Absorptionsmessungen in Mikrotiterplatten - biomed

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wissenschaft & praxis
Aufgrund der demografischen Entwicklung wird es immer schwieriger, die medizinische Versorgung in hoher
Qualität dauerhaft zu gewährleisten – so auch in der Schlafmedizin. Um dem entgegenzutreten, ist es notwendig, innovative flexible Konzepte wie das Telemonitoring der PatientInnen mittels Telecare-Systemen einzusetzen. Ein auf diesem Konzept basierendes System ermöglicht, dass ein chronisch erkrankter Mensch und sein betreuender Arzt bzw.
seine betreuende Ärztin regelmäßig in Kontakt bleiben. Telemonitoring geht auf elektronischem Weg vonstatten. Das
System liefert gesundheitsrelevante Daten und Zahlen, filtert Informationen, macht Grenzwert- sowie Trendanalysen
und bietet Auswertungen für ÄrztInnen in kurzer Zeit in
greifbarer grafischer Form an (Van den Berg, et al. 2009).
Die Anwendung verschiedener Formen der Telemedizin wird künftig an Bedeutung gewinnen, so auch in der
Schlafmedizin. Versorgungsforschungsprojekte können
diesbezüglich helfen, ökonomische Notwendigkeiten für
solch ein Vorgehen zu evaluieren. n
MMaga Ute Maurer
Literatur
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DOI 10.1007/s00347-009-1961-x.
Absorptionsmessungen in Mikrotiterplatten
Evaluierung unterschiedlicher Methoden zur Bestimmung der optischen Pfadlänge
Ich habe meine Bachelorarbeit beim Unternehmen Tecan® Austria geschrieben. Dort durfte
ich eine wundervolle Zeit verbringen, mein
Praktikum absolvieren und äußerst sympathische MitarbeiterInnen kennenlernen. Sie stellten mir Aufgaben, die ich innerhalb von acht Wochen zu
lösen versuchte.
Einleitung
Die Problemstellung war folgende: Absorptionsmessungen, die in Küvetten durchgeführt werden, beinhalten gleiche Gegebenheiten. Messungen in Mikrotiterplatten hingegen zeigen variable Bedingungen. Ich sollte zwei Methoden
testen, welche die variablen Bedingungen in Mikrotiterplatten standardisieren können. Dazu setzte ich mich zuallererst mit der Bedienungsanleitung des Plattenreaders und der
dazugehörigen Software auseinander. Es war für mich neu
und spannend, einmal die Entwicklungsseite anstatt der AnwenderInnenseite im Labor kennenzulernen. Es ging darum,
softwareseitig alle Einstellungen für die Messung tätigen zu
können, als „Neukundin“ alle Möglichkeiten des Geräts
auszuschöpfen und zu bewerten, dabei an das Marketing
zu denken, im Team und mit anderen Abteilungen zu kommunizieren und neue Lösungsansätze zu kreieren.
Die UV/VIS-Spektroskopie ist eine wichtige Messtechnik in der Bioanalytik, weil viele Testansätze auf der Absorptionsmessung basieren. Viele dieser Messungen finden
in Probengefäßen wie Küvetten oder Mikrotiterplatten statt.
Obwohl Küvetten wiederverwendet werden können beziehungsweise es billige Einmalküvetten gibt, ermöglichen sie
nur einen geringen Probendurchsatz. Demzufolge werden
Mikrotiterplatten bevorzugt. Aufgrund des Designs der Mikrotiterplatte ist es aber ausschließlich möglich, die Proben
mit vertikalen Lichtstrahlen zu messen (Abb. 1). Durch diese
Messtechnik ist die optische Pfadlänge vom Füllvolumen abhängig und variabel und nicht konstant wie bei einer Messung in einer Küvette (Abb. 2). Die Absorptionsmessung ist
im Labor aber eine unerlässliche Methode und Versuchsprotokolle, bei denen Plasmid-, Virus- oder Genommaterial eingesetzt wird, erfordern das Wissen über die eingesetzte Menge der DNA bzw. RNA. Aus diesem Grund wurden
Methoden entwickelt, um die optische Pfadlänge in Mikrotiterplatten bestimmen zu können. Mit der ermittelten op-
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tischen Pfadlänge ist es dann möglich, den gemessenen Absorptionswert auf einen Zentimeter normieren und somit
vergleichbar machen zu können.
Abbildung 2: Absorptions­
messung in einer Küvette
© Andreas Hauch
Abbildung 1: Absorptionsmessung
in einer Mikrotiterplatte
Relevanz der Pfadlängenbestimmung bei
Absorptionsmessungen
Grundsätzlich gibt es eine einfache Methode, um trotz
Messung in einer Mikrotiterplatte die Bestimmung der optischen Pfadlänge umgehen zu können. Dafür muss bei jeder
Messung eine Standardreihe mitgeführt werden. Dieser Ansatz ist allerdings zu zeitaufwändig. Für DNA- und RNAQuantifizierungen gibt es auch noch andere Lösungen. Beispielsweise bieten Tecan® Austria die NanoQuant-Platte™
und Thermo Scientific die Geräteserie NanoDrop™ an. Beide Modelle arbeiten mit einer fixen optischen Pfadlänge,
die durch eine festgelegte Höhe der Probensäule garantiert
wird. Diese Arbeitsweise bietet aber nur eine schlechte Automation.
In der Bachelorarbeit wurden zwei etablierte Methoden
evaluiert, mit Hilfe derer die optische Pfadlänge bei Absorptionsmessungen in Mikrotiterplatten bestimmt werden
kann. Die zwei Methoden sind einerseits eine mathematische Methode und andererseits eine von dem Unternehmen
Molecular Devices Corp. patentierte Methode.
Die mathematische Methode
Bei der mathematischen Methode geht es darum, die
Füllstandhöhe der pipettierten Flüssigkeit zu berechnen. Das
funktioniert mittels geometrischen Formeln. Wells in Mikrotiterplatten sind entweder zylinder- oder quaderförmig
(Abb. 3). Davon sind die Gesamthöhe (H), das pipettierte
Volumen (V) und der Durchmesser (d) beziehungsweise die
Seitenlänge (a) bekannt. Verwendet werden dafür die Volumenformeln von Zylindern beziehungsweise Quadern. Mit
den bekannten Größen kann die Höhe (h) des pipettierten
Volumens berechnet werden.
Abbildung 3: Anwendung der mathematischen Formel bei Verwendung von zylinder- und quaderförmigen Wells
Doris Rieder bei der Arbeit
Die patentierte Methode
Die patentierte Methode (PathCheck®-Methode) von
Molecular Devices Corp. ermittelt mithilfe von Referenzmessungen von Wasser die Pfadlänge. Dafür wird Wasser
in einer Küvette bei einer Wellenlänge von 998 Nanometer gemessen. Außerdem wird die Probe in einer Mikrotiterplatte bei dessen Absorptionsmaximum und zusätzlich
bei 998 Nanometer gemessen. Man geht dabei davon aus,
dass sich auch in der Probe etwas Wasser befindet. Damit
sind die optische Dichte des Wassers und der Probe bekannt
und ebenso die optische Pfadlänge von Wasser. Mit diesen
Werten kann die optische Pfadlänge der Probe mit Hilfe einer Schlussrechnung ausgerechnet werden. Das Absorptionsmaximum von Wasser befindet sich eigentlich bei 977
Nanometer und nicht bei 998 Nanometer. Allerdings ist
die Messung bei 977 Nanometer temperaturabhängig. Eine konstante Temperatur ist im Labor jedoch nicht immer
garantierbar. Wie in der Literatur gefunden und bei einer
Spektrumsmessung von Wasser bei unterschiedlicher Temperatur bewiesen, wurde ersichtlich, dass bei 998 Nanometer die Messung temperaturunabhängig ist und die Wellenlänge trotzdem immer noch im Bereich des Maximums liegt
(Abb. 4, Seite 18). Ein weiterer entscheidender Vorteil der
Referenzmessung von Wasser ist jener, dass genau dort, wo
Wasser sein Absorptionsmaximum hat, die meisten anderen
Moleküle keine Absorption zeigen.
Material und Methoden
Nachdem ich den Plattenreader, die Software und die
Methoden bis ins kleinste Detail studiert hatte, ging es darum, das Praktikum und die Experimente zu planen. Mein
Betreuer Dr. Christian Oberdanner und ich bereiteten grob
die Versuche vor. Mit seiner Expertise half er mir, geeignete Proben und Mikrotiterplatten auszusuchen. Nach der
genauen Zeit- und Ressourcenplanung begann ich mit der
Arbeit. Die beiden Methoden wurden mit unterschiedlichen
Lösungen getestet, um verschiedene Bedingungen zu prüfen.
Beispielsweise wurde mit unterschiedlichen Viskositäten experimentiert, indem als Lösungsmittel Ethanol und Glycerin
verwendet wurden. Außerdem wurden Lösungen benützt,
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Abbildung 4: Spektrum von Wasser
deren Absorptionsmaximum im UV- oder VIS-Bereich lagen. Ebenso wurden unterschiedliche Mikrotiterplatten –
384-well, 96-well und 96-well-half-area – getestet. Die Lösungen wurden in Küvetten und in alle Wells der getesteten
Mikrotiterplatten pipettiert. Anschließend wurde die optische Dichte in beiden Probengefäßen im selben MultimodeReader (Tecan® Infinite M200 Pro) gemessen. Nach der
Normierung auf einen Zentimeter mit den beiden Methoden wurde die prozentuelle Abweichung des jeweiligen Ergebnisses vom gemessenen Wert in der Küvette berechnet.
Die Liste der Experimente in der Zwischenzeit bereits
verlängert, türmten sich die benützten Mikrotiterplatten auf
dem Schreibtisch. Die mathematische Methode schien nicht
immer zu funktionieren. Wir hatten den Verdacht, der Meniskuseffekt würde die Methode beeinflussen. Um das herauszufinden, wurde eine neue Art von Mikrotiterplatten
verwendet. Das ist eine Platte, deren Oberfläche mit Plasmagas beschichtet worden ist. Durch einen so geschaffenen
Ladungsausgleich in den Wells wird beim Pipettieren von
Proben der Meniskuseffekt verhindert.
Außerdem wurde herausgefunden, dass die Wells in den
von mir verwendeten Mikrotiterplatten nicht zylinder- oder
quaderförmig sind. Sie sind nämlich kegelstumpf- und pyramidenstumpfförmig. Diese Tatsache wird in der Formel
nicht berücksichtigt und das führt zu falschen Ergebnissen.
Im Zuge des Praktikums versuchte ich mit Dipl. Ing. (FH)
Markus Pavic eine neue mathematische Formel aufzustellen. Leider reichte die Zeit nicht mehr aus, um sie zur Vollendung zu bringen.
Ergebnisse
Die patentierte PathCheck®-Methode von Molecular
Devices Corp. funktioniert sehr gut in der täglichen praktischen Anwendung. Man kann sich auf diese Methoden
verlassen. Die mathematische Methode ist schwieriger in
der Evaluierung. Sie beinhaltet einige Dinge, die beachtet
werden müssen. Zum Beispiel muss Aufmerksamkeit darauf gerichtet werden, welche Wellgrößen- und Formen in
den Platten verbaut sind, welche Oberflächenspannung das
Lösungsmittel hat, und mit welcher Wellenlänge gemessen
werden muss. Leider kann mit dieser Methode auch nicht
rückverfolgt werden, ob die Pipette richtig eingestellt war.
Ein weiteres Problem der mathematischen Methode ist, dass
die richtige Form der Wells in der Formel nicht berücksichtigt wird. Zusammengefasst sind die größten Nachteile der
mathematischen Methode also Meniskuseffekte, die nicht
berücksichtigte Form der Wells und eventuell Pipettierfehler. Betonen möchte ich aber noch, dass die mathematische
Formel nicht grundsätzlich schlecht ist. Sie ist mit keinerlei
Kosten verbunden und in ein paar Experimenten war die
Methode sogar besser als die patentierte. Außerdem konnten wir die Methode auch noch in einer plasmabeschichteten Mikrotiterplatte testen. In diesem Experiment konnte
die prozentuelle Abweichung der mathematischen Methode
eklatant vermindert werden.
Abschließend möchte ich gerne noch die Gelegenheit
nützen, um mich für die Prämierung der Arbeit zu bedanken. Ich danke herzlich dem Unternehmen Abbott, biomed
austria, dem Unternehmen Tecan® Austria und insbesondere Mag. Thomas Olesch, Dr. Christian Oberdanner, Dr.in
Kathrin Flatscher, Dipl. Ing. (FH) Markus Pavic, Thomas
Hengstl MSc, Dr.in Susanna Petzmann
und Patrick Steindl.
n
Doris Rieder
Labor Dr. Mustafa, Dr. Richter
Salzburg
[email protected]
Literatur
Greiner Bio One (2008). UV/VIS Spectroscopy in Microplates
UV-Star®, µClear®, MICROLON® and CELLSTAR®. URL:
www.greinerbioone.com/de/row/articles/literatures/application_notes/ (Zugriff am 17. Juni 2012)
Molecular Devices (2010(b)). Making optical density measurements automatically corrected to a 1 cm pathlength in the
SPECTRAmax® PLUS microplate spectrophotometer (The
three P’s of PathcheckTM: Principle, Procedures and Precautions). Application Note Nr. 25. URL: www.moleculardevices.com/Documents/general-documents/mkt-appnotes/
microplate-appnotes/Maxline_AppNote_25_PathCheck.pdf
(Zugriff am 24. April 2012)