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Nukleinsäuretests und POCTs in der
klinisch-mikrobiologischen Diagnostik
Andreas Podbielski
Inst. f. Med. Mikrobiologie, Virologie & Hygiene
Universitätsklinik Rostock
Workshop Infektionsdiagnostik
25. Januar 2012
Immanuel Klinik Rüdersdorf
Notwendigkeit mikrobiologische Schnellteste –
die klinische Ausgangssituation
Ein aktueller Fall
• 73-jähriger Japaner, seit 1 Woche in D
• zunächst Nausea, perakut hohes Fieber, extreme Dyspnoe
• Notaufnahme samstags 01:30 Uhr
• umgehende Intubation, kalkulierte Therapie, typ. Diagnostik, ITS-Aufnahme
Anruf diensthabende Ärztin
• welche besondere Diagnostik ?
• mit welcher Dringlichkeit ?
Diagnostik nach 6 h
• Mikroskopie aus BK
• typischer Aspekt
• Antigennachweis per Agglutination
• Postexpositionsprophylaxe für Notfallteam ?
Schnelle infektiologische
Diagnostik
Was sind die Ziele ? Welche Antworten sollen gegeben werden ?
• liegt überhaupt eine Infektion vor ?
• ist es eine systemische Infektion ?
• welche(r) Erreger spielt/spielen eine tragende Rolle ?
(in erster Näherung Bakterien, Pilze, Viren)
• gibt es Indizien für eine spezifische Therapie ?
• müssen besondere Schutzmaßnahmen ergriffen werden ?
(Arbeitnehmer, andere Patienten, Personen der Umgebung)
• wie schnell muss „schnell“ für die einzelnen Punkte sein ?
Sepsis – Definition
Generalisierte Infektion mit Bakterien oder Pilzen in der Blutbahn sowie in
einem oder mehreren Organen; Viren verursachen keine Sepsis
Definition d. European Society of Intensive Care Medicine
I Infektiologische Genese (mikrobiol. Nachweis od. klin. Kriterien)
II Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)
• Fieber / Hypothermie
• Tachykardie
• Tachypnoe / Hyperventilation
• Leukozytose / Leukopenie / Linksverschiebung
III Akute Organdysfunktion
• akute Enzephalitis
• arterielle Hypotension trotz adäquater Volumenzufuhr
• rel. / abs. Thrombopenie ohne Blutung
• arterielle Hypoxämie ohne manifeste Herz- od. Lungenerkrankung
• renale Dysfunktion trotz adäquater Flüssigkeitszufuhr
• metabolische Azidose
SIRS (mind. 2 Kriterien aus II),
Sepsis (I plus SIRS),
schwere Sepsis (Sepsis plus 1 Kriterium aus III), sept. Schock (Sepsis plus arterieller BD
<90mmHg f. mind. 2 h bzw. BD >90mmHg nur durch Vasopressoreneinsatz)
Sepsis in Deutschland –
Epidemiologie
• ca. 76.000 - 110.000 Sepsisfälle/Jahr in D
= ca. 250 - 350 Fälle pro 100.000 Einwohner
(entspr. pro 100.000 Einwohner 196 Herzinsuffizienz-, 112 Brustkrebs-, 48 Kolon- /
Rektum-Karzinom-Fälle)
• 28- / 90-Tage Letalität: 44,1% / 50,3%
• 1/3 d. intensivmed. Versorgung f. Sepsisfälle
• Kosten pro Fall ca. 23.000 - 24.000 €
= ca. 2 Milliarden € pro Jahr, ca. 40% d. Intensivmedizinkosten
• gesamtgesellschaftl. Kosten (Arbeitsausfall, Rente u.a.) 3,6 - 7,8 Millarden €
Engel et al. 2007 Intensive Care Med 33: 606-18; Rehberg et al. Management & Krhs 10/2011
Sepsis – Therapie und Prognose
Schnelles Handeln ist überlebenswichtig !
• sofortige kalkulierte Antibiotikatherapie bei geringstem Verdacht
• multiresistente u. spezielle Keime davon nicht erfasst !
• Diagnostik dient gegenwärtig zur Diagnosesicherung, Therapieanpassung
bzw. -fokussierung
• größtes Problem für Kliniker: Dauer aller Schritte der Diagnostik
(Präanalytik, Analytik, Postanalytik)
acute kidney insufficiency
Auburtin et al. 2006 Crit Care Med 34: 2758-65; Bagshaw et al. 2009 Intensive Care Med 35: 87181; Gaieski et al. 2010 Crit Care Med 38: 1045-53; Kumar et al. 2006 Crit Care Med 34: 1589-96
Sepsis - diagnostische Möglichkeiten
Konventionelle Diagnostik
• Mikroskopie
- zu wenig sensitiv / spezifisch
• Serologie
- Antikörperanstieg geschieht zu spät
- Antigennachweise zu wenig sensitiv, nicht umfassend kommerz. verfügbar
• Kultur-gebundene Diagnostik (Methode der Wahl)
- erlaubt offene Fragestellung
- Teilautomatisierung Standard /
Komplettautomatisierung
innerhalb d. nächsten 5 J.
- Resistenztestung möglich
- Durchführungszeit (1,5 -) 2 (- ≥4) d
Sepsis - diagnostische Möglichkeiten
aktuelle Trends
• Nukleinsäurediagnostik
(i.d.R. Amplifikation, ggf. auch Hybridisierung)
• umfassende Messung d. Wirtsreaktion
(z.B. via Transkriptomanalyse)
- ggf. Erreger-spezifische Muster ableitbar
• Point-of-care-Tests (POCTs)
(div. Testformate, direkte Einzelmessungen, Einzel- u.
Multiplexmessungen nach komplexer Probenaufbereitung)
Sepsis Nukleinsäurediagnostik –
in D kommerziell verfügbare Systeme
• Roche SeptiFast rRNA Gene von 10 Gram-neg., 9 Gram-pos. Bakterien, 6 Pilzen, 3 Resistenzgene
• SIRS Lab VYOO rRNA Gene von 15 Gram-neg., 13 -pos. Bakt., 6 Pilzen, Pan-Pilz-PCR, 5 Res.gene
• Molzym SepsiTest qPCR –
Kits für selektive Extraktion bakt. DNA, DNA-freie PCR Reagenzien;
Identifizierung durch Amplifikat-Sequenzierung nicht im Kit
• Qiagen ResPlex PCR + LiquiChip Workstation
• Evaluation bisher nur für SeptiFast, (SepsiTest)
Technische / Ökonomische Daten
• PCR direkt aus Blut
• ca. (90 -) 250 - 400 € Sachkosten,
40 - 60 € Personalkosten pro Analyse
Benefit
• 3 - 6 (- 18) h Bearbeitungs-/Analysezeit
• prinzipiell vollautomatisierbar
• funktioniert auch in Gegenwart von Antibiotika
(Sensitivitätsgewinn)
• weniger anfällig für Koag.-neg. Kontaminanten (?, SeptiFast)
Sepsis Nukleinsäurediagnostik –
kommerziell verfügbare Systeme
Methoden-bezogene Probleme
• (beschränkt. Keimspektrum nachweisbar), keine Aussage z. Erregervitalität
 BK weiter notwendig
• kein Antibiogramm, dito
• bei Einbeziehung von Sequenzdaten:
Qualität der Referenzdaten (Phred bzw. Phrap Values)
• Sensitivität bzgl. BK ca. 87%, Spezifität ca. 90%
• hohe Leukozytenzahlen stören (SeptiFast)
• Ergebnis Lagertemperatur-abhängig
• Gefahr falsch pos. Befunde durch Laborkontamination
• nur 5-10 % der Untersuchungen zum Nachweis von
Sepsis-Erregern erbringen Nachweis
• Palette teurer Geräte notwendig
• zusätzl. Kosten, z.Zt. keine DRG-Abbildbarkeit d. Methode
• systematische Kosten-Nutzen-Erfassung fehlt noch
Tenover 2011
Clin Infect Dis
52 (S4): S338-45
Sepsis Nukleinsäurediagnostik –
kommerziell verfügbare Systeme
Übergeordnete Probleme
• reine PCR im Nachweisspektrum extrem beschränkt
• 3-6 h Analysezeit immer noch zu lang !
Präanalytik
• Prozessierungs- / Analyseautomaten ITS-fern lokalisiert
• damit zusätzlich Materialtransportorganisation u. -zeiten
Analytik
• Arbeitsorganisation im Labor
- tägl. Testansatzzeiten im Labor (Serienlängen) ?
- aufschiebende Auswirkung auf andere Tests ?
- Testdurchführung auch nachts / an Wochenenden / Feiertagen ?
Postanalytik
• Befundrückführung
- telefonisch / elektronisch ?
• Umsetzung in therapeutische Entscheidungen
- kompetentes Personal vorhanden ?
Nukleinsäurediagnostik –
andere kommerziell
verfügbare Systeme
• Nanosphere Verigene Nucleic Acid test (cartridge system,
Multiplex PCR / Nanobead Festphasen Hybridisierung) Atemwegserreger, Gram-pos./neg. Sepsiserreger
• AutoGenomics Infiniti system (Multiplex PCR / automatis. Microarray Hybridis.)
• BD GeneOhm Max system (Multiplex RT PCR)
• Idaho Technologies FilmArray system (Single use pouch,
Multiplex PCR) - Atemwegserreger
• PrimeraDx scalable target analysis routine (STAR) (Multiplex PCR /
Kapillarelektrophorese)
• Abbott Molecular PlexID (Multiplex PCR / electrospray ionization
mass spectrometry) - jegliche Bakterien / Pilze, zahlreiche Viren
Caliendo 2011 Clin Infect Dis 52 (S4): S326-30
Schnelle Sepsis-Diagnostik –
ernstzunehmende Konkurrenz
Massenspektrometrie
Identified species
Bacillus subtilis
MALDI BioTyper
Pattern Matching
Generate MALDI-TOF
profile spectrum
Profiling results from different Bacillus strains
a.i.
6000
4000
Transfer a thin-layer onto
a MALDI target plate
Select a colony
2000
0
-2000
-4000
Unknown
microrganism
-6000
B. globigii
B. licheniformis
B. subtilis
B. thuringiensis
?
Schnelle Sepsis-Diagnostik –
ernstzunehmende Konkurrenz
Massenspektrometrie
Probleme
• (Kurz-)Kultur Voraussetzung
• Resistenzaussagen und Quantifizierungen fehlen noch
Benefit
• extrem breite Bakterien-/Pilz-Differenzierung (> 1.000 Arten, wachsende Datenbank)
• extrem schnell (ca. 4 + 4 min. Vorbereitung, 1 min. Analyse)
• „preiswert“ (Einzelanalyse ca. 10 cent, Gerät ca. 166.000 €)
• auf alle Ausgangsmaterialien anwendbar
• in Automatenstrassen einbindbar
• ggf. Stammerkennung (Epidemiologie, MRE)
Aktuelles Vorgehen
• kurze (2 - 3 h) Vorkultur aus Blut / Urin
• Analytik → Spezies ≤ 1 d
• in parallele orientierendes Antibiogramm ≤ 1,5 d
Schnelle Sepsis-Diagnostik –
zukünftige Konkurrenz ?
Messung der Wirtsreaktion
Grundlagen
• Spektrum d. Wirtsreaktion stark Erreger-assoziiert
• Schadensausmaß maßgebl. durch Muster u. Stärke d. Wirtsabwehr bedingt
aktuell verfügbare Methoden
• Chip-Hybridisierung
• deep sequencing RNA-Analysen
Probleme
• Reaktionsmuster noch unzureichend bekannt
• punktgenaue Therapie für Interferenz mit Wirtsreaktion
nicht verfügbar
• arbeitsaufwändig, unzureichend automatisiert
• teuer (> 1.000 €)
Prognose bzgl. zukünftigem Stellenwert
• derzeit unsicher
Schnelle Sepsis-Diagnostik –
aktueller Status
alle neben der konventionellen Diagnostik
verfügbaren Methoden
- erlauben nur eine beschränkte Aussage
- leiden unter logistischen Problemen
- sind nicht ausreichend schnell genug
sind POCTs die Antwort ?
Schnelle Sepsis-Diagnostik
– Point-of-care testing (POCT)
eigentlich ein sehr altes Prinzip
Mikrobiologisches POCT
- was geht und was gibt es heute ?
• Mikroskopische Verfahren – dezentral-stationär
• Serologische Verfahren – hand-held und dezentral-stationär
(Agglutination, ELISA, Opto-Immuno-Assay, flow-through / lateral-flow Technik)
• Nukleinsäure Nachweisverfahren – (hand-held und)
dezentral-stationär
• Kulturverfahren – (dezentral-stationär)
POCTs
für die schnelle Sepsis-Diagnostik
denkbarer Benefit
• Messung am Patientenbett / auf Station durchführbar
→ Transportprobleme / Wegezeiten entfallen
• für Nukleinsäurediagnostik prinzipiell geeignet
• Cartridge-Lösung verfügbar
→ keine Spezialkenntnisse zur Durchführung erforderlich
• Miniaturisierung ermögl. prinzipiell Beschleunigung d. Testdurchführung
• Durchführung ggf. in Händen des Therapieentscheiders
→ Latenzzeiten f. Umsetzung d. Messergebnisses entfallen
→ ggf. als Vorlauf zur Therapieentscheidung einsetzbar
POCTs
für die schnelle Sepsis-Diagnostik
Probleme
• komplexe Materialbearbeitung erforderlich, (universell) bisher
technisch nicht (überzeugend) gelöst
• im Fall von Materialbearbeitung keine POCT im aktuell. Sinne d. RiliBÄK
• i.d.R. Einzeltests - nur für gezielte Fragestellungen
• Leistungsfähigkeit einzelner Test - i.d.R. geringer als im Labor
• geschultes Personal notwendig / vorhanden ?
• Integration in Arbeitsorganisation ?
• Kosten ! (konventionelle Diagnostik läuft weiter !) / Abrechnung ?
POCTs
für die schnelle Sepsis-Diagnostik
ggf. kann ein POCT mit geringerer Sensitivität /
Spezifität / Reliabilität aufgrund des schnell
verfügbaren Ergebnisses für das Patientenwohl
besser geeignet sein als ein leistungsfähigerer
Labortest, dessen Ergebnis erst am nächsten
Tag zur Verfügung steht
POCTs
für die schnelle Sepsis-Diagnostik
noch mehr Probleme
• Arbeitssicherheit (Risikogruppe S2 – S4 Organismen !)
• Protokollierung ? Dokumentenlenkung nicht banal
(z.B. Integration in Patientenakte,
Protokollverwahrfristen entspr. MPG)
• Qualitätssicherung teilweise technisch nicht gelöst,
ansonsten nicht auf Laborniveau leistbar (Ringversuche ?)
• wer trägt juristische Verantwortung für gesamten Prozess ?
die Alternative: mikrobiologische
Schnelldiagnostik in zentraler Laborplattform
Vorteile
• alternative Methoden verfügbar,
ausreichende Breite d. Diagnostik gewährleistet
• Fachpersonal - zumindest bisher verfügbar
• Fokussierung auf diese Tätigkeit - dito
• biologisches Containment gewährleistet
• Dokumentation - gut und weiter optimierbar
• Qualitätsmanagement - ist Standard
• vernünftige Serienlängen - akzeptable Kosten,
ggf. Optimierungsreserven
die Alternative: mikrobiologische
Schnelldiagnostik in zentraler Laborplattform
Probleme
• Integration der Schnelltests in Arbeitsabläufe des Labors
• Einflussgrößen:
Zeitpunkt Materialgewinnung, Transportfrequenz,
bezahlbare Serienlängen, Regelarbeitszeiten im Labor
• Integration der Befunde in Patientenversorgung
• Einflussgrößen:
Personal in beauftragender Institution zur therapeutischen
/ pflegerischen Umsetzung vorhanden ? und willens ?
Mikrobiologische Schnelldiagnostik –
Beispiel MRSA-Problematik
• Kosten pro Patient 6.000-8.000 €, Erstattung via OPS 8-987 ca. 25(-40)%;
• adäquate Überwachungsstrategie (Erkennung des Keimträgerstatus durch
Abstriche) kann
- nosokomiale Übertragungen minimieren,
- Therapie frühzeitig lenken
aber Abstriche haben
ihren Preis …
Mikrobiologische
Schnelldiagnostik –
Beispiel MRSA-Problematik
Kulturbasierte Verfahren
• Standardkulturverfahren
• Kultur mit chromogenen Medien
• 3M BacLite rapid MRSA-Test
Dauer [h]
Personalaufwand
Komplexität
48-72
24-48
5
niedrig
niedrig
niedrig
niedrig
niedrig
niedrig
4-6
2,5-4
2,5-6
2,5-6
1,5
hoch
hoch
hoch
mittel
niedrig
hoch
hoch
hoch
mittel
niedrig
Molekularbiologische Verfahren
•
•
•
•
•
Hyplex Staphyloresist (BAG)
GenoQuick MRSA (Hain)
Lightcycler MRSA (Roche)
IDI MRSA Assay
Xpert MRSA (Cepheid)
Mikrobiologische
Schnelldiagnostik –
Beispiel MRSA-PCR
Ausgangssituation
mecA-Genomkassette als target, diverse kommerzielle Anbieter vorhanden,
mehrere Evaluationen publiziert
Technische Daten
PCR direkt aus Patientenmaterial / Kulturmaterial möglich, verschiedene Formate
inkl. Real-time, (1-)3-6 h Bearbeitungs-/Analysezeit, ca. 25 € pro Analyse
Benefit
Bestätigung Abwesenheit von MRSA innerhalb eines (halben) Tages
Probleme
- Integration in Arbeitsorganis. (wann werden Abstriche genommen, wie lange
gesammelt, bis wann / wie häufig in Diagnostik eingeschleust, wem Befund
wie gemeldet, bis wann Isolierungsstatus geändert);
- Erkennungslücke f. mecA-Genomkassette 5-20%, kein Resistogramm 
momentan zusätzlich konventionelle Kultur-gebundene Diagnostik unerläßlich
(ca. 9 € neg. / 24 € pos. Nachweis)
POCTs – sinnvolle Zukunft
In der Klinik – Nachweis von
• Erregern der Sepsis bis auf Speziesebene
• Erregern system. Infektionen bis Ordnungsebene
• jeweils in Kombination mit Nachweis häufiger Antibiotikaresistenzen
• Erregern tiefer Atemwegsinfektionen
• Influenza-, Herpes-, ggf. MMR- Viren
• Pilzen (Candida, Aspergillus, ggf. andere Schimmelpilze)
In der Arztpraxis – Nachweis von Erregern
• oberer Atemwegsinfektionen
• gynäkologischer Infektionen
• von Haut- u. Weichteilinfektionen
Als POCT aktuell nicht sinnvoll – Nachweis von Erregern
• von Harnwegsinfektionen (kalkulierte Therapie greift i.d.R.)
• der Tuberkulose (geringe Akuität der Erkrankung)
nicht unbedingt als POCTs,
aber als Schnelltests dringend gebraucht
Biofilmanalytik
• Vorhandensein entscheidend für therapeutisches Vorgehen
• Technik f. in situ Nachweis fehlt, 1. Generation Resistenztestungsautomaten verfügbar
Mikrobiomanalysen
• akute Infektion ggf., chronische Infektion i.d.R. Störung der lokalen
Mikroökologie
• systemanalytische Daten fehlen noch,
danach vollkommen neue
Zielparameter und
Referenzwerte möglich
POCTs – rechtliche Basis
Deuschland
• Paul-Ehrlich-Institut (PEI) prüft nur im Anhang II IVD-Richtlinie gelistete
Tests mit Notwendigkeit einer CE-Markierung durch „benannte Stelle“
(HIV, Hepatitis)
• alle anderen Tests mit CE-Kennzeichnung, aber ohne unabhängiges
Prüfungs- / Zulassungsverfahren
USA
• FDA (Food & Drug Administration)  „approved“ od. „cleared“ 
keine in-house-Validierung erforderlich (Ersparnis von 20 - 50 T€ !)
• CLIA (clinical laboratory improvement act)  POCTs „moderate complex“
 nur durch akkreditierte Labors; „waived“  auch durch Laien
POCTs – Qualitätssicherung
• RiliBÄK (Richtlinien der Bundesärztekammer)
- Teil A fordert für alle Laboratoriumsuntersuchungen ein QMS
- Teil B1 - exakte Details f. quantitat. Untersuchungen inkl. Dokumentation
- Teil B2 - exakte Details für qualitative klin.chem. Untersuchungen
- Teil B3 - exakte Details für mikrobiolog. Untersuchungen - in 2012 ?
• mikrobiolog. POCTs: in Arztpraxen - bisher keine Ringversuch-Teilnahme;
- in Kliniken bisher kaum passende Ringversuche verfügbar
• Einführung POCTS
- in Arztpraxen in Verantwortung des Betreibers
- in Kliniken entspr. DIN EN ISO 22870 nach Entscheidung d. POCT-Kommis.
- nach Würdigung d. klin. Nutzens, d. finanziellen Auswirkungen, d. techn.
Durchführbarkeit u. d. Integrierbarkeit in Funktionsabläufe sowie
- nach fachl. Bewertung d. Geräte u. Festlegung von Verantwortlichkeiten u.
Befugnissen
POCTs – Kosten und Erstattung
GOÄ
• Antigen / -körpernachweise bisher abrechenbar
(einfacher Satz: 5,50 € Agglutinationsassay, 14,57 € Ligandenassay)
• Nukleinsäurenachweise je nach Umfang
(Art d. Aufreinigung, reverse transkriptase Schritt, Art d. Detektion, 99,09 - 128,23 €)
• Reform steht unmittelbar bevor, Tendenz zu geringerer Erstattung
EBM
• serologische POCTs nicht abgebildet
(Ausnahme S. pyogenes Nachweis bis 16. Lebensjahr 2,55 €)
• Nukleinsäurenachweise 16,50 € f. wenige def. Parameter
(Ausnahmen: Chlamydia trachomatis 20,50 €, HBV/HCV quant. 89,50 €, HIV quant. 112,50 €, HPV 30,40 €,
Mtb 61,40 €)
• zukünftige Politik unklar
freier Markt
• aktuell: Reisemedizin, Veterinärmedizin, Lebensmittel- u. Umweltanalytik
• zukünftig: Laienmedizin
POCTs – Kosten und Erstattung
POCTS lohnen sich ökonomisch derzeit
in der Klinik nicht, da unzureichend erstattet und umfassende
Laborstrukturen sowie technisch überlegene Tests weiter
vorgehalten werden müssen;
in der ambulanten Versorgung i.d.R. wg. mangelnder
Erstattung nicht bzw. nur dann, wenn auf technisch
überlegene Tests verzichtet wird
auf dem freien Markt je nach verhandelter Erstattung ggf.
Literatur:
Hartinger 2011 Schnellteste in der Mikrobiologie. Mikrobiologe 21: 52-8; Junker et al. 2010
Patientennahe Labordiagnostik in Klinik und Praxis. Dt. Ärztebl. 107: 561-7; Stürenburg &
Junker 2009 Point-of-care-testing in microbiology. Dt. Ärztebl. 106: 48-54
POCTs –
Lifestyle- und Laienanwendungen
Wartezeit „a“symptomat. Pat. (UK) auf Arzttermin: 2-3 Wo.; vs. no appointment session,
nur Pflegepersonal; sofortige Inspektion,
Screening STD-Erreger, Ergebnis spätestens
nach 48 h
Fa. CS Common Sense (Israel); Pantyliners mit
Indikator-Polymeren, z.B. pH mit Nitrazin-Gelb;
VI-Sense f. BV / Trichomoniasis-Detektion durch
symptomatische Laien
Nukleinsäuretests und POCTs für die
infektiologische Diagnostik –
wo geht die Reise hin ?
Nukleinsäuretests und POCTs in der
klinisch-mikrobiologischen Diagnostik
Vielen Dank
für Ihr Interesse
Andreas Podbielski
Inst. f. Med. Mikrobiologie, Virologie & Hygiene
Universitätsklinik Rostock