IMMUNOZYM HiB IgG - PROGEN Biotechnik GmbH
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IMMUNOZYM HiB IgG Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgGAntikörpern gegen das Polyribosylribitolphosphat (PRP) von Haemophilus influenzae Typ B aus Serum, Citrat, EDTA- und Heparinplasma Art. Nr.: 7704010 Inhalt: Lagerung: 12 8 Bestimmungen 2-8°C IVD Gebrauchsanweisung: www.progen.de 1. Einleitung Haemophilus influenzae Typ B (HiB) ist bei Kindern im Alter bis zu sechs Jahren ein häufiger Erreger invasiver, lebensbedrohlicher Infektionskrankheiten. Dabei treten die folgenden durch den Keim verursachten Krankheitsbilder gehäuft auf: Perikarditiden, Osteomyelitiden, Meningitiden, Encephalitiden, Pneumonien, Sinusitiden, Epiglottitiden und Otitiden. Die Erkrankung führt immer wieder zu Todesfällen bzw. neurologischen Defektheilungen, die sich trotz frühzeitiger Antibiotikatherapie nicht immer vermeiden lassen. Die Ursache ist oft eine latent bestehende Immunschwäche, die eine spezifische Unfähigkeit zur humoralen Immunreaktion auf das Polyribosylribitolphosphat (PRP) der Polysaccharidkapsel des Erregers beinhaltet. Bei Kindern ist generell die noch bestehende Unreife des Immunsystems zu beachten. Aus diesem Grund ist die Impfung mit PRP-haltigen Vakzinen ab dem dritten Lebensmonat indiziert. Damit kann die Häufigkeit von Infektionen mit Haemophilus influenzae Typ B deutlich gesenkt werden. Der Impferfolg korreliert mit den nachweisbaren Antikörperkonzentrationen. Mit IMMUNOZYM HiB IgG ist die Messung von PRP-spezifischen IgG-Antikörpern möglich. Eine Kontrolle des humoralen Immunstatus empfiehlt sich bei Kindern und Probanden aus Risikokollektiven etwa 4 bis 6 Wochen nach kompletter Immunisierung. 2. Indikationen des Tests Kontrolle des humoralen Immunstatus nach Impfung. Sicherung der Diagnose Haemophilus influenzae Typ B Infektion durch den wiederholten Nachweis von sich verändernden Antikörperkonzentrationen. Risikoeinschätzung bei immungeschwächten Patienten durch das Ausbleiben des Impferfolgs nach Impfung mit einer PRP-haltigen Vakzine. 20-205 7704010 HIB de_V10 Zu dieser Gruppe zählen: Kinder unter 2 Jahren mit durchgemachter Haemophilus influenzae Typ B Infektion, Kinder mit chronischen, rezidivierenden bakteriellen Infektionen der oberen Atemwege, Kinder mit chronischen Otitiden, Patienten mit gesicherten humoralen Immundefekten (IgG2-Mangel, IgA-Mangel), Patienten mit gesicherten Granulozyten-Defekten, Patienten unter Chemo- bzw. Zytostatika-Therapie, splenektomierte Kinder, Patienten mit Sichelzellenanämie, Patienten mit Trisomie 21 (Down Syndrom), bestimmte ethnische Gruppen. 3. Testprinzip IMMUNOZYM HiB IgG ist ein Zweischritt-ELISA, der PRP-spezifische IgG-Antikörper nachweist. Die Vertiefungen der ELISA-Teststreifen sind mit PRP beschichtet. Werden verdünnte Serumbzw. Plasmaproben inkubiert, binden spezifische Antikörper an das insolubilisierte PRP (Probeninkubation). Im nachfolgenden Waschschritt werden alle nicht gebundenen und damit nicht spezifischen Bestandteile der Probe entfernt. Im zweiten Inkubationsschritt erfolgt die Konjugatreaktion. Das Konjugat, ein Peroxidasekonjugierter anti-human-IgG-Antikörper (anti-humanIgG-POD), markiert das zuvor spezifisch gebundene IgG. In einem weiteren Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt. Im dritten Inkubationsschritt erfolgt die Substratreaktion, wobei die Peroxidase des Konjugats das Tetramethylbenzidin (TMB) zu einer gefärbten Substanz oxidiert. Durch anschließende Zugabe von Schwefelsäure wird diese Reaktion gestoppt, und es erfolgt ein Farbumschlag nach gelb. Die Farbintensität ist der Konzentration der PRP-spezifischen Antikörper in der Probe direkt proportional. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wird die Extinktion in einem ELISA-Reader gemessen. Über eine Bezugskurve wird die Konzentration der PRP- spezifischen Antikörper in der Probe quantitativ bestimmt. 4. Benötigte, nicht mitgelieferte Materialien und Geräte Aqua dest. Röhrchen zur Probenverdünnung Messzylinder (1000 ml) Präzisionspipetten (10, 500 µl) Pipetten (10 und 20 ml) Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (50 und 200 µl) Probenmischer ELISA-Waschgerät oder Mehrkanalpipette Stoppuhr ELISA-Reader mit 450 nm Filter 5. Packungsinhalt MTP, 12 Streifen mit je 8 einzeln abbrechbaren Mikrotitervertiefungen; beschichtet mit PRP aus Haemophilus influenzae Typ B; mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel verpackt. Gebrauchsfertig! 1/4 WASH 10x, Waschpufferkonzentrat (10x); 0,1 M Tris/HCl; pH 7,4; detergenshaltig; enthält Konservierungsmittel; 1 Flasche; 100 ml. Vor Gebrauch verdünnen! 6.3 Stabilitäten DIL, HiB-Inkubationspuffer; 0,01 M Tris/HCl; pH 7,4; detergenshaltig; rot gefärbt; 1 Flasche; 100 ml. Gebrauchsfertig! Stabilitäten nach Anbruch: 6 Monate bei 2-8°C: CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5; Kalibratoren 1-5; Humanseren mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel; jeweils 1 Flasche; 0,2 ml. Die chargenabhängigen Konzentrationen bitte dem Chargenzertifikat entnehmen! Vor Gebrauch verdünnen! POS LL, POS HL, Positive Kontrollseren, LL, “Low Level”, HL, “High Level”; zur Richtigkeitskontrolle; Humanseren mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel; jeweils 1 Flasche; 0,2 ml. Die chargenabhängigen Sollwerte bitte dem Chargenzertifikat entnehmen! Vor Gebrauch verdünnen! CON, Konjugat; Anti-human-IgG-Peroxidase; blau gefärbt; 1 Flasche; 0,3 ml. Vor Gebrauch verdünnen! S, Substrat; Tetramethylbenzidin (TMB) ; 1 x 12 ml. Gebrauchsfertig! STOP, Stopplösung; 0,5 M Schwefelsäure; 1 Flasche; 15 ml; Gebrauchsfertig! Abklebefolien für ELISA-Teststreifen; 2 Stück. Chargenzertifikat 6. Testdurchführung 6.1 Untersuchungsmaterial, Lagerung Humanserum, Citrat-, EDTA- oder Heparinplasma. Proben können bis zu 6 Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden [12]. Bei –20°C können sie mehrere Monate aufbewahrt werden. Die Proben dürfen nicht mehrfach aufgetaut und wieder eingefroren werden. 6.2 Vorbereitungen Testkit auf Raumtemperatur bringen (20-26°C). Verdünnen der Kalibratoren 1-5, positiven Kontrollseren und Proben, 1+25: Beispiel: 20 µl in 500 µl Inkubationspuffer verdünnen. Für die Auswertung mittels Bezugskurve werden die Kalibratoren 1 bis 5 und Kontrollseren benötigt. Herstellen der Konjugat-Gebrauchslösung, 1+100: Beispiel für 8 Testvertiefungen: 20 µl Konjugat in 2000 µl Inkubationspuffer verdünnen. Kurz vor Gebrauch ansetzen! Angesetzte Lösung bei Raumtemperatur (20-26°C) 60 Min. haltbar. Herstellen des Waschpuffers, 1+9: Beispiel für 12 8 Streifen mit Mikrotitervertiefungen: 30 ml Waschpufferkonzentrat in 270 ml Aqua dest. verdünnen. Gut mischen! Angesetzte Lösung bei 2-8°C 2 Monate haltbar. 20-205 7704010 HIB de_V10 Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind ungeöffnet bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. WASH 10x, S, DIL, MTP (MTP im Aluminiumbeutel mit Trockenmittel) CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5, POS LL, POS HL, CON 6.4 Testablauf Probeninkubation: 100 µl verdünnte Kalibratoren / Kontrollen / Proben in Testvertiefungen pipettieren. Kalibratoren sollten in Teststreifen 1 und 2 pipettiert werden. Teststreifen mit unbenutzter Folie abdecken. Bei Raumtemperatur (20-26°C) 60 Min. inkubieren. Waschen: Testvertiefungen entleeren und 250 µl gebrauchsfertigen Waschpuffer pro Testvertiefung einfüllen, absaugen; 2x wiederholen; auf saugfähiger Unterlage ausklopfen. Konjugatinkubation: 100 µl gebrauchsfertiges Konjugat pro Testvertiefung pipettieren. Teststreifen mit unbenutzter Folie abdecken. Bei Raumtemperatur (20-26°C) 60 Min. inkubieren. Erneut waschen: Testvertiefungen entleeren und wie oben beschrieben (3 x 250 µl pro Testvertiefung) waschen. Substratreaktion: 100 µl gebrauchsfertiges Substrat pro Testvertiefung pipettieren. Bei Raumtemperatur (20-26°C) 30 Min. inkubieren. Stoppen: 100 µl Stopplösung pro Testvertiefung pipettieren. 10 s schütteln. Farbreaktion innerhalb von 10 Min. messen bei 450 nm (Referenzwellenlängenmessung bei 620–690 nm). 7. Hinweise Gebrauch nur durch Fachpersonal! Waschpuffer, Substrat und Stopplösung sind mit folgenden IMMUNOZYM-Produkten austauschbar: FSME IgG, FSME IgM, Tetanus und Diphtherie. Wichtig für Präzision und Richtigkeit: Hämolytische, lipämische, ikterische oder mikrobiell kontaminierte Proben können zu falschen Ergebnissen führen. Inkubationstemperatur 20-26°C einhalten. Einhaltung der Pipettierreihenfolge. Durchführung von Doppelbestimmungen. Inkubationszeit 10% einhalten. Sie beginnt nach dem Einpipettieren der letzten Probe. Einpipettieren der Proben: maximal 60 sec pro ELISATeststreifen. Einpipettieren von Konjugat-, Substrat- sowie Stopplösung: maximal 10 sec pro ELISA-Teststreifen. 2/4 Sicherheitshinweise Stopplösung (Schwefelsäure) und Bestandteile des Substrats können zu Reizungen der Haut führen. Sollte Säure bzw. TMB in die Augen gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und Arzt aufsuchen. Kalibratoren und Kontrollseren sind HBsAg-negativ, HIVAntikörper- und HCV-Antikörper-negativ. Trotzdem sollten diese Komponenten wie die Proben als potenziell infektiös behandelt werden. Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel (ProClin® 300). Nicht schlucken, Haut- und Schleimhautkontakt vermeiden! (Sicherheitsdatenblatt wird auf Anfrage versendet) Entsorgungshinweise Bei der Beseitigung der Testpackung sind die nationalen gesetzlichen Bestimmungen in der jeweils aktuellen Fassung zu beachten. Chemikalien und Zubereitungen, die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel Sonderabfälle. Besondere Hinweise zur Entsorgung sind zusätzlich im Sicherheitsdatenblatt aufgelistet. Maßnahmen bei Beschädigung Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist der Hersteller zu benachrichtigen. Falls einzelne Komponenten erheblich beschädigt sind, sind diese nicht zur Testdurchführung zu verwenden. Sie sollten so lange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden geregelt ist. Danach sollten sie ordnungsgemäß entsorgt werden. 8. Testauswertung 8.1 Erstellen der Bezugskurve Halblogarithmische Auswertebögen verwenden: X-Achse (log.): Konzentration in [µg/ml] Y-Achse (lin.) : Extinktion Mittelwerte der Meßwerte von Kalibratoren, Kontrollseren bzw. Proben bilden. Mittelwerte der Kalibratoren in Auswertebogen eintragen und Punkte mit Kurvenlineal verbinden. Bei Verwendung einer Auswertesoftware wird ein Rechenprogramm mit multipler nicht linearer Regression (z. B. 4-parametrische Kurvenanpassung, Glg. 1) empfohlen. Glg. 1: Y = d + (a-d)/(1 + (x/c)b) 8.2 Beurteilung der Bezugskurve Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte zwischen 1,0 und 2,5 liegen. Die Extinktion des Kalibrators 1 darf 0,5 nicht überschreiten. Die Extinktionsdifferenz zwischen den Kalibratoren 5 und 1 sollte mindestens 1,0 betragen. Die Auswertbarkeit des Tests wird anhand der ermittelten Kontrollwerte überprüft. 8.3 Konzentrationsbestimmung der Proben Konzentration der Proben an der erstellten Bezugskurve ablesen oder mit dem ELISA AuswerteProgramm berechnen. 20-205 7704010 HIB de_V10 Für 1+25 verdünnte Proben kann die Konzentration der Probe (Plasma/Serum) an der Bezugskurve direkt abgelesen werden. Proben, deren Extinktion oberhalb des Kalibrators 5 liegt, müssen mit HiB-Inkubationspuffer 1+1 vorverdünnt werden. Die ermittelte Konzentration wird mit dem Verdünnungsfaktor 2 multipliziert. Die Umrechnung von Citratplasma- in Serumwerte erfolgt durch Multiplikation der abgelesenen Konzentrationen mit dem Faktor 1,1. 9. Interpretationshilfe Die Bestimmung PRP-spezifischer Antikörper gestattet den Nachweis einer humoralen Immunreaktion nach einer Immunisierung mit einem PRP-haltigen Impfstoff bzw. einer Infektion mit Haemophilus influenzae Typ B, die klinisch apparent oder inapparent verlaufen sein kann. Bleibt dieser Nachweis nach einer Immunisierung negativ oder gehört der Patient zu einem Risikokollektiv (vgl. "Testindikationen"), ist davon auszugehen, dass ein Risiko besteht, mit Haemophilus influenzae Typ B infiziert zu werden. Das Ausbleiben einer Serokonversion nach Impfung lässt Schlüsse auf die Reaktionsfähigkeit gegenüber bakteriellen Kohlenhydratantigenen zu. Eine solche Immunschwäche wird bei Patienten mit chronischen Bronchitiden, rezidivierenden Pneumonien, Intrinsic Asthma bronchiale bzw. Bronchiektasen unklarer Genese beobachtet. Humorale Immunreaktionen nach Infektionen mit nicht bekapselten Haemophilus influenzae weist IMMUNOZYM HiB IgG nicht nach. In der Literatur [2, 8, 9, 10, 11,] wird davon ausgegangen, dass bei Antikörperkonzentrationen unter 0,15 µg/ml kein ausreichender Schutz gegen Haemophilus influenzae Typ B vorliegt. Antikörperkonzentrationen zwischen 0,15 und 1,0 µg/ml werden als nachgewiesener Kontakt mit dem Keim interpretiert. Erst Antikörperkonzentrationen oberhalb von 1,0 µg/ml werden als ausreichende natürliche oder nach der 3. Impfung erworbene Immunität gewertet. 10. Testkenndaten Intraassay-Varianz: Es wurden 2 Proben im Konzentrationsbereich der Kalibratoren in Doppelbestimmung jeweils 20-fach mit einer Charge gemessen. Die Intraassay-Varianz betrug, bezogen auf die Konzentration, zwischen 8 und 10%. Interassay-Varianz: Es wurden die POS HL und POS LL Kontrollseren in Doppelbestimmung in jeweils 20 Testansätzen an unterschiedlichen Versuchstagen mit einer Charge gemessen. Die Interassay-Varianz lag, bezogen auf die Konzentration, zwischen 9 und 12%. Die untere Nachweisgrenze beträgt 0,1 µg/ml. 3/4 7. Bezugskurvenbeispiel: E 450 n m 2 8. 1,5 9. 1 10. 0,5 11. 0 0,01 0,03 0,1 0,3 1 3 10 12. anti-HiB [µg /ml] 13. 11. Literatur und Referenzen 1. 2. 3. 4. 5. 6. Barra, A. et al.: Measurement of Anti-Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J. Immunol. Meth. 115, 111 (1988) Claesson, BA. et al.: Development of serum antibodies of the immuno-globulin G class and subclasses against the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B in children and adults with invasive infections. J. Clin. Microbiol. 26, 2549 (1988) Dolan, K.T. et al.: An enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of Haemophilus influenzae type B polysaccharidespecific IgG1 and IgG2 in human and infant rhesus monkey sera. J. 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Turk J Med Sci 2010; 40 (6): 959-964. doi:10.3906/sag-0811-50 Weitere Tests der IMMUNOZYM Produktserie IMMUNOZYM FSME IgG ELISA (7701010) IMMUNOZYM FSME IgM ELISA (7701045) IMMUNOZYM Tetanus IgG ELISA (7702010) IMMUNOZYM Diphtherie IgG ELISA (7702040) IMMUNOZYM Lp(a) ELISA (7700040) Hersteller: PROGEN Biotechnik GmbH Maaßstraße 30 69123 Heidelberg Germany Telephon +49 (0) 6221 / 8278 0 Telefax +49 (0) 6221 / 8278 23 www.progen.de [email protected] Gültig ab: 07.03.2014 20-205 7704010 HIB de_V10 4/4
