10 AMINOSÄUREN UND PROTEINE Zwanzig verschiedene

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AMINOSÄUREN UND PROTEINE
Zwanzig verschiedene Aminosäuren sind die üblichen Bausteine der Proteine. Die DreibuchstabenAbkürzungen und Strukturformeln der Aminosäuren sind auf der umstehenden Tabelle wiedergegeben. Man unterscheidet saure, neutrale und basische Aminosäuren oder apolare (aliphatische,
aromatische) und polare Aminosäuren. In den Proteinen sind die Aminosäuren durch Peptidbindungen
miteinander verknüpft.
Die Aminosäurensequenz (Primärstruktur) bestimmt die dreidimensionale Anordnung der Peptidkette
im Raum (Sekundär- und Tertiärstruktur). Häufig sind zwei und mehr Peptidketten mit ausgebildeter
Sekundär- und Tertiärstruktur zu stabilen oligomeren Molekülen zusammengelagert (Quartär-struktur).
Für die ausführliche Behandlung von Struktur und Konformation der Proteine sei auf Vorlesung und
Lehrbücher verwiesen.
Primäre Aminogruppen von Aminosäuren und Proteinen werden mit der Ninhydrin-Reaktion
nachgewiesen. Ninhydrin reagiert mit Ammoniak und primären Aminogruppen zu einem blauen
Farbstoff.
α-Aminosäuren werden durch Ninhydrin oxidativ desaminiert und decarboxyliert. Auf analoge Weise
reagiert auch die ε-NH2-Gruppe der Lysin-Seitenkette. Deshalb geben auch Proteine eine positive
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Ninhydrinreaktion. Zur quantitativen Bestimmung von Aminosäuren wird die blaue Ninhydrin-Farbe
photometrisch gemessen. Die Trennung verschiedener Aminosäuren mittels IonenaustauscherChromatographie (Chromatographie S. 27 und Exp. 2.4) und anschliessende photometrische Konzentrationsbestimmung mit Ninhydrin wird im sog. Aminosäurenanalysator vollautomatisch durchgeführt
(Fig. 6 S. 30).
Biuret-Test:
Peptidbindungen bilden blau-violette Cu2+-Komplexe. In stark alkalischer Lösung entstehen aus
Proteinen und Kupfersulfat Koordinationskomplexe zwischen Cu2+-Ionen und benachbarten AmidStickstoff-Atomen von Peptidbindungen. Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2) ist die einfachste Verbindung, welche einen derartigen blauvioletten Kupferkomplex bildet. Der Biuret-Test dient zur quantitativen photometrischen Proteinbestimmung (Exp. 4.1). Die Farbe des Komplexes ist in der Regel
unabhängig von der Art des Proteins, so dass eine für Serumalbumin bestimmte photometrische
Eichkurve auch für viele andere Proteine benutzt werden kann (Exp. 4.1 und Photometrie S. 31).
Tryptophan und Tyrosin geben den Proteinen ein charakteristisches UV-Spektrum mit Absorptionsmaximum bei 280 nm. Wie die Spektren in Figur 1 zeigen, trägt Tryptophan am meisten
und Phenylalanin kaum zur Absorption der Proteine im nahen UV-Bereich bei.
εmM
Fig. 1 Absorptionsspektren der
aromatischen Aminosäuren
In Figur 1 bedeutet εmM "millimolarer Extinktionskoeffizient". Der millimolare Extinktions-
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koeffizient ist die Absorption einer millimolaren Lösung der entsprechenden Aminosäure (Photometrie
S. 31). Je nach dem Gehalt an aromatischen Aminosäuren ändert die UV-Absorption von Proteinen.
In Figur 2 sind die UV-Spektren von Lösungen gleicher Massenkonzentration (mg/ml) von Lysozym,
γ-Globulin und Ribonuclease dargestellt. Alle Peptide und Proteine absorbieren sehr stark bei 220
nm aufgrund ihrer Peptidbindungen. Die drei Proteine enthalten unterschiedlich viel Tyrosin und
Tryptophan. Zur Konzentrationsbestimmung kann die UV-Absorption bei 280 nm benutzt werden,
wegen des variablen Gehalts an aromatischen Aminosäuren gilt jedoch eine Eichkurve nur für ein
bestimmtes Protein. Manche Proteine absorbieren sichtbares Licht. Für das sichtbare Absorptionsspektrum sind prosthetische Gruppen verantwortlich (Häm, Flavin, etc.).
Fig. 2
Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehalt
an aromatischen Aminosäuren. Die Spektren wurden mit Proteinlösungen gleicher Konzentration (1 mg/ml) aufgenommen.
Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Protein:
Lysozym (Hühnereiweiss)
Ovalbumin (Hühnereiweiss)
Ribonuclease (Rind)
8.6 Trp
1.3 Trp
-
4.0 Tyr
3.8 Tyr
7.9 Tyr
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Grossmolekulare Proteine werden von kleinen Molekülen durch Dialyse oder Gelchromatographie abgetrennt. Gewisse Cellophanmembranen sind für grosse Moleküle undurchlässig, für Wasser
und andere kleine Moleküle durchlässig. Wird eine Protein-Salzlösung in einem Cellophanschlauch
für längere Zeit (Stunden) in Wasser eingetaucht, so stellt sich für die frei passierbaren Moleküle durch
Diffusion ein Konzentrations-Gleichgewicht über das gesamte Flüssigkeitsvolumen ein. Die grossen
Proteinmoleküle werden im Schlauch zurückgehalten. Der Vorgang wird Dialyse genannt. Durch
Dialyse können Proteinlösungen entsalzt werden (Exp. 3.10, Exp. 5.1), oder ein Protein in einem
Puffer A kann durch Dialyse in einen neuen Puffer B gebracht werden. Die Hämodialyse (künstliche
Niere) arbeitet nach demselben Prinzip. Mit der Gelchromatographie ist eine feinere Trennung von
Molekülen unterschiedlicher Grösse möglich als mit der Dialyse (Exp. 5.1 und 5.4).
Molekularmasse von Proteinen:
Die meisten Proteine haben eine Molekularmasse (Mr) im Bereich 10'000 bis 100'000.
Beispiele:
Glucagon 4'500 (ein Peptid), Ribonuclease 13'700, Myoglobin 17'000, Chymotrypsin 25'000,
Hämoglobin 64'500, Serumalbumin 69'000, Aldolase 160'000, Phosphorylase a 390'000.
Gebräuchliche Methoden zur Molekularmassebestimmung von Proteinen sind Gelchromatographie,
SDS-Gelelektrophorese und Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge. Molekularmassebestimmung mit Gelchromatographie wird im Kapitel "Chromatographie" näher beschrieben (S. 30).
Die heute gebräuchlichste Methode ist die SDS-Gelelektrophorese. Bei dieser speziellen Elektrophoresemethode ist die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld fast ausschliesslich eine Funktion der Molekülgrösse. Proteine mit niedriger Molekularmasse wandern schneller als solche mit hoher
Molekularmasse (SDS siehe S. 17). Die SDS-Gelelektrophorese ist nicht zu verwechseln mit der
üblichen Proteinelektrophorese, bei der native Proteine aufgrund ihrer Ladung getrennt werden
(Elektrophorese S. 27 und Elektrophorese von Serumproteinen in Exp. 4.2).
Die Molekularmassebestimmung in der Ultrazentrifuge ist aufwendig. Sie gibt aber zusätzlich
Information über die Form und den Aggregationszustand von Proteinmolekülen. Im künstlichen
Schwerefeld der Ultrazentrifuge ist die Sedimentationsgeschwindigkeit vs einer Partikel von ihrer
Grösse abhängig gemäss vs = S@Γ. Die Zentrifugalfeldstärke Γ wird bestimmt durch den Radius der
Zentrifuge und die Tourenzahl. S ist die für die untersuchte Partikel charakteristische Sedimentationskonstante, welche experimentell gemäss der obigen Gleichung bestimmt werden kann. S ist unter
anderem eine Funktion der Molekülmasse, und daher kann letzteres aus dem experimentell bestimmten
S berechnet werden. Die Beziehung lautet
S =
M@D (1 - ρm/ρp)
RT
M = Molekularmasse, D = Diffusionskonstante, ρm und ρp = Dichte von Medium und Partikel, RT
= Gaskonstante und absolute Temperatur. Die Sedimentationskonstanten werden in Svedberg-Einheiten (S) (1 Svedberg = 10-13 sec) ausgedrückt und auf ρm von Wasser und 20EC normalisiert (S20,w).
Typische Werte sind 2 S für Myoglobin, 40 S und 60 S für Ribosomen-Untereinheiten, etwa 200 S
für Viren und über 1000 S für ganze Zellen.
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Denaturierung von Proteinen:
Die native Struktur von Proteinen wird unter dem Einfluss verschiedenster Faktoren zerstört, dazu
gehören Wärme, Schaumbildung, Zusatz von organischen Lösungsmitteln, Säuren, Basen,
Schwermetallionen oder hohe Konzentration von Harnstoff. Die für die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verantwortlichen, nicht-kovalenten Bindungen werden teilweise oder ganz gelöst, während
die für die Primärstruktur verantwortlichen kovalenten Bindungen erhalten bleiben. Man bezeichnet
diesen Prozess der partiellen oder vollständigen Entfaltung der Peptidkette als Denaturierung. Ein
denaturiertes Protein hat die gleiche Primärstruktur wie das native, hat aber keine einheitliche
räumliche Struktur und andere physikalisch-chemische Eigenschaften (Beispiel: Hartwerden von Eiern
beim Kochen).
Bei der Denaturierung geht die biologische Aktivität verloren. (Beispiele: Hitze-Inaktivierung von
Enzymen und Proteinhormonen). Denaturierung kann, muss aber nicht reversibel sein.
Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteine. Denaturierte Proteine werden von
Proteasen leichter gespalten als native: gekochtes Fleisch ist leichter verdaulich.
Proteine sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich. Die Löslichkeit der Proteine
variiert stark. Globuläre Proteine wie Serumalbumin und Globuline sind im allgemeinen gut,
Faserproteine (Kollagen, Keratin) sehr schlecht löslich. Proteine sind Polyelektrolyte (Platz 2:
Aminosäuren und Proteine). Elektrostatische Kräfte zwischen Proteinmolekülen einerseits und
zwischen Proteinmolekülen und Wasserdipolen andererseits beeinflussen die Löslichkeit. Proteine
mit vielen geladenen Gruppen sind häufig gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteins ist am
geringsten, wenn seine Gesamtladung gleich Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele
positive wie negative Ladungen trägt. Man bezeichnet den pH-Wert der wässrigen Lösung, bei dem
dies zutrifft, als isoelektrischen Punkt (IEP) des Proteins. Manche Proteine fallen am IEP aus
(= werden unlöslich). Bei pH-Werten über und unter dem IEP bewirken negative bzw. positive
Überschussladungen gegenseitige Abstossung der Proteinmoleküle und damit bessere Löslichkeit.
Fig. 3 Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5.2)
in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 0C. Die Löslichkeit ist bei pH 6 mehr als 40mal grösser als bei
pH 5.2.
Proteine werden aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischen Lösungsmitteln
oder bestimmten Säuren ausgefällt. Zur Isolierung und Reinigung werden Proteine häufig ausgefällt.
Solche Fällungen müssen reversibel sein, soll das Protein seine biologische Aktivität behalten: Ein
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isoliertes Enzym muss nach der Fällung wieder gelöst werden können und unverminderte Aktivität
besitzen. Bei manchen Analysemethoden stören anwesende Proteine; sie werden deshalb irreversibel
ausgefällt und durch Zentrifugation abgetrennt. Eine solche "Deproteinisierung" ist z.B. nötig bei
der Bestimmung von Glucose im Serum (Exp. 5.6).
Die meisten Fällungen beruhen auf der Änderung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen
Proteinmolekülen. So werden Proteine aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von organischen
Lösungsmitteln ausgefällt (Exp. 3.9), weil in organischen Lösungsmitteln die gegenseitige Anziehung
der geladenen Proteinmoleküle grösser wird (Proteine haben ein unregelmässiges Muster von positiven
und negativen Ladungen auf ihrer Oberfläche). Gemäss dem Coulombschen Gesetz über die
Anziehung entgegengesetzt geladener Teilchen nimmt die elektrostatische Anziehung mit
abnehmender Dielektrizitätskonstante des Mediums zu. Organische Lösungsmittel haben eine
niedrigere Dielektrizitätskonstante als Wasser. Industriell bedeutungsvoll ist die Fällung von
Blutplasmaproteinen mit Alkohol und Aceton (Cohn-Fraktionierung). Die Fällung geschieht bei tiefen
Temperaturen, damit die Plasmaproteine nicht irreversibel denaturiert werden.
Zusatz eines Salzes in hoher Konzentration zu einer Proteinlösung bewirkt die Erniedrigung der
effektiven Konzentration (Aktivität) des Wassers und dadurch eine Herabsetzung der für die Lösung
des Proteins verfügbaren Wassermenge. Das Protein wird ausgefällt. Man bezeichnet die durch
Salzzugabe bewirkte Ausfällung als Aussalzung. Sie ist meist reversibel und deshalb zur Isolierung
von Enzymen geeignet. Gewöhnlich wird für die Aussalzung Ammoniumsulfat verwendet, weil es
besonders gut löslich ist. Zur Ausfällung von verschiedenen Proteinen werden unterschiedliche
Konzentrationen von Ammoniumsulfat benötigt. Ein Proteingemisch kann deshalb aufgetrennt werden
durch schrittweises Zufügen von Ammoniumsulfat (Exp. 3.8).
LIPIDE
Die Lipide sind eine heterogene Stoffklasse. Ein hoher Gehalt an hydrophoben Gruppen ist ihnen
gemeinsam. Lipide sind daher in organischen Lösungsmitteln gut, in Wasser schlecht löslich. Die
Lipide können unterteilt werden in einfache Lipide, komplexe Lipide und Isoprenoidlipide. Zu den
einfachen Lipiden gehören die Neutralfette oder Triacylglycerine. Es sind häufige Nahrungsbestandteile und Energiespeicher der Zelle. Zu den komplexen Lipiden werden z.B. die Membranbestandteile
Lecithin, Cerebroside und Cardiolipin gezählt. Die Isoprenoidlipide sind Abkömmlinge des Isoprens
und umfassen Verbindungen wie Cholesterin, Vitamin A, Steroidhormone und Gallensäuren.
Cholesterin ist ein universeller Membranbestandteil, aber auch Ausgangsprodukt für die Biosynthese
von Gallensäuren, Steroidhormonen und Vitamin D.
Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur der Fettsäuren
bestimmt. Die Fette und Öle der Nahrung sind Gemische verschiedener Triacylglycerine. Triacylglycerine sind Verbindungen, die aus einem Molekül Glycerin, verestert mit drei Molekülen Fettsäure,
bestehen. Sie tragen im Gegensatz zu den komplexen Lipiden keine ionisierbaren Gruppen, daher
auch der Name Neutralfette. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Neutralfette sind
je nach Fettsäuren-Zusammensetzung verschieden. So ist der Schmelzpunkt von Fetten um so niedriger, je kürzer die Fettsäuren und je grösser die Zahl der ungesättigten Bindungen. Öle enthalten
vorwiegend Triacylglycerine mit ungesättigten Fettsäuren. Tierische Fette haben einen Schmelzpunkt,
der etwas unter der physiologischen Gewebstemperatur liegt. Fett aus dem Unterhautfettgewebe hat
einen niedrigeren Schmelzpunkt als Fett aus dem Innern des Körpers.