösliche Formen des TNFR2, welche die Fähigkeit zur
Ligandenbindung ebenfalls aufweisen (Seitz et al., 2001; Hehlgans and Mannel, 2002). Der TNFR2
besitzt im Gegensatz zum TNFR1 keine zytosolische DD. Die Signalweiterleitung erfolgt hier über
ein so genanntes TRAF interagierendes Motiv (TIM), welches nach Rezeptoraktivierung TRAF
Proteine rekrutiert und zur Aktivierung von NF-kB und JNK sowie von p38, ERK und der PI3K
führt (Dempsey et al., 2003).
Der Aufbau der Immunantwort gegen Pathogene wird sehr stark von TNF und TNFR1 beeinflusst.
TNFR1 defiziente Mäuse sind hochgradig suszeptibel gegenüber Infektionen mit intrazellulär
replizierenden Pathogenen wie Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, M. avium
und Salmonella typhimurium (Pfeffer et al., 1993; Ehlers et al., 2003; Hehlgans and Pfeffer, 2005).
Bemerkenswert dabei ist, dass TNFR1 defiziente Mäuse nach der Infektion mit L. monocytogenes
die antimikrobiellen Effektorsysteme ROI und RNI funktionell generieren, diese jedoch nicht zum
Aufbau einer effektiven Immunität gegen das Pathogen ausreichen (Endres et al., 1997).
TNF trägt entscheidend sowohl zur antimikrobiellen protektiven als auch zur inflammatorischen
Immunantwort gegen M. tuberculosis bei. Dabei ist TNF essentiell zum einen bei der
Differenzierung spezifischer T-Zellen und der Induktion von Zytokinen durch T H 1 Zellen, zum
anderen bei der Entwicklung von Granulomen, in denen das mykobakterielle Wachstum inhibiert
wird (Ehlers, 2003). Weiterhin steigert TNF die Phagozytoseaktivität der Makrophagen, welche
insbesondere zusammen mit IFNJ deutlich erhöhte mykobakterizide Aktivität entwickeln (Bekker
Einleitung
15
et al., 2001). Außerdem werden durch TNF bei der Bildung von Granulomen auch Chemokine
und Adhäsionsmoleküle induziert, welche zur Rekrutierung inflammatorischer Zellen an den Ort
der Infektion führen (Roach et al., 2002).
Während durch Studien mit TNFR1 defizienten Mäusen wichtige biologische Funktionen der
TNF Antwort bei parasitären Infektionen, wie Leishmania major, Trypanosoma cruzi und
Toxoplasma gondii gezeigt werden konnte, konnten bei TNFR2 defizienten Mäusen keine Defekte
nach T. gondii Infektion gefunden werden (Hehlgans and Pfeffer, 2005). Eine Studie konnte
allerdings eine Rolle des TNFR2 in humanen unreifen dendritischen Zellen während des Aufbaus
einer Toxoplasmostase belegen (Giese et al., 2004).
Ein sehr bedeutender Effekt von TNF ist die systemische endotoxische Aktivität, welche zu
Fieber, Hypotension und Schock führen kann. TNF ist durch seine Fähigkeit die Expression von
proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen, Adhesionsmolekülen und Wachstumsfaktoren zu
induzieren, ein zentraler inflammatorischer Mediator. Diese potenten Effekte sind allerdings auch
für Krankheitsbilder, wie Sepsis, chronische Polyathritis und den Morbus Chron verantwortlich;
dabei weist die Sepsis nach wie vor eine hohe Mortalitätsrate auf (Hehlgans and Pfeffer, 2005).
1.3 Antimikrobielle und antivirale Effektorsysteme
1.3.1 Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffintermediate
Neben zytotoxischen T-Zellen gelten Makrophagen als die wichtigsten zellulären Effektoren der
angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Pathogene. Dabei werden die Makrophagen
primär durch einen IFNJ Stimulus aktiviert, woraufhin durch die Induktion einer Vielzahl von
Genen weitreichende biochemische Veränderungen ablaufen. So wird die Antigenpräsentation,
Phagozytoserate und die Responsivität auf weitere Zytokine, wie TNF, erhöht. Diese Aktivierung
geschieht durch proinflammatorische Zytokine, ausgeschüttet von aktivierten T H 1 Zellen. In den
aktivierten Makrophagen fusionieren nun die Lysosomen effektiver mit den Phagosomen. wobei
letztere intrazelluläre oder kurz zuvor aufgenommene extrazelluläre Mikroben somit mit einer
Vielzahl an bakteriziden lysosomalen Enzymen in Kontakt bringen. Aktivierte Makrophagen
bilden darüber hinaus Sauerstoffradikale (ROI, reactive oxigene intermediate) und Stickstoffintermediate (RNI, reacive nitrogen intermediate), die beide sehr effizient Keime abtöten sowie
antimikrobielle Peptide und Proteasen, die freigesetzt werden und extrazelluläre Parasiten
angreifen (Janeway, Jr. et al., 2005). ROI werden durch eine spezielle NADPH Oxidase gebildet.
Diese Phagozyten-Oxidase (Phox) stellt Zwischenschritte bei der Reduktion von molekularem
Sauerstoff zu Wasser her. Unter RNI versteht man verschiedene Oxidationsstufen von
Stickstoffprodukten, welche durch die katalytische Wirkung der induzierbaren NO Synthase
(iNOS= NOS2) entstehen (Nathan and Shiloh, 2000). Die Produktion von ROI und RNI durch die
Enzyme Phox und iNOS sind in Abbildung 1.4 schematisch zusammengefasst.
Einleitung
16
Abb. 1.4: ROI und RNI Produktion durch die Enzyme Phox und iNOS in mammalischen Zellen, entnommen Nathan und
Shiloh 2000.
ROI und RNI gelten als chemisch hoch reaktive Moleküle, die zum einen zur Zerstörung von
Nukleinsäuren sowie zu einer Vielzahl von chemischen Verbindungen führen. Dabei gelten sie
aufgrund dieser Eigenschaften in der Maus als die wichtigsten antimikrobiellen Effektorsysteme.
Zum anderen sind sie allerdings durch ihre hohe Reaktivität an der lokalen Zerstörung des
Gewebes beteiligt, daher wird ihre Aktivität erst im Rahmen der Immunantwort freigesetzt und
nicht konstitutiv. Die gewebezerstörende Wirkung erlaubt jedoch die Bekämpfung größerer
parasitärer Organismen wie Würmer, die nicht phagozytiert werden können (Nathan and Shiloh,
2000; Janeway, Jr. et al., 2005). Interessanterweise verfügen einige Pathogene auch über Enzyme,
die einen Teil der reaktiven Substanzen unschädlich machen können. So ist der einzellige Parasit
Trypanosoma cruzi in der Lage, Sauerstoffintermediate über eine eigene Superoxiddismutase zu
neutralisieren (Temperton et al., 1996); ebenso neutralisiert Staphylococcus aureus über eine
Katalase Wasserstoffperoxid (Mandell, 1975).
1.3.2 Antimikrobielle Peptide (AMPs)
Antimikrobielle Peptide sind weitverbreitete Effektormoleküle im Tier- und Pflanzenreich. Sie
übernehmen vor allem in der angeborenen Immunität weitreichende Aufgaben. Man findet sie
sowohl in Protozoen, Prokaryoten, Pflanzen, als auch in Invertebraten und Vertebraten. Bei
Säugetieren sind vor allem zwei Gruppen von AMPs vorzufinden: die Defensine und die
Cathelicidine. Defensine werden vor allem von Epithelzellen und Phagozyten produziert und
liegen dort oft in hohen Konzentrationen vor (Ganz et al., 1985; Selsted et al., 1985). Cathelicidine
sind strukturell zu den Defensinen unterschiedliche AMPs, in Verteilung und Häufigkeit sind
diese den Defensinen sehr ähnlich (Zanetti et al., 1995; Lehrer and Ganz, 2002). Andere in
Säugetieren vorzufindende AMPs, wie die Histatine (Histidinreiche Peptide) (Tsai and Bobek,
1998), Dermicidine (Schittek et al., 2001) und „anionische Peptide“ (Brogden et al., 1997) sind
beschränkt auf einige Tierarten und Gewebe.
Typisch für die Klasse der Defensine ist ihr kationischer Charakter, sie sind reich an Cysteinen,
zeichnen sich durch eine E-Faltblattstruktur aus, wobei sie ihre Stabilität durch drei
intramolekulare Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten erlangen. Säugetierdefensine sind
Einleitung
17
klassifiziert in drei Unterfamilien: die D-, E- und T-Defensine, welche durch die Anordnung der
Disulfidbrücken zwischen den sechs Cysteinen unterschieden werden. Die Disulfidbrücken der DDefensine liegen zwischen dem 1. und 6. Cystein (Cys1-Cys6), Cys2-Cys4, sowie Cys3 und Cys5, die
der E-Defensine liegen zwischen Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 und Cys3-Cys6. Im Gegensatz dazu zeigen
die T-Defensine eine zirkuläre Struktur, bei der die Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen Cys1Cys6, Cys2-Cys5 und Cys3-Cys4 liegen.
human neutrophile peptide) sowie
Im Menschen sind 6 D-Defensine bekannt, HNP1, 2, 3 und 4 (h
Defensin 5, bzw. 6). Die HNPs werden dabei hauptsächlich in
HD5 und 6 (humanes D-D
Neutrophilen konstitutiv exprimiert, wobei die Synthese schon in Vorläuferzellen des
Knochenmarks stattfindet und die reifen Peptide in den Granula der Neutrophilen gespeichert
werden. Im Gegensatz dazu wird HD5 als Propeptid vor allem von Panethzellen des Dünndarms
konstitutiv exprimiert und erst nach der Sekretion extrazellulär durch Trypsin prozessiert (Ghosh
et al., 2002). In der Maus sind die D-Defensine als Cryptidine bekannt und werden dabei nicht von
Neutrophilen synthetisiert, sondern kommen in verschiedenen Epithelzellen und hauptsächlich
den Panethzellen vor (Eisenhauer and Lehrer, 1992; Shirafuji et al., 1999). Es konnten bisher 28
humane E-Defensine durch Genbankanalysen identifiziert werden, wobei 6 humane E-Defensine
(HBD1 bis 6) beschrieben werden, die hauptsächlich von Epithelzellen exprimiert werden. Dabei
wird HBD1 konstitutiv in Epithelzellen exprimiert, wohingegen für HBD2 und 3 die Induktion
durch virale Bestandteile, Bakterien und mikrobielle Produkte – wie Endotoxin – sowie
proinflammatorische Zytokine – wie beispielsweise TNF und Interleukin-1E (IL-1E) –
beschrieben wurde (Yang et al., 2001; Duits et al., 2003; Sorensen et al., 2005). In der Maus
konnten bisher mindestens 4 E-Defensine beschrieben werden, welche vor allem von
Epithelzellen exprimiert werden (Bals et al., 1998; Com et al., 2003). Die Defensine werden
grundsätzlich als Pre-Pro-Peptide synthetisiert, d.h. sie besitzen eine N-terminale Signalsequenz
(ca.19 AS), die kotranslational am rauhen Endoplasmatischem Retikulum abgeschnitten wird, ein
mitleres Propeptid (ca. 45 AS), die dem reifen Peptid fehlt, und ein C-terminales kationisches
Peptid (bis 30 AS), welches das reife Defensin nach Prozessierung darstellt (Daher et al., 1988;
Valore and Ganz, 1992).
Die Aktivität der Defensine in der Infektionsabwehr ist divers. So weisen die meisten Defensine
vor allem eine antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien und Pilze auf. Einige Viren mit
Hüllmembran werden außerdem durch Defensine inaktiviert. So wird HNP für die CD8+ T-Zellen
vermittelte antivirale Aktivität gegen HIV in Menschen verantwortlich gemacht, die auch nach
langer Zeit als Träger des Virus keine Symptome der Krankheit aufweisen (non-progressor). Dabei
ist nicht abschließend geklärt, wie die Sezernierung von Defensinen durch CD8+ T-Zellen
induziert wird. Auch andere Viren, wie HSV, Papiloma-, Vaccinia- und Rhinoviren werden direkt
durch Defensine beeinflußt, indem vor allem die Replikation dieser Viren inhibiert wird
(Klotman and Chang, 2006).
Einleitung
18
Die entscheidenden Mechanismen bei der Abtötung von gramnegativen, wie grampositiven
Bakterien, liegen in der durch Defensine vermittelten Kanalbildung der Zytoplasmamembran.
Diese Kanalbildung wird durch hohe Transmembranpotentiale, einem hohem Anteil negativ
geladener Lipide, dem Fehlen von kationischen Peptiden sowie den Cholesterinen der
Bakterienmembran begünstigt. Auf diesen Membranunterschiede zu eukaryotischen Zellen
beruht die Selektivität der Defensine gegen Bakterien. In Bakterien wird nach Permeabilisierung
vor allem die RNS-, DNS- und Protein- Synthese gehemmt. Trotzdem wirken Defensine vor allem
lokal und in hohen Konzentrationen zytotoxisch und sind in entzündeten Geweben an der
Beschädigung der umliegenden Zellverbände beteiligt. Verschiedene Defensine zeigen zusätzlich
eine chemotaktische Wirkung auf Monozyten, T-Zellen und dendritische Zellen. Dabei binden
HBD1 und 2 den Chemokinrezeptor CCR6 von Gedächtnis-T-Zellen und unreifen dendritischen
Zellen, während HNP1, 2 und 3 chemotaktisch auf Monozyten, naive T-Zellen und auch unreife
dendritische Zellen wirken, ohne dass die hierfür verantwortlichen Rezeptoren bisher
identifiziert werden konnten. Eine weitere außergewöhnliche Wirkung konnte für das murine EDefensin 2 beschrieben werden. In Verbindung mit Tumorantigen wirkt es als Adjuvant.
Wenngleich diese Funktion über TLR4 vermittelt wird, ist der zugrundeliegende Mechanismus
der Adjuvantswirkung bisher ungeklärt. Einige weitere Defensine binden in vitro an den Rezeptor
für das adrenocorticotrophe Hormon (ACTH), ohne den Rezeptor dabei zu aktivieren. ACTH
wirkt immunsupprimierend und die kompetitive Hemmung durch Defensine könnte die
Immunantwort und Inflammation lokal verstärken.
Die Cathelicidine sind eine heterogene Familie von kationischen AMPs, welche über eine lineare
alphahelikale Sekundärstruktur charakterisiert sind. Die AS Sequenzen der Cathelicidine weisen
grundsätzlich eine N-terminale Signalsequenz auf, ein mittleres Segment – auch Cathelin-Domäne
genannt – und eine C-terminale Domäne, welche nach Prozessierung des Proteins das antimikrobielle Peptid darstellt. Beim Menschen ist ein Cathelicidin bekannt, hCAT-18, welches auch
als LL-37 bezeichnet wird, da das reife Peptid aus 37 AS besteht, beginnend mit zwei
aufeinanderfolgenden Leucinen. In der Maus ist das Cathelicidin CRAMP sowie CAT-18 bekannt.
Grundsätzlich werden Cathelicidine von zirkulierenden Neutrophilen synthetisiert, aber auch in
der Zunge, der Submucosa der Atemwege sowie den Geschlechtsorganen, wo sie als
Abwehrbarriere fungieren (Malm et al, 2000). Zusätzlich zu ihrer antibiotischen Funktion, sind
die alpha-helikalen Cathelicidine in der Lage, Pilze und einige Hefen effizient abzutöten. Das
humane Cathelicidin LL-37 neutralisiert darüber hinaus auch Endotoxine diverser Bakterien.
Zusammenfassend kann man sagen, dass dem Organismus über das breite Spektrum an AMPs eine
weitreichende erste Abwehr gegen mikrobielle Erreger zur Verfügung steht, von denen die hier
genannten nur einen kleinen Ausschnitt der bekannten und wohl noch unbekannten AMPs
darstellen. Daher werden in den nächsten Jahren durch weitere Forschung sicherlich noch
zahlreiche AMPs in den diversen Spezies identifiziert und charakterisiert werden, wobei ein
speziesübergreifender gezielter Einsatz gegen bestimmte Errgeger ein angestrebtes Ziel sein kann.
Einleitung
19
1.3.3 Die Familie der Interferon induzierten GTPasen
Die Guanosin 5` Triphosphat bindenden Proteine (GTPasen) sind eine große Proteinfamilie. Sie
sind in der Lage GTP zu binden und zu hydrolisieren. GTPasen spielen eine zentrale Rolle in
verschiedenen zellulären Bereichen, wie der Proteinbiosynthese (Elongations- und InitiationsFaktoren), der intrazellulären Signalweiterleitung (kleine Ras-verwandte Proteine, heterotrimere
G-Proteine), des vesikulären Transports (Rab/Ypt1), der Kontrolle des Wachstums und der
Differenzierung der Zelle (Ras) und der rezeptorvermittelten Endozytose (Dynamine) (Bourne et
al., 1990).
Durch das bereits beschriebene Zytokin IFNJ werden neben den bekannten antimikrobiellen
Proteinen, wie der induzierbaren NO-Synthase (iNOS), der Phagozyten Oxidase (Phox), dem
„natural-resistance associated macrophage protein“ (NRAMP), der RNA-abhängigen ProteinKinase (PKR) und der Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO), vor allem eine Gruppe von Proteinen
hochreguliert, welche in die GTPasen-Familie einzuordenen ist. Die Interferon induzierbaren
GTPasen umfassen die p47 GTPasen, die p65 GBPs (Guanylate binding proteins), die Mx Proteine
und die VLIGs (very large inducible GTPases) (Gupta et al., 1979; Haller et al., 1979; Klamp et al.,
2003; Martens and Howard, 2006). Aufgrund von Sequenzhomologien werden die GBPs und die
Mx-Proteine zur Superfamilie der Dynamine gezählt (Praefcke and McMahon, 2004). Daher soll
kurz auf die Struktur dieser Proteinfamilie eingegangen werden. Die Klasse der Dynamine ist an
Prozessen wie Membranfusionen, Vesikelabschnürungen, Vesikeltransportvorgängen sowie der
Teilung der Zelle und von Zellorganellen beteiligt (Praefcke and McMahon, 2004). Dabei
zeichnen sie sich durch ein Molekulargewicht von durchschnittlich 100 kDa aus und werden
daher auch als große GTPasen bezeichnet, um sie von den kleinen Ras-ähnlichen und anderen
regulatorischen GTPasen, wie den D-Unterheinheiten der heterotrimeren G-Proteine, zu
unterscheiden. Die Struktur der Dynamine ist charakterisiert durch eine konservierte N-terminale
G-Domäne, eine wenig konservierte mittlere Domäne, die eine wichtige Rolle bei der
Selbstassemblierung dieser Proteine spielt, eine PH Domäne (Pleckstrin Homology), welche für
das Membrantargeting verantwortlich ist, eine konservierte GTPase Effektor Domäne (GED)
sowie eine C-terminale prolinreiche Domäne (PRD), die der Interaktion mit anderen Proteinen
dient (Praefcke and McMahon, 2004). Ein Vergleich der Proteindomänen von Mitgliedern der
Dynamin Superfamilie ist in Abbildung 1.5 dargestellt.
Die Mitglieder der Dynamin Superfamilie weisen gemeinsame biochemische Eigenschaften auf:
sie binden Nukleotide mit einer geringen Affinität im PM Konzentrationsbereich, im Gegensatz
zu den kleinen GTPasen der Ras Familie, die Nukleotide mit einer deutlich höheren Affinität
binden. Des Weiteren weisen die Dynamine eine hohe Hydrolyserate und eine Tendenz zur
Selbstassemblierung und Oligomerisierung auf, die zur Verstärkung der Nukleotid-Hydrolyserate
führt (Tuma and Collins, 1994).
Einleitung
20
Abb. 1.5: Die Domänenstruktur der humanen Dynamin Superfamilie, nach Praefcke und McMahon, 2004.
Die GTPase Domäne (G-Domäne) besteht aus vier GTP-bindenden Motiven (G1-G4), welche für
die GTP Bindung und Hydrolyse essentiell sind. Dabei sind diese Motive in der Familie der
GTPasen, mit Ausnahme des G4 Motivs, hoch konserviert. Das G4 Motiv ist bei den Guanylatbindenden Proteinen (GBPs) weniger konserviert (RD statt N/TKXXD). Die katalytische GTPaseAktivität wird, wie oben erwähnt, durch die Oligomerisierung begünstigt und ist von der
Interaktion der G-Domäne mit der mittleren Domäne sowie der GED abhängig (Praefcke and
McMahon, 2004). Die konservierten G-Domänen sind in Abbildung 1.6 vergleichend für einige
Vertreter der unterschiedlichen GTPasen Subfamilien zusammengestellt.
Abb. 1.6: Die GTP-Bindungs Motive der G-Domäne, nach Praefcke und McMahon, 2004.
Einleitung
21
1.3.3.1 Mx Proteine
Lindenmann und Kollegen berichteten 1963 erstmals von der Resistenz von A2G Mäusen
gegenüber Influenzaviren (Lindenmann et al., 1963). Die Resistenz gegenüber Influenza konnte
dabei auf ein dominant vererbtes Gen zurückgeführt werden und der Genlocus wurde Mx
(M
Myxxovirus) genannt. Mx wird durch Typ I Interferone induziert, da die antivirale Eigenschaft
durch die Gabe von Antikörpern gegen Typ I Interferone inhibiert wird (Haller et al., 1979). Mx
Proteine kommen in allen untersuchten Vertebraten vor; dabei sind zwei humane Mx Gene
bekannt, MxA und MxB (Staeheli and Haller, 1985) sowie zwei murine Gene Mx1 und Mx2
(Staeheli and Sutcliffe, 1988). Die Mx Gene werden hauptsächlich durch Typ I Interferone
induziert (Goetschy et al., 1989) und üben einen starken antiviralen Effekt aus; so sind Mx
negative Zellen nach stabiler Transfektion von Mx1 ohne Zugabe von Interferonen gegenüber Mx
sensitiven Viren resistent (Staeheli et al., 1986; Arnheiter and Meier, 1990). Zusätzlich sind Mx
Isoformen bekannt, wie humanes MxB und Mx3 der Ratte, welche keine antivirale Aktiviät
aufweisen, dabei scheint MxB bei der Regulation von Transportvorgängen in den Zellkern, sowie
an der Regulation des Zellzyklus beteiligt zu sein (King et al., 2004).
Die Mx Gene kodieren Proteine in der Größe von 70-80 kDa mit einer starken Homologie zu den
Dynaminen, vor allem in der N-terminalen G-Domäne. Die C-terminale GED Domäne beinhaltet
einen Mx-spezifischen Lysinreichen Bereich (Leucin-Zipper), wohingegen die PH Domäne sowie
die prolinreiche Domäne der Dynamine hier fehlen. Weitere biochemische Eigenschaften, wie die
Ausbildung von Oligomeren, die Selbstassemblierung und die hohe Rate an intrinsischer GTPaseAktivität sind den Mx-Proteinen und den Dynaminen gemein (s.o.).
In Interferon stimulierten Zellen lokalisieren humanes MxA Protein und murines Mx2 Protein in
granulären Strukturen im Zytoplasma, während nach Überexpression MxA mehr vesikuläre
Strukturen aufweist (Reichelt et al., 2004). Außerdem kolokalisiert MxA mit dem glatten ER in La
Cross Virus infizierten Zellen, dort wo virale Proteine akkumulieren (Reichelt et al., 2004). Das
zytoplasmatische MxA Protein verleiht eine Resistenz gegen das Influenza, Thogoto, La Cross und
Masern Virus sowie gegen VSV (vesicular stromatitis virus) (Staeheli et al., 1986; Pavlovic et al.,
1990; Schnorr et al., 1993; Hefti et al., 1999). Es konnte nachgewiesen werden, dass MxA am
glatten ER mit dem Nukleokapsidprotein (N-Protein) des La Cross Virus interagiert und dort
zusammen mit dem glatten ER-Marker Syntaxin 17 kolokalisiert. Dabei rekrutiert erst das
membranständige N-Protein das zytosolische MxA zur Membran, allerdings ist das weitere
Schicksal dieses Komplexes bisher nicht geklärt (Reichelt et al., 2004). MxA ist außerdem in der
Lage, den Transport des Nukleokapsids des Thogoto Virus in den Nukleus der Wirtszelle zu
inhibieren, was nachweislich GTP-abhängig geschieht (Kochs and Haller, 1999). Im Gegensatz zu
MxA des Menschen lokalisiert das murine Mx1 im Nukleus der Zelle, wofür eine nukleäre
Signalsequenz in der C-terminalen Proteinregion verantwortlich ist. Dort inhibiert Mx1 die
Transkription der RNS des Influenzavirus (Pavlovic et al., 1992). Humanes MxA hingegen
Einleitung
22
inhibiert die virale Replikation von Influenza in einer späteren Phase, da humanes Wt MxA nicht
im Zellkern vorliegt. Bemerkenswert dabei ist jedoch die Tatsache, dass artifiziell in den Zellkern
eingeschleußtes MxA sich wie Mx1 verhält und die primäre Transkription der viralen (Influenza)
RNS blockiert, während vice versa Mx1 im Zytoplasma zu keiner Inhibition der viralen Infektion
befähigt ist (Zurcher et al., 1992a; Zurcher et al., 1992b). Die Lokalisation der Mx Proteine gibt
daher einen Hinweis auf den Ort der antiviralen Aktivität. Des Weiteren hängt die antivirale
Aktivität der Mx Proteine von einer funktionellen G-Domäne ab. Dabei konnte für MxA gezeigt
werden, dass die Interaktion mit dem Thogoto Virus GTP-bindungsabhängig ist. Der C-terminale
Leucin-Zipper ist zusätzlich essentiell für die antivirale Eigenschaft und scheint außerdem, da in
diesem Bereich die größten Sequenzunterschiede der Mx Proteine untereinander liegen, für die
virale Spezifität der Mx-Proteine verantwortlich zu sein (Zurcher et al., 1992a; Johannes et al.,
1997; Ko et al., 2004).
1.3.3.2 p47 GTPasen, IRGs
Die p47 GTPasen, auch IRG (iimmunity-rrelated GTPases) genannt, sind eine Unterfamilie der
GTPasen, welche bis auf wenige Ausnahmen stark durch IFNJ induziert werden. Die IRG
Proteine besitzen typischerweise ein Molekulargewicht von 47 kDa mit einer kanonischen GDomäne, die ca. 80 AS vom N-Terminus entfernt vorliegt. Die AS Sequenz wird bei den
bekannten IRGs, mit Ausnahme einer Subgruppe in Knochenfischen, durch ein einzelnes langes
Exon kodiert (Bekpen et al., 2005). In der Maus sind bisher 23 IRG Gene bekannt, wobei 4 als
Pseudogene beschrieben wurden. Die Gene liegen dabei geclustert auf den Chromosomen 11 und
18, mit Ausnahme von Irgc (CINEMA), das auf Chromosom 7 lokalisiert ist (Bourne et al., 1990;
Bourne et al., 1991). Drei Maus IRG Proteine haben eine nichtkanonische Sequenz in der G1Domäne: GX 4 GMS anstatt der konservierten Sequenz: GX 4 GKS. Daher werden 2 Subfamilien
klassifiziert: die GMS und die GKS IRGs (Boehm et al., 1998). Im Menschen existiert nur ein zu
den IRGs homologes Gen, welches nicht durch IFNJ induzierbar ist (Bekpen et al., 2005). IRGs
sind bei Vertebraten weit verbreitet, nur in der Linie der Primaten fehlen sie weitgehend. Die
biochemische Beschreibung der IRGs beschränkt sich bis zum heutigen Zeitpunkt auf
Untersuchungen zu Irga6 (IIGP) (Uthaiah et al., 2003). Dabei bindet Irga6, wie die Dynamine,
Nukleotide im PM Bereich und weist eine GTP-abhängige Oligomerisierung sowie eine
kooperative GTPase Aktivität auf.
IFNJ ist der Hauptinduktor der Expression der IRGs; obwohl z.T. auch Typ I Interferone sowie
LPS ebenfalls die Expression induzieren können, wird dies auf eine sekundär induzierte IFNJ
Produktion zurückgeführt (Zerrahn et al., 2002; Lapaque et al., 2006). Zur Expression der Proteine
sind Immunzellen sowie nicht-Immunzellen – wie Fibroblasten – befähigt (Boehm et al., 1998).
Die Generierung von IRG defizienten Mauslinien konnte eine signifikante Bedeutung der
einzelnen p47 GTPasen in der Pathogenabwehr aufdecken. So sind Irgm1 (LRG47) defiziente
Mäuse suszeptibel gegenüber Infektionen mit T. gondii, L. major, T. cruzi, M. tuberculosis, M.
Einleitung
23
avium, L. monocytogenes und S. typhimurium. Irgm3 (IGTP) defiziente Mäuse, welche mit
denselben Pathogenen infiziert wurden, zeigten jedoch nur eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber
L. major und T. gondii. Auch Irgd (IRG47) defiziente Mäuse sind unterschiedlich suszeptibel; so
sind sie resistent gegenüber Infektionen mit M. tuberculosis, L. monocytogenes und S.
typhimurium, wohingegen sie suszeptibel nach Infektion mit T. gondii sind (Taylor et al., 2004;
MacMicking, 2005; Martens and Howard, 2006). Somit scheinen die IRGs essentielle nichtredundante Proteine in der Abwehr gegen die untersuchten Pathogene in der Maus zu sein. In der
antiviralen Immunität spielen die IRGs anscheinend nur eine untergeordnete Rolle. So wurde
bislang nur in Irgb6 (TGTP) und Irgm2 (GTPI) überexprimierenden Zellen eine leicht erhöhte
antivirale Wirkung gegen VSV oder Coxsackie Virus beobachtet (Carlow et al., 1998; Zhang et al.,
2003). Gendefiziente Mäuse, Irgd-/-, Irgm1-/- und Irgm3-/-, weisen nach Infektion mit dem murinen
Cytomegalovirus (MCMV) eine normale Resistenz gegen die virale Infektion auf (Taylor et al.,
2004).
Die IRG Proteine lokalisieren intrazellulär überwiegend membranassoziiert (Golgi, ER), sind aber
auch im Zytosol unterschiedlich stark vorzufinden (Martens et al., 2004; Martens and Howard,
2006). Weitere Studien haben die subzelluläre Lokalisation der IRGs nach Infektion mit
intrazellulären Pathogenen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass manche IRGs von
ihren ursprünglichen Zielorten nach Infektion mit T. gondii rasch die pathogenhaltigen Vakuolen
erreichten. Alle IRGs, außer Irgm1, gelangten so in Astrozyten, embryonalen Fibroblasten oder
3T3 Zellen, nach Präinkubation mit IFNJ, zur parasitophoren Vakuole (PV) von T. gondii,
während Irgm1 anscheinend in der Lage ist, zu mykobakterienhaltigen Phagosomen in IFNJ
präinkubierten Makrophagen zu translozieren (MacMicking, 2005; Martens et al., 2005). Diese
Kolokalisation korreliert mit den Ergebnissen der Irgm1 defizienten Mauslinie, da Irgm1
defizienten Mäuse eine verringerte und verzögerte Azidifizierung der mykobakterienhaltigen
Phagosomen aufweisen (MacMicking et al., 2003). Bemerkenswert dabei ist, dass Irgm1 nicht zur
PV von T. gondii transloziert, obwohl Irgm1 defiziente Mäuse suszeptibel gegenüber T. gondii
sind. Die IRG vermittelten Resistenzen gegen T. gondii können daher womöglich nicht durch
einen einzelnen Effektormechanismus erklärt werden. Für die GMS-Subgruppe der IRG-Proteine,
zu denen Irgm1 gehört, wird daher diskutiert, dass sie eine Rolle bei der korrekten subzellulären
Lokalisation der weiteren p47 GTPasen zur PV von T. gondii ausüben (Martens and Howard,
2006).
Einleitung
24
1.3.3.3 p65 Guanylat-bindende Proteine
Die 65 bis 67 kDa GBPs wurden schon früh als IFNJ induzierte Proteine mit einer Größe von 44
bis 68 kDa in humanen Fibroblasten identifiziert (Gupta et al., 1979). Sie besitzen die
ungewöhnliche Eigenschaft, GTP-, GDP- sowie GMP-Agarose mit ähnlicher Affinität zu binden,
weswegen diese Proteine Guanylat-bindende Proteine (GBP, guanylate binding proteins) genannt
wurden (Cheng et al., 1983; Cheng et al., 1985). Später konnte gezeigt werden, dass diese Proteine
in der Lage sind, nicht nur GTP zu GDP sondern, im Gegensatz zu den anderen bekannten
GTPasen, auch zu GMP zu hydrolysieren (Schwemmle and Staeheli, 1994; Neun et al., 1996;
Praefcke et al., 1999).
Zahlreiche zu GBP homologe Gene wurden seit dem in verschiedenen Spezies identifiziert. Mit
diesen Studien wurde klar, dass es sich bei den GBPs um eine konservierte Genfamilie handelt.
Bisher konnten GBPs beim Menschen, bei der Maus, bei der Ratte und beim Huhn gefunden
werden. Im Menschen sind sieben GBPs und ein Pseudo GBP bekannt, die in einem Gencluster
auf dem Chromosom 1 liegen (Olszewski et al., 2006). In der Maus existieren mindestens elf GBPs
und zwei Pseudogene, die jeweils in Clustern auf Chromosom 3 (gbp1, gbp2, gbp3, gbp5, gbp7,
pseudo gbp1) bzw. Chromosom 5 (gbp4, gbp6, gbp8, gbp9, gbp10, gbp11, pseudo gbp2) angeordnet
sind (Abbildung 1.7) (Degrandi et al., 2007; Kresse et al., 2008). Alle murinen GBPs zeichnen sich
dabei durch eine sehr starke Homologie der Genesequenzen in den Exon- und Intronstrukturen
aus; die murinen GBPs sind höchstwahrscheinlich durch Genduplikationen entstanden (Degrandi
et al., 2007; Kresse et al., 2008).
Abb. 1.7: Phylogenetischer Baum der murinen GBP-Familie. Abbildung nach Degrandi et al. 2007.
Einleitung
25
Die Domänenstruktur der GBPs weist eine Dynamin-typische große G-Domäne, eine
Mitteldomäne und eine GTPase Effektordomäne auf (Abbildung 1.5). Dabei ist ihre
Hydrolyseaktivität oligomerisierungsabhängig (Praefcke and McMahon, 2004). Die GBP
Familienmitglieder von Mensch und Maus weisen eine hohe Homologie in der N-terminalen GDomäne mit den kanonischen GTP-Bindemotiven G1-G3 auf und besitzen das nicht-kanonischen
G4 Motiv RD (Abbildung 1.6). Daneben zeichnen sich einige GBPs (hGBP1, hGBP2, hGBP5,
mGBP1, mGBP2, mGBP5) durch ein C-terminales CaaX Motiv aus, welches als Signal der
posttranslationalen Isoprenylierung dient (Stickney and Buss, 2000). Es konnte dazu gezeigt
werden, dass isoprenyliertes mGBP2 in vesikelartigen oder granulären Strukturen innerhalb des
Zytosols vorliegt, während mutiertes mGBP2, welches nicht mehr isoprenyliert werden kann,
diese typische subzelluläre Verteilung verliert (Vestal et al., 2000). Allerdings konnten die
mGBP2-haltigen vesikelartigen Strukturen bisher nicht näher charakterisiert werden.
Die murinen GBPs (mGBP1-5) werden durch Typ I und Typ II Interferone in vielen Zelltypen
induziert. Dabei gehören einige Mitglieder der mGBPs zu den am höchsten IFNJ induzierbaren
Proteinen in murinen Makrophagen (Boehm et al., 1998). Auch LPS führt zu einer transienten
Induktion von mGBP1-5 (Nguyen et al., 2002). Das humane GBP1-Protein zeigt außerdem eine
deutliche Induzierbarkeit durch IL-1D, IL-1E und TNF (Guenzi et al., 2001; Lubeseder-Martellato
et al., 2002).
Die biologische Funktion der GBPs ist bisher noch nicht ausreichend geklärt. Es konnte zum
jetzigen Zeitpunkt gezeigt werden, dass hGBP1 sowie mGBP2 regulierende Funktionen auf das
Zellwachstum ausüben (Guenzi et al., 2001; Gorbacheva et al., 2002). In humanen Endothelzellen,
die retroviral hGBP1 überexprimieren, wird die Zellproliferation inhibiert. Dabei ist die
Hemmung der Proliferation unabhängig von der GTPase-Aktivität oder der posttranslationalen
Modifikation von hGBP1 (Guenzi et al., 2003). Die Überexpression von mGBP2 in NIH 3T3
Fibroblasten
führt
hingegen
zur
Verstärkung
des
Zellwachstums.
Dabei
ist
diese
Zellproliferationssteigerung abhängig von der intakten GTP-Bindestelle (Gorbacheva et al., 2002).
Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine hGBP1 Expression in Endothelzellen die Expression
von Matrix Metalloproteinase 1 (MMP-1) negativ reguliert und somit zur verringerten Invasion
der Endothelzellen in die Matrix führt (Guenzi et al., 2003). Bei diesem Effekt ist die GTPaseAktivität von hGBP1 essentiell, im Gegensatz zu der o.g. Inhibierung der Zellproliferation.
In zwei weiteren Studien wurde ein hemmender Einfluß von hGBP1 sowie mGBP2 auf die virale
Replikation gezeigt. Dabei wurde die Vermehrung des Vesicular Stomatitis Virus (VSV) und des
Encephalomyocarditis Virus (EMCV) durch die Überexpression von hGBP1 in HeLa-Zellen bzw.
von mGBP2 in NIH 3T3 Fibroblasten inhibiert (Anderson et al., 1999; Carter et al., 2005).
Trotz der bemerkenswert starken Responsivität der GBPs auf proinflammatorische Zytokine ist
ihre Rolle in der Infektionsabwehr gegen mikrobielle Pathogene bisher wenig untersucht.
Einleitung
26
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Die proinflammatorischen Zytokine IFNJ und TNF spielen bei der antimikrobiellen
Immunabwehr eine zentrale Rolle. Durch diese Zytokine wird eine große Anzahl von Genen in
Makrophagen induziert, womit antimikrobielle Abwehrmechanismen, z.B. ROI und RNI, gegen
intrazelluläre Pathogene der Zelle zur Verfügung stehen. Studien konnten belegen, dass TNFR1
defiziente Mäuse eine normale Aktivität der Enzyme ROI und RNI aufweisen und auch die
Produktion von IFNJ und anderer bekannter proinflammatorischer Zytokine weitgehend normal
ist. Trotzdem sind diese gen-defizienten Mäuse hochgradig suszeptibel gegenüber Infektionen mit
dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes (Pfeffer et al., 1993; Endres et al., 1997).
Diese Ergebnisse belegen deutlich, dass es weitere durch IFNJ und TNF induzierte, bisher noch
nicht bekannte bzw. charakterisierte Mechanismen existieren, die zu einer effektiven
antimikrobiellen Aktivität des Wirts beitragen.
Durch vorangegangene Microarray Transkriptomanalysen (Degrandi, 2007) bei denen Ana-1
Makrophagen mit IFNJ oder TNF, sowie einer Kombination von IFNJ/TNF stimuliert wurden,
konnten zwei Genfamilie als hochgradig IFNJreguliert identifiziert werden. Dabei handelt es
sich um die sogenannten IRGs und murinen 65 kDa Guanylat-bindenden Proteine (GBPs). Im
Rahmen von Transkriptomanalysen wurden drei neue Mitglieder der mGBP Familie identifiziert,
dabei handelt es sich um mGBP6, mGBP7 und mGBP8 (Degrandi et al., 2007). Weitere
Familienmitglieder, mGBP9 und 10, konnten zusätzlich durch in silico Analysen identifiziert
werden (Kresse et al., 2008). Das Hauptaugenmerk in der hier vorgelegten Arbeit lag auf der
Charakterisierung der neuen Mitglieder der GBP Familie anhand ihrer Expression in vitro unter
proinflammatorischen Bedingungen und in vivo während einer Infektion. Anhand eines bisher
nicht beschriebenen Familienmitgliedes - mGBP7 - sollte das subzelluläre Verhalten während
Infektionen mit intrazellulären Erregern mikroskopisch analysiert werden.
Ein weiteres durch IFNJ und TNF induziertes Gen war das nur als EST in der Datenbank
vorhandene und noch nicht näher beschriebene Gen AW112010/SSPII. Auch dieses Transkript
sollte im Rahmen dieser Arbeit näher durch in silico Charakterisierung und durch seine
Eigenschaften in vivo und in vitro untersucht werden. Das Verhalten des translatierten Proteins
sollte mikroskopisch und funktionell untersucht werden. Ein weiteres Ziel war die Generierung
einer AW112010/SSPII „knock out“ Maus, um die Rolle des Gens im Verlauf von Infektionen in
vivo studieren zu können.
Material und Methoden
27
2 Material und Methoden
2.1 Bezugsquellennachweis
2.1.1 Chemikalien
Chemikalie
Bezugsquelle
Aceton
Agarose
Ampicillin Natriumsalz
Bactoagar
BES
-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
BSA (Rinderserumalbumin)
Caseinhydrolysat
Chloroform
CpG ODN 1668
Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail
DAPI
DesoxyriboNucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
Dextransulfat
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Dinatriumhydrogenphosphat
Dithiothreitol (DTT)
DMEM Medium
DMSO
ECL
EDTA
EGTA
Essigsäure (Eisessig)
Ethanol
Ethidiumbromid
ExpressHyb Hybridisierungslösung
Ficoll• 400
FKS (Fötales Kälberserum)
FKS (Fötales Kälberserum) low Endotoxin
Merck, Darmstadt
Biozym, Hamburg
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
BD Biosciences, Heidelberg
Roth, Karlsruhe
Gibco, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
TIB MolBiol, Berlin
Roche, Mannheim
Invitrogen, Karlsruhe
MBI Fermentas, St.Leon-Rot
Amersham Biosciences, Braunschweig
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Invitrogen, Karlsruhe
Gibco, Eggenstein
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
GE Healthcare, München
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
BD Biosciences, Heidelberg
Amersham, Braunschweig
PAN-Biotech GmbH, Aidenbach
Cambrex Corporation, East Rutherford,
NJ, USA
SouthernBiotech, Birmingham, USA
Roth, Karlsruhe
Syntex, Aachen
Gibco, Eggenstein
Gibco, Eggenstein
Merck, Darmstadt
BD Biosciences, Heidelberg
Gibco, Karlsruhe
BioWhittaker, Lonza, Belgien
Fluoromount-G
Formaldehyd
Gancyclovir (Cymeven)
Geneticin (G418)
Gentamycin
Glyzerin
Hefeextrakt
HEPES
IMDM Medium
Material und Methoden
Isoamylalkohol
Isopropanol
LB-Agar
LB-Medium
LTA (Listeria monocytogenes, ATCC 43251)
L-Glutamin
LPS E. coli 055:B5
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
Kanamycin
Magnesiumchlorid
Marker 1kb DNS-Leiter
MassRulerTM DNS-Leiter
Methylenblau
mIFN-E
mIFN-J
mIL1-E
mIL-2
mIL-4
mTNF-D
Milchpulver
Mineralöl
Mitomycin C
NP-40 (IGEPAL)
Natriumacetat
Natriumchlorid
Natriumcitrat
Natriumdihydrogenphosphat
Natriumhydroxid
NuPage Transfer Buffer (20x)
Orange G
Paraformaldehyd
Penicillin/Streptomycin
Phenol Rotipuran®
Phosphate Buffer Saline (PBS)
poly (I:C)
Protease Inhibitor Cocktail
Proteinmarker, High-Range Rainbow
Proteinmarker, Low-Range Rainbow
RPMI Medium
Salzsäure (HCL)
Saponin
Sarkosyl
SDS (Natriumdodecylsulfat)
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Triton X-100
TRIzol Reagenz
28
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Thomas Hartung, Lehrstuhl für
Biochemische Pharmakologie,
Universität Konstanz
Biochrom, Berlin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Invitrogen, Karlsruhe
MBI Fermentas, St.Leon-Rot
Merck, Darmstadt
R&D Systems, Mainz
R&D Systems, Mainz
R&D Systems, Mainz
R&D Systems, Mainz
R&D Systems, Mainz
R&D Systems, Mainz
Oxoid, Hampshire, England
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Invitrogen, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Biochrom, Berlin
Roth, Karlsruhe
Gibco, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
GE Healthcare, München
GE Healthcare, München
Biochrom, Berlin
Merck, Darmstadt
Calbiochem-Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Invitrogen, Karlsruhe
Material und Methoden
Trypanblau
Tween-20
Trypsin/EDTA
Ultrapure H 2 O
VLE RPMI-CLICKS 1640 Medium
Ziegenserum
29
Serva, Heidelberg
Merck, Darmstadt
Gibco, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Biochrom, Berlin
DaKoCytomation, Hamburg
2.1.2 Antikörper/-seren
Antikörper/-seren
Anti-E-Aktin
Anti-IRF-1 (M-20)
Anti-Tetra-His
Anti-Listeria monocytogenes
Anti-Toxoplasma gondii [TP3]
CyTM2 Goat Anti-Mouse IgG + IgM
CyTM2 Goat Anti-Rabbit IgG
CyTM3 Goat Anti-Mouse IgG
CyTM3 Goat Anti-Rabbit IgG
Goat Anti-Rabbit IgG POX
Goat Anti-Mouse POX
Anti-mGBP2 (EVNGKPVTSDEYLEHC)
Anti-mGBP7 (CGGKSSMNTNSDKVRK)
Anti-SSPII (TLETSSGKSHPLGRS)
Bezugsquelle
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Santa Cruz Biotechnology, California, USA
Qiagen, Hilden
BioTrend Chemikalien GmbH, Köln
Abcam, Cambridge, UK
Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK
Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK
Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK
Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK
Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK
BD Biosciences, Heidelberg
Eurogentec, Belgien
Eurogentec, Belgien
Eurogentec, Belgien
2.1.3 Enzyme
Enzym
Bezugsquelle
Alkalische Phosphatase
DNS High Fidelity Polymerase
DNS T4 Ligase
NEB, Frankfurt a. M.
Roche, Mannheim
NEB, Frankfurt a. M.
MBI Fermentas, St.Leon-Rot
Invitrogen, Karlsruhe
TaKaRa, Shiga, Japan
Roche, Mannheim
Stratagene, Texas, USA
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
NEB, Frankfurt a. M.
Roche, Mannheim
MBI Fermentas, St.Leon-Rot
Roche, Mannheim
Invitrogen, Karlsruhe
GE Healthcare, München
DNS Polymerase, AccuPrimeTM Pfx
DNS Polymerase, Bca
DNS Polymerase, Expand High Fidelity
DNS Polymerase, Native Pfu
DNS Taq-Polymerase
M-MLV Reverse Transkriptase
Proteinase K
Restriktionsenzyme
RNAse, DNAse frei
RNAse out
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)
Material und Methoden
30
2.1.4 Radiochemikalien
[D32P]-dCTP redivue
Das Reagenz wurde von der Firma GE Healthcare (München) bezogen und vor Ablauf der ersten
Halbwertszeit (T ½ = 14,262 d) verwendet.
2.1.5 Reagenzien und Verbrauchsmaterial
Reagenzien
Bezugsquelle
BCA Protein Assay Kit
BD SMART RACE cDNA Amplification Kit
Bis-Tris Gele (4-12 %)
Filme: Hyperfilm•-ECL
Filtermate A 1205-401
Filterpapier Whatman 3MM
LaddermanTM Labeling Kit
MicroSpinTM S-200 HR Säulen
Nylonmembran, Hybond N+
Nitrocellulosemembran Protan BA85
Parafilm M
PCR-Aufreinigungskit
Plastikwaren
Pierce, Rockford, IL
BD Bioscience Clontech, Heidelberg
Invitrogen, Karlsruhe
GE Healthcare, München
PerkinElmer, Finnland
Whatman, Dassel
TaKaRa, Shiga, Japan
Amersham Biosciences, Braunschweig
Amersham, Braunschweig
Whatman, Dassel
American National Can, Chicago, USA
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
NUNC, Wiesbaden
BD Falcon, Heidelberg
Eppendorf, Hamburg
Macherey-Nagel, Düren
GE Healthcare, Freiburg
Eurogentec, Liege, Belgien
Stratagene, Californien
Sartorius, Göttingen
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Plasmid Isolierungskits
Protein G Sepharose 4 Fast Flow
qPCR MasterMix No ROX
Quik-Change II Site Directed Mutagenese Kit
Sterilfilter
TOPO TA Cloning£ Kit
Tricin Gele 16%
2.2 Geräte
Gerät/Bezeichnung
Hersteller
Abzug
Analysenwaage, Chyo JL-180
Brutschrank,BBD6220
Counter, 120S Betaplate
Digitalkamera, Powershot G2
Elektrophorese von DNS und RNS, Agagel Maxi/Midi
Elekroporationsgerät, Gene Pulser II
ELISA Reader, Sunrise
Entwicklermaschine, Curix 60
Geldokumentationssystem, BioDocAnalyze
Heizofen, OV3
Harvester, Basic 96 Harvester
wrt-Laborbau, Stadtlohn
Welabo, Düsseldorf
Heraeus, Hanau
Perkin Elmer, Rodgau-Jügelsheim
Canon, Amsterdam, Niederlande
Biometra, Göttingen
Biorad, München
Tecan, Crailsheim
Agfa, Köln
Biometra, Göttingen
Biometra, Göttingen
Satron instruments, Tampere, Finnland
Material und Methoden
Kühlzentrifugen, Sorvall£ RC26 PLUS
Megafuge 1.0
Biofuge fresco
Konfokalmikroskop, LSM510 Meta
Mikroskope,
Axiovert 25
TE2000
PCR Maschine, Trio-Thermoblock
Real-time-PCR Maschine, iCycler IQ5
Phosphoimager
Photometer, GeneQuant II
Spannungsquelle, Power Pack P25
PS 500 XT
Sterilbank, HLB 2472 GS
Thermoblöcke, Termomixer Compact
Tischzentrifugen, Zentrifuge 5415 C
Biofuge 15
Biofuge 15 R
£ Ultra-TURRAX
Wasserbad, WNB22
Zellkulturschüttler, 3015
31
Heraeus, Hanau
Heraeus, Hanau
Heraeus, Hanau
Zeiss, Oberkochen
Zeiss, Oberkochen
Nikon, Düsseldorf
Biometra, Göttingen
Biorad, München
FLA-3000, FujiFilm, Düsseldorf
Pharmacia, Braunschweig
Biometra, Göttingen
HIS, San Francisco, USA
Heraeus, Hanau
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf, Hamburg
Heraeus, Hanau
Heraeus, Hanau
IKA-Werke, Staufen
Memert, Schwabach
GFL, Burgwedel
2.3 Medien und Puffer
2.3.1 Stammlösungen und Puffer
Stammlösung oder Puffer
Zusammensetzung
BBS (2 x)
280 mM
50 mM
1,5 mM
NaCl
BES
Na 2 HPO 4
pH = 6,96
DNS Verdaulösung
500 μl
50 μl
25 μl
7,5 μl
TNE
SDS 10 %
Pronase E
Proteinase K
5 x DNS Auftragspuffer
15 %
0,05 %
0,05 %
Ficoll Typ 400
Bromphenolblau
Xylencyanol
10 x DNS Auftragspuffer
1 mg/ml
10 mM
30 %
Orange G
Tris/HCl, pH 7,5
Gelatine
dNTP-Mix
1 mM
1 mM
1 mM
1 mM
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
Material und Methoden
32
ES Zell Lysepuffer
10 mM
10 mM
10 mM
0,5 %
NaCl
Tris/HCl, pH 7,5
EDTA
Sarkosyl
HEBS (2 x)
0,28 M
0,05 M
1,5 mM
NaCl
HEPES
Na 2 HPO 4
pH = 7,0
Minimal-TE
1 mM
0,01 mM
Tris/HCl, pH 8,0
EDTA
PBS
13,7 mM
2,7 mM
80,9 mM
1,5 mM
NaCl
KCl
Na 2 HPO 4
KH 2 PO 4
pH = 7,4
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
10 x PCR Puffer
50 %
48 %
2%
500 mM
100 mM
15, 20, 25 mM
0,1 %
Phenol, pH 8,0
Chloroform
Isoamylalkohol
KCl
Tris/HCl, pH 8,3
MgCl 2
Gelatine
Pronase E
10 mg/ml
10 mM
10 mM
Pronase E
Tris, pH 8,0
NaCl
Proteinase K
10 mg/ml
Proteinase K in H 2 O bidest gelöst
RNS Elektrophoresepuffer
1 x MESA-Puffer
2 x RNS Auftragspuffer
48,0 %
10,0 %
17,3 %
14,0 %
5,3 %
5,3 %
Formamid
10 x MOPS-Puffer
Formaldehyd
DEPC-H 2 O
Glyzerin
Bromphenolblau
10 x MOPS-Puffer
0,4 M
0,1 M
10 mM
MOPS
Natriumacetat˜3H 2 O
EDTA˜Na 2 ˜2H 2 O
pH = 7,2
Material und Methoden
33
20 x SSC
3M
0,3 M
NaCl
Trinatriumcitrat
50 x TAE Elektrophoresepuffer
2M
1M
0,1 M
Tris, pH 8,0
Eisessig
EDTA
TBS-T
TE Puffer
TNE
150 mM
10 mM
0,1 %
NaCl
Tris/HCl pH 7,6
Tween-20
10 mM
1 mM
Tris, pH 8,0
EDTA, pH 8,0
100 mM
10 mM
1 mM
NaCl
Tris, pH 8,0
EDTA, pH 8,0
Waschlösung I (Southern+Northern)
2x
0,05 %
SSC
SDS
Waschlösung II (Southern+Northern)
0,1 x
0,1 %
SSC
SDS
WB Auftragspuffer (5 x)
WB Tricin Auftragspuffer (2x)
45 %
25 %
10 %
0,15 %
30 mM
12 %
4%
0,0025 %
0,0025 %
450 mM
2%
WB Lysepuffer
150 mM
50 mM
1%
1%
1 mM
1 mM
Glyzerin
-Mercaptoethanol
SDS
Bromphenolblau
Tris/HCl pH 6,8
Glyzerin
SDS
Coomassie Blue G
Phenol Red
Tris HCl
pH 8,45
NaCl
Tris/HCl
pH = 7,6
Triton X 100
NP-40
EDTA
EGTA
Material und Methoden
WB IP Lysepuffer
34
140 mM
5 mM
20 mM
1%
WB IP Waschpuffer
150 mM
10 mM
2 mM
0,2 %
WB Organ Lysepuffer
1%
NaCl
MgCl 2
Tris/HCl
pH = 7,6
NP-40
NaCl
Tris/HCl
pH = 7,6
EDTA
NP-40
PBS
NP-40
Den WB Lysepuffern wurde vor Gebrauch Proteaseinhibitor cocktail (Sigma) oder complete mini
(Roche) nach Herstellerangaben hinzugefügt.
WB Laufpuffer
WB Tricin Laufpuffer
WB Transferpuffer
50 mM
50 mM
1 mM
0,1 %
MOPS
Tris Base
EDTA
SDS
pH = 7,7
100 mM
100 mM
0,1 %
Tris Base
Tricin
SDS
pH = 8,3
25 mM
25 mM
1 mM
20 %
Bicin
Bis/Tris
EDTA
Methanol
Material und Methoden
35
2.3.2 Zellkulturmedien
Tabelle 2.1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien
Zelltyp
Grundmedium
FKS*
ANA-1
Makrophagen
RPMI 1640
VLE
10 %
0,05 mM
2 mM
BMDM**
RPMI 1640
VLE
10 %
0,05 mM
2 mM
EF Zellen
ES Zellen***
DMEM
hohe Glukose
DMEM
hohe Glukose
NIH 3T3
Zellen
hohe Glukose
RAW 264.7
Makrophagen
RPMI 1640
VLE
293(F)T Zellen
DMEM
DMEM
hohe Glukose
Penicillin
Streptomycin ȕ-ME
L-Glutamin
5%
100 U/ml
100 Pg/ml
0,05 mM
2 mM
15 %
100 U/ml
100 Pg/ml
0,05 mM
2 mM
10 % NKS 100 U/ml
100 Pg/ml
0,05 mM
2 mM
10 %
100 U/ml
100 Pg/ml
0,05 mM
2 mM
10 %
100 U/ml
100 Pg/ml
2 mM
* für ES und EF speziell getestetes ES-FKS, für Makrophagenzelllinien und BMDM getestetes Endotoxin freies FKS
** M-CSF wurde als Kulturüberstand der M-CSF produzierenden Zelllinie L-929 zugegeben
***1 % LIF wurde als Kulturüberstand des LIF produzierenden Klons CHO-LIF-D zugegeben
2.3.3 Medien für die Bakterienkultur
Tabelle 2.2: Zusammensetzung des Bakterienkulturmediums.
Medium
Zusammensetzung
LB (pH 7,2)
Caseinhydrolysat
Hefeextrakt
NaCl
H 2 O dest
10 g
5g
5g
ad 1 l
Das Medium wurde durch Autoklavieren (121°C/2 bar/20 min) sterilisiert. Das Festmedium
entstand durch Zusatz von 15 g Agar pro Liter Medium. Die Anzucht der Bakterien erfolgte aerob
bei 37°C. Zur Langzeitkonservierung wurden über Nacht gewachsene Klone 1:1 mit 98 % sterilem
Glyzerin gemischt und anschließend bei -80°C gelagert.
Material und Methoden
36
2.4 Antibiotika
Zur positiven Selektion plasmidhaltiger Bakterien wurde dem Kulturmedium je nach
verwendetem Plasmid Ampicillin oder Kanamycin zugegeben.
Tabelle 2.3: Verwendete Antibiotika.
Stammlösung
Endkonzentration
Ampicillin
50 mg/ml in H 2 O bidest , sterilfiltriert
100 Pg/ml
Kanamycin
50 mg/ml in H 2 O bidest , sterilfiltriert
100 Pg/ml
2.5 Bakterien-, Toxoplasmenstämme und Zelllinien
2.5.1 Bakterien- und Toxoplasmenstämme
In Tabelle 2.4 sind die in dieser Arbeit verwendeten Bakterien- und Toxoplasmenstämme unter
Angabe des Genotyps und der Referenz aufgelistet.
Tabelle 2.4: Verwendete Bakterien- und Toxoplasmenstämme
Bakterienstamm Genotyp
Referenz
E. coli DH5D
supE44, 'lacU169, ()80lacZ'M15), hsdR17,
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1
(Hanahan, 1983)
E. coli TOP10
F- mcrA, '(mrr-hsdRMS-mcrBC), '80lacZ'M15,
'lacX74, deoR, recA1, araD139, '(ara-leu)7697,
galU, galK, rpsL, (StrR), endA1, nupG
Invitrogen
L. monocytogenes
fakultativ intrazellulär replizierendes Bakterium
ATCC Stamm 43251
GFP L. monocytogenes
T. gondii ME49,
Gruppe II
fakultativ intrazellulär replizierendes Bakterium
stabil mit GFP transfiziert
(Chakraborty, Gießen)
obligat intrazellulär replizierende Protozoa
(Parmley et al., 1994)
2.5.2 Zellen/Zelllinien
In Tabelle 2.5 sind die in dieser Arbeit verwendeten Zellen unter Angabe der Eigenschaften und
der Referenz aufgelistet.
Tabelle 2.5: Verwendete Zelllinien.
Zellen
Eigenschaften
Referenz
Knochenmarksmakrophagen aus C57BL/6 Mäusen,
immortalisiert mittels J2 Retrovirus
aus dem Knochenmark mit M-CSF in vitro
ausdifferenzierte Makrophagen
embryonale Fibroblasten am Tag 14.5 p.c. aus CD1
Embryonen
frisch isoliert
ES Zellen
embryonale Stammzellen aus SvJ 129/Ola Mäusen
(Kuhn et al., 1991a)
HS27
humane Vorhaut Fibroblasten
ATCC, CRL-1634™
ANA-1
BMDM
EF Zellen
(Cox et al., 1989)
frisch isoliert (Klein et al.,
1993)
Material und Methoden
37
IRF-1-/- EF
embryonale Fibroblasten am Tag 14.5 p.c. aus
IRF-1-/- Embryonen
(Matsuyama et al., 1993)
L-929
Fibroblasten
(Sanford et al., 1948)
NIH 3T3
murine embryonale Fibroblasten Zelllinie
ATCC, CRL-1658™
264.7 RAW
293T Zellen
293FT Zellen
murine Monozyten/Makrophagenzelllinie aus
BALB/c Mäusen, ursprünglich aus Peritoneum
humane primäre embryonale Nierenzelllinie
transformiert mit humanem Adenovirus Type 5 DNS
293T Zellen zusätzlich mit pCMVSPORT6Tag.neo
transformiert
(Raschke et al., 1978)
(Graham et al., 1977)
Invitrogen
2.6 Versuchstiere
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Wildtyptiere der Mausstämme C57BL/6 und CD1 verwendet.
Alle Mäuse wurden in IVCs (individual ventilated cages, Hersteller: Ebeco, Castrop-Rauxel,
Deutschland) in der Tierversuchsanlage der Medizinischen Fakultät der Heinrich-HeineUniversität Düsseldorf gehalten und ggf. bei der Firma Charles River bezogen.
2.7 Primer
Die in diesem Kapitel aufgeführten Primer wurden von der Firma Metabion bezogen.
Für die SSPII RACE PCR wurden folgende Primer verwendet:
SSPII-3`-RACE:
CTG CAA GAT GTC TCC CAT CCC TCT GAT
SSPII-5`-RACE:
GTT TGT CAT GAC GAC CTG GGT CTG GTA
In Tabelle 2.6 sind alle Primer aufgeführt, die zur Klonierung von DsRed- und eGFPFusionskonstrukten verwendet wurden.
Tabelle 2.6: Oligo-Nukleotide zur Klonierung von DsRed und eGFP Fusionskonstrukten.
Primername
pDsRed-Monomer(eGFP)N1-mGBP7_for
pDsRed-Monomer(eGFP)N1-mGBP7_rev
pDsRed-Monomer-C1mGBP7_for
pDsRed-Monomer-C1mGBP7_rev
pDsRed-Monomer(eGFP)N1-SSPII_for
pDsRed-Monomer(eGFP)N1-SSPII_rev
pDsRed-Monomer-C1SSPII_for
pDsRed-Monomer-C1SSPII_rev
Sequenz (5'ĺ
Verwendung
CAA GCT TTG ATG GCA TCT GGT C
mGBP7-pDsRed(eGFP)
Fusionskonstrukt
ATC CTT TGG AGA TTT TCT AAC TTT G
CAA GCT TGA TGG CAT CTG GTC C
ATC CTT TGG AGA TTT TCT AAC TTT G
CTC GAG ACC ATG TCT CCC ATC
GTC GAC TCG TTT TGC TTC TTT AAA G
CTC GAG ACA TGT CTC CCA TCC
GTC GAC TCG TTT TGC TTC TTT AAA G
pDsRed-mGBP7Fusionskonstrukt
SSPII-pDsRed-(eGFP)
Fusionskonstrukt
pDsRed-SSPIIFusionskonstrukt
Material und Methoden
38
In Tabelle 2.7 sind die Primer aufgeführt, die zur Klonierung von GFP-mGBP-7
Fusionskonstrukten zur Erstellung der stabilen Linie mGBP7 verwendet wurden.
Tabelle 2.7: Oligo-Nukleotide zur Klonierung von pWPXL-GFP Fusionskonstrukten.
Primername
Sequenz (5'ĺ
Verwendung
pWPXL-GFPmGBP7_for
pWPXL-GFPmGBP7_rev
ATA TCC CGG GAG CAT CTG GTC CCA ACA TGG
AG
ATA TCA TAT GTT AGA GTT TTC TAA CTT TGT
CTG A
GFP-mGBP7
Fusionskonstrukt
GFP-mGBP7
Fusionskonstrukt
In Tabelle 2.8 sind alle Primer aufgeführt, die zur Klonierung von pDsRed-Monomer-N1-mGBP7
Fusionskonstrukten verwendet wurden, die Mutationen in den GTP-Bindestellen aufweisen. Die
Mutationen sind fett hervorgehoben.
Tabelle 2.8: Mutageneseprimer für Klonierung in pDsRed-Monomer-N1 Vektoren.
Primername
Sequenz (5'ĺ
Verwendung
pDsRed-N1-mGBP7
R48A_fwd
pDsRed-N1-mGBP7
R48A_rev
pDsRed-N1-mGBP7
K51A_fwd
pDsRed-N1-mGBP7
K51A_rev
pDsRed-N1-mGBP7
S52N_fwd
pDsRed-N1-mGBP7
S52N _rev
pDsRed-N1-mGBP7
T75A_fwd
pDsRed-N1-mGBP7
T75A _rev
pDsRed-N1-mGBP7
E99A_fwd
pDsRed-N1-mGBP7
E99A_rev
pDsRed-N1-mGBP7
D182R_fwd
pDsRed-N1-mGBP7
D182R_rev
GCC ATT GTA GGA CTA TAC GCA ACG GGA AAA
TCC TAC TTG A
T CAA GTA GGA TTT TCC CGT TGC GTA TAG
TCC TAC AAT GGC
GA CTA TACCGT ACG GGA GCA TCC TAC TTG
ATG AAG CG
CG CTT CAT CAA GTA GGA TGC TCC CGT ACG
GTA TAG TC
GGA CTA TAC CGT ACG GGA AAA AAC TAC TTG
ATG AAC CGC
GCG GTT CAT CAA GTA GTT TTT TCC CGT ACG
GTA TAG TCC
C ACA GTT AGG TCT GAA GCC AAG GGC ATC
TGG ATG
CAT CCA GAT GCC CTT GGC TTC AGA CCT AAC
TGT G
GTG CTT CTG GAC ACG GCT GGC TTA GGA
GAT GTG
CAC ATC TCC TAA GCC AGC CGT GTC CAG AAG
CAC
CA GAT TTT ATC TGG ACT GTT CGA CGT TTC
GTT CTG GAG C
G CTC CAG AAC GAA ACG TCG AAC AGT CCA
GAT AAA ATC TG
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Mutagenese von
mGBP7
Material und Methoden
39
In Tabelle 2.9 sind alle Primer aufgeführt, die zur Klonierung des mGBP7 Targetingvektors (TV)
und der Sonde, zur Detektion positiver Klone, verwendet wurden.
Tabelle 2.9: Oligo-Nukleotide zur Klonierung des mGBP7 Rekombinationsvektors, sowie die
Sonden zur Detektion positiver Klone.
Primername
Sequenz (5'ĺ
mGBP7-KA fwd
ATA TGC GGC CGC CCT GAG ATT TGT AGA TTG
mGBP7-KA rev
mGBP7-LA fwd
mGBP7-LA rev
Verwendung
TV- mGBP7kurzer Arm
ATA TTC TAG AGC CTC CAT GTT GGG A CC
AGA TG
ATA TCT CGA GCC AAT TCG AAG GCC AAG ACC
TTG
TV- mGBP7langer Arm
ATA TGG TAC CGG ATA TGC TCA TCA TAC CGT
G
5’ Sonde fwd
TAA GGT ACT GTT GTC TTT CAC AG
5’ Sonde rev
GAT GAT ACA TGG ATA TGA TTC T
5’ Sonde mGBP7
In Tabelle 2.10 sind alle Primer aufgeführt, die zur Klonierung des SSPII Targetingvektors (TV)
und der Sonde, die zur Detektion positiver Klone verwendet wurde, sowie die Primer für die
Screening-PCR.
Tabelle 2.10: Oligo-Nukleotide zur Klonierung des SSPII Rekombinationsvektors, sowie die
Sonden zur Detektion positiver Klone.
Primername
Sequenz (5'ĺ
SSPII-KA fwd
GCG GCC GCC ATC CTT TTG TCT CAG CTC CA
SSPII-KA rev
CTA GTC GTT CTT AGA AGA CTT ATA CGC CAG
GT
SSPII-LA fwd
AAC TCG AGT CTT CTG CCA TCA AGC CAA T
SSPII-LA rev
AAG GTA CCT GTG GCT CGG TGG TCC T
5’ Sonde fwd
CAA GTG GGA AAA GGC TCT TG
5’ Sonde rev
CTG GCC CTT CAT ATG CCT AC
Verwendung
TV- SSPII kurzer Arm
TV-SSPII langer Arm
5’ Sonde SSPII
Screening PCR
ko/Wt fwd
Screening PCR ko
rev
Screening PCR Wt
rev
GAA GCT GAT TAT GGG ATG GA
GTG TTG GGT CGT TTG TTC G
CAT ATT TCC ACC CAC CAG AGA
PCR-Screening positiver
Klone
Material und Methoden
40
In Tabelle 2.11 sind die Sequenzen von Primern und Sonden, die für die RT-PCR verwendet
wurden, aufgelistet.
Tabelle 2.11: Sequenzen von Oligo-Nukleotiden und Sonden für Real-time RT-PCR Analysen.
Primername
Sequenz (5'ĺ
ȕ-Actin fwd
TGA CAG GAT GCA GAA GGA GA
ȕ-Actin rev
CGC TCA GGA GGA GCA ATG
GTP-BP1 fwd
GGT GCA GAG CAA AGA TGA TG
GTP-BP1 rev
ATC TGG AAT ATC GGG CAC AT
IFN-J fwd
TCT GGA GGA ACT GGC AAA AG
IFN-J rev
TTC AAG ACT TCA AAG AGT CTG AGG
IL-12p40 fwd
ATC CAG CGC AAG AAA GAA AA
IL-12p40 rev
CTA CGA GGA ACG CAC CTT TC
iNOS fwd
CTTTGCCACGGACGAGAC
iNOS rev
TCATTGTACTCTGAGGGCTGAC
LRG 47 fwd
AAG GCC ACT AAC ATC GAA TCA
LRG 47 rev
TGC CTT ATC TCA CTT AAT ACT CCT CA
mGBP1 fwd
CAG ACT CCT GGA AAG GGA CTC
mGBP1 rev
CTT GGA TTC AAA GTA TTT TCT CAG C
mGBP2 fwd
TGA GTA CCT GGA ACA TTC ACT GAC
mGBP2 rev
AGT CGC GGC TCA TTA AAG C
mGBP3 fwd
GGC TGA GGA CTG TCC CTG T
mGBP3 rev
CAT GGT CCA CTC GGA AGC
mGBP4 fwd
GCC AAG ATC AAG ACC CTC AG
mGBP4 rev
CCA CGT AGG TTG TCA CCA GA
mGBP5 fwd
TCA CTG AAG CTG AAG CAA GG
mGBP5 rev
GCG TCA AAA ACA AAG CAT TTC
mGBP6/10 fwd
ATA TTT CAA CAT TTT TTG TTC CTT GT
mGBP6/10 rev
TGG AAG ACT TCA CTT GCC TTC AC
mGBP7 fwd
GCA GAG AAT CCG GTG CAG
mGBP7 rev
TTT CCA CTA GGC ACA CAG GA
mGBP8 fwd
AAG AAG CTG AAG GAA CAA AAG GC
mGBP8 rev
GAA ATG GGA GAA AAA ATA AAT GAA GC
Sonde
CTCTGGCT
CAGCCTCC
CAGAGCCA
GGAGACAG
AGGCAGAG
CTCCTCTG
GGCTGAAG
AGGAGCTG
CAGAGCCA
ACTGGGAA
ACTGGGAA
AGTCATGTTCAATCTT
CTCCCTCTTGTCC
TCTGGTCC
TGTTTCAGTTGCTGTA
TCTCTCCATCCA
Material und Methoden
mGBP9 fwd
TTC CAA AAC TTT CTC CAG TCA CAG TA
mGBP9 rev
GGC ACG CTC CTC TGC AA
SSPII fwd
GCC ATC AAG CCA ATG ATG TA
SSPII rev
GTG GCT TTT TCC ACT TGA GG
41
CCAGCAGTGAGGGCT
CTATCTGCCT
ACACTGGA
Die Sonden zu mGBP6/10, 8 und 9 wurden von der Firma TIB MolBiol, Berlin, entworfen und
synthetisiert. Alle weiteren Sonden sind Teil der Universal Probe Library der Firma Roche,
Mannheim und beinhalten LNAs (locked nucleoid acid), so dass kurze Sondensequenzen benutzt
werden können. Alle Sonden sind mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM markiert.
2.8 Plasmidvektoren
2.8.1 Ausgangsvektoren
Tabelle 2.12: Verwendete Ausgangsvektoren.
Name
Eigenschaften
Referenz
pCR II-TOPO
Vektor zur direkten Klonierung von PCR Produkten
AmpR, KanR, f1 ori, Col E1 ori, lac-Promotor, lacZD- Fragment
Invitrogen
pEF-Sem
Expressionsvektor, EF1D-Promotor, AmpR, NeoR
Labor
Pfeffer
pBluescript II KS+
Klonierungsvektor, AmpR, NeoR
Fermentas
Vektor mit HSV-Tymidinkinase mit KpnI-Linkern, pGEM7Derivat, AmpR
Expressionsvektor mit DsRed2 und mitochondrialer
Targetingsequenz (Untereinheit VIII von humaner Cytochrom
C Oxidase), CMV-Promotor, KanR, NeoR
Expressionsvektor mit DsRed2 und ER Targetingsequenz
(Calreticulin), CMV-Promotor, KanR, NeoR
Expressionsvektor mit EGFP und Endosomenmarker (RhoB),
CMV-Promotor, KanR, NeoR
Expressionsvektor mit ECFP und Targetingsequenz von
zellulären Membranen (Neuromodulinfragment),CMVPromotor, KanR, NeoR
Expressionsvektor mit AcGFP1 und Golgi Targetingsequenz
(humane beta 1,4-galactosyltransferase), CMV-Promotor,
KanR, NeoR
Expressionsvektor für N-terminales DsRed-Fusionsprotein,
CMV-Promotor, KanR, NeoR
Expressionsvektor für N-terminales EGFP-Fusionsprotein,
CMV-Promotor, KanR, NeoR
Labor
Pfeffer
HSV-TK-KpnI
pDsRed2-Mito
pDsRed2-ER
pEGFP-Endo
pECFP-Mem
pAcGFP1-Golgi
pDsRed-Monomer-C1
pEGFP-C2
pWPXL
pLP/VSVG
psPAX2
Ausgangsvektor zur Klonierung von pWPXL-GFP-w/o-STOP,
EF1-D-Promotor, AmpR
Expressionsvektor zur lentiviralen Transduktion (envelope),
Expression des VSV-G Gens (VSV G Glycoprotein), CMVPromotor, AmpR
Expressionsvektor zur lentiviralen Transduktion (Packaging),
Expression von Gag, Pol und Env, CMV-Promotor, AmpR
Clontech
Clontech
Clontech
Clontech
Clontech
Clontech
Clontech
Labor Trono
(Pan et al.,
2007)
Invitrogen
Labor Trono
Material und Methoden
42
2.8.2 Erstellte Plasmide
Tabelle 2.13: Im Rahmen dieser Arbeit hergestellte Plasmide.
Name
Vektor
Insert
SSPII-His-pEF-Sem
pEF-Sem
SSPII-6xHis
SSPII-DsRed-N1
DsRed-N1
SSPII ORF
SSPII-DsRed-C1
DsRed-C1
SSPII ORF
SSPII-eGFP-N1
eGFP-N1
SSPII ORF
SSPII-TV
pBluescript II KS+
KA-Neo-LA-Neo-TK-
mGBP7-DsRed-C1
DsRed-C1-Monomer
mGBP7 ORF
mGBP7-DsRed-N1
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 ORF
mGBP7-eGFP-N1
eGFP-N1-Monomer
mGBP7 ORF
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 R48A ORF
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 K51A ORF
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 S52N ORF
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 T75A ORF
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 E99A ORF
DsRed-N1-Monomer
mGBP7 D182R ORF
pWPXL-GFP-w/oSTOP
mGBP7 ORF
mGBP7-DsRed-N1R48A
mGBP7-DsRed-N1K51A
mGBP7-DsRed-N1S52N
mGBP7-DsRed-N1T75A
mGBP7-DsRed-N1E99A
mGBP7-DsRed-N1D182R
pWPXL-GFP mGBP7
Eigenschaften
Proteinexpression von
SSPII-6xHis
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
SSPII-Targetingvektor
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
für subzelluläre
Lokalisation
Lentivirale Transduktion
2.9 Tierversuche
2.9.1 Superovulation
Um eine größtmögliche Anzahl von Blastozysten zu erhalten, wurde weiblichen Mäusen zur
Superovulation 10 U Follikelreifungshormon („pregnant Mare Serum Gonadotropin“, PMSG) und
44 Stunden später 10 U humanes Choriongonadotropin (hCG) intraperitoneal injiziert. Die
Ovulation erfolgt etwa 12 Stunden nach hCG Gabe. 12 Stunden nach Verpaarung der
superovulierten Weibchen wurde die erfolgreiche Begattung durch Untersuchung auf einen
Vaginalpfropf bestätigt. Dieser Zeitpunkt wird als Tag 0,5 der Embryonalentwicklung bezeichnet.
Für die Blastozysteninjektion wurden die Embryonen am Tag 3,5 post coitum (p.c.) entnommen.
2.9.2 Generierung chimärer Mäuse
Um chimäre Mäuse aus den homolog rekombinierten ES Zellen zu erhalten, wurden diese in
Blastozysten (Tag 3,5) von superovulierten C57BL/6 Spendertieren injiziert. Dafür wurden die ES
Material und Methoden
43
Zellen auf einer 5 cm Zellkulturschale mit Mitomycin C (MMC) behandelten EF Zellen
ausplattiert, am nächsten Tag das Medium gewechselt und an Tag 3 auf zwei 5 cm
Zellkulturschalen ohne EF Zellen umgesetzt. Am vierten Tag wurde wiederum das Medium
gewechselt und an Tag 5 wurden die rekombinierten ES Zellen in die Blastozysten injiziert. 10 20 dieser Blastozysten wurden anschließend in den Uterus einer scheinschwangeren CD1
Ammenmutter transferiert (durchgeführt von Nicole Krafzik). Etwa sieben Tage nach der Geburt
konnten anhand der Fellfarbe chimäre Mäuse identifiziert werden.
2.9.3 Infektion von Mäusen mit Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes (ATCC 43251) wurden über Nacht in 5 ml Brain-Heart-Infusion (BHI)
Medium kultiviert und für die Infektion auf eine OD 600 von 0,7 eingestellt. Für die
Expressionsexperimente wurden C57BL/6 Mäuse intraperitoneal mit 0,1 x LD 50 in einem Volumen
von 0,35 ml infiziert.
2.9.4 Organentnahme
Zur Entnahme von Organen aus Mäusen wurden diese durch cervicale Dislokation getötet und die
jeweiligen Organe steril entnommen und das Knochenmark mit Medium gespült. Zur RNS- bzw.
Protein-Extraktion wurden die Organe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur
weiteren Verarbeitung bei -80°C gelagert.
2.10
Zellbiologische Methoden
2.10.1 Kultivierung embryonaler Stammzellen und Fibroblasten
Zellkultur von ES/EF Zellen
Embryonale Stammzellen (E14.1) wurden auf mit Mitomycin C (10 μg/ml) vorbehandelten EF
Zellen (2 h, 37°C) ko-kultiviert. Um das Ausdifferenzieren zu verhindern, wurde den ES
Zellkulturen LIF-Überstand in das Medium zugegeben (1000 U/ml Endkonzentration).
Undifferenzierte ES Zellen erscheinen im Phasenkontrast-Mikroskop als runde bis ovale Kolonien
mit einem glatten, doppelbrechenden Rand. Ausdifferenzierte Kolonien sind grau, matt und
bilden Pseudopodien aus.
Elektroporation von ES Zellen
Die embryonalen Stammzellen wurden durch Elektroporation mit dem Rekombinationsvektor
SSPII transfiziert. Dafür wurden ES Zellen auf 15 cm Zellkulturschalen mit EF Zellen expandiert.
Für die Elektroporation wurden 5 x 107 Zellen in 7 ml ES Medium aufgenommen und mit 200 μg
linearisiertem Rekombinationsvektor in 1 ml PBS gemischt. Pro Ansatz wurden je 800 μl in
Elektroporationsküvetten überführt und bei 300 V/250 μF elektroporiert. Elektroporierte Zellen
wurden anschließend 10 min auf Eis abgekühlt und je Ansatz auf zwei 10 cm Kulturschalen mit
EF Zellen verteilt.
Material und Methoden
44
Selektion rekombinanter ES Zellklone
Nach der Transfektion wurden die ES Zellen einem zweifachen Selektionsdruck mit Geneticin
(G418) und Gancyclovir unterzogen, um homolog rekombinierte ES Zellklone anzureichern. Nach
der Transfektion wurden die Zellen für zwei Tage ohne Selektion kultiviert. Am Tag 2 wurde zur
Positivselektion dem Medium Geneticin (G418) (200 μg/ml) zugegeben und an Tag 4 zur
Negativselektion zusätzlich 2 mg/ml Gancyclovir. Anschließend wurde alle zwei Tage das
Medium gewechselt, bis ES Zellkolonien gewachsen waren (Tag 11). Die Kolonien wurden mit
PBS gewaschen und mit 10 ml PBS überschichtet. Mit einer sterilen Pipette wurden die
Einzelkolonien in 20 μl PBS aufgenommen und in eine 96-well Rundboden Platte überführt. Der
Zellverband der Kolonien wurde durch Trypsin/EDTA Behandlung aufgelöst und mit EF Zellen
ko-kultiviert. Nach 2 Tagen wurde ein Teil der Zellen (2/3) auf eine 48-well Platte mit EF Zellen
gesplittet und die restlichen Zellen in der 96-well Platte belassen. Die ES Zellen in der 48-well
Platte wurden nach zwei Tagen eingefroren und die Zellen in der 96-well Platte auf zwei 96-well
Flachbodenplatten ohne EF Zellen gesplittet. Die ES Zellen in den 96-well Platten wurden
wachsen gelassen, bis sie eine dichte Zellschicht gebildet hatten. Dann wurden die Zellen einmal
mit PBS gewaschen und bei -20°C eingefroren oder die Zellen direkt lysiert.
Einfrieren von ES Zellen
Die Zellen wurden vor dem Einfrieren mit Trypsin/EDTA vereinzelt und die Reaktion mit
Medium abgestoppt. Anschließend wurde die Zellsuspension 1:1 mit Einfriermedium (80 % FKS,
20 % DMSO) gemischt, für 30 min bei -20°C inkubiert und dann ü/N bei -80°C gelagert. Die
Zellen konnten so bis zu 6 Wochen aufbewahrt werden. Zur längeren Konservierung der ES
Zellen wurden diese zu größeren Zellzahlen expandiert und anschließend in Einfriermedium in
Cryotubes in flüssigem Stickstoff gelagert.
2.10.2 Kultivierung von Zelllinien
Alle Zellkulturarbeiten wurden in Sterilbänken (Lamina AIR Flow) mit HEPA-Filtern
durchgeführt. Die Inkubation der Zellen erfolgte in Brutschränken bei 37°C, 8 % CO 2 und
wasserdampfgesättigter Atmosphäre. ANA-1 und 264.7 RAW Makrophagen wurden mit
komplettem Medium unter Verwendung von Plastikpipetten von der Kulturschale abgespült und
dann verdünnt umgesetzt. NIH 3T3, 293T und 293FT Zellen wurden alle zwei Tage mit PBS
gewaschen, mit Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst und in Medium verdünnt auf
neue Platten ausplattiert. HS27 Zellen zur Kultivierung von Toxoplasmen wurden in T75 Flaschen
(Nunc) bis Passage 40 passagiert. Von konfluent bewachsenen Flaschen wurde einmal
wöchentlich das Medium gewechselt. Dicht bewachsene T75 Flaschen wurden gesplittet indem
die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend trypsinisiert wurden. Vereinzelte Zellen wurden
in Medium 1:6 in T25 Flaschen umgesetzt.
Material und Methoden
45
2.10.3 Kultivierung von Knochenmarksmakrophagen (BMDM)
Knochenmarkszellen wurden aus dem Femur der Maus herausgespült. Mit einer Plastikpipette
wurde durch Resuspendieren eine Einzelzellsuspension erzeugt, die Zellzahl bestimmt und zu 2 x
106 Zellen auf bakteriologische Petrischalen mit BMDM Kulturmedium (s. Tab. 2.1) kultiviert.
Alle drei Tage wurde ein Teil des Mediums abgenommen und frisches Medium zugegeben. Nach
acht bis zehn Tagen Kultur waren die Zellen zu Makrophagen ausgereift und konnten geerntet,
neu ausgesät (5 x 106) und stimuliert werden.
2.10.4 Transfektion von 293T Zellen mittels Kalzium-Phosphat
Zur transienten Transfektion von Zellen (293T) wurden am Vortag 1 x 106 Zellen auf eine 10 cm
Zellkulturschale ausplattiert. Nach 16 h wurden in einem sterilen Röhrchen (Falcon) 16 μg
Expressionsvektor und 80 μl CaCl 2 gemischt und mit ddH 2 O auf 400 μl aufgefüllt. Unter
kontinuierlichem Mischen wurden tropfenweise 400 μl 2 x BBS zugegeben, für 10 min bei RT
inkubiert und anschließend auf die Zellen gegeben. 16 h später wurde das Medium gewechselt.
Der Erfolg der Transfektion konnte nach weiteren 24 h am Fluoreszenzmikroskop oder per
Western Blot analysiert werden.
2.10.5 Transfektion von 264.7 RAW Makrophagen durch Elektroporation
Die transiente Transfektion der 264.7 RAW Makrophagen erfolgte durch Elektroporation. Dafür
wurden die Zellen einen Tag vor der Elektroporation passagiert. Am Tag der Elektroporation
wurden 2 x 106 – 1 x 107 -Medium (RPMI Medium mit 40 % FKS)
aufgenommen und pro Elektroporationsansatz 20 μg Plasmid-DNS zur Zellsuspension pipettiert.
Der Ansatz wurde in eine Elektroporationsküvette überführt und bei 280 V/975
Nach der Elektroporation wurden die Zellen für 15 min bei RT inkubiert und anschließend in
Röhrchen mit 10 ml Medium gegeben. Nach 5 min Zentrifugation bei 1200 UpM wurde das
Zellpellet in frischem Medium aufgenommen und ü/N im Brutschrank inkubiert.
2.10.6 Lentivirale Transduktion zur Herstellung stabiler Zelllinien
Um stabile Zelllinen zu generieren, wurden diese mit Hilfe eines lentiviralen Expressionssystems
transduziert.
Generierung von Virusüberstand
5 x 106 293FT Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion auf 10 cm Kulturschalen ausplattiert.
Zur Transfektion wurden 5 μg pLP/VSVG, 10 μg psPAX2 und 20 μg Expressionsvektor mit 125 μl
0,5 M CaCl 2 gemischt und mit 0,05 M HEPES auf 250 μl aufgefüllt. In sterile Röhrchen wurden
250 μl 2 x HEBS vorgelegt und die DNS unter Vortexen tropfenweise zugegeben. Anschließend
wurde für 30 min bei RT inkubiert. Zwischenzeitlich wurde das Medium der 293FT Zellen durch
FKS-freies Medium ersetzt und anschließend die DNS auf die Zellen getropft. Nach 6 h erfolgte
Material und Methoden
46
ein Mediumwechsel mit 6 ml FKS-haltigem Medium. Nach 48 h wurde der Virusüberstand von
den Zellen abgenommen, für 10 min bei 2000 UpM zentrifugiert und der Überstand mit einem
0,45 μm Filter steril filtriert. Der Virusüberstand wurde anschließend in Cryotubes aliquotiert,
kurz in Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Lentivirale Transduktion von Zielzellen (NIH 3T3, 264.7 RAW Makrophagen)
Einen Tag vor der Transduktion wurden 3 x 104 Zellen auf 24-well Platten ausplattiert. 1 ml
Virusüberstand wurden mit 25 μg Polybrene zur Transduktion der jeweiligen Zelllinie versetzt
und auf die Zellen gegeben. Diese wurden für 30 min im Brutschrank inkubiert und dann für 2 h
bei 1200 UpM und 32°C zentrifugiert. Nach dreistündiger Inkubation im Brutschrank wurde der
Virusüberstand durch 1 ml Medium ersetzt. Die transduzierten Zellen wurden alle 2 Tage bis zur
10 cm Kulturschale auf eine größere Zellkulturplatte umgesetzt. Der Erfolg der Transduktion
wurde mittels Durchflusszytometrie überprüft.
2.10.7 Stimulation von Zellen
Die Stimulation der verschiedenen primären Zellen und Zelllinien erfolgte in den in Abschnitt
2.3.2 angegebenen Nährmedien, wobei die Zellen zum Zeitpunkt der Ernte eine ca. 75 %ige
Konfluenz erreicht hatten. Folgende Zytokine und Chemikalien wurden zur Stimulation
eingesetzt: IFNJ10 ng/ml), IFNE (10 ng/ml), TNF (10 ng/ml), IFNJ/TNF, CpG 1668 (1 PM), CpG
1720 (1 PM) als Kontrolle, LPS (100 ng/ml), Listeria LTA (1 Pg/ml), IL-2 (10 ng/ml) als
Negativkontrolle, IL-1E10 ng/ml), poly (I:C) (50 Pg/ml). Die Stimulation der Zellen erfolgte
durch direkte Zugabe der entsprechenden Substanzmenge zum Nährmedium.
2.10.8 Immunfluoreszenz-Färbung
Zur Färbung intrazellulärer Toxoplasmen wurde die Methode der Immunfluoreszenz angewendet.
Dafür wurden auf Glasplättchen ausgesäte und mit Toxoplasmen infizierte Zellen mit PBS
gewaschen und anschließend 15 min mit 4 % PFA/PBS im Dunkeln auf einem Schüttler fixiert.
Danach wurden die Zellen für 5 min mit PBS gewaschen. Anschließend wurde mit 0,05 %
Saponin/PBS bei RT für 15 min abgedunkelt permeabilisiert und anschließend mit 0,005 %
Saponin/PBS + 2 % Ziegenserum 20 min bei RT abgedunkelt geblockt. Der Primärantikörper
wurde in 0,0005 % Saponin/PBS + 0,2 % Ziegenserum verdünnt. Die Zellen wurden dann mit dem
verdünnten Antikörper für 1 h bei RT abgedunkelt inkubiert. Anschließend wurden die Zellen
dreimal 5 min mit 0,0005 % Saponin/PBS gewaschen und mit Sekundärantikörper verdünnt in
0,0005 % Saponin/PBS + 0,2 % Ziegenserum für 45 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach
zweimaligem Waschen der Zellen wurden die Zellkerne in DAPI Lösung (1:2500 in PBS
verdünnt) 3 min bei Raumtemperatur gefärbt und anschließend wieder mit PBS gewaschen. Die
Glasplättchen mit den Zellen wurden mit Fluoromount-G auf Objektträger fixiert und bei 4° C
gelagert.
Material und Methoden
47
2.10.9 In vitro Infektion mit Listeria monocytogenes
Transfizierte Zellen (3 x 104) wurden auf Glasplättchen in 24-well Platten ausgesät und im
Brutschrank ü/N inkubiert. Nach ca. 24 h wurden die Zellen mit IFNJ (100 U/ml) stimuliert oder
unbehandelt gelassen. 16 h später wurden die Zellen im Verhältnis 1:10 (Zellen:Bakterien) mit
eGFP-transfizierten L. monocytogenes für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen
zweimal mit PBS gewaschen, 15 min im Dunkeln mit 4 % PFA/PBS Lösung fixiert und zweimal
mit PBS gewaschen. Zellkerne wurden mit einer 1:2500 in PBS verdünnten DAPI Lösung für 3
min angefärbt und erneut zweimal gewaschen. Die Glasplättchen wurden schließlich auf
Objektträger geklebt und mikroskopiert.
2.10.10 Kultivierung von avirulenten Toxoplasmen (ME49)
Zur Vermehrung avirulenten ME49 Toxoplasmen (Parmley et al., 1994) wurden die Parasiten in
T25 Zellkulturflaschen, einschichtig bewachsen mit HS27 Fibroblasten, kultiviert. Nach
Vermehrung der Toxoplasmen wurde der Überstand abgenommen, bei 50 x g und 22°C 5 min
zentrifugiert und der Überstand mit den Zellresten abgesaugt. Bei einer weiteren Zentrifugation
des Überstandes mit 600 x g für 15 min bei 22°C wurden die Parasiten pelletiert. Diese wurden
anschließend in frischem IMDM-Zellmedium resuspendiert. Für die weitere Passage wurden 0,51,5 x 106 Parasiten in eine T25 Zellkulturflasche mit HS27 Fibroblasten gegeben.
2.10.11 In vitro Infektion mit Toxoplasma gondii
Es wurden 3 x 104 Zellen (mGBP7 bzw. SSPII transfiziert oder mGBP7 stabil überexprimierend)
auf Glasplättchen in 24-well Platten ausgesät und im Brutschrank ü/N inkubiert. Nach 24 h
wurden die Zellen mit IFN-J (100 U/ml) stimuliert oder unbehandelt gelassen. Nach weiteren 16 h
wurden die Zellen im Verhältnis 1:50 (Zellen:Parasiten) mit T. gondii (Stamm ME49) für 2 h
infiziert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, 15 min im Dunkeln mit 4
% PFA/PBS Lösung fixiert und zweimal mit PBS gewaschen. Die intrazellulären Parasiten wurden
mittels Immunfluoreszenztechnik angefärbt (s. Abschnitt 2.10.8).
2.11
Molekularbiologische Arbeitsmethoden
2.11.1 Isolierung von Plasmid-DNS
Die Plasmid-DNS Isolierung erfolgte mit Hilfe eines Kits von Macherey-Nagel. Je nach benötigter
DNS-Menge wurden Mini- oder Maxi-Säulen verwendet. Um bei einer Transfektion von
Zelllinien eine Kontamination mit Endotoxinen zu verhindern wurde das Endofree Maxi Kit von
Macherey-Nagel verwendet. Die DNS Isolierung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
Material und Methoden
48
2.11.2 Isolierung von chromosomaler DNS aus 96-well Platten
Zur genomischen Southern Blot Analyse wurde aus selektierten ES Zellklonen die chromosomale
DNS isoliert. Dafür wurden pro well 20 μl ES Zell Lysepuffer mit 0,4 mg/ml Proteinase K zu den
Zellen geben und die Platte über Nacht bei 56°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Am
nächsten Tag wurde das Kondensat kurz abzentrifugiert und zur Abkühlung 1 h bei RT inkubiert.
Zum Fällen der DNS wurden pro well 100 μl 100 % Ethanol zupipettiert und 30 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die DNS 2 x mit 70 % Ethanol gewaschen,
anschließend trocknen gelassen und für genomische Southern Blot Analyse verdaut.
2.11.3 Isolierung chromosomaler DNS aus Zellen oder Schwanzbiopsien
5 x 107 Zellen oder eine Schwanzspitze wurden in Verdaulösung (500 μl TNE; 50 μl 10 % SDS; 7,5
μl Proteinase K 10 mg/ml; 25 μl Pronase E 10 mg/ml) aufgenommen und zunächst 1 h bei 37°C
und anschließend ü/N bei 56°C im Schüttler inkubiert. Am nächsten Tag wurde für 10 min bei
13000 UpM zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Nach Zugabe von 400
μl Phenol/Chloroform wurde für 5 min bei 13000 UpM zentrifugiert und die wässrige Phase mit
einer abgeschnittenen Pipettenspitze abgenommen und in ein neues Gefäß gegeben. Mit 950 μl
Ethanol absolut (-20°C) wurde die DNS gefällt und der DNS-Faden ausgespindelt, in 70 % Ethanol
(-20°C) gewaschen und in 100-500 μl TE gelöst.
2.11.4 Agarosegelelektrophorese
Analytische Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese wird zur Auftrennung von DNS-Fragmenten verwendet. Im
elektrischen Feld wandern die negativ geladenen Nukleinsäuren zur Anode. Hierbei erfolgt im
Agarosegel
eine
Auftrennung
der
Fragmente
nach
ihrer
Größe,
wobei
die
Migrationsgeschwindigkeit dem Logarithmus des Molekulargewichtes invers proportional ist.
Durch die Verwendung von Ethidiumbromid im Gel fluoreszieren die Banden bei Bestrahlung mit
UV-Licht. Das Muster kann photographisch festgehalten und analysiert werden.
0,8-2 % (w/v) Agarose wurden in TAE Puffer aufgekocht bis eine klare homogene Lösung
entstand. Nach Abkühlung der Agarose wurde Ethidiumbromid (4
! Gelwanne mit den gewünschten Kämmen gegeben. Das ausgehärtete Gel wurde in eine
Elektrophoresekammer eingesetzt und mit TAE Puffer überschichtet. Die 1:5 mit Auftragspuffer
vermischten DNS-Proben wurden in die Geltaschen pipettiert und die Elektrophorese je nach
Gelgröße bei 80-150 Volt durchgeführt. Das in die doppelsträngige DNS eingelagerte
Ethidiumbromid fluoreszierte bei UV-Bestrahlung (Transilluminator, 280 nm) und das
Bandenmuster konnte photographisch dokumentiert werden.
Material und Methoden
49
Präparative Agarosegelelektrophorese
Zu präparativen Zwecken wurde die Gelelektrophorese wie oben beschrieben durchgeführt, die
gewünschten Banden im Gel jedoch unter langwelliger UV-Beleuchtung (325 nm) ausgeschnitten. Die DNS wurde schließlich aus dem Gelstück mittels eines Gel Extraction Kits
(Roche) nach Angaben des Herstellers extrahiert.
Bestimmung von Fragmentgrößen
Durch einen internen Standard im Gel kann die Größe der DNS-Moleküle bestimmt werden und
deren Konzentration abgeschätzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die 1 Kb-Leiter von
der Firma Invitrogen (Karlsruhe) oder der MassRulerTM der Firma Fermentas (St.Leon-Rot)
verwendet.
2.11.5 Restriktionsverdau von DNS
Restriktionsendonukleasen vom Typ II erkennen spezifische, palindromische Erkennungssequenzen von vier bis acht Basenpaaren doppelsträngiger DNS. Durch Hydrolyse der
Phosphodiesterbindungen beider Stränge entstehen DNS-Moleküle mit definierten Enden, die für
Klonierungen verwendet werden können. Die durch Restriktionsverdau erhaltenen Fragmente
wurden auch als Sonden eingesetzt, um spezifische Sequenzen durch Hybridisierung zu
identifizieren. Für den Verdau von DNS wurden 2-5 Einheiten Enzym pro Pg Plasmid-DNS und
"#$
"'*<"
allgemeiner Ansatz:
DNS-Lösung
10 x Reaktionspuffer
Enzym
H 2 O bidest.
>
?
2-@'*<
!?
Die Menge des eingesetzten Enzyms sollte 10 % des Reaktionsvolumens nicht überschreiten, da zu
hohe Glyzerinmengen die Reaktion beeinträchtigen können.
2.11.6 Dephosphorylierung von DNS
Um eine Religation des Vektors zu vermeiden und um eine intermolekulare Ligation zwischen
Vektor und DNS-Fragment zu begünstigen, wurden die 5’-Enden des Vektors mit alkalischer
Phosphatase dephosphoryliert. Nach dem Restriktionsverdau des Vektors wurde dem Ansatz eine
Einheit Alkalische Phosphatase zugegeben und dieser bei 37°C eine Stunde inkubiert. Um bei der
anschließenden Ligation störende Enzymaktivität zu vermeiden, wurde das Enzym für 10 min bei
65°C inaktiviert.
Material und Methoden
50
2.11.7 Ligation von DNS-Molekülen
T4-Ligase
Die DNS-Ligase des Bakteriophagen T4 katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen
zwischen einem 5’-Phosphat und einem 3’-Hydroxylende linearer DNS-Moleküle. Sie kann
sowohl überstehende Enden als auch glatte Enden miteinander verknüpfen. Hierfür wurden
Vektor und DNS-Insert im molaren Verhältnis 1:3 gemischt und ? #-fach Inkubationspuffer
und 1 Einheit T4-DNS-Ligase hinzugefügt und mit A. bidest. ad 20\\üllt. Inkubiert wurde
bei RT ü/N.
TOPO TA Cloning® Kit
Bei Klonierungen von PCR-Produkten in den Vektor pCR II-TOPO (Abschnitt 2.1.5) wird die
Eigenschaft thermostabiler DNS-Polymerasen, an alle doppelsträngigen DNS-Moleküle ein
Desoxyadenosin an deren 3’-Ende anzufügen, ausgenützt. PCR-Produkte können so direkt in den
Vektor kloniert werden, da sie die kompatiblen Desoxythymidin-Überhänge am 3’-Ende besitzen.
Die Vorgehensweise erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
2.11.8 Transformation von E. coli Bakterien
CaCl 2 behandelte Bakterien können durch einen kurzen Hitzeschock mit Plasmid-DNS
transformiert werden. Hierfür wurden die Bakterienstämme DH5D oder Top10 (Invitrogen)
verwendet. 100 Pl der kompetenten Bakterien (Lagerung bei -80°C) wurden kurz auf Eis aufgetaut
und der Ligationsansatz bzw. etwa 100 ng zirkuläre doppelsträngige DNS zupipettiert.
Anschließend wurde für 30 min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock erfolgte bei 42°C für 45 sek.
Nach Zugabe von 1 ml vorgewärmten LB-Medium wurde für 1 h bei 37°C im Schüttler inkubiert
um die Expression der plasmidkodierten Antibiotikumresistenz zu ermöglichen. Der Gesamtansatz
wurde auf Agarplatten ausplattiert und ü/N bei 37°C unter Selektionsdruck wachsen gelassen.
2.11.9 Southern Blot Analyse
Diese Methode kann zum Nachweis spezieller DNS-Fragmente unter einer großen Anzahl
elektrophoretisch aufgetrennter DNS-Moleküle dienen (Southern, 1975). Durch DNS/DNS
Hybridisierung mit einer komplementären Sonde können die gesuchten DNS-Sequenzen markiert
und anschließend detektiert werden.
Alkalischer DNS-Transfer auf Nylonmembranen
Nach dem Restriktionsverdau der DNS werden die DNS-Fragmente durch Gelelektrophorese nach
ihrer Größe aufgetrennt. Durch aufeinanderfolgende Säure- und Alkalibehandlung werden die
Fragmente denaturiert. Mittels eines Kapillarblots werden sie auf eine Nylonmembran
transferiert, so dass ein Abbild des Fragmentmusters des Agarosegels auf der Membran entsteht.
Nach dem Restriktionsverd^!?
"'*<{|}~
"{?
Material und Methoden
51
!
!€ü/N) elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel zur
partiellen Depurinierung 15 min in 0,25 N HCl geschwenkt und zur Denaturierung und Spaltung
an den depurinierten Stellen 30 min in 0,4 N NaOH.
Aufbau des Kapillarblots:
-
ca. 10 cm Zellstoffpapier
2 Lagen mit 0,4 N NaOH Blotlösung befeuchtetes 3 MM Whatmanpapier
Nylonmembran
Gel luftblasenfrei auf die Membran legen
2 Lagen mit 0,4 N NaOH Blotlösung befeuchtetes 3 MM Whatmanpapier
ein mit Blotlösung befeuchtetes 3 MM Whatmanpapier (Transfer-Whatman), das auf dem Gel
liegt und bis in eine mit Blotlösung gefüllte Wanne reicht
- Glasplatte mit Gewicht
Der Kapillarblot wird mit etwa 0,5 kg beschwert und ü/N bei RT inkubiert. Durch die
Kapillarkräfte wird die Blotlösung durch das Zellstoffpapier gesaugt und die DNS-Fragmente
werden auf die Nylonmembran transferiert. Am nächsten Tag wurde die Membran kurz in 2 x
SSC gewaschen, um Gelreste zu entfernen und anschließend die DNS durch UV-Bestrahlung
kreuzvernetz und somit auf der Membran fixiert.
Radioaktive Markierung der Sonde
Zur Herstellung und Markierung der Sonde wird das Klenow-Fragment verwendet, welches an
einzelsträngiger DNS den Komplementärstrang synthetisiert. Durch die Zugabe von radioaktiv
markierten Nukleotiden zu unmarkierten Nukleotiden wird die neusynthetisierte DNS markiert.
Zur Markierung der Sonden wurde das „readiprime“-Kit (Amersham) nach Herstellerangaben
verwendet, mit dem bis zu 25 ng DNS unter Verwendung von 1 MBq 32P-dCTP markiert werden
können. Nicht eingebaute radioaktive Nukleotide wurden anschließend mit Microspin S-200
Säulchen (Amersham) vom Reaktionsansatz abgetrennt.
DNS/DNS Hybridisierung
Die DNS/DNS Hybridisierung zwischen einer markierten, einzelsträngigen Sonde und der dazu
komplementären nachzuweisenden chromosomalen DNS-Sequenz führt zur Bildung eines
stabilen doppelsträngigen DNS/DNS-Hybrids. Die Positionen der markierten Hybrid-Moleküle
können durch anschließende Detektion der Markierung sichtbar gemacht werden. Hierfür wurde
die Membran mind. 1 h bei 60°C in 10 ml Hybridisierungslösung (ExpressHyb, BD) prähybridisiert
und dann die markierte, hitzedenaturierte Sonde zugegeben. Die Hybridisierung erfolgte ü/N bei
60°C. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal 10 min bei RT mit Lösung I und einmal 15
min bei 50°C mit Lösung II gewaschen. Spezifisch gebundene Radioaktivität wurde mit Hilfe von
Kodak Biomax MS Film detektiert.
Material und Methoden
52
2.11.10 Isolierung gesamtzellulärer RNS
Zur Isolierung von RNS wurde das TRIzol Reagenz der Firma Invitrogen (Karlsruhe) verwendet.
Hierbei handelt es sich um eine Weiterentwicklung der Guanidiniumthiocyanat Methode. Die
Vorgehensweise erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
2.11.11 Northernblot-Analyse
Analog zur Southernblot-Analyse handelt es sich bei der Northernblot-Analyse um eine Methode
zum Nachweis von RNS-Molekülen einer Probe (Alwine et al., 1977). Dabei wird gesamtzelluläre
RNS in einem denaturierenden Formaldehydgel elektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrocellulose
geblottet und fixiert. Nach Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten DNS-Sonde kann die
mRNS der Probe anhand der Größe und Stärke der Bande qualitativ und quantitativ analysiert
werden.
Die Elektrophorese der RNS erfolgte in einem denaturierenden Agarosegel, um die Hybridisierung von RNS-Molekülen und die Ausbildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Bei
der gebräuchlichsten Methode, die RNS einzelsträngig zu halten, läßt man die freien Amine der
Purin- bzw. Pyrimidinbasen mit Formaldehyd reagieren. Die resultierende Schiff'sche Base kann
keine Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen ausbilden (Lehrach et al.,
1977).
Durchführung:
-
in einer gebackenen 500 ml Schraubdeckelflasche 2,5 g Agarose und 180 ml DEPC-H 2 O
aufkochen, bis eine klare Lösung entsteht
auf ca. 50°C abkühlen lassen
unter Schwenken 45 ml Formaldehyd (37 %) und 25 ml 10 x MOPS zugeben
Gel gießen und erstarren lassen
erstarrtes Gel in Elektrophorese Apparatur einsetzen und mit Laufpuffer überschichten
<?ƒ*<#„'†-H 2 O 1:1 mit RNS-Auftragspuffer versetzen
10 min bei 70°C denaturieren und auf das Gel auftragen
Auftrennung bei konstanten 20 V ÜN
Anschließend wurde das Gel dann 2 mal 5 min in H 2 O geschwenkt. Unter Verwendung von 10 x
SSC als Transferlösung und einer positiven Nylonmembran (Hybond N+, Amersham) wurde dann
wie unter „alkalischer DNS-Transfer“ der Kapillarblot aufgebaut und ausgeführt. Nach dem ü/N
Transfer wurde dann die Membran kurz in 2 x SSC geschwenkt, dann auf Whatmanpapier
getrocknet und unter UV-Bestrahlung kreuzvernetzt.
Die Markierung der DNS-Sonde, die DNS/RNS Hybridisierung und die Detektion der Banden mit
einem Phosphoimager (FujiFilm) wurden, wie unter der Southernblot-Analyse beschrieben,
durchgeführt.
Material und Methoden
53
2.11.12 cDNS Synthese aus gesamtzellulärer RNS
Bei der cDNS Synthese wird mRNS von Zellen oder Gewebeproben in DNS enzymatisch
umgeschrieben. Hierbei werden die molekularen Verhältnisse der Transkripte nicht verändert,
weswegen die entstehende cDNS zur Expressionsquantifizierung mittels semiquantitativer PCR
oder Real-time PCR eingesetzt werden kann. Zusätzlich wurden die cDNS-Proben als
Ausgangsmaterial zur Klonierung von Expressionskonstrukten verwendet.
Ansatz:
+
1 μg
1 μl
RNS in 10 μl DEPC-H 2 O
Oligo-dT Primer 10 μM (Invitrogen)
Inkubation des Anatzes für 2 Minuten bei 70°C und anschließend Abkühlung auf Eis.
+
+
+
+
+
1 μl
4 μl
1 μl
1 μl
2 μl
RNAseOut
5x First-Strand Buffer (Invitrogen)
0,1 M DTT (Invitrogen)
dNTP Mix 10 mM
M-MLV RT (Invitrogen)
Der Ansatz wurde auf Eis pipettiert und für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das
Enzym für 5 min bei 95°C inaktiviert. Abschließend wurden 80 μl H 2 O zum Ansatz zugegeben.
2.11.13 Amplifikation von DNS-Molekülen mittels PCR
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) beruht auf der Eigenschaft von DNS-Polymerasen,
einzelsträngige DNS als Matrize für die Synthese eines Komplementärstranges zu verwenden, um
so Kopien einer spezifischen DNS-Sequenz zu produzieren. Die doppelsträngige DNS wird durch
Hitze denaturiert. Anschließend können durch Abkühlung spezifische Primer an die 5'- und 3'flankierenden Sequenzen des zu amplifizierenden Fragments hybridisieren. Durch Erhitzen auf
72°C kann nun die thermostabile Polymerase den Komplementärstrang synthetisieren. Eine
zyklische Wiederholung der Temperaturänderungen führt zu einem exponentiellen Anstieg der
Konzentration des gewünschten Fragments.
Folgender Reaktionsansatz wurde auf Eis angesetzt:
Reaktionsansatz:
ca. 100 ng
#
#
@
#
#
!@
DNS
Primer 1 (20 pmol)
Primer 2 (20 pmol)
10 x Puffer
dNTP Mix (10 mM)
$"@
H 2 O bidest
Material und Methoden
54
Durchführung des Reaktionszyklus unter folgenden Bedingungen:
1. DNS Denaturierung
2. DNS Denaturierung
3. Primerhybridisierung
4. Primerverlängerung
5. Lagerung bis zur Weiterverarbeitung
95°C
95°C
55-65°C
72°C
4°C
5 min
1 min
30 sec
1 min/Kb des Produktes
unendlich
Die Schritte 2 bis 4 wurden zyklisch 30-mal wiederholt.
2.11.14 SMART-RACE-PCR
Die RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) dient der Identifizierung von cDNA Enden bei
Transkripten, bei denen nur Teile der Sequenz bekannt sind. Zur Identifizierung der VolllängenSequenz der SSPII mRNS wurde die SMART-RACE-PCR (switching mechanism at 5' end of
RNA transcript) von BD Bioscience mit dem „BD SMART RACE cDNA Amplification Kit“
durchgeführt. Bei der SMART-RACE-PCR von BD wird bei der Synthese der 5`bzw. 3`cDNS an
die jeweiligen Enden sog. universelle oligo bzw. Ankersequenzen angehängt. Diese dienen bei der
nachfolgenden RACE-PCR den universellen Kit Primern als Anlagerungsstelle neben den
genspezifischen internen Primern für SSPII. Die cDNS-Synthese wurde in zwei parallelen
Ansätzen für jeweils 5`bzw. 3`cDNS nach Herstellerangaben durchgeführt. Die RACE-PCR
wurde darauffolgend mit den entsprechenden SSPII Primern sowie den universellen Kit Primern
in zwei parallelen Ansätzen (5`bzw. 3`RACE-PCR) nach Herstellerangabe durchgeführt. Danach
konnten die PCR-Produkte kloniert und sequenziert werden.
2.11.15 Real-time PCR
Die Real-time PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht und die Möglichkeit der Quantifizierung bietet. Die
Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenzmessungen während eines jeden PCR-Zykluses
durchgeführt. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu, indem
eine spezifische fluoreszenzmarkierte Sonde, bei der die Fluorophore zuvor gequencht vorliegen,
während der Polymerisierung abgebaut wird und die Fluorophore freigesetzt werden.
Folgender Reaktionsansatz wurde auf Eis angesetzt:
Reaktionsansatz:
5 μl
0,3 0,3 #?{@
‡{
{@
1:5 verdünnte cDNS
Primer 1
Primer 2
qPCR Mastermix-No ROX (Eurogentec)
H 2 O bidest
Sonde
Material und Methoden
55
Durchführung des Reaktionszyklus unter folgenden Bedingungen:
1. DNS Denaturierung
2. DNS Denaturierung
3. Primerhybridisierung und -verlängerung
4. Lagerung bis zur Weiterverarbeitung
95°C
94°C
60°C
4°C
7 min
20 sec
1 min
unendlich
Die Schritte 2 bis 3 wurden zyklisch 40-mal wiederholt. Unmittelbar nach jedem 3. Schritt wurde
die Fluoreszenz gemessen. Die unterschiedliche Geschwindigkeit der Fluoreszenzzunahme konnte
in CT Werten dargestellt und die verschiedenen cDNS Proben und Gene verglichen werden.
2.11.16 Mutagenese-PCR
Zur Insertion einzelner Mutationen in eine DNS wurde der QuikChange® Site-Directed
Mutagenesis Kit (Stratagene) nach Angaben des Herstellers verwendet.
Folgender Reaktionsansatz wurde auf Eis angesetzt:
Reaktionsansatz:
5-10 ng
125 ng
125 ng
@
#
#
!@
dsDNS Template
Primer 1
Primer 2
10 x Puffer
dNTP
Pfu Polymerase (2,5 U/μl)
H 2 O bidest
Durchführung des Reaktionszyklus unter folgenden Bedingungen:
1. DNS Denaturierung
2. DNS Denaturierung
3. Primerhybridisierung
4. Primerverlängerung
5. Lagerung bis zur Weiterverarbeitung
95°C
95°C
55°C
68°C
4°C
30 sec
30 sek
1 min
1 min/Kb der Plasmidlänge
unendlich
Die Schritte 2 bis 4 wurden zyklisch 12-18 Mal in Abhängigkeit von der eingefügten Mutation
wiederholt. Für eine Punktmutation werden 12 Zyklen, für einen einzelnen Aminosäureaustausch
16 Zyklen und für eine Insertion oder Deletion mehrerer Aminosäuren 18 Zyklen vom Hersteller
angegeben. Nach der Amplifikation wurden die Produkte für 1 h bei 37°C mit DpnI verdaut, um
die methylierten, nicht-mutierten Templates zu fragmentieren. Anschließend wurde 1 μl der DNS
zu den kompetenten XL1-Blue Zellen gegeben und für 30 min bei 4°C inkubiert. Nach dem
Hitzeschock (45 sek., 42°C) und 2-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen in 500 μl LBMedium für 1 h bei 37°C geschüttelt und 250 μl auf Antibiotika-haltigen LB-Platten ausplattiert.
Material und Methoden
2.12
56
Protein-biochemische Methoden
2.12.1 Extraktion von Proteinen aus Organen
Zur Proteinextraktion wurden Organe von infizierten und uninfizierten Kontrollmäusen in 2 ml
PBS mit Proteaseinhibitor mit dem Ultra-TURRAX® homogenisiert. Durch Zugabe von 1 % Triton
X-100 wurden die Organe für 15 min bei 4°C auf dem Drehrad lysiert. Zellreste wurden durch 15minütige Zentrifugation bei 4500 UpM abzentrifugiert und der Überstand anschließend in ein
neues Gefäß überführt. Nach erneuter Zentrifugation (10 min, 13000 UpM) und Überführung des
Überstandes in ein neues Gefäß wurde das Lysat bis zur weiteren Verwendung (Western Blot) bei
-80°C gelagert.
2.12.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen wurde das BCA Protein Assay Kit (Pierce)
verwendet. Lysate wurden hierfür in mehreren Verdünnungsstufen (1:3) neben einer BSAVerdünnungsreihe
(2
mg/ml
Ausgangskonzentration)
als
Standard
auf
eine
96-well
Flachbodenplatte ausplattiert. Durch Zugabe von 200 μl Reagenz A+B (50:1) und Inkubation von
20 min bei 37°C konnte anschließend im ELISA-Reader (562 nm) die Konzentration der Proteine
in den Lysaten gemessen werden. Für Western Blot Analysen wurden 35 μg Protein eingesetzt.
2.12.3 Western Blot Analyse
Mit Hilfe der Western Blot Analyse wurden verschiedene Proteine in Zelllysaten durch
spezifische Antikörper nachgewiesen. Hierfür wurden 1 x 106 - 1 x 107 Zellen mit 50 μl - 500 μl
Lysepuffer lysiert. Das Lysat wurde 15 min auf Eis inkubiert und anschließend 10 min bei 13000
UpM und 4°C abzentrifugiert. Zum Überstand wurde je nach Lysatvolumen 5 x Auftragspuffer
gegeben. Die Lysate mit Auftragspuffer wurden vor dem Auftragen auf das SDS-Gradienten Gel
(4% - 12%) bzw. bei kleinen Proteinen (SSPII) 16% Tricin SDS Gel 10min bei 95°C aufgekocht.
Der Gellauf erfolgte in Laufpuffer (entweder Tricin-Laufpuffer für Tricin-Gele oder GlyzinLaufpuffer nach Lämmli für die mit dem NuPAGE® Electrophorese System von Invitrogen nach
Protokollangaben des Herstellers bei 150-200 V. Im Anschluss wurde das Gel auf eine
Nylonmembran für Proteingele mit Transferpuffer mit 20 % Methanol in demselben NuPAGE®
Electrophorese System geblottet. Der Aufbau des Blots erfolgte nach Herstellerprotokoll. Zur
Detektion der geblotteten Proteine wurde die Membran zuerst mit 5 % Milchpulver, gelöst in
TBS-T, für 1 h bei RT geblockt um eine unspezifische Proteinbindung des Antikörpers zu
verhindern. Der primäre Antikörper wurde in 3 % Milchpulverlösung nach Angaben des
Antikörperherstellers verdünnt und über Nacht bei 4°C mit der Membran auf einem Schüttler
inkubiert. Um unspezifisch gebundenen Antikörper abzuwaschen wurde der Blot bei RT für 15
min bei mehrmaligem Wechsel des Waschpuffers (TBS-T) gewaschen. Der Meerettich Peroxidase
Material und Methoden
57
gekoppelte Sekundär-Antikörper wurde ebenfalls in 3 % Milchpulver gelöst und für 2 h mit der
Membran inkubiert und im Anschluss mehrmals insgesamt 30 min gewaschen. In der
Dunkelkammer erfolgte die Proteindetektion mit Chemolumineszenzlösung (ECL, Amersham,
Braunschweig) mit anschließender Exposition und Entwicklung des durch Chemolumineszenz
belichteten Films.
2.12.4 Immunpräzipitation
Die Immunpräzipitation wurde durchgeführt, um die sehr geringe Menge an endogenem SSPIIProtein aus einem Organlysat anzureichern und nach darauffolgender Westernblotanalyse
nachzuweisen. Hierfür wurden Organlysate hergestellt und 10 Pl aufgereinigter polyklonaler
SSPII Antikörper dazugegeben. Nach einer dreistündigen bis über Nacht Inkubation bei 4°C auf
dem Drehrad wurden 50 Pl Protein G Sepharose hinzupipettiert und zwei weitere Stunden bei 4°C
auf dem Drehrad belassen. Nach fünfmaligem Waschen mit Waschpuffer (150 mM NaCl, 10 mM
Tris/HCl, pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,2 % NP40) wurde das Pellet vollständig trocken gesaugt und mit
40 μl 5 x Auftragspuffer versehen. Die Proben wurden für 5 min bei 95°C gekocht, anschließend
für 10 min bei 13000 UpM zentrifugiert und der Überstand erneut in ein frisches Gefäß überführt.
Es wurde je 20 μl Probe auf ein Tricin SDS-Gel (16 %) aufgetragen und wie unter 2.12.3
beschrieben ein Western Blot durchgeführt. Zum Proteinnachweis wurde mit polyklonalem SSPII
Antikörper aus dem Kaninchen mit darauffolgender Inkubation mit HRP gekoppeltem Ziege-antiKaninchen-Antikörper gefärbt.
2.13
Computerprogramme
2.13.1 Klonierungsstrategien
Strategien zum Klonieren von Expressions- und Rekombinationsvektor wurden mit Hilfe des
Programms Gene Construction Kit2 von TEXTCO Company New Hampshire, U.S.A erstellt.
2.13.2 Sequenzvergleiche
Sequenzvergleiche wurden mit dem Programm SeqMen von DNAStar durchgeführt.
2.13.3 Real-time PCR
Für die Auswertung der Real-time PCR Daten wurden die CT Werte mit Hilfe der iQ5 Software
von der Firma Biorad ermittelt. Die ''CT Methode (Pfaffl, 2001) wurde zur Ermittlung der
Expressionszunahme der einzelnen Gene zugrunde gelegt.
Für die statistische Auswertung und die Darstellung der Real-time Daten wurde das Programm
GraphPad Prism 4 verwendet.
Ergebnisse
59
3 Ergebnisse
3.1 mGBP7
3.1.1 Einführung
In vorangegangenen Microarray Transkriptomanalysen (Degrandi, 2007), bei denen Ana-1
Makrophagen mit IFNJ oder TNF sowie IFNJ in Kombination mit TNF stimuliert wurden, konnte
eine Genfamilie als hochgradig IFNJreguliert identifiziert werden. Dabei handelt es sich um die
sogenannten murinen 65 kDa Guanylat-bindenden Proteine (GBPs). Im Rahmen der
Transkriptomanalyse wurden drei neue Mitglieder dieser Familie identifiziert, mGBP6, mGBP7
und mGBP8 (Degrandi et al., 2007). Weitere Familienmitglieder, mGBP9 und 10, konnten
zusätzlich durch in silico Analysen identifiziert werden (Kresse et al., 2008). In diesem Kontext
wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die gesamte 65 kDa GBP-Genfamilie auf mRNS
Expressionsebene charakterisiert. Dafür wurden für alle Familienmitglieder spezifische Real-time
PCR Primer- und Sonden- Kombinationen etabliert und die Expression dieser Gene in
Makrophagen und nach Listerien-Infektion in vivo analysiert. Des Weiteren wurde in dieser
Arbeit die Charakterisierung des neuen, noch unbeschriebenen Proteins mGBP7 auf
Expressionsebene in vivo nach Listerien- und Toxoplasmen-Infektion durchgeführt sowie in vitro
die subzelluläre Lokalisation des Proteins analysiert. Abschließend wurde eine Targetingstrategie
zur Deletion des Genlokus mgbp7 erstellt und der Rekombinationsvektor kloniert.
3.1.2 Etablierung der Real-time PCR für die Genfamilie der murinen 65
kDa Guanylat-bindenden Proteine
Um ein umfangreiches Expressionsprofil der gesamten Familie der murinen Guanylat-bindenden
Proteine zu erstellen, sollten spezifische Real-time PCR Sonden und Primer für jedes Mitglied
(mGBP1-10) etabliert werden. Die Amplifikate sollten, wenn möglich, Intron-überspannend sein,
damit die Amplifikation und Detektion von genomischer DNS verhindert wird. Des Weiteren ist
es für die Verwendung eines großen Probenumfanges und der gleichzeitigen Durchführung der
Real-time PCR für ein geeignetes Housekeeping Gen hilfreich, wenn die Primer und Sonden aller
PCRs bei gleicher Annealingtemperatur und somit parallel durchgeführt werden können. Daher
wurde zunächst überprüft, ob die einzelnen mGBPs mit Hilfe von Sonden der sogenannten
Universal Probe Library gemessen werden können. Diese Sonden basieren auf der Taqman
Technologie (Sonden mit Fluorophor und Quencher), sind aber nur 8-9 Nukleotide lang
(klassische Taqman-Sonden 25-30 nt). Durch Einbau von stabilen DNS Analoga, den sog. LNAs
(Locked Nucleic Acids), sind diese Sonden jedoch so thermostabil wie klassische Taqman-Sonden.
Diese bei uns im Labor vorhandenen Sonden sollten mit spezifischen Primern für die Real-time
Analysen der mGBPs eingesetzt werden. Dafür wurden mit Hilfe des Programms Universal Probe
Finder (https://qpcr1.probefinder.com/roche2.html) und Eingabe der Accession Nummer der
Ergebnisse
60
jeweiligen mRNS oder den vorher identifizierten mGBP Sequenzen, Intron-umspannende Primer
und Sonden ausgesucht. Diese Primer Sequenzen wurden dann auf ihre Spezifität für das einzelne
mGBP Gen untersucht, indem die Sequenzen mit den cDNS-Sequenzen der anderen
Familienmitglieder verglichen wurden (MegAlign, DNAStar, ClustalW Methode). Dabei konnten
für die Gene mGBP1 bis mGBP5 und mGBP7 spezifische Primer und Sonden gefunden werden.
Für die hoch homologen Sequenzen mGBP6, 9 und 10 wurden in Zusammenarbeit mit der Firma
TIB MOLBIOL (Berlin) klassische Taqman Sonden und Primer entwickelt. Auch für mGBP8
wurden herkömmliche Sonden von TIB MOLBIOL entwickelt, da die Sequenz stark homolog zu
mGBP4 ist. Die Real-time PCR für mGBP4 hingegen konnte mittels Primer- und SondenKombination der Universal Probe Library durchgeführt werden, da der forward Primer im Exon 5
liegt und die Sonde sowie der reverse Primer im Exon 6. Ein homologes Exon 6 ist in der Sequenz
von mGBP8 nicht vorhanden (Kresse et al., 2008).
Die Real-time Sonden und Primer der hochhomologen Gene wurden dann mit Hilfe der
klonierten Sequenzen gegeneinander getestet, indem Primer und Sonden von der einen GTPase
mit dem cDNS Template der anderen GTPasen amplifiziert und detektiert wurden. Als Beispiel ist
in Abbildung 3.1 die Test-PCR gezeigt, bei der die Sonden- und Primer-Kombination von mGBP9
unter Einsatz von mGBP9 cDNS als Template (CP-Werte: 9,91 und 9,71) sowie in gleicher Menge
eingesetzt das cDNS Template von mGBP6 (CP-Werte: 36 und 37) durchgeführt wurden; der
Unterschied liegt somit bei 26 PCR Zyklen. Umgekehrt wurde mit der Real-time PCR für mGBP6
und Einsatz von mGBP6 cDNS und mGBP9 cDNS Template ein Unterschied der Zyklenzahl von
24 ermittelt.
Auf dieses Beispiel bezogen müßten, bei der Annahme, dass sich die Anzahl der Produkte nach
jedem Zyklus verdoppelt, rund 107-108 mehr Kopien von mGBP9 in der Probe vorhanden sein, um
einen ähnlichen CP-Wert wie für mGBP6 zu erhalten. Dabei ist die Konkurrenz um Primer und
Sonden durch das bevorzugte Produkt mGBP6 noch nicht mit einbezogen. Daher kann
angenommen werden, dass unter den in dieser Arbeit definierten Amplifikationsbedingungen die
jeweilige PCR spezifisch ist. Ähnliche Ergebnisse konnten auch mit den Primer- und SondenKombinationen für mGBP8 unter Verwendung von mGBP4, 6, 9 und 10 cDNS als Template,
erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Ein anderes Bild stellt sich in Bezug auf die mGBP6 Primerund Sonden-Kombination beim Einsatz von mGBP10 cDNS Template und umgekehrt dar. Hierbei
konnte wegen der großen Übereinstimmungen in den Sequenzen mit 98,4 % Identität (Kresse et
al., 2008) keine für nur ein Template spezifische Primer- und Sonden-Kombination etabliert
werden, die Intron-überspannend beide Genprodukte voneinander abgrenzt, da nur in der Sonde
ein Mismatch vorliegt. Aus diesem Grund wurden die erzielten Ergebnisse als mGBP6/10
dargestellt.
Aufgrund der Experimente konnten für alle Real-time PCRs der mGBPs und E-Aktin eine
Annealingtemperatur von 60°C bestimmt werden, wobei für alle Amplifikationen ein spezifisches
Ergebnis erzielt werden konnte (Außnahme: mGBP6 und mGBP10).
Ergebnisse
61
Template9
Template6
Abb. 3.1: Test der Primer- und Sonden-Kombination für mGBP9 mittels Real-time PCR. Als Template wurde in einer
PCR cDNS von mGBP9 (rosa) und in einer weiteren PCR cDNS von mGBP6 (rot/braun) eingesetzt. Die PCR wurde
jeweils bei einer Annealingtemperatur von 60°C in 40 Zyklen durchgeführt.
3.1.3 Induzierbarkeit der mGBP Familie in Ana-1 Makrophagen
Zur Validierung der Microarray Daten wurden Ana-1 Makrophagen mit murinem IFNJ (10ng/ml
entsprechend 100U/ml) stimuliert. Zu den Zeitpunkten 2, 6 und 16 h nach IFNJ Zugabe wurden
die Zellen geerntet, daraus mRNS aufgereinigt und anschließend in cDNS umgeschrieben. Um die
Induzierbarkeit
der
jeweiligen
Gene
zu
ermitteln,
wurde
deren
Ratio,
also
der
Expressionsunterschied der stimulierten bezogen auf die unstimulierte Probe, mittels der ''CPMethode (Pfaffl, 2001) ermittelt. Hierbei wurden die jeweiligen CP Werte der Gene vorher auf
das Housekeeping Gen E-Aktin normalisiert ('CP) und dann die Ratio (2-''CP) berechnet.
In Abbildung 3.2 sind die relativen Expressionsunterschiede von mGBP1-10, GTPBP-1 (GTP
Binde Protein) als Negativ- sowie iNOS (induzierbare NO Synthase) als Positiv-Kontrolle
dargestellt. Wie abzulesen ist, stiegt die relative mRNS Menge schon ab 2 h nach Stimulation bei
allen Mitgliedern an und nahm bis einschließlich 16 h zu. Somit bestätigten sich dabei auch die
vorangegangenen Array Daten für die neuen Mitglieder (mGBP6, 7, 8, 9 und 10), so dass diese zu
den IFNJ-induzierten GTPasen zu zählen sind. Auch die iNOS mRNA Menge nahm bis 6 h
(höchste Ratio) zu, um dann bis 16 h wieder leicht abzunehmen, wobei der 16 h Wert noch
deutlich den Wert für 2 h überstieg. Im Gegensatz dazu lag die Ratio bei GTPBP1 zu jedem
Zeitpunkt um den Wert 1, was einer zu allen Zeitpunkten (0-16 h) vergleichbaren mRNS-Menge
entsprach. Dieses Gen, das homolog zu den mGBPs ist, war daher als nicht induzierbar durch IFNJ
zu betrachten und trotz der Möglichkeit GTP zu binden, nicht zu den 65kDa GBPs zu zählen, die
alle durch die IFNJ regulierte Expression charakterisierbar sind.
Ergebnisse
10 5
2h
6h
16h
10 4
ratio=2-'' CT
62
10 3
10 2
10 1
10 0
O
S
iN
P1
TP
B
G
B
P9
m
G
B
P8
G
m
G
m
m
G
B
P7
/1
0
B
P6
B
P5
m
G
B
P4
m
G
B
P3
m
G
B
P2
G
m
m
G
B
P1
10 -1
Abb. 3.2: Induktion der murinen GBPs in Ana-1 Makrophagen durch IFNJ. Aus IFNJ stimulierten Makrophagen (0, 2, 6
und 16 h) wurde mRNS gewonnen, in cDNS umgeschrieben und Real-time PCRs durchgeführt. Dargestellt sind die
jeweiligen Expressionsunterschiede der Gene mGBP1-10, GTPBP-1 und iNOS, bezogen auf den 0 h Wert und
- CP
normalisiert zu E-Aktin (2 '' ).
Wie in früheren Arbeiten beschrieben (Boehm et al., 1998; Nguyen et al., 2002), werden mGBP1,
2 und 5 neben IFNJ auch durch IFNE, IL-1E, TNF und LPS induziert. Die Fähigkeit dieser und
weiterer Zytokine sowie TLR-Liganden wurde für die bisher beschriebenen (mGBP1-5) und
neuen mGBPs (mGBP6-10) untersucht. Hierzu wurden Ana-1 Makrophagen 16 h mit IFNJ(10
ng/ml), TNF (10 ng/ml), TNF/IFNJ(je 10 ng/ml), IFNE(10 ng/ml), IL-2 (10 ng/ml) als
Negativkontrolle, IL-1E (10ng/ml), LPS (100 ng/ml), Listerien-LTA (1 Pg/ml), CpG ODN 1668 (1
PM) und poly (I:C) (1 Pg/ml) stimuliert. Analog zum vorherigen Versuch wurde cDNS
synthetisiert und Real-time PCRs der verschiedenen mGBP-Familienmitglieder und Kontrollen
durchgeführt (Abbildung 3.3). Als weitere Positivkontrolle der Stimulation mit den verschiedenen
Liganden wurde die Interleukin 12 Untereinheit p40 (IL-12p40) Expression gemessen. Wie schon
im vorherigen Versuch (Abbildung 3.2) beschrieben, waren die mGBPs1-10 stark induziert durch
IFNJ. Das Zytokin TNF konnte in den Ana-1 Makrophagen nur die Expression von mGBP4
induzieren. Im Gegensatz dazu wurden alle Mitglieder, ausgenommen mGBP1, synergistisch von
IFNJ und TNF induziert, wobei die synergistische Steigerung durch beide Zytokine am
deutlichsten bei mGBP6/10 (Ratio IFNJ: 18800; IFNJ/TNF: 32000) und am geringsten bei mGBP9
(11; 17) zum Tragen kam. IFNE erhöhte die Expression in Ana-1 Makrophagen bei mGBP2, 3, 4,
6/10, 7, 8 und 9. Dem gegenüber konnte eine Expressionssteigerung bei mGBP1 und 5 in Ana-1
Makrophagen nicht detektiert werden. Durch das als T-Zellen Wachstumsfaktor beschriebene
Interleukin-2 (Janeway, Jr. et al., 2005) wurde keine vermehrte Genexpression der gemessenen
Gene in Ana-1 Makrophagen induziert.
Das Zytokin IL-1E löst nur bei mGBP2 eine leichte Steigerung der Expression aus, während bei
allen anderen mGBP-Genen kein Effekt nachzuweisen war. Die TLR-Liganden LTA, LPS und CpG
führten zur Erhöhung der Transkriptmenge der Positivkontrollen IL-12p40 und iNOS, jedoch nur
bei mGBP6/10 führte LTA, LPS und CpG, bei mGBP2 LPS und CpG und bei mGBP1 nur CpG zur
Ergebnisse
63
Expressionszunahme. Das Gen GTPBP1 wurde weder von den Zytokinen, noch von den TLRLiganden induziert. Wie im vorherigen Versuch fungierte auch hier dieses Gen als
Negativkontrolle im Kontrast zur Beschreibung des Proteins (Senju et al., 2000), welches dort in
der humanen Monozytenzelllinie THP-1 durch IFNJ induziert wurde.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Genexpression dieser GTPasen-Familie bei allen
Mitgliedern durch IFNJ und IFNE induzierbar ist, während andere Stimuli, wie TLR-Liganden,
unterschiedliche mGBPs in ihrer Expression beeinflussen können.
10 4
10 3
10 3
10 0
10 0
mGBP6/10
mGBP5
10 4
10 3
10 3
10 0
10 1
10 0
10 -1
mGBP7
10 2
10 1
10 0
LP
S
po C p G
ly
(I:
C
)
10 -1
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
LP
S
po C p G
ly
(I:
C
)
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
10 -1
10 2
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
10 1
ratio = 2-'' CP
10 4
10 3
ratio = 2 -'' CP
10 4
10 2
mGBP9
mGBP8
10 4
10 3
10 3
10 1
10 0
10 -1
ratio = 2-'' CP
10 4
10 3
ratio = 2-'' CP
10 4
10 2
10 2
10 1
10
0
10 1
10 0
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
LP
S
po CpG
ly
( I:
C
)
iNOS
IL-12p40
10 2
10 1
10 0
10 -1
10 4
10 2
10 1
10 0
LP
S
po CpG
ly
( I:
C
)
IF
N
J
IF TN
N F
J/
TN
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
LP
S
po CpG
ly
( I:
C
)
10 -1
10 3
10 2
10 1
10 0
10 -1
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
10 3
ratio = 2 -'' CP
10 4
10 3
ratio = 2-'' CP
10 4
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
10 2
10 -1
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
IF
N
J
IF TN
F
N
J/
TN
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
LP
S
C
po pG
ly
(I:
C
)
10 -1
GTP-BP-1
LP
S
po C p G
ly
(I:
C
)
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
LP
S
po CpG
ly
(I:
C
)
10 -1
IF
N
J
IF TN
N F
J/
TN
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
LP
S
po C p G
ly
(I:
C
)
IF
N
J
IF TN
N F
J/T
N
F
IF
N
E
IL
-2
IL
1E
LT
A
ratio = 2 -'' CP
10 1
10 -1
mGBP4
ratio = 2 -'' CP
10 2
LP
S
po CpG
ly
( I:
C
)
10 0
10 1
LP
S
po CpG
ly
( I:
C
)
10 1
10 2
LP
S
po C p G
ly
(I:
C
)
10 2
ratio = 2 -'' CP
10 4
10 3
ratio = 2-'' CP
ratio = 2 -'' CP
10 4
10 -1
ratio = 2-'' CP
mGBP3
mGBP2
mGBP1
Abb. 3.3: Real-time Analyse der Expression der murinen GBPs 1 bis 10 in Ana-1 Makrophagen nach 16 h Stimulation
- CP
mit verschiedenen Zytokinen und TLR-Liganden. Dargestellt ist die Ratio (2 '' ) für jedes Gen bei den angegebenen
Stimulationen.
Ergebnisse
64
3.1.4 Regulation von mGBP7 durch den Transkriptionsfaktor IRF-1
Unerläßlich für die Expression von Genen sind Transkriptionsfaktoren, welche nach Stimulation
von Zellen aktiviert und/oder neu synthetisiert werden. Diese lagern sich im Promotorbereich der
Genloci vorübergehend an und beeinflussen die Transkription der nachgelagerten Gene positiv
(Lewin, 1998). Im Promotorbereich der beiden GTPasen mGBP1 und mGBP2 konnten je zwei
ISRE und eine GAS Sequenz identifiziert werden (Briken et al., 1995). Der Transkriptionsfaktor
IRF-1 wird durch den Stimulus mit Interferonen, insbesondere IFNJ, neu synthetisiert und
reguliert die Transkription verschiedener Gene somit sekundär durch Anlagern an ISRE
Sequenzen. Insbesondere für iNOS und auch mGBP2 wurde eine starke Abhängigkeit von der
IFNJ induzierten IRF-1 Neusynthese in Makrophagen und embryonalen Fibroblasten beschrieben
(Huang et al., 1993; Kamijo et al., 1994; Boehm et al., 1998). mGBP7 besitzt 2 GAS-Elemente
innerhalb der 5´ Region stromaufwärts von Exon 1 und eine putative ISRE Sequenz 3´der GAS
Elemente, allerdings bei wenigen Transkripten überlappend mit einem erweiterten Exon 1
(Olszewski et al., 2006). Somit stellt sich hier die Frage, ob die Transkription von mGBP7 die
Produktion von IRF-1 erfordert.
3.1.4.1 IRF-1-Abhängigkeit der mGBP Expression in embryonalen Fibroblasten
Zur Beantwortung dieser Frage wurden zunächst murine embryonale Fibroblasten (mEF) von
C57BL/6 (Wt) und irf-1-/- (IRF-1 ko) Mäusen 16 h mit IFNJ stimuliert. Anschließend wurden
Zelllysate zum Proteinnachweis hergestellt sowie mRNS für Real-time RT-PCR Analysen
aufgereinigt. In den Wt Fibroblasten fand eine leichte Steigerung der Transkriptmenge von
mGBP7 statt, während die mGBP2 mRNS-Menge durch IFNJ Stimulation deutlich stärker anstieg.
Ein anderes Bild ergab sich bei der Stimulation der irf-1-/- Fibroblasten, hier fand eine weitaus
stärkere Induktion von mGBP7 durch IFNJ statt als von mGBP2. Allerdings wurde die mGBP2
mRNS-Menge auch ohne den Transkriptionsfaktor IRF-1 hochreguliert, jedoch stark verringert,
im Vergleich zu den Wt Fibroblasten (Wert: 590 in Wt, Wert: 5,1 in IRF-1 ko). Diese
Induktionsfähigkeit
in
IRF1-ko
Fibroblasten
bei
mGBP2
weist
auf
einen
weiteren
Transkriptionsfaktor hin, welcher die Produktion von mGBP2-mRNS beeinflußt.
Die basale Transkriptmenge von mGBP7 und mGBP2 lag in den irf-1-/- mEFs deutlich niedriger,
als in Wt Zellen. Dieses Ergebnis weist auf einen Einfluß von konstitutiv produziertem IRF-1 auf
die Basalexpression von mGBP7 und mGBP2 in unstimulierten Zellen hin.
Ergebnisse
65
10 3
wt unst.
wt IFNJ
IRF-1 ko unst.
2-'CPx10000
10 2
IRF-1 ko IFNJ
10 1
10 0
B
P2
G
m
m
G
B
P7
10 -1
Abb. 3.4: Expression von mGBP7 und mGBP2 in murinen embryonalen Fibroblasten von IRF-1 ko (schwarz,
- CP
dunkelgrau) und Wt (weiß und hellgrau) Mäusen. Dargestellt ist die mRNS Menge normalisiert zu E-Aktin (2 ' ).
Zur Analyse der Proteinexpression (Abbildung 3.5) von mGBP7 und mGBP2 wurde aus den
Zelllysaten ein Westernblot erstellt. Hierfür wurden Peptid-Antikörper in Kaninchen hergestellt.
Das gegen das spezifische mGBP7-Peptid aufgereinigte Serum der Tiere wurde dann auf seine
Spezifität gegen mGBP7 und mGBP2 hin getestet und konnte für die Analyse der
Proteinexpression dieser GTPasen im Westernblot herangezogen werden. Hierbei wurden 35Pg
Gesamtprotein pro Tasche aufgetragen und der Westernblot hinterher mit den jeweiligen
Antiseren inkubiert und entwickelt. Es konnte weder in den IRF-1 ko embryonalen Fibroblasten
noch in den Wt embryonalen Fibroblasten mGBP7-Protein nach IFNJ Stimulation detektiert
werden. Demgegenüber wurde die Proteinexpression von mGBP2 deutlich in Wt embryonalen
Fibroblasten nach IFNJ Stimulation induziert, während keine mGBP2 Proteinexpression ohne den
Transkriptionsfaktor IRF-1 (IRF-1 ko) nach IFNJ Stimulation stattfand.
Dieser Versuch zeigte, dass einerseits die Transkription von mGBP7 mit und auch ohne IRF-1
deutlich induziert wird (Real-time RT PCR Analyse), andererseits in Fibroblasten nach alleiniger
IFNJ Stimulation keine Proteinexpression nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren wurde
deutlich die IRF-1 Abhängigkeit von mGBP2 in Fibroblasten auf Trankriptions- und
Translationsebene belegt.
Abb. 3.5: Westernblotanalyse von mGBP2 und mGBP7. Wt und IRF-1 ko mEF wurden 16 h mit IFNJ stimuliert, IRF-1-ko
mEF. Es wurden 35 Pg Gesamt-Protein je Probe aufgetragen. Der Westernblot wurde mit anti-mGBP7, -mGBP2, und -EAktin inkubiert und entwickelt.
Ergebnisse
66
3.1.4.2 IRF-1-Abhängigkeit der mGBP Expression in Knochenmarksmakrophagen
Wie in Ana-1 Makrophagen und embryonalen Fibroblasten gezeigt, wurde mGBP7 stark von IFNJ
induziert. Um auch weiterhin zu prüfen, ob mGBP7 in Abhängigkeit von der IRF-1 Neusynthese
transkribiert und translatiert wird, wurden Makrophagen aus dem Knochenmark (BMDM) von
Wt und irf-1-/- Mäusen generiert. Die Makrophagen wurden 16 h mit IFNJ(10 ng/ml), TNF (10
ng/ml), TNF/IFNJ(je 10 ng/ml), IFNE(10 ng/ml), IL-1E (10ng/ml), LPS (100 ng/ml), CpG ODN
1668 (1PM), poly (I:C) (1 Pg/ml) und einem Cocktail (Kombination aus allen Einzelstimulationen
plus Listerien-LTA (1 Pg/ml)) stimuliert. Die daraus hergestellte cDNS wurde dann mit Hilfe der
Real-time PCR analysiert (Abbildung 3.6).
Die Transkription von mGBP7 in Wt BMDM wurde von IFNJ und auch von TNF alleine
induziert. Die Kombination des Stimulus IFNJ/TNF zeigte keinen Synergismus, da keine
Steigerung im Vergleich zu IFNJ alleine erfolgte. Weiterhin wurde mGBP7 durch IFNE
hochreguliert. Die TLR-Liganden LPS (TLR4) und poly (I:C) (TLR3) induzierten die Transkription
des Gens ebenso. Ohne den Transkriptionsfaktor IRF-1 war mGBP7 nur marginal weniger
transkribiert als in Wt BMDM, mit Ausnahme beim Stimulus TNF, hier konnte im Vergleich zur
unstimulierten Kontrolle keine Erhöhung der mRNS Menge nachgewiesen werden. Durch den
Stimulus „Cocktail“ wurde sogar eine etwas höhere Menge an mGBP7 mRNA in IRF-1 ko BMDM
produziert als in Wt BMDM (Abbildung 3.6a). Die Transkription von mGBP2 in den Wt BMDM
fand im starken Maße nach IFNJ aber auch nach TNF, IFNJ/TNF und IFNE Behandlung statt
(Abbildung 3.6b). Wie mGBP7 wurde mGBP2 auch von den TLR-Liganden LPS und poly (I:C)
induziert, sowie vom Kombinations-Stimulus „Cocktail“. In den IRF-1 ko BMDM fand nach 16 h
Stimulation auch eine Transkriptionserhöhung nach allen Stimulationen im Vergleich zur
unstimulierten Kontrolle statt, allerdings in einer sehr viel geringeren Menge im Vergleich zu den
Wt Makrophagen.
Irgm1 (LRG-47) gehört zu den in der Maus exprimierten p47 GTPasen (IRGs) und die Induktion
dieses Gens wurde als IRF-1 unabhängig beschrieben (Boehm et al., 1998). Daher diente Irgm1 als
Positivkontrolle für die IRF-1 ko Stimulationen. Das Transkriptionsprofil von Irgm1 war bei Wt
und bei IRF-1 ko BMDM dem von mGBP7 sehr ähnlich (Abbildung 3.6c). Auch hier bestand kein
oder nur ein marginaler Unterschied in der Transkriptionsmenge von Wt zu IRF-1 ko, wobei nach
TNF Stimulation eine etwas geringere Transkriptmenge bei den IRF-1 defizienten Zellen
nachweisbar war, wie bei mGBP7 und im Gegensatz zu mGBP2. Die Ergebnisse der iNOS PCR
bestätigten die für iNOS beschriebene IRF-1 Abhängigkeit sehr deutlich (Abbildung 3.6d). In Wt
BMDM fand ein deutlicher Anstieg der Transkriptmenge nach der Behandlung mit IFNJ sowie
eine deutlich stärkere Induktion nach TNF und eine synergistische Induktion durch IFNJ/TNF
statt. Auch die TLR-Liganden LPS und poly (I:C) sowie der Kombinations-Stimulus „Cocktail“
führten zur deutlichen Induktion von iNOS. Nach IFNE Stimulation kam es nur zu einer geringen
mRNS Synthese, welche jedoch im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle als induziert zu zählen
Ergebnisse
67
war. Im starken Gegensatz dazu wurde ohne IRF-1 Synthese kein iNOS nach den Stimulationen
IFNJ, TNF, IFNE produziert. Eine Induktion fand jedoch nach IFNJ/TNF in Kombination, LPS
sowie nach poly (I:C) statt. Diese Erhöhung war jedoch stark reduziert im Vergleich zur
Stimulation der Wt BMDM. Der Kombinations-Stimulus „Cocktail“ führte zu einer Transkription
von iNOS mRNS in etwa der Höhe des Wt-Wertes. Dies führt zur Hypothese, dass bei einer
Kombination
von
verschiedenen
Zytokinen
und
TLR-Liganden
als
Stimulus
andere
Transkriptionsfaktoren redundant zu IRF-1 wirken und somit das Fehlen von IRF-1 in diesen
Zellen ausgeglichen werden kann.
10 4
Wt
IRF-1 ko
2
10 1
10 0
3
10 2
10 1
10 0
-1
10 1
10 0
d)
L
po PS
ly
(I:
C
)
co
ck
ta
il
10 4
10
Wt
IRF-1 ko
3
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st
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J
T
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N
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TN
F
IF
N
E
10 -1
st
.
10
10 2
un
st
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IF
N
J
TN
IF
F
N
J/
TN
F
IF
N
E
Wt
IRF-1 ko
2-'CPx10.000
10
10 3
L
po PS
ly
(I:
C
)
co
ck
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10 4
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N
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c)
Wt
IRF-1 ko
10 -1
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IF
N
J
T
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N
E
10 -1
10 4
J
TN
IF
F
N
J/
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F
IF
N
E
10
2-'CPx10.000
2-'CPx10.000
10 3
b)
IF
N
a)
Abb. 3.6: Real-time Analyse von cDNS generiert aus stimulierten BMDM von Wt und IRF-1 ko Makrophagen. a) mGBP7,
b) mGBP2, c) Irgm1 (LRG-47), d) iNOS mRNA-Menge, jeweils Wt (grau) und IRF-1 ko (schwarz) nach unterschiedlichen
- CP
Stimulationen 16h. Die CP-Werte der PCRs wurden zu E-Aktin normalisiert (2 ' ) und mit 10.000 multipliziert.
Zusammenfassend läßt sich sagen, dass die Unterschiede auf der Transkriptionsebene zwischen
Wt und IRF-1 ko BMDM bei mGBP7, wie auch bei LRG-47 marginal sind (mit Ausnahme nach
TNF Stimulation). Die Transkription von mGBP2 wird jedoch durch den Transkriptionsfaktor
IRF-1 signifikant verstärkt, da ohne IRF-1 zwar eine Expressionserhöhung stattfand, diese jedoch
zu weniger mGBP2 Transkripten führte als in den Wt BMDM. Die Induzierbarkeit von iNOS in
Abwesenheit von IRF-1 ist nur bei den TLR-Liganden und der Kombination IFNJ/TNF noch
deutlich meßbar und erst durch Kombination aller Stimulationen wurde auf Transkriptionsebene
das Fehlen von IRF-1 ausgeglichen.
Parallel zum Versuch für die mRNS-Gewinnung wurden Ansätze zur Proteingewinnung unter
den gleichen Bedingungen durchgeführt. Hierbei wurden die Makrophagen mit IFNJ sowie TNF
und
IFNJ/TNF
für
16h
stimuliert.
Anschließend
wurde
mit
den
Zelllysaten
eine
Westernblotanalyse durchgeführt (Abbildung 3.7). Hierbei zeigte sich, dass mGBP7 Protein in Wt,
Ergebnisse
68
wie auch in IRF-1 ko Knochenmarksmakrophagen nach IFNJ produziert wurde. Im starken
Gegensatz dazu ist überraschenderweise kein mGBP7 Protein nach Stimulation mit TNF bzw.
IFNJ/TNF nachweisbar, weder in Wt noch in IRF-1 ko BMDM.
Die Proteinexpression von mGBP2 war nach IFNJ Stimulation in Wt BMDM deutlich messbar,
während in den IRF-1 ko BMDM die mGBP2 Proteinexpression sehr stark herabgesetzt war. Nach
Stimulation mit TNF konnte kein mGBP2 Protein in den Wt bzw. IRF-1 ko BMDM gemessen
werden. Im Gegensatz dazu wurde nach Stimulation mit IFNJ/TNF in Gegenwart von IRF-1 (Wt)
aber auch in Abwesenheit des Transkriptionsfaktors IRF-1 (IRF-1 ko) mGBP2 Protein exprimiert;
wobei die Proteinmenge ohne IRF-1 nach IFNJ bzw. IFNJ/TNF Stimulation drastisch vermindert
war im Vergleich zur mGBP2 Proteinmenge in den Wt BMDM. IRF-1 Protein wurde in den Wt
BMDM nach Stimulation mit IFNJsowie synergistisch nach Stimulation mit IFNJ/TNF produziert,
in den IRF-1 ko BMDM konnte dagegen kein IRF-1 detektiert werden.
Abb. 3.7: Westernblotanalyse von Proteinlysaten aus Knochenmarksmakrophagen von Wt und IRF-1 ko Mäusen. Die
Zellen wurden mit IFNJJ, TNF und IFNJ/TNF stimuliert und der Westernblot mit anti-mGBP7, -mGBP2, -IRF-1 und -E-Aktin
inkubiert und entwickelt.
Ergebnisse
69
Die Untersuchung der IRF-1 ko BMDM zeigt deutlich, dass zwei GTPasen aus der Familie der 65
kDa GBPs, mGBP7 und mGBP2, ganz unterschiedlich durch den Transkriptionsfaktor IRF-1
reguliert werden. Die Transkription und damit auch die Translation von mGBP2 wird durch die
Neusynthese von IRF-1 deutlich verstärkt, während die Transkription und Proteinexpression von
mGBP7 nicht von der IFN LQGX]LHUWHQ 1HXV\QWKHVH YRQ ,5)
-1 abhängig ist, bzw. die IRF-1
Induktion nicht zur verstärkten mGBP7 Expression führt.
3.1.5 In vivo Expression der 65kDa GTPasen
3.1.5.1 Infektion mit Listeria monocytogenes
In vitro konnte gezeigt werden, dass die gesamte mGBP-Familie durch das inflammatorische
Zytokin IFNJ aber auch durch das Typ I Interferon IFNE stark reguliert wird. Auch TLR-Liganden
haben einen gewissen und z. T. unterschiedlichen Einfluß auf die Transkription der
verschiedenen mGBPs (vgl. Kapitel 3.3, Ana-1 Stimulationen). Interferone und auch die
verschiedenen TLR Liganden spielen bei der Abwehr von Pathogenen eine wichtige Rolle beim
Einleiten der angeborenen und sekundär der adaptiven Immunantwort. Für die GTPasen mGBP2
und 4 wurde gezeigt, dass diese nach Infektion mit dem grampositiven Bakterium Listeria
monocytogenes auf Transkriptionsebene hochreguliert werden (Boehm et al., 1998). Um
nachzuprüfen, ob auch die weiteren mGBPs in der frühen Phase der Listerien-Infektion eine
mögliche Rolle spielen, wurden C57BL/6 Mäuse mit Listerien vom Stamm ATCC 43251 i.p.
infiziert (0,1 x LD 50 ). Zu den Zeitpunkten 0, 8, 24 und 48 Stunden nach Infektion wurden von je 3
Tieren nach cervicaler Dislokation jeweils Milz und Leber entnommen. Die daraus gewonnene
mRNS wurde in cDNS umgeschrieben und Real-time Analysen der Genfamilie und von
Kontrollen durchgeführt (Abbildung 3.8). In der Milz (Abbildung 3.8a) war nach 8 h Infektion
nur eine marginale Hochregulation der mGBPs zu beobachten, während ein Anstieg in der iNOS
Transkription zu verzeichnen war. Nach 24 h Infektion stiegen alle mGBP mRNS-Mengen
deutlich an. Im Falle von mGBP2 war hier auch ein Maximum erreicht, welches zwischen 24 und
48 Stunden nach Infektion in ein Plateau überging. Die Expression aller anderen mGBPs,
einschließlich mGBP7, stiegen bis 48 h kontinuierlich an. Auch die Kontrollen iNOS und IFNJ
nahmen im weiteren Verlauf der Infektion deutlich zu. Die GTPase GTPBP1 hingegen wurde
kaum hochreguliert.
In der Leber (Abbildung 3.8b) zeigte sich ein ähnliches Expressionsprofil: alle untersuchten Gene
wurden schon nach 8 h Infektion deutlich hochreguliert, allerdings mit Ausnahme von IFNJ,
welches erst nach h signifikant exprimiert wurde. Die Transkriptionsmengen von mGBP1,
6/10 und 8 nahmen im Verlauf der Infektion in der Leber kontinuierlich zu, während die
Gentranskripte von allen anderen (einschließlich der Kontrollen) ihr Maximum bei 24 h nach
Infektion erreicht hatten und im Falle von mGBP3 und 7 nach 48 h wieder abnahmen. In der
Leber wurde mGBP9 deutlich stärker exprimiert als in der Milz.
Ergebnisse
70
a)
10 3
8h
24h
48h
ratio = 2 -'' CP
10 2
10 1
10 0
J
N
IF
iN
iN
O
S
G
TP
-B
P1
G
TP
-B
P1
P9
m
G
B
P8
G
B
m
m
G
B
P7
0
G
B
P6
/1
P5
m
m
G
B
P4
m
G
B
P3
m
G
B
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G
B
m
m
G
B
P1
10 -1
b)
10 3
8h
24h
48h
ratio = 2 -'' CP
10 2
10 1
10 0
J
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P8
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/1
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G
B
P4
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G
B
P3
m
G
B
P2
G
B
m
m
G
B
P1
10 -1
Abb. 3.8: Expression der mGBP-Familie in a) Milz und b) Leber von Listerien infizierten C57BL/6 Mäusen. Die
Induktions-Ratio wurde mit der ''CP-Methode berechnet. Analysiert wurden jeweils 3 Organe pro Zeitpunkt (n=3) aus
denen mRNS gewonnen und in cDNS umgeschrieben wurde. Die Standardabweichungen (Fehlerbalken) berechnete
sich aus den unterschiedlichen Real-time PCR Werten der verschiedenen Mäuse einer Gruppe.
Grundsätzlich waren alle murinen GBPs während der frühen Phase der Listerien-Infektion
hochreguliert, wobei zumindest nach 8 h noch kein IFNJ dafür verantwortlich sein konnte, da die
Transkription weder in der Leber noch in der Milz bis dahin induziert wurde. Möglicherweise
könnte dafür die direkte Erkennung von Pathogenbestandteilen, wie z. B. Listerien-LTA über
TLR2 (Schwandner et al., 1999), entscheidend sein.
Ob die in den Real-time PCR Analysen gemessenen Transkripte auch zur Proteintranslation in
vivo führten, wurde im Rahmen dieser Arbeit für das neue GBP-Mitglied mGBP7 untersucht.
Ergebnisse
71
Nach Listerien-Infektion wurden Organlysate hergestellt und jeweils 35 Pg Protein im SDS Gel
elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Der Westernblot
wurde dann mit Kaninchen anti-mGBP7 Antiseren inkubiert und entwickelt. Zum Zeitpunkt 0 h
konnte schon in beiden Organen, Milz und Leber, eine geringe Basalexpression von mGBP7
nachgewiesen werden. Ein deutlicher Anstieg der Proteinmenge konnte im Verlauf der Infektion
bis 72 h für beide Organe detektiert werden (Abbildung 3.9). Die in den Real-time PCR Analysen
gemessene Induktion von mGBP7 Transkripten führte somit zu einer Translation und
kontinuierlichen Akkumulation des Proteins mGBP7 in den Organen der infizierten Tiere.
Abb. 3.9: Expression des mGBP7 Proteins a) in der Milz und b) in der Leber nach Listerien-Infektion zu den
angegebenen Zeitpunkten.
3.1.5.2 mGBP7 Expression nach Infektion mit Toxoplasma gondii
Die Infektion mit dem obligat intrazellulären einzelligen Parasiten T. gondii führt zu einer starken
angeboren Immunabwehr. Über das Verhalten der murinen GBPs in der Toxoplasma-Infektion
war bisher nichts bekannt. In dieser Arbeit wurde die Rolle von mGBP7 in der ToxoplasmaInfektion analysiert. Hierfür wurden C57BL/6 Mäuse i.p. mit 20 Zysten T. gondii Stamm ME49
infiziert. Die Organe Lunge und Milz wurden 0, 5, 7 und 12 Tage nach Infektion entnommen und
Organlysate hergestellt. Die Westernblot-Analyse nach Inkubation mit dem mGBP7-Antikörper
ergab auch in diesem Infektionsmodell eine deutliche Induktion des mGBP7 Proteins (Abbildung
3.10). In der Milz konnte wieder (vgl. Listerien-Infektion) eine Basalexpression festgestellt
werden. Bis 12 Tage nach Infektion nahm die Menge an mGBP7 Protein stark und kontinuierlich
zu. In der Lunge fand keine Basalexpression des Proteins mGBP7 statt und erst am Tag 5 nach
Infektion war eine leichte Proteinbande detektierbar. Die mGBP7 Proteinmenge nahm dann auch
in der Lunge im Verlauf der Toxoplasma-Infektion deutlich zu. Murines GBP7, wie auch die
anderen 65 kDa GTPasen (Degrandi et al., 2007), werden in der akuten Phase der Infektion dieses
Pathogens stark hochreguliert und könnten daher eine antiparasitäre Funktion haben.
Abb. 3.10: Proteinexpression von mGBP7 in Toxoplasma gondii infizierten C57BL/6 Mäusen. a) in der Milz 0 bis 12
Tage nach Infektion, b) in der Lunge 0 bis 12 Tage nach Infektion; dpi = day post infection.
Ergebnisse
72
3.1.6 Subzelluläre Lokalisation von mGBP7
Die intrazelluläre Lokalisation kann bei der Untersuchung von Proteinen Aufschluss über deren
Funktion geben. Die Untersuchung von mGBP2 zeigte eine vesikelartige nicht näher bestimmte
Struktur innerhalb der Zelle (Vestal et al., 2000; Degrandi et al., 2007). Die murinen GBPs 1, 2 und
5 besitzen ein C-terminales Isoprenylierungssignal, welches durch posttranslationale Modifikation
eine Verankerung der Proteine mit Membranen vermitteln kann. Das neue Familienmitglied
mGBP7
besitzt
weder
ein
solches
Isoprenylierungssignal
noch
eine
vorhergesagte
Transmembrandomäne (TMHMM 2.0, expasy), so dass eine direkte Verankerung mit einer
Membran zunächst unwahrscheinlich erscheint.
Um zu klären, welche subzelluläre Lokalisation mGBP7 aufweist, wurden zunächst
unterschiedliche Fusionskonstrukte hergestellt. Zum einen wurden Konstrukte hergestellt, bei
denen 3´an die mGBP7 Sequenz die cDNS für das rot fluoreszierende Protein DsRed oder das grün
fluoreszierende Protein GFP liegt (mGBP7-DsRed, mGBP7-GFP). Außerdem wurde in einem
weiteren Konstrukt am 5´ Ende des offenen Leserahmens von mGBP7 die Sequenz für DsRed
(DsRed-mGBP7) kloniert. Diese Konstrukte wurden in eukaryotische Zellen transfiziert, die dann
die jeweiligen Fusionsproteine mGBP7-DsRed, mGBP7-GFP oder DsRed-mGBP7 produzierten.
Diese konnten dann nach Anregung mit Licht spezifischer Wellenlänge (GFP: 488 nm, DsRed: 543
nm) im Konfokalmikroskop detektiert werden.
Zunächst wurde die subzelluläre Lokalisation der verschiedenen Konstrukte verglichen und der
Einfluß von IFNJ auf diese untersucht. Dazu wurden RAW 264.7 Makrophagen durch
Elektroporation transient transfiziert und für die spätere Konfokalanalyse auf Deckgläschen
ausgesät. Nach einem Tag wurde ein Teil der Makrophagen mit IFNJ stimuliert, um eine
eventuelle Veränderung der subzellulären Verteilung von mGBP7 durch die Stimulation
beobachten zu können. Nach weiterer ü/N Kultur wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert,
der Kern mit dem Kernfarbstoff DAPI gegengefärbt und die Deckgläschen dann auf Objektträger
aufgebracht. Bis zur konfokalmikroskopischen Analyse wurden die Präparate im Dunkeln und
gekühlt aufbewahrt.
Weder die Stimulation mit IFNJ noch die Art des Fusionskonstruktes veränderten die Lokalisation
von mGBP7 innerhalb der Zelle (Abbildung 3.11). Es konnten nur wenige Überlagerungen mit
dem DAPI-Farbstoff beobachtet werden, der größte Anteil aller Varianten der mGBP7Fusionsproteine befand sich im Zytosol. Hierbei war mGBP7 nicht diffus und frei im Zytosol
verteilt, sondern in vesikulären „punktuellen“ Strukturen unterschiedlicher Größe. Da im
Gegensatz
zu
mGBP2
kein
Isoprenylierungsmotiv
vorhanden
ist
und
eine
andere
posttranslationale Membranverbindung fehlt, führt dies zu der Hypothese, dass diese
vesikelartigen Strukturen keine membran-assoziierten Bestandteile sind oder anderenfalls das
mGBP7 Protein über Brückenproteine sekundär mit einer Membran assoziiert wird.
Ergebnisse
73
Abb. 3.11: Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 in Makrophagen (RAW 264.7) im Konfokalmikroskop. Die obere Zeile
zeigt die mGBP7-Fusionsproteine (rot bzw. grün) und die Kerngegenfärbung in blau (DAPI). Die untere Zeile zeigt die
Differential-Kontrastaufnahmen der Zellen der oberen Zeile. Erste Spalte: DsRed-mGBP7 ohne IFNJJStimulation. Die
Spalten zwei bis vier zeigen die Fusionsproteine DsRed-mGBP7, mGBP7-DsRed und mGBP7-GFP nach IFNJ
Stimulation der transfizierten Makrophagen.
3.1.6.1 Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach Infektion mit L. monocytogenes in
vitro
Wie in Abschnitt 3.1.5 beschrieben, wurde mGBP7 nach Listerien- und nach ToxoplasmaInfektion in der Maus hochreguliert. Ein möglicherweise direkter Einfluss in Form einer
Kolokalisation von mGBP7 mit Pathogenen, wie für einige p47-GTPasen beschrieben
(MacMicking et al., 2003; Martens et al., 2005), sollte im Folgenden untersucht werden. Zunächst
wurden RAW 264.7 Makrophagen mit dem mGBP7-DsRed-Konstrukt transient transfiziert und
ausgesät. Nach 24 h wurden diese dann mit IFNJ (100U/ml) für weitere 16 h stimuliert. Dann
erfolgte eine 30 Minuten andauernde Inkubation mit GFP-exprimierenden Listerien (MOI 10).
Die Zellen wurden danach mit Paraformaldehyd fixiert und der Kern mit DAPI gegengefärbt. Wie
in Abbildung 3.12 dargestellt, veränderte sich die subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach
Listerien-Infektion im Vergleich zu Abbildung 3.11 nicht.
Die GFP-Listerien waren unabhängig von IFNJ Vorinkubation der Makrophagen im Zytosol der
infizierten Zellen zu finden. Das Fusionsprotein blieb weiterhin vesikulär im Zytosol verteilt,
wobei es zu keiner Kolokalisation von Listerien mit mGBP7-Fusionsprotein kam.
Ergebnisse
74
Abb. 3.12: Lokalisation von mGBP7 in der Infektion mit Listeria monocytogenes. RAW Makrophagen wurden mit
mGBP7-DsRed Konstrukten transfiziert, 16 h mit IFNJJ stimuliert und anschließend 30 Minuten mit eGFP exprimierenden Listerien (1:10) inkubiert. Die oberen zwei Zeilen zeigen die Zellen nach IFNJ, die untere Zeile zeigt die
Zellen ohne IFNJStimulation. Die erste Spalte zeigt das mGBP7 Fusionsprotein in Rot. Die zweite Spalte zeigt die
Listerien in Grün. Die dritte Spalte zeigt die Überlagerung aus Spalte 1 und 2 mit dem Kernfarbstoff DAPI. Die vierte
Spalte zeigt die Differential-Kontrastaufnahme der Zellen.
3.1.6.2 Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach Infektion mit Toxoplasma gondii
in vitro
Um eine Interaktion des Fusionsproteins mGBP7 mit der parasitophoren Vakuole von T. gondii zu
untersuchen, wurden, wie zuvor beschrieben, RAW 264.7 Makrophagen mit mGBP7Fusionsproteinen transfiziert, IFNJ stimuliert und dann mit Tachyzoiten (Stamm ME49, MOI 50)
für 2 h inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und die Parasiten mit
einem
spezifischen
Antikörper
gegen
das
Oberflächenprotein
SAG1
gefärbt.
Im
Konfokalmikroskop wurden die Präparate analysiert. Wie in Abbildung 3.13 dargestellt, kam es zu
einer deutlichen Umlagerung von mGBP7-Protein an der parasitophoren Vakuole (PV) von T.
gondii. In den drei oberen Zeilen der Abbildung, welche die Makrophagen nach IFNJ und
Toxoplasma-Infektion zeigen, erschien außerdem weniger mGBP7-Fusionsprotein in der Zelle
verteilt zu sein, als in Zellen, bei denen keine Vorstimulation mit IFNJ erfolgte (untere Zeile
exemplarisch). Dies sieht man sehr deutlich in den beiden mittleren Reihen. Hier und in vielen
anderen Zellen, konnte außerdem beobachtet werden, dass nach fast vollständiger Anlagerung
Ergebnisse
75
von mGBP7-Protein an die PV, der Parasit mit SAG1-Antikörper kaum mehr anzufärben war
(Zeile zwei von oben, exemplarisch).
Abb. 3.13: Kolokalisation von mGBP7 mit der PV von T. gondii. Analyse der in vitro Toxoplasma-Infektion in RAW 264.7
Makrophagen und Lokalisation von mGBP7-DsRed innerhalb der infizierten Zellen. Die oberen drei Zeilen zeigen die
Zellen nach 16 h Vorinkubation mit IFNJJ mit anschließender Toxoplasma-Infektion für 2h (MOI 50). Die untere Zeile
zeigt die Zellen nach 2 h Toxoplasma-Infektion ohne Vorinkubation mit IFNJ. Die erste Spalte zeigt in Rot das mGBP7DsRed Protein. Die zweite Spalte zeigt in Grün das SAG1 Toxoplasmaprotein. Die dritte Spalte zeigt die Überlagerung
von Spalte eins und zwei mit dem DAPI gefärbten Zellkern in Blau. Die vierte Spalte zeigt die DifferentialKontrastaufnahme der Zellen.
Des Weiteren konnte ohne vorherige IFNJ Stimulation keine mGBP7-Rekrutierung zum Parasiten
hin beobachtet werden. Auch die simultane Zugabe von IFNJ bei der Infektion reichte nicht zur
Anlagerung von mGBP7 an die PV aus (Daten nicht gezeigt).
Im Weiteren sollte analysiert werden, ob mGBP7 in einer nicht-professionell-phagozytierenden
Zellart mit der PV von T. gondii kolokalisiert. Dafür wurde über lentivirale Transduktion eine
Ergebnisse
76
murine Fibroblasten-Zelllinie (3T3-mGBP7) hergestellt, die das Fusionsprotein eGFP-mGBP7
(mGBP7 C-terminal) stabil exprimiert. Die Zellen wurden ü/N mit IFNJ stimuliert und
anschließend 2 h mit Toxoplasmen infiziert. In Abbildung 3.14 sind die Ergebnisse der
konfokalmikroskopischen Untersuchung dargestellt. Das Oberflächenprotein von T. gondii, SAG1
(rot), wurde ohne IFNJ Stimulation nicht von mGBP7 (grün) umschlossen. Dagegen zeigten IFNJ
stimulierte 3T3-Zellen auch hier die Fähigkeit der Assoziation von mGBP7 mit intrazellulären
Toxoplasmen. Auch hier konnte beobachtet werden, dass das Fusionsprotein fast ausschließlich an
der PV lokalisiert, während in unstimulierten Zellen eine nahezu gleichmäßig punktuelle
Verteilung von mGBP7 Protein im Zytosol der Zelle vorliegt.
Abb. 3.14: Lokalisation von GFP-mGBP7 Fusionsprotein (grün) mit Toxoplasma gondii (rot) in der stabil transduzierten
murinen Fibroblasten-Zelllinie 3T3. Die obere Zeile zeigt die 3T3 Zellen nach ü/N Inkubation mit IFNJJ und
anschließender Infektion für 2 h mit T. gondii. Die untere Zeile zeigt die 3T3 Zellen ohne IFNJ Vorstimulation nach 2 h
Infektion mit T. gondii. Die erste Spalte zeigt in Rot das mGBP7-DsRed Protein. Die zweite Spalte zeigt in Grün das
SAG1 Toxoplasmaprotein. Die dritte Spalte zeigt die Überlagerung von Spalte eins und zwei mit dem DAPI gefärbten
Zellkern in Blau. Die vierte Spalte zeigt die Differential-Kontrastaufnahme der Zellen.
Ergebnisse
77
3.1.6.3 Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 nach Phagozytose von Latexkugeln
In weiteren Versuchen sollte untersucht werden, ob mGBP7 mit dem Phagosom in Makrophagen
assoziiert. Hierfür wurde die durch lentivirale Transduktion erstellte Makrophagen-Zelllinie
mGBP7-RAW 264.7 verwendet, die das Fusionsprotein GFP-mGBP7 stabil exprimiert. Die
Makrophagen wurden ü/N mit IFNJ stimuliert, bzw. unstimuliert belassen und dann 2 h mit rot
fluoreszierenden Latexkugeln inkubiert. Die konfokalmikroskopischen Aufnahmen (Abbildung
3.15) zeigen, dass das Fusionsprotein eGFP-mGBP7 (grün) nicht mit den phagozytierten
Latexkugeln (Pfeile) in den Makrophagen assoziiert, unabhäng der Vorstimulation mit IFNJ. Diese
und die vorangegangenen Versuche verdeutlichen, dass mGBP7 nicht mit dem Phagosom in
Makrophagen kolokalisiert sondern mit der parasitophoren Vakuole T. gondii infizierter
Makrophagen und 3T3 Fibroblasten.
Abb. 3.15: Lokalisation von eGFP-mGBP7 Fusionsprotein (grün) und phagozytierten Latexkugeln (rot): stabil
transduzierte RAW 264.7 Makrophagen wurden mit IFNJJ ü/N stimuliert (+IFNJ), bzw. unstimuliert belassen (-IFNJ) und
mit Latexkugeln für 2 h inkubiert. Erste Spalte zeigt GFP-mGBP7 in Grün. Die zweite Spalte zeigt die Latexkugeln in
Rot. Die dritte Spalte zeigt die Überlagerung von Spalte 1 und 2 mit dem Kernfarbstoff DAPI (blau). Die vierte Spalte
zeigt die Differential-Kontrastaufnahme der Zellen. Pfeile: Beispiele phagozytierter Latexkugeln.
Ergebnisse
78
3.1.6.4 Lokalisation von mGBP7 Mutanten
Untersuchungen an humanem GBP1 mit Mutationen in den unterschiedlichen GTP-Bindestellen
hatten gezeigt, dass als biochemische Eigenschaft, die Bindungsaffinität zu GTP und nicht die
Hydrolyseaktivität, essentiell für die Lokalisation dieses Proteins mit dem Golgi-Apparat ist
(Modiano et al., 2005).
Die Aminosäuresequenz des Proteins mGBP7 zeigt die gleiche Domänenstruktur, wie sie für die
anderen Mitglieder der GBP-Familie beschrieben ist: eine GTPase Domäne (G-Domäne), eine
mittlere Domäne, sowie die GTPase Effektor Domäne. Anders als hGBP1 und 2 sowie mGBP1, 2
und 5, fehlt bei mGBP7 – wie bereits erwähnt – ein C-terminales CaaX-Motiv.
Im vorangegangenen Kapitel der mGBP7 Lokalisation konnte der deutliche Phänotyp der
Kolokalisation von mGBP7 mit der PV von T. gondii beobachtet werden. Es wurden nun sechs
verschiedene Mutanten von mGBP7 erzeugt, um die Auswirkungen von Punktmutationen in der
G-Domäne auf die Verteilung von mGBP7 in der Zelle und die Umlagerung an die ToxoplasmaPV zu beobachten. Diese Mutationen wurden in Anlehnung an vorherige Publikationen in der GDomäne
des
Proteins
vorgenommen.
Dabei
untersuchten
Praefcke
und
Kollegen
Punktmutationen im humanen GBP1 Protein, welche für die Nukleotid-Bindung und GTP
Hydrolyse wichtig sind (Praefcke et al., 2004). Mit Hilfe des „QuickChange site-directed
mutagenesis kit“ der Firma Stratagene und spezifisch gewählten Primern wurden die
unterschiedlichen Punktmutationen eingebracht. Als Ausgangspunkt zur Herstellung dieser
Mutanten diente der Vektor mGBP7-DsRed aus dem vorangegangenen Kapitel; somit konnten die
entstehenden Mutanten-Vektoren zur Transfektion von Zellen, wie der wildtypische Vektor,
angewendet und im Konfokalmikroskop beurteilt werden.
Die ersten drei mutierten Aminosäuren lagen im GTP-Bindemotiv G1 (G(X) 4 GKS/T) und sind
Arginin (R) 48, Lysin (K) 51 und Serin (S) 52. Diese wurden im folgenden mutiert zu Alanin (R48A und K51-A) und Asparagin (S52-N). Bei der nächsten Mutation wurde Threonin 75 durch
Alanin ersetzt (T75-A). Threonin 75 liegt in der G2 oder sogenannten switchI Region. Diese
Aminosäure ist hoch konserviert in den GTP-Binde-Proteinen und interagiert mit dem JPhosphat von GTP und dem Ko-Faktor Mg2+ (Praefcke et al., 2004), welcher für die Hydrolyse von
GTP unerläßlich ist. Bei der fünften Mutation wurde Glutaminsäure durch Alanin ersetzt (E99A). Diese Mutation liegt in der G3 oder switch II Region (D(X) 2 G). Die letzte Mutation wurde
durch Austausch von Asparaginsäure durch Arginin (D182-R) in der G4 Region (RD)
durchgeführt.
Anschließend wurden die Fusionskonstrukte in RAW Makrophagen transfiziert und die Zellen
nach 24 h für weitere 16 h mit IFNJ stimuliert. Nach Fixierung und Gegenfärbung mit dem
Kernfarbstoff DAPI wurden Präparate erstellt und die Lokalisation der einzelnen Mutanten wurde
im Konfokalmikroskop analysiert.
Ergebnisse
79
Abb. 3.16: Lokalisation der mGBP7 Mutanten in transfizierten RAW-Makrophagen und Einfluß von IFNJJ auf die
subzelluläre Distribution. Die einzelnen mGBP7 Mutanten sind in der Abbildung benannt. Linke Spalten nach 16 h
Stimulation mit IFNJ, rechte Spalten ohne IFNJ Stimulation. Rot: mGBP7-Fusionsproteine; Blau: Zellkern (DAPI); Grau:
Differential-Kontrastaufnahme der Zellen.
Ergebnisse
80
Hierbei wurde festgestellt, dass die Mutationen in der G1 (P-loop) und G2 (switch I) Region zu
einem nahezu vollständigen Verlust der vesikulären Struktur von mGBP7 führten. Die Zugabe
von IFNJ hatte keine weitere Veränderung der Lokalisation der Fusionsproteine innerhalb der
Zelle zur Folge.
Die Mutationen in der G3 (E99-A) und der G4 (D182-R) Region erscheinen für die subzelluläre
Verteilung von mGBP7 in der Zelle unerheblich. Hier blieb in beiden Fällen das mGBP7
Fusionsprotein weiterhin in seiner vesikulären „punktuellen“ Struktur erhalten und auch die
Distribution im Zytosol glich der des Wildtyps. Auch hier führte die Zugabe von IFNJ zu keiner
Umverteilung (Abbildung 3.16).
3.1.6.5 Subzelluläre Lokalisation von mGBP7 Mutanten nach Infektion mit
Toxoplasma gondii in vitro
Bei der nächsten Versuchsreihe wurden die transient transfizierten Zellen zusätzlich wie zuvor
beschrieben mit T. gondii infiziert. Hierbei sollte der Einfluß der Mutationen in den verschiedenen Regionen der G-Domäne auf die Rekrutierung zur PV von T. gondii untersucht werden
(Abbildung 3.17). Da ohne die Zugabe von IFNJ kein Einfluss auf die Distribution der jeweiligen
Fusionsproteine zu beobachten war, wurden diese Aufnahmen in Abbildung 3.17 nicht gezeigt.
Nach Analyse der Präparate konnte bei zwei Mutanten eine Anlagerung des mGBP7-Proteins an
die Toxoplasma PV beobachtet werden. Wie die Pfeile in Abbildung 3.17 verdeutlichen, konnte
bei der Mutante K51-A (G1-Region) und E99-A eine Umverteilung des jeweiligen mutierten
mGBP7 Proteins mit der PV detektiert werden. Hierbei ließ sich jedoch feststellen, dass diese
Fähigkeit im Vergleich zum Wildtyp Protein stark vermindert war. Bei der Mutante T75-A
(switch I Region) ist ein schwaches DsRed-Signal an der PV zu erkennen. Jedoch ist die Fähigkeit
dieser Mutante zur PV zu gelangen so stark herabgesetzt, dass keine weiteren Kolokalisationen in
den untersuchten Zellen detektiert werden konnten. Alle weiteren Mutanten hatten die
Fähigkeit, mit der PV zu lokalisieren, vollständig verloren. Auch die Mutante D182-R war nicht
an der PV zu finden, obwohl diese weiterhin eine vesikuläre Struktur ausbilden konnte. Die
Mutationen in der G-Domäne dieser GTPase hatten somit starke Auswirkungen auf deren
Fähigkeit nach IFNJ Stimulation zur parasitophoren Vakuole zu gelangen.
Ergebnisse
81
Abb. 3.17: Lokalisation der mGBP7 Mutanten R48-A, K51-A, S52-N, T75-A, E99-A und D182-R in RAW 264.7
Makrophagen nach Infektion mit T. gondii (ME49). Die erste Spalte zeigt das mGBP7-Fusionsprotein in Rot. Die zweite
Spalte zeigt T. gondii (SAG1) in Grün. Die dritte Spalte zeigt die Überlagerung aus Spalte 1 und 2 mit dem Kernfarbstoff
DAPI in Blau. Die vierte Spalte zeigt die Differential-Kontrastaufnahmen der Zelle. Pfeile: Akkumulation des
Fusionsproteins mit der Toxoplasma- PV.
Ergebnisse
82
3.1.7 Vorarbeiten zur Erstellung einer mGBP7 defizienten Mauslinie
Das Gene Targeting durch homologe Rekombination in pluripotenten embryonalen Stammzellen
der Maus führt zur systematischen Generierung von Mauslinien mit definierten genetischen
Veränderungen. Dadurch läßt sich die Funktion bestimmter Gene in vivo untersuchen.
Beispielsweise konnten durch das Gene Targeting detaillierte Erkenntnisse über die Entwicklung,
Selektion und Funktion von T und B Zellen sowie über Funktion von Zytokinen gewonnen
werden (Pfeffer and Mak, 1994). Um die Rolle von mGBP7 in vivo untersuchen zu können,
wurden im Rahmen dieser Arbeit vorbereitende Schritte unternommen, um eine embryonale
Stammzelllinie (ES) aus 129/Ola Mäusen (Kuhn et al., 1991) zu generieren. Eine solche ES Zelle
trägt dabei ein mutiertes Allel, welches durch homologe Rekombination mit einem gentechnisch
veränderten Genlokus erzielt wird.
Der Genlokus von mGBP7 ist ca. 18 kb groß und besteht aus 11 Exonen. Im Exon 2 befindet sich
das Start-Kodon ATG, im Exon 11 das Stopp-Kodon.
Die Rekombinations-Strategie wurde so geplant, dass eine Neomycin-Resistenz-Kassette in den
Genlokus eingesetzt wurde, die den 3´Teil von Exon 2, die Exone 3 bis 5 komplett sowie den 5´
Teil von Exon 6 deletierte (Abbildung 3.18). Das Start-Kodon bleibt weiterhin erhalten. Die
Neomycin-Resistenz-Kassette wurde hierbei in entgegengesetzter transkriptioneller Richtung zur
Leserichtung von mGBP7 eingesetzt, wobei der starke Promotor von Neomycin eine
Transkription von mGBP7 verhindern soll. In den Exonen 2 bis 6 ist die G-Domäne kodiert,
welche für die vollständige Funktion der GTPase essentiell ist (GTP-Bindung). Mit dieser
Deletionsstrategie soll verhindert werden, dass eventuell entstehende trunkierte mGBP7 Proteine
eine GTPase-Aktivität ausführen könnte.
Um das Ereignis der homologen Rekombination zu erreichen, wurden 5´ und 3´ der NeomycinResistenz-Kassette die homologen Regionen des Gens kloniert. Der kurze Arm (KA) des
Rekombinationskonstruktes bestand aus der Intronsequenz und einem Teil des Exon 2 und hat
eine Gesamtlänge von 1,5 kb. Über die durch PCR angefügten Schnittstellen Not I und Xba I
wurde der KA in den Targetingvektor eingebracht. Der Lange Arm (LA) bestand aus der
Genlokussequenz, die im Exon 6 startet und im Intronbereich hinter Exon 8 endet. Der LA war ca.
3 kb lang und wurde über die neu eingefügten Schnittstellen Xho I und Kpn I eingebracht. Für die
Negativselektion wurde die HSV-TK über die Schnittstelle Kpn I als letztes eingefügt. Für die
Methode des Targetings wurde der hergestellte Vektor dann über die Schnittstelle Not I
linearisiert. Nach erfolgreichem Targeting können in Zukunft die ES-Zell-Klone mit der 5´
flankierenden Sonde detektiert werden. Dazu werden die Klone mit dem Restriktionsenzym Spe I
geschnitten und mit der 5´Sonde im Southernblot hybridisiert. Das wildtypische Allel wird als
Bande mit einer Größe von ca. 18 kb sichtbar und das rekombinierte knockout Allel als Bande von
ca. 5 kb, da über den Targetingvektor eine zusätzliche Spe I Schnittstelle vor der NeomycinResistenz-Kassette eingefügt wurde. Eine 5´flankierende Southern-Sonde, die das wildtypische
Ergebnisse
83
Allel genomischer DNS von E14 Zellen detektiert, wurde bereits getestet (Abbildung 3.19). Die
Klonierung des Vektors ist abgeschlossen und soll in Zukunft zur homologen Rekombination von
E14 pluripotenten embryonalen Stammzellen herangezogen werden.
Abb. 3.18: Schematische Darstellung der Rekombinationsstrategie des mGBP7 Lokus. Oben: Genlokus mGBP7. Mitte:
Rekombinationsvektor mit den homologen Bereichen und den eingefügten Selektionsmarkern Neomycin-ResistenzKassette (neo) und HSV-Thymidinkinase Kassette (HSV-TK). Unten: Rekombinierter Lokus nach erfolgter Integration
der Neomycin-Kassette in reverser Richtung.
Abb. 3.19: Sondentest der 5´flankierenden Southernsonde. Zwei Proben genomischer DNS (E14) wurden mit dem
Enzym Spe I verdaut und mit der P-32 radioaktiv markierten 5`Sonde hybridisiert.
Ergebnisse
84
3.2 AW112010-SSPII
3.2.1 In silico Charakterisierung von AW112010-SSPII
Ein weiteres Transkript, das bei der initialen Transkriptomanalyse als IFNJ induziert gefunden
wurde, ist AW112010 (Degrandi et al., 2008). Nach IFNJ Stimulation wies AW112010 eine
Expressionssteigerung von 5,5 im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle auf. Des Weiteren
zeigten die Daten der Microarray Transkriptomanalyse eine synergistische transkriptionelle
Expressionssteigerung von AW112010 um den Faktor 11,3, nach simultaner Stimulation mit IFNJ
und TNF.
Über das Gen AW112010 war zu Anfang der Arbeit nur die Information bekannt, welche in der
NCBI Nukleotid Datenbank unter der Accession Nummer AW112010 hinterlegt war. Daraus geht
hervor, dass AW112010 ein Klon einer cDNS-Bibliothek ist, die erstellt wurde, um die
Genexpression in der Leber nach Dioxan Behandlung bei C57BL/6 Mäusen zu untersuchen. Dort
wurde es als 536 nt lange sequenzierte cDNS-Sequenz beschrieben. Die genomische Analyse
ergab, dass AW112010 ein 3 Exon Gen ist und auf Chromosom 19 des Mausgenoms lokalisiert ist.
Abb. 3.20: Nachweis und Größenbestimmung der AW112010 mRNS in Ana-1 Makrophagen im Northernblot. Die
Makrophagen wurden 16 h mit TNF/IFNJJ, TNF, IFNJ, LTA und LPS stimuliert bzw. unstimuliert belassen. Die GesamtRNS wurde aus den Zellen gewonnen und im Northernblot analysiert.
Bei der Überprüfung der Microarray Daten im Northernblot konnte eine für AW112010 spezifisch
hergestellte Sonde eine Bande zwischen 700 und 900 nt statt bei rund 536 nt, detektieren
(Abbildung 3.20). Um die Gesamtlänge der cDNS von AW112010 herauszufinden, wurde eine
RACE-PCR (Rapid Amplification of CDNA Ends) zur Amplifikation der 3´und 5´Bereiche der
cDNS mit dem BD SMART RACE cDNA Amplification KIT durchgeführt. Als Vorlage hierzu
diente Gesamt-RNS aus Ana-1 Makrophagen, welche 16 h mit IFNJ und TNF (jeweils 10ng pro
ml) stimuliert wurden. Die Resultate der Sequenzierung ergaben keine zusätzliche Sequenz in
5´Richtung aber eine Sequenzverlängerung in 3`Richtung. Diese Methode führte zu einer
vollständigen cDNS-Sequenz, welche nun 730 nt lang war (ohne angehängte Poly(A) Sequenz)
und somit mit den Größen im Northernblot vergleichbar war. An den Nukleotid-Positionen 712-
Ergebnisse
85
717 befindet sich das Poly(A)-Signal (AATAAA) welches für die Anheftung eines sogenannten
Poly(A)-Schwanzes (Polyadenylierung) verantwortlich ist (Abbildung 3.21).
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
cgaattctcc
attctcaaac
gagctgcaag
CCTGATGCAA
TCAAGCCAAT
CTCAAGTGGA
AAACTAGaga
cctagaagac
gaagtagaca
tttctctctg
ccatgagcat
atagaaaaac
cgattgtgca
tgtttagcaa
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ATGTCTCCCA
CAATACCTGG
GATGTACATA
AAAAGCCACC
ccaaaataag
tgagggagct
cttgccttgc
ctgagaaaat
ggtttaatat
tcccaagtca
aaaaaaaaaa
atagtgcccc
aaaccaaaga
TCCCTCTGAT
CGTATAAGTC
TATACCAGAC
CACTGGGTCG
tcctcttcct
atctttcaca
ctctattagg
ggaaatttaa
acataccatg
tccactttta
aaaaaaaaaa
aaagcaattc
gaagatcagc
ATTTATCTTT
TTCTAAGAAC
CCAGGTCGTC
TTCAGGAGAG
tctagatgtg
gagtgtattc
acttgattga
gatgggaacc
tgcttgtttt
cttgttatca
aaaaa
aaagggaaag
aggagtctag
GGTGGTGTGC
GTCGTTAAAG
ATGACAAACA
ATCCAGTCTT
catcatctgc
agtggtatac
acccaaatac
aagcactgtg
tctgcttgtg
ttcagtcaca
tgaaactgac
cagacaacct
TCATCATCTG
TCTTCTGCCA
CACTGGAAAC
TAAAGAAGCA
ttcttccttc
gtggagctca
cacaaaattc
tggtcaacat
aacttgtgag
tAATAAAttt
Abb. 3.21: RACE-PCR Ergebnis, in der NCBI-Datenbank unter expressed Sequence AW112010 hinterlegte Sequenz =
536 nt (schwarz, fett). Durch die RACE-PCR konnten im 3´Bereich weitere 219 Nukleotide (rot) identifiziert werden.
Hierzu zählt das Poly(A)-Signal (blau: AATAAA), welches für die Ausbildung des Poly(A)-Schwanzes verantwortlich ist.
Die vollständige mRNS Sequenz wurde in der NCBI-Datenbank unter dem Namen SSPII (gi:151349577) hinterlegt, ORF:
fett, Großbuchstaben.
Die Sequenz Analyse Software Windows 32 EditSeq 5.02 © 1989-2001 DNASTAR ergab, dass der
offene Leserahmen von AW112010 237 nt lang ist (131 bis 367nt). Die vollständige Sequenz
wurde unter dem Namen SSPII, Small Secreted Protein Interferon Induced, in der NCBI
Datenbank hinterlegt (gi:151349577). Der Name, SSPII, wurde gewählt, da aufgrund der
folgenden Ergebnisse dieser Arbeit davon ausgegangen werden kann, dass es sich hierbei um ein
kleines sezerniertes Protein handelt.
3.2.1.1 Protein-Vorhersagen
Aus dem offenen Leserahmen der Nukleotidsequenz ergibt sich eine Proteinsequenz mit 78
Aminosäuren. Dieses Protein besitzt eine Masse von ca. 8,7 kDa, mit einem Isoelektrischen Punkt
(pI) bei 9,275, einer positiven Ladung von 4,33 bei pH7 (EditSeq-Berechnung) und ist daher zu
den kleineren kationischen Proteinen zu zählen. Zum Vergleich: kleine GTPasen wie Ras und
Rho besitzen eine molekulare Masse von 20-25 kDa, das Insulin-Molekül: 5,7 kDa, das kationische
D-Defensin HNP-1: ca. 3,3 kDa, das kationische humane Peptid LL-37: 4,5 kDa.
Um Hinweise zu erhalten, welche Aufgaben ein Protein haben kann, bietet sich ein Vergleich der
Sequenz mit vorhandenen Sequenzen an bzw. mit
Algorithmen zur Vorhersage bestimmter
Funktionen. Der ExPASy Proteomics Server (http://www.expasy.org vom Schweizer Institut für
Bioinformatik, Genf) bietet eine Reihe von Programmen, mit denen ein unbekanntes Protein auf
bekannte Strukturen oder Sequenzenmotive hin analysiert werden kann. Diese Tools wurden von
verschiedenen Institutionen zur Verfügung gestellt, welche beim Aufrufen der einzelnen
Programme im Internet benannt werden. Eine Auswahl von Programmen, die für eine Voranalyse
von AW112010 verwendet wurden sowie der Ergebnisse, ist in der Tabelle 3.1 zusammengefasst.
Ergebnisse
86
Tabelle 3.1: Voranalyse der AW112010-Protein-Sequenz: Vorhersageprogramme zur Voranalyse von
Proteinensequenzen. http://www.expasy.org vom Schweizer Institut für Bioinformatik, Genf.
Programm:
Vorhersage von:
Resultat:
PROSITE
Proteinfamilien und
Domänen
Keine Treffer
SignalP 3.0
Signalpeptid-Schnittstelle
Signalpeptid: ja, mit Schnittstelle an der
Position 24 und 25 (YLA-YK )
TargetP 1.1
Zielsequenz -Untersuchung
Protein des sekretorischen Wegs
iPSORT
Protein-Zielort
sekretorischer Weg
TMHMM 2.0
Transmembrandomänen
1 putative TM Helix an Position 4-25
NetPhos 2.0
Phosphorylierungsstellen
3 putative Phosphorylierungsstellen an den
AS 27, 59 und 62
NetOGlyc 3.1
O-Glykosylierungs-Stellen
Keine O-Glycosylierungs-Stellen
NetNGlyc 1.0
N-Glykosylierungs-Stellen
Keine N-Glykolysierungs-Stellen
ProP 1.0
Propeptid-Schnittstellen
Keine Propeptid-Schnittstelle
(Arginin/Lysin) vorhanden
Für das Protein SSPII konnte mit dem Softwaretool PROSITE, das Proteinfamilien und
Domänenstrukturen sucht, die mit der eingegebenen Zielsequenz vergleichbar sind, keine
Übereinstimmungen mit bekannten Proteindomänen aufgezeigt werden. Hingegen wurde mit
SignalP, TargetP und iPSORT jeweils ein N-terminales Signalpeptid vorhergesagt, welches an der
AS-Position 24-25 (YLA-YK) vom Restprotein abgeschnitten wird. Als Beispiel dafür ist in
Abbildung 3.22 die Vorhersage des Programms SignalP 3.0 dargestellt. Es fand für jede
Aminosäure eine Bewertung hinsichtlich Signalpeptidvorhersage (S-score), Schnittstelle (cleavage
site, C-score) und der Y-score, eine Ableitung des C-Wert kombiniert mit dem S-Wert (Bendtsen
et al., 2004) statt. Ein hoher S-Wert, wie für SSPII in der N-terminalen Region vorhergesagt
(grüne Kurve im Bereich AS 1-24), bedeutet, dass das Protein ein Signalpeptid aufweist, ein
niedriger S-Wert weist hingegen auf ein reifes Protein hin. Der C-Wert, der für jede Aminosäure
jeder Position angezeigt wird, deutet auf die Schnittstelle der Signal Peptidase I (SPase I) hin und
wird nur bei hoher Signifikanz angezeigt. Abgeleitet vom C-Wert wird der Y-Wert. Dieser
kombiniert
den
C-
und
den
S-Wert,
was
in
einer
höheren
Genauigkeit
der
Schnittstellenvorhersage resultieren soll. Die Schnittstelle, vom Y-Wert zugewiesen, wird dort
gesetzt, wo der Anstieg des S-Wertes steil und ein signifikanter C-Wert vorhanden ist (Bendtsen
et al., 2004). Bei dem Protein SSPII liegt die Schnittstelle zwischen den Aminosäuren 24-25 (YLAYK). Dies würde zu einem Protein mit einer verbleibenden Größe von 54 Aminosäuren –
entsprechend 6 kDa – einem pI bei 9,576 und einer positiven Ladung bei pH7 von 4,376 (EditSeq),
führen.
Ergebnisse
87
Abb. 3.22: Signalpeptid-Vorhersage mit dem Programm SignalP 3.0. Dargestellt ist die AS-Sequenz von SSPII, wobei
jeder AS ein C- (rot), S- (grün) und ein Y-Wert (blau) zugeteilt wurde.
Proteine mit einer N-terminalen Signal-Sequenz assoziieren während ihrer Synthese
(cotranslational) mit der ER-Membran. Diese Proteine gelangen dann in das endoplasmatische
Reticulum und von dort weiter in den Golgi-Apparat. Ohne ER- oder Golgi-Rückhaltesignale
werden diese Proteine durch die Plasmamembran sezerniert. Laut Vorhersage mit TargetP, wäre
SSPII ein Protein des sekretorischen Weges. Mit der Software TMHMM hingegen wurde die Nterminale Sequenz von AS 4 bis 20 als Transmembrandomäne interpretiert, da beide
Sequenzstrukturen (Signalpeptid und TMD) über einen hydrophoben Bereich verfügen. Für SSPII
konnten außerdem 3 putative Serin-Phosphorylierungsstellen an den AS 27, 59 und 62
identifiziert werden. Viele sekretorische Proteine werden im ER oder Golgi Apparat
posttranslational verändert. So werden z.B. Oligosaccharide auf bestimmte Asparaginsäure-Reste
(N-Glykosylierung, im ER) oder an bestimmte Serine und Threonine (O-Glykosylierung, im
Golgi-Apparat)
der
Proteine
übertragen;
für
AW112010
konnten
allerdings
keine
Glykosylierungsstellen vorhergesagt werden. Auch die Analyse, ob es sich bei AW112010 um ein
Protein handelt, welches wie z.B. Insulin, zunächst als Propeptid vorliegt, wurde mit dem
Programm ProP 1.0 untersucht. Da in der AS-Sequenz von AW112010 keine geeignete
Schnittstelle (Arginin/Lysin) vorhanden ist, liegt AW112010 wahrscheinlich nicht als „unreifes“
Propeptid vor.
Zusammenfassend kann angenommen werden, dass SSPII ein kleines Protein ist, welches am
rauhen ER translatiert wird und unter Abspaltung der Signalsequenz über den sekretorischen Weg
mit nur geringen weiteren posttranlationalen Veränderungen (keine Glycosylierung, eventuell
Phosphorylierung) sezerniert wird.
Ergebnisse
88
3.2.1.2 SSPII in anderen Spezies
Die im letzten Abschnitt durchgeführten Vorhersageanalysen zu SSPII ergaben, dass es sich um
ein potentiell sezerniertes Protein handelt, wobei es keine bekannten Domänenstrukturen
aufweist. Um weitere Informationen zu erhalten, die zur Aufklärung der Funktion beitragen oder
zur Klärung der Verwandtschaft von SSPII mit anderen Proteinen in anderen Spezies, wurde der
Sequenzvergleich mit BLAST N (Nukleotid-Sequenz, nr-Datenbank) und BLAST P (ProteinSequenz) des NCBI Servers durchgeführt. Das Alignment der Treffer ist in den Abbildungen 3.23
und 3.24 mit dem Programm JalView dargestellt. Die BLAST N und BLAST P Sequenzvergleiche
ergaben einen Treffer mit einer Sequenz von Rattus norvegicus (BLAST N: Rattus norvegicus
predicted XM_579948.2, BLAST P: hypothetical protein Rattus norvegicus XP_579948.2). Es
konnten keine signifikanten Treffer mit anderen Proteinen oder Nukleotid-Sequenzen in anderen
Spezies gefunden werden.
Wie der Nukleotid-Sequenzvergleich in Abbildung 3.23 zeigt, gibt es über die gesamte Sequenz
Übereinstimmungen in Maus und Ratte, vor allem am 5`Bereich bis nt 57 und im 3`Bereich.
Basierend auf einigen Sequenzunterschieden und 9 fehlenden Nukleotiden im Vergleich zur
SSPII-Sequenz käme es bei einer Translation der Rattensequenz (XM_579948) zu Verschiebungen
des offenen Leserahmens gegenüber der Maussequenz. Dennoch lagen die Übereinstimmungen
auf Proteinebene bei 35%. Des Weiteren führte eine TargetP Vorhersage der RattenProteinsequenz zu einem mit der SSPII Sequenz vergleichbaren Ergebnis, auch hier wurde ein
Protein des sekretorischen Weges vorhergesagt. Jedoch wurde mit SignalP dabei kein SignalPeptid vorhergesagt, da die Schnittstellenvorhersage (C-score) zu schwach ist. Statt dessen ist laut
Signal-Peptid-Vorhersage
ein
Signalanker
bei
der
Ratten-Proteinsequenz
XP_579948
wahrscheinlicher. Jedoch muss hierbei beachtet werden, dass noch keine Informationen zur
Präsenz der Sequenz in vivo vorhanden sind. Da es sich bei der Sequenz XM_579948 der Ratte um
eine vorhergesagte mRNS handelt (Vorhersagemethode GNOMON), gibt es keine weiteren
aufschlußreichen Informationen, die mögliche Funktionen bei SSPII aufzeigen können.
Abb. 3.23: Vergleich der Nukleotidsequenzen von SSPII (Maus) und XM_579948 (Ratte).
Ergebnisse
89
Abb. 3.24: Vergleich der Proteinsequenz von SSPII (Maus) und Ratte XP_579948.
Mit mRNS- oder Protein-Datenbanken des Menschen gab es mit Hilfe von BLAST N und P keine
signifikanten
Übereinstimmungen.
Jedoch
wurde
über
den
Ensemble
Browser
(http://www.ensemble.org) der genomische Lokus von AW112010/SSPII untersucht und mit dem
der Ratte (XM_579948) verglichen. Ein Vergleich bekannter Gene 3´ und 5´ der Genloci SSPII
(Chromosom 19) und Ratte XM_579948 (Chromosom 1) ergab eine Übereinstimmung der Lage
bekannter Gene wie z.B. Ms4a8a (membrane spanning 4 domain subfamily 8a), Ms4a10, Ccdc86
(coiled coil domain containing 86) und Zp1 (zona pelucida glycoprotein 1). Diese bekannten Gene
befinden sich in derselben Anordnung auf dem Chromosom 11 des humanen Genoms, jedoch
ohne Hinweis auf ein SSPII oder XM_579948 ähnliches Gen (Vergleich Lokus AW112010 (Maus)
und XM_579948 (Ratte) über http://www.ensembl.org/).
3.2.2 Expressionsanalyse von SSPII
3.2.2.1 Expression in Ana-1 und Knochenmarks-Makrophagen
Nach den umfangreichen in silico Analysen und Vorhersagen, sollten zunächst die Array Daten
validiert werden. Hierzu wurden Ana-1 Makrophagen mit unterschiedlichen Stimuli für 16 h
inkubiert (10 ng/ml IFNJ, 10 ng/ml TNF, je 10 ng/ml IFNJ/TNF, 100 ng/ml LPS, 1 Pg/ml LTA) und
die Gesamt-RNS mit Trizol aufgereinigt. 15 Pg RNS je Probe wurden dann elektrophoretisch
aufgetrennt und danach auf eine Membran geblottet. Die spezifische RNS-Sonde für SSPII wurde
mit D P32dCTP markiert und konnte dann mit der Membran hybridisieren. Das Signal wurde mit
einem Phosphoimager detektiert (Abbildung 3.25). In Ana-1 Makrophagen war keine
Basalexpression von SSPII detektierbar, erst nach IFNJ Stimulation konnte ein Signal im
Northernblot nachgewiesen werden und nach IFNJ/TNF Stimulation wurde SSPII synergistisch
hochreguliert. Die Stimulation mit TNF alleine sowie die Stimuli mit den TLR-Liganden LPS und
LTA ließen im Northernblot keine SSPII mRNS erkennen.
Ergebnisse
90
Abb. 3.25: Northernblot-Analyse von SSPII mRNS und E-Aktin. Ana-1-Makrophagen wurden 16 h mit IFNJ, TNF,
IFNJ/TNF sowie den TLR-Liganden LPS und LTA stimuliert. 15Pg Gesamt-RNS wurden je Ansatz aufgetragen.
Während der Northernblot nur eine geringe IFNJ-Regulation vermuten lässt, wurde eine Kinetik
von 0 bis 48 h Stimulationsdauer mit IFNJ von Ana-1 Makrophagen durchgeführt (Abbildung
3.26). Aus den Zellen wurde cDNS synthetisiert und mit spezifischen Primern und Sonden für
SSPII und E-Aktin wurden anschließend Real-time PCRs durchgeführt. Hierbei wurde eine
Steigerung der Transkriptmenge im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle im Laufe der
Stimulationszeit deutlich nachgewiesen. Während nach 2 h noch keine Erhöhung der
Transkriptmenge stattgefunden hat (Ratio=1), wurde ein stetiger Anstieg (Ratio=7,7; 18; 31) von 6
über 16 bis 24 h Stimulation gemessen. Der Wert der Ratio steigt von 24 bis 48 h auf mehr als das
Vierfache an, was auf sekundäre Effekte schließen lassen könnte, wie z.B. IRF-1 Produktion, TNF
Produktion mit autokriner Wirkung auf die Makrophagen und synergistischem Effekt zu IFNJ.
150
ratio = 2-''CP
125
100
75
50
25
48
h
40
h
24
h
16
h
6h
2h
0
6
Abb. 3.26: SSPII-Expression in IFNJ stimulierten Makrophagen. Ana1-Makrophagen wurden in einer Dichte von 2x10
Zellen am Vortag ausgesät und mit IFNJ2, 6, 16, 24, 40 und 48 h stimuliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden
die Zellen geerntet und die RNS mit TRIZOL aufgereinigt, in cDNS umgeschrieben und Real-time PCR Analysen mit
spezifischen Primer und Sonden für SSPII und E-Aktin durchgeführt. Die relative Veränderung zum unstimulierten
Zustand, normalisiert zur E-Aktin-Kontrolle wurde mit der delta-delta-CP-Methode (Pfaffl, 2001) ermitttelt und
dargestellt.
Ergebnisse
91
In weiteren Analysen wurden aus Knochenmark von C57BL/6 Mäusen in 10 Tagen unter
Verwendung von M-CSF Makrophagen generiert und mit unterschiedlichen Stimuli 16 h
behandelt. Nach Ernten der Zellen, RNS-Aufbereitung und cDNS-Synthese wurden SSPII und
iNOS Real-time PCR Analysen durchgeführt (Abbildung 3.27). Nach Zytokinstimulation (IFNJ,
TNF, IFNJ/TNF und IFNE) sowie nach Stimulation mit den TLR-Liganden LPS und poly (I:C)
konnte jeweils eine deutliche Transkriptionssteigerung gemessen werden. Im Gegensatz zu den
Ana-1 Stimulationen trat in den Knochenmarks-Makrophagen kein synergistischer Effekt durch
IFNJ/TNF Kostimulation auf. Das typischerweise auf T-Zellen wirkende Zytokin IL-2 wurde hier
als Negativkontrolle benutzt und zeigte in den Makrophagen keine Auswirkungen auf die
Expression von SSPII (Ratio bei 1).
10 4
SSPII
iNOS
ratio=2 -'' CP
10 3
10 2
10 1
10 0
IL
-2
(I:
C)
po
ly
LP
S
E
IF
N
J/T
NF
TN
F
IF
N
IF
N
J
10 -1
Abb. 3.27: SSPII Induktion durch verschiedene Stimuli (16 h) in Knochenmarksmakrophagen aus C57BL/6 Mäusen. Die
Zellen wurden 16 h mit den angegebenen Stimuli behandelt, die RNS aus den Zellen aufgereinigt und in cDNS
umgeschrieben. Real-time PCRs wurden generiert und mittels der ''CP-Methode (Pfaffl, 2001) analysiert und als Ratio
dargestellt.
Ob die Hochregulation von SSPII Transkripten von der Signalweiterleitung über den IFNJRezeptor
abhängt,
wurde
in
weiteren
Versuchen
untersucht,
bei
denen
Knochenmarksmakrophagen aus IFNJR ko Mäusen generiert wurden. Auch diese wurden für 16 h
mit IFNJ, als Negativkontrolle, mit TNF, IFNE und den TLR-Liganden LPS und poly (I:C)
stimuliert. Nach der Stimulation mit IFNJ konnte weder eine Hochregulation von SSPII noch von
dem Kontroll-Gen iNOS ermittelt werden. Hingegen konnte eine deutliche Zunahme beider GenTranskripte durch die Zytokine TNF und IFNE sowie die TLR-Liganden LPS und poly (I:C)
gemessen werden (Abbildung 3.28).
Ergebnisse
92
10 4
ratio = 2-'' CP
10
SSPII
iNOS
3
10 2
10 1
10 0
)
po
ly
(I:
C
LP
S
E
IF
N
F
TN
IF
N
J
10 -1
-/-
Abb. 3.28: SSPII Induktion durch verschiedene Stimulationen (16 h) in Knochenmarksmakrophagen aus IFNJ R
Mäusen. Die Zellen wurden mit IFNJ, TNF, IFNE und den TLR-Liganden LPS und poly (I:C) stimuliert, die RNS
aufgereinigt und cDNS synthetisiert. Real-time PCRs von SSPII und iNOS wurden mittels der ''CP-Methode analysiert
(Pfaffl, 2001) und sind als Ratio dargestellt.
3.2.2.2 Expression von SSPII in der Infektion
Die Regulation von SSPII durch Typ I und II Interferone sowie TNF und TLR Liganden konnte in
den vorherigen in vitro Versuchen eindeutig gezeigt werden. Diese Zytokine sowie die Erkennung
von Pathogenen über TLRs spielen bei der Aktivierung der angeborenen Immunantwort eine
wichtige Rolle.
Ob auch in der Abwehr gegen verschiedene Pathogene SSPII transkribiert wird, sollte durch
Infektionsversuche mit den Modellpathogenen Listeria monocytogenes und Toxoplasma gondii
untersucht werden.
Zunächst wurden C57BL/6 Mäuse mit der Infektionsdosis 0,1 x LD 50 i.p. mit Listerien infiziert.
Nach 8, 24 und 48 h wurden die Tiere durch cervicale Dislokation getötet und die Organe
entnommen. Aus diesen Organen wurde RNS aufbereitet sowie Proteinlysate hergestellt. Nicht
infizierte Tiere unter gleichen Haltungsbedingungen dienten als uninfizierte Kontrolle. Die
Gesamt-RNS pro Organ, Maus und Zeitpunkt wurde aufgereinigt und gemessen. In Abbildung
3.29 ist ein Northernblot der Organe Milz und Leber zu den Zeitpunkten 0 und 48 h dargestellt.
Aufgetragen sind jeweils 15 Pg RNS. Zum Zeitpunkt 0 h war in der Milz bei keiner der zwei
Mäuse SSPII-RNS detektierbar, allerdings konnte in diesen Proben generell sehr wenig RNS (EAktin-Kontrolle) detektiert werden, so dass eine Aussage schwer zu treffen ist. Nach 48 h war in
der Milz ein deutliches Signal von SSPII Transkripten messbar. In der Leber konnte schon zum
Zeitpunkt 0 h SSPII detektiert werden. Dieses Signal wurde bei den 48 h Werten deutlich höher
und zeigte zum einen, dass SSPII in der Leber schon in uninfizierten Tieren basal exprimiert
wurde und zum anderen, dass es in diesem Organ nach Infektion hochreguliert wurde.
Ergebnisse
93
Abb. 3.29: Northernblot-Analyse, SSPII mRNS in Milz und Leber nach Infektion mit Listeria monocytogenes.
Aufgetragen wurden pro Spur jeweils 15 Pg Gesamt-RNS. Die Hybridisierung erfolgte mit spezifischen Sonden gegen
SSPII und E-Aktin. Die Detektion der radioaktiv (P-32) markierten Banden erfolgte mit einem Phosphoimager.
Für weitere Analysen zur Expression von SSPII wurden aus der RNS cDNS synthetisiert und Realtime PCRs erstellt. Um die jeweilige Menge an RNS (bzw. cDNS) in verschiedenen Organen von
jeweils zwei Mäusen pro Zeitpunkt zu bestimmen, wurde von der ''CP Methode abgeleitet der
'CP Wert der PCRs ermittelt und über die Formel 2-'CP die Transkriptmenge berechnet. Dieser
Wert gibt dann die zu E-Aktin normalisierte Menge des Transkriptes zum jeweiligen Zeitpunkt an
und nicht die Erhöhung bzw. Ratio. Zur besseren Darstellung wurden alle Werte mit dem Faktor
10.000 multipliziert.
Die Berechnung der Transkriptmenge nach der Real-time PCR von SSPII und iNOS wurde in den
Organen Milz, Leber, Thymus, Niere, Lunge und Gehirn durchgeführt und in Abbildung 3.30
dimensionslos dargestellt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von jeweils 2 Proben
dar. In der Milz war eine Basalexpression von SSPII bei 0 h zu erkennen (Wert 100) der Wert stieg
abhängig von der Infektion auf den Mittelwert 400 bei Zeitpunkt 48 h nach Infektion an. In der
Leber war die SSPII Transkriptmenge bei 0 Stunden deutlich höher als beim 0 Stunden-Wert der
Milz und stieg bis 48 h nach Infektion noch weiter deutlich an (Wert 0 h: 340; 48 h: 615). Die
SSPII Transkription wurde auch im Thymus (0 h:20; 48 h: 550), in der Niere (73; 420) und der
Lunge (65; 180) durch die Infektion mit Listerien erhöht. Hingegen fand im Gehirn fast keine
Transkription von SSPII statt (Werte: 2; 8). Die Werte für die iNOS-Kontrolle zeigten eine
deutliche Induktion der iNOS mRNS in der Milz nach Infektion (0 h: 0,16; 48 h: 67) eine
geringere Erhöhung in der Leber (0,2; 8) und nur sehr wenig Transkripte in Thymus, Niere, Lunge
und Gehirn zu den angegebenen Zeitpunkten.
Ergebnisse
94
b)
0h
48h
700
70
600
60
50
e
G
eh
irn
ie
N
Th
ym
ie
r
0
G
eh
irn
10
0
re
20
100
Lu
ng
e
200
us
30
Le
be
r
300
Lu
ng
e
40
N
400
r
Th
ym
us
2-'CPx10000
80
500
0h
48h
90
800
M
ilz
2-'CPx10000
900
be
1000
iNOS
100
Le
SSPII
M
ilz
a)
Abb. 3.30: Transkriptionsmenge von a) SSPII und b) iNOS induziert durch Listerien-Infektion in verschiedenen Organen
zum Zeitpunkt 0 h und 48 h p.i. Die Werte beider Gene wurden auf E-Aktin normalisiert und in dimensionsloser Einheit
dargestellt.
Die Expressionsanalyse mittels Northernblot und Real-time RT PCR zeigten eine basale
Expression von SSPII in der Leber, welche noch durch die Infektion mit Listerien erhöht wurde,
sowie infektionsbedingte Induktionen von SSPII in den Organen Milz, Thymus, Lunge und
Nieren. Allerdings wurde auch deutlich, dass im Gehirn keine basale SSPII Expression stattfindet,
diese wurde zu den angegebenen Zeitpunkten auch nicht nach Infektion induziert.
Durch die Etablierung eines polyklonalen Antikörpers gegen SSPII aus immunisierten Kaninchen
sollte im Weiteren endogenes SSPII-Protein nachgewiesen werden. Da in Vorexperimenten
festgestellt wurde, dass das Protein nur in sehr geringen Mengen vorliegt, wurde für den
Proteinnachweis in Organen eine Immunpräzipitation durchgeführt. Hierbei wurden die
Organlysate (je ½ Organ, Leber: 1/8) mit dem Kaninchen-anti-SSPII-Antikörper bei 4°C
vorinkubiert und danach die Antikörper an G-Sepharose gekoppelt. Das Präzipitat wurde dann
nach Abtrennung von der Sepharose-Matrix denaturiert und Westernblots erstellt. Das SSPII
Protein wurde darauf wieder mit dem polyklonalen Antikörper auf dem Westernblot detektiert.
In Abbildung 3.31 sind die Ergebnisse der Immunpräzipitation mit nachfolgendem Nachweis
durch Westernblot dargestellt.
Dabei konnte in der Milz 48 h p.i SSPII Protein in beiden Mäusen der jeweiligen Gruppe
nachgewiesen werden, wohingegen in den uninfizierten Kontrollen kein SSPII detektierbar war.
In der Leber konnte deutlich eine basale Produktion des SSPII Proteins festgestellt werden. Nach
48 h Infektion mit Listerien wurde die SSPII Translation in der Leber zumindest einer Maus
(Maus 1) deutlich gesteigert. In den Organen Lunge, Thymus und Gehirn konnte weder in den
uninfizierten Kontrollen, noch nach 48 h Infektion mit Listerien, SSPII Protein detektiert werden.
Die Größe des detektierten Proteins lag bei ca. 6,5 kDa. Die Spezifität der detektierten Bande
wurde mit Hilfe des Peptidblocks bei Leberlysaten getestet (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse
95
Abb. 3.31: Immunpräzipitation von SSPII Protein verschiedener Organlysate nach Listerien-Infektion. Dargestellt sind
pro Organ zwei Zeitpunkte mit je 2 Mäusen (0 und 48 hpi, Maus 1 und Maus 2). In den jeweiligen oberen Reihen sind die
Resultate der Immunpräzipitation und Westernblotanalyse von SSPII (ca. 6,5 kDa) mit polyklonalem anti-SSPIIE-Aktin (ca. 45 kDa) dargestellt.
Antikörper und darunter die Ladekontrolle der Lysate mit anti-E
In einem weiteren Infektionsmodell wurden C57BL/6 Mäuse mit dem obligat intrazellularen
Parasiten Toxoplasma gondii infiziert. Jeweils 3 Tieren wurden zu den angegebenen Zeitpunkten
die Organe Milz und Lunge entnommen und gesamt RNS gewonnen. Real-time Analysen zur
Ermittlung der Expressionserhöhung wurden für SSPII und die Kontrollgene iNOS und IFNJ
erstellt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.32 als Ratio (2-''CP) dargestellt. In der Milz konnte
eine Expressionszunahme von SSPII ab 7 Tage nach Infektion gemessen werden, welche bis Tag
12 nach Infektion wieder leicht abnahm. Die iNOS Expression nahm erst ab Tag 7 nach Infektion
zu, während die IFNJ Induktion schon 5 Tage nach Infektion erfolgte. In der Lunge war der
höchste Wert der SSPII Induktion im Vergleich zur uninfizierten Kontrolle schon nach 5 Tagen
erreicht und nahm dann bis 12 Tage nach Infektion wieder ab, obwohl in der Lunge die
Transkription von IFNJ, welche auch für die SSPII Expression verantwortlich ist, noch bis 12 Tage
nach Infektion weiter zunahm.
5d
7d
12d
10 2
10 1
10 0
10 -1
Lunge
10 3
10
5d
7d
12d
2
10 1
10 0
-J
IF
N
O
S
iN
-J
IF
N
S
iN
O
SS
PI
I
10 -1
SS
PI
I
ratio = 2 -'' cp
b)
Milz
10 3
ratio = 2-'' cp
a)
Abb. 3.32: Expression von SSPII, iNOS und IFNJ Transkripten (Real-time-PCR) in den Organen a) Milz und b) Lunge von
T. gondii infizierten C57BL/6 Mäusen (n=3). Infektionsdosis: 20 Zysten intraperitoneal. Dargestellt sind die
Expressionserhöhungen relativ zur uninfizierten Kontrolle, normalisiert auf E-Aktin.
Ergebnisse
96
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SSPII auch in diesem Infektionsmodell eine Rolle spielen
kann, da eine Zunahme der Transkriptmenge in Milz und Lunge messbar war.
Ein weiterer einzelliger Parasit ist Trypanosoma cruzi, der Erreger der südamerikanischen Chagas
Krankheit. Gesamt-RNS aus Milzen von infizierten C57BL/6 Mäusen (n=3), welche mit 50
Blutstadien (trypomastigote) von T. cruzi i.p. infiziert wurden, wurden von Christoph Hölscher,
Tuberkulosezentrum Borstel, zur Verfügung gestellt. Nach cDNS Synthese konnten Real-time
PCRs von SSPII und den für eine adaptive Immunabwehr wichtigen Kontrollgenen iNOS, IFNJ
und IL-12p40 erstellt werden. Da nur RNS von Milzen der Zeitpunkte 8 und 14 Tage nach
Infektion vorhanden waren, wurden die Werte wie zuvor bei der Listerien-Infektion nicht auf
uninfizierte Kontrolltiere relativiert, sondern die CP-Werte der PCR auf E-Aktin normalisiert und
als Transkriptmenge (dimensionslos) zu den Zeitpunkten 8 und 14 Tagen nach Infektion
dargestellt. Die in Abbildung 3.33 dargestellten Resultate zeigen, dass während der T. cruzi
Infektion SSPII RNS produziert wurde und von Tag 8 bis Tag 14 nach Infektion ansteigt. In dieser
Zeitspanne nahmen auch die Transkriptmengen von iNOS und IFNJ stark zu, während IL-12p40
wieder abnahm.
10 3
8 dpi
14 dpi
2-'CPx10.000
10 2
10 1
10 0
0
IL
-1
2p
4
J
IF
N
O
S
iN
SS
PI
I
10 -1
Abb. 3.33: mRNS Expression von SSPII, iNOS, IFNJ und IL-12p40 während der Trypanosoma cruzi Infektion in der Milz
–
von C57BL/6 Mäusen zu den Zeitpunkten 8 und 14 dpi (n=3). Die Expression wurde normalisiert zu E-Aktin (2
'CP
x10.000). Die Mäuse wurden mit einer Infektionsdosis von 50 Trypanosomen (Stamm Tulahuen) i.p. infiziert. Die
mRNS wurde von Christoph Hölscher, Tuberkulosezentrum Borstel, zur Verfügung gestellt.
Alle drei Infektionsmodelle ergaben, dass in der ersten Phase der jeweiligen Infektion, mit dem
grampositiven
Bakterium
L. monocytogenes, den intrazellulären Parasiten T. gondii
(Apicomplexa) und T. cruzi (Kinetoplastida), die Transkription von SSPII induziert wurde.
Zusätzlich wurde das SSPII Protein durch die Listerien-Infektion in der Milz und in der Leber
induziert. Des Weiteren lagen geringe Mengen SSPII Protein in der Leber als basal exprimiertes
Protein in uninfizierten Mäusen vor.
Ergebnisse
97
3.2.3 Nachweis der Sekretion in vitro
Der N-terminale Bereich der SSPII Aminosäuresequenz weist, wie im Kapitel 3.2.1.1 beschrieben,
auf ein Signalpeptid hin. Da die weitere Sequenz lt. in silico Analysen keine ER- oder GolgiRückhaltesequenz beinhaltet, könnte SSPII demnach ein sekretorisches Protein sein. Um dies
experimentell zu untersuchen, wurde ein Fusionskonstrukt von SSPII mit 6 Histidinen am CTerminus unter der Kontrolle des EF-Promoters (EF= humaner Elongationsfaktor 1 D) hergestellt.
Damit wurden je 2x106 293T-Zellen transient transfiziert (Kalzium-Phosphat-Methode). Nach
einem Tag wurde das Vollmedium ersetzt durch Medium ohne FKS. Nach weiteren 48 Stunden
wurde dann der Überstand entnommen und mit der 5 fachen Menge Aceton gefällt. Nach
Zentrifugation und zweimaligem Waschen mit Ethanol wurde das Protein-Pellet in PBS mit
Proteaseinhibitor aufgenommen und stand zur Analyse bereit. Aus den Zellen wurde Zelllysat
erstellt. Drei Ansätze unter vergleichbaren Bedingungen wurden durchgeführt und im WesternBlot analysiert. Abbildung 3.34 zeigt den Nachweis des Fusionsproteins SSPII-6xHis mit einem
Tetra-His-Antikörper.
Abb. 3.34: Sekretionsnachweis von SSPII-6xHis Fusionsprotein. 293T Zellen wurden mit dem Expressionsvektor pEFSem-SSPII-6xHis (Lysate/Überstände 1-3) sowie mit dem Leervektor pEF-Sem (Lysat 0) transfiziert. Nach 3 Tagen
wurden die Überstände abgenommen und mit Aceton die Proteine gefällt sowie aus den Zellen Zelllysate erstellt und
daraus ein Westernblot hergestellt. Die obere Reihe zeigt den Westernblot nach Inkubation mit Tetra-His-Antikörper,
die untere Reihe zeigt denselben Westernblot nach Inkubation mit E-Aktin-Antikörper.
In der oberen Reihe der Abbildung 3.34 sind die Banden des SSPII-6xHis Fusionsproteins gezeigt,
in der unteren Reihe die E-Aktin-Banden. In der ersten dargestellten Spalte (Lysat 0) wurde das
Lysat von 293T-Zellen, transfiziert mit dem Leervektor (Konstrukt ohne SSPII-6xHis),
aufgetragen. In den nächsten drei Spalten wurde Zelllysat der drei Transfektions-Ansätze mit dem
Fusionskonstrukt (Lysate 1-3) und in den letzten drei Spalten die jeweiligen Überstände (1-3) der
Transfektion mit Fusionskonstrukt aufgetragen. Während im Leer-Vektor-Lysat keine SSPII6xHis Bande detektierbar war, konnte sowohl in den Lysaten 1 bis 3, als auch in den
dazugehörigen Überständen 1 bis 3, SSPII-6xHis nachgewiesen werden. Die E-Aktin-Kontrolle
zeigt deutlich, dass zwar in allen aufgetragenen Lysaten E-Aktin meßbar war, jedoch nicht in den
Überständen. Das weist darauf hin, dass die Überstände, die vor Ernte abzentrifugiert wurden, frei
von abgelösten Zellen oder Zellbestandteilen sind.
Ergebnisse
98
Dieser Versuch belegt die Sezernierung von SSPII-Protein in den Überstand von SSPII
produzierenden Zellen.
3.2.4 Subzelluläre Lokalisation von SSPII
Die Aminosäuresequenz von Proteinen trägt Erkennungssequenzen, die für die jeweilige
Lokalisation des reifen Proteins verantwortlich sind (Blobel, 2000). Die SSPII Sequenz weist ein
solches Erkennungsmotiv am N-Terminus auf. Die durch einen hydrophoben Bereich
gekennzeichnete Leader Sequenz deutet zum einen auf ein putatives Signalpeptid hin, zum
anderen auf eine Transmembran-Helix (vgl. Kapitel 3.2.1.1 Proteinvorhersage durch SignalP und
TMHMM). Um die subzelluläre Lokalisation von SSPII zu bestimmen, wurden daher SSPII
Fusionskonstrukte erstellt und in RAW 264.7 Makrophagen oder 293T-Zellen transient
transfiziert. In Abbildung 3.35 sind die subzellulären Lokalisationen von zwei unterschiedlichen
SSPII-Fusionsproteinen dargestellt. Zunächst wurde ein Konstrukt verwendet, bei dem das
Fusionsprotein das rot fluoreszierende DsRed am C-Terminus trägt (SSPII-DsRed). Mit einem
weiteren Konstrukt sollte die Auswirkung der SSPII-Signalsequenz untersucht werden. Dafür
wurde das Konstrukt so kloniert, dass das DsRed-Protein am N-Terminus des Fusionsproteins liegt
(DsRed-SSPII).
Die Lokalisationen der beiden Fusionsproteine waren sehr unterschiedlich: befand sich SSPII am
N-Terminus, so lag das Protein netzartig im Zytoplasma der Zelle vor, der Zellkern (DAPIFärbung) blieb ausgespart; d.h. hier war kein SSPII-DsRed-Protein lokalisiert (obere Reihe).
Wurde die putative N-terminale Signalsequenz von SSPII vom vorgelagerten DsRed-Protein
verdeckt (DsRed-SSPII), so lag das Fusionsprotein ubiquitär in der Zelle und im Zellkern vor.
Abb. 3.35: Subzelluläre Lokalisation von SSPII-DsRed Fusionsproteinen in 264.7 RAW-Makrophagen. Links: SSPIIDsRed Fusionsprotein (rot) und Zellkerngegenfärbung mit DAPI. Rechts: DsRed-SSPII Fusionsprotein (rot) und
Zellkerngegenfärbung mit DAPI. Grau: Differential-Kontrastaufnahme der Zellen.
Als nächstes sollte die Identität der subzellulären Kompartimente genauer untersucht werden, in
denen sich das SSPII-Protein befindet. Daher wurden 293T-Zellen mit SSPII-DsRed transfiziert
sowie simultan mit grün fluoreszierende GFP-gekoppelten Proteinen, die Zielsequenzen für
bestimmte Zellkompartimente besitzen. Bei der Untersuchung der potentiellen Kolokalisation von
SSPII mit Mitochondrien wurde ein SSPII-GFP Fusionskonstrukt verwendet, da der
Mitochondrienmarker nur mit DsRed fusioniert vorlag. Nach 2 Tagen wurden die Zellen fixiert
Ergebnisse
99
und mit DAPI der Zellkern gegengefärbt. Die hergestellten Präparate wurden dann im
Konfokalmikroskop analysiert. Überlagerungen der beiden Fusionsproteine sind als gelbe Bereiche
im konfokalen Überlagerungsbild erkennbar (Abbildung 3.36).
In der oberen Reihe wurde das SSPII-GFP Fusionskonstrukt mit dem Mitochondrien-DsRed
Konstrukt ko-transfiziert. Im Überlagerungsbild sind einige Bereiche erkennbar, bei denen SSPII
mit Mitochondrien kolokalisiert. In der Reihe darunter wurde die Lokalisation von SSPII-DsRed
mit Membranen-CFP Proteinen untersucht. Auch hier sind einige wenige Überlagerungsbereiche
erkennbar, jedoch fand beim größten Teil der Moleküle keine subzelluläre Kolokalisation der
Proteine statt. Kolokalisationen mit Endosomen (mittlere Reihe) konnten nur in wenigen
Bereichen ermittelt werden. Die größten Übereinstimmungen mit SSPII-DsRed Protein konnten
mit den subzellulären Organellenbereichen endoplasmatisches Retikulum (ER, zweite Reihe von
unten) sowie Golgi-Apparat (untere Reihe) beobachtet werden.
Ergebnisse
100
Abb. 3.36: SSPII Kolokalisation mit subzellulären Kompartimenten. 293T Zellen wurden mit SSPII sowie verschiedenen
Markerkonstrukten für die Organellenbereiche Mitochondrien, Lipidmembranen, Endosomen, endoplasmatisches
Retikulum (ER) und Golgi-Apparat, kotransfiziert. Die erste Spalte zeigt das SSPII-Fusionsprotein, die zweite Spalte das
jeweilige organellenspezifische Markerprotein, die dritte Spalte die Überlagerung der Spalte eins und zwei mit dem
Kernfarbstoff DAPI und die vierte Spalte die Differential-Kontrastaufnahme der Zellen.
Ergebnisse
101
Des Weiteren sollte überprüft werden, wie sich die subzelluläre Lokalisation von SSPII bei einer
Infektion von RAW 264.7 Makrophagen mit dem intrazellulären Parasiten T. gondii (ME49)
verhält. Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen transient mit SSPII-GFP transfiziert, nach 24 h mit
IFNJ über Nacht stimuliert und weitere 2 h mit Toxoplasma Tachyzoiten (MOI 10) infiziert.
Danach wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert und die Parasiten mit anti-SAG1 Antikörper
gefärbt. Der Kern wurde wieder mit DAPI gegengefärbt. Die Präparate wurden ebenfalls im
konfokalen Mikroskop analysiert (Abbildung 3.37). Hierbei konnten keine Assoziationen des
SSPII Proteins mit dem intrazellulären Parasiten beobachtet werden, unabhängig von einer IFNJ
Vorstimulation.
Abb. 3.37: SSPII-Lokalisation in T. gondii (ME 49) infizierten 264.7 RAW Makrophagen. Erste Spalte: SSPII-GFP (grün),
zweite Spalte: Toxoplasma (rot), dritte Spalte: Überlagerungsbild aus Spalte eins und zwei mit dem Kernfarbstoff DAPI,
vierte Spalte: Differential-Kontrastaufnahme der Zellen.
Aufgrund der in diesem Abschnitt vorgestellten Beobachtungen lässt sich zusammenfassend
schließen, dass das SSPII-Protein vor allem im endoplasmatischen Retikulum sowie im Golgi
Apparat, außerhalb des Zellkerns lokalisiert ist. Weder die Vorstimulation mit IFNJ noch die
Infektion mit T. gondii veränderten die Lokalisation von SSPII innerhalb der Zelle.
Ergebnisse
102
3.2.5 Gene Targeting: Inaktivierung des SSPII Gens der Maus
Wie in Abschnitt 3.1.7 für mGBP7 beschrieben, sollte zur detaillierten Aufklärung der Funktion
von SSPII im Gesamtorganismus eine SSPII-defiziente Mauslinie generiert werden. Zunächst
sollte eine embryonale Stammzelllinie (ES) aus 129/Ola Mäusen mit homologer Rekombination
des SSPII-Lokus generiert werden. Ziel dabei ist die erfolgreiche Keimbahntransmission des
gentechnisch veränderten Genlokus zur Generierung einer SSPII defizienten Mauslinie.
Die Rekombinations-Strategie ist in Abbildung 3.38 gezeigt. Der Genlokus von SSPII ist ca. 3 kb
lang (von Exon 1 bis 3) und besteht aus 3 Exonen. Am Ende von Exon 1 befindet sich das Start Kodon ATG, im Exon 3 das Stopp-Kodon TAG.
Abb. 3.38: Schematische Darstellung der Rekombinationsstrategie des SSPII Lokus. Oben: Genlokus von SSPII. Mitte:
Rekombinationsvektor mit den homologen Bereichen und den eingefügten Selektionsmarkern Neomycin-ResistenzKassette (neo) und HSV Thymidinkinase Kassette (HSV-TK). Unten: Rekombinierter Lokus nach erfolgter Integration
der Neomycin-Kassette in reverser Orientierung.
Die Neomycin-Resistenzgen-Kassette sollte in reverser Orientierung zur Leserichtung von SSPII
in Exon 2 in den Genlokus eingesetzt werden. Hierbei wurde keine endogene SSPII Sequenz
deletiert, allerdings sollte der starke Promotor der Neomycin-Resistenz-Kassette eine
Transkription von SSPII verhindern.
Um das Ereignis der homologen Rekombination zu erreichen, wurden 5´ und 3´ der NeomycinResistenz-Kassette (Neo-Kassette) die Gen-Lokus-Bereiche kurzer Arm und langer Arm gesetzt.
Der kurze Arm (KA) bestand aus der Intronsequenz von Intron 1 und einem Teil des Exon 2 und
Ergebnisse
103
hatte eine Gesamtlänge von 0,65 kb. Über die durch PCR angefügten Schnittstellen Not I und Spe
I wurde der KA in den Targetingvektor eingebracht. Der lange Arm (LA) bestand aus der
Genlokussequenz die im Exon 2 startet und im Intronbereich hinter Exon 3 endet. Der LA war ca.
2,5 kb lang und wurde über die eingefügten Schnittstellen Xho I und Kpn I eingebracht. Für die
Negativselektion wurde die HSV-TK über die Schnittstelle Kpn I als Letztes eingefügt. Für die
Durchführung der homologen Rekombination wurde der hergestellte Vektor dann über die
Schnittstelle Not I linearisiert. Nach erfolgreicher Rekombination konnten die Klone mit der 5´
flankierenden Sonde analysiert werden. Dazu wurden die Klone mit dem Restriktionsenzym EcoR
V und Pst I geschnitten und mit der 5´Sonde im Southernblot hybridisiert. Durch Einbringen
einer EcoR V Schnittstelle über die Neo-Kassette in den SSPII Lokus ergab das rekombinierte
knockout Allel eine Bande in der Größe von 4,3 kb während das wildtypische Allel als Bande eine
Größe von 5,4 kb ergab.
Bisher konnten drei positive ES-Zell-Klone detektiert werden, allerdings konnten zwei Klone
nach dem Auftauen nicht mehr expandiert werden. Der verbleibende positive Klon 2 (Klon 2 des
ersten Targetings) wurde nach Auftauen im Southernblot analysiert (Abbildung 3.39). Deutlich ist
hier bei allen drei aufgetragenen und mit EcoR V und Pst I geschnittenen Proben die wildtypische
Bande bei <5 kb zu erkennen. Während Klon 1 und E14 keine weitere Bande mehr aufwies, war
bei Klon 2, wie vorausgesagt, eine weitere Bande bei 4 kb detektierbar. Diese liegt in gleicher
Stärke wie die wildtypische Bande vor, so dass es sich hierbei um keinen sogenannten Mischklon
handelt. In Abbildung 3.39 b) wurde der Klon 2 auf die einmalige Integration der Neo-Kassette
hin überprüft. Dazu wurde die genomische DNS der Klone 1, 2 sowie E14 mit den Enzymen Sma I
bzw. Spe I geschnitten und im Southernblot analysiert. Hierbei konnte eindeutig nur eine
Integration der Neo-Kassette in das Genom von Klon 2 nachgewiesen werden. Die E14-KontrollDNS wies keine spezifische Bande auf, wohingegen bei Klon 1 deutlich wurde, dass dort die
Neomycin-Resistenz-Kassette in das Genom integriert wurde, allerdings an falscher Stelle, wie
auch die zu Klon 2 unterschiedlich großen Banden belegen.
Abb. 3.39: Southernblot-Analyse zum Nachweis der homologen Rekombination im SSPII Lokus und der einmaligen
Integration der Neomycin Resistenz Kassette. a) aufgetragen wurde die genomischen DNS der Klone 1 und 2 sowie
E14 nach Restriktionsverdau mit EcoRV und PstI und Hybridisierung mit der 5´-Sonde; b) aufgetragen wurde die
genomische DNS von Klon 1 und 2 sowie E14 nach Restriktionsverdau mit SmaI (links) bzw. SpeI (rechts) und
Hybridisierung mit der Neomycin-Sonde.
Ergebnisse
104
Der durch homologe Rekombination erhaltene Klon 2 wurde mehrfach in C57BL/6 Blastozysten
injiziert und in Ammentiere (Stamm CD1) transferiert. Die daraus resultierenden chimären Tiere
wurden mit C57BL/6 Mäusen verpaart. Diese Verpaarungen führten in einem Fall zu einer
sogenannten Keimbahnmaus, welche aus dem genetischen Material des Klons 2 besteht. Eine
Schwanzbiopsie wurde im Southernblot analysiert (Abbildung 3.40). Hierbei wurde belegt, dass
Tier Nr. 7343 nicht das erhoffte knockout Allel trug, sondern das genetische Material des
wildtypischen Allels.
Abb. 3.40: Southernblot-Analyse zur Typisierung der Keimbahnmaus. Aufgetragen wurde jeweils die genomische DNS
der Schwanzbiopsie der Keimbahnmaus 7343 sowie die genomische DNS von Klon 1 und 2 nach Verdau mit EcoRV
und PstI.
Weitere Verpaarungen der Chimären sollen zukünftig zu Keimbahntieren mit dem erhofften
knockout Allel führen. Auch soll das erneute Durchführen des Targetings zu weiteren positiven
Klonen führen, um die Chance der Keimbahntransmission durch eventuell potentere Klone zu
erhöhen.
Diskussion
105
4 Diskussion
4.1 mGBP7 in der Infektionsabwehr
Die 65 kDa GTPasen konnten schon früh als IFNJ induzierte Gene identifiziert werden (Gupta et
al., 1979; Cheng et al., 1983; Cheng et al., 1985). Obwohl die starke Induktion durch Interferone
(Boehm et al., 1998; Nguyen et al., 2002) zu der Entdeckung und Aufklärung des JAK-STAT
Signalweges bei der IFNJ und IFND/E Signaltransduktion beitrugen, ist die biologische Funktion
dieser GTPasen noch immer unklar.
Zu Beginn dieser Arbeit waren 5 Mitglieder der murinen 65 kDa GBPs bekannt (Cheng et al.,
1983; Boehm et al., 1998; Nguyen et al., 2002). Durch umfangreiche Transkriptomanalysen mittels
Microarrays von IFNJ und TNF stimulierten Ana-1 Makrophagen konnten in unserem Labor drei
weitere mGBPs identifiziert werden, mGBP6, 7 und 8 (Degrandi et al., 2007). Im Rahmen von in
silico Untersuchungen genomischer Datenbanken zur Klärung der genomischen Organisation der
mGBP Loci auf den Chromosomen 3 und 5 der Maus, konnten weitere mGBPs identifiziert
werden, so dass mittlerweile sogar insgesamt 11 Mitglieder der murinen GBPs sowie zwei
Pseudogene bekannt sind (Degrandi et al., 2007; Kresse et al., 2008). Zeitgleich zu den in unserem
Labor angefertigten umfangreichen Analysen der murinen GBPs wurde die genomische
Organisation von neuen Mitgliedern der murinen als auch humanen GBPs von der Arbeitsgruppe
um Deborah Vestal analysiert (Olszewski et al., 2006). Nach Sequenzanalysen stellte sich heraus,
dass das dort beschriebene mGBP6, dem in unserer Arbeitsgruppe bearbeiteten und publiziertem
Gen mGBP7 entspricht (Degrandi et al., 2007; Kresse et al., 2008) und in der hier vorliegenden
Arbeit auch weiterhin als mGBP7 geführt wird.
Zunächst wurde die transkriptionelle Regulation von mGBP1 bis 10 in vivo und in vitro
analysiert,
wobei
weiterführende
Untersuchungen,
wie
die
Regulation
durch
den
Transkriptionsfaktor IRF-1, die Induktion in T. gondii infizierten Mäusen und die subzelluläre
Lokalisation, primär für mGBP7 durchgeführt wurden.
4.1.1 Expression der murinen 65 kDa GTPasen in vitro und in vivo
Durch die Etablierung der Real-time RT-PCR für mGBP1-10 im Rahmen dieser Arbeit konnten
umfangreiche Expressionsstudien dieser Genfamilie durchgeführt werden. Für mGBP1-5 war
bereits bekannt, dass diese nach IFNJ Stimulus in embryonalen Fibroblasten und Ana-1
Makrophagen sowie in RAW 264.7 Zellen hochreguliert werden (Boehm et al., 1998; Nguyen et
al., 2002). In dieser Arbeit konnte für mGBP1-5 und ebenfalls für mGBP6-10 eine starke
Induktion der Transkriptmenge durch IFNJ in Ana-1 Makrophagen, im zeitlichen Verlauf der
Stimulation von 0, 2, 6 und 16 h gezeigt werden. Mehr noch, die Expression wurde auch von Typ I
Interferon (IFNE) bei allen GBPs, mit Ausnahme von mGBP5 (hier nur eine Ratio von 2,4),
deutlich hochreguliert. Dies weist auf die transkriptionelle Beteiligung von ISRE Elementen in
Diskussion
106
den Promotorbereichen der einzelnen Genloci der mGBPs hin. Die Induzierbarkeit durch Typ I
Interferon war bisher nur für hGBP1 und mGBP2 beschrieben (Cheng et al., 1986; Vestal et al.,
2000; Gorbacheva et al., 2002). In der Promotorregion von hGBP1 wurde neben einem ISRE auch
ein GAS Motiv identifiziert. Beide sind für die Induzierbarkeit durch Typ I bzw. Typ II
Interferone verantwortlich (Decker et al., 1991; Lew et al., 1991). ISRE Elemente, sowie auch GAS
Elemente, konnten vor allem in den Promotorregionen von mGBP1-5 und 7 beschrieben werden
(Olszewski et al., 2006). In der Promotorregion des humanen GBP1 Gens liegt ein NF-NBBindemotiv, welches dort für die Induzierbarkeit nach TNF Stimulus verantwortlich ist
(Naschberger et al., 2004). Auch für mGBP3, 4 und 5 konnte ein NF-NB-Bindemotiv in der
Promotorregion beschrieben werden (Olszewski et al., 2006). In unserem Stimulationsmodell
wurde nur bei mGBP4 und in geringem Maße bei mGBP2 eine Expression nach TNF-Stimulus
beobachtet, während TNF auf die Expression von mGBP3, 5, 7, 8 und 9 einen negativen Effekt
ausübte, was an der Ratio <1 zu erkennen ist. Über die Ursache kann nach jetzigem Kenntnisstand
nur spekuliert werden, denn entweder ist die Induktion über diese Motive im Falle von mGBP3
und 5 transient oder es müssen weitere Transkriptionsfaktoren synergistisch wirken, um diese
Genexpressionen zu induzieren. Möglicherweise werden durch TNF Genprodukte induziert, die
tatsächlich negativ auf die Expression von mGBP3, 5, 7, 8 und 9 wirken. Ein negativer Effekt von
TNF auf proinflammatorische Gene ist allerdings bisher nicht beschrieben. Ein synergistischer
Effekt von IFNJ und TNF konnte hier für alle mGBPs, mit Ausnahme von mGBP1, ermittelt
werden.
Nguyen und Kollegen konnten außerdem in RAW Makrophagen eine Induktion von mGBP1, 2, 3
und 5 durch LPS nachweisen, wobei diese Expression transient ist und nach 12 h auf den
unstimulierten Wert wieder abfällt (Nguyen et al., 2002). Bei der Stimulation von Ana-1
Makrophagen wurde nur mGBP6/10 durch LPS nachhaltig hochreguliert, was darauf hindeuten
könnte, dass auch in dieser Makrophagenzelllinie die Expression der anderen GBPs 16 h nach
Stimulation wieder auf den Ausgangswert der unstimulierten Zellen abgesunken war. Dies bedarf
weiterer Messungen der mGBP Expression im Zeitverlauf nach Stimulation mit LPS, wie für das
Zytokin IFNJ bereits durchgeführt. Die mGBPs6 und 10 wurden außerdem durch den TLR9
Liganden CpG hochreguliert, gleiches konnte in dieser Expressionsstudie zusätzlich nur für
mGBP1 festgestellt werden. Auch das Zytokin IL-1E löste nur eine leichte Induktion von
mGBP6/10 sowie von mGBP2 aus, was konsistent zu den Daten in RAW Makrophagen von
Nguyen und Kollegen ist (Nguyen et al., 2002). Die unterschiedlichen transkriptionellen
Expressionsmuster der 65 kDa GBPs führen daher zu der Hypothese, dass sie funktionell nicht
redundant sind, sondern einer komplexen transkriptionellen Kontrolle nach der Erkennung von
unterschiedlichen PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) unterliegen und somit eigene
Aufgaben erfüllen könnten.
Die in vivo Expressionsanalyse von mGBP1-10 zeigt deutlich eine Induzierbarkeit aller
untersuchten GBPs in den Organen Leber und Milz nach Infektion mit Listeria monocytogenes.
Diskussion
107
Bemerkenswert an dieser in C57BL/6 Mäusen durchgeführten Analyse ist, dass auch mGBP1 hier
und in Ana-1 Makrophagen, die aus C57BL/6 Mäusen generiert wurden (Cox et al., 1989),
eindeutig hochreguliert wurde. In früheren Studien wurde gezeigt, dass nach Injektion von poly
(I:C) oder LPS in verschiedene Mausstämme, mGBP1 in C57BL/6 Mäusen nicht induziert wurde
weswegen man von einem Fehlen eines funktionellen Allels in diesem Mausstamm ausgegangen
war (Staeheli et al., 1984; Nguyen et al., 2002). In unserem Stimulations- als auch
Infektionsmodell konnte eindeutig mGBP1 auf Transkriptionsebene (diese Arbeit) aber auch auf
Proteinebene nach Listerien- und Toxoplasma-Infektion mittels spezifischen Antiseren
nachgewiesen werden (Degrandi et al., 2007). Es kann daher davon ausgegangen werden, dass in
Mausorganen von C57BL/6 Mäusen die alleinige Gabe von LPS oder poly (I:C) nicht ausreicht, um
eine transkriptionelle Induktion von mGBP1 auszulösen. Möglicherweise müssen erst komplexere,
durch eine Infektion ausgelöste Stimulationsbedingungen vorliegen, so dass der mGBP1 Genlokus
frei liegt zur Transkription, wobei möglicherweise zunächst Repressorproteine verdrängt werden.
Diese Spekulationen müssen in weiterführenden Arbeiten verfolgt werden und können durch die
bisher ausgeführten Experimente noch nicht ausreichend beantwortet werden.
4.1.1.1 Expression von mGBP7 in Ana-1 Makrophagen und in vivo
In Ana-1 Makrophagen wurde mGBP7 nach Stimulation durch Typ I und II Interferone deutlich
hochreguliert. Das lässt in diesem Falle auf GAS sowie ISRE Motive im Promotorbereich
schließen, welche, wie oben erwähnt, im Promotorbereich von mGBP7 vorhanden sind. Des
Weiteren konnten in der Promotorregion mehrere AP-1 (activating protein-1) Bindemotive, aber
kein NF-kB-Konsensus Element identifiziert werden (Olszewski et al., 2006).
TNF führte nur synergistisch mit IFNJ zur deutlichen Hochregulation der mGBP7 Transkripte in
Ana-1 Zellen. Die Stimulation mit den TLR-Liganden LTA (TLR2), LPS (TLR4), CpG (TLR9) und
poly (I:C) (TLR3) führte in diesen Makrophagen zu keiner Induktion von mGBP7. Dies könnte
mit den fehlenden NF-NB Motiven in der Promotorregion von mGBP7 erklärt werden.
Nach Infektion von C57BL/6 Mäusen mit L. monocytogenes wurde die mGBP7 Expression
transkriptionell mittels Real-time RT-PCR analysiert. Zusätzlich wurde die mGBP7 Expression auf
Proteinebene mittels Westernblot nach Listerien- und Toxoplasma-Infektion untersucht. Deutlich
konnte eine Transkriptionserhöhung von mGBP7 in der Leber und in der Milz nach L.
monocytogenes Infektion beobachtet werden. Es zeigte sich außerdem auch eine verstärkte
mGBP7 Proteinproduktion in diesen beiden untersuchten Organen nach Infektion. In beiden
Organen war eine basale Expression des Proteins vorhanden, was auf eine konstitutive Expression
in diesen Geweben schließen läßt. Auch für die Proteine mGBP3 und 5 konnte in unserem Labor
eine basale Expression detektiert werden, während mGBP1 und 2 erst im Verlauf der Infektion
gebildet werden (Degrandi et al., 2007).
Nach Toxoplasma-Infektion wurde in der Milz und in der Lunge die Expression von mGBP7 auf
Proteinebene gemessen. Hier konnte wieder eine Basalexpression in der Milz gezeigt werden,
Diskussion
108
jedoch war im Lungengewebe uninfizierter Tiere kein mGBP7 Protein in nachweisbaren Mengen
vorhanden. Im Verlauf der Infektion konnte allerdings auch in der Lunge der Mäuse eine starke
Zunahme des mGBP7 Proteins gemessen werden. Die Proteinexpression von mGBP1, 2, 3 und 5 in
der Lunge war basal ebenfalls nicht nachweisbar. Erst ab Tag 5 nach Infektion konnten hier
mGBP1, 2, 3 und 5 Proteine nachgewiesen werden (Degrandi et al., 2007). Um diesen
interessanten Unterschied in der konstitutiven Proteinexpression der einzelnen mGBPs zu klären,
müssen weitere Studien durchgeführt werden. Dabei sollte zunächst der Frage nachgegangen
werden, in welchen weiteren Geweben der Maus eine basale Proteinexpressionen der
unterschiedlichen mGBPs vorhanden ist. Die Herstellung von gendefizienten Mauslinien muriner
GBPs könnte dabei zur Aufklärung der Bedeutung der basalen Expression beitragen. In Bezug auf
mGBP2, bei der die defiziente Mauslinie bereits in unserem Labor hergestellt wurde, konnte
hinsichtlich der Organentwicklung allerdings kein Phänotyp gefunden werden (Konermann et al.,
unveröffentlicht), allerdings lag mGBP2 nicht als basal exprimiertes Protein in der Milz von Wt
Tieren vor.
Zusammen genommen könnte dieser Umstand in den Expressionsunterschieden jedoch ein
Hinweis auf differentielle Funktionen der untersuchten p65 kDa GBPs in der Infektabwehr im
Gesamtorganismus oder auf zellulärer Ebene sein.
4.1.2 Expressionsanalyse von mGBP7 in Wt und IRF-1 defizienten
Fibroblasten und BMDM
In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass mGBP1 und 2 sowie iNOS transkriptionell
sekundär responsive Gene sind, die erst nach Proteinneusynthese von IRF-1 (Interferon
regulatory factor-1) nach IFNJ Stimulation in embryonalen Fibroblasten und Makrophagen
gebildet werden (Kimura et al., 1994; Kamijo et al., 1994). Im Weiteren konnten in der
Promotorregion von mGBP1 und 2 funktionelle ISRE Motive beschrieben werden, die auch als
Bindemotiv für IRF-1 (Interferon regulatory factor 1) dienen (Briken et al., 1995). Im Gegensatz
dazu wurde für die Expression von humanem GBP1 keine Abhängigkeit von der IRF-1
Neusynthese in Fibroblasten belegt; hier ist das beschriebene GAS-Element in der Promotorregion
funktionell und für die Synthese von hGBP1 verantwortlich (Decker et al., 1989). Für mGBP7, für
das in der Promotorregion 2 GAS Elemente aber auch ein ISRE Element beschrieben wurden
(Olszewski et al., 2006), war deshalb die Überprüfung der IRF-1 abhängigen Synthese ein
interessanter Punkt dieser Arbeit. Daher wurden IRF-1 ko Fibroblasten sowie IRF-1 ko BMDM
stimuliert und zunächst auf mRNS Transkripte hin untersucht. Bei der Analyse der IRF-1 ko
Fibroblasten konnte eine deutliche Induktion von mGBP7 Transkripten nach Stimulation mit
IFNJ nachgewiesen werden, so dass hier die GAS Elemente funktionell zu sein scheinen. Jedoch
reichte eine Induktion von mGBP7 durch IFNJ in Wt und IRF-1 ko Fibroblasten für die
Proteinsynthese nicht aus (was der Westernblot zeigte). Die Induktion von mGBP2 hingegen
Diskussion
109
zeigte auffällige Unterschiede zwischen Wt und IRF-1 ko Fibroblasten. Hier wurde die
Transkriptmenge deutlich durch die Neusynthese von IRF-1 verstärkt. Im Gegensatz dazu war die
mGBP2 Transkriptmenge in IRF-1 ko Zellen stark vermindert und führte auch zu keiner
Proteinsynthese. In diesen Zellen ist die mGBP2 Transkription und Translation von der IRF-1
Neusynthese stark abhängig. Auffallend bei mGBP7 und 2 war außerdem, dass die basale
Transkriptmenge beider GTPasen in den IRF-1 ko Fibroblasten stark verringert war. IRF-1 liegt in
geringen Mengen konstitutiv in Zellen vor (Salkowski et al., 2000), was eventuell auch für die
basale Expression von mGBP7 und 2 verantwortlich sein kann.
Die umfangreiche Analyse der Stimulation von Wt und IRF-1 ko BMDM konnte zum einen
zeigen, dass mGBP7 in Wt Makrophagen auch nach Stimulation durch den TLR-Liganden LPS
und poly (I:C) induziert wurde sowie zum anderen auch nach TNF Stimulus. Dies zeigt, dass im
Gegensatz zu Ana-1 Makrophagen hier trotz des Fehlens von NF-NB Bindemotiven im mGBP7
Promotorbereich alternative Elemente für die Induktion von mGBP7 verantwortlich sein müssen,
die in Ana-1 Makrophagen nicht aktiv sind. Zunächst einmal befinden sich im mGBP7
Promotorbereich mehrere AP-1 (activation protein 1) Elemente. Diese können neben NF-NB über
den TNF Signalweg via TRAF2 angesprochen werden (Karin et al., 1997; LaMonica et al., 2001).
Andererseits werden Typ I Interferone nach TLR3 (z.B. poly (I:C)) und TLR4 (LPS) Stimulation
durch den Transkriptionsfaktor IRF3 in Makrophagen produziert (Toshchakov et al., 2002; Doyle
et al., 2002) und könnten dann in einem autokrinen Stimulationsweg über die ISRE Bindestelle
die Produktion von mGBP7 in den BMDM induzieren. Zusätzlich bindet IRF3 an ISRE Elemente
und kann somit die Transkription von mGBP7 direkt induzieren (Fitzgerald et al., 2003).
Die Ergebnisse der Real-time RT-PCR Analyse zeigen außerdem, dass in IRF-1 ko Makrophagen
zum Wt vergleichbare Mengen an mGBP7 Transkripten gebildet wurden. Hier findet eine IRF-1
unabhängige Induktion von mGBP7 statt. Allerdings konnte durch TNF Stimulation nur eine
geringere Expression von mGBP7 gemessen werden: hier scheint die IRF-1 Neusynthese beteiligt
zu sein, um die Transkription von mGBP7 in Menge der Wt Stimulation zu induzieren. Die basale
Expression in BMDM lag – wie in den IRF-1 Fibroblasten – etwas geringer vor als in den Wt
Zellen. Möglicherweise führt auch hier eine konstitutive IRF-1 Synthese zu diesem Zustand.
Die p47 GTPase Irgm1 (LRG-47) wurde in Makrophagen als von IRF-1 unabhängig exprimiert
beschrieben (Boehm et al., 1998). Auch in dieser Arbeit konnte durch die Real-time RT-PCR
Analyse in Makrophagen gezeigt werden, dass Irgm1 ohne IRF-1 in gleichem Maße nach
unterschiedlichen Stimulationen exprimiert wird, wie in den Wt Makrophagen. Es stellte sich
außerdem heraus, dass auch die Basalexpression dieser GTPase ohne IRF-1 in gleicher Höhe
vorkommt wie in Wt Makrophagen, was konsistent zu den Daten von Boehm und Kollegen ist
(Boehm et al., 1998).
Die Expression von mGBP2 in BMDM zeigte starke transkriptionelle Unterschiede. Bei allen
Stimulationsarten war die Menge der mGBP2 Transkripte ohne IRF-1 deutlich niedriger, was eine
Beteiligung von IRF-1 an der Transkription belegt. Jedoch fand auch ohne IRF-1 eine, jedoch
Diskussion
110
geringere, Induktion von mGBP2 statt. Dieser Versuch belegt die Verstärkung der Transkription
von mGBP2 durch die Neusynthese von IRF-1, allerdings bleibt eine IRF-1 unabhängige
Induktionsfähigkeit weiterhin vorhanden. Auch die induzierbare NO Synthase (iNOS) wurde von
IRF-1 abhängig induziert, wie das bereits in früheren Studien gezeigt werden konnte (Martin et
al., 1994); nur ein Kombinationsstimulus mit den Zytokinen IFNJ, TNF, IFNE und IL-1E sowie
den TLR-Agonisten LPS, LTA, poly (I:C) und CpG konnte hier das Fehlen des
Transkriptionsfaktors in den IRF-1 ko Makrophagen ausgleichen und iNOS in vergleichbaren
Mengen, wie in Wt Zellen, produzieren.
Die Proteinsynthese von mGBP7 wurde von IFNJ stark in Wt BMDM induziert. Auch ohne IRF-1
wurde mGBP7 Protein in vergeichbaren Mengen produziert, wie auch in Anwesenheit des
Transkriptionsfaktors IRF-1. Bemerkenswert ist das völlige Fehlen von mGBP7 Protein nach der
simultanen Stimulation mit den Zytokinen IFNJ/TNF, da die Resultate der Real-time RT-PCR in
Wt, wie auch in IRF-1-ko BMDM die Transkription von mGBP7 mRNS belegen. Hier scheinen
postranskriptionelle Mechanismen, wie z.B. die Anwesenheit regulatorischer microRNS, die
Proteinsynthese von mGBP7 vollständig zu blockieren. Im Gegensatz dazu verdeutlichen die
Daten der Westernblotanalyse von mGBP2 die Abhängigkeit dieses Proteins von der Neusynthese
von IRF-1, da in Abwesenheit von IRF-1 (Stimulation mit TNF in Wt BMDM, Stimulation mit
IFNJ, TNF sowie IFNJ/TNF in IRF-1 ko BMDM) kein oder nur sehr wenig mGBP2 Protein
nachweisbar war. Auch kam es zur Proteinsynthese von IRF-1 sowie mGBP2 durch die
Kombination von IFNJ/TNF in den Wt BMDM. Dies belegt zum einen die Abhängigkeit der
mGBP2 Synthese von der Anwesenheit des Transkriptionsfaktors IRF-1 und zum anderen die
Tatsache,
dass
die
mGBP2
Proteinsynthese
nicht
denselben
posttranskriptionellen
Regulationsmechanismen wie mGBP7 unterliegt.
Zusammen betrachtet verdeutlichen diese Ergebnisse jedoch die unterschiedlichen Effekte und
Regulationsmöglichkeiten durch verschiedene Komponenten der Pathogenerkennung (Zytokinund TLR-Signalwege) bei zwei GTPasen derselben Genfamilie. IRF-1 reguliert und verstärkt die
Produktion von mGBP2, während mGBP7 nicht oder kaum durch die Neusynthese von IRF-1
abhängig produziert wird.
4.1.3 Subzelluläre Lokalisation von mGBP7
In früheren Studien an mGBP2 konnte gezeigt werden, dass die subzelluläre Verteilung dieses
Proteins granulär bzw. in Vesikeln von heterogener Größe in der Zelle vorliegt (Vestal et al.,
2000; Degrandi et al., 2007). Die genaue Identität dieser vesikelartigen Strukturen konnte
allerdings bisher nicht näher bestimmt werden. In dieser Arbeit sollte die subzelluläre Struktur
des neu identifizierten Proteins mGBP7 untersucht werden. Dafür wurden unterschiedliche
Fusionskonstrukte kloniert, welche entweder N-terminal oder C-terminal von mGBP7 ein
fluoreszierendes Protein tragen. Die zelluläre Verteilung dieser Fusionsproteine wurde dann in
Abhängigkeit vom IFNJ Stimulus in transfizierten RAW Makrophagen untersucht. Hierbei konnte
Diskussion
111
festgestellt werden, dass diese mGBP7 Fusionsproteine unabhängig von der Position des jeweiligen
fluoreszierenden Proteins (DsRed N- bzw. C-terminal, GFP C-terminal), ebenfalls in vesikulären
Strukturen im Zytoplasma der Zellen vorlagen. Die Präinkubation mit IFNJ hatte zunächst keine
Auswirkung auf die zelluläre Distribution von mGBP7, es lag auch nach IFNJ Stimulation
vesikulär im Zytoplasma unter Aussparung des Zellkerns vor. Während mGBP1, 2 und 5 ein Cterminales CaaX Motiv tragen, welches für die posttranslationale Isoprenylierung und damit
Assoziation mit Membranen verantwortlich ist, konnte ein solches Motiv für mGBP7 nicht
identifiziert werden. Auch wurde keine Transmembrandomäne mit dem Programm TMHMM 2.0
vorhergesagt. Für mGBP2 konnte außerdem festgestellt werden, dass die Mutation des CaaX
Motivs zu STIL zur Veränderung der subzellulären Lokalisation führt und die mGBP2 Mutante im
Zytoplasma der Zelle die vesikuläre Verteilung vollkommen verliert (Vestal et al., 2000). Um so
erstaunlicher ist daher das Resultat, dass mGBP7 ohne ein solches Isoprenylierungsmotiv in den
Zellen in granulären oder vesikelartigen Strukturen lokalisiert ist. Bei der biochemischen
Untersuchung von hGBP1 konnte in Abhängigkeit von GTP Bindung und Hydrolyse eine
Oligomerisierung dieses Proteins beobachtet werden (Praefcke et al., 2004). Möglich ist daher,
dass mGBP7 mit mGBP1, 2 oder 5 Heteromere bildet und somit über diese Proteine in vesikulären
Strukturen eingebracht wird.
4.1.3.1 Lokalisation von mGBP7 in infizierten Zellen
In früheren Publikationen wurde für mehrere Mitglieder der p47 GTPasen eine Kolokalisation
dieser Proteine mit Pathogenen beschrieben. So zeigen MacMicking und Kollegen, dass Irgm1 mit
mykobakterienhaltigen Phagolysosomen assoziiert und eine antibakterielle Funktion ausübt
(MacMicking, 2005). In weiteren Veröffentlichungen wird für die 47kDa GTPasen Irga6 (IIGP1),
Irgb6 (TGTP), Irgd (IRG47), Irgm2 (GTPI) und Irgm3 (IGTP) eine Akkumulation um die
parasitophore Vakuole von T. gondii beschrieben (Martens et al., 2005; Martens and Howard,
2006). In dieser Arbeit sollte nun geklärt werden, ob mGBP7 mit intrazellulären Pathogenen
assoziiert oder andere subzelluläre Lokalisationsveränderungen von mGBP7 durch Pathogene
hervorgerufen werden.
In RAW Makrophagen, die 30 Minuten mit L. monocytogenes inkubiert wurden, konnte keine
Veränderung der subzellulären Verteilung des mGBP7-DsRed Proteins beobachtet werden. Auch
die Vorstimulation mit IFNJ veränderte die Lokalisation nicht. Es fand hier keine nachweisbare
Interaktion von mGBP7 mit dem Pathogen statt.
Ein anderes Bild ergab sich in der in vitro Toxoplasma-Infektion. In mit mGBP7-DsRed
transfizierten RAW Makrophagen, die zuvor mit IFNJ 16 h stimuliert wurden und dann für zwei
Stunden mit avirulenten Toxoplasmen des Stamms ME49 infiziert wurden, konnte hingegen eine
eindeutige Kolokalisation von mGBP7-DsRed Fusionsprotein mit dem Pathogen beobachtet
werden. Diese Akkumulation war von der IFNJ Vorinkubation abhängig, denn ohne IFNJ
Diskussion
112
Präinkubation, wie auch bei der gleichzeitigen Gabe von IFNJ zum Zeitpunkt der Parasiteninfektion konnte diese Kolokalisation nicht beobachtet werden.
Für T. gondii wurde beschrieben, dass dieser die Wirtszelle aktiv durch Veränderung der
Zellmembran penetriert und nicht aktiv von der Wirtszelle phagozytiert wird (Jones et al., 1972).
Das Eindringen des Parasiten ist verbunden mit der Bildung einer spezialisierten Membran, die
nicht mit Lysosomen verschmilzt und als parasitophore Vakuolenmembran (PVM) bezeichnet
wird (Joiner et al., 1994). Es kann ferner davon ausgegangen werden, dass mGBP7 mit aktiv
eingedrungenen Parasiten und nicht mit phagozytierten Parasiten assoziiert, da weitere Versuche
mit phagozytierten Latexkugeln in stabil transduzierten RAW Makrophagen keine Akkumulation
von GFP-mGBP7-Protein mit dem Phagosom zeigte (unabhängig einer IFNJVorinkubation). Die
in vitro Infektion von stabil transduzierten murinen NIH 3T3 Fibroblasten, welche keine
professionell phagozytierenden Zellen sind, konnte zudem eine Kolokalisation von mGBP7-GFP
Protein mit der parasitophoren Vakuole der Toxoplasmen zeigen. Auch dieser Versuch belegt die
Hypothese, dass aktiv eingedrungene Parasiten mit mGBP7 kolokalisieren.
Martens und Kollegen konnten zeigen, dass Irga6 (IIGP1) und andere p47 GTPasen direkt mit der
PV von T. gondii (ME49) nach IFNJ Stimulation interagieren und möglicherweise die Membran
der PV zersetzen (Martens et al., 2005). Diese Zerstörung konnte fluoreszenz-mikroskopisch und
elektronenmikroskopisch beobachtet werden und wurde in drei Stufen eingeteilt: „smooth“, dabei
ist die PV glatt umrandet mit dem IIGP1-Protein; „rough“: hier zeigt sich die PV als weniger
kompakt und das IIGP1 Protein liegt in breiteren Strukturen um die PV herum. Als dritte Stufe
wurde „disrupted“ beschrieben. Dabei akkumuliert IIGP1 in breiten Strukturen um die PV herum,
zusätzlich wird die PV nicht mehr komplett durch IIGP1 umrandet. Bei der letzten Stufe wird die
PV Membran als zersetzt interpretiert, da sich tatsächlich PV Membranenmaterial in dieser Stufe
vom Parasiten absetzt und den Parasiten nicht mehr einheitlich umschließt. Zersetzte, sog.
„disrupted“ PVs wurden schon nach 2stündiger Infektion beobachtet; ihr Anteil nahm mit
zunehmender Infektionszeit zu. Nach diesen Beobachtungen wurde ein antiparasitärer Effekt für
einige Mitglieder der 47kDa GTPasen, speziell IIGP1, vermutet.
In dieser Arbeit konnten einige der mGBP7 positiven PVs mit der auffälligen Morphologie von
„rough“ bis „disrupted“ vergleichbar gezeigt werden (Abbildung 3.13 oberen zwei Reihen), was
möglicherweise zur Zerstörung der PV Membran durch mGBP7 führt. Daher kann die Hypothese
aufgestellt werden, dass mGBP7 durch direkte Assoziation mit der PV des Parasiten einen antimikrobiellen Effekt auslöst, der das Wachstum des Parasiten inhibiert oder den Parasiten für
weitere zelluläre Effektoren wie z.B. NO oder reaktive Sauerstoffe zugänglich macht. Es wäre
allerdings auch möglich, dass der Effekt von mGBP7 erst durch Interaktionen mit p47 GTPasen
oder/und mit weiteren GBPs zusammen an der PV zustande kommt, die nach IFNJ Stimulus
ebenfalls aktiviert werden.
Diskussion
113
4.1.3.2 Veränderte Lokalisation von mGBP7 G-Domänen-Mutanten
In der Aminosäuresequenz von mGBP7, konnten im Protein drei Bindestellen identifiziert
werden, welche hohe Motivhomologien zu den früher beschriebenen mGBP1-5 GTP-Bindestellen
besitzen (Degrandi et al., 2007). Diese Bindestellen sind verantwortlich für die Hydrolyse von
GTP zu GDP aber, und damit unterscheiden sich die GBPs von allen anderen GTPasen, auch zu
GMP. Modiano und Kollegen konnten bei GTP-Bindestellen Mutanten von humanem GBP1
zeigen, dass die GTP Bindung, aber nicht die Hydrolyse, essentiell zur Assoziation des Proteins
mit dem Golgi Apparat ist (Modiano et al., 2005). Die Auswirkungen der Mutationen auf die
GTPase Aktivität von mGBP7 sind bislang biochemisch noch nicht untersucht worden. Jedoch
lassen sich aufgrund der Tatsache, dass die GTP-Bindedomänen in der Familie der GBPs hoch
konserviert sind, und die funktionellen Regionen bei mGBP7 vorhanden sind, ähnliche
biochemische Eigenschaften postulieren, wie für hGBP1 beschrieben (Praefcke and McMahon,
2004; Praefcke et al., 2004; Degrandi et al., 2007).
In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen von gentechnisch eingebrachten Punktmutationen in
der G-Domäne von mGBP7 untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Mutationen in der
konservierten G1 Domäne (P-loop) sowie der switch I Region (G2) zur völligen Auflösung der
vesikulären Struktur von mGBP7 führten und das Protein ubiquitär in der Zelle vorlag. Im
Gegensatz dazu wurde die subzelluläre Verteilung durch Mutationen in der switch II Region (G2)
und der G4 Domäne nicht verändert und die granuläre Struktur blieb erhalten. Für die
Mutationen in der G1 und switch I Region bei humanem GBP1 wurde beschrieben, dass diese
zum völligen Verlust der kooperativen Hydrolyse durch hGBP1 Dimere sowie zur starken
Herabsetzung der Hydrolyserate (Praefcke et al., 2004). Dies führt zu einer drastischen
Verminderung der GMP Produktion. Der Austausch von Arginin (R48) in der G1 Domäne von
hGBP1 hatte jedoch keine Auswirkung auf die GTP-Bindung. Beim Austausch von Lysin (K51)
bzw. Serin (S52) in der G1 Domäne wurde jedoch eine verminderte GTP-Bindung beschrieben.
Die Mutation von Threonin in der switch I Region führte ebenfalls zu einer verminderten GTP
Hydrolyserate und zur zehnfachen Verringerung der GTP Bindung. Da die vesikuläre Struktur bei
mGBP7 in dieser Arbeit bei allen vier Mutanten (P-loop und switch I) gleichermaßen zerstört
war, liegt die Vermutung nahe, dass die Hydrolyse-Eigenschaft, die bei diesen Mutanten bei
hGBP1 gleichermaßen drastisch verringert war, und nicht die GTP-Bindung, für die vesikuläre
Struktur von mGBP7 verantwortlich ist. Die weiteren Mutationen in der switch II (E99-A) sowie
G4 Domäne (D182-R) führten bei mGBP7 zu keiner Auflösung der vesikulären Struktur. Bei
hGBP1 konnte dabei beobachtet werden, dass die Mutation E99 die Fähigkeit zur kooperativen
Hydrolyse nicht beeinträchtigt und auch bei der Mutation von D184 die Hydrolyserate bestehen
blieb, die Dimer-vermittelte kooperative Hydrolyse allerdings vermindert aber nicht aufgehoben
war (Praefcke et al., 2004). Daraus läßt sich wiederum ableiten, dass die Beibehaltung der
Hydrolyseaktivität für die vesikuläre Struktur von mGBP7 wichtig ist und nicht die GTP Bindung.
Diskussion
114
Wie zuvor beschrieben, konnte nach Infektion von mGBP7 transfizierten RAW Makrophagen mit
T. gondii eine IFNJ abhängige Translokation von mGBP7 zur PV des Parasiten beobachtet
werden. Die Mutationen von mGBP7 in der G-Domäne führten teilweise zu veränderten
subzellulären Lokalisationen der einzelnen Mutanten und sollten weiter auf die Fähigkeit hin
untersucht werden, an der PV von T. gondii zu akkumulieren. Dabei zeigte sich, dass mGBP7
Proteine, die in der G1 Domäne mutiert waren (R48-A und S52-N), nicht mehr in der Lage waren,
zur PV des Parasiten zu gelangen. Die Mutante K51-A hingegen – ebenso in der G1 Domäne –
hatte eine Restfähigkeit zur Akkumulation an der PV behalten, jedoch war diese stark
eingeschränkt und daher in verringerter Häufigkeit als das Wt Protein zu beobachten. Auch die
Mutante in der switch I Region, T75-A, hatte die Fähigkeit zur Assoziation mit der PV fast
vollständig verloren und nur eine Zelle konnte beobachtet werden, bei der eine partielle
Kolokalisation mit der PV von T. gondii detektiert werden konnte. Bei der Mutante E99-A in der
switch II Region konnte die Assoziation mit der PV weiter beobachtet werden, obgleich auch hier
die Häufigkeit gegenüber dem Wt Protein herabgesetzt war. Die Mutante D182-R in der G4
Domäne verlor nachhaltig jede Assoziationsfähigkeit, obwohl hier die vesikuläre Struktur des
Proteins weiterhin zu beobachten war. Demnach ist die Fähigkeit zur Assoziation mit der PV
nicht allein mit der vesikulären Struktur des Proteins bzw. mit dem Erhalt der Hydrolyserate zu
erklären, da diese weiterhin bei der D182 Mutante im hGBP1 erhalten ist (Praefcke et al., 2004).
Bei dem Prozess der Akkumulation von mGBP7 an der PV scheinen demnach GTP-Bindung und
Hydrolysefähigkeit sowie Potenzierung der Hydrolyserate durch kooperative Hydrolyse an
Protein-Dimeren eine große Rolle zu spielen. Ist dieser Prozess durch das Einfügen von
Mutationen in das mGBP7-Protein gestört, führt dies zur starken Herabsetzung des beim Wt
mGBP7-Protein beobachteten Phänotyps der Assoziation mir der PV von T. gondii. Es ist
außerdem denkbar, dass durch die verminderte Fähigkeit zur Oligomerisierung der Mutante D182
auch die mögliche Fähigkeit der Heteromerbildung mit anderen GTPasen verhindert und daher
die Rekrutierung zur PV des Parasiten unterbunden wird. Diese Hypothese soll in weiteren
Untersuchungen analysiert werden, bei denen Wt und Mutanten von mGBP7 auf ihre Fähigkeit
der Interaktion untereinander und mit anderen mGBPs hin untersucht werden.
Diskussion
115
4.2 SSPII in der Infektabwehr
4.2.1 SSPII:
Identifizierung
und
Charakterisierung
als
potentiell
sekretorisches Protein
Bei der Transkriptomanalyse mittels Microarray von IFNJ und TNF stimulierten Ana-1
Makrophagen wurde das Transkript AW112010 (SSPII) als induziertes Gen identifiziert. Da über
dieses Gen zunächst wenig bekannt war, wurde das Transkript genauer charakterisiert. Mit Hilfe
eines Northernblots konnte zunächst gezeigt werden, dass die mRNS von SSPII größer ist, als in
der NCBI Datenbank hinterlegt. Die genaue Größe wurde dann mittels SMART RACE PCR (BD
Clontech) identifiziert und konnte, statt 536 nt, wie in NCBI unter AW112010 angegeben, als 730
nt lange Sequenz unter dem Namen SSPII in der NCBI Datenbank hinterlegt werden. Am 3´Ende
der SSPII Sequenz konnte so zusätzlich ein Poly(A)-Signal (AATAAA) identifiziert werden,
welches
für
die
Polyadenylierung
der
naszierenden
mRNS
verantwortlich
ist.
Die
Polyadenylierung ist ein wichtiger Schritt für alle mRNS-Spezies in eukaryotischen Zellen mit
Ausnahme von einigen Histon-Transkripten (Edmonds, 2002), wirkt stabilisierend und ist
zusätzlich wichtig für die Translation sowie den Transport der mRNS (Zhao et al., 1999; Mangus
et al., 2003). Somit lässt sich hier ableiten, dass es sich bei der in dieser Arbeit ermittelten SSPII
Sequenz um die vollständige mRNS handelt. Bei der Untersuchung des offenen Leserahmens mit
einer Sequenzlänge von 237 nt konnte außerdem festgestellt werden, dass SSPII für ein kleines
Protein kodiert, mit umgerechnet 78 Aminosäuren. Dieses Protein beinhaltet eine N-terminale
Signalsequenz, welche bei anderen Proteinen für die Translation am rauhen ER, Abtrennung des
Signalpeptides und Weiterleitung über den Golgi-Apparat verantwortlich ist. Dies konnte z.B. für
Defensine als wichtige sekretorische Proteine der Immunabwehr gezeigt werden (Ganz et al.,
1985; Daher et al., 1988). Daher ist auch bei SSPII anzunehmen, dass dieses am rauhen ER
translatiert wird. Im Folgenden konnte mit Hilfe weiterer Vorhersageprogramme bestimmt
werden, dass SSPII keine weiteren bekannten ER- oder Golgi-Rückhaltesignale beinhaltet und
daher ein Protein des sekretorischen Weges ist. Die Sekretion von SSPII wurde außerdem mittels
eines SSPII-6xHis Fusionsproteins gezeigt. Dieses war nach Überexpression transient transfizierter
293T Zellen in den Überstand der Zellkultur sezerniert worden (Abbildung. 3.34).
Weitere Vorhersageprogramme wie z.B. PROSITE, bei der die Aminosäuresequenz von SSPII mit
bekannten Domänenstrukturen und Proteinfamilien verglichen wurden, führten zu keinem
positiven Ergebnis, so dass davon ausgegangen werden muss, dass SSPII keine prominente
Domäne aufweist. Für die Defensine, als antimikrobielle Proteine, ist bekannt, dass auch sie keine
bestimmten Domänen beinhalten, außer der N-terminalen Signalsequenz, aber durch
intramolekulare Disulfidbrücken über 6 bis 8 Cysteinen innerhalb des Proteins charakterisiert
sind (Ganz, 2003; Bulet et al., 2004). Auch die kleinen sezernierten Proteine der ChemokinFamilien CXC und CC, die bei der Rekrutierung von Lymphozyten eine große Rolle spielen,
Diskussion
116
weisen charakteristische Cysteine auf, über welche sie klassifiziert werden (Stein and NombelaArrieta, 2005). Weitere antimikrobielle Peptide bestehen aus einem hohen Anteil an ein oder
zwei bestimmten Aminosäuren, wie Prolin, Arginin, Tryptophan, Histidin oder Glyzin, so z.B. das
anti-mikrobielle Peptid Acanthoscurin der Spinne Acanthoscurria gomesiana, bei der 73 % der 92
Aminosäuren aus Glyzin aufgebaut sind (Bulet et al., 1999). Solche Charakteristika konnten bisher
für SSPII anhand der Aminosäuresequenz nicht festgestellt werden, was die Einordnung dieses
Proteins in eine bestimmte Proteinklasse momentan nicht zuläßt.
4.2.2 Subzelluläre Lokalisation von SSPII
Wichtige Erkenntnisse über die Funktion von Proteinen können über die Identifizierung der
subzellulären Lokalisation gewonnen werden. Transkriptionsfaktoren finden sich beispielsweise
im Kern der Zelle wieder, oder werden nach Aktivierung durch aktiven Transport dahin
importiert. Dabei beinhalten zelluläre Antworten die Translokation von Proteinen innerhalb der
Zelle, was für weitere molekulare Regulationsmöglichkeiten biologischer Prozesse sorgt
(Schwoebel and Moore, 2000; Smith and Koopman, 2004). Die subzelluläre Lokalisation von SSPII
Fusionsproteinen sollte daher weiteren Aufschluß über die zelluläre Funktion dieses Proteins
geben. Die Untersuchung verschiedener SSPII Fusionskonstrukte führte zum Ergebnis, dass
einerseits das Maskieren der N-terminalen Signalsequenz durch das DsRed-Protein (DsRed-SSPII)
zu einer ubiquitären Verteilung des SSPII-Proteins führt, während es andererseits bei dem
Fusionsprotein, bei dem DsRed am C-Terminus von SSPII kloniert wurde, zu einer netzartigen
Verteilung des SSPII-DsRed Fusionsproteins kommt, welches um den Zellkern herum verteilt im
Zytoplasma vorliegt. Außerdem wurde bei der Untersuchung der Kolokalisation des SSPIIFusionsproteins mit Proteinen spezifischer Organellen festgestellt, dass das SSPII-Protein vor
allem mit dem ER und dem Golgi-Apparat kolokalisiert, während Assoziationen mit
Mitochondrien, Membranen oder Endosomen marginal blieben. Diese Ergebnisse belegen die
Vorhersage des N-terminalen Signalpeptides des SSPII-Proteins experimentell und zeigen die
Assoziation von SSPII mit dem ER und dem Golgi-Apparat.
Intrazelluläre Abwehrmechanismen benötigen den Kontakt mit Pathogen, um ihre Funktion
auszuüben (Miller et al., 2004). Aus der Sicht des Pathogens wurde für den intrazellulär
replizierenden Parasiten T. gondii gezeigt, dass dieser extensive Assoziationen mit Mitochondrien
und dem ER der Wirtszelle eingeht, wobei noch spekuliert wird, ob dies der Aufnahme von
metabolisch wichtigen Nährstoffen und Proteinen dient (Jones et al., 1972; Sinai et al., 1997).
Daher wurde die subzelluläre Lokalisation von SSPII-GFP in T. gondii infizierten Makrophagen
nach Stimulation mit IFNJ untersucht. Bei diesem Experiment konnte jedoch keine direkte
Kolokalisation von SSPII-GFP mit T. gondii beobachtet werden und es scheint daher
unwahrscheinlich, dass intrazelluläre Interaktionen von SSPII mit dem Pathogen bestehen und
SSPII eine potentielle antimikrobielle Funktion direkt am oder im ER ausübt.
Diskussion
117
4.2.3 SSPII Expression in vitro
Bei der Microarray Transkriptomanalyse wurde das Genprodukt SSPII in Ana-1 Zellen als etwa
11-fach synergistisch durch IFNJ und TNF induziert gefunden, wohingegen IFNJ alleine zur
Transkriptionssteigerung um den Faktor 6 führte. In dieser Arbeit wurden zur Validierung dieses
Ergebnisses Ana-1 Makrophagen stimuliert und die mRNS im Northernblot analysiert. Hierbei
bestätigte sich der ursprüngliche Befund. Dabei konnte ein Synergismus von IFNJ mit TNF auf die
SSPII Expression ermittelt und eine geringere Induktion durch IFNJ alleine beobachtet werden. In
diesen Makrophagen konnte keine Transkription des SSPII Gens durch TNF, LPS oder LTA
Stimulus ermittelt werden. Eine Kinetik Analyse mittels Real-time RT-PCR von IFNJ stimulierten
Ana-1 Makrophagen machte deutlich, dass mit zunehmender Zeit die Induktion von SSPII durch
IFNJ Stimulation deutlich zunahm. Dies würde darauf hinweisen, dass SSPII ein sekundär
responsives Gen ist und die Produktion eines weiteren Faktors, induziert durch IFNJ, die
Expression von SSPII verstärkt. Beispielsweise ist beschrieben, dass die Expression des
Transkriptionsfaktors IRF-1 durch synergistische Wirkung von IFNJ und TNF verstärkt wird
(Ohmori et al., 1997). Möglicherweise könnte dieser Transkriptionsfaktor für die Expressionsverstärkung der Kombination von IFNJ und TNF verantwortlich sein, aber auch für die verzögerte
Expression von SSPII nach IFNJ Stimulus. Hierbei muss postuliert werden, dass im
Promotorbereich des SSPII Gens ein IRF-1 bzw. ISRE Bindemotiv vorhanden ist. Bei der
Überprüfung der möglichen Promotorregion vor dem SSPII Lokus konnte allerdings kein IRF-1,
jedoch 109-119 nt 5´von Exon 1 ein NF-NB Bindemotiv festgestellt werden. Erst ca. 80 nt 5´vor
dem Start-Kodon, allerdings schon im 5`UTR-Bereich des Exon 1 des SSPII Lokus, befindet sich
eine vorhergesagte ISRE Bindestelle. Für das Tumorsuppressor-Gen p53 ist bekannt, dass dieses
ein ISRE Bindemotiv im Exon 1 sowie in der anschließenden Intronsequenz besitzt, welches für
die IFND/E Responsivität in der antiviralen Abwehr verantwortlich ist (Takaoka et al., 2003).
Somit ist es auch für das Genprodukt SSPII denkbar, dass das ISRE Element im Exon 1 vor dem
Start-Kodon funktionell ist.
Die Untersuchung der SSPII Expression in Knochenmarksmakrophagen aus C57BL/6 Mäusen
zeigten starke Induktionen durch IFNJ aber auch TNF, IFNE und den TLR-Liganden LPS (TLR4)
und poly (I:C) (TLR3), wohingegen keine synergistische Steigerung der Induktion durch
IFNJ/TNF in diesen BMDM stattfand. In diesen Makrophagen bestätigt sich die Funktionalität des
NF-NB Bindemotives, welches durch TNF über TRAF 2 zur Aktivierung von NF-NB führt.
Allerdings können auch TLR4 über den MyD88 abhängigen Signalweg sowie TLR3 über den
MyD88 unabhängigen Signalweg zur Aktivierung des Transkritptionsfaktors NF-kB führen
(Hehlgans and Mannel, 2002; Hehlgans and Pfeffer, 2005; O'neill, 2006) und somit vermutlich zur
Induktion der SSPII Expression führen. Die Induktion von SSPII durch IFNJ findet, ohne
entsprechende GAS Bindesequenz im SSPII Promotorbereich, möglicherweise über die
Aktivierung des STAT1-IRF9-Komplexes und die Bindung an das ISRE Element in Exon 1 statt,
Diskussion
118
auch die IFNE Induktion führt sehr wahrscheinlich über einen STAT1-STAT2-IRF9-Komplex
(ISGF3) und dessen Bindung an ISRE zur SSPII Induktion. Diese Ergebnisse weisen auf die
Funktionalität der ISRE Bindestelle im Exon 1, sowie auf das Vorhandensein des NF-kB
Bindemotivs im 5`Bereich von Exon 1 des SSPII Lokus hin. In Makrophagen generiert aus dem
Knochenmark von IFNJR ko Mäusen wurde ebenfalls eine Expressionssteigerung von SSPII durch
TNF, IFNE sowie LPS und poly (I:C) detektiert. Hierfür gelten die oben genannten Signalwege
entsprechend und verdeutlichen, dass SSPII nicht nur über IFNJ, sondern auch über Typ I
Interferon sowie TNF aber auch über PAMP Rezeptoren, TLR3 und 4, induziert wird. Diese
Resultate sprechen deutlich für eine direkte Teilnahme von SSPII an der frühen Abwehr gegen
verschiedene Pathogene.
4.2.4 SSPII in der Infektionsabwehr
Um die Expression von SSPII in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse mit L. monocytogenes, T.
gondii (Stamm ME49) sowie T. cruzi (Stamm Tulahuen) infiziert, welche als Modellorgansimen
für intrazellulär replizierende Bakterien und Parasiten verwendet wurden. Nach i.p. Infektion in
der Maus akkumulieren Listerien zunächst in den Organen Leber und Milz, in denen sie
intrazellulär replizieren (Hof et al., 1997). Noch bevor eine adaptive Immunantwort eingeleitet
werden kann, wird in diesen Organen die Ausbreitung der Infektion primär durch Granulozyten
eingedämmt, die an die infektiösen Foci rekrutiert werden (Conlan, 1999). Conlan und North
konnten belegen, dass den Neutophilen in der Milz eine geringere Bedeutung zukommt als in der
Leber (Conlan and North, 1994). In der Milz findet nach zwei Tagen eine verstärkte
Einwanderung von Makrophagen statt, die an der Begrenzung der Infektion und zu einer
Aktivierung einer adaptiven Immunantwort gegen Listerien beitragen (Mandel and Cheers, 1980;
Portnoy, 1992; Endres et al., 1997). In der Milz der infizierten Tiere konnte nach 48 h eine
deutliche Hochregulation von SSPII Transkripten wie auch von SSPII-Protein beobachtet werden,
dies möglicherweise aufgrund der Einwanderung von aktivierten Makrophagen in das infizierte
Gewebe. In der Leber der Tiere konnte schon eine basale Expression von SSPII detektiert werden,
allerdings stieg auch hier die Expression der SSPII Transkripte und auch des SSPII-Proteins im
Verlauf der Infektion weiter an. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass SSPII an der
Infektionssabwehr beteiligt sein könnte. Mit Hilfe der Real-time RT-PCR konnte weiter auch ein
Anstieg der SSPII Transkriptmengen im Thymus, in der Niere und in der Lunge detektiert
werden, wohingegen allerdings kein SSPII-Protein in diesen Organen detektiert werden konnte.
Es kam aber nicht zu einer verstärkten iNOS Transkription in diesen Organen im Gegensatz zu
Leber und Milz, so dass hier eine erhöhte Infektionslast, die zur Akkumulation von aktivierten
Makrophagen führt, eher ausgeschlossen werden kann. Eine Erklärung für das Fehlen des SSPIIProteins könnte sein, dass das gering exprimierte Protein unter der im Westernblot möglichen
Nachweisgrenze liegt. Unklar bleibt jedoch weiter die Interpretation dieses Ergebnisses, während
in den Organen Niere und Lunge bei einer sublethalen Infektion mit Listerien Einwanderungen
Diskussion
119
der Bakterien möglich sind, sind Listerien im Thymus als primäres lymphatisches Organ, nicht
beschrieben. Möglicherweise ist der Anstieg der SSPII Transkripte daher auf einwandernde
Makrophagen oder dendritische Zellen zurückzuführen. Auch ist eine Expression in den reifenden
T-Zellen möglich, darüber kann hier aber nur spekuliert werden und diese Fragestellung müsste
in Folgeexperimenten weiter untersucht werden. Dabei ist es auf der einen Seite denkbar die
Expressionsfähigkeit von SSPII in noch nicht reifen thymusständigen T-Zellen zu untersuchen
und andererseits, bei infizierten Tieren mittels Zellsortierung nach den Zellpopulationen zu
suchen, die neben T-Zellen im Thymus zusätzlich für die SSPII Expression verantwortlich sein
könnten. Grundsätzlich können T-Zellen SSPII in geringem Maße exprimieren, wie in der Realtime PCR Abb.6.1 (im Anhang) gezeigt. Diese T-Zellen wurden aus der Milz mit anti-CD90Antikörper gekoppelten magnetischen Partikeln heraussortiert und anschließend mit anti-CD3und anti-CD28-Antikörpern für 2 Tage stimuliert; dabei stieg die SSPII Transkriptmenge auf das
4,5 fache im Vergleich zu unstimulierten T-Zellen an.
In den Infektionsexperimenten mit den intrazellulären Parasiten T. gondii und T. cruzi konnten
ebenfalls Anstiege der SSPII Transkription in der akuten Phase der jeweiligen Infektion gemessen
werden. Alle drei Modellinfektionen (einschließlich L. monocytogenes) induzieren in Mäusen
eine überwiegend proinflammatorische Immunantwort (T H 1), in der die SSPII Produktion eine
noch nicht genau bestimmbare Rolle spielt. Bei der Transkriptomanalyse von suszeptiblen und
resistenten Mauslinien nach M. tuberculosis Infektion wurde SSPII ebenfalls als induziertes Gen
in der Lunge in allen Mäusen detektiert, so dass auch in diesem Infektionsmodell die SSPII
Produktion bei der Abwehr gegen ein weiteres Pathogen den Verlauf der Krankheit
mitbestimmen könnte. Jedoch wurden keine Unterschiede in der Höhe der Expression in
Abhängigkeit des Mausstammes vorgefunden (Keller et al., 2006). Aus HBV transgenen Mäusen
generierte Hepatozyten induzieren nach IFNJ sowie nach IFNE Stimulation eine Gruppe von
Genen, zu denen auch SSPII gehört. Es wird dabei postuliert, dass diese Gene an der
Verhinderung der Replikation des Hepatitis B Virus direkt beteiligt sind (Wieland et al., 2003). Da
SSPII in der Leber schon konstitutiv exprimiert wird, aber auch nach den diversen o.g.
Infektionen durch Interferone zusätzlich induziert wird, kann diesem Protein eine besondere
Rolle in der Abwehr nahe gelegt werden und es ist daher zukünftig notwendig die biologische
Funktion von SSPII weiter zu untersuchen. Hinzu kommt, dass es sich bei SSPII um ein
sekretorisches Protein handelt. Es ergibt sich daher die dringende Frage, ob sezerniertes SSPII
antimikrobielle Effekte auslöst, oder ob es sich dabei um ein chemotaktisches Protein,
vergleichbar mit den Chemokinen oder auch Zytokinen handelt. Dabei muss festgestellt werden,
auf welche Zellen das Protein wirkt, an welchen Rezeptor SSPII bindet und welche
Zellpopulationen einen SSPII Rezeptor exprimieren. Um diese Fragen zu beantworten, muss das
Protein in ausreichender Menge synthetisiert werden und Effekte auf verschiedene Pathogene
bzw. Mauszellen müssen untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, aus SSPII
überexprimierenden Zellen, wie 293T, 3T3 oder COS7, SSPII-6xHis aufzureinigen. Diese
Diskussion
120
Versuche blieben jedoch erfolglos, da sich das Protein leider nicht in genügender Menge
anreichern ließ. Eine methodische Verbesserung könnte die Expression des Proteins im
bakteriellen System sein, wobei die Proteinfaltung und auch mögliche posttranslationale
Veränderungen im bakteriellen System nicht denen der mammalischen Zellen entsprechen. Ein
weiterer interessanter Punkt wäre die Charakterisierung der Expression von SSPII in
Infektionsmodellen, die überwiegend die T H 2-Antwort des Immunsystems auslöst, die vor allem
dominiert wird von Zytokinen wie IL-4, IL-10 und TGFE. Dieser Frage könnte z.B. durch das
Infektionsmodell mit Eiern der parasitären Würmer Schistosoma mansoni beantwortet werden
(Janeway, Jr. et al., 2005).
Ein weiterer wichtiger experimenteller Ansatz wäre die Etablierung einer SSPII defizienten
Mauslinie. Die Phänotypisierung von SSPII defizienten Tieren in Infektionsmodellen könnte
dabei ein wichtiger Schritt bei der Charakterisierung dieses Proteins sein. Möglicherweise hat das
Fehlen der basalen Expression von SSPII in der Leber schon Auswirkungen auf die Vitalität der
Tiere, wahrscheinlicher jedoch ist, dass das Fehlen von SSPII erst in der Infektion mit den o.g.
Pathogenen seine Auswirkung zeigt.
Diskussion
121
4.3 Ausblick
Um die Funktion der in dieser Arbeit charakterisierten „neuen“ GTPase mGBP7 weiter zu klären,
sollte zunächst die Generierung einer mGBP7 defizienten Mauslinie forciert werden. Dabei
werden sich die infektiologischen Untersuchungen der mGBP7 defizienten Mauslinie im
besonderen Maße auf die Rolle von mGBP7 bei der T. gondii Abwehr konzentrieren. Hier konnte
bereits durch konfokalmikroskopische Untersuchungen ein direkter Effekt auf die PV des
Parasiten in vitro beobachtet werden. Zusätzlich sollen auch andere Infektionsmodelle, wie L.
monocytogenes aber auch virale Infektionen in dieser Mauslinie Aufschluss über die Rolle von
mGBP7 in der Infektabwehr geben. mGBP7 defiziente Zelllinien können außerdem in einem sog.
Toxoplasma-kill-assay auf die Fähigkeit der Eindämmung der parasitären Replikation hin
untersucht werden. Außerdem könnte in diesen Zelllinien durch elektronenmikroskopische aber
auch konfokalmikroskopische Untersuchungen geklärt werden, ob mGBP7 direkt an der
Zersetzung der PV des Parasiten beteiligt ist.
Des Weiteren soll durch Interaktionsstudien – zum einen mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System,
zum anderen über gezielte Immunpräzipitation – das mögliche Zusammenspiel von mGBP7 mit
weiteren an der PV von T. gondii beobachteten mGBPs sowie den p47 GTPasen, eingehender
analysiert werden.
Die translationale Regulation von mGBP7 sollte näher charakterisiert werden. Hier scheint durch
das Zytokin TNF, trotz simultaner IFNJ Stimulation, die Expression des Proteins mGBP7 inhibiert
zu werden. Dieser Mechanismus ist bisher nicht beschrieben. MicroRNS könnte die mRNS von
mGBP7 zerstören. Die Halbwertszeit der mGBP7 mRNS kann dabei Aufschluss darüber geben, ob
die Translation auf dieser Ebene unterbrochen wird. Die Regulation der einzelnen mGBPs
unterliegt nicht denselben Mechanismen, wie die IRF-1 unabhängige Expression von mGBP7
bzw. die IRF-1 abhängige mGBP2 Expression gezeigt hat. Daher sollten für die gesamte Familie
der murinen GBPs mittels Real-time PCR und Westernblot-Analyse weiter die expressionellen
Unterschiede näher untersucht werden, um die unterschiedlichen Regulationen der einzelnen
GBPs näher zu charakterisieren.
Die Bedeutung von SSPII in der Immunabwehr gegen mikrobielle Pathogene sollte ebenfalls
durch die Generierung einer SSPII defizienten Mauslinie charakterisiert werden. Durch geeignete
Verpaarungen der SSPII chimären Tiere sollte in Kürze die Keimbahntransmission und
Etablierung der sspii-/- Mauslinie bewerkstelligt werden.
Ein wichtiger experimenteller Ansatz wäre außerdem die Messung der Effekte des sezernierten
SSPII-Proteins auf verschiedene Zellpopulationen, da SSPII möglicherweise bei der Chemotaxis
und/ oder Aktivierung/ Reifung anderer Zellpopulationen eine Rolle spielen könnte. Über ein
Fusionskonstrukt mit Fc-Protein und SSPII soll außerdem ein möglicher Rezeptor gefunden
werden, an das das sezernierte SSPII bindet. Des Weiteren ist ein direkter Effekt auf verschiedene
Diskussion
122
Pathogene denkbar und sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Dafür wäre die
Aufreinigung von hohen Mengen des SSPII-Proteins erforderlich. Ein monoklonaler Antikörper
gegen das SSPII-Protein könnte außerdem in Wt-Mäusen eine Rolle des SSPII-Proteins belegen,
wenn diese Infektionen ausgesetzt werden. Diese Strategie könnte – so lange die defiziente
Mauslinie noch nicht etabliert ist – Hinweise auf die biologische Funktion von SSPII geben.
Zusammenfassung
123
5 Zusammenfassung
Die Zytokine IFNJ und TNF induzieren eine starke antimikrobielle Immunantwort gegen
verschiedene Pathogene. Neben bekannten antimikrobiellen Effektorsystemen (z.B. RNI, ROI)
zeichnet sich eine Klasse von Proteinen als hochgradig IFNJ induzierbar aus: die murinen 65 kDa
Guanylat-bindenden Proteine (mGBPs) 1-10.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Etablierung der Real-time PCR für die zehn
Familienmitglieder der mGBPs ein umfangreiches Expressionsprofil erstellt werden. Dadurch
konnte die IFNJ abhängige Expression in Ana-1 Makrophagen von mGBP1 bis mGBP5 belegt
werden. Es stellte sich dabei zusätzlich heraus, dass die hoch homologen „neuen“ Mitglieder
mGBP6, 7, 8, 9 und 10 auch zu den IFNJ induzierten GTPasen zu zählen sind. Die Expression der
gesamten Genfamilie zeigte sich auch in der in vivo Infektion mit Listeria monocytogenes als stark
induzierbar nach der Infektion.
Im Verlauf der Arbeit konnte mGBP7 eingehender charakterisiert werden. Es konnte gezeigt
werden, dass mGBP7-Protein nach der in vivo Infektion mit L. monocytogenes in der Leber und
der Milz sowie nach der Infektion mit dem intrazellulären Parasiten Toxoplasma gondii in der
Leber und der Lunge induziert wird. Die transkriptionelle Expression von mGBP7 wurde in Ana-1
Makrophagen durch IFNJ und IFNJ/TNF induziert, während in Knochenmarksmakrophagen auch
IFNE sowie die TLR-Agonisten LPS und poly (I:C) die mGBP7 mRNS Synthese induzierten. Die
Expression von mGBP7 geschieht in Makrophagen dabei generell IRF-1 unabhängig, sodass hier
das beschriebene ISRE Element nicht funktionell ist, im Gegensatz zur klassischen IRF-1
abhängigen mGBP2 Transkription. Zusätzlich zeigte sich in diesen Zellen ein weiterer
interessanter Regulationsmechanismus durch TNF: trotz Kostimulation mit IFNJ wird kein
mGBP7-Protein in Makrophagen bei gleichzeitiger TNF Stimulation produziert. TNF scheint über
noch nicht beschriebene Mechanismen die Proteinsynthese von mGBP7 zu inhibieren. Ein
weiterer Unterschied der Regulation von mGBP7 im Vergleich zu mGBP2 ist das Fehlen des
mGBP7-Proteins in embryonalen Fibroblasten nach IFNJ Stimulation.
Die Überexpression von mGBP7-eGFP bzw. -DsRed -Fusionsproteinen in RAW Makrophagen
oder Fibroblasten zeigten, dass mGBP7 granulär bzw. in vesikelartigen Strukturen in der Zelle
vorliegt. Nach Infektion mit dem avirulenten T. gondii Stamm ME 49 in IFNJ stimulierten
Makrophagen und Fibroblasten konnte eine Translokation der vesikulären mGBP7-Proteine zur
parasitophoren Vakuole des Parasiten beobachtet werden. Gezielt eingebrachte Mutationen in der
G-Domäne von mGBP7 hatten unterschiedliche Auswirkungen auf die Distribution des Proteins
innerhalb der Zelle. So kam es zu einem völligen Verlust der vesikulären Struktur bei gezielten
Punktmutationen in den G1 (G(X) 4 GKS/T) und G2 (T) GTP-Bindemotiven, während bei
Mutationen in den G3 (DXXG) und G4 (RD) Motiven die vesikuläre Verteilung von mGBP7
erhalten blieb. Auch wurde durch alle diese Mutationen die Fähigkeit von mGBP7 weitgehend
Zusammenfassung
124
inhibiert mit der PV von T. gondii zu kolokalisieren. Vorarbeiten zur Erstellung einer mGBP7
defizienten ES-Zelllinie sollen zur Generierung einer mGBP7 defizienten Mauslinie führen und
die biologische Funktion von mGBP7 in der Infektionsabwehr zukünftig klären helfen.
Ein weiteres Gen, welches durch IFNJ und TNF Stimulation in murinen Makrophagen
differenziell exprimiert wird, ist SSPII. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde dieses noch
unbekannte Gen näher charakterisiert. Mittels RACE PCR konnte die Gesamtlänge des Gens auf
730 nt bestimmt werden. Die 237 nt lange kodierende Sequenz ergibt ein kationisches Protein in
der Größe von 78 AS und einem Molekulargewicht von 8,7 kDa. Während SSPII keine bekannten
Domänenstrukturen aufweist, kodieren die ersten 24 AS jedoch für ein N-terminales Signalpeptid.
Dieses Signalpeptid ist für die im Westernblot nachgewiesene Sekretion des Proteins aus der Zelle
verantwortlich. Lokalisationsexperimente bei denen SSPII mit DsRed oder GFP am C-Terminus
von SSPII fusioniert vorlag, zeigten eine subzelluläre Lokalisation von SSPII mit dem GolgiApparat und dem Endoplasmatischem Retikulum innerhalb der Zelle Dagegen kam es nach
Maskierung der N-terminalen Signalsequenz durch DsRed am N-Terminus von SSPII zur
Fehllokalisation und diffusen Verteilung des Proteins in der gesamten Zelle kam. Somit konnte
gezeigt werden, dass SSPII ein sezerniertes Protein ist.
Expressionsversuche zeigten darüber hinaus, dass in Knochenmarksmakrophagen nach
Stimulation mit den Zytokinen IFNJ, IFNJ/TNF, TNF, IFNE aber auch durch die TLR-Agonisten
LPS und poly (I:C) die Expression von SSPII induziert wird. Des Weiteren konnte die Induktion
der mRNS Expression auch in den in vivo Infektionen bei C57BL/6 Mäusen mit den Pathogenen L.
monocytogenes, T. gondii und Trypanosoma cruzi detektiert werden. Dabei konnte auch das Wt
Protein im Westernblot nach L. monocytogenes Infektion detektiert werden, womit SSPII als ein
funktioneller Genlokus definiert werden kann. Um die Rolle von SSPII in der Infektabwehr
weiter zu definieren, wurde eine ES-Zelllinie etabliert, welche ein nicht funktionelles SSPII Allel
besitzt. Die Generierung einer SSPII defizienten Mauslinie kann in künftigen Arbeiten für die
weitere Charakterisierung der biologischen Funktion von SSPII verwendet werden.
Zusammenfassung
125
Summary
The cytokines IFNJ and TNF induce a potent immune respons against various pathogens,
including well described anti-microbial effector mechanisms such as RNI and ROI. In addition to
this a group of murine proteins with marked IFNJ inducibility has become recognised, the
guanylate-binding proteins (mGBP) 1 to 10.
In this dissertation a comprehensive expression profile of the 10 members of this class of proteins
was established using real-time PCR. Using this tool the IFNJ dependent expression profile of
mGBP1 to mGBP5 in Ana-1 macrophages could be elucidated. Furthermore it was demonstrated
that the highly homologous “newer” members, mGBP6-10, were also IFNJ induced and that the
expression of the whole family is induced by in vivo infection with Listeria monocytogenes.
In the course of this project it was found that, after infection with L. monocytogenes, the protein
mGBP7 was expressed in the liver and spleen and also that, after infection with the intracellular
protozoan parasite Toxoplasma gondii, expression in the liver and lung was induced. The
transcriptional expression of mGBP7 in Ana-1 macrophages was induced by IFNJ whereas in bone
marrow macrophages IFNE and the TLR agonists LPS and poly (I:C) also induced a marked
mGBP7 expression. The expression of mGBP7 was, generally speaking, independent of IRF-1 and
thus the ISRE element is, in contrast to the classical IRF-1-dependant mGBP2 transcription, nonfunctional. These cells demonstrated a further interesting regulatory mechanism in that despite
co-stimulation with IFNJ TNF stimulation induced no expression of mGBP7 protein. TNF appears
to inhibit the protein mGBP7 synthesis by an unknown mechanism. A further difference in the
regulation of mGBP7 compared to mGBP2 is that in contrast to the latter no mGBP7 is detectable
in embryonal fibroblasts after IFNJ stimulation.
Overexpression of mGBP7-eGFP or mGBP7-DsRed fusion proteins in RAW macrophages or
fibroblasts showed that mGBP7 is to be found in granular or vesicular structures in the cytoplasm.
Infection of IFNJ stimulated macrophages and fibroblasts with the avirulent T. gondii strain, ME
49, resulted in a translocation of the vesicular mGBP7 protein to the T. gondii parasitophorous
vacuole (PV). Targeted mutations in the G-domain of mGBP7 had various effects on the
distribution of the protein in the cytoplasm. A point mutation in the G1 (G(X) 4 GKS/T) and G2 (T)
GTP-binding motif resulted in the complete loss of the vesicular distribution whereas the point
mutation in the G3 (DXXG) and G4 (RD) motifs had no such effect. All these mutations inhibited
the co-localisation of mGBP7 with the PV. Work towards the establishing of a mGBP7 deficient
ES-cell line in order to generate a mGBP7 knock out mouse is underway. This should help to
better describe the function of mGBP7 in the immune response to infection.
Zusammenfassung
126
A further gene differentially expressed in macrophages after stimulation with IFNJ and TNF is
SSPII. The gene for this protein was characterized in the second part of this thesis. Using RACEPCR the full length of this gene was determined to be 730 nt. The 237 nt coding sequence
produces a cationic protein of size 78 AA with molecular mass of 8,7 kDa. Whereas SSPII does not
demonstrate a known domain structure, the first 24 AA represent an N-terminal signal peptide.
This signal peptide could be shown by western blot to be responsible for the translocation of the
protein out of the cell. Using SSPII labeled with DsRed or GFP at the C-terminal end it was shown
that the protein is to be found in the Golgi apparatus and endoplasmatic reticulum, whereas
masking the N-terminal signal peptide lead to a diffuse cytoplasmic distribution throughout the
cell. Thus it is concluded that SSPII is a secreted protein.
Expression of SSPII was induced by stimulation of bone marrow macrophages with the cytokines
IFNJ, IFNJ/TNF, TNF, IFNE and also the TLR agonists LPS and poly (I:C). Moreover the in vivo
infection of C57BL/6 mice with the organisms L. monocytogenes, T. gondii and Trypanosoma
cruzi induced the mRNA expression of SSPII. In this infection model the wildtype protein was
detected by western blot after infection with L. monocytogenes thus confirming SSPII as a
functional gene locus. To investigate the role of SSPII in infection an ES cell line with a non
functional SSPII allele was created. This may be used to create a SSPII deficient mouse line, which
will be decisive in the future investigation of the biological function of SSPII.
Anhang
127
6 Anhang
b)
a)
1.5
ratio = 2-'' CP
1.0
0.5
c)
1.0
0.5
2h
48
h
24
h
8h
0.0
2h
0.0
a-IgM
a-IgM+IL4
a-IgM+CD40
12
h
ratio = 2-'' CP
1.5
d)
5
30
ratio = 2-'' CP
ratio = 2 -'' CP
4
3
2
20
10
1
S
IF
N
J+
LP
J
IF
N
h
48
h
24
LP
S
0
0
Abb. 6.1: Expression von SSPII in lymphatischen Zellen und Mikroglia. a) B220 positive Milzzellen (B-Zellen) wurden
mit IgM 2 bis 48h stimuliert. b) CD90 negative Milz und Lymphknotenzellen wurden mit unterschiedlichen
Stimulationen behandelt. c) SSPII in T-Zellen. CD90 positive Zellen wurden aus vereinigten Milz- und
Lymphknotenhomogenat heraussortiert und mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern (T-Zellstimulus) 24 und 48h lang
behandelt. d) Aus dem Gehirn von neugeborenen Mäusen generierte Mikroglia-Zellen wurden mit LPS, IFNJ und
LPS/IFNJ aktiviert. Die Expressionsunterschiede zu unstimulierten Zellen, relativ zu beta-Aktin sind als Ratio
dargestellt.
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Lebenslauf
147
8 Tabellarischer Lebenslauf
Name:
Geb.:
Geb.-Ort.:
Cornelia Beuter-Gunia, geb.: Beuter
16.09.1972
Herdecke
Familienstand:
verheiratet
Schulische Bildung:
Grundschule:
Dorfschule Witten-Heven
08/1979-06/1983
Realschule:
Otto-Schott-Realschule Witten
08/1983-06/19989
Gymnasium:
Albert-Martmöller-Gymnasium
08/1989-06/1992
Abschluss:
Berufliche Ausbildung:
Stammhauslehre Siemens:
Abschluß:
Angestellte Vertrieb Düsseldorf:
Studium:
Universität:
Studiengang:
Allgemeine Hochschulreife
10/1993-09/1995
Industriekauffrau IHK, Land Bayern
10/1995-09/1996
Ruhr-Universität Bochum
Wirtschaftswissenschaften und Englisch, Lehramt
10/1992-09/1993
Biologie, Diplom
10/1996-11/2002
Diplomarbeit:
Thema:
Betreuer:
Abschluß:
AG „Spezielle Zoologie“ / Max-Planck-Institut für
Immunbiologie (Freiburg)
„Rekonstitution der alymphoiden Knock-out-Maus
RAG2-/-Jc-/- zur Analyse der Immunantwort bei
einer Trypanosoma cruzi Infektion“
Prof. Dr. G.A. Schaub (Bochum) / Dr. H. Mossmann
(Freiburg)
Diplom Biologin
Ergänzende Arbeiten am MPI zur T.cruzi Infektion
11/2002-02/2004
Promotion:
Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Krankenhaushygiene der Heinrich-Heine
Universität Düsseldorf
ab 03/2004
Thema:
Betreuer:
„Identifizierung und Charakterisierung von IFNJ
regulierten Effektormolekülen (mGBP7, SSPII) bei
der antimikrobiellen Immunantwort“
Prof. Dr. Klaus Pfeffer/ Prof. Dr. Heinz Mehlhorn
Danksagung
149
9 Danksagung
Herrn Professor Dr. Klaus Pfeffer möchte ich für die Überlassung des interessanten Themas sowie
für die fürsorgliche Betreuung der vorliegenden Arbeit danken.
Herrn Professor Dr. Heinz Mehlhorn danke ich recht herzlich für die Bereitschaft der Betreuung
meiner Doktorarbeit.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Sandra Beer für die große Unterstützung und die kreativen
Gespräche und Ideen.
Lieben Dank an Daniel Degrandi für das super Teamwork die Freundschaft und Unterstützung in
allen Lagen des Laboralltags.
Carolin Konermann möchte ich für den guten Austausch von Ideen hinsichtlich der GTPasen
danken.
Herzlichen Dank an Nicole Krafzig für die Maus-Unterstützung, Blastozysteninjektion und
Transfer sowie die Freundschaft!
Karin Buchholz möchte ich für die Laborunterstützung und den regen Info-Austausch herzlich
danken.
Simone Brandt und Anne Mausberg gilt ein besonderer Dank für ihre Freundschaft in und
außerhalb des Labors.
Allen anderen Mitgliedern der Pfeffer/Beer/Scheu-Gruppe möchte ich auch herzlich danken, für
anregende Gespräche und gegenseitige Unterstützung. Als da wären: Philipp Dresing (Sardinien
war doch super, auch ohne Koffer!), Steffi Borkens, Steffi Scheu, Sonja Kropp, Magdalena Kocur,
Regina Jakubiak, Bernhard Reis, Max von Holleben und Sarah Lahme.
Meinem Ehemann Frank Gunia gilt der größte Dank, mit seiner Liebe und Geborgenheit hat er
mir den größten Halt gegeben. Auch meiner Familie: Eltern, Geschwistern, Omas und Tante,
Schwiegereltern, Schwägerin und Schwager sowie meiner Nichte Sarah gilt mein besonderer
Dank, da sie mir den Blick für das Wesentliche geben sowie jedwede Unterstützung.