Die Verteilung von 32P im Virus der klassischen Geflügelpest bei

Aus den Verteilungskurven ergibt sich das aus
Systox-Sulfoxyd"
(XXIII)
und fast das Doppelte
Tab. 10 ersichtliche Mengenverhältnis zwischen un-
von „ E 6 0 5 "
verändertem „ D i p t e r e x " , „ D D V P " und Hydrolysat
Lösung auf die Hydrolyse-Geschwindigkeit im Be-
nach halbstündigem Erwärmen auf 7 0 ° .
reich von n. HCl bis pn 8 ist gering.
PH
„Dipterex"
[%]
„DDVP"
[%]
Hydrolvsenprodukte
[%]
1
5
6
7
8
98,5
96,2
72,2
3,0
0
0,5
L6
21,6
58,5
54,0
1
1,6
6,2
38,5
46,0
Hydrolyse
(XIII)
PN-Bereich von
und „ D D V P "
1—5
(„DDVP"
(II)
lösten Substanzen, also nicht für Emulsionen und
Suspensionen, gelten. Ferner gelten sie nur für rein
wäßrige Lösungen. Lösungsvermittler, z. B. Methanolzusätze, können
von
angegebene Beispiel zeigt.
CH3OH
beiden
ven) .
(XXII)
„ E 6 0 0 " (I) konnten keine Unterschiede in der Hywerden.
Beide
terex" ( X I I I ) . Ihre Halbwertzeit bei 2 0 ° ist etwa
nur ein Drittel geringer als die des „ E 6 0 5 "
(IV).
[%]
0
10
20
30
und
Präparate besitzen etwa die Beständ'gkeit von „ D i p -
hydrolysierte Substanz
pro Stde.
[%]
Präparaten wesentlich rascher (vgl. Hydrolyse-Kur-
festgestellt
Hydrolyse-Geschwindigkeit
des Agens beträchtlich herabsetzen, wie das in Tab. 11
PH 2 — 5 ) am stabilsten. In stark saurer Lösung und
drolyse-Geschwindigkeit
die
durch „ V e r d ü n n u n g " des Wassers als hydrolysieren-
im Bereich
Zwischen den Präparaten „ S 7 7 6 "
Lösungsmittel
Es muß ausdrücklich darauf hingewiesen werden,
sind im
oberhalb pn 5 verläuft die Hydrolyse bei
bei Zusatz nicht wäßriger
daß alle angegebenen Zahlen nur für die echt ge-
Tab. 10. Ubergang von „ D i p t e r e x " in „ D D V P " .
„Dipterex"
( I V ) . Der Einfluß des p H -Wertes der
11,6
9,9
8,1
6,6
Tab. 11. Hydrolyse von „Präparat S 4 8 1 " ( X X V I ) bei 4 0 °
bei Zusatz wechselnder Mengen an Methanol zur wäßrigen
Lösung.
Das Präparat „ D i s y s t o n " ( X I ) ist m ; t seiner Halbwertzeit von 3 Jahren bei 2 0 ° das hydrolytisch sta-
Über das hydrolytische Verhalten von Emulsio-
bilste von allen bisher von uns gemessenen Verbin-
nen kann nichts ausgesagt werden, da sich die Ver-
dungen. Die Halbwertzeiten dieses Präparates betragen etwa das
l 1 /2-fache
derjenigen
von
„PO-
seifung
von
Emulsionen
nach
unserer
Methodik
nicht verfolgen läßt.
NOTIZEN
Die Verteilung von
32P
im Virus der klassischen
Markierungsverfahren
EBERHARD
WECKER
Max-Planek-Institut für Virusforschung
Abteilung für tierpathogene Virusarten. Tübingen
auch
( Z . Naturforschg. 12 b, 2 0 8 — 2 1 0 [ 1 9 5 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 18. D e z e m b e r 1956)
Über den Einbau von
arten ist schon m e h r f a c h
1
2
32P
in t i e r p a t h o g e n e V i r u s berichtet w o r d e n 2 ' 3 . A l s
A . F. GRAHAM U. L . M C C L E L L A N D . Can.
121 [1950],
O . C. Liu, H . BLANK J . SPIZIZEN U. W .
logy 73. 415 [ 1 9 5 4 ] .
J.
Res. Sect.
E
markierten
GRAHAM
und
MCCLELLAND
1
Influenza-
V i r u s u n d f a n d e n d a b e i , d a ß etwa 4 - m a l m e h r 3 2 P in
d i e R i b o n u c l e i n s ä u r e ( R N S ) d e s V i r u s als in d e s s e n
L i p o i d e e i n g e b a u t w o r d e n w a r . L i u u n d M i t a r b b . 2 dag e g e n f a n d e n b e i d e m g l e i c h e n V i r u s etwa 7 2 / o d e r
A k t i v i t ä t in d e n L i p o i d e n und n u r etwa 16 — 1 8 % in
d e r R N S . E i n e ä h n l i c h e V e r t e i l u n g d e s I s o t o p s stellten
Geflügelpest bei verschiedenen
Von
erste
28,
WECKER
und
SCHÄFER3
bei
der
V i r u s d e r klassischen G e f l ü g e l p e s t
Markierung
(KP-Virus)
des
fest.
D a d i e b e i d e n letztgenannten A r b e i t s g r u p p e n 2 - 3 d a s
schon 4 8 b i s 7 2 S t d n . v o r d e r Z u g a b e d e s V i r u s
32P
den
3
Wirtszellen
E . WECKER
U.
anboten,
W . SCHÄFER,
GRAHAM
Z.
und
MCCLELLAND
Naturforschg.
11
b,
1
181
[1956].
HENLE,
J.
Immuno-
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aber erst kurz vorher oder gleichzeitig, war damit zu
rechnen, daß ein Zusammenhang zwischen der unterschiedlichen Verteilung der Radioaktivität im Virus und
der verschieden langen Vorinkubation der Zellen mit
3 2 P besteht. In der vorliegenden Arbeit wurde nunmehr
beim KP-Virus eingehender geprüft, wie sich die zeitlich unterschiedliche Vorgabe von radioaktivem Phosphor auf die Verteilung des Isotops in den produzierten Viruspartikeln auswirkt. Gleichzeitig wurde untersucht, wie sich dabei der Gesamtgehalt der Teilchen an
32 P ändert. Beim Influenza-Virus konnten bereits Liu
und Mitarbb. 2 zeigen, daß der Markierungsgrad dieses
Virus um so höher war, je früher das Isotop den Wirtszellen vor der Infektion mit dem zu markierenden
Virus zur Verfügung stand.
serum (Endkonzentration 30%) 4 lyophilisiert und danach aus ihnen — wie früher angegeben 3 — die Lipid-,
kalte Trichloressigsäure(TCE)- und Nucleinsäure(NS)Fraktionen gewonnen.
Sowohl bei der Reinigung wie bei der chemischen
Fraktionierung des Virus wurden sämtliche Proben
gleich behandelt.
Wie Tab. 1 zeigt, enthielten unsere, aus den verschiedenen Ansätzen gewonnenen Viruspräparate nach den
Ergebnissen der Hämagglutinations (HA)-Teste im allgemeinen die gleiche Virusmenge. Die zeitlich unterschiedliche Zugabe des 32 P zur Gewebekultur hatte
demnach keinen Einfluß auf die Menge des produzierten Virus. Es änderte sich aber mit der Zeit der
Zugabe des Isotops die spezifische Radioaktivität der
gewonnenen Viruspräparate und zwar in dem Sinne,
daß die Aktivität des Virus um so höher war, je länger
die Zellen mit 32 P vor der Infektion bebrütet worden
waren. Wurden infizierendes Virus und Isotop der Gewebekultur gleichzeitig zugefügt, dann betrug die spezifische Aktivität des gewonnenen Virus 9 0 I P M / H A
( = Impulse pro Minute pro hämagglutinierende Einheit) ; fügte man das Isotop jedoch schon 48 Stdn. ante
infectionem hinzu, so stieg sie auf 158 I P M / H A an.
Technik
Die Einzelheiten der Markierungstechnik, die Reinigung der markierten Viruspräparate sowie deren chemische Fraktionierung sind in einer vorangegangenen
Arbeit ausführlicher beschrieben 3 .
Embryonale Hühnerzellen wurden in 10 Petrischalen
angezüchtet. Zwei Platten wurden sofort mit je 2 mC
32 P in Form von trägerfreiem Orthophosphat versetzt,
je zwei weitere erst nach 24, 36, 42 und 48 Stdn. langer Bebrütung bei 37° C. 48 Stdn. nach dem Ansetzen
wurden alle Platten mit - 5 - 1 0 6 P B E * des KP-Virus
beimpft. Die Infektion des letzten Plattenpaares erfolgte also gleichzeitig mit der Zugabe von 3 2 P. Sämtliche Platten wurden nun zur Vermehrung des Virus
für weitere 48 Stdn. bei 37 u C inkubiert. Anschließend
erfolgte die Isolierung und Reinigung des markierten
Virus aus den einzelnen Kulturmedien in der früher
beschriebenen Weise 3 . Von der Radioaktivität der gereinigten Präparate waren im Durchschnitt nur 6,3
+ 0,15% nicht an Hühner-Erythrocyten zu adsorbieren
und demnach möglicherweise nicht an Viruspartikel gebunden. Wahrscheinlich ist diese Aktivität noch auf eine
geringe Verunreinigung der Viruskonzentrate mit anorganischem 32 P-Phosphat zurückzuführen.
Für die chemische Fraktionierung wurden jeweils
0,5 ml der gereinigten markierten Viruspräparate verwendet. Sie wurden nach Zusatz von normalem PferdeGesamtlipid
32 P-Vorgabe
in Stdn.
IPM
Zeit der
"P-Vorgabe
in Stdn.
IPM
IPM/ml
1 : 1 2 8
40
24
1:
2 1 3 5 8
133
12
1 : 1 2 8
30
838
120
6
1 : 1 2 8
25
178
98
0
1 : 1 2 8
23
208
90
80
428
IPM/HAE*
48
158
* Da der H A - T i t e r sich auf 0.5 ml bezieht, wurde zur Berechnung der I P M / H A E e b e n f a l l s nur die Aktivität von 0,5 ml
der Viruspräparate eingesetzt.
T a b . 1. H A - T i t e r und spezifische Aktivität der Viruspräparate
in A b h ä n g i g k e i t zur Dauer der 3 2 P - V o r g a b e für die
Wirtszellen.
Bei der Untersuchung der aus den einzelnen Präparaten gewonnenen chemischen Fraktionen im G e i g e r Zähler (s. Tab. 2) ergab sich dann, daß dieser Anstieg
Gesanit-NS
Gesamt-TCE
[%1
HA-Titer
Summe
wiedergef.
Akt.
IPM
[%]
[%!
IPM
[%]
274
26,3
19
969
12
309
61,7
2
386
12
5
24*)
8
190
50,2
2
450
15
5
680
34,8
16
320
—
12
5
470
40,1
2
304
16,9
5
844
43,0
13
618
88,5
6
4
189
35,3
2 1 7 0
18,3
5
500
46,4
11
859
94,3
0
3
055
31,3
1
18,5
4
892
50,2
9
758
84,2
48
811
98
* D i e absoluten Radioaktivitäts-Werte für den 24-Stdn.-Ansatz w u r d e n für eine Gesamtaktivität von 16 320 I P M umgerechnet, die bei gleichem Virusgehalt wie in den ü b r i g e n Ansätzen g e g e b e n gewesen wäre.
T a b . 2. Die Verteilung des
* P B E = plaquebildende
32P
auf die einzelnen chemischen Fraktionen der Viruspräparate in A b h ä n g i g k e i t zur Dauer der
3 2 P - V o r g a b e f ü r die W i r t s z c l l e n .
Einheiten.
4
E . WECKER
u.
W .
SCHÄFER,
in Vorbereitung.
der spezifischen Radioaktivität der Viruspartikel auf
einen verstärkten Einbau von 32 P in die Lipid-Fraktion
des Virus zurückzuführen ist. Während die absolute
Aktivität dieser Fraktion bei gleichzeitiger Gabe von
Isotop und Virus nur 3055 IPM betrug, erreichte sie
einen Wert von 12 309 IPM, wenn das Isotop 48 Stdn.
vorher zugesetzt wurde. Im Gegensatz hierzu blieb die
absolute Aktivität der Nucleinsäure- und TCE-Fraktion unter den gleichen Versuchsbedingungen nahezu
konstant. In den Nucleinsäure-Fraktionen wurden
durchschnittlich etwa 5300 IPM, in den TCE-Fraktionen etwa 2200 IPM gefunden. Entsprechend der unterschiedlichen Markierung der Lipid-Fraktionen verschob
sich die prozentuale Verteilung der Radioaktivität auf
die verschiedenen Komponenten des Virus. Viruspartikel, welche aus dem Ansatz stammten, bei dem das
Isotop zum Zeitpunkt der Infektion zugesetzt wurde,
enthielten 31,3% der Radioaktivität in den Lipiden,
50,2% in der Nucleinsäure- und 18,5% in der TCEFraktion. Wurde das Isotop 48 Stdn. ante infectionem
zugegeben, so ließen sich 61,7% der Aktivität in den
Lipiden, 26,3% in der Nucleinsäure- und 12% in der
TCE-Fraktion nachweisen.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann man folgendes festhalten:
a) Die Markierung mit 32 P wird beim KP-Virus —
ebenso wie beim Influenza-Virus 2 — um so stärker, je
Nachträge zur Physiologie des Gaswechsels der
Larve von Sialis lutaria
Von
O.
HARNISCH
früher man das Isotop der Gewebekultur vor der Infektion zusetzt; dies trifft zumindest für den geprüften Zeitraum von 0 — 48 Stdn. ante infectionem zu.
b) Die höhere Markierung beruht darauf, daß unter
den genannten Bedingungen mehr 32 P in die Viruslipide gelangt. Die in die Virusnucleinsäure eingebaute
32 P-Menge ändert sich dabei nicht; sie richtet sich lediglich nach dem Verhältnis radioaktiver/nicht-radioaktiver
P im Nährmedium der Wirtszellen (vgl. 3).
Unsere Befunde legen die Annahme nahe, daß das in
den Viruslipiden gefundene 32 P zunächst in zelleigene
Bestandteile eingebaut wird und erst von oder mit diesen auf die in der Vermehrung begriffenen Virusteilchen übergeht. Unter diesen Umständen kann man erwarten, daß — wie es unseren Feststellungen entspricht — um so mehr 32 P in das Viruslipid gelangt,
je länger die Zelle Gelegenheit hatte, das Isotop aufzunehmen. Im Gegensatz hierzu scheint der in der
Virus-RNS enthaltene radioaktive Phosphor auf einem
schnelleren, möglicherweise auch direkterem Wege dahin zu gelangen.
Es ist geplant von den gefundenen Ansatzpunkten
aus, die Synthese der Virusbausteine in der Zelle noch
näher zu untersuchen.
Fräulein I .
Deutschen
von Mitteln.
danke ich für ihre unermüdliche Mitarbeit, der
F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t für die Bereitstellung
KLOETZEL
empfindlich gegen 0 2 -Mangel im Medium, so daß sie
nicht mehr als stenoxybiont bezeichnet werden kann.
In der Waschflasche erträgt sie bis zu 3 Tagen Aufenthalts unter N 2 , was allerdings die oberste, nicht
immer erreichte Grenze ist. In Abb. 1 gebe ich Photos
Hydrobiologische Anstalt der Max-Planck-Gesellschaft, Plön
(Z. Naturforschg. 12 b, 210—211 [19571 ! eingegangen am 6. November 1956)
In einer früheren Arbeit 1 habe ich die 0 2 -Aufnahme
der Larve von Sialis lutaria eingehend studiert, ohne
mich um die Mechanismen der 0 2 -Aufnahme näher zu
kümmern. Die wichtigsten Ergebnisse waren, daß entsprechend der Arbeitsweise des geschlossenen Tracheensystems ziemlich weitgehende Unabhängigkeit der Atmungsgröße vom 0 2 -Partialdruck des Mediums besteht
und daß schon unterm Partialdruck der Luft, besonders
aber bei erniedrigtem Partialdruck, erhebliche Gasemission im Körper stattfindet.
In der vorliegenden Mitt. versuche ich nun zu diesen beiden wichtigen Faktoren neue Daten zu erbringen. 1. In Untersuchungen, die später veröffentlicht
werden sollen, habe ich an stenoxybiont lebenden Insektenlarven verschiedentlich gefunden, daß sie schon
bei kurzer Behandlung mit N 2 ihr Tracheensystem wesentlich erweitern. Ich habe nun danach gefahndet, ob
sich auch am Tracheensystem der Sialis-Larve ähnliche
Beobachtungen über eine Anpassung des geschlossenen
Tracheensystems an niederen Partialdruck machen lassen. Die Larve von Sialis ist verhältnismäßig wenig
1
O . HARNISCH,
Zool. Jb. Physiol. 6 4 , 4 9 6
[1953].
A b b . 1. Sialis lutaria-Larve. Kiemenfäden, a) unbehandeltes
Tier, b) nach 3 Tagen N 2 . Obj. 3. Ok. 10-fach.
Dr. GROSPIETSCH phot.
des Tracheensystems in den seitlichen Kiemenschläuchen der Larve; Abb. 1 a zeigt einen Kiemenschlauch
einer unbehandelten Larve, Abb. 1 b den einer 3 Tage