MegaBLOT® LYME IgM - Gebrauchsinformation / Instructions for use
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MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. LINE-Immunoassay zum qualitativen Nachweis spezifischer IgM-Antikörper gegen Borrelia burgdorferi sensu lato im Plasma oder Serum des Hundes In vitro Diagnostikum GEBRAUCHSINFORMATION LINE immunoassay for the qualitative detection of specific IgM antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato in plasma or serum of the dog In vitro diagnosticum INSTRUCTIONS FOR USE Hersteller / Manufacturer: Lochauer Str. 2 A-6912 Hörbranz – AUSTRIA (+43) 5573 85400 (+43) 5573 85400-4 [email protected] www.megacor.com Version 07/2016 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Seite 2 1. EINLEITUNG Die Borreliose, eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit des Hundes sowie anderer Tierarten und des Menschen, wird von der Spezies Borrelia burgdorferi sensu lato (B. b. s. l. Genospezies B. b. sensu stricto, B. garinii, B. afzelii) verursacht. Die borrelienübertragenden Zecken (Ixodes ricinus, Gemeiner Holzbock) sind bis zu 30 % mit Borrelien infiziert. Die Antikörperprävalenz korreliert bei Hunden in endemischen Gebieten (z. T. bis zu 95 %) mit der Haltung, der Zeit, die die Hunde im Freien verbringen und der Saugdauer der Zecken. Die definitive Diagnose „Lyme-Borreliose“ gestaltet sich in der Praxis häufig schwierig, da diese nur durch eine analytische Betrachtung umfangreicher Informationen wie Krankheitsgeschichte, klinische Symptome (z. B. Lethargie, Abgeschlagenheit, Fieber, geschwollene Lymphknoten, wechselnde Lahmheit, Arthritis und neurologische Ausfallserscheinungen) und v. a. durch Labordiagnostik zu stellen ist. Wichtig für eine erfolgreiche Therapie ist das frühzeitige Erkennen infektionsbedingter Symptome, die etwa zwei bis fünf Monate nach Zeckenexposition einsetzen. Ein Antikörpernachweis (IgM vor IgG) gelingt frühestens 4–6 Wochen nach Exposition, nach ca. 3 Monaten ist die Antikörperkonzentration am höchsten. Den klinischen Symptomen Lahmheit und Fieber geht fast immer ein Titeranstieg (Serokonversion) voraus. Damit kann ein negativer Test bei einem Tier mit klinischen Symptomen eine akute Borreliose ausschließen. Bei der Antikörperbestimmung gilt die Zwei-Stufen-Diagnostik als Mittel der Wahl. Zunächst wird ein IgM- / IgG-Antikörper-Screening-Test (z. B. Schnelltest [ICT], ELISA und / oder IFA durchgeführt. Da falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse nicht auszuschließen sind, sollte ein positives Ergebnis oder ein unklares negatives Ergebnis durch einen Immunoblot-Bestätigungstest wie den MegaBLOT® LYME IgM (2. Stufe der Borrelien-Diagnostik) abgesichert werden. Auch eine Unterscheidung von Impf-Antikörpertiter und Antikörpertiter aufgrund einer Feldinfektion ist nur durch wiederholte Westernblot-Untersuchungen beweisend möglich. Die serologische IgM- / IgG-Antwort auf eine Borrelien-Infektion kann von mannigfaltigen Kriterien wie Alter, Immunstatus, Infektionsgrad mit der jeweiligen BorrelienGenospezies und / oder kreuzreagierenden Erregern (v. a. Spirochäten), Zeitpunkt der labordiagnostischen Untersuchung, Behandlung mit Glucocorticoiden etc. abhängen. Hierbei erweist sich der MegaBLOT® LYME IgM als die Methode der Wahl, um eine abschließende Befundung über den tatsächlichen Borreliosestatus des Tieres zu erhalten. 2. VERWENDUNGSZWECK Der MegaBLOT® LYME IgM ist ein LINE-Immunoassay zum qualitativen Nachweis spezifischer IgM-Antikörper gegen Borrelia burgdorferi sensu lato im Plasma oder Serum des Hundes. Seite 3 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 3. TESTPRINZIP Neue LINE Blot-Technik! Spezifische rekombinante Borrelia burgdorferi-Antigene werden, zusammen mit einer Cut-off-Kontrolle, mittels eines speziellen Auftrageverfahrens auf definierten Testlinienpositionen auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht. Anschließend wird die Membran in gebrauchsfertige Streifen geschnitten. Verdünnte Hundeseren oder -plasma werden mit den LINE-Blot-Streifen inkubiert. Dabei binden in der Probe vorhandene IgM-Antikörper gegen Borrelia burgdorferi an ihre auf der Membran fixierten Ziel-Antigene. Nach einem Waschschritt wird Anti-Hund IgM-Konjugat, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, dazugegeben. Nicht gebundenes Konjugat wird in einem weiteren Waschschritt entfernt. Gebundenes Konjugat wird durch Zugabe eines chromogenen Substrates (Tetramethylbenzidin, TMB) sichtbar gemacht. Nach dem Trocknen können die gefärbten Antigen-Testlinien mit Hilfe der Abbildung eines Referenzstreifens auf dem Evaluierungsblatt ausgewertet werden. 4. TESTKITKOMPONENTEN 4.1. MITGELIEFERTE TESTKITKOMPONENTEN / REAGENZIEN Die Reagenzien einer Packung reichen für 16 Bestimmungen. 1. 16 Borrelia burgdorferi IgM LINE-Blot-Streifen (fortlaufend nummeriert), beschichtet mit rekombinanten Borrelia burgdorferi-Antigenen und einer Cut-off-Kontrolle 2. 20 ml Probenverdünnungspuffer (PVP, 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 ± 0,2, gelb gefärbt, enthält > 0,1 % CMIT), gebrauchsfertig, weiße Flasche mit weißer Kappe 3. 50 ml Waschpuffer (20× Phosphatpuffer, 0,2 M, pH 7,2 ± 0,2, enthält1 % Ethanol), weiße Flasche mit weißer Kappe 4. 20 ml Konjugat (Peroxidase-konjugierte Anti-Hund IgM-Antikörper, pink gefärbt, enthält 1 % Ethanol), gebrauchsfertig, schwarze Flasche mit schwarzer Kappe 5. 20 ml Substrat (< 0,1 % 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin [TMB] / Wasserstoffperoxid), gebrauchsfertig, schwarze Flasche mit blauer Kappe. Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen! 6. 1 Evaluierungsblatt mit Abbildung eines LINE-Blot-Referenzstreifens 7. 2 Einmal-Inkubationswannen 8. 1 Gebrauchsinformation 4.2. ERFORDERLICHE, NICHT MITGELIEFERTE REAGENZIEN / ZUBEHÖR • • • • • • Schere Destilliertes oder deionisiertes Wasser Wipptisch Laborpipetten (10–100 µl, 1 ml) Einmal-Pipettenspitzen Kunststoffpinzette für das Hantieren mit den LINE-Blot-Streifen MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. • • • • • • Seite 4 Vakuum-Saugpumpe mit Desinfektionsfalle Filterpapier / Labortücher Messzylinder (1000 ml) Stoppuhr Klares Klebeband Abfallbehälter mit einer 0,5%-igen Hypochloritlösung 5. HALTBARKEIT UND LAGERUNG Verwendbar bis – siehe Etikett Lagerung 2–8 °C 2–8 °C Für den tierärztlichen Gebrauch In vitro Diagnostikum Gebrauchsinformation genau beachten LOT Chargen-Bezeichnung ! Keine Reagenzien verschiedener Testkits, Chargennummern oder mit abgelaufenem Verfallsdatum verwenden. Der verdünnte Waschpuffer ist bei einer Lagerung bei Raumtemperatur (20–25 °C) 5 Tage haltbar. Mikrobielle Kontamination ist zu vermeiden. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Bei Öffnung des Umschlags mit den LINE-Blot-Streifen ist darauf zu achten, dass die Streifen nicht beschädigt werden! Die benötigte Anzahl an LINE-Blot-Streifen entnehmen, die restlichen sofort wieder im Umschlag in den Beutel geben, verschließen und bei 2–8 °C lagern. Eine direkte Lichteinwirkung auf das farblose bis blassgelbe Substrat ist unbedingt zu vermeiden, um einer Zersetzung bzw. Blaufärbung durch Autooxidation vorzubeugen. Bei aufgetretener Blaufärbung kann das Substrat nicht mehr verwendet werden (Funktionsunfähigkeit)! Seite 5 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 6. INFORMATIONEN ZUM PROBENMATERIAL • Nur Hunde-Plasma oder Serum verwenden! • Das Probenmaterial vor der Verwendung gut homogenisieren! • Ungekühlt (20–25 °C) sollte das Plasma oder Serum innerhalb von 4 Stunden getestet werden! Bei 2–8 °C kann das Plasma oder Serum bis max. 5 Tage gelagert werden. Plasma- oder Serumproben können aliquotiert und dauerhaft bei mindestens −20 °C aufbewahrt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. • Wiederaufgetaute Proben vor dem Verdünnen gut homogenisieren. • Nicht hitze-inaktivieren. • Beachten Sie, dass das Probenmaterial, ebenso wie alle verwendeten Testkitkomponenten, zum Zeitpunkt der Anwendung Raumtemperatur haben sollte. • ACHTUNG: Unvollständig gefüllte und / oder unzureichend durchmischte EDTA-, Citrat- oder Heparinröhrchen können Störeffekte verursachen, die zu unterschiedlichen Testergebnissen führen können. 7. TESTVORBEREITUNG ! Gebrauchsinformation vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die Gebrauchsinformation genau zu befolgen. Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen. Für jeden Pipettierschritt saubere Einmalspitzen verwenden. 7.1. ALLGEMEINES • • • • • • • • Die benötigte Menge an LINE-Blot-Streifen erst nach Erreichen der Raumtemperatur mit Hilfe einer Kunststoff-Pinzette dem Umschlag entnehmen. Die Reagenzien sind unmittelbar vor ihrer Verwendung gut zu vermischen. Nach Gebrauch der Pipettenspitzen sind diese zu verwerfen und eine neue Spitze einzusetzen. Nach Gebrauch sind sowohl die nicht verwendeten LINE-Blot-Streifen (im verschlossenen Kunststoffbeutel) als auch die Reagenzien wieder bei 2–8 °C zu lagern. Einmal benutzte LINE-Blot-Streifen dürfen nicht wiederverwendet werden. Beschädigte Testkitkomponenten dürfen nicht verwendet werden. Ein direkter Kontakt von Proben mit den Testkitkomponenten ist zu vermeiden (Kreuzkontamination). Direkte Sonneneinstrahlung während der Testdurchführung vermeiden, z. B. durch Abdecken mit Alufolie o. ä. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Seite 6 7.2. HERSTELLUNG DES WASCHPUFFERS 1:20 1 Teil des Waschpufferkonzentrates wird mit 19 Teilen destilliertem Wasser gemischt. Sollten im Waschpufferkonzentrat Kristalle zu sehen sein, lösen Sie diese durch Erwärmen des Waschpufferkonzentrates im Wasserbad bei 37 °C auf. Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur (20–25 °C) 5 Tage haltbar. 7.3. PROBENVORBEREITUNG / PROBENVERDÜNNUNG 1+200 Die Probenverdünnung erfolgt direkt während der Testdurchführung. 8. TESTDURCHFÜHRUNG • Vor Testbeginn die Zuordnung der Patientenproben zu den LINE-Blot-Streifen genau festlegen und auf dem mitgelieferten Evaluationsblatt festhalten. Je Probe einen Streifen verwenden. • Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen. • Während der Inkubation die Inkubationswannen abdecken, um die LINE-Blot-Streifen vor Licht zu schützen. 8.1. PROBENAUFTRAG UND ERSTE INKUBATION • Je 1 ml PVP in die benötigten Rinnen der Inkubationswanne geben. • Die erforderliche Anzahl an benötigten LINE-Blot-Streifen mittels Pinzette und Schere vorsichtig zwischen den Beschriftungen aus dem Umschlag herausschneiden und einzeln in die jeweiligen Rinnen der Inkubationswanne legen. Die beschriftete Seite der LINE-Blot-Streifen muss nach oben zeigen! Die Streifen müssen vollständig untergetaucht sein! Wenn nötig, die Wanne sanft schütteln oder die Streifen mit einer sauberen Pipettenspitze vorsichtig in die Lösung schieben. • Zugabe von 5 µl Probe zwischen Rinne und Streifen in den PVP. Direktes Pipettieren auf den LINE-Blot-Streifen vermeiden! • Inkubieren Sie zugedeckt für 60 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) unter leichtem Wippen auf dem Wipptisch. Der Verlauf der Rinnen sollte entlang der Wippbewegung ausgerichtet sein, um eine optimale Flüssigkeitsbewegung über den LINE-Blot-Streifen zu gewährleisten. 8.2. WASCHEN – SORGFÄLTIG und STRIKT NACH ANLEITUNG! • Flüssigkeit aus jeder Rinne sorgfältig absaugen. • Entsorgen Sie das Inkubat durch Ausleeren in einen Abfallbehälter mit Hypochlorit. Gemäß den behördlichen Vorschriften entsorgen! • Geben Sie 1 ml Waschpuffer pro Rinne zu. • Auf dem Wipptisch für 5 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) inkubieren. • Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal. Seite 7 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 8.3. ZWEITE INKUBATION • Geben Sie je 1 ml Konjugat in jede Rinne der Inkubationswanne. • Inkubieren Sie zugedeckt für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) unter leichtem Wippen. 8.4. WASCHEN Waschen wie in Punkt 8.2. 8.5. DRITTE INKUBATION • Geben Sie 1 ml Substrat (TMB) in jede Rinne der Inkubationswanne. • Inkubieren Sie zugedeckt für 20 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C). Die Reaktion nicht vorzeitig abbrechen, auch wenn sich die LINE-Blot-Streifen blau verfärben sollten. Diese Verfärbung verblasst in der Regel beim Trocknen. • Stoppen der Reaktion durch Absaugen der Lösung und dreimaliges Waschen der LINE-Blot-Streifen in deionisiertem oder destilliertem Wasser. Dazu die Rinnen vollständig befüllen und wieder absaugen. • Die LINE-Blot-Streifen aus den Rinnen entnehmen und mit der Beschriftung nach oben auf einem Filterpapier trocknen (mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur). Die LINE-Blot-Streifen nicht auswerten, solange sie nicht vollständig getrocknet sind! Um ein Bleichen der LINE-Blot-Streifen zu verhindern, die Streifen vor direktem Licht schützen! 9. TESTAUSWERTUNG 9.1. REAGENZIENSTABILITÄT – INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE Der Test wurde korrekt durchgeführt, wenn die Cut-off-Kontrolle eine schwache bis mäßig starke Färbung aufweist. Ist dieses Kriterium nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden. Vor einer Testwiederholung sollte Folgendes geprüft werden: – Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien – Visuelle Kontrolle der Testkitkomponenten auf Kontamination oder Undichtigkeit; eine bläulich verfärbte Substratlösung darf nicht mehr verwendet werden. 9.2. INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE Für den MegaBLOT® LYME IgM wird eine Abbildung eines Referenzstreifens verwendet, welche die Positionen aller Antigen-Testlinien und der Cut-off-Kontrolle zeigt. Durch Vergleich mit der Abbildung können die reaktiven Testlinien auf den LINE-Blot-Streifen identifiziert werden. Dazu werden die LINE-Blot-Streifen nach dem Trocknen mit einem klaren Klebeband so auf dem Evaluationsblatt fixiert, dass die Cut-off-Kontrolle auf der Index-Linie aufliegt. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Seite 8 Reaktive Antigen-Testlinien auf dem LINE-Blot-Streifen werden gewertet, wenn ihre Intensität stärker oder gleich der Cut-off-Kontrolle auf demselben Streifen ist. Die Werte aller gewerteten Testlinien werden zu einem Gesamtresultat aufaddiert. 9.3. SPEZIFITÄT DER ANTIGEN-TESTLINIEN Testlinie Borrelienantigene und ihre diagnostische Relevanz p100 (93 kDa) hochspezifischer Marker, chromosomales Protein der Gattung Borrelia erscheint im Verlauf chronischer Borreliose-Infektionen OspA (32,5 kDa) hochspezifisches Oberflächenprotein A nach Infektion: selten, in späten Stadien, wenig intensiv (stärker bei multiplen Antigenkontakten) nach Impfung: früh, sehr intensiv und lang anhaltend p58 (58 kDa) Spezies-abhängiger, aber infektionsspezifischer Marker bei Infektionen mit starkem Antigenkontakt (häufig in Kombination mit p18) nach Impfungen sehr häufig (relativ „impfspezifischer“ Marker) BmpA (39 kDa) hochspezifisches Membranprotein A alle Infektionsstadien Flagellin (41 kDa) Flagellin-Protein alle Infektionsstadien Kreuzreaktionen mit anderen Spirochäten häufig OspC (22–23 kDa) spezifisches Oberflächenprotein C nach Infektion: meist früh (wichtiger IgM-Marker), aber auch später gelegentlich nach Impfungen (frühes und kurzzeitiges Auftreten) p18 (18 kDa) hochspezifischer, starker Marker späte Infektionsstadien (v. a. bei hochgradig positiven Seren) 9.3. BEWERTUNG DER ANTIGEN-TESTLINIEN Vor der Bewertung der Testlinien müssen folgende Aspekte berücksichtigt werden: 1. Ist das Tier regelmäßig bzw. häufig Zeckenbissen ausgesetzt? In diesem Fall kann der Blot auch in Abwesenheit einer akuten Infektion spezifische Testlinien aufweisen. 2. Deutet das klinische Erscheinungsbild auf eine akute Borreliose hin? In Abwesenheit von Fieber und / oder Lahmheit kann eine Differenzierung zwischen einem vorausgegangenen Kontakt und einer gerade ablaufenden Infektion äußerst schwierig sein. Seite 9 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 9.4. PUNKTEBEWERTUNG DER BORRELIEN-ANTIGENE IM MegaBLOT® LYME IgM Borrelienantigen Punkte IgM Borrelienantigen Punkte IgM p100 1 Flagellin (p41) OspA 3 OspC 7 p58 3 p18 3 BmpA (p39) 3 1 9.5. INTERPRETATION DER PUNKTEBEWERTUNG Summe der Punkte Bewertung IgM <6 negativ 6 fraglich >6 positiv < 6 Punkte: Es sind keine IgM-Antikörper gegen Borrelien-Antigene in der Probe vorhanden. Ein vorangegangener Kontakt mit Borrelien ist unwahrscheinlich, kann jedoch nicht in jedem Fall ausgeschlossen werden (s. u.). 6 Punkte: IgM-Antikörper gegen Borrelien-Antigene sind fraglich. Es wird empfohlen, den Test mit einer frischen Probe nach 2–4 Wochen zu wiederholen. Sollte das Ergebnis immer noch fraglich ausfallen, so ist die Probe als negativ zu bewerten. Eine parallele Untersuchung auf IgG-Antikörper wird empfohlen. > 6 Punkte: Es konnten IgM-Antikörper gegen Borrelien-Antigene nachgewiesen werden. Eine parallele Untersuchung auf IgG-Antikörper wird empfohlen. 10. EINSCHRÄNKUNGEN DES TESTS • Die Abwesenheit von Antikörpern gegen Borrelien-Antigene im MegaBLOT® LYME IgM kann eine Borrelien-Infektion nicht in jedem Fall ausschließen. In der Frühphase der Infektion können Antikörper noch nicht oder in nicht detektierbarer Menge vorhanden sein. Ebenso kann eine Antibiotika-Therapie im Frühstadium der Infektion die Antikörperbildung supprimieren. • Eine Interpretation des Testergebnisses sollte nur in enger Verbindung mit den klinischen Befunden (Impfpass!) erfolgen. Bei unklaren oder fraglichen Testergebnissen sind Wiederholungsuntersuchungen in 2–3 wöchigem Abstand anzuraten. • Eine Kontamination der Proben durch Bakterien sowie wiederholtes Einfrieren und Auftauen können zu einer Veränderung der Testergebnisse führen. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. • Seite 10 Manche Patientenproben führen zu einer dunklen, durchgängigen oder gemusterten Verfärbung des LINE-Blot-Streifens. Dies wird durch verschiedene Faktoren in der Patientenprobe hervorgerufen, welche dann mittels anderer serologischer Verfahren untersucht werden sollte. Eine Interpretation solcher Streifen ist nur eingeschränkt möglich. Weiße Testlinien auf dunklem Grund sind als negativ zu bewerten. 11. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE • • • • • • • • • • • • • • • Tragen von Schutzkleidung (Einmal-Handschuhe) und Händewaschen nach Ende der Testdurchführung. Essen und Trinken während der Testdurchführung verboten. Das Probenmaterial muss als potentiell infektiös angesehen werden und ist, zusammen mit den verwendeten Testkitkomponenten, nach der Testdurchführung fachgemäß zu entsorgen. Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden. Keine Reagenzien unterschiedlicher Chargen zusammen verwenden. Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen. Die Verwendung eines Wipptisches wird empfohlen. Verwendung eines Orbitalschüttlers kann die Bindungs- und Wascheffizienz reduzieren. Flaschen nach Gebrauch sofort fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach dem ersten Öffnen Reagenzien-Fläschchen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination prüfen. Beschriften Sie Probenmaterial und Inkubationswanne, damit die exakte Zuordnung gewährleistet ist. Während der Inkubationen und des Waschens müssen die LINE-Blot-Streifen komplett von Flüssigkeit bedeckt sein und die beschriftete Seite muss stets nach oben zeigen. Um Kreuzkontaminationen und falsch erzielte Ergebnisse zu vermeiden, die Patientenproben und das Konjugat sorgfältig und ohne Verspritzen in die Rinnen pipettieren. Die Inkubationswannen nicht mehrfach verwenden (Kreuzkontamination!). – Probenverdünnungspuffer enthält CMIT als Konservierungsmittel. – Substratlösung enthält Wasserstoffperoxid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist unbedingt zu vermeiden! – Waschpuffer und Konjugat enthalten Ethanol als Konservierungsmittel. In der verwendeten Konzentration besitzt Ethanol kaum toxikologische Risiken bei Kontakt mit Haut und Schleimhäuten. Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden. Seite 11 • • MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Niemals mit dem Mund pipettieren! Der MegaBLOT® LYME IgM ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, das die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht. Die Testdurchführung, die Information, die Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise in der Gebrauchsanweisung sind strikt zu befolgen. Bei Anwendung des Testkits auf Diagnostika-Geräten ist die Testmethode zu validieren. Jede Änderung am Aussehen, der Zusammensetzung und der Testdurchführung sowie jede Verwendung in Kombination mit anderen Produkten, die der Hersteller nicht autorisiert hat, ist nicht zulässig; der Anwender ist für solche Änderungen selbst verantwortlich. Der Hersteller haftet nicht für falsche Ergebnisse und Vorkommnissse, die mit diesen Gründen in Zusammenhang stehen. 12. HAFTUNG Das gesamte Haftungsrisiko im Zusammenhang mit der Verwendung dieses Produktes liegt beim Käufer. Der Hersteller übernimmt keine Haftung für indirekte, spezielle oder daraus folgende Schäden jeglicher Art, die aus der Benutzung, Testdurchführung und -auswertung dieses Produktes resultieren. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Seite 12 13. KURZ-PROTOKOLL MegaBLOT® LYME IgM TESTVORBEREITUNG Benötigte LINE-Blot-Streifen und Reagenzien auf Raumtemperatur (20–25 °C) bringen. Waschpuffer 1:20 mit destilliertem Wasser verdünnen. Zuordnung der Proben zu den LINE-Blot-Streifen und der jeweiligen Rinne der Inkubationswanne. TESTDURCHFÜHRUNG Je 1 ml PVP in je eine Rinne pipettieren. LINE-Blot-Streifen in die Rinne legen. Darauf achten, dass die Streifen komplett untergetaucht sind! 5 µl Probe in die Rinne neben den Streifen pipettieren. Zugedeckt 60 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) unter leichtem Wippen inkubieren. 3× 5 Minuten unter leichtem Wippen mit je 1 ml Waschpuffer waschen. 1 ml Konjugat in jede Rinne pipettieren. Zugedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) unter leichtem Wippen inkubieren. 3× 5 Minuten unter leichtem Wippen mit je 1 ml Waschpuffer waschen. Je 1 ml Substrat (TMB) in jede Rinne pipettieren. Zugedeckt 20 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C) unter leichtem Wippen inkubieren. 3× mit deionisiertem oder destilliertem Wasser waschen. Trocknen und auswerten. Page 13 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 1. INTRODUCTION Borreliosis caused by the borrelia species Borrelia burgdorferi sensu lato (B. b. s. l., genospecies B. b. sensu stricto, B. garinii, B. afzelii) is a world-wide spread infectious disease in dogs, other animals and in humans. Ticks that transmit Borrelia (Ixodes ricinus, castor bean tick) are infected up to 30 % with Borrelia. In dogs from endemic areas, the antibody prevalence (up to 95 %) correlates with dog ownership, dog’s outdoor time and sucking time of the ticks. The definitive in-clinic diagnosis “Lyme borreliosis“ is often complex and can only be done by an analytical view combining many details like case history, clinical symptoms (e. g. lethargy, exhaustion, fever, swollen lymph glands, switching lameness, arthritis and neurological disorders) and especially by laboratory diagnostics. A successful therapy is based on an early detection of symptoms (first signs 2 to 5 months after tick exposition). Antibody detection (IgM before IgG) succeeds earliest in week 4–6 after tick exposition, after 3 months the antibody level is highest. A titre increase (seroconversion) mostly is seen before clinical signs of lameness and fever. Therefore, a negative test in an animal with clinical symptoms can rule out an acute borreliosis. For the detection of antibodies, a two-step diagnostics is known to be golden standard. First step is an IgM / IgG antibody screening test like rapid test (ICT), ELISA and / or IFA test. Because false positive or false negative test results cannot be ruled out, a positive test result or unclear negative test result should be verified by a confirmatory test like the MegaBLOT® LYME IgM (2nd step of diagnostics). Also, a determination whether the antibody titre is caused by antibodies due to vaccination or due to a natural infection only is possible by repeatedly running Westernblot analysis. Various criteria affect the serological IgM / IgG answer, like age, immune status, rate of infection, Borrelia genotype species, cross reactions with other spirochaetes, timepoint of laboratory testing, medical treatment with glucocorticoids etc. The MegaBLOT® LYME IgM is proven to be a reliable tool for a concluding appraisal for the actual Borreliosis status of the dog. 2. INTENDED USE MegaBLOT® LYME IgM is a LINE immunoassay for the qualitative detection of specific IgM antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato in plasma or serum of the dog. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Page 14 3. TEST PRINCIPLE New LINE Blot technique! Specific recombinant Borrelia burgdorferi antigens, together with a Cut-off Control, are applied to defined test line positions on a nitrocellulose membrane using a special coating method. The membrane then is cut into ready-to-use strips. Diluted dog serum or plasma samples are incubated with the LINE Blot Strips. If present in the sample, IgM antibodies against Borrelia burgdorferi will bind to their target antigens fixed on the membrane. After washing, horseradish peroxidase conjugated anti-dog IgM conjugate is added. Non-bound conjugate is removed by another wash step. Bound conjugate is visualised by addition of a chromogenic substrate (tetramethylbenzidine, TMB). After drying, the stained antigen test lines can be evaluated using the illustration of the reference strip on the evaluation sheet. 4. TEST-KIT COMPONENTS 4.1. COMPONENTS / REAGENTS PROVIDED WITH THE TEST-KIT The reagents of one package are sufficient for 16 determinations. 1. 16 Borrelia burgdorferi IgM LINE Blot Strips (consecutively numbered), coated with recombinant Borrelia burgdorferi antigens and a Cut-off Control 2. 20 ml Sample Dilution Buffer (SDB, 10 mM phosphate buffer, pH 7.2 ±0.2, yellow stained, contains > 0.1 % CMIT), ready to use, white bottle with white cap 3. 50 ml Wash Buffer (20× phosphate buffer, 0.2 M, pH 7.2 ±0.2, contains 1 % ethanol), white bottle with white cap 4. 20 ml Conjugate (peroxidase-conjugated anti-dog IgM antibodies, pink stained, contains 1 % ethanol), ready to use, black bottle with black cap 5. 20 ml Substrate (< 0.1 % 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine [TMB] / hydrogen peroxide), ready to use, black bottle with blue cap. Do not expose to sun light! 6. 1 evaluation sheet with illustration of a LINE Blot reference strip 7. 2 disposable incubation trays 8. 1 instructions for use 4.2. REQUIRED, NON-PROVIDED REAGENTS / DEVICES • • • • • • • • Scissors Distilled or deionised water Tilting table Laboratory pipettes (10–100 µl, 1 ml) Disposable pipette tips Plastic tweezers for handling the LINE Blot Strips Vacuum apparatus with disinfection trap Filter paper / laboratory cloths Page 15 • • • • MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Measuring cylinder (1000 ml) Stop watch Waste bin with a 0.5 % hypochlorite solution Clear tape 5. STABILITY AND STORAGE 2–8 °C Expiry date – see label Store at 2–8 °C For veterinary use only In vitro diagnosticum LOT Lot number ! Follow instructions for use precisely Do not use test-kit components from different kits, lot numbers or beyond stated expiry date. The diluted Wash Buffer is stable for 5 days when stored at room temperature 20–25 °C. Microbial contamination must be avoided. After the expiration date, the guarantee of quality is not provided. When opening the envelope with the LINE Blot Strips, care must be taken that the strips do not get damaged! Remove the required amount of LINE Blot Strips, place the remaining strips immediately back into the bag, close it and store it at 2–8 °C. Direct influence of light onto the colourless to pale yellow Substrate must be absolutely avoided to prevent degradation / auto oxidation / colour change to blue. If the Substrate colour has changed to blue, it cannot be used any more (functional incapacity). 6. INFORMATION ON THE SAMPLE MATERIAL • Use only dog plasma or serum samples! • Mix the sample material well before use! • Non-cooled (20–25 °C), plasma or serum should be tested within 4 hours! At 2–8 °C, the plasma or serum can be stored up to 5 days. Plasma or serum samples can be aliquoted and permanently stored at minimum −20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. • If samples were frozen, mix thawed samples well before testing. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Page 16 • Do not heat inactivate! • Keep in mind that the sample material, as well as all used test-kit components, should have reached room temperature at the time of application. • ATTENTION: Partially filled and / or insufficient mixed EDTA, Citrate or Heparin tubes could create interference effects resulting in varying test results. 7. TEST PREPARATION ! Read instructions for use carefully before starting the test. For the reliability of the results it is important to follow the instructions for use exactly as described. Carry out the test in the given order and without delay. Use clean disposable tips for each pipetting step. 7.1. GENERAL • Remove the required LINE Blot Strips from the envelope with help of the plastic tweezers after they have reached room temperature. • Mix the reagents well immediately before their use. • After use of disposable tips, discard these and use a new tip. • After use, both non-used LINE Blot Strips (in envelope in closed plastic bag) and reagents should be stored at 2–8 °C again. • LINE Blot Strips that once were used cannot be used again. • Damaged test-kit components must not be used. • Avoid direct contact of samples with the test-kit components (cross contamination). • Avoid direct solar radiation during testing, for example by covering with aluminium foil. 7.2. PREPARATION OF WASH BUFFER 1:20 Mix 1 part of the Wash Buffer concentrate with 19 parts of distilled water. When crystals are visible in the Wash Buffer concentrate, dissolve these by warming the Wash Buffer concentrate up to 37 °C in a water bath. The diluted buffer will be stable for 5 days if stored at room temperature (20–25 °C). 7.3. SAMPLE PREPARATION / SAMPLE DILUTION 1+200 The sample dilution is carried out directly during the test procedure. Page 17 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 8. TEST PROCEDURE • Before beginning, define the assignment of patient samples to the LINE Blot Strips and on the result sheet included with the kit. Use one strip per sample. • Perform the test in the specified sequence and without delay. • Cover the incubation tray during incubation to protect the LINE BLot Strips from light. 8.1. SAMPLING AND FIRST INCUBATION • Add 1 ml SDB into the required channels of the incubation tray. • Cut the amount of required LINE Blot Strips with scissors and tweezers carefully between the two labels from the envelope and place them separately into each channel of the incubation tray. The labelled side of the LINE Blot Strip must face up! The strips must be completely submerged! If necessary, shake the tray softly or push the strips into the solution carefully with a clean tip. • Add 5 µl of sample between incubation tray and LINE Blot Strip into the SDB. Avoid direct pipetting of the sample onto the strip! • Cover and incubate for 60 minutes at room temperature (20–25 °C) with soft tilting on the tilting table. The direction of the channels has to be parallel to the tilting direction to achieve optimal fluid movement over the LINE Blot Strips. 8.2. WASHING – CAREFULLY and STRICTLY FOLLOWING THE INSTRUCTIONS! • Carefully aspirate the liquid from each channel. • Remove the incubation solution by emptying into a waste bin with hypochlorite. Disposal must be done according to official regulations! • Add 1 ml Wash Buffer per channel. • Cover and incubate on tilting table for 5 minutes at room temperature (20–25 °C). • Repeat Wash Step twice. 8.3. SECOND INCUBATION • Add 1 ml Conjugate into each channel of the incubation tray. • Cover and incubate for 30 minutes at room temperature (20–25 °C) with soft tilting. 8.4. WASHING Wash as described in issue 8.2. 8.5. THIRD INCUBATION • Add 1 ml Substrate (TMB) into each channel of the incubation tray. • Cover and incubate for 20 minutes at room temperature (20–25 °C). Do not stop the reaction earlier, even when the LINE Blot Strips colour blue. This colouring normally fades during drying. • Stop the reaction by aspirating the solution and washing the LINE Blot Strips three times with deionised or distilled water. Fill the channels completely and re-aspirate. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. • Page 18 Remove the LINE Blot Strips from the channels and place them – labelling upside – onto a filter paper. Let them dry for at least 30 minutes at room temperature. Do not evaluate the LINE Blot Strips before they are completely dry! To prevent fading of the LINE Blot Strips, protect the Strips from direct light! 9. TEST EVALUATION 9.1. REAGENT STABILITY – INTERNAL QUALITY CONTROL The test was performed correctly when the Cut-off Control shows a weak to moderately strong colour. If this criterion is not met, the test is not valid and must be repeated. Before repetition of the test, following criteria should be ensured: – Stability of the used reagents – Visual control of the test-kit components for contamination or leakage; a blueish stained Substrate solution should not be used. 9.2. INTERPRETATION OF TEST RESULTS For the MegaBLOT® LYME IgM, an illustration of a reference strip is used which shows the positions of all antigen test lines and of the Cut-off Control. By comparison with the illustration, the reactive test lines on the LINE Blot Strips can be identified. For that, the LINE Blot Strips are fixed after drying on the evaluation sheet with clear tape in such a way that the Cut-off Control is aligned with the index line. Reactive antigen test lines on the LINE Blot Strips are counted if their signal is equal to or higher than the signal of the line of the Cut-off Control on the same strip. The values of all counted test lines are summed up to a total rating. 9.3. SPECIFICITY OF THE ANTIGEN TEST LINES Test line Borrelia antigens and their diagnostic value p100 (93 kDa) highly specific marker, chromosomal protein of the genus Borrelia appears in the course of chronic Borrelia infection OspA (32.5 kDa) highly specific outer surface protein A after infection: rare, in later stages, low intensity (stronger in case of multiple antigen contacts) after vaccination: early, very intense and long-lasting p58 (58 kDa) species-dependent, but infection-specific marker in infections with strong antigen contact (often in combination with p18) common after vaccinations (relatively “vaccination-specific”) BmpA (39 kDa) highly specific membrane protein A all stages of infection Flagellin (41 kDa) Flagellin protein all stages of infection cross reactions with other spirochaetes are common Page 19 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Test line Borrelia antigens and their diagnostic value OspC (22–23 kDa) specific outer surface protein C after infection: often in early stages (important IgM marker), but also in late stages occasional after vaccinations (early and short appearance) p18 (18 kDa) highly specific, strong marker late infection stages (especially in strongly positive sera) 9.3. EVALUATION OF THE ANTIGEN TEST LINES Before analysing the test lines, two questions have to be addressed: 1. Is the animal frequently or often exposed to tick bites? If this is the case, the blot will show several specific test lines even in the absence of an ongoing infection. 2. Is the clinical presentation suggestive of an ongoing borreliosis? In the absence of fever and / or lameness, distinguishing between a past exposure and an ongoing infection may be extremely difficult. 9.4. POINT EVALUATION OF THE BORRELIA ANTIGENS IN MegaBLOT® LYME IgM Borrelia antigen Points IgM Borrelia antigen Points IgM p100 1 Flagellin (p41) 1 OspA 3 OspC 7 p58 3 p18 3 BmpA (p39) 3 9.5. INTERPRETATION OF POINT EVALUATION: Sum of points evaluation IgM <6 negative 6 questionable >6 positive < 6 points: There are no IgM antibodies against Borrelia antigens present in the sample. A previous contact with Borrelia is unlikely but cannot be ruled out completely in every case (see below). 6 points: IgM antibodies against Borrelia antigens could not be detected clearly. It is recommended to repeat the test with a new sample after 2–4 weeks. If the result is questionable again, the sample must be rated negative. Parallel testing for IgG antibodies is recommended. > 6 points: IgM antibodies against Borrelia antigens could be detected. Parallel testing for IgG antibodies is recommended. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Page 20 10. LIMITATIONS OF THE TEST • Absence of antibodies against Borrelia antigens in the MegaBLOT® LYME IgM can not rule out a Borrelia infection in all cases. In the early stage of infection, detectable amounts of IgM antibodies may not or not yet be present. In addition, antibiotic therapy in early stages of infection can suppress the formation of antibodies. • An interpretation of the test result should only be done in close connection with clinical results (vaccination certificate!). In the case of unclear or questionable test results, repetitional testing in 2–3 weeks of distance is recommended. • Bacterial contamination of samples or repeated freeze-thaw cycles may affect the test results. • Some samples may cause a dark, continuous or patterned colouring of the LINE Blot Strip. This is due to varying factors of the patient’s sample, which should then be analysed with different serological methods. An interpretation of such LINE Blot Strips is restricted. White test lines on a dark background must be considered negative. 11. SAFETY MEASURES AND PRECAUTIONS • Wear safety clothes (disposable gloves) and wash the hands after finishing the test procedure. • No eating and drinking during test procedure. • The sample material must be seen as potentially infectious and disposed of accordingly, together with the used test-kit components. • Do not use reagents of other manufacturers together with the reagents of this test-kit. • Do not mix reagents of different Lot numbers. • Do not change the caps of the individual reagents among each other. • The use of a tilting table is recommended. Use of an orbital shaker can reduce the binding and washing efficiency. • Close bottles immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. • After first opening, the reagent bottles must be checked for microbial contamination before reusing. • Label the sample material and the incubation tray to ensure a precise assignment. • During incubation and washing, the LINE Blot Strips must be completely covered with liquid, and the labelled side must face up. • To avoid cross contamination and false test results, pipet the patient samples and the Conjugate carefully and without spraying into the channels. Page 21 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. • Do not reuse the incubation trays (cross contamination!). • – Sample Dilution Buffer contains CMIT as preservative. – Substrate solution contains hydrogen peroxide. Absolutely avoid skin or mucosa contact! – Wash Buffer and Conjugate contain ethanol as preservative. In the used concentration, ethanol has hardly any toxicological risk upon contact with skin and mucous membranes. • Only use clean pipette tips, dispenser and laboratory material. • Never pipet with your mouth! • MegaBLOT® LYME IgM is only provided for the use of qualified staff that knows the work technique objectionable. The test procedure, the information, the safety measures and warnings in the instructions for use are to be followed strictly. For use of the test-kit in diagnostical instruments, the test method has to be validated. Each change in appearance, composition and the application as well as each use in combination with other products not authorised by the manufacturer is not permitted; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents being associated herewith. 12. LIABILITY The entire risk due to the performance of this product is assumed by the purchaser. The manufacturer shall not be liable for indirect, special or consequential damages of any kind resulting from the use of this product. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. 13. SHORT PROTOCOL MegaBLOT® LYME IgM TEST PREPARATION Warm needed LINE Blot Strips and reagents to room temperature (20–25 °C). Dilute Wash Buffer 1:20 with distilled water. Assignment of the samples to the LINE Blot Strips and the respective channel of the incubation tray. TEST PROCEDURE Add 1 ml SDB each into a channel. Place LINE Blot Strips into the channel. Take care that the strips are completely submerged! Add 5 µl of sample into the respective channel, next to the strip. Cover and incubate 60 minutes at room temperature (20–25 °C) with soft tilting. Wash 3× 5 minutes with soft tilting with 1 ml Wash Buffer each. Add 1 ml of Conjugate into each channel. Cover and incubate 30 minutes at room temperature (20–25 °C) with soft tilting. Wash 3× 5 minutes with soft tilting with 1 ml Wash Buffer each. Add 1 ml of Substrate (TMB) into each channel. Cover and incubate 20 minutes at room temperature (20–25 °C) with soft tilting. Wash 3× with deionised or distilled water. Dry and evaluate. Page 22 Page 23 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Abkürzungen / Abbreviations • CMIT Chlormethylisothiazon / 5-Chloro-2-methyl-2H-isothiazol-3-one • H2O2 Wasserstoffperoxid / Hydrogen peroxide Page 24 MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. MegaBLOT® LYME IgM ad us. vet. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 2. Verwendungszweck 3. Testprinzip 4. Testkitkomponenten 5. Haltbarkeit und Lagerung 6. Informationen zum Probenmaterial 7. Testvorbereitung 8. Testdurchführung 9. Testauswertung 10. Einschränkungen des Tests 11. Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise 12. Haftung 13. Kurz-Protokoll MegaBLOT® LYME IgM Contents Seite 2 2 3 3 4 5 5 6 7 9 10 11 12 Page 1. Introduction 2. Intended use 3. Test principle 4. Test-kit components 5. Stability and storage 6. Information on the sample material 7. Test preparation 8. Test procedure 9. Test evaluation 10. Limitations of the test 11. Safety measures and precautions 12. Liability 13. Short protocol MegaBLOT® LYME IgM 13 13 14 14 15 15 16 17 18 20 20 21 22 Abkürzungen / Abbreviations 23
