Haemophilus

Kurs 6
Themen:
Haemophilus
DD Meningitis
Chlamydien
Mykoplasmen
PCR
Aufgaben:
1. Betrachten Sie die von Ihnen angefertigten Resistenz-Testungen aus der vorherigen
Woche. Messen Sie den Durchmesser des Hemmhofes. Tragen Sie das Ergebnis in den
Protokollbogen ein.
2. PCR Ansatz
3. Beurteilen Sie das Wachstum von Haemophilus influenzae auf der Ammen-,
Kochblut- und Faktorenplatte.
4. Fertigen Sie ein Grampräparat an von Haemophilus influenzae aus dem Ammenbereich
und vom Kochblutagar. Arbeiten Sie im Team.
5. Elektrophorese der PCR - Produkte
6. Betrachten Sie den Kleeblatttest. Wie kommt es zu diesem Phänomen?
7. Mikroskopieren Sie die Präparate „Hämophilus influenzae aus Liquor“ und
„Chlamydien“.
8. Theorie: Mykoplasmen

Betrachten Sie die Mykoplasmenkultur im Mikroskop mit dem 10´er Objektiv. Die
Petrischale bleibt dabei geschlossen.
 Beurteilung der Flüssigkulturen.
9. Welche Keime befinden sich auf den Wiederholungsplatten?
Auswertung des Blättchen – Diffusionstest:
gram neg. Stäbchen
S
Staphylokokken
R
S
R
Penicillin
Vancomycin
Cefazolin
Cefotaxim
Wirkstoff
Penicillin
Vancomycin
Cefazolin
Cefotaxim
1
2
Hemmhof nach
gram neg. Stäbchen
S
R
> 24
<12
>12
<9
>24
<18
>30
<20
Menge
( µg )
10
30
30
30
3
4
5
6
7
8
9
10 cm
DIN u.a. (mm)
S
>29
>12
>24
>30
Staphylokokken
R
<28
<9
<18
<20
Haemophilus influenzae
Die Anzucht erfolgt auf Spezialnährböden, die zwei Wachstumsfaktoren enthalten müssen:
1. X – Faktor: = Hämin (= Protohämin ) aus Erythrozyten ist thermostabil und wird
durch Erhitzen freigesetzt.
2. V – Faktor: = NAD ( = Nikotinamid – adenin – dinukleotid – phosphat ) ist
thermolabil und wird bei über 100°C wird er inaktiviert. Fast alle Bakterien mit
Ausnahme von Haemophilus influenzae synthetisieren den V – Faktor aus den
Bestandteilen von Blutagar. Haemophilus parainfluenzae kann nur den X – Faktor
synthetisieren.
Kochblutagar: Durch Erhitzen des Blutes auf 80°C werden beide Faktoren in ausreichender
Menge freigesetzt.
Blutagar: Einfacher Blutagar enthält nur den X – Faktor. Ein üblicher Nährboden enthält nicht
genügend NAD. Manche Bakterien jedoch, z.B. Staph. aureus bilden bei Ihrem Wachstum
ungeheuer viel NAD und sezernieren dies in das Nährmedium. Hämophilus influenzae kann
deshalb in unmittelbarer Nachbarschaft von Staph. aureus - Kolonien wachsen. Dies wird als
Ammenphänomen bezeichnet.
Faktorenplatte: Auf einer Agarplatte ohne Blut, werden Blättchen getränkt mit X-, V- und
X/V – Faktor gebracht. Hämophilus influenzae wächst nur um das X/V – Blättchen.
Kleeblatttest
Auf einer Kochblutplatte wird ein empfindlicher Stamm gegen Ampicillin und Penicillin
ausgespatelt. Im Kreuz wird der resistente Hämophilus Stamm ausgeimpft.
Erklärung:
Mykoplasmen (Myco - pilzähnlich, plasma - verformbar) gram-negativ, da Zellwand-los
Ordnung: Mycoplasmatales,
Familien: Acholeplasmataceae,
Spiroplasmataceae
Mycoplasmataceae (mit den Gattungen Mycoplasma und Ureaplasma)
Besonderheiten: keine Zellwand (ähnlich den L-Formen anderer Bakterien), filtrierbar
resistent gegen zellwandwirksame Antibiotika,
wachsen auf isotonischen Spezial-Nährböden
Infektionen:
M. pneumoniae
Tröpfcheninfektion
Inkubationszeit
primär atypische Pneumonie (10% aller Lungenentzündungen), Infekte des oberen Respirationstrakts;
Pleuritis(Rippenfellentzündung);
Otitis media,
(es handelt sich nicht um einen Keim der Normalflora!)
10-20 Tage.
(fakultativ )pathogen im Urogenitalbereich:
M. hominis
Vaginose, Kolpitis; Neugeborenenmeningitis
M. genitalium
nicht gonorrhoeische Urethritis und Prostatitis
U. urealyticum/
nicht gonorrhoeische Urethritis und Prostatitis, Pyelonephritis
U. parvum
Nierensteine sind hier Infektsteine, die Auskristallisation erfolgt
aufgrund der pH-Änderung bei der Harnstoffspaltung.
M. fermentans incognitus
systemische Infektionen bei AIDS, nektrotische Läsionen
in Herz, Leber, Hirn, etc
Therapie:
Diagnostik:
Nachweis:
Tetrazykline (Mycopl. und Chlamydien), bei Kindern im Falle der
M. pneu-Infektion: Erythromycin;
M. hominis:Erythromycin-resistent,
U. urealyticum: Lincomycin-resistent
PCR
Anzucht in Spezialmedien( zeitaufwändig)
auf Festnährböden: Spiegeleiform,
in Glucosemedium: - M. genitalium/M. pneumoniae
in Argininmedium: - M. hominis
in Harnstoffmedium: - U. urealyticum/U. parvum
Mycoplasmen sind oft unentdeckte Zellkulturkontaminanten!
PCR zum Nachweis Urethritis-relevanter Bakterien
• Ziel: Vervielfältigung Spezies-spezifischer Genabschnitte
• Prinzip einer Polymerasekettenreaktion:
Zyklische Wiederholung (30-40x)
von
1 minute 95°C
 Denaturierung
Aufschmelzen der Nukleinsäurestränge
 Annealing
1 minute 45°C
1 minute 72°C
• Reaktionsansatz:
in 0.5 ml Gefäß
• Temperaturprofil:
Hybridisierung Spezies-spezifischer Primer
 Extension
Verlängerung der Primersequenz in
3‘-Richtung – Synthese des 2. Strangs
50 µl Probe (vorbehandelter Urin)
50 µl 5-fach Probenpuffer + MgCl2 (1)
50 µl dNTPs
(2)
50 µl Primer
(3)
50 µl Taq-Polymerase (thermostabil) (4)
5 min 95°C
1 min 95°C
1 min 54°C
1 min 72°C
bp
40 Zyklen
Pause 4°C
• Analyse:
10 µl + 2 µl Probenauftragspuffer versetzen
und neben Längenstandard
auf 1.5% Agarosegel auftragen
– Elektrophorese bei 50 mA
• Vergleich mit der Positivkontrolle
500
400
300
200
100
Mh
Uu
Mg
Ct
Für Notizen: