Borrelia burgdorferi - medac

Borrelia burgdorferi
Gesellschaft für klinische Spezialpräparate
Theaterstraße 6
D-22880 Wedel
Telefon:
Fax:
04103/8006-0
04103/8006-359
www.medacshop.de
e-mail: [email protected]
Auftragsannahme:
Telefon
Fax
04103/8006-111
-113
Produktmanagement:
Telefon
Fax
04103/8006-351
-359
Borrelia-Serologie und
Serum-Liquor-Diagnostik
von medac
Diagnostik mit Augenmaß
12
Stand 09/2011
BOR 1
Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH GE Diagnostika Theaterstrasse 6
Telefon 04103/8006-0 Fax 04103/8006-359 www.medac.de
D-22880 Wedel
Bedeutung
Borrelia-Serologie von medac
Literatur
Die Lyme Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Erkrankung
der nördlichen Hemisphäre. Es handelt sich hierbei um eine multisystemische
Erkrankung mit unterschiedlicher Symptomatik, in Abhängigkeit von den
befallenen Organsystemen (Haut, Nervensystem, Gelenke) und vom
Krankheitsstadium.
Reiber, H., Felgenhauer, K.: Protein transfer at the blood cerebrospinal
fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within
the central nervous system.
Clin Chim Acta. 319-328 (1987)
Als potentielle Krankheitserreger sind für Europa im wesentlichen vier
Genospezies des zu den Spirochäten gehörenden Bakteriums Borrelia
burgdorferi sensu lato beschrieben (B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii,
B. garinii und B. spielmanii). Die Übertragung der Erreger auf den Menschen
erfolgt während der Blutmahlzeit infizierter Zecken.
Das Risiko einer Infektion mit B. burgdorferi nach Zeckenkontakt liegt in
Deutschland bei 2-3 %. Die Seroprävalenz bei Erwachsenen beträgt in
Abhängigkeit von Alter, Wohnort und Exposition zwischen 5 und 25 %. Die
Anzahl der jährlichen Neuerkrankungen ist regional und klimabedingt
unterschiedlich und wird für Deutschland mit 25 bis > 100 Fälle pro 100.000
Einwohner mit steigender Tendenz angegeben.
Krankheitsbilder
In mehr als 25 % der Fälle verläuft eine Borrelieninfektion klinisch unauffällig
und selbstlimitierend.
Bei klinisch apparenten Verläufen kommt es kurz nach der Infektion vermehrt
zur lokalen Ausbreitung der Erreger in der Haut mit entzündlicher Reaktion.
Zeitlich verzögert können die Borrelien über den lymphogenen und hämatogenen Weg in verschiedene Organe gelangen und dort entsprechende
klinische Krankheitsbilder ausprägen. Die Erkrankungen manifestieren sich
individuell unterschiedlich. Meist ist jedoch bevorzugt ein Organsystem
betroffen.
Klinische Manifestationen - Häufigkeit des Auftretens:
Haut
●
●
●
2
Erythema migrans
Borrelienlymphozytom
Acrodermatitis chronica atrophicans
Storch-Hagenlocher, B., Reiber, H., Wildemann, B.,
Otto, M.:
Liquordiagnostik.
in: Neurologische Labordiagnostik, Wildemann, B., Oschmann, P., Reiber, H.
(Hrsg.): Georg Thieme Verlag Stuttgart, 30-73 (2006)
Strle, F., Stanek, G.: Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme
Borreliosis.
in: Lyme Borreliosis. Curr Probl Dermatol 37, Lipsker, D., Jaulhac, B. (eds.):
Karger Basel, 51-110 (2009)
Wilske, B., Zöller, L., Brade, H., Eiffert, U.B., Stanek, G., Pfister, H.-W.:
Quality Standards for the Microbiological Diagnosis of Infectious
Diseases.: Lyme Borreliosis. (MIQ 12)
Urban und Fischer München (2000)
Wilske, B.: Epidemiology and diagnosis of Lyme borreliosis.
Annals of Medicine 37, 568-579 (2005)
Wormser, G.P., Nowakowski, J., Nadelmann, R.B. et al.: Impact of Clinical
Variables on Borrelia burgdorferi-Specific Antibody Seropositivity in
Acute Phase Sera from Patients in North America with CultureConfirmed Early Lyme Disease.
Clin Vaccine Immunol 15 (10), 1519-1522 (2008)
60 - 90 %
≤2%
≤1%
Nervensystem
●
Frühe Neuroborreliose
●
Chronische Neuroborreliose
<5%
extrem selten
Bewegungsapparat
●
Lyme-Arthritis
5%
Herz
●
<1%
Karditis
Reiber, H.: Liquordiagnostik.
in: Klinische Neurologie, Berlit,P.(Hrsg.): Springer Verlag, Heidelberg, 148177 (1999)
11
Literatur
Borrelia-Serologie von medac
Aguero-Rosenfeld, M.E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. P.: Diagnosis
of Lyme Borreliosis.
Clin Microbiol Rev 18 (3), 484-509 (2005)
Die Lyme Borreliose wird in erster Linie klinisch diagnostiziert. Kriterien wie
gesicherter Zeckenkontakt und typische klinische Bilder sind entscheidende
Faktoren für die Diagnosestellung und für die Interpretation von mikrobiologischen/ serologischen Laborergebnissen.
Aguero-Rosenfeld, M.E.: Lyme Disease: Laboratory Issues.
Infect Dis Clin N Am 22, 301-313 (2008)
Goettner, G., Schulte-Spechtel, U., Hillermann, R., et al.: Improvement of
Lyme Borreliosis Serodiagnosis by Newly Developed Recombinant
Immunoglobulin G (IgG) and IgM Line Immunoblot Assay and Addition of
VlsE and DbpA Homologues.
J Clin Microbiol 43 (8), 3602-3609 (2005)
Hofmann, H.: Lyme Borreliose. Kutane Manifestationen.
Hautarzt 56 (8), 783-796 (2005)
Jobe, D.A., Lovrich, S.D., Asp, K.E. et al.: Significantly Improved Accuracy
of Diagnosis of Early Lyme Disease by Peptide Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay Based on the Borreliacidal Antibody Epitope of
Borrelia burgdorferi OspC.
Clin Vaccine Immunol 15 (6), 981-985 (2008)
Kaiser, R., Fingerle, V.: Neuroborreliose.
Nervenarzt 80 (10), 1239-1251 (2009)
Krause, A., Fingerle, V.: Lyme Borreliose.
Z Rheumatol 68 (3), 239-254 (2009)
Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Neurologie zur Neuroborreliose,
2008
Diagnostik
Der Erregernachweis (PCR, Kultur) ist auf Grund seiner begrenzten
diagnostischen Sensitivität auf wenige spezielle Fragestellungen begrenzt.
Darüber hinaus muß ein positives PCR-Ergebnis bezüglich seiner Spezifität
abgesichert werden.
Für die Absicherung der klinischen Diagnose wird eine serologische Stufendiagnostik empfohlen (gem. Nationalem Referenzzentrum für Borrelien).
Antikörperdiagnostik
1. Als erster Schritt (Screening-Methode) erfolgt die Bestimmung von
IgM- und IgG-Antikörpern mit Enzymimmunoassays, die eine
optimale Sensitivität und Spezifität haben sollten.
Suchtest*:
IgG-ELISA und IgM-ELISA
Bei Verdacht auf Neuroborreliose: Liquor/Serum-Paar vom selben Tag auf intrathekale
Antikörper untersuchen (AI-Bestimmung)
positiv oder
grenzwertig
2. Stufe
Bestätigungstest:
Immunoblot
negativ
Keine weiteren Teste im aktuell vorliegenden Serum.
Bei kurzer Krankheitsdauer serol. Verlaufskontrolle.
* Screening mit polyvalentem Test (z. B. HAT) möglich, danach Ig-Klassendifferenzierung
Mathiesen, M.J., Christiansen, M., Hansen, K. et al.: Peptide-Based OspC
Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Serodiagnosis of Lyme
Borreliosis.
J Clin Microbiol 36 (12), 3474-3479 (1998)
Mathiesen, M.J., Holm, A., Christiansen, M. et al.: The Dominant Epitope of
Borrelia garinii Outer Surface Protein C Recognized by Sera from
Patients with Neuroborreliosis Has a Surface-Exposed Conserved
Structural Motif.
Infect Immun 66 (9), 4073-4079 (1998)
Nau, R., Christen, H.-J., Eiffert, H.: Lyme Disease-Current State of
Knowledge.
Dtsch Arztebl Int 106 (5), 72-82 (2009)
Stanek, G., Strle, F.: Lyme borreliosis: a European perspective on
diagnosis and clinical management.
Curr Opin Infect Dis 22, 450-454 (2009)
10
2. Bei positiven oder grenzwertigen IgM- und/oder IgG-Ergebnissen
erfolgt in einem zweiten Schritt eine Bestätigungsdiagnostik mittels
Immunoblots auf der Basis rekombinanter Proteine.
Bestätigungstest:
IgG-Immunoblot und IgM-Immunoblot
positiv
grenzwertig
negativ
positiver
serol. Befund
grenzwertiger
serol. Befund
negativer
serol. Befund
- Bei weiter bestehendem klinischen Verdacht und kurzer
Krankheitsdauer serologische Verlaufskontrolle
- Bei weiter bestehendem klinischem Verdacht und längerer
Krankheitsdauer Indikationen prüfen für:
- serologische Verlaufskontrolle
- Einsatz zusätzlicher serologischer Verfahren
(z. B. Verwendung anderer Borrelia-Spezies als
Blot-Antigen)
3
Borrelia-Serologie von medac
Borrelia-Serum-Liquor-Diagnostik
Die Bestimmungsraten für Serum-Antikörper bei den jeweiligen Organmanifestationen sind:
Die Bestimmung der intrathekalen Borrelia-spezifischen Antikörpersynthese
ist ein wichtiger Bestandteil bei der differentialdiagnostischen Abklärung der
Verdachtsdiagnose einer Neuroborreliose. Die ermittelten erregerspezifischen Antikörperindices sind dabei stets im Zusammenhang mit den
typischen Entzündungsparametern im Liquor sowie der Beurteilung der
Schrankenfunktion zu betrachten.
● 20-50 % für Stadium I
● 70-90 % für Stadium II
● 100 % für Stadium III
(E. migrans - lokalisiert)
(E. migrans - multiple Läsionen,
Neuroborreliose, Lymphozytom, Karditis)
(Acrodermatitis, Lyme Arthritis)
Ein negatives serologisches Ergebnis in einem frühen Infektionsstadium
schließt eine Erkrankung nicht aus. Bei begründetem Verdacht auf eine
Borreliose sollten in diesen Fällen serologische Verlaufskontrollen durchgeführt werden.
Berechnung der AU-Werte wie unter Borrelia-IgM/-IgG beschrieben.
Bedeutung
Auswertung
Berechnung des erregerspezifischen IgM-/IgG-Quotienten (Qspez):
Sowohl Borrelia-IgG- als auch -IgM-Antikörper können nach erfolgreicher
Therapie noch längere Zeit persistieren. Ein positives IgM ohne nachweisbares IgG schließt eine späte Manifestation der Erkrankung in der Regel
aus.
Qspez
AU Liquor x Verdünnung Liquor
AU Serum x Verdünnung Serum
Berechnung des Antikörperindex (AI):
Prophylaxe
Therapie
medacTestvorteile
Eine wirksame Immunprophylaxe gegen Borrelia burgdorferi durch
entsprechende Impfungen ist bisher nicht verfügbar.
Die Vermeidung der Exposition, der Schutz durch geeignete Kleidung und die
Verwendung von Repellentien sind praktikable Maßnahmen zur Verhinderung einer Borrelieninfektion.
Eine Antibiotika-Prophylaxe nach Zeckenstich ohne diagnostische
Bestätigung einer Infektion ist nicht empfohlen.
Nach gesicherter Diagnose sind die klinischen Manifestationen von Borrelieninfektionen mittels Antibiotika-Therapie meist sehr gut beherrschbar. Die
Therapien werden stadien- und symptomorientiert entsprechend den Empfehlungen oder Leitlinien der zuständigen medizinischen Fachgesellschaften
durchgeführt.
Die Erkrankungen können bei einem intakten Immunsystem des betroffenen
Patienten auch spontan ausheilen.
Qspez / Qges
(für Qges < Qlim)
2. AI
Qspez / Qlim
(für Qges > Qlim)
3. Qlim
0,67 x
Qalb + 120 x 10 - 7,1 x 10 für IgM
Qlim
0,93 x
Qalb + 6 x 10 - 1,7 x 10
2
2
-6
-6
-3
-3
für IgG
AI-Werte von 0,6 - 1,3 gelten als normal.
Interpretation
AI-Werte > 1,3 und ≤ 1,5 gelten als grenzwertig.
AI-Werte < 0,6 weisen auf analytische Fehler hin und sind nicht interpretierbar.
Der pathologische Bereich ist festgelegt mit AI > 1,5.
Der Borrelia-IgM-ELISA medac ist ein Nachweissystem zur quantitativen
Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi. Die Verwendung hochkonservierter VlsE- und OspC-abgeleiteter Peptide ermöglicht
einen sensitiven und spezifischen Genospezies-unabhängigen Antikörpernachweis.
Durch die IgG/RF-Absorption werden falsch-positive und unspezifische
Reaktionen im IgM-Testsystem vermieden.
Der Borrelia-IgG-ELISA medac ist ein Nachweissystem zur quantitativen
Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi. Das als Antigen
eingesetzte VlsE-Peptid ermöglicht eine Genospezies-übergreifende hochsensitive und spezifische Bestimmung von Antikörpern.
4
1. AI
Im Frühstadium einer Neuroborreliose schließt ein normaler Antikörperindex eine Infektion nicht aus, so dass bei eindeutiger Symptomatik, dem
Nachweis von Entzündungsparametern, einem erhöhten Plasmazellanteil und einer positiven Borrelia-Serologie eine therapeutische Intervention angezeigt sein kann.
Intrathekale Borrelia-Antikörper können über lange Zeiträume persistieren. Ohne gleichzeitig nachgewiesene Entzündungsmerkmale im
Liquor ist ein pathologischer Antikörperindex daher nicht als Indikator für
eine aktive Infektion zu interpretieren.
9
Borrelia-Serologie von medac
Auswertung
Borrelia-IgM/
Borrelia-IgG
Borrelia-Serologie von medac
Die photometrische Auswertung erfolgt bei 450 nm als Meßwellenlänge
(620-650 nm als Referenzwellenlänge).
Bei beiden Borrelia-ELISA medac wurde das Prinzip der Einpunktquantifizierung umgesetzt. Zusätzliche Standardkurven sind daher nicht erforderlich.
Die OD des Leerwertes wird von allen OD-Werten subtrahiert.
Die Borrelia-ELISA medac sind für die Serum-Liquor-Diagnostik evaluiert. Die
Tests ermöglichen den Nachweis einer Borrelia-spezifischen intrathekalen
IgM- bzw. IgG-Antikörpersynthese über die Ermittlung eines erregerspezifischen Antikörperindex in Serum-Liquor-Paaren.
Die OD der Negativen Kontrolle muß < 0,150 betragen.
Der OD-Mittelwert des Kalibrators muß oberhalb des Grenzwertes und
der Unit-Wert der Positiven Kontrolle muß innerhalb des Sollwertbereiches gemäß chargenspezifischem Datenblatt liegen.
Korrektur der Meßergebnisse:
ODkorrigiert =
Die Tests sind gemäß der europäischen Richtlinie 98/79 EG über In-vitroDiagnostika CE-zertifiziert.
OD-Sollwert des Kalibrators
x ODgemessen
OD-Meßwert des Kalibrators
Quantifizierung der Meßergebnisse:
Konzentration AU/ml
b/
( OD a
-1
korrigiert
Borrelia-IgM
Cut-off
Cut-off
)
● Einfaches Handling - Einheitliche Abarbeitung und Inkubationsbedingungen
● Gebrauchsfertige Reagenzien
● Brechbare Mikrotiterstreifen (Einzelkavitäten)
● Einsetzbar auf offenen Mikrotiterplatten-Automatensystemen
● Farbcodierte Reagenzien zur Vermeidung von Pipettierfehlern
14 AU/ml
Grenzbereich
Borrelia-IgG
Die Borrelia-ELISA medac ermöglichen die gleichzeitige Abarbeitung von
Seren und Liquores. Eine zusätzliche Standardkurve für die Serum-LiquorDiagnostik ist nicht erforderlich.
12,6 -15,4 AU/ml
12 AU/ml
Grenzbereich
Es wurden 100 Seren von Blutspendern im Vergleich zu einem MitbewerberELISA untersucht. Dabei wurde für Borrelia-IgM eine Prävalenz von 1 %
(Mitbewerbertest 2 %) und für Borrelia-IgG eine Prävalenz von 7 %
(Mitbewerbertest 5 %) ermittelt.
Anforderungen
Seroprävalenz
10,8 -13,2 AU/ml
Borrelia-IgM
Interpretation
Mitbewerber-ELISA (n
Proben mit Werten unterhalb des Grenzbereiches werden als NEGATIV
bewertet.
Proben mit Werten innerhalb des Grenzbereiches werden als
GRENZWERTIG bewertet.
Werte im Grenzbereich sollten kontrolliert werden, indem nach 14 Tagen
eine zusätzliche Patientenprobe entnommen wird, die zusammen mit der
ersten Probe auf eine Titerbewegung untersucht wird.
Borrelia-IgMELISA medac
negativ
grenzwertig
positiv
Summe
grenzwertig
2
1
0
3
positiv
1
0
1
2
Summe
98
1
1
100
Borrelia-IgG
Proben mit Werten oberhalb des Grenzbereiches werden als POSITIV
bewertet.
Mitbewerber-ELISA (n
Borrelia-IgGELISA medac
8
negativ
95
0
0
95
100)
negativ
grenzwertig
positiv
Summe
negativ
90
1
1
92
grenzwertig
2
0
1
3
100)
positiv
0
0
5
5
Summe
92
1
7
100
5
Sensitivität
und
Spezifität
Borrelia-Serologie von medac
Borrelia-Serologie von medac
Sensitivität und Spezifität der medac-Tests wurden im Vergleich zur Sollbewertung ermittelt. Die Festlegung der Sollbewertung erfolgte in Anlehnung
an die Qualitätsstandards zur mikrobiologischen Diagnose der Lyme
Borreliose (MiQ 12) durch Kombination eines Mitbewerber-ELISA und eines
Western-Blots.
Im ELISA und Western-Blot grenzwertig bestimmte Proben wurden eliminiert
und bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
Borrelia-IgM-ELISA medac
Borrelia-IgG-ELISA medac
Borrelia-IgM
Sollbewertung (n
Borrelia-IgMELISA medac
negativ
grenzwertig
positiv
Summe
negativ
154
2
11
167
grenzwertig
0
0
0
0
322)
positiv
36
5
114
155
Summe
190
7
125
322
Probenverdünnung
Waschpuffer 1:10
für Serum: IgG
für Serum-Liquor: IgG
100 ml
900 ml
Aqua ad
iniectabilia
Waschpuffer
(10x)
Probenverdünnungspuffer
Probenverdünnungspuffer
IgG =
1:250
74 %
92 %
für Serum: IgM
für Serum-Liquor: IgM
Borrelia-IgGELISA medac
Sensitivität:
Spezifität:
negativ
116
0
18
134
96 %
87 %
grenzwertig
0
0
0
0
RFAbsorbens
Probenverdünnungspuffer
Serum
1:100*
Summe
121
2
167
290
** Endverdünnung 1:5
IgM, IgG: Kontrollen, Kalibrator,
verdünnte Proben
Platte 3 x waschen
Inkubation bei 37°C,
feuchte Kammer
60 min
entleeren und ausklopfen
Übereinstimmung: 91 %
Inkubation bei 37°C,
feuchte Kammer
IgG: Konjugat
je 50 μl*
60 min
Kombination von medac-IgM- und IgG-Ergebnissen im Vergleich zu den definierten Sollbewertungen:
Sollbewertung (n
negativ
grenzwertig
positiv
Summe
negativ
48
1
11
60
grenzwertig
0
0
0
0
297)
positiv
5
0
232
237
Testablauf
je 200 μl
je 50 μl
je 50 μl*
BorreliaIgM/IgGELISA medac
Liquor
1:4 **
RFAbsorbens
* Endverdünnung 1:150
290)
positiv
5
2
149
156
1:100*
IgM: Konjugat
Kombination
IgM/IgG
+25 Vol%
Übereinstimmung: 83 %
Sollbewertung (n
negativ
grenzwertig
positiv
Summe
Liquor
1:5
+50 Vol%
Probenverdünnungspuffer
Borrelia-IgG
Serum
1:250
Probenverdünnung
+50 Vol%
Sensitivität:
Spezifität:
Ansatz
Kat.-Nr. 201
Kat.-Nr. 202
* bei automatischer Abarbeitung 60 μl
Summe
53
1
243
297
Platte 3 x waschen
Inkubation bei 37°C,
im Dunkeln, feuchte Kammer
TMB-Substrat
je 200 μl
je 50 μl
30 min
entleeren und ausklopfen
Sensitivität:
Spezifität:
98 %
80 %
Übereinstimmung: 94 %
Stopplösung (0,5 M H2SO4)
Photometrieren
O.D.
je 100 μl
Die medac-Tests ermöglichen eine spezifische und sensitive
Borrelia-Antikörperbestimmung und gewährleisten in Kombination
eine zuverlässige Interpretation des Serostatus im Rahmen des
Screenings der Borrelia-Stufendiagnostik.
6
450 nm
Referenz
620 - 650 nm
7