UPLC-ANALYSE VON AMINOSÄUREN IN MAIS UND SOJA

UPLC-ANALYSE VON AMINOSÄUREN IN
MAIS UND SOJA
Diplomarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades der Diplom-Ingenieurin
Studienrichtung „Landwirtschaft"
eingereicht
von
Sigrid Haslinger
Betreuer: Ao. Univ. Prof. Dipl. Ing. Dr. Helmut MAYER
Universität für Bodenkultur Wien
Department für Lebensmittelwissenschaften und - technologie
Abteilung für Lebensmittelchemie
Wien, Jänner 2008
Mein Dank gilt Herrn Ao. Univ. Prof. Dipl. Ing. Dr. Helmut Mayer für die
Betreuung während der praktischen Durchführung der Versuche und
der Fertigung dieser Arbeit.
Ein Dankeschön auch an alle Mitarbeiter im Labor, die mich beim
praktischen Teil der Diplomarbeit unterstützt haben.
Meiner Mutter danke ich für die finanzielle Unterstützung während
meines Studiums; speziell aber für die gemeinsame Zeit, die langen
Gespräche und die Unterstützung beim Erfüllen meiner Träume.
Ein besonderer Dank gilt meinem Freund für Deinen Rat, Deine Liebe,
Deine Geduld und Deinen unerschütterlichen Glauben an mich.
Zusammenfassung
Summary
1. Einleitung
1.1. Aminosäuren
1.1.1. Allgemein
1.1.2. Vorkommen von einzelnen Aminosäuren
1.1.3. Eigenschaften von Aminosäuren
1
2
4
4
4
6
10
1.2. Einteilung der Proteine nach T.B. Osborne (1907)
1.3. Proteinqualität in der Nahrung
11
12
1.4. Allgemein Mais (Zea mays L.)
14
1.5. Allgemein Sojabohne (Glycine max.)
17
1.6. Allgemein Milch
19
1.7. Hydrolyse von Proteinen
20
1.8. UPLC
1.8.1. Allgemein
24
24
1.8.2. Gerätespezifische Methode Waters AccQ-Tag
26
2. Problemstellung
29
3. Material und Methoden
30
3.1. Probenmaterial
30
3.1.1. Mols
30
3.1.2. Soja
31
3.1.3. Milchpulver
32
3.2. Geräte und Chemikalien
32
3.2.1. Geräteliste
32
3.2.2. Chemikalienliste
34
3.3. Methoden Mais
37
3.3.1. Hydrolyse für Gesamtominosäurenbestimmung
37
3.3.2.. Derivotisierung mittels AccQ-Tag•-Methode
40
3.3.3. Analyse UPLC
40
3.3.4. Ergebnisberechnung
41
3.4. Methoden Soja
3.4.1. Hydrolyse für Gesamtominosäurenbestimmung
41
41
3.4.2. Vorbereitung für die Bestimmung der Freien Aminosäuren 44
3.4.3. Derivatisierung mittels AccQ-Tag'^'^-Methode für TAA
45
3.4.4. Derivatisierung mittels AccQ-Tag•-Methiode für FAA
46
3.4.5. Analyse UPLC
3.4.6. Ergebnisberechnung
46
47
3.5. Methoden Milchpulver
48
3.5.1. Hydrolyse zur Bestimmung der Gesamtaminosäuren
48
3.5.2. Derivatisierung mittels AccQ-Tag'^'^-Methode
51
3.5.3. Analyse UPLC
52
3.5.4. Ergebnisberechnung
52
3.6. UPLC
3.6.1. Kalibration
53
53
3.6.2. Vorbereitungen an der UPLC
3.6.3. Chromatogramme, Integration, Berechnung
55
57
3.6.4. Vorbereitungen vor dem Ausschalten
57
3.7. Methodenoptimierung bei Mais
59
4. Ergebnisse
61
4.1. Mais
61
4.1.1. Gesamtaminosäuren
4.2. Soja
61
80
4.2.1. Gesamtaminosäuren
80
4.2.2. Freie Aminosäuren
93
4.3. Milch
4.3.1. Gesamtaminosäuren
103
103
5. Diskussion
106
6. Literaturliste
11 3
Zusammenfassung
Im Zuge dieser Arbeit wurden die Aminosäuren-Gehaltswerte in Mais,
Soja und Milch untersucht. Die quantitative Bestimmung gelang unter
Verwendung des von der Firma Waters entwickelten Reagenz AQC
zur
Vorsäulen-Derivatisierung
und
anschließender
Analyse
der
entstandenen Derivate mit einem UPLC-System (Ultra Performance
Liquid
Chromatography,
Flüssigchromatographie).
Die
dt.
zu
Ultra-Hochleistungs-
untersuchenden
Aminosäuren
können frei vorliegen oder können in Proteinen und Peptiden
gebunden sein. Ist das der Fall, müssen sie vorweg unter Durchführung
einer sauren Hydrolyse aus den Proteinen gelöst werden.
In
dieser
Diplomarbeit
vorausgegangenen
Analysen
des
Gesamtaminosäurengehalts in Mais stellt sich das Problem einer im
Vergleich zur Literatur um bis zu 50% zu geringen Ausbeute an
Aminosäuren dar. Innerhalb dieser Arbeit wurde versucht, die
Standardbedingungen der sauren Hydrolyse bei 112°C und 20h zu
optimieren. Vor allem eine Erhöhung der Temperatur und damit
Verkürzung der Hydrolysezeit auf 1 h kann als positiver Aspekt erwähnt
werden. Die Versuche eine höhere Ausbeute durch Verwendung
unterschiedlicher
Lösungschemikalien
zu
erlangen,
zeigt
unter
Verwendung von 0,01 N Natronlauge eine deutliche Steigerung des
analysierten Aminosäurengehalts.
Die durch vorherige Kjeldahl-
Bestimmung erhaltenen und durch die Literatur bestätigten Ergebnisse
können aber auch nicht erreicht werden.
Bei der Bestimmung des Gesamtaminosäurengehalts von Soja können
die Standardbedingungen der sauren Hydrolyse bei 112°C und 20h
durch richtige Ergebnisse bestätigt werden.
Der Gehalt an Freien Aminosäuren in Sojabohnen wurde im Auftrag
einer Molkerei
zwischen
bestimmt,
um
Aminosäurengehalt
einen
und
möglichen
Zusammenhang
Schäumungseigenschaften
zu
untersuchen. Auch bei Bestimmung der freien Aminosäuren wurden
verschiedene Parameter der Probenvorbereitung optimiert.
Die Analyse der Gesamtaminosäurenzusammensetzung bei Milch
wurde
zu
Vergleichszwecken
durchgeführt.
Die
Standardprobenvorbereitung wurde wie üblich durchgeführt und
zeigt, dass bei Milch, wie auch schon bei Soja, diese durchaus richtige
Ergebnisse liefert.
Somit kann die Standardprobenvorbereitung für Milch und Soja, beide
sehr proteinreiche Nahrungsmittel, durchaus empfohlen werden. Bei
kohlenhydratreichen Getreiden (z.B.: Mais) kommt es bedingt durch
eine
unvollständige
Hydrolyse
zu
fehlerhaften
Ergebnissen
der
Gesamtaminosäurezusammensetzung.
Summary
In this work, the amount of total amino acids and free amino acids
was analysed. The quantitative determination was done using the
reagent AQC, which was developed by Waters Company for precolumn-derivatisotion and following detection of the built derivates
by on UPLC-system (Ultra Performance Liquid Chromatography). The
analysed amino acids can occur as free amino acids or can be
bound in proteins or peptides. In the second case they hove to be
detached by doing an acid hydrolysis.
Previous analysis of the total amino acid concentration in maize
showed a yield deviation of up to 50% compared to literature
reference. So it was tried to optimize the standard conditions (112°C
for 20h).
Especially using a
higher temperature
(150°C)
and
consequently reducing the hydrolysis time to one hour can be
mentioned positive. The experiments to get a higher yield by using
different dissolving reagents give the most visible rise using 0,01 N
sodium-hydroxide.
However,
the
yields
given
by
literature
or
preceding Kjeldahl-determination were not reached.
The analyses of the total amino acid yield of soya lead to accurate
results using standard sample preparation and hydrolysis conditions
(n2°C20h).
The determination of free amino acids was done in commission of a
dairy, which produces soya drinks. They had problems with foam
during the production process and wanted to investigate a possible
correlation with the concentration of free amino acids. While doing
the analysis, the sample preparation was optimised.
The determination of the total amino acids in milk was done as a
reference method. The sample preparation was done according to
SOP and shows that the standard preparation can be used for
samples rich in proteins.
For analysing milk or soya, both rich in proteins, the standard sample
preparation can be recommended. However, the analysis of foods
rich in carbohydrates (e.g. maize) may lead to incorrect results due to
an incomplete hydrolysis of samples.
1. Einleitung
7.7. Aminosäuren
1.1.1. Allgemein
Aminosäuren sind wichtige Bestandteile in allen Lebensmitteln, sie
nehmen auf praktisch alle Eigenschaften wie Geschmack oder
Verarbeitbarkeit Einfluss. Proteinreiche Produkte können z.B. bei der
Stärke- oder Olgewinnung anfallen indem die Begleitstoffe extrahiert
werden oder indem die Proteine vorab extrahiert und dann
abgeschieden werden. Wichtige Proteinlieferanten sind: Leguminosen
(Sojabohne, ...), Mais bzw. Kartoffel im Zuge der Stärkegewinnung
oder Milch als Lieferant für Molkenproteine [Belitz, 2007].
In der Natur gibt es circa 200 Aminosäuren, die hauptsächlich in
Pflanzen frei vorliegen. Nahrungsproteine sind aus 20 verschiedenen
Aminosäuren aufgebaut, wobei ein Teil davon essentiell bzw. semiessentiell ist (kann vom Körper nicht oder nur teilweise selbst
synthetisiert werden) und ein Teil nicht-essentiell ist.
Zu den essentiellen Aminosäuren gehören Leucin, Isoleucin, Histidin,
Phenylolanin, Tryptophan, Methionin, Threonin, Lysin oder Vajin. Zur
Gruppe der nicht-essentiellen Aminosäuren sind Alanin, Asparagin,
Prolin, Tyrosin, Glycin, Serin, Cystein oder Glutamin zu rechnen [Belitz,
2007].
Die allgemeine Formel für Aminosäuren lautet:
NHrC
Carbamiosäure
OH
R-CH—C
a-Aminoeäuit!
a-CH-CHa-c
,ff-Aminosäure
R-CH-CHj-CHa-C
^-Aminosäure
Abbildung: Allgemeine Formeln von Aminosäuren (Quelle: www.wikipedia.org)
Die Eigenschaften der jeweiligen Aminosäure werden hauptsächlich
durch die Seitenkette
R
bestimmt.
R
kann
ein
aliphatischer,
heterocyclischer oder aromatischer Rest sein [Belitz, 2007].
Eine Einteilung der Aminosäuren ist auf verschiedene Arten möglich.
Eine Einteilung aufgrund der Seitenkette ergibt:
•
Aminosäuren mit ungeladenen, unpolaren Seitenketten:
Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin,
Tryptophan, Methionin;
•
Aminosäuren mit ungeladenen, polaren Seitenketten:
Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin;
•
Aminosäuren mit geladenen Seitenketten:
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Arginin.
NHj
HgC
OH
0
0
HO
HN
NH^
NHo
Alanin (Ala)
0
Arginin (Arg)
0
0
0
OH
NHn
NHn
Cystein (Cys)
NH^
Asparaginsäure (Asp)
NHn
OH
NHj
OH
0
Asparagin (Asn)
0
HO
HS' ^ "X)H
NH.
NH.,
Glutaminsäure (Glu)
Glutamin (Gin)
Glycin (Gly)
0
H3CY'-Y^0H
^N,JJ
NH^
CHg NHj
Histidin (His)
Leudn (Leu)
0
H °
.f^Y^OH
OH
HgC
NH,
Methionin (Met)
Phenyialanin (Phe)
OH
NHn
Threonin (Thr)
Oo
"NH
Serin (Ser)
0
0
CH3 0
HO
ProHn (Pro)
OH
OH
NH„
Tryptophan (Trp)
CH3 0
HO
NH^
Tyrosin (Tyr)
H3C
OH
NH^
VaHn (Val)
Abbildung: Strukturformeln der 20 wictitigsten Aminosäuren (Quelle: www.wikipedia.org)
Aminosäuren wie Methionin, Glutaminsäure oder Lysin können heute
biotechnisch oder synthetisch hergestellt und Nahrungsmittel oder
Futtermitteln zur Geschmacksverbesserung zugesetzt werden. Auch
für therapeutische Zwecke können Aminosäuren beigemischt werden
[Belitz, 2007].
1.1.2. Vorkommen von einzelnen Aminosäuren
Alanin ist für den Menschen nicht essentiell. In den üblichen Proteinen
liegt der Gehalt etwa bei 2 bis 7 %, Gelatine enthält etwa 9%. Ein
besonders hoher Anteil an Alanin lässt sich in Seidenfibrinoin
nachweisen [Belitz, 2007].
Arginin
ist eine semi-essentielle Aminosäure,
die Zufuhr ist in
bestimmten Situationen für den Stoffwechsel sehr wichtig. Das
durchschnittliche Vorkommen in Proteinen beträgt 3 bis 6 %,
besonders hoch ist der Anteil in Protaminen.Vor allem das Protein der
Erdnuss hat mit 11 % einen sehr hohen Anteil. Bekannt ist Arginin vor
allem als Zwischenprodukt in der Harnstoffsynthese [Belitz, 2007].
Asporogin wurde als erste Aminosäure aus Spargel isoliert und ist das
Y-Halbomid der Monoaminsäure Asparaginsäure. Das natürliche
Vorkommen befindet sich hauptsächlich in pflanzlichen Produkten. In
Glykoproteinen kann die Kohlenhydratkomponente N-glykosidisch
über die Amidgruppe gebunden sein [Belitz, 2007].
Asparaginsäure ist in allen tierischen Proteinen, besonders aber in
Albuminen (6-10%) enthalten. Auch Proteine aus Mais können bis zu
12% Asparaginsäure enthalten. Im Vergeich dazu hat Weizen mit 3,8%
einen eher geringen Anteil. Asparaginsäure ist nicht essentiell [Belitz,
2007].
Cystein kann durch Oxidation bzw. Dehydration in dos Disulfid Cystin
umgewandelt werden. Dies geschieht in basischer oder neutraler
Umgebung unter Anwesenheit von Sauerstoff sehr rasch. Cystein kann
nur in saurer Umgebung bestehen. Vor allem bei der Hydrolyse von
Proteinen bildet sich das schwerer lösliche Cystin. Im SchwefelStoffwechsel ist Cystein wichtig. Bis zu einem gewissen Grad kann es
Methionin ersetzen. In größeren Mengen kommt es in Keratinen vor
(9%). Meistens ist es in Proteinen in Mengen von 1 bis 2 % enthalten. Es
ist nicht essentiell.
Glutamin geht leicht in Pyrrolidoncarbonsäure über, die dann zerfällt
und Glutaminsäure abspaltet. Es ist in vielen Produkten pflanzlicher
8
Herkunft enthalten, vor allem in Prolaminen von Weizen, Gerste oder
Roggen (35%).
Glutaminsäure kommt in Proteinen in großen Mengen vor, besonders
reichlich in Milch- (21%), Mais- (18%) oder Sojaprotein (18%). Als
Mononatriumsalz wird
sie
in
verschiedenen
Lebensmitteln
als
Geschmackverstärker (Glutamat) eingesetzt.
Glycin ist eine nicht-essentielle Aminosäure, greift ober als Baustein in
viele biosynthetische Abläufe ein. Grössere Mengen finden sich vor
allem in den Strukturproteinen (Kollagen 25%) [Belitz, 2007].
Histidin
ist
spezieil
für
Säuglinge
essentiell,
da
es
für
den
heranwachsenden Organismus von Bedeutung ist. Es befindet sich in
den Wirkungszentren vieler Enzyme. In den meisten Proteinen kommt
es in den Mengen um 2% vor, nur Blutproteine enthalten etwas mehr
[Belitz, 2007].
Isoleucin ist essentiell. Es ist in Fleisch- und Getreideproteinen mit einer
Menge um 4% und in Ei- und Milchproteinen um 6% enthalten [Belitz,
2007].
Leucin ist weit verbreitet, stellt eine essentielle Aminosäure dar und
kommt meist zwischen 7 und 10% in Proteinen vor. Mais enthält etwa
12% Leucin [Belitz, 2007].
Lysinreiche Nahrungsmittel sind vor allem Fisch und Krebstiere. Viele
Cerialenproteine (vor allem Prolamine) enthalten mit 2 bis 4% relativ
wenig Lysin, damit wird die biologische Wertigkeit der Proteine stark
gesenkt.
Besonders Kinder brauchen Lysin. Die großtechnische
Produktion erfolgt vor allem als Zusatz in der Futtermittel- und
Lebensmittelherstellung [Belitz, 2007].
Methionin ist in tierischen Proteinen in etwas höheren Mengen als in
pflanzlichen Proteinen zu finden. Es spielt in biochemischen Prozessen
(z.B. in der Leber) als Methylgruppendonator eine entscheidende
Rolle und ist daher essentiell. Methionin ist licht- und hitzeempfindlich,
daher können bei technischen Prozessen Verluste auftreten [Belitz,
2007].
Phenylalanin ist essentiell und kommt in Proteinen in Mengen um 4 %
vor. Es kann im Organismus in Tyrosin umgewandelt werden und bei
Mangel aus Tyrosin entstehen [Belitz, 2007].
Prolin
ist
keine
essentielle
Aminosäure.
Es
ist
an
Proteinen
durchschnittlich mit 6 bis 7% beteiligt. Erhöhte Werte sind in
Weizenproteinen zu finden. Vor allem für die Proteinstruktur ist es von
Bedeutung [Belitz, 2007].
Serin kann aus Glycin gebildet werden. In Phosphoproteinen wie
Casein ist es Träger der Phosphorsäure außerdem ist es bei vielen
Proteasen im Wirkungszentrum vorhanden [Belitz, 2007].
Threonin ist eine essentielle Aminosäure. Der Gehalt in Fleisch, Milch
oder Eiern ist in der Regel etwas höher als der in Getreide. Als
limitierender Faktor wirkt es nur dann, wenn die Proteine generell
mindenA/ertig sind [Belitz, 2007].
Tryptophan kommt in tierischen Produkten in kleinen Mengen.(< 2%)
•vor, ist in pflanzlichen Produkten aber noch weniger enthalten. Es ist
eine essentielle Aminosäure und besonders wichtig als Vorläufer der
Nikotinsäure. Erwähnenswert ist, dass Tryptophan bei der sauren
Hydrolyse vollständig zerstört wird und damit nicht mehr nachweisbar
ist [Belitz, 2007].
10
Tyrosin ist meist im Bereich zwischen 2 und 6 % enthalten. Es kann aus
Phenylalanin gebildet werden und stellt eine Vorstufe für Hormone
oder Pigmentstoffe wie Melanine dar [Belitz, 2007].
Valin ist essentiell und kommt in Fleisch und Getreide in etwa der
gleichen Menge vor, nur in Milch und Eier ist der Anteil etwas höher
[Belitz, 2007].
1.1.3. Eigenschaften von Aminosäuren
•
Löslichkeit:
Allgemein ist die Löslichkeit einzelner Aminosäuren in Wasser
sehr unterschiedlich. Prolin, Glycin und Alanin sind gut löslich;
schwer löslich sind Cystin oder Tyrosin. Je weiter man in den
sauren oder alkalischen Bereich übergeht, desto leichter sind
die
einzelnen
unpolaren
Aminosäuren
organischen
durch
Salzbildung
Lösungsmitteln
löslich.
dissoziieren
In
die
Aminosäuren schlecht [Belitz, 2007].
•
Dissoziation:
In wässriger Lösung bilden Aminosäuren je noch pH-Wert der
Lösung geladene Formen: Anionen, Kationen oder Zwitterionen.
Im Allgemeinen liegen sie über einen großen pH-Bereich als
Zwitterionen vor und verfügen über gute Puffereigenschaften.
Als isoelektrischen Punkt bezeichnet man den pH-Wert, bei dem
die Zwitterionen-Form die höchste Konzentration erreicht [Belitz,
2007].
•
Konfiguration und optische Aktivität:
Alle
Aminosäuren
(außer Glycin)
haben
mindestens
ein
asymmetrisches C-Atom und sind daher optisch aktiv. Die in
n
Proteinen normalerweise vorkommenden Aminosäuren haben
am a-C-Atom dieselbe Konfiguration und sind L-Aminosäuren.
D-Aminosäuren
kommen
natürlich
in
einigen
Peptiden
mikrobiellen Ursprungs vor. Die Drehung von Aminosäuren hängt
im Normalfall vom pH-Wert ab [Belitz, 2007].
UV-Absorption:
Aromatische Aminosäuren wie Phenylalanin oder Tryptophan
absorbieren im UV-Bereich (Maximum bei 200 - 230 nm und bei
250 - 290 nm). Daher wird die Absorption bei 280 nm für die
Bestimmung von Proteinen und Peptiden herangezogen [Belitz,
2007].
7.2. Einteilung der Proteine nact) T.ß. Osborne (1907)
Seit 1907 werden die in Getreiden und anderen Stoffen vorhandenen
Proteine aufgrund ihrer Löslichkeit in vier Fraktionen eingeteilt.
Die Albumin-Fraktion ist aus Mehlen mit Wasser löslich, Globuline
lassen sich mit einer Salzlösung, z.B.: 0,4 mol/l NaCI, lösen und als dritte
Fraktion lassen sich mit 70% Ethanol die Prolamine aus dem Mehl
extrahieren. Im Rückstand verbleibt die Fraktion der Gluteline. Diese
können unter Anwendung von verschieden konzentriertem Propanol
in
hochmolekulare und
niedermolekulare
Untereinheiten zerlegt
werdeh.
Verwendung
finden
die
Fraktionen
Albumin
und
Globulin
wahrscheinlich im Cytoplasma als Hilfsstoffe bei der Genese des Korns.
Auch Enzyme können hierzu gezählt werden. Bei Prolaminen und
Glutelinen handelt es sich vorwiegend um Reserveproteine, die bei
der Keimung aktiviert werden können [Belitz, 2007].
12
7.3. Proteinqualität in der Nat)rung
Proteine werden im Darml<anal zu Aminosäuren zerlegt und nach
Absorption zum Aufbau von körpereigener Substanz verwendet. Dies
erfolgt meist im Zuge des Vorganges der „Transaminierung". Dabei
wird die NH2-Gruppe auf eine 2-Oxosäure übertragen. Es entsteht eine
Aminosäure und die reagierende Aminosäure wird wiederum eine 2Oxosäure. Dadurch kann der Körper verschiedene Aminosäuren, wie
z.B.: Alanin, Asparaginsäure oder Serin herstellen. Weiters können
Aminosäuren
durch
Umwandlung
aus
anderen
Aminosäuren
hergestellt werden. So kann aus Methionin Cystein oder aus Serin
Glycin hergestellt werden [Kirchgeßner, 2004].
Sind für bestimmte Aminosäuren im Stoffwechsel keine Vorstufen
vorhanden, so müssen sie dem Körper mit der Nahrung zugeführt
werden. Dies sind essentielle Aminosäuren [Kirchgeßner, 2004].
Aber auch bei erhöhtem Bedarf an nicht-essentiellen Aminosäuren
kann es dazu kommen, doss zu wenige im Zuge des Stoffwechsels
erzeugt werden und es zu Mangelerscheinungen kommt. Dies wurde
bei einem Experiment in der Schweinemast bewiesen [Kirchgeßner,
2004].
Somit ist die Proteinversorgung beim Menschen und auch bei
monogastrischen
Tieren
weitgehend
eine
Versorgung
mit
Aminosäuren. Jeder Organismus braucht für den Eiweißstoffwechsel
ein
spezielles
Aminosäurenmuster
Leistungsstoffwechsel aufrecht zu
Aminosäure,
so wird
sofort
um
den
halten.
der gesamte
Erhaltungs-
und
Fehlt eine essentielle
Wert
der
Nahrung
herabgesetzt. Diese Aminosäure wirkt „limitierend". Auch die Relation,
13
der in der Nahrung vorhandenen Aminosäuren spielt eine wichtige
Rolle für die Wertigkeit des Proteins. Als Referenz wird das Idealprotein,
also ein Protein in dem alle Aminosäuren in nötiger Menge und
richtiger Relation vorliegen, angenommen. Dieses Idealprotein hat die
höchste Wertigkeit und dient zur Abschätzung der Wertigkeit von
anderen Substanzen. Die Qualität des Nahrungsproteins ist damit
umso höher, je näher das Aminosäurenmuster an den Bedarf des
Tieres oder Menschen herankommt [Kirchgeßner, 2004].
Unter Biologischer Wertigkeit eines Proteins „versteht man nach
Thomas (1909) und Mitchell (1924) den Anteil des absorbierten
Stickstoffs, der im Körper für den N-Erhaltungsstoffwechsel und für die
Neusynthese
N-haltiger
Körperbestandteile
(Proteinansatz)
Verwendung findet." [Kirchgeßner, 2004]
Es kann somit eine Aussage getroffen werden, wie viel g intermediär
genutzter Stickstoff aus 100g absorbiertem Futterstickstoff bezogen
werden kann.
Tabelle: Biologische Wertigkeit einiger Futter- bzw. Nahrungsmittel [Quelle: Kirchgeßner, 2004]
Nahrungs-ZFuttermitte!
Ei
Kuhmilch
Sojabohnen, roh
Mais
Ist in
einem
ungenügender
Nahrungs- bzw.
Menge
Biologische Wertigkeit
96
92
64
54-60
Futtermittel
vorhanden,
so
eine Aminosäure in
kann
man
sich
die
Ergänzungwirkung der Futtermittel zu Hilfe nehmen und der Ration ein
zusätzliches Futtermittel zugeben, das die gewünschte Aminosäure in
ausreichender Menge enthält. In diesem Zusammenhang wichtig sind
die essentiellen Aminosäuren Methionin und Lysin. Eine weitere Form
der Ergänzung ist die direkte Zugabe von synthetisch erzeugten
Aminosäuren [Kirchgeßner, 2004].
14
Die biologische Wertigkeit spielt auch für ökologische Betrachtungen
eine wichtige Rolle. Ist die biologische Wertigkeit für ein Futterprotein
in der Tierernährung niedrig, muss eine entsprechend hohe Menge
des Proteins zugeführt werden, um alle essentiellen Aminosäuren in
ausreichender Menge zu Verfügung stellen zu können. Dies bewirkt
wiederum,
dass
andere
Aminosäuren
in
großem
Überschuss
vorhanden sind und der enthaltene Stickstoff über den Harn an die
Umwelt abgegeben wird. Dies kann zu einer enormen Belastung der
Umwelt führen.
1.4. Allgemein Mais (Zea mays L)
Mais ist eine einjährige
Pflanze
und
gehört zur Familie der
Gramineaen. Teilweise werden die Pflanzen als Ganzes geerntet,
meist werden aber nur die Körner geerntet. Bekannt ist Mais vor allem
durch den hohen Kohlenhydratanteil von bis zu 65% [Geisler, 1991].
Die
Keimung
erfolgt
im
Frühjahr
ab
etwa
8°C,
optimale
Wachstumstemperatur ist zwischen 25°C und 35°C.
Ursprünglich stammt der Mais aus Süd-Amerika und war daher vor der
Entdeckung Amerikas hauptsächlich in indianischen Kulturen bekannt.
Mais kann mit dem Kolben ausserhalb der menschlichen Produktion
nicht vermehrt werden. Die heutige Verbreitung geht weit über den
subtropischen
Raum
hinaus.
Begrenzend
wirkt
nur,
dass
die
Leistungfähigkeit stark von der Temperatur abhängig ist. Durch eine
hohe Schwankungsbreite in der Vegetationsdauer zwischen den
einzelnen Formen ist ein Anbau bis nach Süd-Skandinavien möglich
[Geisler, 1991].
15
Der heutige Maisanbau basiert hauptsächlich auf Hybridzüchtungen;
dabei wird der Heterosiseffekt genutzt und durch Kreuzung von
Inzuchtlinien besonders ertragsstarke Sorten erzeugt [Geisler, 1991].
Bei
günstigem
Klima
steht
die
Nutzung
als
Körnerfrucht
im
Vordergrund; Hauptzweck ist die Verfütterung an Tiere. Hierfür spielt
auch die Ernte als
„Silomais"
(Ernte der ganzen
Pflanze und
Konservierung durch Ansäuerung) eine Rolle. In der menschlichen
Ernährung wird Maismehl wegen der fehlenden Backfähigkeit weniger
eingesetzt [Geisler, 1991].
Die Weiterverarbeitung zu Maisstärke und Maiseiweiß ist ein wichtiger
Industriezweig. Auch die Gewinnung von Maiskeimöl kann erwähnt
werden. Die Qualität der Proteine kann als niedrig bezeichnet
werden, da der Anteil an essentiellen Aminosäuren nicht hoch genug
ist [Geisler, 1991].
Die Zusammensetzung der Aminosäuren zeigt im Allgemeinen, dass
generell bei Getreide, im speziellen aber bei Mais der Gehalt an Lysin
und Methionin gegenüber Milchproteinen niedrig ist. Heute gibt es
aber durch
spezielle
Züchtungen
auch
Maissorten
mit
einem
gesteigerten Gehalt an essentiellen Aminosäuren [Belitz, 2007].
Der Gesamtproteingehalt beträgt bei Berechnung mittels N x 6,25
durchschnittlich 9,2 g/lOOg [Souci, 2000].
16
Tabelle: Durchschnittliche Aminosäurenzusammensetzung in Mais [Quelle: Souci, 2000]
Aminosäuren
Menge [mg/100 g]
Variation
Menge [mg/100 g]
Alanin
790
770 - 830
Arginin
420
190-560
Asparaginsäure
620
590 - 630
Cystein
140
70 - 280
Glutaminsäure
1780
1740- 1880
Glycin
430
430 - 440
Histidin
260
130-330
Isoleucin
430
350 - 620
Leucin
1220
910-2110
Lysin
290
40 - 480
Methionin
190
90 - 400
Phenylalanin
460
320-510
Prolin
1020
930- 1190
Serin
520
500 - 530
Threonin
390
320-510
Tryptophan
70
40-110
Tyrosin
380
190-690
Valin
510
430 - 740
Gesamt
9920
Durch die Fraktionierung von Osborne ist bekannt, dass Mais einen im
Vergleich zu anderen Getreidearten hohen Prolamingehalt hat. Der
Gehalt an Albumin ist als niedrig einzustufen. Das Verhältnis Prolamine
zu Glutelinen beträgt in etwa 1:1 [Belitz, 2007].
Tabelle: Proteinfraktionen noch Osborne in Mais [Quelle: Belitz, 2007]
Fraktionen
Protein in Mais [%]
Albumine
4,0
Globuline
2,8
Prolamine
47,9
Gluteline
45,3
17
1.5. Allgemein Sojabohne (Glycine max.)
Soja zählt zu den einjährigen Leguminosen. Als Wildform wird eine aus
Asien stammende Pflanze vermutet. Heute wird weltweit Soja
angebaut, wobei der subtropische Raum besonders geeignet ist.
Durch die Züchtung von frühreifen Sorten wurde ein Anbau bis in hohe
Breitengrade ermöglicht, eine Einschränkung im Ertrag ist aber zu
erwarten da Sojabohnen Kurztagspflanzen sind. Die Entwicklung ist bei
tieferen Temperaturen verlangsamt. Leistungsfähige Sorten brauchen
eine
Vegetationsdauer von
etwa
150 Tagen.
Eine weltweite
Verbreitung begann erst als die Verwendung zur Ölherstellung
bekannt wurde. Mit einer Anbaufläche von etwa 90 Mio. ha werden
über 210 Mio. t Soja erzeugt. Soja kann sowohl als Ölpflanze, als auch
als Eiweißpflanze genutzt werden. Die Ölgehalte können, je nach
Sorte, bis zu 20% erreichen [Geisler, 1991].
Das enthaltene Eiweiß kann als hochwertig bezeichnet werden;
essentielle Aminosäuren wie Isoleucin, Leucin, Valin, Lysin oder Arginin
sind in hohen Konzentrationen enthalten. Die bei der Olgewinnung
entstandenen Rückstände werden daher häufig als Futtermittel in der
Rinder- und Schweinemast eingesetzt. Für die menschliche Ernährung
sind vor allem die unreifen Samen interessant, da die reifen Früchte
einen unangenehmen Geschmack aufweisen können und zum Teil
auch toxische Stoffe enthalten können [Geisler, 1991].
Der Gesamtproteingehalt beträgt bei einer Berechnung mittels N x
6,25 durchschnittlich 37,6 g/lOOg [Souci, 2000]..
18
Tabelle: Durchschnittliche Aminosäurenzusammensetzung in Soja [Quelle: Souci, 2000]
Aminosäure
Menge
[mg/lOOgl
Alanin
1530
Arginin
2360
Asparaginsäure
3990
Cystein
590
Glutaminsäure
6490
Glycin
1420
Histidin
830
780 - 880
Isoleucin
1780
1580-1980
Leucin
2840
Lysin
1900
1430-2330
Metliionin
580
490 - 680
Pinenylalanin
1970
1830-2150
Prolin
1820
Serin
1690
Variation
[mg/IOOpl
2010-2670
520 - 660
Threonin
1490
1350-1660
Tryptophan
450
400-510
Tyrosin
1250
1180-1330
Valin
1760
1420-1940
Gesamt
34740
Hülsenfrüchte im Allgemeinen weisen nach Osborne-Fraktionierung
nur die Albumine, Globuline und Gluteline auf. Die Fraktion der
Prolamine ist nicht bekannt. Soja im Speziellen kann auf zwei
Fraktionen reduziert werden: Albumine und Globuline. Letzere Fraktion
macht 90% der Proteine aus.
Tabelle: Proteinfraktionen nach Osborne in Mais [Quelle: Belitz, 2007]
Fraktion
Albumine
Globuline
Gluteline
Prolamine
Protein in Soja [%]
10
90
0
0
19
7.6. Allgemein Milch
„Milch
ist
die
von
den
Milchdrüsen
sowohl
des
Menschen
(Frauenmilch, Humanmilch) als auch der Säugetiere abgeschiedene
Flüssigkeit, die dem Neugeborenen als Nahrung dient" [Spreer, 2005].
Die deutsche Milchverordnung definiert: „Milch ist das durch ein- oder
mehrmaliges tägliches Melken gewonnene unveränderte Eutersekret
von zur Milchgewinnung gehaltenen Kühen" [Spreer, 2005].
'
Äußerlich kann Milch als weiße, undurchsichtige und homogene
Flüssigkeit beschrieben werden.
Laut Definition im Österreichischen Lebensmittelkodex handelt es sich
bei „Milch" ohne nähere Angabe immer um Kuhmilch [AMA, 2007].
In Österreich gibt es noch etwa 50.000 Milchbauern, die in etwa die
Hälfte der österreichischen Nutzfläche bewirtschaften. Damit kann ein
Großteil der heutigen Natur- und Kulturlandschaft erhalten werden
[AMA, 2007].
Von der Verbraucherseite her betrachtet, liegt Österreich mit einem
etwa
70%igen
Anteil
von
Frischmilchkonsumenten
an
der
Gesamtbevölkerung EUweit über dem Durchschnitt [AMA, 2007].
Milch kann zu den ältesten Lebensmitteln der Menschen gezählt
werden
und
weist
hohe
Wertigkeit
auf.
Sie
enthält
alle
Grundnährstoffe und Wirkstoffe, die zur Erhaltung und Entwicklung des
Lebens wichtig sind.
20
Für die Verarbeitbariceit von Milch gibt es verschiedenste Faktoren
bzvy/. Einflussbereiche: Sauberes Melken, schnelle Kühlung, kurze
Transportwege, frische Verarbeitung. Von der Landwirtschaftlichen
Seite aus spielen auch noch die Fütterung und die Züchtung im
Vorfeld eine wesentliche Rolle [AMA, 2007].
Der Proteingehalt der Milch kann durch die Fütterung der Tiere stark
beeinflusst werden und kann durchschnittlich zwischen 3,0% und 3,6%
schwanken. Die Proteinfraktion kann nicht als einheitliches Ganzes
betrachtet werden, sondern unterteilt sich in 2 Fraktionen: etwa 80%
Caseine und etwa 20% Molkenproteine [Spreer, 2005].
Trockenmilch
verarbeiteter
(auch
Milch
Milchpulver)
durch
wird
Wasserentzug
aus
molkereimäßig
(Verdampfen
oder
Verdunsten) hergestellt. Ein Wassergehalt unter 5% wird gefordert.
Magermilchpulver wird aus Milch mit weniger als 1,5% Fett erzeugt. In
der Lebensmittelindustrie werden vor allem die Vorteile in der
Lagerung bzw. die vielfältige Verwendungsmöglichkeit geschätzt und
damit dem Einsatz von Vollmilchpulver vorgezogen [Spreer, 2005].
1.7. Hydrolyse von Proteinen
Proteinogene Aminosäuren erhält man zum überwiegenden Teil
durch Totalhydrolyse von Proteinen und anschließende Trennung des
dabei anfallenden Aminosäurengemisches. So ist ein Großteil der 20 LAminosäuren zugänglich [Latscha, 2002].
Der Eiweißabbau im Organismus wird durch proteolytische Enzyme
eingeleitet, die sehr spezifische Spaltungspositionen und ein pH-
21
spezifisches Optimum aufweisen. Zuerst werden Peptide und Proteine
in kleinere Fragmente zerlegt und dann weiter abgebaut.
Die Söureomid-Bindung der Peptide wird durch Hydrolyse mit Säuren
oder Basen gespalten um so die einzelnen Aminosäuren freizusetzen.
Hierbei wird die saure Spaltung bevorzugt, da der Einsatz von Basen zu
racemischen Gemischen führt [Latscha, 2002].
^eH-G?I^GH^GO0MJ'¥V>lT»20i *t2Mpi
I
I
1
+NH3-CH-COOH+ +NH3-CH-COOH.
Abbildung: Saure Hydrolyse von Peptiden [Quelle: http://www.chemguide.co.uk]
Generell gibt es verschiedene Arten
Veränderungen
kann
man
hinsichtlich
Hydrolyse durchzuführen,
Reaktionsflüssigkeit
und
Temperatur bzw. Dauer der durchgeführten Hydrolyse durchführen.
Die allgemein übliche Methode sieht 6 N HCI als Hydrolysereagenz
vor, die Reaktionszeit beträgt 24h bei 110°C [Fountoulakis, 1998; Albin,
2000; Solchert, 2003; Sarwar und Botting, 1993].
Generell sieht Fountoulakis (1998) eine doppelte Reaktionsrate bei
einem Temperaturanstieg von 10°C vor. Dies bedeutet daher, dass
eine Hydrolyse bei 160°C für 45 min einer Hydrolyse bei 110°C für 24 h
entspricht.
im Laufe der Zeit wurden viele Zeit- und Temperaturversuche
durchgeführt und festgehalten. So testet Weiss (1997) eine Hydrolyse
bei 155°C für 20, 30 und 45 min. Auch Hydrolysetemperaturen von
115°C für 24 oder 42 h sind im Gespräch [Liu, 1994]. Dazu verwendet
22
Liu als Reaktionsflüssigkeit 6N HCI nnit 0,5% Phenol. Im gleichen
Temperaturbereich von 114°C schlägt van Wandelen (1997) eine
Reaktionszeit von 24 h mit 200 pl 6N HCI mit einem Kristall Phenol vor.
Wieder wesentlich höhere Temperaturen testen Lucas und Soleto
(1982) im Vergleich zur Standardmethode und kommen zu dem
Ergebnis, dass es durchaus gleichwertige Ergebnisse sind.
Eine Temperatur von 166°C für 25 min schreiben Gehrke und Zumwalt
in Fountoulakis (1998) vor.
Auch das Begleitheft zur PicoTag-Workstation gibt einen Hinweis zur
Erhöhung der Temperatur auf 150°C und somit einer Senkung der
Reaktionszeit auf 1 h.
Salzsäure hat sich als Hydrolysereagenz durchgesetzt, weil es bei der
Rekonstitution mit Puffer nur mehr in kleinen Mengen vorkommt, nur
wenig Substrat zur Analyse nötig ist und weil sie sowohl in der Flüssigais auch in der Gashydrolyse einsetzbar ist [Fountoulakis, 1998].
Allgemein
kann
Aminosäurenhydrolyse
gesagt
immer
werden,
von
dass
einer
eine
gute
funktionierenden
Hydrolysemethode abhängig ist. Hydrolyse ist aber immer ein
Kompromiss zwischen dem vollständigen Ablauf der Reaktion und der
Konservierung der entstehenden Produkte. Sie ist im Allgemeinen als
die größte Quelle an Unzulänglichkeiten während der Analyse
anzusehen [Fountoulakis, 1998].
Reubsaet et al. (1998) beschreiben die Hydrolyse als eine Reaktion,
die immer zu Degradation führen kann. Salchert et al. (2003) führen
dies auf die unterschiedliche Sensibilität der Peptidbindungen gegen
23
das verwendete Hydrolysereagenz zurück. Somit kommt es zu
Abweichungen zwischen dem Ergebnis der Messung und dem
tatsächlichen Gehalt an Aminosäuren in der analysierten Probe.
Mit steigender Konzentration der Aminosäuren in der Lösung steigt
auch die Genauigkeit der Analyse. Es werden für die Aminosäuren
Serin, Isoleucin und Valin Korrekturfaktoren von 6% angegeben. Auch
eine Theorie, dass man den 100% genauen Wert nur durch Messungen
noch 10 Temperaturintervallen zwischen 2 und 141 h Hydrolyse
bekommt wird aufgestellt [Fountoulakis, 1998].
Verluste von einzelnen Aminosäuren werden in der Literatur in vielen
Fällen zugestanden. Die Zerstörung von Tryptophan während der
sauren Hydrolyse wird sowohl von Solchert et al. (2003) als auch von
Fountoulakis (1998) bestätigt. Fountoulakis beschreibt außerdem die
Möglichkeit einer teilweisen Zerstörung von Tyrosin bei Verwendung
eines nicht 100% reinen Hydrolysereagenzes. Weiters sieht er vor allem
bei Serin und Threonin Verluste von 5 bis 10%. Weitere Verluste können
bei Cystin, Serin, Threonin, Arginin und Aperoginsäure auftreten. Die
Aminosäuren Methionin und Glycin können steigen, wenn Schmutz in
das Substrat eingebracht wird [Liu, 1994].
Zusätzlich beschreibt Albin (2000) in seinem Bericht eine langsame
Freisetzung der Aminosäuren Valin und Isoleucin. Er stellt somit fest,
dass eine Hydrolyse von 24h bei 110°C nicht immer den maximalen
Ertrag an Aminosäuren liefert.
Fountoulakis (1998) sieht eine Hydrolysezeit von bis zu 120h für
optimale
Ergebnisse
nötig,
da
er
bei
Bindungen
zwischen
aliphatischen Resten mit Aminosäuren wie lle-lle oder Val-Val
24
Resistenzen
gegen
die
Hydrolyse
sieht.
Er
deutet
auf
eine
Wiederfindungsrate von 50 bis 70% hin.
Als Schutzsubstanz für Aminosäuren werden von
Blackburn in
Fountoulakis (1998) Mercaptoethanol und Phenol beschrieben.
Auch dos Begleitheft von Waters für die PicoTag-Workstation weist auf
mögliche Verluste bei den Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin
hin.
Schlussendlich sehen Salchert et ol. (2003) in einer sauren Hydrolyse
mit darauf folgender Analyse mittels HPLC die beste Methode zur
Bestimmung von gebundenen Proteinen.
Die
von
Waters
entwickelte
AQC-Methode
für
eine
Vorsäulenderivatisierung wird von Fountoulakis (1998) aufgrund der
Stabilität der erhaltenen Derivate als positiv bewertet. Auch die UVMessung bei 254 nm sieht er als akzeptabel an.
1.8. UPLC
1.8.1. Allgemein
Das System der UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography; dt.
Höchst
auflösende
Flüssigkeitschromatographie)
Weiterentwicklung
der
HPLC-System
Chromatography;
Hoch
auflösende
(High
kann
Performance
als
Liquid
Flüssigkeitschromatographie)
angesehen werden. Entstanden ist diese Analysentechnik aus der
Überlegung der Trennung durch neue Trennsäulen und damit
verbunden kleineren Partikeln mehr Effizienz zu verleihen [Waters,
1993].
25
Die Trennleistung wird durch ein Unterschreiten der Teilchengröße von
2,5 |jnn effizienter auch wenn die Flussrate gesteigert wird. JJ. van
Deemter liefert die theoretischen Überlegungen und beschreibt den
Zusammenhang zwischen Flussrate und Bodenhöhe (HETP) in einer
Gleichung [Waters, 1993],
HPLC
H
T
P 10
M
ACQUiTYUPtC. System
2
3
4
S
linear Velocity [u, mm/tec] -
FW Roto Iml/n^]:
E>'1.0mm
0.04
0.07
0.10
D-2.1 mm
0.15
03
0.43
D -4.6 ran
07
1.4
3.)
0.»'
0.17
2:8
0.W
0*
3J
4.2
i».'o3
4.9
Abbildung: Van Deemter-Kurve: Bei Partiicelgrößen von ],7\in\ steigt die Effizienz aucli bei einenn Anstieg
der linearen Geschwindigkeit [Quelle: Swartz et Murphy, 2004]
Im Bereich der Gradientenelution ist die Peakkapazität, also die Zahl
von Peaks, die in einem Chromotogramm vorkommen dürfen,
ausschlaggebend
für
die
Trennleistung.
Dabei
besteht
ein
Zusammenhang mit der Gradientendauer (d.h. Analysezeit) und dem
Fluss. Um die volle Peakkapazität erreichen zu können muss der Druck
deutlich (bis zu 1000 bar) gesteigert werden.
Durch das Arbeiten im „UPLC-Bereich" der Van Deemter Kurve kann
man die Geschwindigkeit, die Auflösung und die Empfindlichkeit der
Analyse gegenüber den herkömmlichen HPLC-Systemen steigern.
26
Bei dieser Art von Technologie steht die Verwendung einer stationären
Phase
mit
Partikeldurchmessern
von
l,7|jm
Durchmesser
im
Mittelpunkt. Dies bewirkt, dass für eine gegebene Säulenlänge der
Gegendruck
umgekehrt
proportional
mit
dem
Quadrat
des
Partikeldurchmessers ansteigt. Auch die optimale Flussgeschwindigkeit
durch
die
Säule
steigt
mit
sinkender
Partikelgröße.
Aus
der
Kombination dieser Fakten lässt sich ableiten, dass bei Verkleinerung
der
Partikelgröße
gleichzeitig
Geschwindigkeit,
Peakkopazität,
Auflösung und Empfindlichkeit gesteigert werden können.
Durch die kleinere Partikelgröße ergibt sich die oben erwähnte
erhöhte
optimale
Flussgeschwindigkeit
und
daraus
auch
eine
Verkürzung der verwendeten Säule. Die verwendete Säule hat eine
Länge von 5 cm und wird mit einer Flussrate von 0,4 ml/min betrieben
[Waters, 1993].
Nimmt man alle Vorteile des UPLC-Systems, dann ist es unter
isokratischen Bedingungen dreimal schneller als das HPLC-System und
auch die Peakkopazität ist höher.
1.8.2. Gerätespezifische Metliode Waters AccQ-Tag•
Die von der Firma Waters entwickelte AccQ-Tag Methode stellt eine
Form der Vorsäulen-Derivatisation als Folge einer Hydrolyse von
Peptiden oder Proteinen dar.
Durch
dos
speziell
entwickelte
AccQ-Fluor•
Reagenz
(6-
Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate, AQC) werden die
durch die Hydrolyse entstandenen Aminosäuren derivatisiert, damit sie
in Folge durch eine RP-HPLC detektiert werden können.
27
•N'
Waters AccQ-Fluor Reagent
Abbildung: Strukturformel AccQ-Fluor•-Reagenz [www.waters.com]
Diese Methode bietet hohe Genauigkeit, Sensibilität bis in den
piconnolaren
Bereich
und
nicht zuletzt
ist
sie
einfach
in
der
Anwendung [Waters, 1993].
Das AccQ-Fluor'^'^-Reagenz schafft sowohl aus primären als auch aus
sekundären
Aminosäuren
stabile,
fluoreszierende
Derivate.
Als
Nebenprodukt entsteht 6-Aminoquinolin (AMQ), das die Messung
nicht beeinflusst.
ISferivätized?^rSöÄ^
ISIHS
Abbildung: Aminosäurederivatisierung mittels AQC-Reagenz [www.waters.com]
Die Reaktion erfolgt sehr schnell, es bilden sich dabei stabile HarnstoffVerbindungen, die ihre höchsten Fluoreszenz-Werte bei 395 nm
28
aufweisen. Diese Derivate sind bei Raumtemperatur bis zu einer
Woche stabil.
Überschüssiges
Reagenz
reagiert
mit
Wasser
und
bildet
6-
Aminoquinolin (AMQ), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Kohlendioxid
(C02).
CO2
Abbildung: Weiterführende Realction des AQC-Reagenz [Quelle: www.waters.com]
AMQ hat bei 395 nm schlechte Fluoreszenz-Eigenschaften, die
Anwesenheit von NHS und CO2 beeinflussen die Analyse nicht.
29
2. Problemstellung
Im Zuge dieser Arbeit sollten die Aminosäuren in Getreide, speziell
Mais und Soja, mit einer von Waters entwickelten Methode der
Vorsäulen-Derivatisierung analysiert werden. Das spezielle Reagenz
AQC bildet beständige Derivate, die mittels eines UPLC-Systems (Ultra
Performance Liquid Chromatography) quantitativ bestimmt werden
können.
Vorausgegangene Analysen des Gesamtaminosäurengehalts in Mais
zeigen das Problem einer im Vergleich zur Literatur zu niedrigen
Ausbeute
an
Aminosäuren.
Dies
sollte
durch
Verkürzung
der
Hydrolyse-Zeit und Veränderung der Standardprobenvorbereitung
verbessert werden.
Bei
den
geriebenen
Sojaproben
Gesamtaminosäurengehalt
als
Aminosäuren
werden.
bestimmt
auch
sollten
der
Neben
sowohl
Gehalt
der
an
der
freien
Standard-
probenvorbereitung sollten in beiden Fällen neue Methoden zur
Probenvorbereitung getestet werden.
Zu Vergleichszwecken sollte der Gesamtaminosäurengehalt in Milch
zur Überprüfung der erhaltenen Ergebnisse bei Soja und Mais
analysiert werden.
30
3. Material und Methoden
3.7. Probenmaferial
3.1.1. Mais
Tabelle: Probenname und - herkunft der Maisproben
Seriennummer
Probennänne
SNr. 1
St.Georgen DKC4626
SNr. 12
St.Georgen PR36P85
SNr. 14
St. Georgen Soxxoo
SNr. 25
St. Georgen Ribera
Herkunft
Mittelwert
Kjeldatilbestimmung
[g/kg]
Trockenmasse
[g/i^gl
95,2
883,8
85,7
884,6
72,4
886,1
91,8
882,1
Landwirtschaftskamnner
Steiermark
Landwirtsctiaftskammer
Steiermark
Landwirtsctiaftskammer
Steiermark
Landwirtschaftskammer
Steiermark
Die Probenanlieferung erfolgt mittels der Österreichischen Post AG, es
werden keine besonderen Lagerungshinweise ausgegeben.
Im Labor werden die Proben lichtgeschützt im Kühlschrank bei 4-8°C
gelagert. Die Proben werden nur kurz für die jeweilige Einwaage
entnommen und sofort wieder kühl gelagert.
Die unzerkleinerten Probenkörner werden mit Hilfe des Osterizers 2-mal
je 1 min gemahlen. Das daraus erhaltene Mehl kann noch gröbere
Partikel
enthalten.
Um
die
nachfolgenden
Analysen
nicht zu
beeinträchtigen, wird das Mehl durch ein Sieb mit Maschenweite
0,160 mm gesiebt. Dies erfolgt ohne Aufwendung von größerem
Druck. Anschließend wird das feine Mehl im Kühlschrank bis zur
Analysenvorbereitung gelagert.
31
Die Proben werden nach der Zerkleinerung einer N-Bestimmung nach
Kjeldahl unterzogen. Dies bietet einen guten Anhaltspunkt bezüglich
des Gesamtaminosöurengeholts in der jeweiligen Probe. Aufgrund
der Zusammensetzung des mittels Kjehldahl bestimmten Rohproteins
muss der mittels UPLC erhaltene Gesomtaminosöurengehalt (als
Summe der einzelnen Aminosäuren) etwas unterhalb des KjehldahlWertes liegen.
3.1.2. Soja
Tabelle: Probenname und -herkunft der Sojaproben
r
Mittelwert
KjeWahlbestimmung [mg/g]
Seriennumnner
Probenname
Herkunft
Soja 1
E06 Versuch 1
Molkerei Oberwart
373,1
Soja 2
E06 Versuch 2
Molkerei Oberwart
374,8
Soja 3
E06 Versuch 3
Molkerei Oberwart
375,1
Soja 4
0500 101 27810
Molkerei Oberwart
395,7
Soja 5
STROBL 250107
Molkerei Oberwart
374,1
Soja 150307
S150307
Molkerei Oberwart
439,6
Die Probenanlieferung erfolgt mittels der Österreichischen Post AG, es
werden keine besonderen Lagerungshinweise ausgegeben.
Im Labor werden die Proben lichtgeschützt im Kühlschrank bei 4-8°C
gelagert. Die Proben werden nur kurz für die jeweilige Einwaage
entnommen und sofort wieder kühl gelagert.
Die unzerkleinerten Probenkörner werden mit Hilfe des Osterizers 2-mal
je 1 min gemahlen. Das daraus erhaltene Mehl kann noch gröbere
Partikel
enthalten.
Um
die
nachfolgenden
Analysen
nicht zu
beeinträchtigen wird das Mehl durch ein Sieb mit Maschenweite 0,160
mm gesiebt. Dies erfolgt ohne Aufwendung von größerem Druck.
32
Anschließend
wird
das
feine
Mehl
im
Kühlschrank • bis
zur
Analysenvorbereitung gelagert.
Die Proben werden nach der Zerkleinerung einer N-Bestimmung nach
Kjeldahl unterzogen. Dies bietet einen guten Anhaltspunkt bezüglich
des Gesamtaminosäurengehalts in der jeweiligen Probe. Aufgrund
der Zusammensetzung
des
Rohproteins
(Reineiweiß
und
NPN-
Substanzen) muss der UPLC-Wert der Gesamtaminosäuren etwas
unterhalb des Kjehldahl-Wertes liegen.
3.1.3. Milchpulver
Tabelle: Probenname und -herkunft des Magermilchpulvers
Pröbenname
Herkunft
,*,
Magermilchpulver
Alpi Magermilchverarbeltungs- und
HandelsGmbH & Co.KG
. Mittelwert Kjeldahlbestimmung
[mg/g]
343,1
Das Magermilchpulver wird im Kühlschrank lichtgeschützt aufbewahrt.
3.2. Geräte und Chemikalien
3.2.1. Geräteliste
Alle verwendeten Glasgeräte werden für mind. 4 Stunden pyrolysiert.
Probenvorbereitung
Mixer
Firma Osterizer Pulse Matil 10; Stufe: Mahlen
Sieb
Firma Retsch Analysensieb Weite: 0,160 mm
bzw. 0,100 mm
33
UPLC:
Acquity UPLC System
Firma Waters
UPLC-Säule: BEH Cis; l./gm; 2,1 x50mm
Firma Waters
Messzylinder 100 ml, 500 ml
Firma Schott
Bechergläser
Firma Schott
Glasflaschen mit Verschluss
Firma Schott
Vakuumpumpe XDS5
Firma BOC EDWARDS
Filtriervorrichtung
Firma Millipore
RC-Rundfilter, fließverstärkt, 0,2|jm
Firma Sartorius
Parafilm
Fritten
Firma Waters
Pyrolyseofen (0-220°C)
Firma Hereaus
Ultraschallbad 32
Firma Bronsonic
Hydrolyse:
Waage
Firma Sartorius
Messkolben 100ml
Firma Schott
Bechergläser 25ml bzw. 50 ml
Firma Schott
Messzylinder
Firma Schott
Reaktionsgefäße mit
Kunststoffverschluss
Firma Waters
Reaktionsröhrchen (50 x 6-6,5mm)
Firma Roth
Speed-Vak System
Firma Savant
Picotag Workstation Millipore
Firma Waters
Teflonpinzetten
Muffelofen
Firma Hereaus
Pipette P200
Firma Gilson
Pipette 200-lOOOpl
Firma Socorex
Wattestäbchen
Firma VWR
MagnetrOhrer
Firma VWR
34
Vakuumpumpe XDS5
Firma BOG EDWARDS
Tiegelofen (0-1100°C)
Firma Hereaus
Freie AS:
Bechergläser 25ml
Firma Schott
Glasflaschen
Firma Schott
Magnetrührer
Firma VWR
Rührstäbe
Firma VWR
Faltenfilter 595 'k Größe 90mm
Firma Selica
Eppendorfgefäße
Firma Roth
Glastrichter 60mm Durchmesser
Firma Schott
Derivatisierung
Eppendorfgefäße
Firma Roth
Pipetten 10- lOOpl
Firma VWR
Pipetten 1 - lOpl
Firma ABIMED Langenfeld
Pinzetten
Vortex
Firma Bender & Hobein AG
Zentrifuge 113
Firma Sigma
Glasvials 9mm, 12x32mm Septon
Firma Waters
Einmalspritzen 2ml
Firma BIBRUN
Minisart Filter
(0,2MI)
Inserts
6x29mm
300MI,
Heizblock QBT 1
RC4
Firma Sartorius
Firma Waters
Firma Grant
3.2.2. Chemikalienliste
•
UPLC
Methanol HPLC Ultra Gradient Grade, Reinheit 99, 9%
Firma Roth
Acetonitril HiPersolv Chromanorm for HPLC-Gradient Grade,
35
Reinheit 99, 9%
Firma VWR
UHQ (Ultra High Quality Water; mind. 18 mQ Widerstand)
AccQ Tag'^'^ Eluent A Concentrate
Laufmittel: AI:
Firma Waters
10 ml Accq-Fluor Eluent A Konzentrat +
lOOmlUHQ-Wasser
A2:
20 ml Methanol + 80 ml UHQ-Wosser
Bl:
60 ml Acetonitril + 40 ml UHQ-Wosser
B2:
100 ml Acetonitril
Strong: 100 ml Methanol
Weak:
100 ml UHQ-Wosser
Interner Standard DL-o-Aminobuttersäure (AABA) M = 103, 1
g/Mol
Firma Sigma Aldrich
L-Tryptophan M = 204, 2 g/Mol
Firma Sigmo Aldrich
Aminosäurenstandard (NCI0180)
Firma Pierce
lOmM HCI: 2,5ml 0,1 M HCI in 25ml-Kolben und mit UHQ auffüllen
Hydrolyse:
HCI 32%ig reinst
Firma Roth
UHQ (Ultra High Quality Water; mind. 18 mQ Widerstand)
NoOH 99%
Firma Roth
Acetonitril HiPersolv Chromanorm for HPLC-Gradient Grade,
Reinheit 99, 9%
Firma VWR
EtOH absolut zur Synthese Reinheit >99,5%
Firma Merck
Phenol, gesättigte Lösung, Biotechnology Grade
Firma Amresco
6 N HCI: 58,93 ml 32% HCI ad 100 ml UHQ -Wasser auffüllen
6 N HCI mit 1% (v/v) Phenol: 10
|JI
100% Phenol ad 1 ml 6 N HCI
36
20 mM HCI: 333|ji 6 N HCI ad 100 ml UHQ-Wosser
Freie AS:
Tri-Natriumcitrot-Dihydrat z.A.
Firma Merck
HCI 32%ig reinst
Firma Roth
5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat, Reinheit min. 99%
Firma Merck
Borsäure zur Analyse, >99,5%
Firma Roth
NoOH 99%
Firma Roth
UHQ-Wasser (Ultra High Quality Water; mind. 18 mQ Widerstand)
CitrotpufferOJ M, pH2,2
0,1M Citronensäure vorlegen und mit 4M NoOH auf pH 2,2
stellen
oder alternativ
23,528 g Natriumeitrat werden eingewogen und mit etwa 700
ml UHQ-Wasser versetzt. Mittels 32%iger HCI wird der pH auf 2,2
eingestellt und weiters auf 800 ml mit UHQ-Wasser aufgefüllt.
Natriumboratpuffer 0,5 M pH 9,0
3,0915 g Borsäure werden eingewogen und mit etwa 95 ml
UHQ-Wasser versetzt. Nachdem der pH-Wert mit 1 N NaOH auf
9,0 eingestellt wurde, kann die Lösung mit UHQ-Wasser auf 100
ml aufgefüllt werden.
Sulfosalicylsäure 3% (g/v)
3 g 5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat werden eingewogen und mit
UHQ-Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
37
•
Derivatisierung:
Waters AccQ-Fluor• Reagent Kit
Enthält:
Waters AccQ-Fluor"^'^ Borat Puffer (1)
Waters AccQ-Fluor• Reagent Powder (2A)
Waters AccQ-Fluor• Reagent Diluent {2B)
Der Heizblock wird auf 55°C vorgeheizt. Danach sollte das Vial
2A längere Zeit leicht angetippt werden, damit sich das ganze
zu lösende Pulver am Boden des Gefäßes sammelt. Mit der 1000
pl Pipette 1 ml aus Reagent 2B entnehmen und verwerfen um
sicher zu stellen, dass die Pipettenspitze sauber ist. Jetzt kann
langsam und am Rand 1 ml des Diluent 2B zum Pulver 2A
zugegeben werden. Das Vial wird nun vorsichtig verschlossen
und wieder längere Zeit leicht angetippt um damit dos
Reagenz-Pulver zu lösen. Das Pulver sollte, bevor es auf den
Heizblock gestellt wird, optimalerweise schon fast gelöst sein. Ist
das der Fall wird es für maximal 10 min. auf den Heizblock
gestellt, meist jedoch ist eine Zeit von 5 min ausreichend.
Das
rekonstituierte
AccQ-Fluor•
Reagenz
wird
bei
Raumtemperatur, aber lichtgeschützt gelagert.
3.3. Methoden Mais
3.3.1. Hydrolyse für Gesamtaminosäurenbestimmung
Es werden 200 mg der zu analysierenden Probe genau in einen 100 ml
-Messkolben eingewogen. Der Kolben wird mit dem gewünschten
Lösungsmittel (Standardlösungsmittel ist 20 mM HCI) bis zur Ringmarke
38
aufgefüllt (2mg/ml). Nach einer Inkubationszeit wird die Suspension
unter Rühren in ein geeignetes Becherglas überführt. Daraus werden 2
ml mit Hilfe einer Pipette entnommen und in einen 25 ml-Kolben
transferiert (Verdünnung 1:12,5; 160[jg/ml). Auch dieser wird mit 20
mM HCI aufgefüllt. In weiterer Folge wird die Lösung unter Rühren in
ein
Becherglas geleert und aus diesem jeweils
vorbereiteten
Reaktions-Tubes
pipettiert
100 \i\ in die
(16|jg/100|jl).
Als
Dreifachbestimmung werden pro Lösung 3 Tubes verwendet.
Zur Verbesserung des Handlings wird die Öffnung der Tubes mit einem
Streifen Parafilm umwickelt. Jetzt werden die Reaktionsröhrchen in der
Speed-Vac 1 h getrocknet. Am Ende des Trocknungsvorganges darf
keine Flüssigkeit mehr vorhanden sein.
Den weiteren Anweisungen (Pico Tag Operator's Manual) folgend
werden die Tubes nach Entfernung des Parafilms in ein vorbereitetes
Reaktionsgefäß gestellt. Die Vorbereitung schließt das Vorlegen von
200 |jl einer 6 N HCI mit 1% Phenol auf den Gefäßboden mit ein. In ein
Gefäß sollten,
um das Eindringen von Säuretropfen in schräg
stehende Tubes zu vermeiden, 10 Gefäße eingebracht werden. Das
Gefäß wird mit dem speziellen Verschluss geschlossen und an der
Pico-Tag-Workstation angesetzt.
Als nächstes wird das Ventil an der Stickstoffflasche geöffnet und die
Vakuumpumpe eingeschaltet. Langsam wird das Vakuumventil an
der Workstation so weit geöffnet, bis die Säure am Boden leicht zu
kochen beginnt. Danach das Ventil schließen und das Stickstoffventil
öffnen, um die Atmosphäre in dem Gefäß mit Stickstoff zu spülen. Dies
wird 3-mal wiederholt und nach dem letzten Duchgang lässt man das
Vakuumventil für etwa
1
Minute geöffnet um die vollständige
Verdrängung des Sauerstoffs zu garantieren (inerte Bedingungen).
39
Danach wird der Deckel verschlossen („red in"). Das gesamte Gefäß
wird nun in den auf 112°C bzw. 150°C vorgeheizten Ofen gestellt und
20 h bzw. 1 h zur Hydrolyse dort belassen.
Noch diesem Zeitraum wird das Gefäß zum Abkühlen aus dem Ofen
genommen.
Noch einer Abkühlzeit von etwa 15 min wird dos Gefäß vorsichtig
geöffnet („green in") und der Deckel abgeschraubt. Die einzelnen
Tubes werden mit einer Teflonpinzette entnommen, mit einem Tuch
außen
abgetrocknet
und
in
ein
bereitgestelltes
zweites
Reaktionsgefäß überführt. Sollten während der Hydrolyse oder dem
Abkühlen Säuretropfen in eines der Tubes gelangt sein, sind diese hier
zu entfernen, da die Ergebnisse nicht verwertbar sind. Wenn olle Tubes
überführt sind, wird das neue Gefäß mit einem sauberen Deckel
verschlossen und wieder an die Pico-Tag-Workstotion angeschlossen.
Nach dem Einschalten der Vakuumpumpe wird das Vakuumventil um
2-3 Drehungen geöffnet, die Vakuumanzeige sinkt auf etwa 300
Millitorr. Jetzt werden die Proben 30 min getrocknet. Noch an der
Station wird dos Ventil geschlossen („red in") und danach dos Gefäß
entnommen.
Bis zur weiteren Verarbeitung (Derivatisierung) können die Proben nun
unter Lichtschutz im Kühlschrank gelagert werden.
Um eventuell vorhandene Säuredämpfe zu entfernen sollte die
Vakuumpumpe nach Gebrauch noch 15 min auf Gasballast Stufe 2
weiterlaufen.
Alle verwendeten Gefäße werden nach Verwendung umfassend mit
UHQ-Wasser gespült und bei 500°C 4 h im Muffelofen pyrolysiert.
40
3.3.2. Derivatisierung mittels AccQ-Tag^'^-Mettiode
Das Reaktionsgefäß wird geöffnet („green in") und die Reaktionstubes
einzeln herausgenommen.
Die getrocknete Probe wird in 20 |jl Interner Standard-Lösung 20
pmol/|jl (siehe 3.6.1.; S. 53) gelöst. Nach kurzem Vortexen wird das
Tube kurz anzentrifugiert. Nun werden 60 pl AccQ-Fluor-Boratpuffer
zugegeben. Nach erneutem Vortexen und Zentrifugieren sollte die
getrocknete Probe vollständig gelöst sein. Erst danach können 20 fjl
AccQ-Fluor-Reagenz zugegeben werden. Nach der Zugabe sollte das
Reagenz sofort eingemischt werden, da die
Halbwärtszeit der
Derivatisierungsreaktion sehr kurz ist. Aufgrund des Arbeitsablaufs
(Zugabe und Einmischung des Reagenz in mehrere Proben) kommt zu
einer ca. 1-minütigen Verweilzeit der Proben bei Raumtemperatur,
danach wird die Lösung mit Gelladespitzen in ein vorbereitetes
Eppendorf-Gefäß überführt.
Die
befüllten
Eppendorf-Geföße
werden
in
einem
auf
55°C
vorgeheizten Heizblock für 10 min inkubiert. Nach einer 5-minütigen
Abkühlzeit wird der Inhalt über RC-Filter in ein zweites EppendorfGefäß filtriert. Nach der Filtration werden die Inhalte in ein dafür
vorgesehenes und mit einem Insert bestücktes Glasvial pipettiert.
Nach der Durchführung der Derivatisierung werden die Viols im
Kühlschrank bis zum nächsten Tag gelagert um analysiert zu werden.
3.3.3. Analyse UPLC
Die Vials werden in die dafür vorgesehenen Troys gestellt und dann
laut Vorschrift analysiert. Siehe dazu Pkt. 3.6.1. bis 3.6.4. (Seite 53ff.)
41
3.3.4. Ergebnisberechnung
Die
Firma
Waters
gibt
in
der
beiliegenden
Literatur
einen
vorgegebenen Mindestgehalt an Protein in der Probe mit 0,1 bis 5 pg
an.
mg Gesamtaminosöuren/g =
( o * MG * F )
EW
a
Amount (UPLC) in pmol/4|jl
MG
Molekulargewicht der Aminosäure
EW
Ist-Einwaage der Probe
F
Faktor
Berechnung des Faktors:
*25 (100/4)
pmol/|jg -> jJiTnol/g (ohne Faktor)
:1000 [Umrechnung von pmoi/g -+ mmol/g] = 0,0025
Berechnung der Einwaage:
Bezug der Einwaage auf |jg Probe, die in 100 pl enthalten
Einwaage 200 mg/100 ml (=2mg/ml)
Verdünnung 2 ml/25 ml (=160Mg/ml)
Entnahme für
IOOJJI
^ 16 jjg/lOO |jl
Probemenge im Reaktionsgefäß daher 16pg
3.4. Methoden Soja
3.4.1. Hydrolyse für Gesamtaminosäurenbestimmung
Es werden 100 mg der zu analysierenden Probe genau in einen 100 ml
- Messkolben eingewogen. Der Kolben wird mit dem gewünschten
Lösungsmittel (Standardlösungsmittel ist 20 mM HCI) bis zur Ringmarke
42
aufgefüllt (1 mg/ml). Nach einer Inkubationszeit wird die Suspension
unter Rühren in ein geeignetes Becherglas überführt. Daraus wird 1 ml
mit Hilfe einer Pipette entnommen und in einen 50 ml - Messkolben
transferiert (Verdünnung 1:50; 20pg/ml). Auch dieser wird mit 20 mM
HCI aufgefüllt. In weiterer Folge wird die Lösung unter Rühren weiter in
ein Becherglas geleert und aus diesem jeweils 100 pl in die
vorbereiteten
Reaktions-Tubes
pipettiert
(2[jg/100|jl).
Bei
einer
Dreifachbestimmung werden pro Lösung 3 Tubes verwendet.
Zur Verbesserung des Handlings wird die Öffnung der Tubes.mit einem
Streifen Porafilm umwickelt. Jetzt werden die Reaktionsröhrchen im
Speed-Vac 1 h getrocknet. Am Ende des Trocknungsvorganges darf
keine Rüssigkeit mehr vorhanden sein.
Den weiteren Anweisungen {Arbeitsanweisungen Rico Tag) folgend
werden die Tubes nach Entfernung des Parafilms in ein vorbereitetes
Reaktionsgefäß gestellt. Die Vorbereitung schließt das Vorlegen von
200 fjl einer 6 N HCI mit 1% Phenol auf den Gefäßboden mit ein. In ein
Gefäß sollten, um dos Eindringen von Säuretropfen in schräg
stehende Tubes zu vermeiden, 10 Gefäße eingebracht werden. Das
Gefäß wird mit dem speziellen Verschluss geschlossen und an der
Pico-Tag-Workstation angesetzt.
Als Nächstes wird das Ventil an der Stickstoffflasche geöffnet und die
Vakuumpumpe eingeschaltet. Langsam wird das Vakuumventil an
der Workstation so weit geöffnet, bis die Säure am Boden leicht zu
kochen beginnt. Danach das Ventil schließen und das Stickstoffventil
öffnen um die Atmosphäre in dem Gefäß mit Stickstoff zu spülen. Dies
wird
3-mal wiederholt und
Vakuumventil
etwa
1
beim
Minute
letzten
geöffnet,
Mal
um
lässt man
die
das
vollständige
Verdrängung des Sauerstoffs zu garantieren (inerte Bedingungen).
43
Danach wird der Deckel verschlossen („red in"). Das gesamte Gefäß
wird nun in den auf 112°C bzw. 150°C vorgeheizten Ofen gestellt und
20 h bzw. 1 h zur Hydrolyse dort belassen.
Nach diesem Zeitraum wird das Gefäß zum Abkühlen aus dem Ofen
genommen. Nach einer Abkühlzeit von etwa 15 min wird dos Gefäß
vorsichtig geöffnet („green in") und der Deckel abgeschraubt. Die
einzelnen Tubes werden mit einer Teflonpinzette entnommen, mit
einem Tuch aussen abgetrocknet und in ein bereitgestelltes zweites
Reaktionsgefäß überführt. Sollten während der Hydrolyse oder dem
Abkühlen Säuretropfen in eines der Tubes gelangt sein, sind diese hier
zu Entfernen, da die Ergebnisse nicht verwertbar sind. Wenn alle Tubes
überführt sind wird das neue Gefäß mit einem sauberen Deckel
verschlossen und wieder an die Pico-Tag-Workstation angeschlossen.
Noch dem Einschalten der Vakuumpumpe wird das Vakuumventil um
2-3 Drehungen geöffnet, die Vakuumanzeige sinkt auf etwa 300
Millitorr. Jetzt werden die Proben 30 min getrocknet. Noch an der
Station
wird
dos
Ventil
geschlossen
(„red
in")
und
danach
entnommen.
Bis zur weiteren Verarbeitung (Derivotisierung) können die Proben nun
unter Lichtschutz im Kühlschrank gelagert werden.
Um eventuell vorhandene Säuredämpfe zu entfernen sollte die
Vakuumpumpe nach Gebrauch noch 15 min auf Gasballast Stufe 2
weiterlaufen.
Alle verwendeten Gefäße werden noch Verwendung umfassend mit
UHQ-Wasser gespült und bei 500°C 4 h im Muffelofen pyrolysiert.
44
3.4.2. Vorbereitung für die Bestimmung der Freien Aminosäuren
1 .Variante - Filtration:
1 g Sojamehl wird in ein Becherglas eingewogen und in 4 ml 0,1M
Citratpuffer suspendiert, bei Raumtemperatur 30 min gerührt und über
einen Faltenfilter 595 V2 filtriert.
Weiters wird
1
g Filtrat in einem großen Sterilin mit 5 g 3%
Sulfosalicylsäure versetzt und nach kurzem Schwenken für 30 min bei
Raumtemperatur ohne Schütteln inkubiert. Wiederum wird die Lösung
über einen Faltenfilter 595 1/2 filtriert.
Das gewonnene Filtrat wird nun 1:2 und 1:5 mit 0,5 M Boratpuffer
neutralisiert (2,5 ml auf 5 ml und 1 ml auf 5 ml). Danach ist die Probe
fertig für die Derivatisierung.
2.Variante - Zentrifugation:
1 g Sojamehl wird in ein Becherglas eingewogen und mit 4 ml 0,1M
Citratpuffer suspendiert. Jetzt wird es bei Raumtemperatur 30 min
gerührt und danach in ein großes Sterilin überführt. Der Inhalt wird im
Sterilin 15 min bei 3500 Umdrehungen / Minute zentrifugiert.
1 g des entstandenen Überstandes wird direkt entnommen und in ein
weiteres großes Sterilin überführt. Dort wird er dann mit 5 g 3%
Sulfosalicylsäure versetzt und nach kurzem Schwenken für 30 min bei
Raumtemperatur ohne Schütteln inkubiert. Nach der Inkubationszeit
wird der Inhalt in Corex-Röhrchen überführt und diese 15 min bei 5000
Umdrehungen / Minute zentrifugiert. Auch hier wird danach direkt 1
ml entnommen und um vollständiges Absetzen zu gewährleisten in
45
einem großen Eppendorf-Gefäß ein drittes Mal 10 min bei 13000
Umdrehungen / Minute zentrifugiert.
Der gewonnene Überstand wird nun 1:2 und 1:5 mit 0,5 M Boratpuffer
neutralisiert. Danach ist die Probe fertig für die Derivatisierung.
3.4.3. Derivatisierung mittels AccQ-Tag^'^-Mettiode für TAA
Das Reaktionsgefäß wird geöffnet („green in") und die Reaktionstubes
einzeln herausgenommen.
Die getrocknete Probe wird in 20 |jl Interner Standard-Lösung 20
pmol/pl (siehe 3.6.1.; S. 53) gelöst. Nach kurzem Vortexen wird das
Tube mit Inhalt kurz anzentrifugiert. Nun werden 60 pl AccQ-FluorBoratpuffer zugegeben. Nach erneutem Vortexen und Zentrifugieren
sollte die getrocknete Probe vollständig gelöst sein. Erst danach
können 20 |jl AccQ-Fluor-Reagenz zugegeben werden. Nach der
Zugabe sollte das Reagenz sofort eingemischt werden, da die
Halbwertszeit der Derivatisierungsreoktion sehr kurz ist. Aufgrund des
Arbeitsablaufs (Zugabe und Einmischung des Reagenz in mehrere
Proben) kommt zu einer ca. 1-minütigen Verweilzeit der Proben bei
Raumtemperatur, danach wird die Lösung mit Gelladespitzen in ein
vorbereitetes Eppendorf-Gefäß überführt.
Die befüllten Eppendorf-Gefässe werden auf einem auf 55°C
vorgeheizten Heizblock für 10 min inkubiert. Nach einer 5-minütigen
Abkühlzeit wird der Inhalt über RC-Filter in ein zweites EppendorfGefäß filtriert. Nach der Filtration werden die Inhalte in ein dafür
vorgesehenes mit einem Insert bestücktes Glasvial pipettiert.
46
Nach der Durchführung der Derivatisierung v\/erden die Vials im
Kühlschrank bis zum nächsten Tag gelagert um analysiert zu werden.
3.4.4. Derivatisierung mittels AccQ-Tag•-Mettiode für FAA
30 [^\ des AccQ-Fluor Boratpuffers werden in ein kleines EppendorfReaktionsgefäß vorgelegt. Hinzugegeben werden jeweils 5 pl des
Internen Standards 40 pmol/MJ (siehe '3.6.1.; S. 53) und 5 fj' der zu
untersuchenden Probe (Verdünnung 1:2 od. 1:5). Nach kurzem
Vortexen und Zentrifugieren werden 10 pi des AccQ-Fluor-Reagenzes
zugefügt
und
sofort
wieder
gevortext.
Jetzt
kommt
es
bei
Raumtemperatur zu einer Inkubationszeit von 1 min.
In einem vorgeheizten Heizblock werden die Proben nun 10 min bei
55°C inkubiert. Danach wird eine Abkühlzeit von 5 min eingehalten
und die Proben über einen RC-Filter in ein zweites Eppendorf-Gefäß
filtriert.
Noch
der Filtration werden
die
Proben
in
ein
dafür
vorbereitetes mit Insert versehenes Glasvial überführt und sind am
nächsten Vormittag zur Analyse mittels UPLC bereit.
Die Lagerung über Nacht sollte lichtgeschützt im Kühlschrank
erfolgen.
3.4.5. Analyse UPLC
Die Viols werden in die dafür vorgesehenen Trays gestellt und dann
laut Vorschrift analysiert. Siehe dazu Pkt. 3.6.1. bis 3.6.4. (Seite 53ff.)
47
3.4.6. Ergebnisberechnung
Gesamtaminosäuren:
mg Gesamtaminosäuren/g =
( a * MG * F )
EW
a
Amount (UPLC) in pmol/4|ji
MG
Molekulargewicht der Aminosäure
EW
Ist-Einwaage der Probe
F
Faktor
Berechnung des Faktors:
*25 (100/4)
pmol/fjg —> |jmol/g (ohne Faktor)
:1000 [Umrechnung von pmoi/g -» mmol/g] = 0,0025
Berechnung der Einwaage:
Bezug der Einwaage auf pg Probe, die inlOOpl enthalten
Einwaage 100 mg/100 ml (1 mg/ml)
Verdünnung 1 ml/50 ml (20pg/ml)
Entnahme für Reaktionstube 100 pl -»2 pg/ 100 pl
Probemenge im Reaktionstube daher 2 pg
Freie Aminosäuren:
mg Freie Aminosäuren/g =
( a * MG * F )
EW
a
Amount (UPLC) in pmöl/4[j|
MG
Molekulargewicht der Aminosäure
EW
Ist-Einwaage der Probe
F
Faktor
48
Berechnung des Faktors {Injektionsvolumen 4 [i\):
Sojapulver 1:2 Verdünnung
*0,25 (von 4|jl auf 1 pl)
*10 (Derivatisierungsansatz) = 2,5
*2 (Verdünnung mit 0,5M Boratpuffer) = 5
*6 (Verdünnung mir Sulfosalicylsäure 3%) = 30
•10-9 (pmol/|jl — mmol/pi) = 30*10-'
*103(mmol/|jl -^ mmol/ml) = 30*10-*
*5 (Citratpuffer) = 1,5* 10-" = 0.00015
Die Einwaage beträgt 1 g, daher Ergebnis in mg/g.
Berechnung des Faktors (Injektionsvolumen 4 |jl):
Sojapulver 1:5 Verdünnung
*0,25 (von 4|jl auf 1 ^ll)
*10 (Derivatisierungsansatz) = 2,5
*5 (Verdünnung mit 0,5M Boratpuffer) = 12,5
*6 (Verdünnung mir Sulfosalicylsäure 3%) = 75
*10-9 (pmol/^Jl -> mmol/|jl) = 75*10-'
*103(mmol/|jl -^ mmol/ml) = 75*10-*
*5 (Citratpuffer) = 3,5*10-" = 0,000375
Die Einwaage beträgt 1 g, daher Ergebnis in mg/g.
3.5. Methoden Milchpulver
3.5.1. Hydrolyse zur Bestimmung der Gesamtaminosäuren
Es werden 100 mg der zu bestimmenden Probe genau in einen 100 ml
- Messkolben eingewogen. Der Kolben wird mit dem gewünschten
Lösungsmittel (Standardlösungsmittel ist 20 mM HCI) bis zur Ringmarke
aufgefüllt (1 mg/ml). Nach einer Inkubationszeit wird die Suspension
unter Rühren in ein geeignetes Becherglas überführt. Daraus wird 1 ml
mit Hilfe einer Pipette entnommen und in einen 50 ml - Messkolben
überführt (Verdünnung 1:50; 20 pg/nnl). Auch dieser wird mit 20 mM
49
HCI aufgefüllt. In weiterer Folge wird die Lösung unter Rühren weiter in
ein Becherglas transferiert und aus diesem jeweils 100 [i\ in die
vorbereiteten
Reaktions-Tubes
pipettiert
(2pg/100|jl).
Bei
einer
Dreifachbestimmung werden pro Lösung 3 Tubes verwendet.
Zur Verbesserung des Handlings wird die Öffnung der Tubes mit einem
Streifen Parafilm umwickelt. Jetzt werden die Reaktionsröhrchen in der
Speed-Vac 1 h getrocknet. Am Ende des Trocknungsvorganges darf
keine Flüssigkeit mehr vorhanden sein.
Den weiteren Anweisungen (Pico Tag Operator's Manual) folgend
werden die Tubes noch Entfernung des Parafilms in ein vorbereitetes
Reaktionsgefäß gestellt. Die Vorbereitung schließt das Vorlegen von
200 |jl einer 6 N HCI mit 1% Phenol auf den Gefäßboden mit ein. In ein
Gefäß sollten, um das Eindringen von Säuretropfen in schräg
stehende Tubes zu vermeiden, 10 Gefäße eingebracht werden. Das
Gefäß wird mit dem speziellen Verschluss geschlossen und an der
Pico-Tag-Workstation angesetzt.
Als nächstes wird das Ventil an der Stickstoffflasche geöffnet und die
Vakuumpumpe eingeschaltet. Langsam wird dos Vakuumventil an
der Workstation so weit geöffnet, bis die Säure am Boden leicht zu
kochen beginnt. Danach das Ventil schließen und das Stickstoffventil
öffnen um die Atmosphäre in dem Gefäß mit Stickstoff zu spülen. Dies
wird 3-mal wiederholt und
Vakuumventil
etwa
1
beim
Minute
letzten
geöffnet,
Mol
um
lässt man
die
dos
vollständige
Verdrängung des Sauerstoffs zu garantieren (inerte Bedingungen).
Danach
wird
der
Deckel
(„red
in")
und
das
Stickstoffventil
verschlossen. Das gesamte Gefäß wird nun in den auf 112°C bzw.
150°C vorgeheizten Ofen gestellt und 20 h bzw. Ih zur Hydrolyse dort
belassen.
50
Nach diesem Zeitraum wird das Gefäß zum Abkühlen aus dem Ofen
genommen. Nach einer Abkühlzeit von etwa 15 min wird das Gefäß
vorsichtig geöffnet („green in") und der Deckel abgeschraubt. Die
einzelnen Tubes werden mit einer Teflonpinzette entnommen, mit
einem Tuch außen abgetrocknet und in ein bereitgestelltes zweites
Reaktionsgefäß überladen. Sollten während der Hydrolyse oder dem
Abkühlen Säuretropfen in eines der Tubes gelangt sein, sind diese hier
zu Entfernen, da die Ergebnisse nicht verwertbar sind. Wenn alle Tubes
überführt sind wird das neue Gefäß mit einem sauberen Deckel
verschlossen und wieder an die Pico-Tag-Workstation angeschlossen.
Nach dem Einschalten der Vakuumpumpe wird das Vakuumventil um
2-3 Drehungen geöffnet, die Vakuumanzeige sinkt auf etwa 300
Millitorr. Jetzt werden die Proben 30 min getrocknet. Noch an der
Station
wird
das
Ventil
geschlossen
(„red
in")
und
danach
entnommen.
Bis zur weiteren Verarbeitung (Derivatisierung) können die Proben nun
unter Lichtschutz im Kühlschrank gelagert werden.
Um eventuell vorhandene Säuredämpfe zu entfernen sollte die
Vakuumpumpe nach Gebrauch noch 15 min auf Gasballast Stufe 2
weiterlaufen.
Alle verwendeten Gefäße werden nach Verwendung gut mit UHQWasser gespült und bei 500°C 4 h im Muffelofen pyrolysiert.
51
3.5.2. Derivatisierung mittels AccQ-Tag•-Mettiode
Das Reaktionsgefäß wird geöffnet („green in") und die Reaktionstubes
einzeln herausgenonnnnen.
Die getrocknete Probe wird in 20 pl Interner Standard-Lösung 20
pmol/|jl (siehe 3.6.1.; S. 53) gelöst. Nach kurzem Vortexen wird das
Tube kurz anzentrifugiert. Nun werden 60 fjl AccQ-Fluor-Boratpuffer
zugegeben. Nach erneutenn Vortexen und Zentrifugieren sollte die
getrocknete Probe vollständig gelöst sein. Erst danach können 20 |j|
AccQ-Fluor-Reagenz zugegeben werden. Nach der Zugabe sollte das
Reagenz sofort eingemischt werden, da die
Halbwertszeit der
Derivatisierungsreaktion sehr kurz ist. Aufgrund des Arbeitsablaufs
(Zugabe und Einmischung des Reagenz in mehrere Proben) kommt zu
einer ca. 1-minütigen Verweilzeit der Proben bei Raumtemperatur,
danach wird die Lösung mit Gelladespitzen in ein vorbereitetes
Eppendorf-Gefäß überführt.
Die
befüllten
Eppendorf-Gefäße
werden
in
einen
auf
55°C
vorgeheizten Heizblock für 10 min inkubiert. Nach einer 5-minütigen
Abkühlzeit wird der Inhalt über RC-Filter in ein zweites EppendorfGefäß filtriert. Nach der Filtration werden die Inhalte in ein dafür
vorgesehenes mit einem Insert bestücktes Glasviol pipettiert.
Nach der Durchführung der Derivatisierung werden die Vials im
Kühlschrank bis zum nächsten Tag gelagert um analysiert zu werden.
52
3.5.3. Analyse UPLC
Die Vials werden in die dafür vorgesehenen Trays gestellt und werden
dann laut Vorschrift analysiert. Siehe dazu Pkt. 3.6.1. bis 3.6.4. (Seite
53ff.)
3.5.4. Ergebnisberechnung
mg Gesamtaminosäuren/g =
( a * MG * F 1
EW
a
Amount (UPLC) in pmol/4|jl
MG
Molekulargewicht der Aminosäure
EW
Ist-Einwaage der Probe
F
Faktor
Berechnung des Faktors:
*25 (100/4)
pmol/pg -^ ^lmol/g (ohne Faktor)
:1000 [Umrechnung von pmol/g -^ mmol/g] = 0,0025
Berechnung der Einwaage:
Bezug der Einwaage auf |jg Probe, die in100^Jl enthalten
Einwaage 100 nng/100 ml (1 mg/ml)
Verdünnung 1 ml/50 ml (20Mg/ml)
Entnahme für Reaktionstube 100 |jl ^ 2 |jg/ 100 |jl
Probemenge im Reaktionstube daher 2 ^lg
53
3.6. UPLC
3.6.1. Kalibration
Für die notwendige Kalibration werden 6 Standardlösungen in
ansteigender Konzentration vorbereitet.
Für den Aminosäurenstandard werden die Stammlösungen des
Mischstandards (AAS), des Tryptophans (Trp) und der Interne Standard
40 pmol/|jl (AABA) vermischt.
Herstellung Interner Standard 40 pmol/pl (für FAA):
25,78 mg a-Aminobuttersäure werden in einen 5 ml Messkolben
eingewogen und mit 0,1 N HCI versetzt und gelöst -> (50 mM Lösung).
0,5 ml dieser Lösung werden weiters in 10 ml einer 0,1N HCI verdünnt
(1:20) ^ (2,5 mM Lösung).
80|jl der 2,5 mM Lösung werden in einem 5 ml-Kolben mit UHQ-Wasser
verdünnt (1:62,5) ^ (40 pmol/[jl).
Herstellung Interner Standard 20 pmol/|jl (fürTAA):
25,78 mg a-Aminobuttersäure werden in einen 5 ml Messkolben
eingewogen und mit 0,1 N HCI versetzt und gelöst -> (50 mM Lösung).
0,5 ml dieser Lösung werden weiters in 10 ml einer 10 mM HCI verdünnt
(1:20) ^ (2,5 mM Lösung).
80|jl der 2,5 mM Lösung werden in einem 10 ml-Kolben mit 10 mM HCI
verdünnt (1:125) ^ (20pmol/Ml).
54
Herstellung Tryptophanlösung:
51,05 mg L-Tryptophan werden in 5 ml 0,1 N HCI gelöst -> (50 mM
Lösung).
0,5 ml dieser Lösung werden weiters mit 9,5 ml einer 0,1 N HCI versetzt
-> (2,5 mM Lösung).
Mischstandard Aminosäuren:
Dieser enthält folgende Aminosäuren: L-Ala, L-Arg, L-Asp, L-Cys (1,25
mmolar), L-Glu, Gly, L-His, L-Ile, L-Leu, L-Lys, L-Met, L-Phe, L-Pro, L-Ser, LThr, L-Tyr und L-Val.
Die Aminosäuren liegen in 0,1 N HCI in einer Konzentration von 2,5 mM
vor.
Tabelle: Verdünnungsschema Kalibration
Verdünnung
1
1
11
III
IV
V
VI
Amino Add
Stammlösung
Stammlösung
Standard AAS
AABA
Trypthophan
W
40
80
160
80
120
160
[MO
320
320
320
80
80
80
UHQ
Konzentration
Konzentration
Konzentration
Konzentration
AAS
AABA
AAS nach der
AAS bei der
Derivatislening
Injektion
M
M
[pmol/pl]
[pmol/pö
[pmol/pl]
[pmoMMO
40
80
160
80
120
160
19600
5
10
20
40
60
80
40
40
40
40
40
40
0,5
1
2
4
6
8
2
4
8
16
24
32
19520
19360
4760
4680
4600
Die Standardlösung IV wird zur qualitativen Kontrolle des Geräts
täglich vor jeder Messung analysiert.
55
0.08
0.06
0.04
3
<
0.02
0.00-
-0.02
7.00
3.00
8.00
10.00
11.00
Minutes
Abbildung: UPLC-Chromatogramm Standardlösung IV
3.6.2. Vorbereitungen an der UPLC
Zu Wochenbeginn werden alle benötigten Laufmittel und die Fritten
der Laufmittel AI und Bl erneuert. Dazu sollten die Fritten nach
vierstündiger Pyrolyse im Ultraschallbad für 5 min im jeweiligen
Laufmittel entgast werden.
Vor jeder Analyse sind zur Sicherstellung einer gleich bleibenden
Performance der Analysengeräte folgende Schritte auszuführen:
•
Binary Solvent Manager:
Seal Wash:
5 min
Prime Solvents AI, Bl, A2, B2 jeweils 2 min
Sample Manager:
Prime syringe:
Sample syringe and wash syringe (6 primes)
zu Wochenbeginn
Sample syringe only (5 primes) täglich
Needle wash:
Weak wash: 200ijl
Strong wash: 0|jl
12.00
56
Danach muss ein Startgradient gefahren werden:
Fiuss
(ml/min)
0
0.4
0.4
0.4
0.4
0
Zeit (min)
Initial
5
10
11
16
17
%A
100
100
100
0
0
0
%B
0
0
0
100
100
100
Kurve
Initial
6
6
6
6
11
Verwendete Laufmittel: A2 und B1
Zum Konditionieren der Säule wird der Aminosäurengradient ohne
Probeninjektion über die Säule gefahren:
Zeit (min)
Initial
0.4
5
6,3
11
11,5
12
13
14
18
Fiuss
(mi/min)
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
%A
100
98
94
90
67
67
0
0
100
100
%B
0
2
6
10
33
33
100
100
0
0
Kurve
Initial
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Verwendete Laufmittel: AI und Bl
Danach
können
die
einzelnen
Aminosäurengradienten analysiert werden.
Proben
mit
dem
57
3.6.3. Chromatogramme, Integration, Berechnung
Die aus der Analyse erhaltenen Chromatogramme werden integriert
und den jeweiligen Peaks werden die entsprechenden Peaknamen
zugewiesen.
Danach kann der Gehalt an Aminosäuren quantitativ berechnet
werden. Die Berechnung erfolgt unter Einbeziehung der Probe und
Verdünnung während der Probenvorbereitung.
Im Anschluß wird der Gehalt an Aminosäuren quantitativ bestimmt.
3.6.4. Vorbereitungen vor dem Aussclialten
Am Ende jeder Analysesequenz muss zuerst ein Endgradient gestartet
werden. Ist die erwartete Stehzeit des Geräts größer als 72 Stunden,
wird ein Feriengradient durchgeführt.
Endgradient
Zeit (min)
Initial
10
12
27
28
Ffuss
(ml/min)
0.4
0.4
0.4
0.4
0
%A
0
0
100
100
100
Verwendete Laufmittel: A2 und Bl
%B
100
100
0
0
0
Kurve
Initial
6
6
6
11
58
Feriengradient
Zeit (min)
Initial
30
• 32
62
63
Fiuss
(mi/min)
0.4
0.4
0.4
0.4
0
%A
0
0
100
• 100
100
%B
100
100
0
0
0
Kurve
Initial
6
6
6
11
Verwendete Laufmittel: A2 und B1
Im Anschluß werden folgende Abläufe ausgeführt:
•
Needle wash:
3 mal
Weak wash: 10
|JI
Strong wash: 500 pi
•
Seal wash:
5 min (bei längerer Stehzeit: 10 min)
59
3.7. Mefhodenoptimierung bei Mais
Aufgrund zahlreicher Literaturhinweise [Lucas, 1982; Weiss et al., 1998;
Fountoulakis,
[PicoTag
1998]
und auch einem Hinweis der Firnna Waters
Operator's
Manual,
1988]
folgend
wird
ein
Temperaturversuch durchgeführt. Anstatt die Hydrolyse wie üblich bei
112°C 20 h zu en/virken, wird auf eine Methode mit 150°C für Ih
zurückgegriffen. Den durchaus positiven Ergebnissen folgend werden
zur Optimierung der Reaktionszeit die weiteren Versuche basierend
auf der neuen Methode durchgeführt.
Im
Zuge
der
Chemikalien
Arbeiten
wird
(Lösungsmitteln)
hauptsächlich
zur
Herstellung
mit
verschiedenen
der
anfänglichen
Suspension experimentiert. Die Lösung der Probe wird in saurem und
alkalischem Milieu, in Alkohol und Acetonitril durchgeführt. Auch eine
Konzentrationsabstufung (10% bis 70%) der verwendeten Lösungsmittel
wird in Betracht gezogen. Bezüglich der Quellzeit gibt es Versuche, die
in 4 Stufen ablaufen: 0,5 h, 1 h, 2 h und über Nacht. Die Quellung über
Nacht erfolgt grundsätzlich lichtgeschützt im Kühlschrank und dauert
etwa 12 bis 14 h.
Auch
wird
auch
ein
Versuch
unter
Berücksichtigung
unterschiedlich löslichen Osborne-Fraktionen mit
der
Ih Quellung in
Alkohol und anschließender weiteren Lösung in alkalischem Milieu
durchgeführt.
Weiters wurde der Effekt einer feineren Zerkleinerung und Siebung der
Proben untersucht.
60
Zusammenfassung der Lösungsmittelversuche / Versuchsserien (VS) :
Konzentrationsabstufung bei Acetonitril: 10%, 50%
Konzentrationsabstufung bei EtOH: 10%, 70%
Verschiedene Molarität bei NaOH: 0,1 N, 0,01 N
Um alkohollösliche und laugenlösliche Aminosäuren speziell zu
erfassen: 0,01 N NaOH in 10% EtOH
2 Schritte: Versuch die in Alkohol lösliche Fraktion und die in
alkalischem Milieu lösliche Fraktion hintereinander zu lösen: Das Pulver
wird zuerst in 50 ml 10% EtOH gelöst und nach einer Stunde Quellzeit
bis zur Ringmarke im 100 ml-Kolben mit 0,02N NaOH in 10% EtOH
aufgefüllt.
Rüttler: Das Maispulver wird nach Verdünnung mit dem jeweiligen
Lösungsmittel für 1 h auf einen Rüttler gestellt um ein Absetzen des
Pulvers zu verhindern.
ME:
Zur
Reaktionsflüssigkeit
während
der
Hydrolyse
wird
Mercaptoethanol zugeführt. Daraus ergibt sich als Reaktionsflüssigkeit
6N HCI mit 0,02% Phenol und 2-Mercaptoethanol [Weiss et al., 1997]
Feinere Siebung: Sieb statt mit Maschenweite 0,160 mm mit 0,100 mm.
61
4. Ergebnisse
4.1. Mais
4.1.1. Gesamtaminosäuren
Ausgehend von den Ergebnissen der vorangegangen Diplomandin
Mario Moritz und Prof. Mayer werden im Folgenden Versuche mit
verschiedenen ausgewählten Maisproben vorgestellt.
Tabelle: Analysen-Mittelwerte von ausgewählten Maisproben bei Standardanalyseverfatiren [mg/g]
[Quelle: Datensätze Maria Moritz, Prof. Mayer]
MW Mqis j, MW Mais
Saxxoo
^ Ribeixi
SNr.l 4
SNr.25
20mM HCI ;20mMHCI
MW Mais
DKC4626
SNr.l
20nnM HGI
MW Mais
PR36PiB5
SNr.l 2
20mM HCI
3,1
1,9
3,1
1,8
2,9
3,7
1,9
2,2
GLUTAMINSÄURE
6,2
6,0
5,5
GLYCIN
2,0
2,0
2,1
7,1
2,4
1,1
0,0
0,0
ASPARAGINSÄURE
SERIN
HISTIDIN
1,3
1,2
NH3
0,0
ARGININ
2,8
0,0
2,7
THREONIN
1,3
1,3
ALANIN
1,9
2,0
1,3
2,3
1,2
2,2
2,5
3,6
1,4
PROLIN
3,4
3,1
1,8
2,7
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
CYSTEIN
0,4
0,3
0,3
0,2
TYROSIN
1,2
1,3
0,6
VALIN
2,0
1,1
1,9
1,8
2,1
METHIONIN
0,6
0,6
0,5
0,5
2,6
LYSIN
2,3
2,3
1,9
ISOLEUCIN
1,4
1,2
1,2
1,3
LEUCIN
3,7
3,3
3,3
3,5
PHENYLALANIN
1,8
1,6
1,5
1,5
TRYPTOPHAN
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
37,2
35,5
33,2
38,7
Laut durchgeführter N-Bestimmung noch Kjeldahl sind die Ergebnisse
aus der früheren Diplomarbeit zu tief. Auch in den Futterwerttabellen
[Souci, 2000] sind durchschnittliche Proteingehalte in Mais von etwa
9% angeführt.
62
Es werden sowohl Versuche mit verschiedenen
Lösungsmitteln
durchgeführt als auch an den Konzentrationen der einzelnen
Lösungsmittel Veränderungen vorgenommen.
Eine veränderte Aminosäurenausbeute aufgrund von verschiedenen
Quellzeiten wird beobachtet.
Temperaturversuch:
Aufgrund des Pico-Tag Operator's Manual wird eine Erhöhung der
Temperatur von 112°C auf 150°C in Betracht gezogen. Dies bringt eine
verkürzte Reaktionszeit auf 1 h während der Hydrolyse mit sich.
Tabelle: Temperaturversuche 150°C Ih im Vergleich zur bisherigen Standardtemperatur von 112°C tür 20h
bei den Maissorten St. Georgen DKC4626 SNr. 1, St. Georgen Saxxoo SNr. 14 und St. Georgen Ribera
SNr. 25 [mg/g]
ASP
SER
GLU
GLY
HIS
NH3
MW Mais
DKC4626
SNr.l
112°C20h
MW Mais
DKC4626
SNr.l
ISOX Ih
3,1
1,9
3,5
2,2
ASP
SER
6,2
6,8
2,0
2,3
1,4
GLU
GLY
1,3
0,0
Mais
Saxxoo
SNr.14
112°C20h
MW Mais
Saxxoo
SNr.14
150°C Ih
2,9
2,8
1,9
1,9
5,5
2,1
6,0
1,9
MW
HIS
0,0
NH3
1,1
0,0
1,1
0,0
2,8
1,3
2,9
1,5
ARG
THR
2,3
1,2
2,0
THR
ALA
1,9
2,4
ALA
1,8
2,0
PRO
AABA
3,4
3,7
PRO
2,7
3,1
0,0
0,0
AABA
0,0
CYS
0,4
0,6
CYS
TYR
0,3
0,0
0,4
1,3
0,9
ARG
1,2
TYR
1,2
1,6
VAL
2,0
VAL
1,8
1,7
MET
0,6
2,1
0,9
MET
0,5
0,6
LYS
2,3
2,4
LYS
1,9
1,8
ILE
1,4
1,4
ILE
1,2
1,2
LEU
3,7
4,2
3,3
PHE
1,8
1,9
LEU
PHE
3,8
1,5
1,6
TRP
0,0
0,0
TRP
0,0
0,0
Gesamt
37,2
41,9
Gesamt
33,2
34,0
63
1
1
MW Mais
Ribera SNr.25
112-0 20 h
MW Mais
Ribera SNr.25
ISO-C Ih
ASP
3,7
3,7
SER
2,2
2,3
GLU
7,1
7,2
GLY
2,4
3,1
HIS
1,3
1,3
NH3
0,0
0,0
ARG
2,2
2,3
THR
1,4
1,5
ALA
2,5
2,7
PRO
3,6
3,9
AABA
0,0
0,0
CYS
0,2
0,4
TYR
0,6
0,8
VAL
2,1
2,1
MET
0,5
0,6
LYS
2,6
2,4
ILE
1,3
1,4
4,3
LEU
3,5
PHE
1,5
1,9
TRP
0,0
0,0
Gesamt
38,7
41,8
1
Im Wesentlichen sind bei kürzerer Hydrolyse durchwegs positive
Ergebnisse bei allen Proben zu verzeichnen. Es kommt zu leicht
erhöhten Werten bei Probe DKC 4626, Saxxoo und auch bei Ribera.
Einzelne Aminosäuren zeigen bei Probe 14 leicht schlechtere Werte,
der Gesamtgehalt wird aber durch den leichten Anstieg anderer
Aminosäuren ausgeglichen.
Aufgrund dieser durchaus positiven Ergebnisse werden die folgenden
Versuche mit der neuen Hydrolysetemperatur und -zeit durchgeführt.
Auch
eine
Absicherung
der
Ergebnisse
durch
Versuche
mit
ausgewählten Sojaproben führt zur Äquivalenz der Methode. Siehe
dazuPkt. 4.2.1. (Seite 80ff.)
Um eine Verbesserung des Aminosäurengehalts zu erwirken, werden
verschiedene Lösungsmittel angedacht. Es wird nicht nur eine Lösung
im sauren Milieu (20 mM HCI) in Betracht gezogen, auch neutrales
Milieu (UHQ-Wasser), basisches Milieu (NaOH) oder alkoholisches
Milieu wird verwendet.
64
Um auch den Einfluss von verschieden langen Quellzeiten zu
untersuchen, werden Zeitversuche mit 0,5h, Ih und 2h Quellzeit
angelegt. Wie sich dieselbe Probenvorbereitung nach einer Quellung
über Nacht im
Kühlschrank auswirkt, wird ebenfalls analysiert. Die
Zeitversuche sind durch die kürzere Hydrolysezeit im Arbeitsablauf
wesentlich erleichtert.
Mais St. Georgen DKC4626 SNr. 1:
Tabelle: Quellversuch (0,5h, Ih und 2h) der Malssorte St. Georgen DKC4626 SNr. 1 in 10% Acetonitril
[mg/g]
MW ZV Mais
DKC4626SNr.1
10%CH3CN0,5h -
1
MWZV Mais
DkC4626SNr.l
*1C^CH3CN Ih
MW ZV Mais
DKC4626SNr.l
10%CH3CN2h
ASP
5,0
4,4
4,7
SER
3,1
2,9
3,2
GLU
10,4
9,9
10,2
GLY
3,2
2,9
3,2
HIS
1,8
1,8
1,9
NH3
0,0
0,0
0,0
ARG
2,7
2,7
3,0
THR
2,0
1,9
2,0
ALA
3,9
3,8
3,9
PRO
5,4
5,2
5,4
AABA
0,0
0,0
0,0
CYS
0,5
0,5
0,6
TYR
0,8
0,9
1,0
VAL
2,9
2,9
3,0
MET
0,7
0,7
0,8
LYS
3,0
2,9
3,2
ILE
1,9
1,9
2,0
LEU
6,5
6,2
6,3
PHE
2,5
2,5
2,6
TRP
0,0
0,0
0,0
Gesamt
56,3
54,0
57,2
Es ist für alle drei durchgeführten Quellzeiten in 10% Acetonitril kein
signifikant höherer Gesamtwert nachweisbar.
65
Tabelle: Quellversuch (0,5h, 1 h, 2h und über Nacht) der Maissorte St. Georgen DKC4626 SNr. 1 in 0,01 N
NaOH [mg/g]
MW ZV Mais
DKC4626
SNr.l
0,0IN NaOH
0,5h
MW ZV Mais
DKC4626
SNr.l
0,0IN NaOH
Ih
MW ZV Mais
DKC4626
SNr.l
COIN NaOH
2h
MW ZV Mais
DKC4626
SNr.l
0,01 N NaOH
ü.N.
ASP
5,0
5,0
5,0
5,0
SER
3,4
3,4
3,4
3,0
GLU
11,5
11,5
11,6
11,7
GLY
3,4
3,4
3,3
3,5
HIS
2,1
2,1
2,1
2,1
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
3,2
3,2
3,4
2,8
THR
2,2
2,2
2,2
2,0
ALA
4,5
4,5
4,5
4,6
PRO
6,1
6,0
6,0
6,2
AABA
0,0
0,0
0,0
CO
CYS
0,4
0,4
0,5
0,3
TYR
1,1
1,2
1,3
1,0
VAL
3,4
3,4
3,4
3,4
MET
0,8
0,9
C9
0,8
LYS
3,4
3,2
3,3
3,2
ILE
2,2
2,2
2,2
2,2
LEU
7,3
7,4
7,4
7,5
PHE
3,0
3,0
3,1
3,0
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
63,1
62,9
63,4
62,3
Auch bei dem Quellversuch in 0,01 N NaOH sind im Verlauf des
Versuchs keine signifikant höheren Werte feststellbar.
66
Tabelle: Quellversuch (0,5h, 1h, 2h und über Nacht) der Maissorle St. Georgen DKC4626 SNr. 1 in 0,0IN
NaOH in 10%EtOH[mg/g]
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,0IN NaOH
in 10%EtOH
0,5h
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,0IN NaOH
in 10%EtOH
1h
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,0IN NaOH
in 10%EtOH
2h
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,0IN NaOH
in 10%EtOH
ÜN
ASP
5,0
SER
3,6
5,0
5,2
5,1
3,5
3,7
GLU
3,6
11,6
11,7
11,7
GLY
3,5
3,4
12,3
3,7
HIS
2,1
2,1
2,3
2,0
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
3,6
3,7
3,8
THR
2,4
2,3
2,4
3,6
2,4
ALA
4,6
4,5
4,8
4,6
PRO
AABA
6,1
6,1
6,5
6,0
0,0
0,0
0,0
0,5
1,7
0,5
0,0
0,4
1,7
1,5
3,4
CYS
TYR
VAL
3,3
0,5
3,5
1,8
3,4
3,6
LYS
1,1
3,4
1,1
3,4
3,5
1,1
3,4
2,2
MET
1,0
ILE
2,3
2,2
2,4
LEU
7,7
7,6
8,1
7,6
PHE
3,2
3,1
3,3
3,2
TRP
0,0
0,0 •
0,0
0,0
Gesamt
66,0
65,6
68,7
65,0
Auch im Verlauf des Quellversuchs in 0,01 N NaOH in 10% EtOH wird
keine Steigerung aufgrund der längeren Quellzeit festgestellt.
Grundsätzlich kann nach den Quellversuchen beim Vergleich der
Gesamtwerte festgestellt werden, dass es mit allen hier erprobten
Lösungsmitteln tendenziell eine Steigerung des Aminosäurengehaltes
gibt. Der Gesamtaminosäurengehalt steigt von etwa 4,4% bei
Standardbedingungen auf durchschnittlich 6,6% bei Lösung in 0,01 N
NaOH.
67
MaisPR36P85SNr.l2:
Tabelle: Quellversuch (0,5h, Ih und 2h) der Maissorte St. Georgen PR36P85 SNr. 12 in COIN NaCH in 10%
EtOH [mg/g]
MW ZV Mais
PR36P85
SNr. 12
0,01NNaOHin
10%EtOH
0,5h
MW ZV Mais
PR36P85
SNr. 12
O.GINNaOHin
10%EtOH
Ih
MW ZV Mais
PR36P85
SNr. 12
0,01NNaOHin
10%EtOH
2h
ASP
4,3
4,1
4,3
SER
2,9
2,8
2,9
GLU
9,6
9,1
9,8
GLY
3,1
2,8
3,2
HIS
1,8
1,7
1,9
NH3
0,0
0,0
0,0
ARG
3,2
3,2
3,3
THR
1,9
1,9
1,9
ALA
3,7
3,5
3,8
PRO
5,0
4,7
5,1
AABA
0,0
0,0
0,0
CYS
0,5
0,5
0,5
TYR
1,2
1,3
1,2
VAL
2,8
2,7
2,9
MET
0,8
0,8
0,8
LYS
3,2
3,1
3,2
ILE
1,8
1,7
1,8
LEU
6,1
5,8
6,3
PHE
2,5
2,4
2,6
TRP
0,0
0,0
0,0
Gesamt
54,4
52,2
55,4
Auch bei Maissorte St. Georgen PR36P85 SNr. 12 ist eine Steigerung
von 3,5% bei Standardbedingungen auf 5,4% bei Lösung in 0,01 N
NaOH in 10% EtOH zu verzeichnen.
Wiederunn ergeben sich keine auffälligen Veränderungen inn Laufe
des Zeitversuchs.
68
Mais Ribera SNr. 25:
Tabelle: Quellversuch (0,5h und 2h) der Maissorte St. Georgen Ribera SNr. 25 in 0,01 N NaOH in 10% EtOH
[mg/g]
MW Mais
Ribera SNr.25
0,01NNaOHin
10%EtOH
0,5h
MW Mais
Ribera SNr.25
COlNNaOHin
10%EtOH
2h
4,6
4,8
ASP
SER
3,2
3,2
GLU
10,7
11,1
GLY
3,0
3,1
HIS
1,9
1,9
NH3
0,0
0,0
ARG
3,3
3,3
THR
2,1
2,1
ALA
4,1
4,2
PRO
5,7
5,9
AABA
0,0
0,0
CYS
0,6
0,5
TYR
1,3
1,4
VAL
3,1
3,2
MET
0,9
0,9
LYS
3,1
3,2
ILE
2,0
2,1
LEU
6,9
7,1
PHE
2,8
2,9
TRP
0,0
0,0
Gesamt
59,3
60,9
Bei Maissorte St. Georgen Ribera SNr. 25 ist wiederunn eine Steigerung
auf 5,9 mg/g Gesanntanninosäurengehalt festzustellen.
Auch hier ist keine Steigerung des Ergebnisses aufgrund einer
verlängerten Quellzeit nachzuweisen.
In
weiterer
Folge
werden
alle
Versuchsreihen
die
nnit
den
ausgewählten Maissorten St. Georgen DKC4626 SNr. 1, St. Georgen
PR36P85 SNr. 12, St. Georgen Saxxoo SNr. 14 und St. Georgen Ribera
SNr. 25 vorgestellt. Hier gilt es einen Überblick zu verschaffen über die
69
durchgeführten Versuche und deren Auswirkungen auf den Gehalt
an Gesamtanninosäuren in Mais.
Mais DKC 4626 SNr. 1:
7.00
e.oo
Mrujtes
Abbildung: UPLC-Chromatogramm Mais DKC 4626 SNr. 1 (Verdünnung mit 0,01 N NaOH in 10% EtOH)
Tabelle: Zusammenfassende Ergebnisse Gesamtaminosäurengehalt in Mais DKC4626 SNr. 1
(Lösungsmittel- und Temperaturversuche) [mg/g]
«.»
-
MW Mais
MW Mais
DKC462«
tDICC4626
SNr.l
SNr.l
20mM
150°CIh
HCI
•;
.
t
MW Mais
DKC4626
SNr.l
UHQ
MW Mais
DKC4626
SNr.l
10%EtOH
MW Mais
DKC4626
SNr.l
10%EtOH
0. Nacht
Aminosäuren [mg/g] ^4- •
MW Mals
MW Mais
MW Mals
DKC4626
DKC4626
01^4626
' SNr.l
SNr.l "
SNr.i *
50%
50%
10%
CH3CN
CH3CN
CH3CN
ö. Nacht
:."-'r
*
MW Mais MW Mais MW Mals
:DICC4626 DKC4626 D»;C4626
1 SNr.l*
SNr.l
SNr.l .-•
10%
10%
10%
CH3CN
CH3CN
CH3CN
Ih
, 0,5h
, 2h .
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,01N
NaOH
ASP
3,1
3,5
4,2
4,5
5,8
3,8
3,8
4,7
5,0
4,4
4,7
SER
1,9
2,2
2,6
3,1
3,2
2,5
2,5
2,9
3,1
2,9
3,2
3,0
GLU
6,2
6,8
10,4
10,0
10,2
8,8
8,8
9,1
10,4
9,9
10,2
12,9
GLY
2,0
2,3
2,4
3,5
3,3
2,5
2,7
3,2
3,2
2,9
3,2
3,2
HIS
1,3
1,4
1,5
1,8
1,7
1,5
1,5
1,6
1,8
1,8
1,9
1,9
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
2,8
2,9
2,4
2,5
2,9
1,9
1,9
2,5
2,7
2,7
3,0
2,8
1,5
1,6
1,9
1,9
2,0
1,9
2,0
1,9
3,9
4,4
THR
1,3
1,5
1,4
1,8
4,9
ALA
1,9
2,4
3,3
3,9
3,7
3,3
3,3
3,5
3,9
3,8
PRO
3,4
3,7
4,4
5,2
5,1
4,5
4,3
4,7
5,4
5,2
5,4
5,8
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
CYS
0,4
0,6
0,5
0,5
0,5
0,3
0,3
0,5
0,5
0,5
0,6
0,3
TYR
1,2
1,6
0,7
0,7
1,0
0,6
0,4
0,8
0,8
0,9
1,0
1,2
VAL
2,0
2,1
2,3
2,9
2,9
2,3
2,3
2,7
2,9
2,9
3,0
3,1
MET
0,6
0,9
0,6
0,6
0,8
0,5
0,3
0,7
0,7
0,7
0,8
0,8
LYS
2,3
2,4
2,8
3,0
3,1
2,5
2,5
3,0
3,0
2,9
3,2
3,3
ILE
1,4
1,4
1,5
1,9
2,0
1,5
1,5
1,7
1,9
1,9
2,0
2,0
LEU
3,7
4,2
4,7
6,5
6,6
5,3
5,0
5,6
6,5
6,2
6,3
6,7
PHE
1,8
1,9
2,1
2,6
2,7
2,0
1,9
2,3
2,5
2,5
2,6
2,9
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
55,1
57,4
45,5
44,5
51,2
56.3
54,0
57,2
«1,1
•
TRP
0,0
0,0
0,0
Gesamt
37,2
41,9
48,1
70
Aminosäuren [mg/g]
MWMais
MW Mais
DKC4626
DKC4626
SNr.l
SNr.l
0,01 N
2Schritte
NaOH in
EtOH
10%EtOH
NaOH
0.5h
|
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH in
10%EtOH
Ih
MWMais
DKC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH In
10%EtOH
2h
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH in
10%EtOH
0. Nacht
MW Mais
D1CC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH in
70%EtOH
MWMais
DiCC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH in
10%EtOH
-ME
5,0
5,0
5,2
5,1
4,9
4,8
3,6
3,5
3,7
3,6
3,3
3,4
13,4
11,6
11,7
12,3
11,7
14,1
14,1
3,6
3,1
3,5
3,4
3,7
3,3
3,1
3,0
1,8
2,1
2,1
MW Mais
DKC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH
RDttler
MW Mais
DICC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH
0. Nacht
MW Mais
DKC4626
SNr.l
COIN
NaOH
0,5h
MWMais
DKC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH
Ih
MW Mais
DICC4626
SNr.l
0,01 N
NaOH
2h
ASP
5,0
5,0
5,0
5,0
4,9
4,4
SER
3,0
3,4
3,4
3,4
3,1
2,8
GLU
11,7
11,5
11,5
11,6
14,8
GLY
3,5
3,4
3,4
3,3
HIS
2,1
2,1
2,1
2,1
2,0
2,3
2,0
2,0
2,1
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
2,8
3,2
3,2
3,4
3,2
2,1
3,6
3,7
3,8
3,6
3,0
3,6
THR
2,0
2,2
2,2
2,2
2,0
1,7
2,4
2,3
2,4
2,4
2,2
2,2
ALA
4,6
4,5
4,5
4,5
4,7
4,3
4,6
4,5
4,8
4,6
4,5
4,6
PRO
6,2
6,1
6,0
6,0
6,0
5,4
6,1
6,1
6,5
6,0
5,7
6,0
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0.0
0,0
CYS
0,3
0,4
0,4
0,5
0,3
0,1
0,5
0,5
0,4
0,5
0,3
0,0
TYR
1,0
1,1
1,2
1,3
1.5
0,8
1,7
1,8
1,7
1,5
1,4
1,6
VAL
3,4
3,4
3,4
3,4
3,1
2,9
3,5
3,4
3,6
3,4
3,1
3,1
MET
0,8
0,8
0,9
0,9
0,9
0,6
1,1
1,1
1,0
1,1
0,9
0,2
LYS
3,2
3,4
3,2
3,3
3,5
3,2
3,4
3,4
3,5
3,4
3,6
3,6
ILE
2,2
2,2
2,2
2,2
2,1
1,9
2,3
2,2
2,4
2,2
2,1
2,1
LEU
7,5
7,3
7,4
7,4
6,9
6,2
7,7
7,6
8,1
7,6
6,8
6,7
PHE
3,0
3,0
3,0
3,1
2,9
2,6
3,2
3,1
3,3
3,2
2,9
2,9
TRP
Gesamt
0,0
«2,3
0,0
63,1
0,0
«2,?
0,0
63.4
0,0
65,5
0,0
57,3
0,0
66,0
0,0
65,6
0,0
68,7
0,0
65,0
0,0
63,8
0,0
64,0
Anhand von Versuchen mit verschiedenen Lösungsmitteln und
Quellzeiten kann festgestellt werden, dass es durch eine Beteiligung
von
Natronlauge
im
Lösungsmittel
zu
einer
Steigerung
der
Aminosäurenausbeute kommt.
Bei allen Versuchen mit Acetonitril kann beobachtet werden, dass die
Konzentration wichtig ist. Während nämlich bei einer Konzentration
von 10% Acetonitril durchaus akzeptable Werte zu ersehen sind,
bleiben die Werte bei Verwendung von 50%igem Acetonitril unter
jenen von 10%igem Acetonitril.
Auch die Versuche mit 10% EtOH liefern Ergebnisse im Bereich von 10%
Acetonitril.
71
Die höchsten Werte sind aber bei einenn Gemisch aus 0,01 N NaOH
und 10% EtOH zu erl<ennen. Bei allen Versuchen mit Maisprobe St.
Georgen DKC4626 SNr. 1 durchgeführten Tests zeigt sich dieser Trend.
Eine Steigerung der Konzentration von 10% EtOH auf 70% EtOH zeigt
wiederum einen negativen Einfluss auf die erhaltenen Ergebnisse.
Mais PR36P85 SNr. 12:
Mnutes
Abbildung: UPLC-Chromatogramm Mais PR36P85 SNr. 12 (Verdünnung nriit 0,01N NaOH in 10% EtOH)
72
Tabelle: Ergebnisse der Gesanntanninosäurenanalyse in Mais PR36P85 SNr.12
(Lösungmittel- und Temperaturversuche) [mg/g]
Aminosäuren [mg/g]
ASP
MW Mais
PR36P85
SNr.12
20mM
HCI
MW Mais
PR36P85
SNr.12
UHQ
MW Mais
PR36P85
SNr.12
70%EtOH
Rüttler
MW Mais
PR36P85
SNr.12
0,1 N NaOH
MW Mais
PR36P85
SNr.12
0,01 N
NaOH
MW Mais
PR36P85
SNr.12
0,01 N
NaOH
Sieb 0,100
3,1
3,6
3,8
4,1
4,4
4,8
SER
1,8
2,3
2,6
2,3
2,5
3,3
GLU
6,0
9,1
10,9
11,4
11,5
10,5
GLY
2,0
2,3
2,6
3,9
2,7
3,4
1,6
1,6
1,9
HIS
1,2
1,3
1,6
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
2,7
2,1
2,2
2,8
2,5
3,3
THR
1,3
1,4
1,6
1,5
1,6
2,1
3,4
3,7
3,7
4,2
ALA
2,0
2,9
PRO
3,1
3,8
4,5
4,7
4,6
5,4
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
CYS
0,3
0,4
0,4
0,3
0,3
0,4
1,1
0,6
0,7
1,3
0,9
0,8
TYR
VAL
1,9
2,1
2,3
2,5
2,5
3,0
MET
0,6
0,4
0,5
0,8
0,5
0,7
LYS
2,3
2,7
3,0
3,1
3,1
3,5
ILE
1,2
1,3
1,5
1,6
1,6
1,9
4,1
4,9
5,2
4,9
6,2
LEU
3,3
PHE
1,6
1,8
2,0
2,3
2,1
2,5
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
35,5
42,2
48,5
52,9
51,0
58.1
73
MW Mais
PR36P85
SNr.12
0,01 N NaOH
in 70% Eton
MW Mais
PR36P85
SNr.12
0,1 NNaOH
In 70% EtOH
Rüttler
4,2
2,7
11,9
2,8
1,7
0,0
2,7
1,8
3,8
4,8
0,0
0,2
1,0
2,7
0,7
3,4
1,8
5,6
2,4
0,0
54,3
3,9
2,5
11,3
3,9
1,5
0,0
2,9
1,6
3,5
4,6
0,0
0,1
1,4
2,5
0,7
3,1
1,7
5,1
2,3
0,0
52,6
ASP
SER
GLU
GLY
HIS
NH3
ARG
THR
ALA
PRO
AABA
CYS
TYR
VAL
MET
LYS
ILE
LEU
PHE
TRP
Gesamt
Aminosäuren [mg/g]
MW Mais
MW Mais
MW Mais
PR36P85
PR36P8S
PR36P85
SNr.12
SNr.12
SNr.12
0,01 N
0,01 N
0,01 N
NaOH in
NaOH in
NaOH in
10% EtOH
10% EtOH
10% EtOH
0,5ti
2h
Ih
4,3
4,3
4,1
2,9
2,9
2,8
9,6
9,8
9,1
3,1 •
3,2
2,8
1,8
1,7
1,9
0,0
0,0
0,0
3,2
3,2
3,3
1,9
1,9
1,9
3,7
3,5
3,8
5,0
4,7
5,1
0,0
0,0
0,0
0,5
0,5
0,5
1,2
1,2
1,3
2,8
2,9
2,7
0,8
0,8
0,8
3,2
3,2
3,1
1,8
1,7
1,8
6,1
5,8
6,3
2,5
2,4
2,6
0,0
0,0
0,0
54,4
52,2
55,4
MW Mais
PR36P85
SNr.12
2Schrltte
EtOH und
NaOH
4,0
2,4
11,2
2,7
1,6
0,0
2,1
1,5
3,7
4,5
0,0
0,1
0,7
2,5
0,5
3,1
1,7
5,1
2,1
0,0
49,5
MW Mais
PR36P85
SNr.12
0,01 N
NaOH in
10% EtOH.
ME
4,1
2,8
11,4
2,7
1,6
0,0
3,2
1,8
3,7
4,7
0,0
0,0
1,4
2,5
0,3
3,3
1,6
5,2
2,3
0,0
52,8
Im Vergleich zu den Standardbedingungen konnte immer zumindest
eine
leichte
Steigerung
des
Gesamtaminosäurengehalts
erzielt
werden.
Wieder werden mit dem Lösungsmittel 0,01 N NaOH in 10% EtOH
erhöhte Ergebnisse erreicht. Die Verwendung einer erhöhten EtOHund NaOH-Konzentration liefert keine weitere Steigerung. Ein Versuch
die Lauge und den Alkohol in zwei Schritten und nicht wie üblich als
Gemisch zuzuführen, bringt nicht die erwünschten Ergebnisse.
Die Beteiligung eines Rüttlers während der Quellzeit wird in einem
Versuch angewendet;
Entwicklung.
auch dieser Versuch zeigt eine negative
74
Den höchsten Gesamtgehalt an Aminosäuren liefert bei der Maissorte
St. Georgen PR36P85 SNr.
12 eine feinere Siebung mit einer
Maschenweite von 0,100mm. Der Erhalt dieses sehr feinen Pulvers ist in
der Vorbereitung ein langwieriger Prozess und kann bei anderen
Maissorten nicht bestätigt werden.
St Georgen 12
OTTV
^
55
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o
c
E
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35 •
30
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§
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X
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5
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5
S'
1'
9
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5
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i / / / / /
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Mais PR36P85 SNr. 12 (Lösungsmittel- und Temperaturversuche) (mg/g]
75
Mais Saxxoo SNr. 14:
7.00
8.00
Mnutes
Abbildung: UPLC-Chromatogramm Mais Saxxoo SNr. 14 (Verdünnung mit 0,01 N NaOH)
Tabelle: Ergebnisse der Gesomtominosäurenanalyse in Mais St. Georgen Saxxoo SNr.14
(Lösungmittel- und Temperaturversuche) [mg/g]
Aminosäuren (mg/g]
?
ASP
MW Mais
s! Saxxoo
SNr.14
50%
^ CHsCN
MW Mais
' Saxxoo
^ SNr.14:
20mM HCI
MW Mqis
Säxxois
: SNr.14
150°C Ih
2,9
2,8
2,9
MW Mais
Saxxoo
SNr.14
10%'
CHsCN
MW Mais
Soxxoo «
SNr.14
lOXCHsCN
ÜN
,
2,0
2,5
MyVMaiS|
Saxxoo
SNr. 14 ,
10%EtOH
MW Mais
Saxxoo
SNr.i4
lÖ%EtÖH*
^JÜNfe u
2,6
3,3
MW Mais
Saxxoo
SNr.14
NoOH
MW Mais
Saxxoo
SNrj,14
O,OTN *
NaOH ÜN;
4,1
4,3
"o,o'iN
SER
1,9
1,9
2,0
1,2
1,6
1,7
2,1
2,6
3,0
GLU
5,5
6,0
6,8
3,7
5,2
5,9
6,3
9,8
10,9
GLY
2,1
1,9
2,0
1,5
1,7
1,7
2,3
3,0
2,9
HIS
1,1
1,1
1,1
0,7
1,0
1,1
1,2
1,6
1,9
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
2,3
2,0
1,5
1,2
1,4
1,6
2,0
2,3
2,4
THR
1,2
1,2
1,1
0,7
0,9
1,1
1,7
1,6
1,9
ALA
1,8
2,0
2,4
1,1
1,8
1,9
2,4
3,6
4,1
PRO
2,7
3,1
3,1
1,9
2,5
3,1
3,6
5,0
5,7
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
CYS
0,3
0,4
0,3
0,3
0,3
0,4
0,4
0,4
0,3
TYR
1,3
0,9
0,6
0,4
0,2
0,6
0,7
1,0
0,9
VAL
1,8
1,7
1,7
1,2
1,5
1,7
2,0
2,7
2,9
MET
0,5
0,6
0,4
0,3
0,2
0,5
0,5
0,6
0,7
LYS
1,9
1,8
1,8
1,4
1,7
1,7
2,5
2,5
2,6
ILE
1,2
1,2
1,1
0,7
0,9
1,1
1,3
1,8
2,0
LEU
3,3
3,8
4,2
2,2
2,9
3,8
4,2
6,5
7,3
1,1
1,5
1,8
2,6
2,8
PHE
1,5
1,6
1,6
0,9
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
33,2
34,0
34,4
21,7
27,4
32,1
38.3
51,7
56,4
76
Auch bei Maisprobe St. Georgen Saxxoo SNr. 14 bestätigt sich, dass
man bei Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel keine Erhöhung
im Gesamtgehalt erwirkt, der Versuch mit 10% Acetonitril zeigt sogar
einen Abfall des Wertes. Zusätzlich wird auch bestätigt, dass die
Quellzeit keinen Einfluss auf dos Endergebnis hat.
Die unter den ausgewählten Lösungsmitteln effizienteste Methode ist
eine Verdünnung mit Beteiligung von NaOH. Damit kann der
Aminosäurengesamtgeholt auf über 5% gesteigert werden.
St. Georgen 14
i9
_JHi
tSm
^R
$'
/
/
/
!•
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Mais St. Georgen Saxxoo SNr. 14 (Lösungsmittel- und Tennperaturversuche)
[mg/g]
n
Mais Ribera SNr. 25:
isxi
aoo
Mnutes
Abbildung: UPLC-Chiromatogramm Mais Ribera SNr. 25 (Verdünnung mit 0,01 N NaOH in 10% EtOH)
Tabelle: Ergebnisse der Gesamtaminosaurenanalyse in Mais St. Georgen Ribera SNr.25
(Lösungmittel- und Temperaturversuctie) [mg/g]
Aminosäuren [mg/
**-
pl
MW Mais
Ribera SNr.25
20mM HCI
MW Mais
Ribera
SNr.25
ISO-C Iti
MW Mais
Ribera
SNr.25
UHQ
MW Mais
Ribera
SNr.25
50% CHsCN
MW Mais
Ribera
SNr.25
70%EtOH
Rüttler
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,1N
NaOH
Rüttler
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,0 IN
NaOH
ASP
3,7
3,7
4,2
4,0
4,0
4,6
4,6
SER
2,2
2,3
2,6
2,7
2,5-
2,9
GLU
7,2
10,8
11,6
3,1
4,3
6,2
3,0
13,8
3,1
12,4
GLY
7,1
2,4
2,8
9,4
HIS
1,3
1,3
1,5
1,4
1,5
1,8
1,6
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
2,2
2,3
2,0
2,0
3,1
2,4
2,5
3,6
THR
1,4
1,5
1,6
1,5
1,8
1,6
1,8
ALA
2,5
2,7
3,4
3,5
3,5
4,3
4,0
PRO
3,6
3,9
4,5
4,5
5,0
5,7
4,8
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
CYS
0,2
0,4
0,4
0,4
0,6
0,2
0,3
TYR
0,6
0,8
0,7
0,8
1,9
1,0
0,9
VAL
2,1
2,3
2,3
2,4
2,9
2,6
MET
2,1
0,5
0,6
0,5
0,5
0,9
0,7
0,5
LYS
3,1
3,1
2,6
2,4
2,7
2,3
2,7
ILE
1,3
1,4
1,5
1,6
1,6
1,9
1,6
LEU
3,5
4,3
4,8
6,0
5,6
6,4
5,1
PHE
1,5
1,9
2,1
2,2
2,4
2,7
2,1
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
38,7
41,8
49,8
51.4
54,4
58,7
54,3
78
MW Mais
Ribera SNr.25
2Sctiritte
EtOH NoOH
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,IN NaOH
in 70%EtOH
Rüttler
Aminosäuren
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,01 N
NaOH in
lOToEtOH
0,5h
[mg/g]
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,0 IN
NaOH in
10%EtOH
Ih
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,01 N
NaOH in
10%EtOH
2h
MW Mais
Ribera
SNr.25
0,0 IN
NaOH in
10%EtOH
ME
4,4
4,6
4,8
4,9
4,6
SER
5,1
3,4
2,4
3,2
3,2
3,3
3,2
GLU
14,2
13,2
10,7
13,5
4,5
3,0
3,0
11,1
3,1
14,2
GLY
3,8
2,8
HIS
2,0
1,8
1,9
1,9
2,0
1,9
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
3,1
2,1
4,7
2,1
1,4
3,3
3,3
3,1
0,0
3,4
2,1
2,1
2,2
2,1
4,2
4,1
4,2
4,5
4,5
5,8
5,5
5,7
5,9
5,8
5,6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,2
0,0
0,9
0,6
0,5
1,4
0,3
0,0
1,3
1,6
1,6
3,1
0,9
3,1
1,0
2,9
0,7
3,2
0,9
0,2
3,4
ASP
THR
ALA
PRO
AABA
CYS
TYR
MET
1,1
3,3
0,7
LYS
3,7
3,1
3,1
3,2
3,6
ILE
2,2
1,9
2,0
2,1
2,1
1,9
LEU
PHE
6,9
6,3
6,9
7,1
6,4
3,0
2,6
2,8
2,9
6,8
2,9
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
«5,9
56,6
59,3
60,9
65,1
60,8
VAL
2,9
2,7
Auch bei dieser Maissorte bestätigt sich die Vermutung, dass sich eine
Versuchsanordnung mit NaOH und EtOH positiv auf den Gehalt
auswirkt.
UHQ-Wasser,
Acetonitril,
reines
EtOH
können
den
Gesamtertrag erhöhen, auch Natronlauge ohne Zusatz wirkt sich
steigernd aus. Die höchsten Gesamtgehalte resultieren aber aus dem
Versuch EtOH und NaOH in 2 Schritten bzw. aus der Kombination
0,01 N NaOH in 10% EtOH.
Der abschließende Versuch, die Reaktionslösung während der
Hydrolyse mit Mercaptoethanol zu versetzen kann keine zusätzliche
Erhöhung der Ausbeute bewirken. Es kommt sogar zu einem
vollständigen Verlust von Cystin und zu teilweisem Verlust von
Methionin.
79
st Georgen 25
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Mais St. Georgen Ribera SNr.25 (Lösungsmittel- und Temperaturversuctie)
[mg/g]
80
4.2. Soja
Die Sojaproben werden von einer Molkerei im Burgenland zur
Bestimmung des Gesamtgehaltes an Aminosäuren bzw. des Gehaltes
an freien Aminosäuren eingesendet. Bei der Herstellung von Sojadrinks
ergeben sich bei einzelnen Sorten verändertes Schäumverhalten als
bei anderen. Es gilt, einen Zusammenhang zum Gehalt an freien
Aminosäuren herzustellen.
4.2.1. Gesamtaminosäuren
Zur Bestimmung der Gesamtaminosäuren wird auch
hier das
Standardverfahren der Probenzubereitung (20 mM HCI) angewandt.
0.08-
0.02-
I
3.00
4.00
I
5.00
"T
I
6.00
7.00
8.00
9.00
Miutes
Abbildung: UPLC-Chromatogramm Soja 150307 (Verdünnung mit 20 mM HCI)
1
•-
11.00
81
Tabelle: Ergebnisse der Gesamtaminosäurenanalyse Soja 1, Soja 2, Soja 3, Soja 4, Soja 5 und Soja 150307
[mg/g]
Aminosäuren mg/g
MW Soja 1
20mM HCI
Die
MW Soja 2 MW Soja 3
20 mM HCI 20 mM HCI
MW Soja 4 MW Soja 5
20 mM HCI 20 mM HCI
MW Soja 150307
20 mM HCI
ASP
41,3
42,5
42,0
44,6
41,9
47,5
SER
19,7
26,1
20,1
22,2
20,1
23,9
GLU
65,1
66,4
66,3
71,9
65,9
77,6
GLY
17,6
20,5
23,8
18,7
18,6
22,4
10,6
HIS
9,1
10,0
9,3
9,8
9,1
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
28,1
28,1
29,3
31,6
28,5
33,7
THR
13,5
14,3
14,0
14,5
14,1
14,5
ALA
10,7
12,2
10,8
11,4
10,7
13,0
PRO
17,8
17,9
18,2
19,5
18,0
21,5
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
CYS
2,2
2,7
2,6
3,7
3,6
3,9
13,6
TYR
10,5
10,3 '
12,6
13,8
13,0
VAL
15,8
16,5
17,1
18,2
17,4
MET
4,1
4,0
4,0
4,7
4,6
LYS
28,5
29,0
29,1
30,1
29,2
32,8
ILE
15,1
15,5
16,3
17,2
16,4
17,3
18,4
.
4,8
LEU
27,3
27,6
28,2
29,5
28,0
33,2
PHE
17,5
17,5
18,8
19,9
18,6
20,9
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
344,0
361,1
362,3
381,2
357,8
409,7
Probenverarbeitung
mit
20
mM
HCI
führt
zu
plausiblen
Ergebnissen, die Gesamtominosäurenwerte sind knapp unter jenen
der Kjeldahl-Bestimmungen.
Herausragend hohe Werte an Aminosäuren liefern die Proben Soja 4
und vor allem Soja 150307.
Zusätzlich zur standardisierten Bestimmung der Gesamtaminosäuren
werden auch Versuche zur Kontrolle der Versuchsanordnung bei Mais
durchgeführt. Dazu wird, wie bei den Maisproben auch, die 20 mM
HCI in der Vorbereitung durch diverse andere Lösungsmittel ersetzt
bzw. wird auch bei verschiedenen Sojaproben während der Hydrolyse
anstatt 112°C für 20h der Temperaturversuch 150° für 1 h durchgeführt.
82
Soja 1:
Tabelle: Ergebnisse der Lösungsmittel- und Temperaturversuche mit Soja 1 im Vergleich zur
standardisierten Variante [mg/g]
MW Soja 1
20mM HCI
Aminosäuren mg/g
MW Soja 1
MW Soja 1
50% CHsCN
Temp. 150 °C
frisch
Ih
ASP
41,3
41,4
41,8
SER
19,7
19,4
19,7
GLU
65,1
64,4
. 66,3
GLY
17,6
17,4
16,1
HIS
9,1
8,6
9,0
NH3
0,0
0,0
0,0
ARG
28,1
26,7
28,5
THR
13,5
13,2
12,3
ALA
10,7
11,1
11,1
PRO
17,8
17,9
18,5
AABA
0,0
0,0
0,0
CYS
2,2
3,8
3,6
TYR
10,5
11,8
11,4
VAL
15,8
17,6
16,2
MFT
4,1
4,8
4,9
LYS
28,5
28,4
29,5
ILE
15,1
15,2
15,1
LEU
27,3
27,8
29,1
PHE
17,5
18,0
18,3
TRP
0,0
0,0
0,0
Gesamt
344,0
347,5
351,4
83
VS-Reihe Soja 1
.-^
>i>
.#
^^•9-
*?
^^'
/
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Soja 1 bei verscliiedenen Temperatur- und Lösungsmittelversuchen [mg/g]
Die Probenvorbereitung mit Acetonitril bringt im Wesentlichen keine
Änderung
der
Werte,
die
leichte
Erhöhung
des
Gesamtaminosöurenwertes ist hauptsächlich aut erhöhte Werte von
Cystein und Tyrosin zurückzuführen.
Der Temperaturversuch mit 150°C ergibt eine leichte Erhöhung des
Wertes. Es kann also angenommen werden, dass die Erhöhung der
Temperatur und damit Verkürzung der Hydrolysezeit keine negativen
Auswirkungen auf das Ergebnis hat.
84
Soja 2:
Tabelle: Ergebnis des Temperaturversuctis mit Soja 2 im Vergleicti zur standardisierten Variante [mg/g]
Aminosäuren mg/g
MW Soja 2
20 mM HCI
MW Soja 2
Temp. 150°C Ih
ASP
42,5
44,1
SER
26,1
20,8
GLU
66,4
70,0
GLY
20,5
17,8
HIS
10,0
9,6
NH3
0,0
0,0
ARG
28,1
29,7
THR
14,3
13,3
ALA
12,2
12,8
PRO
17,9
19,6
AABA
0,0
0,0
CYS
2,7
3,2
TYR
10,3
11,9
VAL
16,5
17,7
MET
4,0
5,1
LYS
29,0
31,4
ILE
15,5
16,3
LEU
27,6
31,5
PHE
17,5
19,4
TRP
0,0
0,0
Gesamt
361,1
374,0
85
VS-Reihe Soja 2
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Soja 2 beim Tennperaturversuch [mg/g]
Auch bei Probe Soja 2 ist eine leichte Steigerung des Gehaltes an
Gesamtaminosäuren durch die Hydrolysevariante mit 150°C zu
verzeichnen. Wie schon Weiss et al. 1997 nachweisen konnten, ist ein
etwas geringerer Wert an Serin und Threonin festzustellen.
86
Soja 3:
Tabelle: Ergebnis Temperaturversuch mit Soja 3 im Vergleich zur standardisierten Variante [mg/g]
Aminosäuren mg/g
MW Soja 3
20 mM HCI
MW Soja 3
Temp. 150-0 Ih
ASP
42,0
41,7
SER
20,1
21,8
GLU
66,3
65,7
GLY
23,8
17,4
HIS
9,3
9,9
NH3
0,0
0,0
ARG
29,3
29,5
THR
14,0
13,3
ALA
10,8
11,8
PRO
18,2
18,6
AABA
0,0
0,0
CYS
2,6
3,5
TYR
12,6
12,6
VAL
17,1
17,0
MET
4,0
4,9
LYS
29,1
29,9
ILE
16,3
16,1
LEU
28,2
29,9
PHE
18,8
18,9
TRP
0,0
0,0
Gesamt
362,3
362,3
87
VS-Reihe Soja 3
400
1—1 350
H
£ 250
3
»Q 200
tn
o
C
150
•<
100
1
^^g
^^
1^300
s
B
•
D IRP
DPHE
DiRi
• LE
• LYS
• MET
• VAL
• TYR
laCYS
DAABA
• PRO
• ALA
DlWI
• ARG
mNH3
• HIS
DGLY
50
DGLU
*
• sm
• ASP
>/SAnordnunc3^
^
Abbildung: TAA-Verteilung in Soja 3 beinn Temperaturversucti [nng/g]
Auch
hier ist
keine
Verschlechterung
analysierten Aminosäuren nachzuweisen.
des
Gesamtwertes
der
88
Soja 4:
Tabelle: Ergebnisse der Lösungsmittel- und Temperaturversuche mit Soja 4 im Vergleich zur
standardisierten Variante [mg/g]
Aminosäuren mg/g
MW Soja 4
20 mM HCI
MW Soja 4
0,01 N
NaOH
frisch
MW Soja 4
0,01 N
NaOH ü.
Nacht
MW Soja 4
10%EtOH
frisch
MW Soja 4
10% EtOH
0 Nacht
MW Soja 4
50%
CHsCN
frisch
MW Soja 4
10%
CHaCN
frisch
MW Soja 4
10%
CH3CN
0 Nacht
MW Soja 4
Temp.
lSO°Clh
ASP
44,6
47,2
47,9
47,7
44,4
44,5
43,2
37,5
44,7
SER
22,2
21,5
21,8
21,8
21,3
20,7
23,0
18,2
23,7
GLU
71,9
75,6
77,0
73,9
72,1
71,0
70,7
60,4
72,5
GLY
18,7
18,2
18,0
18,1
17,5
17,4
19,5
15,6
18,1
HIS
9,8
10,3
10,4
9,9
9,7
9,3
9,6
8,1
10,5
NH3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
ARG
31,6
32,7
31,9
31,0
31,8
30,5'
29,8
24,0
31,8
THR
14,5
14,1
14,0
13,4
13,3
13,5
13,1
10,3
13,3
ALA
11,4
12,4
12,7
11,7
11,4
11,7
11,3
8,7
11,9
PRO
19,5
20,9
21,4
20,2
19,7
19,6
19,2
15,9
19,8
AABA
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
CYS
3,7
2,5
3,5
3,5
3,2
4,6
3,6
2,2
3,6
TYR
13,8
12,9
12,1
12,2
12,8
12,9
12,0
7,1
12,8
VAL
18,2
18,0
17,7
17,3
17,2
18,3
16,0
13,8
17,7
MET
4,7
4,4
5,0
4,6
4,8
4,9
4,4
2,4
4,8
LYS
30,1
30,8
31,1
30,0
30,4
30,4
28,0
24,9
30,6
ILE
17,2
16,9
17,0
16,5
16,6
16,6
15,1
12,5
16,9
LEU
29,5
32,1
32,0
31,6
31,3
30,5
29,4
23,4
31,1
PHE
19,9
20,6
20,6.
20,0
20,0
19,9
18,6
14,6
19,9
TRP
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Gesamt
381,2
391,1
394,3
383,3
377,5
376,3
366,4
299,6
383,7
89
VS-Reihe Soja 4
DTRP
OFHE
OLHJ
• ILE
• LYS
• lUET
• VAL
• TYR
BCYS
DAABA
• PRO
• ALA
• THR
• ARG
• KK3
• HS
DGLY
• au
• Sffi
• ASP
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#
/" , .^
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung In Soja 4 bei verschiedenen Temperatur- und Lösungsnnittelversuchen [mg/g]
Durch den höheren Wert der standardisierten Analyse werden mit der
Probe Soja 4 weitere Versuchsreihen durchgeführt.
Einen deutlichen
Lösungsnnittel
Einbruch des Wertes liefert der Versuch,
10%iges
Acetonitril
zu
verwenden.
als
Wobei
beachtenswert ist, dass sich eine Quellung über Nacht im Kühlschrank
zusätzlich
negativ
auf die
Werte
auswirkt.
Bei
den
restlichen
Versuchen zeigten sich keine signifikanten Abweichungen von den
ursprünglichen Werten. Die grundsätzliche Tendenz ist dahingehend,
dass eine Lösung in NaOH die höchsten Ergebnisse liefert. Hier dürfte
sich die Quellzeit über Nacht positiv auswirken.
90
Soja 5:
Tabelle: Ergebnis des Lösungsmittel- und Temperaturversucties mit Soja 5 im Vergleicti zur standardisierten
Variante [mg/g]
Aminosäuren mg/g
MW Soja 5
MW Soja 5
MW Soja 5
50% CHaCN
Temp.l50"C
20 mM HCI
1h
friscti
ASP
41,9
41,0
40,1
SER
20,1
19,1
21,1
GLU
65,9
64,0
63,4
GLY
18,6
16,3
17,0
HIS
9,1
9,1
9,6
NH3
0,0
0,0
0,0
ARG
28,5
26,4
28,1
THR
14,1
12,9
12,8
ALA
10,7
11,2
11,1
PRO
18,0
18,1
18,0
AABA
0,0
0,0
0,0
CYS
3,6
4,5
3,3
TYR
13,0
11,6
12,1
VAL
17,4
17,3
16,4
MET
4,6
4,9
4,8
LYS
29,2
29,4
29,2
ILE
16,4
15,5
15,5
LEU
28,0
28,4
28,7
PHE
18,6
18,3
18,1
TRP
0,0
0,0
0,0
Gesamt
357,8
348,0
349,3
91
VS-ReIhe Soja 5
450
FHE
LHJ
LE
LYS
MET
VAL
TYR
CYS
AABA
PRO
ALA
THR
ARS
NH3
HS
GLY
GLU
400
•S?
350
O)
300
c
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(0
O
C
E
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250
XO
150
100
50
sm
ASP
0
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#•
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Soja 5 bei verschiedenen Temperatur- und Lösungsmittelversuchen [mg/g]
Bei der Sojaprobe 5 ist ein leichter Abfall beim Temperaturversuch zu
erkennen.
Auch der Lösungsmittelversuch mit 50%igem Acetonitril brachte keine
erkennbare Steigerung.
Im
Wesentlichen zeigen
Unterschiede.
alle drei Versuche
keine signifikanten
92
Soja 150307:
Tabelle: Ergebnisse der Lösungsmittelversuche mit Soja 150307 im Vergleich zur standardisierten Variante
[mg/g]
Aminosäuren mg/g
MW Soja
MW Soja
MW Soja
150307
150307
150307
20mM
0,01 N
UHQ
NaOH
HCI
ASP
47,5
49,8
SER
23,9
23,9
24,3
GLU
77,6
79,8
82,9
GLY
22,4
21,8
25,5
HIS
10,6
11,0
NH3
0,0
0,0
11,1
0,0
ARG
33,7
34,3
34,3
THR
14,5
14,9
15,1
50,5
ALA
13,0
13,4
13,8
PRO
21,5
22,9
22,8
AABA
0,0
0,0
0,0
CYS
3,9
4,2
4,2
TYR
13,6
13,7
13,3
VAL
18,4
19,6
MET
4,8
5,3
LYS
32,8
33,3
19,6
,
4,9
34,8
ILE
17,3
18,3
18,4
LEU
33,2
34,7
34,5
PHE
20,9
22,2
21,9
TRP
0,0
0,0
0,0
Gesamt
409,7
422,9
432,0
93
VS-Reihe Soja 150307
450
VS Anordnung
Abbildung: TAA-Verteilung in Soja 150307 bei Lösungsmittelversuclien [nng/g]
Die Sojaprobe
150307 hebt sich schon aufgrund ihres hohen
Grundwertes von den restlichen Proben ab. Eine leichte Steigerung
konnte sowohl durch die Auflösung in UHQ als auch durch NaOH
quantifiziert werden.
4.2.2. Freie Aminosäuren
Bei jeder Sojaprobe wird zur Bestimmung der freien Aminosäuren
jeweils eine Verdünnung 1:2 und 1:5 hergestellt und analysiert. Dies ist
vor allem durch den hohen Gehalt an Arginin notwendig. Im Zuge der
1:5 - Verdünnung gelangt man aber bei den restlichen Aminosäuren
an
den
Rand
oder
sogar
ausserhalb
des
vorgesehenen
94
Linearitätsbereichs,
daher
ist
bei
diesen
Aminosäuren
die
Verdünnung 1:2 als aussagekräftiger für das Gesamtergebnis zu
betrachten.
Soja
0.08-
o.oe-
0.04
3.00
4.00
7.00
8.00
9.00
Mnutes
Abbildung: UPLC-Chromatrogramm FAA Soja 1 (Verdünnung 1:2)
10.00
11.00
95
Tabelle: Ergebnisse FAA Soja 1 (Verdünnung 1:2 und 1:5) [mg/kg]
mg FAA / kg Sojamehl
MW Soja 1
MW Sojo 1
E06 1:2
E06 1:5
1
ASP
471,6
482,7
SER
218,2
212,8
GLU
669,7
673,0
GLY
70,2
104,8
HIS
68,5
69,0
NH3
0,0
0,0
ARG
1836,9
1863,6
1
1
THR
ALA
81,9
71,0
126,4
44,7
PRO
114,5
119,7
1
AABA
0,0
0,0
CYS
109,7
107,3
TYR
153,0
155,7
VAL
62,4
64,0
MET
34,7
35,9
LYS
127,2
133,9
ILE
47,0
43,4
LEU
58,0
58,6
PHE
134,2
138,5
TRP
139,9
Gesamt
4524,1
96,9
4475,4
1
1
1
96
FAA_Soja 1
• TOP
i
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I
4000,0 -<#'y-:>^
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DLOJ
• LE
• LYS
• MET
• VAL
• TYR
• CYS
OAABA
• PRO
• ALA
DTHR
• ARQ
• NH3
• HIS
DGLY
OGLU
• sm
• ASP
#.4
Verdünnung
Abbildung: FAA-Verteilung Soja 1 [mg/kg Soja]
Bei den Aminosäuren Alanin, Trytophan und Glycin ist ein deutlich
abweichender
festzustellen.
Wert
bei
den
verschiedenen
Verdünnungen
97
Soja 2:
Tabelle: Ergebnisse FAA Soja 2 (Verdünnung 1:2,1:5 und 1:3) [mg/kg]
mq FAA / kg Sojamehl
MW Soja 2
MW Soja 2
MW Soja 2
E06 1:5
E06 1:2
E06 1:3
ASP
469,1
479,6
507,4
SER
219,1
222,6
232,3
GLU
677,2
685,1
715,1
GLY
69,6
97,2
62,2
61,9
HIS
75,4
78,3
NH3
0,0
0,0
0,0
ARG
1856,9
1895,6
1978,5
THR
91,0
78,1
34,8
ALA
131,8
45,6
105,1
PRO
123,7
128,6
129,4
AABA
0,0
0,0
0,0
CYS
109,9
108,8
101,8
TYR
152,5
152,4
162,5
VAL
62,0
65,1
66,2
MET
35,2
34,9
35,9
LYS
132,0
135,4
134,7
ILE
48,5
49,0
48,7
LEU
57,8
62,3
72,0
PHE
130,5
136,4
140,1
TRP
141,0
100,8
126,5
Gesamt
4583,2
4555,8
4715,0
FAA_Soja 2
JD TRP • ;
DLBJ
!<• LE ; ,
• LYS
[•MET :
: • VAL"
• TYR
• II CYS
DAA8A
• PRO
• ALA
DTVR
• ARG
BNH3
• HIS
DGLY
DGLU
, BSGR
• ASP
0,00
/
/
„#
Verdünnung
Abbildung: FAA-Verteilung Soja 2 [mg/kg Soja]
98
Auch hier ist anzumerken, dass es deutliche Unterschiede bei Ala, Trp
und Gly zwischen 1:2 und 1:5 gibt obwohl der Gesamtgehalt
äquivalent ist. Die Verdünnung 1:3 nähert sich bei diesen Werten eher
der 1:2 Verdünnung an.
Soja 3:
Tabelle: Ergebnisse FAA Soja 3 (Verdünnung 1:2, 1:5 und 1:3) [mg/kg]
mg FAA / kg Sojamehl
MW Soja 3 MW Sojo 3 MW Soja 3E06 1:2
E06 1:3
E06 1:5
ASP
SER
471,2
468,1
240,7
235,5 •
529,3
264,5
GLU
690,0
665,4
744,0
GLY
91,1
HIS
77,4
137,5
79,1
71,1
62,3
NH3
0,0
ARG
0,0
2123,9
THR
2016,5
81,4
0,0
1979,1
ALA
137,1
PRO
AABA
73,3
38,8
117,8
130,9
49,3
133,6
0,0
0,0
0,0
CYS
112,6
107,3
112,3
173,8
140,8
TYR
158,6
162,2
VAL
66,8
64,4
70,8
MET
36,4
34,0
33,9
LYS
142,1
141,5
146,4
ILE
50,7
46,3
51,7
LEU
62,4
59,2
75,3
PHE
137,1
138,8
141,5
TRP
156,5
109,2
136,3
Gesamt
4859,4
4683,8
5034,6
99
FAA_Soja 3
6000,00
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B ASP
JVerdünnung
Abbildung: FAA-Verteilung Soja 3 [mg/kg Soja]
100
Soja 4:
Tabelle: Ergebnisse FAA Soja 4 (Verdünnung 1:2 und 1:5) [mg/kg]
mg FAA / kg Sojamehl
MW Soja 4
MW Soja 4
0500101 1:2 0500101 1:5
ASP
435,4
432,5
SER
191,1
192,2
GLU
787,1
767,7
GLY
70,9
88,0
HIS
87,2
92,0
NH3
0,0
0,0
ARG
2398,8
2416,0
85,4
THR
82,7
ALA
123,2
68,5
PRO
127,7
129,1
AABA
0,0
0,0
CYS
83,9
81,8
TYR
.111,6
106,1
VAL
60,9
62,]
MET
33,7
33,4
LYS
139,6
140,2
ILE
45,9
43,8
LEU
60,1
60,9
PHE
89,4
89,9
TRP
340,8
308,5
Gesamt
5270,1
5198,3
FAA_Soja 4
5000,0 •
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Verdünnung
Abbildung: FAA-Verteilung Soja 4 [mg/kg Soja]
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• LYS
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• NH3
• HIS
OGLY ,
DGLU
• SSt
• ASP
101
Soja 5:
Tabelle: Ergebnisse FAA Soja 5 (Verdünnung 1:2 und 1:5) [mg/kg]
mg FAA / kg Sojamehl
MW Soja 5 MW Soja 5
StrobI
StrobI
240107 1:2 240107 1:5
ASP
464,8
467,0
SER
169,2
184,3
GLU
530,2
515,1
GLY
54,9
86,2
HIS
55,8
66,9
NH3
0,0
0,0
ARG
1279,6
THR
62,4
1285,3
- 53,5
ALA
89,7
11,4
PRO
89,7
94,6
AABA
0,0
0,0
CYS
116,7
111,1
TYR
104,8
104,5
VAL
57,7
63,5
MET
35,0
32,7
LYS
106,4
108,4
ILE
44,2
42,6
LEU
56,9
57,0
PHE
86,4
86,0
TRP
179,4
130,6
Gesamt
3583,9
3500,7
FAA_SoJa 5
DTOP
aPHE
OLBJ
• LE
• LYS
• ncr
• VAL
• TYR
» 2a)o,( l--%
eCYS
a AABA
• PFO
< 200W f'^^J
• ALA
aivn
• AFO
• NH3
iooo,( • •i'jtvSi
• HB
QGLY
QGLU
• sm
• ASP
ntf>^
c/
,*
cP^
Verdünnung
Abbildung: FAA-Verteilung Soja 5 [mg/kg Soja]
.
102
Soja 150307:
Tabelle: Ergebnisse FAA Soja 150307 (Verdünnung 1:2 und 1:5) [mg/kg]
mg FAA / kg Sojamehl
MW Soja
MW Soja
150307_Zen
150307 1:2
trif. 1:2
,
576,2
ASP
576,7
SER
120,8
112,2
GLU
755,7
755,9
GLY
48,0
33,0
HIS
50,7
NH3
53,0
0,0
ARG
2549,8
2508,1
0,0
THR
34,2
32,6
ALA
59,2
58,7
PRO
92,9
93,6
AABA
0,0
0,0
CYS
146,8
162,4
TYR
101,2
114,3
VAL
65,0
MET
58,1
33,1
LYS
110,8
109,1
32,1
ILE
35,4
33,7
LEU
55,3
55,0
PHE
60,3
57,5
TRP
293,9
303,9
Gesamt
5185,2
5154,0
MW_Soja 150307
' 6000,0
OTPP
»
an^
OLHJ
• LE
• LYS
N
• Her
\.- .,..
;••'"'
••;
&•::•
^^
'•",•-
ixs-^-
..:•.> ..
"•'.':•?
• VAL
• TYR
BCYS
OAABA
• PRO
• ALA
Dim
• AR3,
D^KJ
• HE
oaY
OGLU
• sm
.#
/'
Verdünnung
Abbildung: FAA-Verteilung Soja 150307 [mg/kg Soja]
103
Bei allen Analysen ist festzustellen, dass die 1:5-Verdünnung etwas
geringere
Werte
als
die
1:2
Verdünnung
aufweist.
Die
Übereinstimmung, was den Gehalt an Aminosäuren betrifft, ist mit
Ausnahme von Glycin, Alanin und Tryptophan ausreichend. Glycin
zeigt einen deutlich höheren Wert, Alanin und Tryptophan zeigen
einen zu niedrigen Wert.
Mit Probe Soja 150307 wurde als Alternativmethode getestet, wie sich
in der Probenvorbereitung mehrfache Zentrifugation anstatt der
wiederholten Filtration auswirkt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass es
zu keinen signifikanten Unterschieden kommt und dass es durchaus als
zusätzliche, alternative Methode angesehen werden kann.
Die Sojaproben 4 und 150307 enthalten mit über 5000 mg FAA/kg
Sojamehl deutlich am meisten Aminosäuren.
4.3. Milch
Die
Probenvorbereitung
des
Magermilchpulvers
wurde
laut
standardisierten Vorgaben, also mit 20mM HCI, durchgeführt um eben
diese
einer
Überprüfung
zu
unterziehen
und
damit
einen
Referenzwert zu generieren.
4.3.1. Gesamtaminosäuren
Die
Analyse
des
Milchpulvers
Standardreaktionsbedingungen
eine
ergibt
klar,
vollständige
dass
die
Hydrolyse
gewährleisten. Die Werte liegen knapp unterhalb der Werte aus der
N-Bestimmung nach Kjeldohl.
104
0.08-1
o
CM
CM
in
006-
n
1^
o
O
IT
1^
Q.
Ö
CM
00
&
?
a>
r- s r^
s «i "r
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O02-
o
^
o ^ ^
^
T
cop
sy
o
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•"
1
0)
1^
o
UJ
_l
tD
5
id
0.00-
o
^
-J
1
o
rV
-0.024.00
7.00
6.00
5.00
8.00
Mnutes
Abbildung : Chromatogramm Magermilchpulver „Alpi"
Tabelle: Ergebnis TAA Magermilchpulver „Alpi" [mg/g]
Aminosäuren
mg/g .
MWMMP
Alpi
20mMHCI
ASP
25,2
SER
18,9
GLU
GLY
85,1
9,2
HIS
7,8
NH3
0,0
ARG
10,2
THR
12,2
ALA
7,9
PRO
30,0
AABA
0,0
CYS
1,2
TYR
12,1
VAL
18,6
MET
6,0
LYS
33,3
HE
15,2
LEU
29,5
PHE
14,9
TRP
0,0
Gesamt
337,4
10.00
11.00
105
Milch
Abbildung: TAA-Verteilung Magermilchpulver „Alpi" [mg/g]
106
5. Diskussion
Soja und Milch sind im Gegensatz zu Mais proteinreiche Stoffe mit
einem Proteinanteil von über 30% im Vergleich mit 9% bei Mais.
Alle Versuche zur Bestimmung der Gesamtaminosäuren bei Mais
zielen darauf ab, mittels UPLC-Analyse und vorausgegangener
Hydrolyse den wahren Gehalt an Aminosäuren zu erfassen. Dieser
liegt knapp unter dem zuvor bestimmten Kjeldahl-Wert. Dies ist mit
Verwendung der Standardmethode mit 20mM HCI nicht möglich.
Der Versuch, die Temperatur zu steigern wird aufgrund von Hinweisen
von Waters PicoTag Operator's Manual (1988) und Lucas und Sotelo
(1982) durchgeführt. Es kann bestätigt werden, dass die Ergebnisse
weitgehend äquivalent sind, die für Serin und Threonin befürchteten
Verluste können nur zum Teil verzeichnet werden. Im Allgemeinen setzt
sich die kürzere Analysenmethode auch aufgrund von schnelleren
Arbeitsabläufen durch.
Grundgedanke
hinter
den
Versuchen
mit
unterschiedlichen
Lösungsmitteln ist die Aufteilung der Aminosäuren noch Löslichkeit in
Gsborne-Fraktionen. Angedacht wird eine Steigerung der Ausbeute,
wenn zuerst eine Fraktion aufgelöst wird und später eine zweite bzw.
wenn man sich bei der Lösung speziell auf einzelne Fraktionen
konzentriert. Zusätzlich stellt die Literatur klar, dass eine Hydrolyse mit
6N HCI als Kompromiss gilt.
Andere
Lösungsmittel
ergeben
durchwegs
Steigerungen
der
Ausbeute, vor ollem bei Beteiligung von alkalischen Chemikalien wie
Natronlauge. Dies kann bei ollen untersuchten Proben festgestellt
107
werden. Eine Steigerung des erhaltenen Gehalts von mindestens 20%
kann erreicht werden.
Der Einsatz von Ethanol muss differenziert betrachtet werden. Das
Ergebnis
ist stark
konzentrationsabhängig.
Während sich
die
Beteiligung von 10%igem Alkohol als durchwegs positiv herausgestellt
hat, ist die Konzentration von 70% als zu hoch anzusehen. Generell
werden
einzelne
Cysteingehalt,
Aminosäurengehalte,
reduziert.
Auch
bei
wie
zum
Verwendung
Beispiel
von
der
Ethanol-
Gemischen mit zu hohen Konzentrationen bestätigt sich diese
Aussage.
Eine Kombination von alkalischem Lösungsmittel und Alkohol erweist
sich bei allen analysierten Proben als förderlich. Höhere Werte werden
hierbei bei allen Proben mit einer Kombination von 0,0IN NaOH in 10%
EtOH erreicht.
Leider wirkt sich eine Quellzeit in den einzelnen Lösungsmitteln
unabhängig von diesen nicht weiter positiv aus, eine weitere
Steigerung
kann
auch
nach
2h
Quellung
nicht
signifikant
nachgewiesen werden. Ein Quellen über Nacht wirkt sich wiederum
negativ auf die erhaltenen Werte aus.
Der Einsatz eines Rüttlers wird aufgrund der Beobachtungen während
vorangegangener Analysen angedacht, bringt aber schlussendlich
keine weiteren Verbesserungen.
Es wird in der Literatur (Weiss et al., 1997) eine Verbesserung der
Ausbeute bei Verwendung von Acetonitril erwähnt. Sowohl der Einsatz
von 10%igem als auch von 50%igem Acetonitril zeigt keine positiven
Ergebnisse, im Gegenteil sogar eine Verschlechterung. Auch in
108
diesem
Fall
ist
eine
negative
Tendenz
speziell
bei
Cystein
nachzuweisen.
Der von Blackburn in Fountoulakis (1998) vorgeschlagene Zusatz von
Mercaptoethanol als Schutzsubstanz während der Hydrolyse kann nur
bedingt als positiv gewertet werden. Die Aminosäure Cystein geht bei
dieser Art von Hydrolyse vollständig verloren und kann mittels UPLC
nicht mehr nachgewiesen werden. Auch der Gehalt der zweiten
schwefelhaltigen Aminosäure, Methionin, wird stark gesenkt, die
restlichen
Aminosäuren
können
nicht
vermehrt
nachgewiesen
werden.
Die VenA/endung von UHQ-Wosser als Lösungsmittel, das bei der
Hydrolyse von Soja durchwegs positive Ergebnisse liefert, zeigt bei
Mais keinerlei Verbesserungen.
Die Aminosäure Glycin zeigt bei allen Proben innerhalb eines
spezifischen
Bereichs
möglicherweise
auf
die
größten
Schwankungen.
Kontaminationen
Dies
während
kann
des
Vorbereitungsprozesses zurückzuführen (Liu, 1994).
Eine neue, feinere Siebung während der Probenvorbereitung kann
auch nur bedingt als Erfolg gewertet werden. Bei Maisprobe St.
Georgen PR36P85 SNr. 12 kommt es zu einer Steigerung der Ausbeute
bei Verwendung von 0,01 N NaOH als Lösungsmittel. Bei weiteren
Versuchen mit dem bei Maissorte St. Georgen DKC4626 SNr. 1
erfolgreichem Lösungsmittel 0,01 N NaOH in 10% EtOH kann das
Ergebnis aber nicht eindeutig bestätigt werden.
Am Schluss aller durchgeführten Maisanalysen kann erwähnt werden,
dass es keine einheitlich beste Lösung zur Probenvorbereitung gibt, mit
109
der man den wahren Gesamtgehalt an Aminosäuren bei Mais
feststellen kann. Die Verwendung von 0,01 N NaOH in 10% EtOH hat
sich
im
Zuge
dieser
Diplomarbeit
als
der
beste
Kompromiss
herausgestellt und hat bei allen analysierten Proben eine starke
Verbesserung erwirkt. Es kann damit eine Steigerung des Ergebnisses
abhängig vom wahren Gehalt an Proteinen in Mais auf bis zu 6,5%
erzielt werden.
Die Gesamtaminosäurenbestimmung in Soja brachte, wie erwartet,
Ergebnisse knapp unter dem vorher bestimmten Kjeldohl-Wert und
sind daher durchaus als realistisch zu bezeichnen. Zwei Sorten, Soja 4
und Soja 150307, zeichnen sich durch einen besonders hohen Wert an
Gesamtaminosäuren aus. Bei eben diesen Sorten zeigen sich aber
auch bei der Bestimmung der freien Aminosäuren die höchsten
Werte. Man kann daher davon ausgehen, dass der Gehalt an freien
Aminosäuren und der Gesamtgehalt an Aminosäuren bei Soja positiv
korrelieren.
Beim Gesamtgehalt ist Glutaminsäure mit über 65 mg/g am meisten
vertreten, gefolgt von Asparaginsäure und Leucin. Beim Vergleich der
Gesamtaminosäuren-Zusammensetzung der einzelnen Sorten sind
keine besonderen Auffälligkeiten zu erkennen.
Um die Abschätzbarkeit der Maisversuche zu bestätigen, sind auch
bei einer ausgewählten Sojaprobe (Probe Soja 4) Versuche bezüglich
des
Lösungsmittels
durchgeführt
worden.
Gegenüber
der
Standardmethode mit 20 mM HCI als Lösungsmittel, zeigt sich bei 0,01
N NaOH eine leichte Steigerung im Gehalt. Auch 10%iger Ethonol
erreicht in etwa die Ausgangswerte. Bei Acetonitril zeigt sich, dass die
Konzentration
einen
deutlichen
Einfluss
hat;
während
50%iges
Acetonitril durchaus die Ausgangswerte erreicht, sind bei 10%igem
no
Acetonitril
Verluste
zu
erkennen.
Weitere
Verluste
sind
bei
durchgeführten Quellungen über Nacht zu beobachten.
Bei der Sojaprobe 150307 wurden UHQ und 0,01 N NaOH als
Lösungsmittel getestet. Die Natronlauge hat den bei Probe Soja 4
entstandenen Eindruck bestätigt, dass man dem Kjeldahl-Wert nähert
und konnte somit den Ausgangswert steigern. Auch eine Verdünnung
mit UHQ konnte den ursprünglichen Wert steigern.
Auch bei den Sojaproben zeigt sich, dass eine Hydrolyse für Ih bei
ISO^C einen guten Kompromiss darstellt. Der Gesamtwert verändert
sich unsignifikant. Die erhaltene Zusammensetzung der einzelnen
Aminosäuren ergibt leichte Veränderungen bei Serin, Threonin und
Glycin. Während Alanin und Threonin bei den meisten Sojaproben
geringere Werte erkennen lassen, erhöht sich im Gegensatz dazu der
Glycin-Wert geringfügig.
Die Bestimmung der freien Aminosäuren bei den Sojaproben zeigt
technisch
keinerlei
Schwierigkeiten.
Es
wird
neben
der
Standardmethode mit Filtration auch eine Methode mit dreifacher
Zentrifugation,
die
die
Filtrationsprozesse
ersetzen
erprobt.
Im
Wesentlichen ist auch die neuere Methode anwendbar, es haben
sich keine Unterschiede im Gesamtgehalt ergeben und auch die
Zusammensetzung
Welche
der einzelnen
Methode
letztlich
Aminosäuren
gewählt
ist
ist vergleichbar.
stark
von
der
apparatetechnischen Ausstattung des jeweiligen Labors abhängig.
Generell zeigt sich bei den freien Aminosäuren in Soja ein extem
hoher Wert an Arginin. Dieser nimmt fast die Hälfte des Gesamtgehalts
ein. Daraus ergibt sich ein Problem bei der Verdünnung der Probe.
Hat
Arginin
die
nötige
Konzentration
und
liegt
im
linearen
ni
Kalibrationsbereich, so sind die meisten anderen Aminosäuren am
Rande ihres Kalibrationsbereiches oder sogar ousserhalb dieses. Somit
sind die restlichen Werte mit einem Unsicherheitsfaktor belegt. Um
diesem Problem aus dem Weg zu gehen, werden die Verdünnungen
1:2 und 1:5 hergestellt. Die Kalibrationskurve für Arginin dürfte auch
ousserhalb des kalibrierten Bereichs linear verlaufen, da die Werte der
1:2-Verdünnung und 1:5-Verdünnung durchaus ident sind. Bei den
anderen Aminosäuren, vor allem Alanin, Tryptophan und Glycin,
zeigen sich schon deutlichere Unterschiede. Aufgrund der oben
erwähnten Probleme, sind hier die Werte der 1:2-Verdünnung als
realistischer zu betrachten.
Die Bestimmung des Gesomtaminosäurengehalts in Milch wurde
hauptsächlich deshalb vorgenommen, um einen weiteren Test der
Hydrolyse-Standardbedingungen durchzuführen. Auch bei Milch wird
ein Aminosäurengesamtwert knapp unterhalb des Kjeldahl-Wertes
erhalten. Damit bestätigt sich dos Ergebnis aus den Sojaversuchen,
proteinreiche Stoffe können mit der Standardmethode zu einem
realistischen Ergebnis gebracht werden. Die Gehalte der einzelnen
Aminosäuren stimmen im Wesentlichen auch mit der Literatur überein.
Die
offensichtliche
Schwäche
der Standardprobenvorbereitung
betrifft nur das Maispulver. Die Gründe für die zu niedrige Ausbeute an
Aminosäuren in den Maisproben können hier nicht genau definiert
werden. Vermutungen gehen dahin, dass es möglicherweise an den
generell geringen Gehalten an Proteinen und an den hohen
Kohlenhydrat-Gehalten liegt. Dem setzen aber Lucas und Sotelo
(1982) entgegen, dass der Kohlenhydrat-Gehalt auf die Hydrolyse
keinen Einfluss hat. Die zusätzliche Spezialisierung auf die einzelnen
Aminosäurenfraktionen bringt nicht den gewünschten Erfolg. Weitere
Vermutungen gehen dahin, dass es an der Struktur der Proteine in
112
Mais liegen könnte, durch die möglicherweise eine vollständige
Hydrolyse verhindert wird. Ein anderer Denkansatz besteht darin, dass
während
der
sauren
Hydrolyse
möglicherweise
bestimmte
Aminosäuren zerstört werden und das Ergebnis deshalb verzerrt wird.
Positiv
kann
aber
letztlich
erwähnt
werden,
dass
die
Standardvorbereitung bei den proteinreichen Lebensmitteln wie Soja
und Milch gut funktioniert und bei diesen auch die Versuche mit
anderen Lösungsmitteln durchwegs positive Ergebnisse liefern.
113
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