9. Labordiagnostik

Labordiagnostik
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9. Labordiagnostik
Um Rückschlüsse über mögliche Fehlfunktionen oder Erkrankungen einzelner Hormondrüsen zu ziehen, ist neben genauen körperlichen Untersuchungen hauptsächlich
der Nachweis der Hormonkonzentration im Serum bzw. Harn erforderlich.
Im Zentrallabor des LKH-Klagenfurt wird die quantitative Bestimmung von Hormonen
im Humanserum und -plasma mit dem „Elecsys 2010“ durchgeführt. „Elecsys 2010“ ist
ein Elektrochemilumineszenz Immunoassay („ECLIA“)-Analysenautomat.
Die Verfasserin dieser Fachbereichsarbeit vor dem "Elecsys
2010".
Elektrochemilumineszenz (ECL) ist ein Prozess, bei dem aus stabilen Ausgangsstoffen
durch Anlegen einer Spannung hochreaktive Stoffe erzeugt werden. Diese hochreaktiven Stoffe durchlaufen einen Reaktionskreislauf, bei dem Licht emittiert wird (Chemilumineszenz-Reaktion).
Beim „Elecsys 2010“ sind zwei Stoffe, ein Rutheniumkomplex und Tripropylamin (TPA),
an diesen lichterzeugenden Reaktionen beteiligt. Genau genommen, werden Ruthenium-tris(bipyridil)-Salze eingesetzt. Die Bipyridil-Liganden können mit reaktiven Gruppen so modifiziert werden, dass sie aktivierte chemilumineszente Verbindungen bilden.
Für die ECL-Immunoassays wird der N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) eines
modifizierten Ru(bpy)3-Komplexes verwendet. Dieser kann nämlich mit Aminogruppen
von Proteinen leicht eine Verbindung eingehen. Beim Reaktionskreislauf wird TPA verbraucht, während sich der Rutheniumkomplex ständig regeneriert. Die erzeugte Lichtemission wird mit einem Fotomultiplier gemessen und in die entsprechende
Konzentration umgerechnet.
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Auf dem „Elecsys 2010“ können drei verschiedene immunologische Testprinzipien
durchgeführt werden. Für den Nachweis von Hormonen wird entweder der kompetitive
Test oder der Brücken-Test angewendet. Welches der beiden Testprinzipien man
wählt, hängt vom Molekulargewicht des Analyten ab. Das dritte Testprinzip, der Test
nach dem Brückenprinzip, wurde zum Nachweis von Antikörpern entwickelt und ist somit für den Nachweis von Hormonen uninteressant.
9.1. Der kompetitive Test
Dieses Testprinzip wird bei Analyten mit einem geringen molekularen Gewicht angewendet. Zu dieser Gruppe von Hormonen gehört zum Beispiel das Schilddrüsenhormon FT3, sowie auch Progesteron und Östradiol.
Beim kompetitiven Test werden die Patientenprobe und ein spezifischer Antikörper
des Hormons, dessen Konzentration man bestimmen will, in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Dieser spezifische Antikörper ist mit einem Rutheniumkomplex markiert. Nach einer Inkubationsphase von einigen Minuten werden Strepatavidin1-beschichtete,
paramagnetische Mikropartikel und biotinylierte Antigene zur Probe gegeben. Aus den
biotinylierten Antigenen und den mit einem Rutheniumkomplex markierten Antikörper
bilden sich Anikörper-Antigen-Komplexe. Diese sogenannten Immunkomplexe binden
sich in weiterer Folge durch Interaktion von Biotin2 und Streptavidin an die Mikropartikel. Nach einer zweiten Inkubationsphase wird das Reaktionsgemisch in die Messzelle
gesaugt. Dort werden die Immunkomplexe mit Hilfe eines Magneten an der Arbeitselektrode angelagert. Nun wird die ECL-Reaktion zwischen den Rutheniumkomplexen
und TPA durch die elektrische Spannung an der Elektrode ausgelöst. Die Lichtstärke,
die dabei produziert wird, verhält sich indirekt proportional zum Antigengehalt in der Patientenprobe.
1
Streptavidin: Von den Bakterien Streptomyces avidinii gebildetes Protein, das wie Avidin eine
hohe Affinität zu Biotin zeigt. Streptavidin wird in Verbindung mit Biotin zur Immobilisierung von Liganden oder Reaktanden verwendet, so z.B. in Immunoassays.
2
Biotin: wasserlösliches Vitamin
9.2. Der Sandwich-Test
Das Sandwich-Prinzip wird bei Analyten mit einem höheren Molekulargewicht verwendet, wie zum Beispiel TSH, Prolaktin, LH und FSH.
Im Gegensatz zum kompetitiven Test besteht das Reagenz beim Sandwich-Test nicht
aus biotinylierten Antigenen, sondern aus biotinylierten Antikörpern des zu bestimmen-
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den Hormons. Wie beim kompetitiven Test enthält auch diese Reagenz rutheniummarkierte Hormonspezifische Antikörper, die gemeinsam mit der Patientenprobe in ein
Reaktionsgefäß pipettiert werden. Während der Inkubationsphase binden sich diese
Antikörper an das in der Probe befindliche Hormon.
Die nächsten Schritte sind beim Sandwich-Test und beim kompetitiven Test gleich.
Streptavidin-beschichtete
paramagnetische
Mikropartikel
werden
in
das
Reaktionsgefäß hinzugefügt, an die sich während der nächsten Inkubationsphase die
biotinylierten Antikörper anlagern. Als Nächstes wird das Reaktionsgemisch mit den
Immunkomplexen in die Messzelle überführt. Die Mikropartikel mit den gebundenen
Immunkomplexen werden mit Hilfe des Magneten an der Arbeitselektrode angelagert.
Schließlich wird die ECL-Reaktion zwischen dem Rutheniumkomplex und dem TPA
durch die elektrische Spannung an der Elektrode ausgelöst.
Anders als beim kompetitiven Test verhält sich die Lichtstärke, die bei der Reaktion im
Sandwich-Test produziert wird, direkt proportional zum Antigengehalt in der Patientenprobe. Die Bewertung und Berechnung der Antigenkonzentration wird mit Hilfe einer
Kalibrationskurve ausgeführt, die mit Kalibratoren bekannter Antigenkonzentration ermittelt wurde.