Die PCR-Diagnostik invasiver Mykosen
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Die PCR-Diagnostik invasiver Mykosen Dr.med. Ralf Bialek Institut für Tropenmedizin, Universitätsklinikum Tübingen Verbreitungsgebiete der Histoplasmose Kultur- und 18S rDNA-PCR-Ergebnisse zum Nachweis von H. capsulatum in Mausgewebeproben PCR pos PCR neg Gesamt Kultur pos 66 7 74 Kultur neg 47 199 245 Gesamt 113 206 319 Histoplasma Histoplasma capsulatum capsulatum 18S 18S PCR PCR Vergleich PCR versus Kultur im Mausmodell ◆ Hoch signifikanter Unterschied (p < 0,0001) PCR 3- bis 17-fach sensitiver als Kultur (Bialek et al., J Clin Microbiol 2001; 39:1506-1509) Histologische Diagnostik versus PCR 30 Milzproben infizierter Mäuse Hämatoxylin-Eosin Färbung ¾ Grocott Färbung ¾ Fungiqual A Fluoreszenzfärbung ¾ Immunhistologie mit Anti-BCG Antikörper ¾ 18S rDNA nested PCR ¾ 10 µm 1 0.9 Probability of a positive result 0.8 Immunostain 0.7 Grocott´s stain 0.6 PCR Fluorochrome stain Hematoxylin eosin stain 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 .1 1 10 100 1000 10000 Colony forming units of Histoplasma capsulatum /mg spleen Bialek et al., Am J Clin Pathol 2002; 117: 597- 603 Evaluation in menschlichen Untersuchungsmaterialien Paraffin-eingebettete Gewebeproben von 100 Patienten aus Zimbabwe 50 mit histologisch nachgewiesener H. capsulatum Infektion 50 Histoplasmose negativ PCR-Ergebnisse zum Nachweis von H. capsulatum DNA in Gewebeproben Histologie: Histoplasmose Pos (50) Neg (50) GAPDH pos H. capsulatum PCR pos 29 26 33 18 Histoplasma Histoplasma capsulatum capsulatumPCR PCR Ergebnisse der Sequenzierung z Histoplasmose-positive Biopsien 20 x H. capsulatum, 6 x Euascomycetes z Histoplasmose-negative Biopsien 18 x Euascomycetes (6 in GAPDH-negativen DNA-Extrakten) PCR-Diagnostik Zielsequenz: Ribosomale RNA Gene 0 NACHTEILE / Homologie zu nicht-fungaler und humaner rDNA / Kreuzreaktionen mit ubiquitär vorkommenden Pilzsporen 0Zielsequenz-Alternativen? PCR-Ergebnisse zum Nachweis von H. capsulatum DNA in Gewebeproben Histologie: Histoplasmose Pos (50) Neg (50) GAPDH pos 29 33 H. capsulatum 100 PCR pos 20 0 H. capsulatum PCR pos 20 (+6) 0 (+18) (Bialek et al., J Clin Microbiol 2002; 40: 1644-1647 PCR PCR Diagnostik Diagnostik invasiver invasiver Mykosen Mykosen Der DNA-Nachweis von Erregern systemischer Mykosen in klinischen Untersuchungsmaterialien mittels PCR ist bei Wahl der Zielsequenz in Genen spezifischer Proteine sensitiv und spezifisch PCR PCR Diagnostik Diagnostik invasiver invasiver Mykosen Mykosen Bei Wahl der Zielsequenz in konservierten Genen von Erregern invasiver Mykosen ist eine große Rate falsch-positiver Befunde durch unspezifische Amplifikationen in potenziell mit Pilzen kontaminierten Materialien zu erwarten! Cryptococcus neoformans 18S rDNA nested PCR ¾ ¾ Kreuzreaktionen mit 12 von 32 verwandten Tremellomycetidae, davon wiesen 6 eine 100%ige Homologie der amplifizierten 278 bp Region auf (Bialek et al., Clin Diagn Lab Immunol 2002; 9:461-469) Aspergillus fumigatus 18S rDNA PCR ¾ 17 KMT-Kindern im Alter von 1 - 108 Monaten ¾ 71 Serumproben mittels Platelia Antigen Test und retrospektiv mittels PCR untersucht Aspergillus fumigatus 18S rDNA PCR ¾ Spezifische DNA in 8 Antigen-positiven und 2 Antigen-negativen Serumproben ¾ EORTC-Kriterien: 3 mögliche IA-Fälle, bei 14 Kindern Ausschluss einer IA ¾Positiver Vorhersagewert: 20% für Antigentest und 18S rDNA PCR ¾ Hohe Rate falsch-positiver Ergebnisse bei KMT-Kindern (Bialek et al., Eur J Med Res 2002; 7:177-180) University of Texas Health Science Center at San Antonio Laura Najvar, J. R. Graybill, Annette Fothergill, M. G. Rinaldi University of Zimbabwe, Harare Uniklinik Frankfurt/Main Rolf Hohle, Valerie J. Robertson Gudrun Just-Nübling V. Rickerts, V. Jacobi Hopital Necker, Institut Pasteur, Paris D. Moshous, JL Casanova, S. Blanche, C. Hennequin Med. Mikrobiologie, Universität Regensburg Udo Reischl Anna Cascante, Friedericke Ernst, Antje Feucht, Jörg Fischer, Aida Ibricevic Christian Aepinus, Dominik Begerow, Klaus Dietz, Michael Weiß Walter Deschle, Tanja Herrmann, Sonja Jauch, Oliver Schneider, Ulrike Zelck Tübingen Prof. Dr. Jürgen Knobloch
