recomLine Parvovirus B19 IgM - Pharma Consulting Marion Senn

MIKROGEN
Gebrauchsinformation
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität]
recomLine Parvovirus B19 IgM
Immunoassay mit rekombinant produzierten Antigenen zur Bestimmung von IgG- oder IgM-Antikörpern,
sowie Aviditätsbestimmung von IgG-Antikörpern gegen Parvovirus B19 in humanem Serum oder
Plasma.
1. Allgemeines, Verwendungszweck
Der recomLine Parvovirus B19 IgG/IgM ist ein qualitativer in-vitro-Test zum Nachweis und zur
Identifizierung von IgG- und IgM-Antikörpern gegen das Parvovirus B19 in humanem Serum oder
Plasma. Der recomLine Parvovirus B19 IgG/IgM erlaubt durch separates Auflinieren verschiedener
rekombinant hergestellter Antigene die Bestimmung von spezifischen Parvovirus B19 Antikörpern. Im
Gegensatz zu ELISA Testsystemen können durch die verschiedenen Antigen-Reaktionsmuster und der
Möglichkeit der Aviditätsbestimmung zusätzliche Aussagen über den Infektionsstatus gemacht werden.
2. Parvovirus B19
Parvovirus B19 ist ein Einzelstrang-DNA-Virus mit einem linearen Genom von ca. 5,1 Kb Länge. Seine
Oberfläche wird von einer Proteinhülle gebildet, die aus zwei Polypeptiden VP1 (ca. 84 kDa) und VP-2
(ca. 58 kDa) besteht. Die beiden Kapsidproteine VP1 und VP2 werden vom gleichen Leserahmen auf
dem viralen Genom kodiert, sie sind sequenzidentisch bis auf einen zusätzlichen N-terminalen Anteil
des VP1 (ca. 26 kDa). Weiterhin wird noch ein Nicht-Strukturprotein NS-1 gebildet, welches für die
Virusreplikation und Vermehrung in der Zelle nötig ist.
Parvovirus B19 wird primär in erythropoetischen Vorläuferzellen repliziert und lysiert diese, so dass je
nach immunologischer Kompetenz mehr oder weniger ausgeprägte Anämien auftreten können. Das
Virus wird meist durch Tröpfchen-Infektion übertragen; bedingt durch die relativ hohe Stabilität der
Virusproteinhülle ist eine Infektion durch Blut und Blutprodukte ebenso möglich. Parvovirus B19 tritt
weltweit auf, wobei in den meisten Ländern ein Durchseuchungstiter von ca. 60 - 70% beobachtet wird.
Klinische Bilder:
Die häufigste klinische Manifestation ist das Erythema infectiosum, auch als typische Kinderkrankheit
Ringelröteln (engl. „Fith Disease“, die fünfte exanthematöse Kinderkrankheit neben Scharlach, Masern,
Röteln, und Exanthema subitum) bekannt. Nach relativ milden Prodromalsymptomen kommt es nach ein
bis zwei Wochen zur Ausbildung des typischen Exanthems, das meist von grippeähnlicher Symptomatik
begleitet wird. Das Exanthem tritt meist zuerst an den Wangen auf und breitet sich innerhalb weniger
Tage über den ganzen Körper aus.
Bei ca. 50% der erwachsenen Normalpersonen verläuft eine Infektion durch Parvovirus B19 weitgehend
asymptomatisch; in einigen Fällen werden grippeähnliche Symptome beobachtet.
Allerdings sind Komplikationen wie zusätzlich auftretende Arthralgien und Arthritis häufig (ca. 60%).
Frauen sind hiervon doppelt so oft betroffen wie Männer. Diese Arthropathien verschwinden in den
meisten Fällen innerhalb von zwei bis vier Wochen. In wenigen Fällen können die Symptome jahrelang
intermittierend fortbestehen, so dass bei der Abklärung chronischer Arthropathien auch an eine
persistierende Parvovirus B19-Infektion gedacht werden muss.
Bedingt durch die Bildung von spezifischen Antikörpern ist die Dauer der Virusvermehrung limitiert, so
dass der Befall und Verlust von erythropoetischen Vorläuferzellen keine gravierenden Effekte nach sich
zieht. Bei Patienten mit hämolytischen Anämien kann dieses jedoch zu einer lebensbedrohenden
aplastischen Krise führen.
Bei Infektion während der Schwangerschaft kann das Parvovirus B19 transplazentar auf den Föten
übertragen werden, und führt somit bei ca. 20% der Fälle zu einer intrauterinen Infektion. Aufgrund der
kurzen Erythrozytenüberlebenszeit bis zur zwanzigsten Schwangerschaftswoche und einer fehlenden
effizienten Immunabwehr kann eine Infektion zu einer schweren akuten oder chronischen Anämie und
nachfolgendem Spontanabort führen. Eine weitere Komplikation nach Infektion während des zweiten
und dritten Trimenons ist die Ausbildung eines Hydrops fetalis, der unbehandelt meist das Absterben
der Frucht zur Folge hat. Im Gegensatz zum Rötelnvirus verursacht der Erreger der Ringelröteln keine
Embryopathie, ein Schwangerschaftsabbruch ist deshalb nicht indiziert.
-1-
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
Bei immundefizienten Personen kann eine Parvovirus B19-Infektion eine chronische Anämie sich
ziehen, da das Virus nicht vollständig eliminiert werden kann. Im Vergleich zur aplastischen Krise bei
Patienten mit Anämie handelt es sich hier jedoch um deutlich mildere Verlaufsformen.
Zusätzliche Organmanifestationen wie etwa hepatische Dysfunktionen, respiratorische Erkrankungen,
Parvovirus B19-assoziierte Myokarditis u.a. sind in jüngster Zeit beschrieben worden.
In Einzelfällen werden auch chronische Anämien und Arthropathien verursacht durch persistierende
Parvovirus B19-Infektionen in Patienten ohne bekannten Immundefekt gefunden.
3. Diagnostik
Eine Erstinfektion durch Parvovirus B19 ist durch das Vorhandensein spezifischer IgM Antikörper
charakterisiert. IgM-Titer werden meist etwa 10 Tage nach Infektion und damit meist gleichzeitig mit dem
Auftreten der Symptomatik gefunden. IgG-Titer sind wenige Tage später zu finden und persistieren in
der Regel lebenslang. Für den Antikörpernachweis können die Strukturproteine des Virus verwendet
werden.
In aktuellen Arbeiten wurde auch das Nicht-Strukturprotein NS-1 als serologischer Marker bei
chronischen Verlaufsformen beschrieben. Nach Parvovirus B19-Infektionen werden in mindestens 10 20% aller Seren Antikörper gegen das NS-1 Protein gefunden. Bei Patienten mit Verdacht auf
persistierende
Infektion
(chronische
Anämie,
chronische
Arthropathien,
Immundefizienz,
Ausschlussdiagnostik) sollte immer auch ein Virusnachweis mittels PCR durchgeführt werden.
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität], IgM
Für den vorliegenden Line-Assay werden gentechnologisch erzeugte Parvovirus B19-Antigene
verwendet, die in E.coli bzw. in eukaryotischen Zellen als Nicht-Fusionsproteine produziert werden.
Die Unterteilung des Strukturproteins VP1 in zwei Segmente sowie die separate Präsentation von
linearen und Konformationsepitopen des VP2-Proteins erlauben bei der serologischen Interpretation
einen Hinweis auf den möglichen Infektionszeitpunkt. Mit Beginn der Immunantwort nach Erstinfektion
werden im allgemeinen IgG-Antikörper gegen lineare Epitope auf dem gesamten Strukturprotein
gebildet; d.h. eine Patientenprobe mit diesem Immunstatus erkennt sowohl den N- wie auch den Cterminalen Bereich (VP-N und VP-C, daneben auch noch VP-2r und VP-1S). Im Verlauf von etwa 6 - 9
Monaten werden die VP-C-spezifischen, gegen lineare Epitope gerichteten Antikörper durch solche
ersetzt, die bevorzugt Konformationsepitope erkennen. Diese Epitope werden durch das Protein VP-2p
präsentiert. Die entsprechenden IgG-Antikörper bleiben in der Regel lebenslang erhalten. Mit
zunehmender Dauer nach Erstinfektion ist somit ein Verschwinden der Reaktion gegen VP-C (meist
nach 6 Monaten) und VP-2r (meist nach wenigen Jahren), auf den Streifen feststellbar, während die IgGAntikörper gegen VP-N (und z.T. VP-1S) über sehr viele Jahre hin nachweisbar und diejenigen gegen
VP-2p meist lebenslang erhalten bleiben.
Zusätzlich ist auf dem Teststreifen noch das Nicht-Struktur-Protein NS-1 von Parvovirus B19 vorhanden.
Nach Literaturangaben und eigenen Evaluierungen (siehe Punkt 13) sind IgG-Antikörper gegen NS-1 in
Patienten mit B19-induzierter Arthritis und anderen chronischen Verläufen, nicht aber bei akuten
Infektionen zu finden. Aufgrund des Durchseuchungstiters kann eine Diagnose nie alleine aufgrund von
Anti-NS-1 gestellt werden, sondern muss immer durch ein positives PCR-Resultat untermauert werden.
Bei Verdacht auf persistierende Parvovirus B19-Infektion kann das Vorhandensein eines Anti-NS-1Titers also nur einen Hinweis geben.
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Gebrauchsinformation
MIKROGEN
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Abbildung 1: Parvovirus B19 Gene; verwendete rekombinante Antigene im recomLine Parvovirus B19 IgG, IgM
Lokalisation und Anordnung Parvovirus B19 Proteine
5’
3´
NS-1
VP1
VP2
rekombinante Antigene im recomLine Parvovirus B19
NS-1
VP-N
VP-1S
VP-C
VP-2p; VP-2r
Tabelle 1: Beschreibung und diagnostische Aussagekraft der verwendeten rekombinanten Antigene
Antigenbez.
Beschreibung und diagnostische Aussagekraft
VP2
Hauptkapsidantigen; IgG-Antikörper gegen die Konformationsepitope (VP2p) sind in der Regel lebenslang nachweisbar, gegen die linearen Epitope
(VP-2r) nur Monate bis wenige Jahre. Beide Antigene zeigen eine gute
Reaktivität in der frühen Phase der Infektion.
(VP-2p, VP-2r)
VP-N
N-terminales Fragment des Kapsidantigens VP1; IgG-Antikörper oft
jahrelang nachweisbar. Berücksichtigung bei der Aviditätsbestimmung.
VP-C
C-terminales Fragment der Kapsidantigene VP1 bzw. VP2; die Reaktivität
(IgG und IgM) der linearen Epitope erscheint früh im Verlauf der
Parvovirus-B19-Infektion und verschwindet bald wieder (IgG: in der Regel
nach etwa 6 Monaten, IgM: in der Regel bis spätestens nach ca. 12
Wochen).
VP-1S
N-terminales, spezifisches Fragment des Kapsidantigens VP1 (der
Bereich, in dem sich VP-1 und VP-2 unterscheidet), IgG-Antikörper nach
Infekt lange nachweisbar. Berücksichtigung bei der Aviditätsbestimmung.
NS-1
Nichtstrukturprotein 1, erscheint im IgG frühestens 6-8 Wochen nach
Infektion bei mindestens 20 % der Erkrankten, kann evtl. Hinweis auf
Viruspersistenz geben.
Bei der Interpretation eines positiven oder fraglichen IgM-Resultats muss immer das IgGReaktivitätsmuster miteinbezogen werden. Bei einer frischen oder kurz zurückliegenden Infektion sollte
in der Regel auch immer ein deutlicher VP-C-IgG-Titer zu finden sein.
Durch die Aviditätsbestimmung im recomLine Parvovirus B19 IgG kann die Diagnosestellung in der
Parvovirus B19-Serologie erweitert werden. Die Avidität ist ein Maß für die Stärke der Bindung zwischen
einem Antikörper und „seinem korrespondierendem“ Antigen. Normalerweise durchlaufen die IgGAntikörper eine Reifung, d.h. die IgG-Antikörper der frühen Phase sind niedrig avide, während die
Antikörper der abgelaufenen Infektion eine hohe Avidität aufweisen. Die Bindung zwischen Antigen und
Antikörper ist bei niedrig aviden Antikörpern so schwach, dass sie durch Anwendung eines
Aviditätsreagenzes aufgelöst werden kann, d.h. die Antikörper können von der Bindungsstelle auf dem
recomLine Parvovirus B19 IgG Streifen abgewaschen werden. Hoch avide Antikörper weisen eine starke
Bindung zum Antigen auf, die durch den Einsatz eines Aviditätsreagenzes nicht gelöst werden kann.
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recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
⇒ Immundominante rekombinante Antigene sowohl von VP1 als auch VP2
⇒ Die IgG- und IgM-Immunantworten werden getrennt erfasst und können jeweils in ihrer Intensität
bewertet werden.
⇒ Kontrollbanden zur Überprüfung der Konjugat-Reaktion (IgG, IgM)
⇒ Sicherer Nachweis durch Streifen spezifische Cutoff-Kontrolle
⇒ Klar definierte, rekombinante, hoch aufgereinigte Antigene, dadurch hohe Spezifität. Einfache und
klare Interpretation durch leicht ablesbare Banden.
⇒ Höhere Sensitivität aufgrund mengenmäßig optimierter Antigene
⇒ Möglichkeit der Aviditätsbestimmung zur Eingrenzung des Infektionszeitpunk, individuelle Bewertung
der gegen Einzelantigene gerichteten Avidität der IgG-Antikörper (VP-N, VP-1S)
4. Testprinzip
Die rekombinanten, hochgereinigten Proteine werden auf eine Nitrozellulose-Membran aufgetragen.
Diese Matrix wird anschließend in Streifen geschnitten.
Zum Nachweis von Parvovirus B19-spezifischen Antikörpern werden die Streifen mit der verdünnten
Serumprobe inkubiert, wobei die Antikörper sich an die Antigene auf den Streifen anlagern. Nichtgebundene Antikörper werden anschließend weggewaschen und die Streifen in einem zweiten Schritt
mit Anti-human-IgG bzw. -IgM inkubiert, die mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt sind. Mit einer durch
die Peroxidase katalysierten Färbereaktion werden spezifisch gebundene Antikörper nachgewiesen.
Falls eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattgefunden hat, erscheint an der entsprechenden Stelle eine
dunkle Bande auf dem Streifen.
Am oberen Ende der Teststreifen befinden sich untereinander vier Kontrollbanden:
1. Die Reaktionskontrolle unter der Streifennummer, die bei jedem Serum eine Reaktion zeigen muss
2. Zwei Konjugatkontrollen IgG/IgM: diese Banden dienen zur Kontrolle der jeweiligen nachgewiesenen
Antikörperklasse. Wird der Teststreifen z. B. zum Nachweis von IgG-Antikörpern benutzt, zeigt die
IgG-Konjugatkontrollbande eine deutliche Bande. Analoges gilt für die IgM-Konjugatkontrollbande.
3. Cutoff Kontrolle: zur Kontrolle des Färbeprozesses bzw. Auswertung der Teststreifen. Die Intensität
dieser Bande erlaubt die Beurteilung der Antikörper-Reaktivität in positiv, fraglich oder negativ.
5. Packungsinhalt
Die Reagenzien einer Packung reichen für 25 Bestimmungen.
Jeder Reagenziensatz enthält:
100 ml
Waschpuffer (zehnfach konzentriert)
Enthält Phosphat-Puffer, NaCl, KCl, Detergenz, Konservierungsmittel:
Methylisothiazolon und Oxypyrion
45 ml
Chromogenes Substrat Tetramethylbenzidin (TMB, gebrauchsfertig)
5g
Magermilchpulver
1
Gebrauchsinformation
1
Auswertebogen
-4-
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
5.1
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität]
Jeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten:
1 Stück
Röhrchen mit 25 durchnummerierten Teststreifen, beschichtet mit
rekombinant hergestellten Parvovirus B19 Antigenen
6 ml
Anti-human IgG Konjugat (zehnfach konzentriert)
Aus Kaninchen, enthält NaN3
Aviditätsbestimmung
Für die Bestimmung der Avidität von Parvovirus B19 IgG-Antikörpern ist als Zusatz auf Wunsch das
Aviditätsreagenz mit entsprechender Gebrauchsinformation lieferbar.
1
Aviditätsreagenz (Feststoff) für 60 ml gebrauchsfertige Lösung
Art. Nr. 11010
5.2
recomLine Parvovirus B19 IgM
Jeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten:
1 Stück
Röhrchen mit 25 durchnummerierten Teststreifen, beschichtet mit
rekombinant hergestellten Parvovirus B19 Antigenen
6 ml
Anti-human IgM Konjugat (zehnfach konzentriert)
Aus Kaninchen, enthält NaN3
6. Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör
Deionisiertes Wasser, Absaugsystem mit Desinfektionsfalle, Mikropipetten, Plastikpinzette, Schüttler,
Messzylinder, Laborwaage.
Inkubationsschalen (sind bei Bedarf von der MIKROGEN GmbH zu beziehen),
7. Hinweise zum Test und den Reagenzien
7.1
Vorsichtsmaßregeln
* Während des gesamten Testablaufs müssen geeignete Einmalhandschuhe getragen werden.
* Die Konjugate enthalten Natriumazid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu
vermeiden.
* Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen,
müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 1 Stunde bei 121°C
autoklaviert werden.
* Inkubationsschalen nur einmal verwenden.
* Streifen vorsichtig mit einer Plastikpinzette handhaben.
7.2
Hinweise zur Handhabung
Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2°C - 8°C lagern, nicht einfrieren. Vor Testbeginn sind alle
Bestandteile für mindestens 30 Minuten auf 18°C - 25°C (Raumtemperatur) zu temperieren. Die
Testdurchführung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur. Die Inkubationstemperatur soll zwischen 18°C
und 25°C liegen.
Vor Gebrauch die konzentrierten Konjugate gut durchmischen. Die Patientenseren ebenfalls gut
mischen.
Das Röhrchen mit den Teststreifen ist erst unmittelbar vor Gebrauch zu öffnen, um eine
Kondenswasserbildung zu vermeiden. Die nicht benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werden
weiterhin bei 2°C - 8°C gelagert (Röhrchen wieder gut verschließen, Teststreifen dürfen vor
Versuchsbeginn nicht feucht werden!).
Die Packungen tragen ein Verfallsdatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie mehr
übernommen werden kann.
-5-
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
Es dürfen nur Einzelreagenzien verwendet werden, deren Chargennummer mit der entsprechenden
Chargennummer auf dem Etikett der Kitverpackung übereinstimmt.
Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzuführen.
Bei substantiellen Änderungen am Produkt, bzw. der Anwendungsvorschrift kann die Anwendung
außerhalb der von MIKROGEN vorgegebenen Zweckbestimmung liegen.
Automatisierung ist möglich, nähere Informationen erhalten Sie von MIKROGEN.
7.3
Herstellung der Lösungen
7.3.1
Herstellung des gebrauchsfertigen Waschpuffers
Dieser Puffer wird für die Serum- und Konjugatverdünnung sowie die Waschschritte benötigt.
Vor dem Verdünnen ist das Volumen des Waschpuffers für die entsprechende Anzahl der
durchzuführenden Tests zu bestimmen.
Das Magermilchpulver wird zuerst in Waschpuffer-Konzentrat vorgelöst und diese Mischung dann mit
deionisiertem Wasser auf das Endvolumen aufgefüllt (Verdünnung: 1 + 9). Die benötigten Mengen sind
der Tabelle 2 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführte Streifen-Anzahlen sind
rechnerisch zu ermitteln.
Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann bei 2°C - 8°C vier Wochen gelagert werden.
Tabelle 2: Waschpuffer pro eingesetzte Teststreifen
eingesetzte
Teststreifen
7.3.2
Magermilchpulver
WaschpufferKonzentrat
Deionisiertes
Wasser
gebrauchsfertiger
Waschpuffer
1
0,1 g
2 ml
18 ml
20 ml
2
0,2 g
4 ml
36 ml
40 ml
3
0,3 g
6 ml
54 ml
60 ml
5
0,5 g
10 ml
90 ml
100 ml
10
1g
20 ml
180 ml
200 ml
20
2g
40 ml
360 ml
400 ml
25
2,5 g
50 ml
450 ml
500 ml
Herstellung der Konjugatlösungen
Die Konjugatlösung für die IgG- bzw. IgM-Bestimmung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen, eine
Lagerung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung ist nicht möglich.
Ein Teil des IgG- bzw. IgM-Konjugat-Konzentrats wird mit 9 Teilen gebrauchsfertigem Waschpuffer
verdünnt (1 + 9).
Die benötigten Mengen sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführte
Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln.
-6-
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Tabelle 3: Volumina der Anti-human-IgG / IgM-Konjugat-Verdünnung
eingesetzte
Konjugat-Konzentrat
(wahlweise IgG, IgM)
gebrauchsfertiger
Waschpuffer
Gebrauchsfertige
Konjugatlösung
1
0,2
1,8 ml
2 ml
2
0,4 ml
3,6 ml
4 ml
3
0,6 ml
5,4 ml
6 ml
5
1 ml
9 ml
10 ml
10
2 ml
18 ml
20 ml
20
4 ml
36 ml
40 ml
25
5 ml
45 ml
50 ml
Teststreifen *
* Die Mengen sind ohne Totvolumen berechnet. Je nach Abarbeitung (manuell bzw. an einem Gerät) bitte zusätzliche
Konjugatlösung für 1 bis 3 Streifen ansetzen.
7.3.3
Substratlösung
Das Substrat ist gebrauchsfertig. Vor Beginn der Färbung auf Raumtemperatur (18°C - 25°C) bringen.
Eine Kontamination der nicht verwendeten Substratlösung durch unsterile Pipettenspitzen etc. muss
unbedingt vermieden werden, da dadurch die Sensitivität des Testes beeinträchtigt werden kann.
7.4
Lagerung und Haltbarkeit
Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2°C - 8°C lagern.
Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann bei 2°C - 8°C vier Wochen gelagert werden.
Die Konjugatlösung muss immer frisch zubereitet werden.
8. Probenmaterial
Das Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, das nach Entnahme möglichst rasch vom
Blutkuchen getrennt wurde, um eine Hämolyse zu vermeiden. Hitzeinaktivierte Proben können zu
erhöhten Hintergrundreaktionen führen. Eine mikrobielle Kontamination der Probe ist unbedingt zu
vermeiden. Unlösliche Stoffe sind vor der Inkubation aus der Probe zu entfernen.
Die Verwendung von lipämischen, hämolysierten oder trüben Proben kann einen dunklen Hintergrund
auf den Streifen recomLine Parvovirus B19 IgG/IgM ergeben.
Achtung!
Sollen die Bestimmungen nicht sofort erfolgen, kann das Probenmaterial bis zu 2 Wochen bei
2 °C - 8 °C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist durch Aufbewahrung bei 20 °C oder tiefer möglich. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben wird wegen der
Gefahr fehlerhafter Resultate nicht empfohlen.
9. Testdurchführung
9.1
Allgemeines
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen der
Streifen ab. Die unter 9.3 und 9.5 beschriebenen Waschfrequenzen sollten deshalb immer eingehalten
werden.
9.2
1.
Inkubation der Proben
Für jeden Testansatz wird eine Vertiefung einer Inkubationsschale benötigt (siehe 6). In die
Vertiefungen werden je 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers pipettiert. In die mit
gebrauchsfertigem Waschpuffer gefüllten Vertiefungen wird anschließend je ein Teststreifen
vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette eingetaucht. Die Streifennummerierung zeigt nach oben.
-7-
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Achtung!
Die Streifen müssen
untergetaucht sein.
vollständig
Gebrauchsinformation
mit
gebrauchsfertigem
MIKROGEN
Waschpuffer
benetzt
und
Verwendete Röhrchennummer und Streifennummer im Auswertebogen notieren.
2. Probenzugabe
IgG/IgM-Testdurchführung: 20 µl einer unverdünnten Probe (Humanserum oder Plasma) werden
je Inkubationsansatz zum Teststreifen pipettiert. (Verdünnung 1 + 100)
Bitte achten Sie darauf, die Probe an einem Ende des untergetauchten Streifens in den
Waschpuffer einzupipettieren und schnellstmöglich durch vorsichtiges Schütteln der
Inkubationswanne einzumischen.
Probennummern und zu detektierende Immunglobulinklasse (IgG, IgM) im Auswertebogen notieren.
Die Inkubationsschale wird mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt und unter leichtem Schütteln
1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Achtung!
Es ist darauf zu achten, dass die Inkubationslösungen nicht in andere Vertiefungen
verschleppt werden; insbesondere beim Öffnen und Schließen des Deckels sind Spritzer zu
vermeiden.
9.3
Waschen
1.
Nach der Inkubation werden die Kunststoffdeckel vorsichtig von den Inkubationsschalen
abgenommen.
2.
Die Serumverdünnung wird vorsichtig aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt.
Achtung!
Nach dem Absaugen der Lösungen aus einer Vertiefung sind die Pipettenspitzen zu
wechseln oder nach jedem Absaugvorgang gut mit deionisiertem Wasser zu spülen, da die
Gefahr einer Kreuzkontamination besteht.
Bei maschineller Abarbeitung sind diesbezüglich die Hinweise des Geräteherstellers zu
beachten.
3.
In jede Vertiefung werden anschließend 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers gegeben und für
5 Minuten unter leichtem Schütteln auf dem Schüttler gewaschen. Nach dem Waschvorgang wird
der Waschpuffer abgesaugt.
4.
Der Waschschritt unter Punkt 3 wird insgesamt dreimal durchgeführt.
9.4
Inkubation mit Peroxidase-Konjugat
Nach dem Waschen der Streifen werden in jede Vertiefung 2 ml der entsprechend vorbereiteten
Konjugatlösung (siehe Tabelle 3) gegeben und 45 Minuten unter leichtem Schütteln bei
Raumtemperatur inkubiert. Dabei wird die Inkubationsschale mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt.
9.5
Waschen
Die Konjugatlösungen werden aus den Inkubationswannen abgesaugt und die Streifen erneut
gewaschen (vergleiche 9.3).
9.6
Substratreaktion
1.
In jede Vertiefung werden 1,5 ml Substratlösung gegeben und 5 - 10 Minuten unter leichtem
Schütteln und unter Beobachtung bei Raumtemperatur inkubiert.
2.
Sobald die Cutoff-Kontrollbande zu sehen ist, wird der Färbeprozess beendet.
-8-
MIKROGEN
Gebrauchsinformation
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Abstoppen der Reaktion
9.7
1.
Nach Absaugen der Substratlösung werden die Streifen dreimal kurz mit deionisiertem Wasser
gewaschen.
2.
Die Streifen werden vorsichtig mit einer Plastikpinzette aus dem Wasser entnommen und zum
Trocknen für ca. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers gelegt. Anschließend können
die Streifen auf dem beigelegten Auswertebogen aufgeklebt und die Ergebnisse protokolliert
werden.
3.
Die Streifen sollten vor Licht geschützt aufbewahrt werden.
9.8
Durchführung der Aviditätsbestimmung
Die Durchführung der Aviditätsbestimmung mit dem recomLine Parvovirus B19 IgG wird in der
Gebrauchsinformation zu dem Aviditätsreagenz (Artikel-Nr. 11010) beschrieben.
10. Zusammenfassung der Testdurchführung
1.
alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen.
2.
in 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer Streifen einlegen, die Streifen müssen komplett
untergetaucht sein.
3.
jeweils 20 µl von der Probe einpipettieren
4.
1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren
5.
dreimal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen
6.
2 ml gebrauchsfertige Konjugatlösung zugeben
7.
45 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren
8.
dreimal je 5 Minuten, mit je 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen
9.
1,5 ml der Substratlösung zugeben; 5 - 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln
inkubieren.
10. mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser waschen
11. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers trocknen und das Ergebnis ablesen
11. Auswertung
11.1
Bewertung der Bandenintensität
1. Notieren Sie im beigefügten Auswertebogen Datum und Chargen-Nummer, sowie die detektierte
Antikörperklasse.
2. Tragen Sie die Proben-Identifizierungs-Nummern in das Protokollblatt ein.
3. Kleben Sie nun mit einem Klebestift die dazugehörigen Teststreifen in die entsprechenden Felder
des Auswertebogens. Richten Sie dazu die Teststreifen mit der Reaktionskontroll-Bande an der
eingezeichneten Markierungslinie aus. Kleben Sie dann mit einem durchsichtigen Klebeband die
Teststreifen links von der Markierungslinie an. Flächiges Ankleben der ganzen Teststreifen mit
Klebestift oder Klebeband kann zu Veränderungen der Färbung führen.
4. Identifizieren Sie nun die Banden der entwickelten Teststreifen anhand des aufgedruckten
Kontrollstreifens des Auswertebogens und tragen diese in das Protokollblatt ein. Nehmen Sie dazu
anhand der
5. Tabelle 4 die Bewertung der Intensität der auftretenden Banden gesondert für die entsprechenden
Immunglobulin-Klassen vor.
-9-
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
11.2
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
Kontrollergebnisse
Eine Auswertung des Tests kann erfolgen, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind:
•
Reaktionskontroll-Bande (oberste Linie) deutlich gefärbt, dunkle Bande
•
Antikörperklasse (zweite und dritte Bande): die entsprechende Konjugatkontrollbande muss eine
deutliche Färbung zeigen. Die andere Konjugatkontrollbande kann eine schwache, unspezifische
Färbung entwickeln.
•
Cutoff-Kontrolle (vierte Bande): schwache, aber sichtbare Färbung
Tabelle 4: Bewertung der Bandenintensität im Bezug zur Cutoff-Bande
Banden
Intensität
keine Reaktion
-
sehr schwache Intensität (geringer als Cutoff-Bande)
+/-
schwache Intensität (entspricht Cutoff-Bande)
+
starke Intensität (stärker als Cutoff-Bande)
++
sehr starke Intensität
+++
Achtung !
Die Bandenmuster beim recomLine Parvovirus B19 IgG- und IgM-Nachweis können unterschiedliche
Intensitäten aufweisen. Es ist möglich, dass der IgG recomLine kräftigere und dunklere Banden als der
IgM recomLine zeigt. Die Intensität der Proteinbanden ist abhängig von der Konzentration der Parvovirus
B19-spezifischen Antikörper.
Bewertung der Avidität: siehe Kapitel 11.5.
11.3
Testergebnisse und Testinterpretation
Tabelle 5: Auswertung der Banden beim IgG- Nachweis (ohne Beurteilung der NS-1-Reaktivität)
keine Reaktion oder andere Konstellationen wie unten
IgG negativ
VP-N oder VP-2r oder VP-C
mindestens mit +
IgG fraglich
VP-2p oder zwei Antigene (VP-N, VP-1S, VP-2r, VP-C)
mindestens mit +
IgG positiv
Tabelle 6: Auswertung der Banden beim IgM-Nachweis (ohne Beurteilung der NS-1-Reaktivität)
keine Reaktion oder andere Konstellationen wie unten
IgM negativ
VP-N oder VP-1S oder VP-2r oder VP-C
mindestens mit +
IgM fraglich
zwei Antigene (VP-2p, VP-N, VP-1S; VP-2r, VP-C)
mindestens mit +
IgM positiv
Interpretation der NS-1-Reaktivität (IgG)
Die NS-1-Reaktion sollte nur im IgG betrachtet werden. Für die Beurteilung Anti-Parvovirus B19
positiv/negativ sollte die NS-1-Reaktion im Normalfall nicht mit einbezogen werden.
Bei der Beurteilung des möglichen Zeitpunktes der Infektion kann bei vorhandener NS-1-Reaktivität im
IgG in der Regel davon ausgegangen werde, dass dieser mindestens sechs Wochen zurückliegt. Zu
beachten ist allerdings, dass NS-1-Antikörper in nur etwa 20% der Fälle überhaupt gebildet werden.
Im Zusammenhang mit entsprechender Symptomatik und klinischen Vorbefunden kann ein NS-1-Titer
einen Hinweis auf eine mögliche Persistenz dieses Virus geben.
Allerdings darf die Diagnose „persistierende Parvovirus B19-Infektion“ nie allein aufgrund des
serologischen Befunds gestellt werden. Hauptkriterium bleibt der Nachweis von Parvovirus B19-Antigen
oder Parvovirus B19-DNA. Weiterhin ist zu beachten, dass sich NS-1 IgG-Antikörper erst nach gewisser
- 10 -
MIKROGEN
Gebrauchsinformation
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Zeit entwickeln, auch eine DNA-Bestimmung mittels PCR muss nicht zu jedem Zeitpunkt der Persistenz
positiv sein. Deshalb sind in solchen Fällen immer mehrere Bestimmungen im zeitlichen Verlauf zu
fordern.
11.4
Hinweise zur Interpretation
Bei der Beurteilung des Testergebnisses sollten stets IgG- und IgM-Befunde gemeinsam betrachtet
werden.
Für alle Testinterpretationen, insbesondere aber bei schwachpositiven bzw. fraglichen Resultaten, ist die
Einbeziehung eventuell vorhandener klinischer Informationen unerlässlich. Es empfiehlt sich auch hier
eine enge Kooperation von Labor und behandelndem Arzt. Proben mit unklaren oder fraglichen
Ergebnissen sollten in Abhängigkeit von der klinischen Situation nach 2 - 3 Wochen kontrolliert werden.
Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer Parvovirus B19-Infektion nicht grundsätzlich aus.
Falsch negative Ergebnisse können auftreten, wenn die Probenabnahme vor der initialen Reaktion des
Immunsystems erfolgte.
Isoliert positive IgM-Nachweise ohne positiven IgG-Befund bedürfen sorgfältiger Interpretation. Hier kann
es sich um eine akute Infektion handeln.
Auch bei einem eindeutigen IgG-Befund einer länger zurückliegenden Parvovirus B19 Infektion kann
eine schwache IgM-Reaktivität durch persistierende IgM-Antikörper verursacht werden.
Durch eine polyklonale Stimulierung von B-Lymphozyten bei einer akuten Epstein-Barr Virus Infektion
kann die Parvovirus B19 IgM-Antikörperbildung reaktiviert werden, und somit zu einem positiven
Parvovirus B19 IgM-Ergebnis führen.
Die Verwendung von ikterischen Seren kann zu einer erhöhten Anzahl von positiven Ergebnissen
führen.
Typische Parvovirus B19 Reaktionsprofile:
Aufgrund bisher durchgeführter Evaluierungen können die folgenden IgG- und IgM-Reaktionsmuster
einen Hinweis auf einen bestimmtem Parvovirus B19-Status geben. Es muss aber darauf hingewiesen
werden, dass es sich hierbei um typische Reaktionsmuster handelt, von denen es durchaus
Abweichungen geben kann.
Bei lang zurückliegenden Infektionen wird meist eine IgG-Reaktivität gegen VP-2p und/oder VP-N
(meist mit VP-1S) beobachtet.
Bei einer frischen Infektion ist zusätzlich zu VP-2p, VP-N und VP-1S eine starke IgG-Reaktivität gegen
VP-C und VP-2r zu beobachten. Diese starke Reaktivität gegen das VP-C ist meist bei einer
beginnenden oder kurz zurückliegenden Infektion (Dauer meist nicht länger als 6 Monate) zu finden.
Falls keine IgG-Reaktivität gegen VP-C auftritt, kann eine akute Infektion mit hoher Wahrscheinlichkeit
ausgeschlossen, bei weiteren Verdacht wird eine Verlaufskontrolle empfohlen.
- 11 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
Tabelle 7: Parvovirus B19 Status und typische IgG- und IgM-Antikörperreaktionsmuster
IgG
IgM
möglicher
Parvovirus B19 Status
akute Infektion,
IgG-Titer noch schwach oder
nicht vorhanden
VP-2p, VP-N, VP-2r, VP-C
(Reaktivitäten meistens ≤ +)
VP-2p, VP-N
(Reaktivitäten meistens ≥ ++)
VP-2r, VP-C
(Reaktivitäten meistens + bis ++)
VP-2p, VP-N, VP-1S, VP-2r,
VP-C
(Reaktivitäten meistens ≥ ++)
VP-2p, VP-N, VP-2r und VP-C,
meist mit VP-1S
(Reaktivitäten meistens ≥ ++)
VP-2p, VP-N und VP-2r
(Reaktivitäten meistens ≥ +)
Status nach Infektion
(Wochen bis Monate)
mit IgM- und IgG-Antwort
negativ oder fraglich (isolierte
Antigen-Reaktivitäten mit ≤ +)
Status nach Infektion (Monate)
VP-2p und/oder VP-N mit VP-1S
(Reaktivitäten meistens ≥ ++)
negativ: VP-2r und VP-C
negativ
lang zurückliegende Infektion
(Jahre)
VP-2p, VP-N und VP-2r,
(Reaktivitäten meistens nur +)
VP-2p, VP-N und/oder VP-2r
(evtl. VP-1S),
(Reaktivitäten meistens nur +)
VP-2p, VP-N, VP-1S
(Reaktivitäten meistens ≥ +)
negativ: VP-2r und VP-C
VP-N, VP-1S
(Reaktivitäten meistens nur +)
unklarer Status, evtl. verursacht
durch Boosterung; Test sollte im
zeitlichen Verlauf wiederholt
werden
zurückliegende Infektion durch
IgG-Befund mit untypischer IgMReaktivität, Konstellation wurde
bei einigen Rheumafaktor
positiven Seren beobachtet, Test
sollte im zeitlichen Verlauf
wiederholt werden
Die Bewertung von NS-1 Titern im IgG zur Abklärung persistierender Parvovirus B19-Infektionen,
reaktiven Arthropathien, chronischen Anämien oder anderer Symptomatik mit Verdacht auf Parvovirus
B19-Persistenz wurde in Tabelle 7 nicht berücksichtigt, da hier abhängig von Dauer, Klinik, und
Immunkompetenz eine Vielzahl von Kombinationen möglich sind. NS-1-Titer sollten nur bei speziellen
Fragestellungen mit in die Interpretation einbezogen werden (siehe 11.3).
Aviditätsbestimmung: In den meisten Fällen erlaubt die Bestimmung der Avidität der gegen die
jeweiligen Einzelantigene gerichteten IgG-Antikörper eine genauere Bestimmung des vorliegenden
Infektionsstatus, insbesondere die Unterscheidung einer akuten Infektion mit Parvovirus B19 von einer
subakuten Infektion mit persistierenden IgM-Antikörpern (siehe 11.5).
Dunkle Teststreifen: Manche Patientenseren können auf dem gesamten Nitrozellulose-Streifen eine
dunkle, durchgängige oder gemusterte Färbung erzeugen (z.B. bei Seren von Patienten mit MilcheiweißAllergien). Hierfür sind unterschiedliche Faktoren aus dem jeweiligen Patientenserum verantwortlich. Die
Auswertung dieser Streifen ist in der Regel nur mit Einschränkungen möglich. So sind z.B. "inverse"
Banden (weiße Banden auf dunklem Hintergrund) als negativ zu werten. Das entsprechende Serum
sollte in jedem Fall mittels anderer serologischer Methoden überprüft werden.
- 12 -
MIKROGEN
11.5
Gebrauchsinformation
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Diagnoseerweiterung durch Aviditätsbestimmung
11.5.1 Testprinzip und Testdurchführung
Die Bestimmung der Avidität von Parvovirus B19 IgG-Antikörpern ist mit dem Aviditätsreagenz, ArtikelNr. 11010 möglich. Die Testdurchführung entnehmen Sie bitte der Gebrauchsinformation zum
Aviditätsreagenz.
11.5.2 Avidität im recomLine Parvovirus B19 IgG
Die Avidität wird an IgG-Antikörpern gegen VP-N und VP-1S beurteilt. Gegen die im recomLine
Parvovirus B19 präsentierten linearen Epitope des VP-2r und VP-C werden in vielen Fällen im
Infektionsverlauf keine hoch-aviden IgG-Antikörper gebildet. Die Konformation des VP-2p-Antigens und
damit die Bindungseigenschaften werden durch das Aviditätsreagenz verändert, deshalb kann beim
VP-2p keine verlässliche Abschätzung der Avidität durchgeführt werden.
11.5.3 Auswertung und Interpretation der Avidität im recomLine Parvovirus B19 IgG
⇒ Aviditätsbestimmung nur von anti- VP-N- und anti-VP-1S-IgG-Antikörpern
⇒ Banden auf dem IgG-Streifen die in ihrer Reaktivität geringer als der Cutoff sind, werden bei der
Aviditätsbestimmung nicht berücksichtigt.
⇒ Vergleichen Sie die Intensitäten der entsprechenden Banden auf den beiden Teststreifen (IgGStreifen und Aviditätsstreifen), die mit der gleichen Patientenprobe inkubiert wurden. Achten Sie
darauf, ob sich die Intensitäten verändert haben.
⇒ Eine Abnahme der Intensität der VP-N und VP-1S-Bande um wesentlich mehr als 50% kann als
geringe Avidität betrachtet werden, eine Abnahme um ca. 50% als intermediäre Avidität.
⇒
Bei hoher Avidität nimmt die Bandenintensität des Aviditätsstreifens nicht bis kaum ab, die IgGAntikörper werden als hoch avide betrachtet.
⇒ Die gegen VP-N und VP-1S gerichteten IgG-Antikörper erreichen frühestens im Verlauf von ca.
4 Wochen, spätestens 6 bis 8 Wochen nach Infektion hohe Avidität. Eine niedrige bzw. intermediäre
Avidität der VP-N- und VP-1S-Bande ist daher als ein deutlicher Hinweis auf eine akute Infektion zu
sehen. Im Falle von hoch aviden IgG-Antikörpern gegen VP-N und VP-1S kann eine Infektion
innerhalb der letzten 4 Wochen in aller Regel ausgeschlossen werden. Weichen die Aviditäten von
VP-N und VP-1S voneinander ab, so ist diejenige des VP-N maßgeblich.
⇒ Generell gilt, dass für die Aviditätsbeurteilung keine absoluten Regeln aufgestellt werden können. In
einzelnen Fällen ist zu beachten, dass niedrige Aviditäten auch bei zurückliegenden Infektionen nicht
auszuschließen sind, da eine Reifeverzögerung der Avidität möglich ist. Die Interpretation der
Avidität muss immer im Zusammenhang mit den gesamten Untersuchungsergebnissen erfolgen.
12. Klinische Ergebnisse
Zur Leistungsbewertung des recomLine Parvovirus B19 IgG, IgM wurden Patientenproben
unterschiedlicher Herkunft getestet. Insgesamt wurde bei 298 Patientenproben ein IgGAntikörpernachweis und bei 287 Proben ein IgM-Antikörpernachweis durchgeführt. Zusätzlich wurden 70
mögliche Störseren und 10 Serum/Plasma-Paare getestet. Bei 67 Patientenproben wurde die Avidität
der IgG-Antikörper bestimmt.
12.1
Proben von Patienten mit akuter Parvovirus B19-Infektion
Es wurden insgesamt 52 Serumproben von Patienten mit einer akuten Parvovirus B19-Infektion getestet.
Darunter waren 12 Infektionsverläufe, bestehend aus jeweils 2-5 Abnahmen.
In allen 12 Verläufen konnten spezifische Parvovirus B19 Antikörper nachgewiesen werden. In einigen
Fällen war bereits die erste Patientenprobe des Infektionsverlauf positiv, bei den erst negativen Proben
konnte bei den folgenden Abnahmen eine Serokonversion beobachtet werden. IgM-Antikörper konnten
bei elf von diesen zwölf Infektionsverläufen mindestens bis zum 42. Tag nach dem ersten Auftreten von
Symptomen nachgewiesen werden.
- 13 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
12.2
Gebrauchsinformation
MIKROGEN
Blutspender
Weiterhin wurden 187 (im IgG-Ansatz) und 176 (im IgM-Ansatz) nicht selektierte Blutspenderplasmen im
recomLine Parvovirus B19 untersucht. Diese Proben wurden auch parallel mit einem Parvovirus B19
Vergleichs-ELISA getestet (siehe unter 12.3.2).
IgG-Ergebnis: Im recomLine Parvovirus B19 IgG waren 66% der Proben positiv. Viele dieser Proben
zeigten typische Reaktionsmuster für länger zurückliegende Infektionen (siehe Tabelle 7).
IgM-Ergebnis: Im recomLine Parvovirus B19 IgM waren 3% der Proben positiv.
12.3
Vergleichstestung des recomLine Parvovirus B19 mit einem Parvovirus B19 ELISA
Die Übereinstimmung der beiden Parvovirus B19 Testsysteme war gut, beim Nachweis von IgGAntikörpern stimmten die Ergebnisse zu ca. 98% überein, beim Nachweis von IgM-Antikörpern wurde
eine Übereinstimmung der Ergebnisse, je nach Patientenkollektiv, von 93,1% bis 95,5% festgestellt. Bei
der Berechnung der „Übereinstimmung beider Testsysteme“ wurden die grenzwertigen bzw. fraglichen
Ergebnisse zu den positiven Ergebnissen gezählt.
12.3.1 Austestung von 101 Serumproben von Patienten mit einer akuten oder kürzlich zurückliegenden
Parvovirus B19-Infektionen.
akute oder kürzlich
zurückliegende Infektionen
recomLine
Parvovirus B19
IgG
recomLine
Parvovirus B19
IgM
Vergleichs-ELISA Parvovirus B19 IgG/IgM
positiv
grenzwertig
negativ
positiv
99
0
0
fraglich
0
0
1
negativ
1
0
0
positiv
40
0
1
fraglich
2
1
4
negativ
1
1
51
Summe IgG bzw. IgM 101
Überstimmung beider IgG-Testsysteme 98,0%
Überstimmung beider IgM-Testsysteme 93,1%
12.3.2 Austestung der Blutspenderproben
Vergleichs-ELISA Parvovirus B19 IgG/IgM
Blutspenderproben
recomLine
Parvovirus B19
IgG
recomLine
Parvovirus B19
IgM
positiv
grenzwertig
negativ
positiv
123
0
1
fraglich
0
0
0
negativ
2
1
60
positiv
2
2
2
fraglich
0
0
3
negativ
3
0
164
Summe IgG 187
Summe IgM 176
Überstimmung beider IgG-Testsysteme 97,8%
Überstimmung beider IgM-Testsysteme 95,5%
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MIKROGEN
12.4
Gebrauchsinformation
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Bestimmung der Sensitivität mittels des WHO-Standards IgG
Der WHO-Standard IgG (100 IU/ml) wurde in davon ausgehenden Verdünnungen im recomLine
Parvovirus B19 IgG und in einem Vergleichs-ELISA IgG untersucht. Der WHO-Standard IgG zeigte bei
einer Verdünnung noch bei von 1,5 IU/ml im recomLine Parvovirus B19 ein fragliches Ergebnis (isoliert
positive VP-N-Reaktivität). Der Vergleichs-ELISA IgG zeigte hier ebenfalls ein grenzwertiges Ergebnis.
12.5
Mögliche Störseren
Bei der Untersuchung potentiell interferierender Faktoren wurden im Falle von lipämischen, CRP- und
ANA-positiven Seren keine Hinweise auf eine Beeinträchtigung des Testergebnisses gefunden. Bei
ikterischen, hämolytischen und Rheumafaktor-positiven Seren ergab sich eine leicht erhöhte Zahl an
positiven IgM-Befunden (s. Tabelle 7).
Bei Vorliegen einer infektiösen Mononukleose (Pfeiffer’sches Drüsenfieber, EBV-Infektion) kann es zu
einer polyklonalen Stimulierung von B-Lymphozyten kommen. Dies kann zu positiven Reaktionen beim
Nachweis von Antikörpern der IgM-Klasse führen.
12.6
Vergleich Serum und Plasma
Bei der Untersuchung der Proben von 10 Patienten wurden keine Unterschiede bei der Verwendung von
Serum oder Plasma (EDTA-Plasma) festgestellt.
12.7
Bestimmung der Avidität der IgG-Antikörper
Es wurden 67 Serumproben von akuten, kürzlich zurückliegenden bzw. länger zurückliegenden
Parvovirus B19-Infektionen im recomLine Parvovirus B19 IgG auf Avidität der gegen VP-N und VP-1S
gerichteten IgG-Antikörper untersucht.
Die Ergebnisse der Aviditätsuntersuchung korrelierten verlässlich mit den klinischen Daten und der
Interpretation aus den Reaktivitäten der einzelnen Antigene mit IgG- und IgM-Antikörpern. Die Daten
zeigten, dass die gegen VP-N und VP-1S gerichteten IgG-Antikörper frühestens nach 4 Wochen, in der
Regel nach 6 bis 8 Wochen nach der Infektion zu hoher Avidität gereift waren. Nachfolgend wurden
ausschließlich hoch avide IgG-Antikörper gefunden.
13. Literatur
Die ausführliche Literaturliste finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation ab Seite 30.
Auf Anforderung übersenden wir Ihnen gerne weiterführende Literatur zur Parvovirus B19 Diagnostik zu.
14. Erklärung der Symbole
Die Tabelle mit der Erklärung der Symbole finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation auf
Seite 31.
- 15 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Instructions for use
MIKROGEN
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidity]
recomLine Parvovirus B19 IgM
Line immunoassay based on recombinant antigens for the determination of IgG and IgM antibodies and
avidity of IgG antibodies against Parvovirus B19 in human serum and plasma.
1. General aspects, intended use
recomLine Testkit Parvovirus B19 is a qualitative in-vitro-Test for the detection of IgG- and IgMantibodies against proteins of Parvovirus B19 in human sera and plasma. recomLine Parvovirus B19
IgG, IgM provides for identification of specific Parvovirus B19 antibodies by means of separate line-ups
of different antigens, produced by recombinant engineering. In contrast to ELISA testing systems the
recomLine Parvovirus B19 gives additional information about the state of infection by different reactivity
patterns and the determination of avidity.
2. Parvovirus B19
Parvovirus B19 is a single-stranded DNA virus with a linear genome, ca. 5.1 Kb in length. Its surface is
formed by a protein envelope which consists of two polypeptides VP-1 (approx. 84 kDa) and VP-2
(approx. 58 kDa). The two capsid protein VP1 and VP2 are coded from one reading frame on the viral
genome; this means that both proteins are identical with the exception of a ca. 26 KDa N-terminal
segment of VP 1. Also coded is a major non-structural protein (NS-1), which is required for virus
replication and propagation.
Parvovirus B19 replicates primarily in erythropoietic precursor cells, causing cell lysis. Therefore,
depending on the immunological competence, more or less pronounced anaemias can occur. This virus
is usually transmitted by droplet infection. As a result of the relative high stability of the virus protein
envelope, infection via blood and blood products is also possible. Parvovirus B19 is found world-wide,
about 60 - 70 % of the population in most countries are infected.
Clinical Pictures:
The most frequent clinical manifestation produced is erythema infectiosum, also known as fifth
disease, a typical childhood disease. Following relatively mild prodromal symptoms, a typical exanthem
appears after one to two weeks, which is usually accompanied by symptoms similar to those of flu. The
exanthem generally begins on the cheeks and spreads over the entire body within a few days.
In the case of ca. 50 % of normal adults, a Parvovirus B19 infection progresses largely
asymptomatically. In some cases, symptoms similar to those of flu are observed.
However, complications such as arthralgia and arthritis occur frequently (ca. 60 %). Women are
affected by these complications twice as often as men. In most cases, these arthropathies disappear
within two to four weeks. But in a few cases, the symptoms can continue intermittently for many years.
Consequently, in the clarification of chronic arthropathies, a persistent Parvovirus B19 infection must
also be considered.
The duration of virus multiplication is limited because of the formation of specific antibodies. Therefore,
the infection and loss of erythropoietic precursor cells cause no serious effects. However, this can result
in a life threatening aplastic crisis in patients suffering from haemolytic anaemias.
If infection occurs during pregnancy, Parvovirus B19 can be transplacentally transmitted to the fetus (in
approx. 20%). Since the survival time of erythrocytes is short up to the twentieth week of pregnancy and
an efficient immune response is lacking, infection can cause severe acute or chronic anaemia and lead
to a spontaneous abortion. Another complication after infection during the second trimester is the
formation of hydrops fetalis, which untreated usually results in the death of the embryo. In contrast to
the rubella virus, the pathogen responsible for infectious erythema causes no embryopathy and an
abortion of a pregnancy is therefore not indicated.
In immunodeficient persons, a Parvovirus B19 infection can result in chronic anaemia because the virus
cannot be completely eliminated. However, this type of anaemia has a much milder course when
compared to the aplastic crisis of anaemic patients.
Additional organ manifestations such as hepatic dysfunction, respiratory diseases, Parvovirus B19
associated myocarditis etc have been described recently.
- 16 -
Instructions for use
MIKROGEN
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
In individual cases, chronic anaemias and arthropathies are also caused by persistent Parvovirus B19
infections in patients without a known immune defect.
3. Diagnosis
A primary infection with Parvovirus B19 is documented by the presence of specific IgM antibodies. IgM
titers are generally found about 10 days after infection, at the same time as the appearance of
symptoms. IgG titers are found a few days later and, as a rule, persist lifelong. The structural proteins of
the virus can be used for antibody detection.
Recently, the non-structural protein NS-1 has also been described as a serological marker in chronic
courses of the disease. However, it should be taken into account that in about 10 - 20 % of all sera,
antibodies against this protein are found after infection. In patients suspected of having a persistent
infection (chronic anaemia, chronic arthropathies, immunodeficiency, diagnosis of exclusion), virus
detection by means of PCR should always be carried out as well.
recomLine Parvovirus B19 IgG [avidity], IgM
This line immunoassay uses Parvovirus B19 antigens made with the help of genetic engineering. They
are produced as nonfusion proteins in E.coli alternatively in eukaryotic cell cultures.
Serological interpretation based on division of the structural protein VP1 into two segments, and
separate presentation of linear and conformational epitopes, reveals the possible time of infection.
Generally speaking, IgG antibodies to linear epitopes on the entire structural protein are produced at the
onset of the immune response subsequent to primary infection; that is to say a patient sample with this
immune status recognises both the N-and C-terminal regions (VP-N and VP-C, as well as VP-2r and VP1S). In the course of a period of approx. 6-9 months, the VP-C-specific antibodies directed against linear
epitopes are replaced by antibodies that show a preference for recognition of conformational epitopes.
These epitopes are presented by the protein VP-2p. The corresponding IgG antibodies normally show
lifelong persistence. With increasing duration of the primary infection, the disappearance of the reaction
to VP-C (usually after 6 months) and VP-2r (usually after a few years), becomes visible on the strips,
whereas the IgG antibodies to VP-N (and partly antibodies to VP-1S as well) remain detectable for many
years; antibodies to VP-2p show lifelong persistence in most cases.
In addition, the non-structural protein NS-1 of Parvovirus B19 is also present on the test strip. According
to the literature and our own evaluations, IgG antibodies against NS-1 are to be found in patients with
Parvovirus B19 induced arthritis and other chronic forms of the disease, but not in patients suffering from
acute infections. As a result of the infection titer in the population, a diagnosis can never be made solely
on the basis of anti-NS-1, but must always be supported by a positive PCR result. If a persistent
Parvovirus B19 infection is suspected, the presence of a NS-1 titer can only be regarded as an
indication.
Figure 1: Parvovirus B19 genes; usage of recombinant antigens in recomLine Parvovirus B19 IgG, IgM
Localisation and arrangement of Parvovirus B19 proteins
5’
3´
NS-1
VP1
VP2
recombinant antigens use in recomLine Parvovirus B19
NS-1
VP-N
VP-1S
VP-C
VP-2p; VP-2r
- 17 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Instructions for use
MIKROGEN
Table 1: Description and diagnostic significance of used recombinant antigens
rec. antigen
Description and diagnostic significance
VP2
main capsid antigen; IgG antibodies to the conformation epitopes (VP-2p)
normally show lifelong detectability, those to the linear epitopes (VP-2r)
are detectable for months to a few years. Both antigens show good
reactivity in the early phase of the infection.
(VP-2p, VP-2r)
VP-N
N-terminal fragment of the capsid antigen VP1; IgG antibodies often
detectable for years. Taken into account in avidity testing.
VP-C
C-terminal fragment of capsid antigens VP1 resp. VP2; the reactivity (IgG
and IgM) of the linear epitopes appears early in the course of a Parvovirus
B19 infection, then disappears soon after (IgG: usually after about 6
months, IgM: usually after about 12 weeks at the latest).
VP-1S
N-terminal, specific fragment of the capsid antigen VP1 (the fragment in
which VP-1 and VP-2 differ), IgG antibodies remain detectable long after
an infection. Taken into account in avidity testing.
NS-1
Non-structural protein 1, appears in IgG at the earliest 6-8 weeks after
infection in at least 20% of ill persons, may be indicative of virus
persistence.
The IgG reactivity pattern must always be taken into account in the interpretation of a positive or
borderline IgM result. In a fresh or recent infection, a pronounced VP-C-IgG titer should also be
detectable as a rule.
The Parvovirus B19 diagnostic process can be advanced by determining the avidity of the IgG
antibodies. The IgG antibodies undergo a maturation process whereby early-phase antibodies show a
low avidity level and post-infection antibodies show a high level of avidity. Low-avidity antibodies can be
washed off the strip binding location with an avidity reagent, whereas high-avidity antibodies are not
removed by the same reagent. Parallel processing of two IgG charges, one of which must be treated
with the avidity reagent, can determine whether the IgG antibodies are low-avidity (acute process) or
high-avidity (infection has run its course). MIKROGEN can supply the avidity reagent for the avidity test.
⇒ Immunodominant recombinant antigens from VP1 and VP2
⇒ Separate detection of IgG and IgM antibodies possible
⇒ Safe evaluation due to strip specific controls (cut off and conjugate control)
⇒ Well-defined and highly purified recombinant antigens, therefore high specificity. Easy and clear
interpretation due to easy to read bands
⇒ High sensitivity because of quantitative optimised antigens
⇒ Easy and reliable determination of avidity possible
4. Test Principle
The recombinant, highly purified proteins are applied to a nitrocellulose membrane. This matrix is then
cut into strips.
To facilitate detection of Parvovirus B19-specific antibodies, the strips are incubated with the diluted
serum or plasma sample, whereby the antibodies bind to the antigens on the strips. Unbound antibodies
are then flushed away and the strips are incubated in a second step with anti-human IgG and IgM
coupled with horse radish peroxidase. Specifically bound antibodies are detected by means of a colour
reaction catalysed by the peroxidase. If an antigen-antibody reaction has taken place, a dark band
appears at the corresponding locus on the strip.
- 18 -
Instructions for use
MIKROGEN
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Five control bands are arranged side-by-side at the upper end of the test strip:
1. The reaction control band under the strip number, which must show a reaction to every serum.
2. Tow conjugate control bands: IgG/IgM. These bands serve as controls for the antibody class
detected in each case. For instance, if the test strip is used to detect IgG antibodies, the conjugate
control band IgG shows a clearly defined band. This applies analogously to the conjugate bands IgM.
3. "Cutoff control": For control of the coloration process and evaluation of the test strip. The intensity of
this band provides a basis for evaluation of the antibody reactivity as positive, borderline or negative.
5. Package contents
The reagents in a pack are sufficient for 25 determinations.
Each reagent set contains:
100 ml
Wash buffer (ten times the concentration)
Contains phosphate buffer, NaCl, KCl, detergent, preservatives:
methylisothiazolone and oxypyrione
5.1
45 ml
Substrate Solution Tetramethylbenzidin (TMB, ready-to-use)
5g
Skim milk powder
1
Instructions for use
1
Evaluation form
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidity]
Additionally to the components listed under point 5 each reagent set contains:
1 piece
Test tubes with 25 consecutively numbered test strips, coated with
recombinant Parvovirus B19 antigens
6 ml
Anti-human IgG conjugate (ten times the concentration)
From rabbit, contains NaN3
Determination of avidity
For avidity detection of IgG antibodies against Parvovirus B19 the following additional reagent
supplementary to recomLine Parvovirus B19 is available on demand:
1
Avidity reagent (solid) for 60 ml ready-to-use solution
Art. No. 11010
5.2
recomLine Parvovirus B19 IgM
Additionally to the components listed under point 5 each reagent set contains:
1 piece
Test tubes with 25 consecutively numbered test strips, coated with
recombinant Parvovirus B19-antigens
6 ml
Anti-human IgM conjugate (ten times the concentration)
From rabbit, contains NaN3
6. Additional reagents and accessory equipment required
Deionised water, vacuum extraction system with disinfection trap, micro pipettes, plastic forceps, shaker,
metric cylinder with graduations, scales.
Incubation trays (can be obtained from MIKROGEN GmbH)
- 19 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Instructions for use
MIKROGEN
7. Information on test and reagents
7.1
Precautions
* Suitable single-use gloves must be worn during the entire test procedure.
* The conjugates contain sodium azide. Avoid contact with skin or mucosa.
* All reagents and materials contaminated with potentially infectious samples must be treated with
suitable disinfectants or autoclaved at 121°C for at least 1 hour.
* Use incubation trays only once.
* Handle strips carefully with a plastic forceps.
7.2
Handling information
Store reagents before and after use at 2°C - 8°C, do not freeze. Temper all components before starting
the test for at least 30 minutes to 18°C - 25°C (room temperature). Both the test and incubation
procedures are carried out at room temperature.
Mix the concentrated conjugates well before use. Mix the patient sera well before use as well.
Do not open the tube containing the test strips until just before use to avoid condensation of water. The
strips that are not used must be left in the tube and stored further at 2°C - 8°C (reclose tube tightly, test
strips must not become moist before testing!).
A quality guarantee can only be given up to the expiry date on the packages.
Only reagents with lot numbers corresponding to the respective lot number on the label of the kit
package may be used.
The test must be performed by well-trained and authorised qualified personnel.
In case of substantial modifications of the product or the instructions for use, the application of the test
might differ from the purpose intended by MIKROGEN.
Automation is possible, please refer to MIKROGEN for details.
7.3
Preparation of solutions
7.3.1
Preparation of ready-to-use wash buffer
This buffer is used for both serum and conjugate dilution as well as for the washing steps.
Prior to dilution, the volume of wash buffer required for the corresponding number of tests must be
determined.
The skim milk powder is first dissolved in wash buffer concentrate. This mixture is then filled up with
deionised water to the final volume (dilution: 1 + 9). See Table 2 for the amounts required. Volumes for
numbers of test strips not listed in the table have to be determined by calculation.
Ready-to-use wash buffer can be stored at 2°C - 8°C for four weeks.
Table 2: Wash buffer per test strip used
Test strips
used
Skim milk
powder
Wash buffer
concentrate
Deionised
water
Ready-to-use wash
buffer
1
0,1 g
2 ml
18 ml
20 ml
2
0,2 g
4 ml
36 ml
40 ml
3
0,3 g
6 ml
54 ml
60 ml
5
0,5 g
10 ml
90 ml
100 ml
10
1g
20 ml
180 ml
200 ml
20
2g
40 ml
360 ml
400 ml
25
2,5 g
50 ml
450 ml
500 ml
- 20 -
Instructions for use
MIKROGEN
7.3.2
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Preparation of conjugate solutions
The conjugate solution for the IgG resp. IgM test is to be prepared immediately before use. It is not
possible to store the ready-to-use conjugate solution.
One part of IgG resp. IgM conjugate concentrate is diluted with 9 parts of ready-to-use wash buffer
(1 + 9).
See Table 3 for the amounts required. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have to
be determined by calculation.
Table 3: Volumes for anti-human IgG resp. IgM conjugate dilution
Test strips
used *
IgG / IgM conjugate
concentrate
Ready-to-use wash
buffer
Ready-to-use
conjugate dilution
1
0,2 ml
1,8 ml
2 ml
2
0,4 ml
3,6 ml
4 ml
3
0,6 ml
5,4 ml
6 ml
5
1 ml
9 ml
10 ml
10
2 ml
18 ml
20 ml
20
4 ml
36 ml
40 ml
25
5 ml
45 ml
50 ml
* The volumes have been calculated without dead volume. Depending on handling (manually or by machine processing) please
prepare conjugate solution for additional 1 to 3 strips.
7.3.3
Substrate solution
The substrate is ready for use! Bring to room temperature (18°C - 25°C) before starting the colour
reaction.
Avoid contamination of the unused substrate solution by nonsterile pipette tips, etc. at all costs since this
may affect test sensitivity.
7.4
Storage and stability
Store reagents at 2°C - 8°C before and after use.
Ready-to-use wash buffer can be stored at 2°C - 8°C for four weeks.
The conjugate solution is to be prepared always freshly.
8. Sample material
The sample material can be serum or plasma that is separated from the coagulum as soon as possible
after sampling. A microbial contamination of the sample has to be avoided at all costs. Insoluble
substances are to be removed from the sample prior to incubation by means of centrifugation.
Use of lipaemic, haemolytic or turbid samples may result in a dark background in the recomLine
Parvovirus B19 IgG/IgM.
Important!
If the tests are not carried out immediately, the samples can be stored for up to 2 weeks at 2°C8°C. Longer storage of the samples is possible at -20°C or colder. Repeated freezing and thawing
of the samples is not recommended because this may affect the quality of the results.
- 21 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Instructions for use
MIKROGEN
9. Test procedure
9.1
General
The reproducibility of the results depends to a great extent on consistent washing of the strips. The
washing frequencies described under 9.3. and 9.5 should therefore always be maintained.
9.2
1.
Incubation of samples
One well in the incubation tray (see 6) is required per sample to be tested. 2 ml of ready-to-use
wash buffer is pipetted into each well. Then one test strip is carefully dipped into each of the wells
filled with ready-to-use wash buffer using a plastic forceps. The strip number must face upwards.
Important!
The strip must be completely wet and immersed in the ready-to-use wash buffer.
Record the tube and strip numbers used on the evaluation sheet.
2.
Adding the samples
IgG/IgM test procedure: 20 µl of an undiluted sample (human serum or plasma) is pipetted into the
proper wells (dilution 1 + 100).
Please be sure to add the sample at one end of the immersed strips into the wash buffer and mix as
soon as possible by shaking the tray carefully.
Record the sample numbers and the immunoglobulin class (IgG, IgM) on the evaluation sheet.
Cover the incubation tray with the plastic lid and incubate for 1 hour at room temperature while
shaking gently.
Important!
Make sure the incubation solutions are not carried over into other wells; be particularly
careful to avoid splashing when opening and closing the lid.
9.3
Washing
1.
Following incubation, the plastic lids are carefully removed from the incubation trays.
2.
The serum dilution is carefully aspirated from the individual wells.
Important!
When the solutions have been aspirated from a well, the pipette tip has to be changed or
rinsed well with deionised water after each aspiration procedure to prevent crosscontamination.
In the case of machine processing the references of the equipment manufacturer have to be
considered.
3.
Then place 2 ml of the ready-to-use wash buffer in each well and wash on the shaker while shaking
gently for 5 minutes. The wash buffer is aspirated after the washing procedure.
4.
Carry out the washing step under 3. a total of three times.
9.4
Incubation with peroxidase conjugate
After washing the strips, place 2 ml of the appropriately prepared conjugate solution (see Table 3) into
each well and incubate for 45 minutes while shaking gently at room temperature, whereby the
incubation tray is covered with the plastic lid.
9.5
Washing
The conjugate solutions are aspirated from the wells and the strips are washed again (see 9.3).
9.6
Substrate reaction
1.
Add 1.5 ml substrate solution into each well and incubate for 5 - 10 minutes, shaking gently and
under observation, at room temperature.
2.
You should terminate the reaction as soon as the cutoff control band can be seen.
- 22 -
MIKROGEN
Instructions for use
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Stopping the reaction
9.7
1. After the solution is aspirated, wash the strips briefly three times with deionised water.
2. Use a plastic forceps to remove the strips carefully from the water and place them between 2 layers of
absorbent paper to dry for about 2 hours. The strips may be adhesively attached to the enclosed
evaluation sheet and the results may be recorded.
3. The strips should be stored protected from exposure to light.
9.8
Test procedure of avidity determination
The avidity test procedure is described in detail in the instructions for use for the avidity reagent (Article
No.: 11010).
10. Summary of the test procedure
1.
bring all reagents to room temperature
2.
deposit the strips in 2 ml ready-to-use wash buffer and take care that they are completely
immersed in the ready-to-use wash buffer
3.
pipette 20 µl of the sample
4.
incubate for 1 hour at room temperature while shaking gently
5.
wash on the shaker three times with 2 ml of ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time
6.
add 2 ml appropriately prepared conjugate solution
7.
incubate at room temperature for 45 minutes while shaking gently
8.
wash on the shaker three times with 2 ml of ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time
9.
add 1.5 ml of the substrate solution, incubate while shaking at room temperature for
5 - 10 minutes
10. wash the strips at least three times with deionised water
11. dry the strips between 2 layers of absorbent paper for 2 hours and read off the result
11. Evaluation
11.1
Evaluation of band intensity
1.
On the enclosed evaluation sheet, record the date, lot and tube number along with the antibody
class detected.
2.
Enter the sample identification number on the protocol sheet.
3.
Now attach the corresponding test strips with a glue stick into the corresponding fields of the
evaluation sheet. To do this, place the test strips with the reaction control band on the marking lines.
Then use clear adhesive tape to attach the test strips left from the marking line. Complete sticking of
the test strip with glue or adhesive tape may lead to aberrations of the colouring.
4.
Now identify the bands of the developed test strips based on the printed control strip on the
evaluation sheet and record them in the protocol sheet (Table 4). Identify the bands on the test
strips separately for the respective immunoglobulin classes.
- 23 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
11.2
Instructions for use
MIKROGEN
Control results
The test can be evaluated if the following criteria are met:
•
Reaction control band (upper line) pronounced colour, dark band
•
Antibody class (second and third band): The corresponding conjugate control band must show a
clear colour reaction. The two other conjugate control bands may develop a weak, non-specific
colouring.
•
Cutoff control (fourth band): weak, but clearly evident colouring.
Table 4: Intensity of bands in relation to the cutoff band
Bands
Intensity
No reaction
-
Intensity weaker than the cutoff band
±
Same intensity as the cutoff band
+
Strong intensity (stronger than the cutoff band)
++
Very strong intensity
+++
Important!
The band patterns in recomLine Parvovirus B19 IgG and IgM detection tests may show varying
intensities. It is possible that the IgG recomLine will show more intense and darker bands than the IgM
recomLine. The intensity of the protein bands depends on the concentration of the Parvovirus B19specific antibodies.
Evaluation of avidity results: see chapter 11.5
11.3
Test results and test interpretation
Table 5: IgG test evaluation (without assessment of NS-1 reactivity)
no reactions or other constellations as below
IgG negative
VP-N or VP-2r or VP-C positive
at least +
IgG borderline
VP-2p or two antigens (VP-N, VP-1S, VP-2r, VP-C)
positive
at least +
IgG positive
Table 6: IgM test evaluation (without assessment of NS-1 reactivity)
no reactions or other constellations as below
IgM negative
VP-N or VP-1S or VP-2r or VP-C positive
at least +
IgM borderline
two antigens (VP-2p, VP-N, VP-1S; VP-2r, VP-C) positive
at least +
IgM positive
Evaluation of NS-1 reactivity (IgG)
The NS response should only be considered in term of IgG. In evaluation of the result for anti-Parvovirus
B19 -positive/negative - the NS response should not be taken into consideration in normal cases.
When determining the possible time of infection, positive NS-1 reactivity in the IgG will generally mean
that the infection is at least 6 weeks old. It must, however, also be remembered that NS-1 antibodies are
only produced in about 20% of cases.
In the context of relevant symptoms and preliminary clinical findings, an NS-1 titer may be an indication
of a possible persistence of this virus.
- 24 -
MIKROGEN
Instructions for use
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
However, the diagnosis “persistent Parvovirus B19 infection“ must never be made on the basis of
serological findings alone. The detection of virus antigen or virus DNA must always be demanded. It
must also be taken into account that NS-1 IgG antibodies do not develop until after a certain amount of
time, so that a PCR DNA would not necessarily be positive at every point in time in a case of
persistence. For this reason, a number of tests should always be carried out at intervals during the
course of such cases.
11.4
Notes on interpretation of the results
When evaluating the test results, IgG and IgM findings should always be considered together.
In all test interpretations, especially of weak positive results, it is important to include any other clinical
record data available. Close co-operation between laboratory and the physician in charge of treatment is
recommended here as well. Samples with unclear or borderline results should be rechecked after 2 - 3
weeks in keeping with the clinical situation.
A negative result does not exclude the possibility of a Parvovirus B19 infection. False negative results
may occur with serum samples obtained at a very early stage after infection in which no antibodies have
been produced as yet.
Isolated positive IgM reactivities (no IgG antibodies) should be carefully interpreted, it may concern an
acute infection in the early phase of infection.
Weak IgM reactivity can be caused by persistent IgM antibodies from an infection in the more distant
past, by reactivated IgM antibodies, e.g., in the case of an Epstein Barr virus infection, or by nonspecifically attached antibodies.
Use of icteric sera may lead to an increased number of positive results.
Typical reaction profiles:
Based on evaluations carried out until now, the following IgG/M reaction patterns can give an indication
of a certain Parvovirus B19 status. However, it must be pointed out that these are typical reaction
patterns, so deviations are very well possible.
In cases of long-past infections, an IgG reactivity to VP-2p and/or VP-N (usually with VP-1S) is observed
in most cases.
In a acute infection, a pronounced IgG reactivity to VP-C and VP-2r is observed in addition to VP-2p, VPN and VP-1S. This pronounced reactivity to VP-C is normally found in an incipient or recent-past
infection (duration usually no longer than 6 months).
If no IgG reactivity to VP-C occurs, an acute infection can be excluded with a high level of probability; if
suspicion of infection persists, the course should be monitored.
- 25 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Instructions for use
MIKROGEN
Table 7: Parvovirus B19 status and typical IgG/IgM reaction patterns
IgG
IgM
possible
Parvovirus B19 status
acute infection,
IgG titer still weak or absent
VP-2p, VP-N, VP-2r, VP-C
(reactivities mostly ≤ +)
VP-2p, VP-N
(reactivities mostly ≥ ++)
VP-2r, VP-C
(reactivities mostly + to ++)
VP-2p, VP-N, VP-1S, VP-2r,
VP-C
(reactivities mostly ≥ ++)
VP-2p, VP-N, VP-2r and VP-C,
usually with VP-1S
(reactivities mostly ≥ ++)
VP-2p, VP-N and VP-2r
(reactivities mostly ≥ +)
status after infection
(weeks to months)
with IgM and IgG response
negative or borderline (isolated
antigen reactivities with ≤ +)
Status after infection (months)
VP-2p and/or VP-N with VP-1S
(reactivities mostly ≥ ++)
negative: VP-2r and VP-C
negative
long past infection (years)
VP-2p, VP-N and VP-2r,
(reactivities mostly only with +)
VP-2p, VP-N and/or VP-2r
(possibly VP-1S),
(reactivities mostly only with +)
unclear status, possibly caused
by boostering, test should be
repeated at time intervals,
VP-2p, VP-N, VP-1S
(reactivities mostly ≥ +)
negative: VP-2r and VP-C
VP-N, VP-1S
(reactivities mostly only with +)
past infection by IgG response
and atypical IgM reactivity,
constellation was founded in
some rheumatic factor positive
samples, test should be repeated
at time intervals,
The evaluation of NS-1 titers for the clarification of persistent Parvovirus B19 infections, reactive
arthropathies, chronic anaemias, or other symptoms with suspected Parvovirus B19 persistence have
not been taken into account in Table 7 because a large number of combinations are possible here,
depending on the duration, clinical data, and immunocompetence. The NS-1 titers should be included in
the interpretation only when special questions arise (see 11.3).
Avidity testing: In most cases, determination of the avidity of the IgG antibodies to the specific
individual antigens allows for a more exact definition of the actual infection status, in particular facilitating
differentiation of an acute Parvovirus B19 infection from a subacute infection with persisting IgM
antibodies (see 11.5).
Dark test strips: Some patient sera may cause a dark, continuous or patterned coloration on the entire
nitrocellulose strip (e.g. sera from patients with milk protein allergies). Various different factors in each
patient serum are responsible for this effect. Evaluation of these strips is usually feasible in a restricted
sense only. For instance, "inverse" bands (white bands on a dark background) must be evaluated as
negative. The corresponding serum should in any case be tested using other serological methods.
- 26 -
MIKROGEN
11.5
Instructions for use
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Extension of diagnosis with avidity determination
11.5.1 Test principle and test procedure
The testing procedure for avidity is described in detail in the instructions for use accompanying the
avidity reagent (article no. 11010). See these instructions for use for the detailed procedure for
determining avidity in recomLine Parvovirus B19 IgG.
11.5.2 Avidity in recomLine Parvovirus B19 IgG
The recomLine Parvovirus B19 detects reactivities to individual, singular antigens, VP-N and VP-1S. The
determination of the antibody avidity of VP-2r and VP-C is not evaluated, because high-avide antibodies
are not developed in many cases during the course of infection. The conformational epitopes of VP-2
antigen were modified by using the avidity reagent, therefore the avidity determination of VP2 is not
reliable.
11.5.3 Interpretation of avidity in the recomLine Parvovirus B19 IgG
⇒ Only avidity determination of the IgG antibodies to VP-N and VP-1S.
⇒ Reactivities on the IgG strip below the cutoff control (very weak intensities) should not be considered.
⇒ Compare the intensities of the corresponding bands on the two test strips incubated with the same
patient sample (IgG strip and avidity strip). Check whether the intensities have changed.
⇒ At low avidity the intensity should be reduced by at least 50% at intermediate avidity the intensity is
reduced by approx. 50%.
⇒ At high avidity levels, the band intensity on the avidity strip is reduced either not at all or practically
not at all.
⇒ The IgG antibodies to VP-N and VP-1S reach a high avidity level at the earliest in the course of
about 4 weeks and at the latest 6 to 8 weeks after infection. A low resp. intermediate avidity of the
VP-N and VP-1S band is therefore to be interpreted as a clear indication of an acute infection. If
highly avid IgG antibodies to VP-N and VP-1S are present, an infection within the past 4 weeks can
usually be excluded. If the avidity levels of VP-N and VP-1S deviate from one another, the avidity of
VP-N is then decisive.
⇒ Generally speaking, no absolute rules apply to the assessment of avidity. In individual cases, it must
be kept in mind that low avidity levels are possible in past infections as well, since the maturation of
avidity may be delayed. The interpretation of avidity must always be assessed within the context of
all test results.
12. Clinical Results
Patient samples from different sources were tested to assess the performance capability of recomLine
Parvovirus B19 IgG [avidity], IgM. This study considered a total of 298 IgG res. 287 IgM determinations.
Additional 70 potentially falsifying samples and 10 serum-plasma comparisons were tested. 67 serum
samples were tested in the recomLine Parvovirus B19 IgG for avidity determination of the IgG
antibodies.
12.1
Patients samples from acute infection with Parvovirus B19
A panel of 52 human sera samples from patients supposed to be recently infected with Parvovirus B19
was analysed, included 12 courses of an infection (2 to 5 samples of each patient). In all 12 courses of
an infection specific Parvovirus B19 antibodies were found. In some cases, the first patient sample in the
course of an infection was positive; in cases in which the samples were first negative, a seroconversion
was observed in the following samples. IgM antibodies remained detectable in eleven of these twelve
courses of infection until at least the 42nd day after initial occurrence of symptoms.
- 27 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
12.2
Instructions for use
MIKROGEN
Blood donors
187 (IgG) and 176 (IgM) non-selected blood donors plasma were tested. These samples were tested
with a reference ELISA Parvovirus B19 testing system (see 12.3.2), also.
IgG result: 66% of patient samples had IgG antibodies, a lot of these positive samples showed a typical
reaction pattern as long past infections (see Table 7).
IgM result: 3% of patient samples hat IgM antibodies.
12.3
Comparison of the recomLine Parvovirus B19 with reference Parvovirus B19 ELISA
The agreement between the two Parvovirus B19 testing systems was good; the level of agreement of the
results for detection of IgG antibodies was approx. 98%; in detection of IgM antibodies, the determined
agreement levels for the results was between 93.1% and 95.5% in different patient collectives. In the
calculations of the “agreement of the two testing systems,” borderline results were assessed to be
positive results.
12.3.1 results of 101 serum samples of patients with acute or recent Parvovirus B19 infection
reference ELISA IgG Parvovirus B19 IgG/IgM
acute or recent infection
positive
borderline
negative
positive
99
0
0
borderline
0
0
1
negative
1
0
0
positive
40
0
1
borderline
2
1
4
negative
1
1
51
recomLine
Parvovirus B19
IgG
recomLine
Parvovirus B19
IgM
sum IgG resp. IgM 101
agreement between the two IgG testing systems
98,0%
agreement between the two IgM testing systems 93,1%
12.3.2 Blood donors
reference ELISA IgG Parvovirus B19 IgG/IgM
blood donors
recomLine
Parvovirus B19
IgG
recomLine
Parvovirus B19
IgM
positive
borderline
negative
positive
123
0
1
borderline
0
0
0
negative
2
1
60
positive
2
2
2
borderline
0
0
3
negative
3
0
164
sum IgG 187
sum IgM 176
agreement between the two IgG testing systems
97,8%
agreement between the two IgM testing systems 95,5%
- 28 -
MIKROGEN
12.4
Instructions for use
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Determination of sensitivity by WHO standard IgG
The WHO standard IgG (100 IU/ml) was tested in dilutions derived from that standard in recomLine
Parvovirus B19 IgG and in a reference ELISA IgG. The WHO standard IgG still showed a borderline
result (isolated positive VP-N reactivity) at a dilution of 1.5 IU/ml in the recomLine Parvovirus B19. The
reference ELISA IgG also showed a borderline result at this level.
12.5
Potentially falsifying samples
Investigations of potential interference factors revealed no evidence that test results were affected in
cases of lipaemic patient samples, CRP-positive or in ANA-positive patient samples .
Haemolytic or icteric samples or samples from patients that were positive for rheumatism factor showed
a slightly increased number of positive IgM results (see Table 7).
In cases of infectious mononucleosis (Pfeiffer's disease, EBV infection), a polyclonal stimulation of B
lymphocytes may occur. This may lead to positive reactions in IgM class antibody detection tests.
12.6
Serum-plasma comparison
Analysis of 10 samples from patients revealed no differences between serum and plasma analyses.
12.7
Avidity evaluation data
67 serum samples from cases of acute, recent-past and long-past Parvovirus B19 infections were tested
in the recomLine Parvovirus B19 IgG for avidity of the IgG antibodies to VP-N and VP-1S.
The results of the avidity test correlated reliably with the clinical data and the interpretation of the
reactivities of the individual antigens with IgG and IgM antibodies. The data demonstrate that the IgG
antibodies to VP-N and VP-1S had matured to a high level of avidity at the earliest after 4 weeks, but in
most cases 6 to 8 weeks, after the infection. After that point, only highly avid IgG antibodies were found.
- 29 -
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
Instructions for use
MIKROGEN
13. Literature
(1)
S. Modrow, S. Dorsch: Antibody responses in parvovirus B19 infected patients. Pathol Biol (2002), 50, 326 - 31
(2)
H. W. Lehmann, S. Modrow: Parvovirus B19. Monatsschr Kinderheilkd (2004), 152, 203 - 214
(3)
P. Cassinotti: Human Parvovirus B19 infections and their diagnosis. Alpe Adria Microbiology Journal (1995), 4, 235 - 246
(4)
S. Modrow: Parvovirus-B19. Deutsches Ärzteblatt 98, Heft 24, (2001), A1620 - A1624
(5)
M. Schleuning: Parvovirus-B19-Infektionen. Deutsches Ärzteblatt 93, Heft 43, (Oktober 1996), B2182 - B2185
(6)
M. Söderlund, C. S. Brown, W. J. M. Spaan, L. Hedman, K. Hedman: Epitope type-specific IgG response to capsid proteins VP1 and
VP2 of human Parvovirus B19. The Journal of Infectious Deseases 172, (1995), 1431 - 1436
(7)
T. F. Schwarz, G. Jäger: A recombinant immunoblot and ELISA for detection of acute Parvovirus B19 infection. Zbl. Bakt. 280,
(1994), 526-533
(8)
A. von Poblotzki, A. Gigler, B. Lang, H. Wolf, S. Modrow: Antibodies to Parvovirus B19 NS-1 protein in infected individuals. J. Gen.
Virology (1995), 76, 519-527
(9)
A. von Poblotzki, A. Hemnauer, A. Gigler, E. Puchhammer-Stöckl, F.-X. Heinz, J. Pont, K. Laczika, H. Wolf, S. Modrow: Antibodies to
the nonstructural protein of Parvovirus B19 in persistently infected patients: Implications for pathogenesis. The Journal of
Infectious Diseases (1995), 172, 1356-1359
(10)
K.-I. Pfrepper, M. Enders, M. Motz: Human Parvovirus B19 serology and avidity using a combination of recombinant antigens
enables a differentiated picture of the current state of infection. Journal of Veterinary Medicine Series B (2005), 52, 362-365
We will be pleased to send you further literature on Parvovirus B19- diagnostics at your request.
- 30 -
Instructions for use
MIKROGEN
recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] / IgM
14. Explanations of the symbols
y°C
x°C
Contains sufficient for < n > tests
amount of tests
Evaluation form
Instructions for use
Consult instructions for use
Inhalt ist ausreichend für < n > Ansätze
Anzahl der Ansätze
Auswertebogen
Gebrauchsinformation
Gebrauchsinformation beachten
Contains
in vitro diagnostic device
Batch code
Do not freeze
Inhalt, enthält
In vitro Test
Chargen-Nummer
Nicht einfrieren
Catalogue number
Use by
expiry date
Temperature limitation
Store between x°C and y°C
Bestell-Nummer
verwendbar bis
Mindesthaltbarkeitsdatum
Lagerung bei x°C bis y°C
Artikel-Nr./ Article No.:
Artikel-Nr./ Article No.:
recomLine Parvovirus B19 IgG
recomLine Parvovirus B19 IgM
optional als Zusatzreagenz zu 5972 erhältlich:
optionally available in addition to Art.-No. 5972
4472
4473
Artikel-Nr./ Article No.:
Aviditätsreagenz / Avidity reagent
11010
Gebrauchsinformation Version/ Instructions for use version:
GIRLPA004DE.DOC
gültig ab/ valid from:
Februar/February 2006
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Fraunhoferstraße 20
D-82152 Martinsried
Germany
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+49 (0)89 85 65 28 0
+49 (0)89 85 65 28 29
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