Skript Tutorium 5
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BiochemietutoriumNr5 JonathanHammer,SelinaLerch TutoriumNummer5 Übersicht WiederholungderletztenStunde • • • AllgemeineVorgehensweisebeiderProteinsequenzierung Chromatographie Edmann-Abbau TandemMassenspektrometrie Proteinstruktur • • Allgemeines Sekundärstruktur:α-Helixundβ-Faltblatt Eselsbrücken Tyrosin:PhenylalaninmitOH-Gruppe Chromatographie 1. DienachstehendendreiPeptidesollenmittelschromatographischerMethodengetrennt werden. PeptidA:G-T-I-E-F PeptidB:Y-T-I-C-T PeptidC:Y-T-K-C InwelcherReihenfolgeeluierendiePeptide a)beiderGelfiltration? b)voneinemKationenaustauscherbeipH8,wennmandieNaCl-Konzentrationinder mobilenPhasegraduellvon0auf500mMerhöht? c)voneinerreversenPhaseSäulebeipH3,wennmandieAcetonitril-Konzentrationinder mobilenPhasegraduellvon0auf50%erhöht? BegründenSiejeweilsIhreAntwort.(pks-TabelleimAnhang!) BiochemietutoriumNr5 • • • 1. 2. 3. • 1. 2. JonathanHammer,SelinaLerch Antwort a) 1.PeptidA+B 2.PeptidC Wichtig:BeiderGelfiltrationwirdnachderLängederAminosäurenketteaufgetrenntund nichtnachderMolekülmasse! b)LadungvonPeptidA:-1,PeptidB:+/-0,PeptidC:+1 PeptidA PeptidB PeptidC c)hydrophobeRestevonPeptidA:3,PeptidB:2,PeptidC:1 PeptidC PeptidB PeptidA Edman-Abbau 1. DasPolypeptidBC1wirdinparallelenAnsätzemitjeweilseinerderEndoproteasenTrypsin (spaltetnachArgundLys)undGluC(spaltetnachGlu)verdaut.DieenthaltenenPeptide werdenmittelsUmkehrphasenchromatographievoneinandergetrenntundjeweilsmittels Edmanabbauvollständigsequenziert.DabeiwurdendienachstehendenSequenzenermittelt. Peptid1:F-K-H-N-K-L-E Peptid2:N-O-R-E Peptid3:A-D-C-E-F-K Peptid4:L-E-N-O-R GebenSiedieSequenzdesPolypeptidsBC1an! 2. DasPeptidF-K-H-N-K-L-EsollmitHilfedesEdman-Abbaussequenziertwerden.Welches PeptidliegtnachdemdrittenZyklusvor?GebenSieNamenundchemischeStrukturdes Reagenzesan,dasbeimEdman-AbbaumitdemPeptidreagiert! Tandem-Massenspektrometrie 1. DieTandemMassenspektrometrie ergabfüreinunbekanntesPeptid nebenstehendesSpektrum.Werten SiedieerhaltenenDatenaus,indem SiedieAminosäuresequenzdes untersuchtenPeptidsbestimmen. VerwendenSiedafürdieMassenaus dergegebenenTabelle(nächste Seite). BiochemietutoriumNr5 JonathanHammer,SelinaLerch Lösung UnterderVoraussetzung,dassalleFragmentedery-Reiheeinfachgeladensindgilt:dieDifferenzder m/z-VerhältnissezweierbenachbarterPeaksderselbenReiheentsprichtderMolekülmasseder Aminosäure,umwelchesichdiebeidenFragmenteinderLängevoneinanderunterscheiden FürdieY-Reihe: • • • • • • y2-y1=113,04DaàLeucin/Isoleucin y3-y2=113,1DaàLeucin/Isoleucin y4-y3=70,96DaàAlanin y5-y4=114,12DaàAsparaginsäure y6-y5=115DaàAsparagin y7-y6=147,01DaàPhenylalanin àPeptid:L/I-L/I–A–D–N–F Proteinstruktur 1. ErklärenSiedieBegriffePrimär-,Sekundär-,Tertiär-undQuartärstrukturbeiProteinen! 2. WasverstehtmanunterdernativenKonformationundwasunterderdenaturierten? 3. ZeichnenSiediechemischeStrukturdesuntenimEinbuchstabencodegegebenenβ-Faltblatt (vierAS-Reste,stattNundR:FundY!).GebenSiegepunkteteLinienan,welchefunktionellen GruppendervierASdurchnicht-kovalenteWWverbundensind! BiochemietutoriumNr5 JonathanHammer,SelinaLerch HandeltessichbeidemebenvonIhnengezeichnetenβ-Faltblattumeinparallelesoder antiparallelesFaltblatt? 4. a)ZeichnenSiediechemischeStrukturdesPeptidsW-K-E-I-Gindemdominierenden LadungszustandbeipH5,5!(TabelleimAnhang!) b)WelchenpH-WertweisteineLösungauf,inderdienetto+1geladeneSpeziesunddie nettoungeladeneSpeziesdesPeptidesimVerhältnis10:1vorliegen. AminosäurenderWoche • Tryptophan • Glutaminsäure • Lysin BiochemietutoriumNr5 JonathanHammer,SelinaLerch Tabelle1Anhang:pKs-WertederAminosäuren
