IMMUNOZYM HiB IgG - PROGEN Biotechnik GmbH

IMMUNOZYM HiB IgG
Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgGAntikörpern gegen das Polyribosylribitolphosphat
(PRP) von Haemophilus influenzae Typ B aus
Serum, Citrat, EDTA- und Heparinplasma
Art. Nr.:
7704010
Inhalt:
Lagerung:
12  8 Bestimmungen
2-8°C
IVD
Gebrauchsanweisung: www.progen.de
1. Einleitung
Haemophilus influenzae Typ B (HiB) ist bei Kindern im
Alter bis zu sechs Jahren ein häufiger Erreger invasiver,
lebensbedrohlicher Infektionskrankheiten. Dabei treten
die folgenden durch den Keim verursachten
Krankheitsbilder
gehäuft
auf:
Perikarditiden,
Osteomyelitiden, Meningitiden, Encephalitiden, Pneumonien, Sinusitiden, Epiglottitiden und Otitiden. Die
Erkrankung führt immer wieder zu Todesfällen bzw.
neurologischen Defektheilungen, die sich trotz frühzeitiger Antibiotikatherapie nicht immer vermeiden
lassen.
Die Ursache ist oft eine latent bestehende
Immunschwäche, die eine spezifische Unfähigkeit zur
humoralen Immunreaktion auf das Polyribosylribitolphosphat (PRP) der Polysaccharidkapsel des
Erregers beinhaltet. Bei Kindern ist generell die noch
bestehende Unreife des Immunsystems zu beachten.
Aus diesem Grund ist die Impfung mit PRP-haltigen
Vakzinen ab dem dritten Lebensmonat indiziert. Damit
kann die Häufigkeit von Infektionen mit Haemophilus
influenzae Typ B deutlich gesenkt werden. Der
Impferfolg
korreliert
mit
den
nachweisbaren
Antikörperkonzentrationen. Mit IMMUNOZYM HiB IgG ist
die Messung von PRP-spezifischen IgG-Antikörpern
möglich. Eine Kontrolle des humoralen Immunstatus
empfiehlt sich bei Kindern und Probanden aus
Risikokollektiven etwa 4 bis 6 Wochen nach kompletter
Immunisierung.
2. Indikationen des Tests
Kontrolle des humoralen Immunstatus nach Impfung.
Sicherung der Diagnose Haemophilus influenzae Typ B
Infektion durch den wiederholten Nachweis von sich
verändernden Antikörperkonzentrationen.
Risikoeinschätzung bei immungeschwächten Patienten
durch das Ausbleiben des Impferfolgs nach Impfung mit
einer PRP-haltigen Vakzine.
20-205 7704010 HIB de_V10
Zu dieser Gruppe zählen:
Kinder unter 2 Jahren mit durchgemachter Haemophilus
influenzae Typ B Infektion,
Kinder mit chronischen, rezidivierenden bakteriellen
Infektionen der oberen Atemwege,
Kinder mit chronischen Otitiden,
Patienten mit gesicherten humoralen Immundefekten
(IgG2-Mangel, IgA-Mangel),
Patienten mit gesicherten Granulozyten-Defekten,
Patienten unter Chemo- bzw. Zytostatika-Therapie,
splenektomierte Kinder,
Patienten mit Sichelzellenanämie,
Patienten mit Trisomie 21 (Down Syndrom),
bestimmte ethnische Gruppen.
3. Testprinzip
IMMUNOZYM HiB IgG ist ein Zweischritt-ELISA, der
PRP-spezifische
IgG-Antikörper
nachweist.
Die
Vertiefungen der ELISA-Teststreifen sind mit PRP
beschichtet.
Werden
verdünnte
Serumbzw.
Plasmaproben inkubiert, binden spezifische Antikörper
an das insolubilisierte PRP (Probeninkubation). Im
nachfolgenden Waschschritt werden alle nicht
gebundenen und damit nicht spezifischen Bestandteile
der Probe entfernt. Im zweiten Inkubationsschritt erfolgt
die Konjugatreaktion. Das Konjugat, ein Peroxidasekonjugierter anti-human-IgG-Antikörper (anti-humanIgG-POD), markiert das zuvor spezifisch gebundene
IgG. In einem weiteren Waschschritt wird ungebundenes
Konjugat entfernt. Im dritten Inkubationsschritt erfolgt die
Substratreaktion, wobei die Peroxidase des Konjugats
das Tetramethylbenzidin (TMB) zu einer gefärbten
Substanz oxidiert. Durch anschließende Zugabe von
Schwefelsäure wird diese Reaktion gestoppt, und es
erfolgt ein Farbumschlag nach gelb. Die Farbintensität
ist der Konzentration der PRP-spezifischen Antikörper in
der Probe direkt proportional. Bei einer Wellenlänge von
450 nm wird die Extinktion in einem ELISA-Reader
gemessen. Über eine Bezugskurve wird die
Konzentration der PRP- spezifischen Antikörper in der
Probe quantitativ bestimmt.
4. Benötigte, nicht mitgelieferte Materialien und Geräte
Aqua dest.
Röhrchen zur Probenverdünnung
Messzylinder (1000 ml)
Präzisionspipetten (10, 500 µl)
Pipetten (10 und 20 ml)
Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (50 und 200 µl)
Probenmischer
ELISA-Waschgerät oder Mehrkanalpipette
Stoppuhr
ELISA-Reader mit 450 nm Filter
5. Packungsinhalt
MTP, 12 Streifen mit je 8 einzeln abbrechbaren
Mikrotitervertiefungen; beschichtet mit PRP aus
Haemophilus influenzae Typ B; mit Trockenmittel im
Aluminiumbeutel verpackt. Gebrauchsfertig!
1/4
WASH 10x,
Waschpufferkonzentrat (10x);
0,1 M
Tris/HCl;
pH 7,4;
detergenshaltig;
enthält
Konservierungsmittel; 1 Flasche; 100 ml. Vor Gebrauch
verdünnen!
6.3 Stabilitäten
DIL, HiB-Inkubationspuffer; 0,01 M Tris/HCl; pH 7,4;
detergenshaltig; rot gefärbt; 1 Flasche; 100 ml.
Gebrauchsfertig!
Stabilitäten nach Anbruch:
6 Monate bei 2-8°C:
CAL 1,
CAL 2,
CAL 3,
CAL 4,
CAL 5;
Kalibratoren 1-5; Humanseren mit Stabilisatoren und
Konservierungsmittel; jeweils 1 Flasche; 0,2 ml. Die
chargenabhängigen Konzentrationen bitte dem
Chargenzertifikat entnehmen! Vor Gebrauch verdünnen!
POS LL, POS HL, Positive Kontrollseren, LL, “Low
Level”, HL, “High Level”; zur Richtigkeitskontrolle;
Humanseren mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel; jeweils 1 Flasche; 0,2 ml. Die chargenabhängigen Sollwerte bitte dem Chargenzertifikat
entnehmen! Vor Gebrauch verdünnen!
CON, Konjugat; Anti-human-IgG-Peroxidase; blau
gefärbt; 1 Flasche; 0,3 ml. Vor Gebrauch verdünnen!
S, Substrat; Tetramethylbenzidin (TMB) ; 1 x 12 ml.
Gebrauchsfertig!
STOP, Stopplösung; 0,5 M Schwefelsäure; 1 Flasche;
15 ml; Gebrauchsfertig!
Abklebefolien für ELISA-Teststreifen; 2 Stück.
Chargenzertifikat
6. Testdurchführung
6.1 Untersuchungsmaterial, Lagerung
Humanserum, Citrat-, EDTA- oder Heparinplasma.
Proben können bis zu 6 Wochen im Kühlschrank
aufbewahrt werden [12]. Bei –20°C können sie mehrere
Monate aufbewahrt werden. Die Proben dürfen nicht
mehrfach aufgetaut und wieder eingefroren werden.
6.2 Vorbereitungen
Testkit auf Raumtemperatur bringen (20-26°C).
Verdünnen der Kalibratoren 1-5, positiven Kontrollseren
und Proben, 1+25:
Beispiel: 20 µl in 500 µl Inkubationspuffer verdünnen.
Für die Auswertung mittels Bezugskurve werden die
Kalibratoren 1 bis 5 und Kontrollseren benötigt.
Herstellen der Konjugat-Gebrauchslösung, 1+100:
Beispiel für 8 Testvertiefungen: 20 µl Konjugat in 2000 µl
Inkubationspuffer verdünnen. Kurz vor Gebrauch
ansetzen! Angesetzte Lösung bei Raumtemperatur
(20-26°C) 60 Min. haltbar.
Herstellen des Waschpuffers, 1+9:
Beispiel für 12  8 Streifen mit Mikrotitervertiefungen:
30 ml Waschpufferkonzentrat in 270 ml Aqua dest.
verdünnen. Gut mischen! Angesetzte Lösung bei 2-8°C
2 Monate haltbar.
20-205 7704010 HIB de_V10
Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind
ungeöffnet bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar.
WASH 10x, S, DIL, MTP
(MTP im Aluminiumbeutel mit Trockenmittel)
CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5,
POS LL, POS HL, CON
6.4 Testablauf
Probeninkubation: 100 µl verdünnte Kalibratoren /
Kontrollen / Proben in Testvertiefungen pipettieren.
Kalibratoren sollten in Teststreifen 1 und 2 pipettiert
werden. Teststreifen mit unbenutzter Folie abdecken.
Bei Raumtemperatur (20-26°C) 60 Min. inkubieren.
Waschen: Testvertiefungen entleeren und 250 µl
gebrauchsfertigen Waschpuffer pro Testvertiefung
einfüllen, absaugen; 2x wiederholen; auf saugfähiger
Unterlage ausklopfen.
Konjugatinkubation:
100 µl
gebrauchsfertiges
Konjugat pro Testvertiefung pipettieren. Teststreifen mit
unbenutzter Folie abdecken. Bei Raumtemperatur
(20-26°C) 60 Min. inkubieren.
Erneut waschen: Testvertiefungen entleeren und wie
oben beschrieben (3 x 250 µl pro Testvertiefung)
waschen.
Substratreaktion: 100 µl gebrauchsfertiges Substrat
pro Testvertiefung pipettieren. Bei Raumtemperatur
(20-26°C) 30 Min. inkubieren.
Stoppen: 100 µl Stopplösung pro Testvertiefung
pipettieren. 10 s schütteln. Farbreaktion innerhalb von
10 Min. messen bei 450 nm (Referenzwellenlängenmessung bei 620–690 nm).
7. Hinweise
Gebrauch nur durch Fachpersonal!
Waschpuffer, Substrat und Stopplösung sind mit
folgenden
IMMUNOZYM-Produkten
austauschbar:
FSME IgG, FSME IgM, Tetanus und Diphtherie.
Wichtig für Präzision und Richtigkeit:
Hämolytische, lipämische, ikterische oder mikrobiell
kontaminierte Proben können zu falschen Ergebnissen
führen.
Inkubationstemperatur 20-26°C einhalten.
Einhaltung der Pipettierreihenfolge.
Durchführung von Doppelbestimmungen.
Inkubationszeit 10% einhalten. Sie beginnt nach dem
Einpipettieren der letzten Probe.
Einpipettieren der Proben: maximal 60 sec pro ELISATeststreifen.
Einpipettieren von Konjugat-, Substrat- sowie Stopplösung: maximal 10 sec pro ELISA-Teststreifen.
2/4
Sicherheitshinweise
Stopplösung (Schwefelsäure) und Bestandteile des
Substrats können zu Reizungen der Haut führen. Sollte
Säure bzw. TMB in die Augen gelangen, sofort mit viel
Wasser auswaschen und Arzt aufsuchen.
Kalibratoren und Kontrollseren sind HBsAg-negativ, HIVAntikörper- und HCV-Antikörper-negativ. Trotzdem
sollten diese Komponenten wie die Proben als potenziell
infektiös behandelt werden.
Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel (ProClin® 300). Nicht schlucken, Haut- und
Schleimhautkontakt vermeiden!
(Sicherheitsdatenblatt wird auf Anfrage versendet)
Entsorgungshinweise
Bei der Beseitigung der Testpackung sind die nationalen
gesetzlichen Bestimmungen in der jeweils aktuellen
Fassung zu beachten. Chemikalien und Zubereitungen,
die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel
Sonderabfälle. Besondere Hinweise zur Entsorgung sind
zusätzlich im Sicherheitsdatenblatt aufgelistet.
Maßnahmen bei Beschädigung
Im Falle einer erheblichen Beschädigung der
Testpackung ist der Hersteller zu benachrichtigen. Falls
einzelne Komponenten erheblich beschädigt sind, sind
diese nicht zur Testdurchführung zu verwenden. Sie
sollten so lange aufbewahrt werden, bis der
Transportschaden geregelt ist. Danach sollten sie
ordnungsgemäß entsorgt werden.
8. Testauswertung
8.1 Erstellen der Bezugskurve
Halblogarithmische Auswertebögen verwenden:
X-Achse (log.): Konzentration in [µg/ml]
Y-Achse (lin.) : Extinktion
Mittelwerte der Meßwerte von Kalibratoren, Kontrollseren bzw. Proben bilden.
Mittelwerte der Kalibratoren in Auswertebogen eintragen
und Punkte mit Kurvenlineal verbinden.
Bei Verwendung einer Auswertesoftware wird ein
Rechenprogramm mit multipler nicht linearer Regression
(z. B. 4-parametrische Kurvenanpassung, Glg. 1)
empfohlen.
Glg. 1:
Y = d + (a-d)/(1 + (x/c)b)
8.2 Beurteilung der Bezugskurve
Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte zwischen
1,0 und 2,5 liegen. Die Extinktion des Kalibrators 1 darf
0,5 nicht überschreiten. Die Extinktionsdifferenz
zwischen den Kalibratoren 5 und 1 sollte mindestens
1,0 betragen. Die Auswertbarkeit des Tests wird
anhand der ermittelten Kontrollwerte überprüft.
8.3 Konzentrationsbestimmung der Proben
Konzentration der Proben an der erstellten
Bezugskurve ablesen oder mit dem ELISA AuswerteProgramm berechnen.
20-205 7704010 HIB de_V10
Für 1+25 verdünnte Proben kann die Konzentration der
Probe (Plasma/Serum) an der Bezugskurve direkt
abgelesen werden.
Proben, deren Extinktion oberhalb des Kalibrators 5
liegt,
müssen
mit
HiB-Inkubationspuffer
1+1
vorverdünnt werden. Die ermittelte Konzentration wird
mit dem Verdünnungsfaktor 2 multipliziert.
Die Umrechnung von Citratplasma- in Serumwerte
erfolgt
durch
Multiplikation
der
abgelesenen
Konzentrationen mit dem Faktor 1,1.
9. Interpretationshilfe
Die Bestimmung PRP-spezifischer Antikörper gestattet
den Nachweis einer humoralen Immunreaktion nach
einer Immunisierung mit einem PRP-haltigen Impfstoff
bzw. einer Infektion mit Haemophilus influenzae Typ B,
die klinisch apparent oder inapparent verlaufen sein
kann.
Bleibt dieser Nachweis nach einer Immunisierung
negativ oder gehört der Patient zu einem Risikokollektiv
(vgl. "Testindikationen"), ist davon auszugehen, dass ein
Risiko besteht, mit Haemophilus influenzae Typ B
infiziert
zu
werden.
Das
Ausbleiben
einer
Serokonversion nach Impfung lässt Schlüsse auf die
Reaktionsfähigkeit gegenüber bakteriellen Kohlenhydratantigenen zu. Eine solche Immunschwäche wird
bei
Patienten
mit
chronischen
Bronchitiden,
rezidivierenden
Pneumonien,
Intrinsic
Asthma
bronchiale bzw. Bronchiektasen unklarer Genese
beobachtet.
Humorale Immunreaktionen nach Infektionen mit nicht
bekapselten
Haemophilus influenzae
weist
IMMUNOZYM HiB IgG nicht nach.
In
der
Literatur
[2, 8, 9, 10, 11,]
wird
davon
ausgegangen, dass bei Antikörperkonzentrationen unter
0,15 µg/ml
kein
ausreichender
Schutz
gegen
Haemophilus influenzae Typ B vorliegt. Antikörperkonzentrationen zwischen 0,15 und 1,0 µg/ml werden
als nachgewiesener Kontakt mit dem Keim interpretiert.
Erst Antikörperkonzentrationen oberhalb von 1,0 µg/ml
werden als ausreichende natürliche oder nach der
3. Impfung erworbene Immunität gewertet.
10. Testkenndaten
Intraassay-Varianz:
Es wurden 2 Proben im Konzentrationsbereich der
Kalibratoren in Doppelbestimmung jeweils 20-fach mit
einer Charge gemessen. Die Intraassay-Varianz betrug,
bezogen auf die Konzentration, zwischen 8 und 10%.
Interassay-Varianz:
Es wurden die POS HL und POS LL Kontrollseren in
Doppelbestimmung in jeweils 20 Testansätzen an
unterschiedlichen Versuchstagen mit einer Charge
gemessen. Die Interassay-Varianz lag, bezogen auf die
Konzentration, zwischen 9 und 12%.
Die untere Nachweisgrenze beträgt 0,1 µg/ml.
3/4
7.
Bezugskurvenbeispiel:
E 450 n m
2
8.
1,5
9.
1
10.
0,5
11.
0
0,01
0,03
0,1
0,3
1
3
10
12.
anti-HiB [µg /ml]
13.
11. Literatur und Referenzen
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Barra, A. et al.: Measurement of Anti-Haemophilus
influenzae type B capsular polysaccharide
antibodies by ELISA. J. Immunol. Meth. 115, 111
(1988)
Claesson, BA. et al.: Development of serum
antibodies of the immuno-globulin G class and
subclasses against the capsular polysaccharide of
Haemophilus influenzae type B in children and
adults with invasive infections. J. Clin. Microbiol.
26, 2549 (1988)
Dolan,
K.T.
et
al.:
An
enzyme-linked
immunosorbent
assay
for
quantitation
of
Haemophilus influenzae type B polysaccharidespecific IgG1 and IgG2 in human and infant rhesus
monkey sera. J. Immunoassay 12, 543 (1991)
Hetherington, S.V. et al.: Correlation between
antibody affinity and serum bactericidal activity in
infants. J. Infect. Dis. 165, 753 (1992)
Isaacs, D.: Infectious diseases. Editorial overview.
Curr. Opin. Pediat. 4, 45 (1992)
Kristensen, K., Weis Bentzon, M.: Relation
between enzyme-linked immunosorbent assay and
radioimmunoassay for the detection of antibodies
to the capsular polysaccharide of Haemophilus
influenzae type B. Acta. path. microbiol. immunol.
scand. Sect. C 100, 142 (1992)
Lagergard, T. et al.: Comparison between radioimmunoassay and direct and indirect enzymelinked immunosorbent assay for determination of
antibodies against Haemophilus influenzae type B
capsular polysaccharide. J. Clin. Microbiol. 26,
2554 (1988)
Käyhty, H. et al.: Antibodies response to capsular
polysaccharides of groups A and C Neisseria
meningitis and Haemophilus influenzae type b
during bacteremic disease. Infect. Dis. 143, 32
(1981)
Anderson, P.: The protective level of serum
antibodies to the capsular polysaccharide of
Haemophilus influenzae type B. J. Infect. Dis. 149,
1034 (1984)
Zielen, S. et al.: Untersuchung zur Effektivität der
Haemophilus-influenzae-B - Diphtherie-Konjugatimpfung bei deutschen Kindern. Monatsschr.
Kinderheilkunde 140, 852 (1992)
Zielen, S., Ahrens, P.: Haemophilus influenzae Typ
b-Impfserologie. Ellipse 11, 15 (1994)
Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum.
6, 113-120 (2002)
Sönmez C., Cöplü N., Kurtoglu D., Esen B.,
Crowley-Luke A., Ransley L.: Levels of antiHaemophilus influenzae type B antibody in Turkey
before routine vaccination. Turk J Med Sci 2010;
40 (6): 959-964. doi:10.3906/sag-0811-50
Weitere Tests der IMMUNOZYM Produktserie
IMMUNOZYM FSME IgG ELISA (7701010)
IMMUNOZYM FSME IgM ELISA (7701045)
IMMUNOZYM Tetanus IgG ELISA (7702010)
IMMUNOZYM Diphtherie IgG ELISA (7702040)
IMMUNOZYM Lp(a) ELISA (7700040)
Hersteller:
PROGEN Biotechnik GmbH
Maaßstraße 30
69123 Heidelberg
Germany
Telephon +49 (0) 6221 / 8278 0
Telefax +49 (0) 6221 / 8278 23
www.progen.de
[email protected]
Gültig ab: 07.03.2014
20-205 7704010 HIB de_V10
4/4