Untersuchungsprogramm Humangenetik
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Labor Staber Labormedizin Transfusionsmedizin Mikrobiologie/Hygiene Humangenetik Pathologie/Zytologie Onkogenetik Untersuchungsprogramm Humangenetik 2014 www.labor-staber.de Genetische Beratung In einer genetischen Beratung werden persönliche, sowie Daten zur Familie erhoben (Stammbaum). Ergeben sich hieraus Risiken, werden mögliche diagnostische Schritte erläutert und die sich daraus ergebenden Konsequenzen besprochen. Eine genetische Beratung wird empfohlen bei: • Erbkrankheiten in der Familie, • geistigen/körperlichen Entwicklungsauffälligkeiten, • Auffälligkeiten in der Schwangerschaft, • unerfülltem Kinderwunsch, • Blutsverwandtschaft und Kinderwunsch • Zustand nach Aborten oder Totgeburten • familiären Krebserkrankungen (z. B. Brustkrebs, Darmkrebs) • unerfülltem Kinderwunsch, insbesondere vor geplanter IVF- oder ICSI-Therapie, • Fragen der Teratogenität (z. B. Medikamenteneinnahme, Strahlenexposition oder Drogenabusus vor / in der Schwangerschaft), • im Rahmen der Präimplantationsdiagnostik. Vor und nach jeder humangenetischen Diagnostik sollte, bei pränatalen oder prädiktiven Analysen muss laut Gendiagnostikgesetz §10 eine genetische Beratung angeboten werden. Um eine vorherige telefonische Anmeldung und Terminabsprache wird gebeten. 3 Genetische Beratung Labor Dr. Staber und Kollegen Bayern Terminvergabe Augsburg (nur montags) Praxis Dr. Müller-Koch Halderstraße 29 86150 Augsburg 0821-3446513 Bayreuth Labor Dr. Staber Wilhelm-Pitz-Straße 1 95448 Bayreuth 0941-53710 Deggendorf Kinderklinik Perlasberger Straße 41 94469 Deggendorf 0941-53710 Landshut Krankenhaus Landshut-Achdorf Achdorfer Weg 3 84036 Landshut 0941-53710 München Labor Dr. Staber Hofer Straße 15 81737 München 089 630238-0 Nürnberg Labor Dr. Staber Deutschherrnstraße 15-19 90429 Nürnberg 0911944700 Pocking Praxis Dr. Werner Berger Straße 1 94060 Pocking 0941-53710 Regensburg Labor Dr. Staber Bahnhofstraße 13 93047 Regensburg 0941-53710 Weiden Klinikum Weiden – Kinderklinik Söllnerstraße 16 92637 Weiden 0941-53710 Holzmühlenstraße 86 22041 Hamburg 040 6003876-0 Herkulesstraße 34A 34119 Kassel 0561 9188-0 Schönkirchenerstr 78 24149 Kiel 0431 21838-0 Hamburg Labor Dr. Staber Hessen Kassel Labor Dr. Staber Schleswig-Holstein Kiel Labor Dr. Staber 4 Labor Staber Labormedizin Transfusionsmedizin Mikrobiologie/Hygiene Humangenetik Pathologie/Zytologie Onkogenetik Labor Bayreuth Wilhem-Pitz-Straße 1 95448 Bayreuth E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de Telefonzentrale / Büro Telefax 0921 5072045-0 0921 5072045-45 Labor Hof (LG) Telefon Telefax 0921 5072045-0 0921 5072045-45 Labor Dresden-Klipphausen Bremer Straße 9 01665 Klipphausen E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de Telefonzentrale 035204 635-0 Auftragsnachforderung Laborarztpraxis 035204 635-0 Telefax Cito-Platz Telefax Büro 035204 63-555 035204 63-586 DFÜ (analog) 035204 63-535 Labor Potsdam (LG) Wetzlarer Straße 34 14482 Potsdam Telefon Telefax E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de 0331 7049100-0 0331 11710173 Telefonverbindungen 5 Labor Hamburg Holzmühlenstraße 86 22041 Hamburg E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de Telefonzentrale 040 6003876-0 Auftragsnachforderung 040 6003876-0 Bakteriologie Serologie/ Klinische Chemie 040 6003876-16 040 6003876-19 Fahrdienst 040 6003876-17 Telefax 040 6003876-22 DFÜ (analog/ISDN) 040 27886209 Labor Heilbronn Hausanschrift: Postanschrift: Sülmer Straße 60 74072 Heilbronn Postfach 14 63 74004 Heilbronn E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de Telefonzentrale 07131 20375-0 Auftragsnachforderung Klinische Chemie Bakteriologie 07131 20375-0 07131 20375-15 07131 20375-50 Telefax 07131 163911 DFÜ (analog) DFÜ (ISDN) 07131 629988 07131 676170 6 Telefonverbindungen Labor Kassel Hausanschrift: Postanschrift: Herkulesstr. 34a 34119 Kassel Postfach 101 707 34017 Kassel E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de Telefonzentrale 0561 9188-0 Auftragsnachforderung / Befundauskunft Bakteriologie Blutgruppen-Serologie 0561 9188-108 0561 9188-132 0561 9188-123 Fahrdienst 0561 9188-213 Materialwirtschaft 0561 9188-116 0561 9188-212 DFÜ-Bereitstellung / Auskunft 0561 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90429 Nürnberg E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de Telefonzentrale von 7:30 – 19:00 Uhr 0911 94470-0 ab 19:00 Uhr bis Dienstschluss Samstag: von 9:00- 12:00 Uhr 0911 94470–36 0911 94470–16 Telefax DFÜ 0911 94470-41 0911 94470-484 Labor Regensburg (Humangenetik) Bahnhofstraße 13 93047 Regensburg E-Mail: [email protected] Internet: www.labor-staber.de www.genetik-regensburg.de Telefonzentrale 0941 53710 Telefax0941/53708 Telefonverbindungen 9 Inhaltsverzeichnis Genetische Beratung Labor Dr. Staber und Kollegen 4 Untersuchungen nach Fachgebieten geordnet 16 Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“ 21 Zytogenetische Untersuchungen 24 Molekulare Zytogenetik (FISH) 26 FISH bei numerischen Chromosomenaberrationen 26 Pränataler FISH-Schnelltest bei Amniozentese 26 Diagnostik an Mundschleimhautzellen 26 FISH an Urothelzellen zur Diagnostik des Harnblasenkarzinoms (UroVysion™-Test)26 FISH bei strukturellen Chromosomenaberrationen 27 Mikrodeletionen (submikroskopische Deletionen) 27 Translokationen29 Array CGH (Comparative Genomic Hybridisation) 30 Molekulargenetische Untersuchungen 31 ACE-Polymorphismus33 Achondroplasie34 Adrenogenitales Syndrom (21-Hydroxylase-Defizienz) 35 Alpha-1-Antitrypsindefizienz36 Alzheimer-Demenz, familiäre 37 Angelman-Syndrom (AS) 38 Angioödem hereditäres (Serpin G1, C1-Esteraseinhibitor) 40 Antithrombin III (Serpin C1) 41 Apolipoprotein B 42 Apolipoprotein E 43 Azoospermiefaktor44 Catechol-O-Methyltransferase45 CBAVD (congenitale bilaterale Vas deferens Aplasie) 45 Cholinesterase, atypische 46 Chorea Huntington 47 Col1A1-Gen (SP1-Polymorphismus) 48 Cumarin-Sensitivität49 Cytochrom P 450 50 Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Atrophie (DRPLA) 52 DPD-Defizienz siehe 5-Fluorouracil-Sensitivität 52 Ehlers-Danlos-Syndrom (klassischer Subtyp) 53 Faktor V-LEIDEN-Mutation (APC-Resistenz) 54 5-Fluorouracil-Sensitivität (DPD-Defizienz) 55 10 Inhaltsverzeichnis Fragiles-X-Syndrom56 (Martin-Bell-Syndrom, Marker-X-Syndrom) 56 Friedreich'sche Ataxie 57 Fruktoseintoleranz58 Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel59 Glutathion-S-Transferase (M1, P1, T1) 60 Hereditäre Hämochromatose 61 Hereditäre Thromboembolie-Risiken 62 Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv 63 Hyperhomocysteinämie (MTHFR C677T und 64 A1298C-Mutationen) 64 Hypochondroplasie65 IL28B (Interleukin 28B Genotypisierung) 66 Interleukin 1-Polymorphismus 67 Kardiomyopathie, familiär hypertroph 68 Laktoseintoleranz69 Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) siehe SHOX 69 Marfan Syndrom Typ 1 70 Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) siehe SHOX 71 Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) 71 Mittelmeerfieber, hereditäres 72 Morbus Fabry , Alpha-Galactosidase A-Mangel 73 Morbus Meulengracht 74 Morbus Wilson 75 Mukoviszidose (Cystische Fibrose) 76 Muskeldystrophie Typ Duchenne oder Becker 77 Myotone Dystrophie Typ 1 79 Myotone Dystrophie Typ 2 80 N-Acetyltransferase81 Noonan-Syndrom81 Osteoporose siehe Vitamin D-Rezeptor und Col1A1-Gen 82 Pankreatitis, hereditäre (HP) 83 Phenylketonurie84 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor85 Prader-Willi-Syndrom (PWS) 86 Protein C 87 Protein S 88 Prothrombin (Gerinnungsfaktor II) Dimorphismus 89 11 Inhaltsverzeichnis Pyruvatkinase, erythrozytäre 90 RETT-Syndrom90 SHOX-(Short Stature Homeobox) Haploinsuffizienz, Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD), Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) 92 Spinobulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy Syndrom) 93 Spinocerebelläre Ataxien (SCA, Olivopontocerebelläre Atrophien) 94 SCA1, SCA2, SCA3 (Machado-Joseph disease (MJD)), SCA6 und SCA7 94 Taubheit, nicht syndromisch, neurosensorisch, DFNB1 (DeaFNess Typ B1) 95 Thalassämie (alpha) 96 Thalassämie (beta) und Sichelzellanämie 98 Thiopurin-Methyltransferase (TPMT)-Defizienz 99 Vitamin-D-Rezeptor (B/b-Polymorphismus) 100 Hämatoonkologische Erkrankungen 102 Erweiterte Diagnostik 102 Chronisch lymphatische Leukämie, IGHV-Status 116 Chronisch myeloische Leukämie 116 Chronische myelomonozytäre Leukämie / 117 Myelodysplastische Syndrome 117 Januskinase 2 siehe Myeloproliferative Erkrankungen 118 Multiplex-Aberrationsscreening118 Myeloproliferative Erkrankungen 119 Genetische Krebsrisiken 120 Colonkarzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom) 120 Darmkrebsscreening: Septin 9 Test 121 Familiäre adenomatöse Polyposis coli 122 Tumorprotein p53, Li-Fraumeni-Syndrom 123 Mammakarzinom (Familiärer Brustkrebs) 124 Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1) 126 Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN2) 128 MEN2A (Sipple-Syndrom), MEN2B (Wagenmann-Froböse-Syndrom), Familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom (FMTC) 128 Neurofibromatose Typ1 / Morbus Recklinghausen 129 Peutz-Jeghers-Syndrom130 Prostatakarzinom (PCA3) 131 12 Inhaltsverzeichnis HLA-Assoziationen133 Abacavir-Hypersensitivitätsreaktion (HLA-B*5701) 133 Morbus Behcet (HLA-B51) 134 Narkolepsie (HLA-DQB1, HLA-DRB1) 135 Rheumatoide Arthritis (HLA DR4, shared epitope) 136 Seronegative Arthritiden (HLA B27) 137 Zöliakie (HLA DQ2, DQ8) 138 Molekularpathologierkrankungen140 BRAF (B-RAF-Protein) 140 EGFR (epidermal growth factor receptor) 141 HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer)/ Lynch-Syndrom141 KRAS146 Abstammungsdiagnostik147 Vaterschaftssanalyse147 Analyse der Eineiigkeit bei Zwillingen 148 Stichworte in alphabetischer Reihenfolge 149 13 Glossar Array CGH: siehe Artikel Seite 30 Exon: Abschnitt eines Gens, der auf messengerRNA übertragen wird. Haplotyp: Eine Reihe von Allelen an gekoppelten Loci auf einem einzigen Chromosom. Intron: Nichtcodierende DNA, die in einem Gen benachbarte Exons voneinander trennt. MIM-Nummer: Listennummer eines Gens oder eines mendelnden Merkmals, wie sie in der OMIM-Datenbank aufgeführt sind. MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification. Mit ihr lassen sich schon anhand kleinster DNA-Mengen größere Dosisunterschiede an einem zuvor definierten Ort im Genom nachweisen. Dazu zählen Deletionen/Duplikationen einzelner Genabschnitte (Exons), bzw. ganzer Gene. Dieses gendiagnostische Verfahren erlaubt daher ein Screening auf Deletionen oder Amplifikationen in krankheitsspezifischen Genen. Dabei wird ein Sondenpaar (»MLPA-Probes«) an die TemplateDNA hybridisiert. Ihre Sequenzen sind so gewählt, dass sie direkt nebeneinander zu liegen kommen und daher von einer thermostabilen Ligase verknüpft werden können. In einem zweiten Schritt werden die ligierten Sondenpaare dann per PCR amplifiziert. Ist die Zielsequenz mutiert, können sich die Sondenpaare nicht zusammenlagern und es entsteht kein PCR-Produkt. OMIM: Zentrale Datenbank für menschliche Gene und mendelnde Merkmale: Online Mendelian Inheritance in Man (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim) PCR: Ein in vitro-Verfahren zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen mithilfe definierter Oligonucleotid-Primer. Nach ldentifizierung einer zu amplifizierenden Sequenz (die Zielsequenz) stellt man Primer her, die komplementär zu Sequenzen auf den jeweils gegenüberliegenden DNA-Strängen sind und die Zielsequenz flankieren. Das PCR-Verfahren besteht aus Zyklen mit den Schritten Denaturierung, AnIagerung der Primer (annealing) und schließlich DNA-Synthese, bei der die Primer in die neu synthetisierten DNA-Stränge eingehen. Der erste Zyklus führt zu zwei 14 Glossar neuen DNA-Strängen (N), deren 5‘-Enden durch die Positionen der OligonucleotidPrimer festgelegt sind, deren 3‘-Enden aber unterschiedlich sind. Nach dem zweiten Zyklus umfassen die vier neuen Stränge zwei neue Produkte mit unterschiedlichen 3‘-Enden (wie beim ersten Zyklus) und zwei neuen Strängen mit definierten Enden (5‘- und 3‘-Ende). die durch die Primer vorgegeben sind. Nach dem dritten Zyklus haben sechs der acht Stränge die gewünschte Länge, und nach 30 Zyklen sind von dem richtigen Produkt sehr große Mengen vorhanden (Amplifizierung). Penetranz: Häufigkeit, mit der sich ein Genotyp in einem bestimmten Phänotyp manifestiert. Realtime-PCR: Eine Art quantitative PCR, bei der die Reaktionszyklen mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors verfolgt werden. So ist es möglich, mehrere spezifische Nucleinsäuresequenzen zu amplifizieren und gleichzeitig ihre Konzentration zu messen. Uniparenterale Disomie: Wenn bei einer Zelle oder einem Organismus beide Kopien eines bestimmten Chromosoms von nur einem Elternteil stammen. 15 Untersuchungen nach Fachgebieten geordnet MOLEKULARGENETIK Hämatologie Anämie. akut hämolyt. (Gluc-6-P-Dehydrogenase) Anämie, chronisch hämolytische (Pyruvatkinase) a-Thalassämie HBA1-U. HBA2-Gen ß-Thalassämie (HBB-Gen) Sichelzellanämie (HBB-Gen) Hämatonkologische Systemerkrankungen CMML (TET2) B-CLL Prognosemarker (IgHV-Status) Chronisch myeloische Leukämie (BCR-ABL) Myeloproliferatives Syndrom (BCR-ABL) Myeloproliferatives Syndrom (JAK2) Multiplex-Aberrationsscreening (27 Aberrationen) Gerinnungsstörungen Antithrombin (SERPlNC 1-Gen) Faktor V-Leiden Hyperhomocysteinämie (MTHFR-Gen) Plasminogen-Aktivator-Inhibitor PAI Protein C-Mangel (PROC-Gen) Protein S-Mangel (PROS1-Gen) Prothrombin (=Faktor II) (G20210A) 16 Hämatoonkologische Erkrankungen Kardiovaskuläres Risiko / Fettstoffwechsel ACE-Polymorphismus Dysbetalipoproteinämie (Apolipoprotein E) Hypercholesterinämie, LDLRAP1-Gens (ARH-Gen) Hypertrophe Kardiomyopathie Familiäre Hypercholesterinämie ApoB 100 LDL-Rezeptor (LDLR) Fertilitätsstörungen Adrenogenitales Syndrom (AGS-; CYP21A2-Gen, CYP11B1-Gen) Azoospermiefaktor (AZF) CBAVD (Vas deferens-Aplasie) Stoffwechselerkrankungen Adrenogenitales Syndrom (AGS; CYP21A2-Gen, CYP11B1-Gen) Angioödem, hereditäres (SERPING1-Gen, F12-Gen) Alpha-1-Antitrypsin (AAT-Gen) Hämochromatose (HFE-Gen) Hyperhomocysteinämie (MTHFR-Gen) Mittelmeerfieber, familiäres (Marenostrin-Gen) Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) Morbus Fabry (a-Galaktosidase-Gen) Morbus Meulengracht (UGT1A1-Gen) Morbus Wilson (ATP7B-Gen) Pankreatitis, hereditäre (PRSS1-Gen, SPINK1/PSTI-Gen) Phenylketonurie (PAH-Gen) Zystische Fibrose (=Mukoviszidose) Hämatoonkologische Erkrankungen 17 Mentale Retardierung / Dysmorphie-Syndrome Angelman-Syndrom Array CGH-Diagnostik (molekulare Karyotypisierung) Fragiles X-Syndrom (FMR1-Gen: CGG-Expansion) Noonan-Syndrom (PTPN11-Gen) Prader-Willi-Syndrom RETT-Syndrom (MECP2-Gen) Nutrigenetik Fruktoseintoleranz (Aldolase B-Gen) Laktoseintoleranz Zöliakie (HLA-Assoziationen) Neurologische / neuromuskuläre Erkrankungen Alzheimer-Demenz, familiäre, Frühform Chorea Huntington (Huntington-Gen, CAG-Expansion) Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Athrophie (Atrophin 1-Gen) Friedreich'sche Ataxie (FXN-Gen: GAA-Expansion) Kennedy-Disease (Spinobulb. Muskelatrophie; AR-Gen) Muskeldystrophie Duchenne-Becker (DMD-Gen) MyotoneDystrophie Narkolepsie Sensoneurale Schwerhörigkeit (Typ DFNB1; GJB2-Gen, GJB6-Gen) Spinocerebelläre Ataxien (ATXN1-3 u. 7-Gen, CACNA1A-Gen) Pharmakogenetik Abacavir Hypersensitivitätsreaktion(HLA-B*5701) Cholinesterase, atypische Catechol-O-Methyltransferase (COMT) 18 Hämatoonkologische Erkrankungen Cumarin-Sensitivität Cytochrom P450 5-Fluorouracil-Toxizität (DPD-Gen) Glutathion-S-Transferase N-Acetyltransferase (NAT2-Gen) Thiopurin-S-Methylferase (TPMT-Gen) Erkrankungen des Bindegewebes, der Muskulatur u. des Stützapparates Achondroplasie (FGFR3-Gen: G375C, G380R) Hypochrondroplasie (FGFR3-Gen: I539V, N540K) M. Bechterew (HLA B27) M. Behçet (HLA B51) Osteoporose (Vitamin D-Rezeptor und Collagen Typ I a1) Parodontose (Interleukin 1-Polymorphismus) Rheumatoide Arthritis SHOX Haploinsuffizienz (SHOX-Gen) Tumorerkrankungen Darmkrebsscreening (SEPT9) Familiäre adenomatöse Polyposis coli HNPCC Stufendiagnostik Li-Fraumeni-Syndrom (TP53) Mamma-Ca. familiär (BRCA1 und 2) Multiple endokrine Neoplasie Typ 1, 2A, 2B Neurofibromatose Typ 1 (NF1-Gen) PCA3 (Prostata Cancer-Gen3) Peutz-Jeghers-Syndrom (STK11-Gen) Hämatoonkologische Erkrankungen 19 ZYTOGENETIK Konventionelle Chromosomenanalyse MOLEKULARE ZYTOGENETIK (Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Deletionssyndrom 22q11.2 (DiGeorge-Syndrom) Mikrodeletions-Syndrom 1p36 Miller-Dieker-Syndrom 17p13.3 Smith-Magenis-Syndrom 17p11.2 Williams-Beuren-Syndrom 7q11.2 Weitere spezifische Sonden nach Rücksprache Harnblasenkarzinom (FISH) Array-CGH 20 Hämatoonkologische Erkrankungen Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“ Bei der Amniozentese (Fruchtwasserdiagnostik) werden kindliche Zellen aus dem Fruchtwasser gewonnen. Die fetalen Zellen werden in mehreren getrennten Zellkulturen angezüchtet und hinsichtlich numerischer und struktureller Chromosomenanomalien untersucht. Die häufigste numerische Aberration, die zu lebensfähigen Individuen mit geistigen und körperlichen Behinderungen unterschiedlicher Ausprägung führt, ist das Down-Syndrom (Trisomie 21), weniger häufig sind eine Trisomie 13 und 18. Die klinische Bedeutung von Gonosomenaberrationen (Geschlechtschromosomveränderungen) muss individuell diskutiert werden. Das Risiko für ein Kind mit einer Trisomie steigt mit zunehmendem mütterlichen Alter, sodass jede Schwangere über 35 Jahren auf das altersbedingte Risiko hingewiesen werden muss und aufgrund des altersbedingten Risikos eine pränatale Diagnostik angeboten werden sollte. Die Diagnostik wird auch vor dem 35. Lebensjahr ohne Vorliegen eines erhöhten Risikos für Chromosomenanomalien durchgeführt, wenn dies eine Patientin wünscht. Darüber hinaus besteht die Empfehlung zur pränatalen Diagnostik bei: • bekanntem Vorliegen einer Chromosomenanomalie im Karyotyp der Schwangeren oder ihres Partners (Kindsvaters), • einem vorangegangenen Kind mit einer Chromosomenanomalie, • einer familiär vorliegenden Stoffwechselstörung oder einem molekulargenetisch nachweisbaren Gendefekt in der Verwandtschaft, • Ultraschallauffälligkeiten, die auf eine Chromosomenanomalie oder einen Gendefekt hindeuten können, • auffälligen Serumparametern im mütterlichen Blut. Nach einer Amniozentese dauert es in der Regel zwei bis drei Wochen bis das Ergebnis der zytogenetischen Analyse vorliegt. 21 Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“ Neben der chromosomalen Auswertung erfolgt auf Wunsch auch eine Bestimmung des Alpha-Fetoproteins und der Acetylcholinesterase aus dem Fruchtwasser. Auffällige Werte können Hinweis auf Entwicklungsstörungen, wie z. B. einen Neuralrohrdefekt geben. Für Einsendungen von Fruchtwasserproben können Sie das notwendige Versandmaterial bei uns bestellen. In Regensburg bieten wir die Fruchtwasserpunktionen ab der 15. SSW an. Um eine vorherige telefonische Terminabsprache wird gebeten. In Gießen und Friedberg erfolgt die Amniozentese in den Praxen langjährig kooperierender und pränatal spezialisierter Gynäkologen. Die Fruchtwasserentnahme wird in Gießen ab der 14. Schwangerschaftswoche und in Friedberg ab der 15./16. Woche angeboten. Jeder Amnionprobe muss gemäß Gendiagnostik-Gesetz (GenDG) eine von der Patientin unterschriebene Einwilligungserklärung beiliegen. Benötigt werden weiterhin ein gelber und ein weißer Überweisungsschein (Muster 06 und 10). 22 Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“ Pränataler Schnelltest (FISH-Schnelltest) Etwa 90% aller Chromosomenaberrationen, die bei einer pränatalen zytogenetischen Diagnostik gefunden werden, sind numerische Aberrationen der Chromosomen 13, 18, 21, X oder Y. Mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) kann die Anzahl dieser fünf Chromosomen pro Zelle auch in unkultivierten Interphase-Zellen sichtbar gemacht werden. Auf diese Weise lässt sich bereits nach 24 Stunden ermitteln, ob in den Zellen eine Trisomie 13, 18, 21 oder auch eine numerische Aberration der Chromosomen X und Y vorliegt. Hierzu wird von dem Fruchtwasser bis zu 3 ml abgezweigt. Die Mindestmenge für die FISH-Diagnostik hängt von der Schwangerschaftswoche ab. In der 14. Woche ist die Zellzahl im Fruchtwasser noch sehr gering, d. h. hier wird entsprechend mehr Fruchtwasser als in einer späteren Woche benötigt, um genügend Zellkerne für die Auswertung zur Verfügung zu haben. Bei allen Bemühungen um ein schnelleres Ergebnis muss aber auf jeden Fall sichergestellt sein, dass für die konventionelle Chromosomenanalyse eine ausreichende Zahl an Zellen zur Kultivierung zur Verfügung steht. Im Extremfall kann das bedeuten, dass die FISH-Analyse nicht durchführbar ist, oder zu keinem Ergebnis führt, wenn die verfügbare Zellzahl zu gering ist. Eine nachfolgende zytogenetische Analyse ist in jedem Fall zwingend vorgeschrieben, da die FISH-Untersuchung weder strukturelle Aberrationen noch numerische Aberrationen der übrigen Chromosomen erfasst. Auch Zellmosaike mit numerischen Aberrationen der fünf untersuchten Chromosomen lassen sich mit dem FISH-Test nicht sicher nachweisen. Gänzlich ungeeignet für die FISH-Methode ist Fruchtwasser, das mit Blut kontaminiert ist, weil dadurch die Gefahr besteht, dass bei der Auswertung mütterliche Zellen analysiert werden. Bei der Einsendung von Fruchtwasser mit der Anforderung einer Schnelldiagnostik in Hinblick auf numerische Aberrationen der Chromosomen 13, 18, 21, X und Y (FISH-Test) ist zu beachten, dass es sich hierbei um keine Kassenleistung handelt und die Patientin die Leistung, wenn sie diese routinemäßig wünscht, selbst bezahlen muss. Dazu benötigen wir eine von der Patientin unterschriebene Einverständnis- und Kostenübernahme-Erklärung, die zusammen mit dem Fruchtwasser zugeschickt werden müssen. 23 Zytogenetische Untersuchungen Allgemeine Grundlagen zur Zytogenetik Bei zytogenetischen Untersuchungen werden die Chromosomen aus bestimmten Körperzellen (in der Regel Zellen aus Blut, Bindegewebe, Fruchtwasser oder aus Chorionzotten) unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Untersuchungsziel ist die Untersuchung des Chromosomensatzes (Karyotyps) auf zahlenmäßige oder strukturelle Veränderungen. Normale Körperzellen des Menschen enthalten in ihrem Zellkern 46 Chromosomen, in denen sich der Hauptteil der genetischen Information befindet. 44 dieser Chromosomen lassen sich paarweise anordnen. Im weiblichen Geschlecht liegt ein 23. Chromosomenpaar bestehend aus den beiden X-Chromosomen vor, während im männlichen Geschlecht ein X und ein Y-Chromosom zu finden sind. Der unten abgebildete Chromosomensatz zeigt einen normalen männlichen Karyotyp, der mit der Karyotypformel 46,XY beschrieben wird. Folgende Untersuchungen können in unserem zytogenetischen Labor vorgenommen werden: Chromosomenanalysen aus • • • • • Blutlymphozyten Amnionzellen Chorionzotten Fibroblasten (Hautbiopsien) Abortgewebe Zur Chromosomenuntersuchung müssen die Zellen in aller Regel vorher im Labor in einer Zellkultur vermehrt werden. Dazu ist es wichtig, dass das Zellmaterial steril bleibt und ungekühlt innerhalb einer möglichst kurzen Zeit das Labor erreicht (Fruchtwasser und Heparin-Blut spätestens 48 Stunden nach Entnahme, Chorionzotten und Abortgewebe spätestens nach 24 Stunden). Bei Chorionzottenbiopsien bitten wir immer um telefonische Voranmeldung. Vor Feiertagen bitten wir, auch alle anderen Proben für die Zytogenetik anzumelden. 24 Zytogenetische Untersuchungen Blutproben für die Chromosomenanalyse (ca. 5 ml bzw. bei Säuglingen ca. 1-2 ml) bitten wir entweder in unseren vorgefertigten Heparinröhrchen zu verschicken oder ausschließlich mit Natrium-Heparin (Heparin novo oder Liquemin) im Verhältnis 1:10 zu versetzen (bitte kein Ammonium-Heparin, EDTA oder Citrat verwenden). Chorionzottengewebe, Abortmaterial und Fibroblasten sollten steril in den von uns mit Medium vorbereiteten Versandröhrchen verschickt werden. Sofern Sie kein Versandmaterial vorrätig haben, kann ersatzweise sterile Kochsalzlösung verwendet werden, wenn ein rasches Eintreffen in unserem Labor gewährleistet ist. Alle Spritzen und Probenröhrchen sind bitte unbedingt mit dem Namen des Patienten zu beschriften. Bei Kassenpatienten wird ein Überweisungsschein (Nr. 10) benötigt. Eine humangenetische Untersuchung darf nur vorgenommen werden, wenn der Patient / die Patientin von der verantwortlichen ärztlichen Person über Wesen, Bedeutung und Tragweite der genetischen Untersuchung hinreichend aufgeklärt wurde und eine schriftliche Einwilligung des Patienten zur Untersuchung und der Gewinnung der dafür erforderlichen Probe vorliegt. Durchschnittliche Untersuchungsdauer in der Zytogenetik: Chromosomenanalyse aus Fruchtwasser Blutlymphozyten Abortgewebe sonstiges Gewebe Chorionzotten: Direktpräparation Chorionzotten: Langzeitkultur 14 Tage 14-20 Tage 2-4 Wochen 2-4 Wochen 2 Werktage 2-4 Wochen 25 Molekulare Zytogenetik (FISH) Die Technik der „Fluoreszenz in situ Hybridisierung“ (FISH) ermöglicht es, die Anzahl bestimmter DNA-Abschnitte in einzelnen Zellen und deren Position innerhalb der Chromosomen sichtbar zu machen. Damit lassen sich numerische und strukturelle Chromosomenaberrationen näher definieren. FISH bei numerischen Chromosomenaberrationen Pränataler FISH-Schnelltest bei Amniozentese Hierbei werden einzelne Chromosomen in unkultivierten Interphasezellkernen in ihrer Anzahl bestimmt. Für Details zur Methode siehe 2. Amniozentesen. Diagnostik an Mundschleimhautzellen Mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Zellkernen aus Mundschleimhautzellen ist die Untersuchung eines, neben Blutlymphozyten einfach zu gewinnenden, zweiten Zelltyps möglich. Dies dient hauptsächlich zur Abklärung von numerischen Aberrationen der Geschlechtschromosomen bei Verdacht auf ein Zellmosaik. Für die Entnahme fordern Sie bitte vorgefertigte Versandröhrchen im Labor an. Der Versand ins Labor sollte möglichst rasch erfolgen (bitte nicht vor Wochenenden oder Feiertagen verschicken und vor Wärme schützen). FISH an Urothelzellen zur Diagnostik des Harnblasenkarzinoms (UroVysion™-Test) Der Verlust oder Zugewinn ganzer Chromosomen und auch die Deletion oder Duplikation bestimmter Gene ist ein charakteristisches Merkmal von Tumorzellen. In frühen Stadien des Harnblasenkarzinoms lassen sich gehäuft Deletionen in der Chromosomenregion 9p21 nachweisen. Hierbei kommt es zu einem Verlust zweier Tumorsuppressor-Gene p16/INK4a und ARF, die eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellzyklus spielen. Besonders häufig findet man bei Harnblasenkarzinomen auch zusätzliche Chromosomen 3, 7 und 17. Der UroVysion™ FISH-Test (Abbott) enthält DNA-Sonden, die Aneuploidien der Chromosomen 3, 7 und 17 und den Verlust des 9p21-Locus auf einfache Weise an unkultivierten Urothelzellen aus dem Urin der Patienten erkennen lassen. 26 Molekulare Zytogenetik (FISH) Indikationen sind: • weitere Abklärung auffälliger zytologischer Befunde mit Verdacht auf ein Harnblasenkarzinom, • Überwachung von Patienten mit Blasenkarzinom zur frühzeitigen Diagnose von Rezidiven. Material: 50 ml Urin (keinen Morgenurin) in Spezialbehälter mit Konservierungsflüssigkeit (bitte im Labor anfordern). Zur Erhöhung der Zellzahl im Urin empfiehlt sich körperliche Bewegung vor Entleeren der Blase. Ein möglichst rascher Versand ins Labor sollte gewährleistet sein (bitte nicht vor Wochenenden oder Feiertagen verschicken und vor Wärme schützen). FISH bei strukturellen Chromosomenaberrationen Mikrodeletionen (submikroskopische Deletionen) Hierbei gelingt der Nachweis kleinster chromosomaler Deletionen (Stückverluste) bei definierten Syndromen (übergeordneten Krankheitsbildern), die auf konventionelle zytogenetische Weise nicht erkennbar sind. 1p36 Deletions-Syndrom (Mikrodeletion 1p36; OMIM #607872) Die Mikrodeletion 1p36 ist gekennzeichnet durch eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Entwicklungsverzögerung. Die motorische Entwicklung ist dabei häufig weniger beeinträchtigt als die Sprachentwicklung. Darüber hinaus haben viele Patienten u. a. eine Mikrozephalie und Brachyzephalie, faziale Auffälligkeiten (Ohrmuscheldysplasien, tief angesetzte Ohren, tief liegende Augen, Lippen-Kiefer-Gaumenspalten, spitzes Kinn, breite und flache Nasenwurzel), Minderwuchs, Herzfehler, Nierenfehlbildungen, Genitalfehlbildungen sowie Seh- und Hörstörungen. Bisher konnte keine eindeutige Korrelation zwischen dem Ausmaß der jeweiligen Deletion und dem Auftreten einzelner Symptome gefunden werden, so dass eine Prognose für die Entwicklung eines Patienten nur eingeschränkt möglich ist. 27 Molekulare Zytogenetik (FISH) Williams-Beuren-Syndrom (Mikrodeletion 7q11.23; OMIM #194050) Bei dem Williams-Beuren-Syndrom handelt es sich um ein „Contiguous gene“Syndrom, bei dem unterschiedliche, dem Elastin-Gen benachbarte Gene, in die Mikrodeletion 7q11.23 einbezogen sind. Neben dem häufig zu findenden Herzfehler (typisch Aortenstenose) finden sich ein Minderwuchs, eine Muskelhypotonie, sowie eine typische Gesichtsdysmorphie. Mit einer Einschränkung der geistigen Entwicklung muss in der Regel gerechnet werden. Die Sprachentwicklung ist verzögert, die Betroffenen sind jedoch verbal sehr gewandt und kontaktfreudig. Es besteht eine Empfindlichkeit gegenüber lauten Geräuschen, wobei die Betroffenen häufig sehr musikliebend sind. Die Inzidenz des Williams-Beuren-Syndroms wird auf 1:30.000 geschätzt. Smith-Magenis-Syndrom (Mikrodeletion 17p11.2; OMIM #182290) Zu den klinischen Merkmalen des Smith-Magenis-Syndroms (SMS) gehören Brachyzephalie, Mittelgesichtshypoplasie, Prognathie, eine rauhe Stimme, mentale Retardierung, eine Sprachentwicklungsverzögerung mit oder ohne Hörstörungen, Hyperaktivität und ein stereotypes autoaggressives Verhalten. Bei einem Teil der Patienten werden Zeichen einer peripheren Neuropathie sowie signifikante Schlafstörungen beobachtet. Das Smith-Magenis-Syndrom wird durch eine Deletion von 2 bis 9 Megabasen in 17p11.2 verursacht. Das RAI1-Gen innerhalb der kritischen Region scheint dabei für einen Hauptteil der Symptomatik verantwortlich zu sei, da Punktmutationen innerhalb von RAI1 zu einem Smith-Magenis ähnlichen Phänotyp führen können. Die Inzidenz für SMS liegt bei ca. 1:25 000 Geburten. Miller-Dieker-Syndrom (Mikrodeletion 17p13.3; OMIM #247200) Infolge einer Entwicklungsstörung der Großhirnrinde findet man bei allen Patienten mit einem Miller-Dieker-Syndrom eine Lissenzephalie (fehlende oder zumindest unvollständig ausgebildete Hirnwindungen) in Kombination mit typischen fazialen Anomalien (hohe Stirn, bitemporale Eindellungen, prominente Oberlippe). Die Patienten haben eine schwerwiegende mentale Retardierung und leiden häufig an epileptischen Anfällen. Zusätzlich können auch Fehlbildungen des Herzens, der Nieren und des Gastrointestinaltraktes voliegen. Das Miller-Dieker-Syndrom wird durch eine Mikrodeletion in 17p13.3 verursacht. In mehr als 90% der Fälle ist ein Verlust des LIS1-Gens (PAFAH1B1= Platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform 1B, alpha subunit 1 nachweisbar. 28 Molekulare Zytogenetik (FISH) 22q11.2-Deletions-Syndrom (Mikrodeletion 22q11.2; OMIM #188400, #192430) Bei der Verdachtsdiagnose eines 22q11.2-Deletions Syndroms (CATCH22-Syndrom, Velo-Cardio-Faciales Syndrom, Di-George Syndrom) kann eine Mikrodeletion innerhalb der für dieses Syndrom kritischen Chromosomenregion (22q11.2) mit Hilfe einer spezifischen DNA-Sonde (TUPLE 1) nachgewiesen werden. Es handelt sich um eine Mikrodeletion, die unterschiedliche Genabschnitte umfasst. Daher ist die klinische Symptomatik sehr variabel. Symptome des 22q11.2-Deletions-Syndroms können unter anderem eine Sprachentwicklungsverzögerung, charakteristische Gesichtszüge, angeborene Herzfehler (Ventrikel- Septum Defekt, Fallot‘sche Tetralogie u. a.), ein hoher Gaumen, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, eine mehr oder weniger stark ausgeprägte mentale Retardierung, eine Immunschwäche unter Umständen aufgrund einer Thymusaplasie sein. Da das Krankheitsbild auch innerhalb einer Familie sehr variabel sein kann, wird zum Beispiel bei familiär vorliegenden Herzfehlern die Ausschlussdiagnose eines 22q11.2-DeletionsSyndroms empfohlen. Die Abklärung weiterer Mikrodeletionssyndrome kann individuell nach telefonischer Rücksprache erfolgen. Translokationen Zur Abklärung einer Translokation (Stückaustausch zweier Chromosomen) können Lokus-spezifische fluoreszenz-markierte Sonden zytogenetisch eingesetzt werden. Balanzierte reziproke Translokationen Bei Vorliegen einer augenscheinlich balanzierten Translokation wird zum Ausschluss eines komplexeren chromosomalen Umbaus eine komplette Färbung der beteiligten Chromosomen mit so genannten „whole chromosome painting (=wcp)“ Sonden durchgeführt. Derivative Chromosomen Findet sich in der zytogenetischen Analyse ein auffälliges Chromosom, dessen Zusammensetzung mit konventionellen zytogenetischen Methoden nicht vollständig geklärt werden kann, wird eine FISH-Diagnostik durchgeführt. 29 Molekulare Zytogenetik (FISH) Je nach Auffälligkeit können dabei „painting“-Sonden bei Verdacht auf einen innerchromosomalen Umbau oder spezifische DNA-Sonden aus der Subtelomerregion bei Verdacht auf eine unbalanzierte Translokation oder eine telomernahe Deletion eingesetzt werden. Ein neueres Verfahren der molekularen Karyotypisierung erlaubt die Abklärung von Deletionen und Duplikationen mit sehr hoher Auflösung (s. Array CGH). Array CGH (Comparative Genomic Hybridisation) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Bei Kindern mit mentaler Retardierung und zusätzlichen Dysmorphiezeichen führt eine Chromosomenanalyse häufig zu einem unauffälligen zytogenetischen Befund. In der zytogenetischen Analyse sind Deletionen und Duplikationen in der Regel erst ab ca. 5-10 Mb zu erkennen. Weiterführende FISH-Untersuchungen zur Identifizierung submikroskopischer Chromosomenveränderungen bleiben bei Patienten, deren Symptomatik nicht eindeutig auf ein spezifisches Mikrodeletionssyndrom hindeutet, in vielen Fällen ebenfalls ohne Nachweis einer Chromosomenveränderung. Die Array CGH erlaubt einen Nachweis von Imbalancen (Verlust oder Zugewinn kleinerer chromosomaler Abschnitte) mit einer extrem hohen Auflösung (ca. 20 Kilobasen). Bei auffälligen Chromosomenbefunden kann die Array CGH für eine weitere Abklärung und zur genaueren Bestimmung einer Deletion oder Duplikation eingesetzt werden. Methode: Etwa gleiche Mengen genomischer Patienten-DNA und DNA einer gesunden Kontrollperson werden mit unterschiedlichen Fluorochromen (Patienten-DNA mit CY3=rot, Kontroll-DNA mit CY5=grün) chemisch über das Universal-LinkageSystem (ULS, Agilent) markiert und gemeinsam auf einem Subarray (Oligo-Array, Bluegnome) hybridisiert. Durch Messung der Intensitätsverhältnisse der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind Dosisunterschiede, also Deletionen und Duplikationen nachweisbar. Der Nachweis einer Imbalance mit möglicher Relevanz für die Symptomatik des Patienten wird, soweit dies möglich ist, durch FISH mit einer entsprechenden Sonde bestätigt und/oder ggf. über eine Elternuntersuchung weiter abgeklärt. 30 Molekulare Zytogenetik Durchschnittliche Bearbeitungsdauer in der molekularen Zytogenetik Pränataler Schnelltest/Schnelltest Trisomie 21: 24 h (nächster Werktag) bei Eingang bis 16 Uhr Mikrodeletionssyndrome: 2 Tage (nach der Fertigstellung der Chromosomenanalyse) wcp (whole chromosome painting): 2 Tage (nach der Fertigstellung der Chromosomenanalyse) Mundschleimhautzellen (FISH Gonosomen): 1 Woche Array CGH: ca. 2 Monate Molekulargenetische Untersuchungen Im Gegensatz zur zytogenetischen Diagnostik, bei welcher der gesamte Karyotyp eines Patienten analysiert wird, erfordert die molekulargenetische Diagnostik konkrete Hinweise auf das Vorliegen eines bestimmten Gendefektes, um diesen spezifisch mit molekulargenetischen Methoden untersuchen zu können. Grundsätzlich erfordert eine molekulargenetische Untersuchung das Einverständnis des Patienten. Daher bitten wir, die Einverständniserklärung unterschrieben vom Patienten bzw. dessen Erziehungsberechtigten zur Diagnostik mit einzusenden. Das erforderliche Formblatt kann online ausgedruckt werden, oder wird auch gerne von uns zugeschickt. Die angegebenen OMIM-Zahlen beziehen sich auf die Angaben in „Online Mendelian Inheritance In Man“ (OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM/). Die vorangestellten Symbole charakterisieren den Eintrag weiter: Ein Stern * vor der Nummer verweist auf ein Gen. Eine Raute # verweist auf ein beschreibenden Eintrag, in der Regel ein Phänotyp. Ein Pluszeichen + verweist auf ein Gen mit bekannter Sequenz und Phänotyp. 31 Molekulargenetische Untersuchungen – Hinweise Hinweise zu Untersuchungen, die nach Kapitel 11.4.2 EBM abgerechnet werden: Eine molekulargenetische Untersuchung darf erst dann durchgeführt werden, wenn die Indikationsstellung aus den Auftragshinweisen geprüft und beurteilt werden kann. Die Auftragshinweise müssen mindestens folgende Informationen enthalten: • Nachweis über die Aufklärung und Einwilligung des Patienten oder seines gesetzlichen Vertreters zur Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen • Angabe, ob es sich um eine diagnostische, prädiktive oder vorgeburtliche Untersuchung handelt • Angabe zu molekulargenetischen Voruntersuchungen des Patienten in Bezug auf die aktuelle Indikationsstellung • Angabe, ob ein Indexfall bekannt ist; wenn ja, Angabe von molekulargenetischen Vorbefunden • Art des Untersuchungsmaterials und Entnahmedatum • die für die Prüfung des Auftrags erforderlichen klinischen und anamnestischen Angaben Die Untersuchungen dürfen erst dann durchgeführt werden, wenn aus den vollständigen Auftragsunterlagen hervorgeht, dass die im Anhang aufgeführten Kriterien an die Indikationsstellung erfüllt sind. 32 ACE-Polymorphismus Gen: Angiotensin converting enzyme Genort: 17q23 MIM ID: +106180 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Das Angiotensin Converting Enzyme (ACE) ist mit der wichtigste Regulator im Blutdrucksystem, im so genannten Renin-Angiotensin-AldosteronSystem. Das Enzym ACE wandelt das „inaktive“ Angiotensin I in die physiologisch aktive Form Angiotensin II um, das dann in den Erfolgsorganen Herz, Niere und den Gefäßwänden seine stark gefäßzusammenziehende (vasokonstriktorische) Wirkung entfaltet. Parallel wird der Abbau des gefäßerweiternde (vasodilatierende) Gegenspielers Bradykinin verstärkt, was die vasokonstriktorische Wirkung verstärkt. Der Test bestimmt den jeweils vorliegenden Genotyp im ACE-Gen. Damit ist einerseits eine Aussage zum Risiko eines Bluthochdrucks möglich und andererseits ergibt sich aus dem ermittelten Genotyp auch eine Aussage zum individuellen therapeutischen Ansatz. Die homozygote I/I- und meist auch die heterozygote I/D-Konstellation ist therapeutischen Interventionen gut zugänglich. Die homozygote D/D-Konstellation ist mit deutlich höheren und einer Therapie schwer zugänglichen Enzymspiegeln im Blut verbunden. Dies bedeutet ein wesentlich erhöhtes Risiko für einen erhöhten Blutdruck und kardiovaskuläre Erkrankungen Indikation Hypertonie, kardiovaskuläre Erkrankungen – medikamentöse Therapieplanung Mutationen Nachweis von Insertions(I)- und Deletions (D)-Polymorphismus im ACEGen: Genotypen: I/I-, I/D- und D/D Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Die extrahierte genomische DNA wird auf den Insertions-/Deletions-Pomethode lymorphismus im ACE-Gen untersucht. Die spezifischen DNA-Fragmente werden mittels PCR amplifiziert und anschließend durch eine AgaroseGelelektrophorese aufgetrennt. Der Nachweis erfolgt durch Färbung der Fragmente mit Ethidiumbromid und Vergleich mit einem DNA-Längenmarker. Untersuchungs- 3-5 Tage dauer Literaturhinweise Tiret et al., Am. J. Hum. Genet. 51, 197-205, 1992 Singer et al., Cirulation 94, 236-239, 1996 Suehiro et al., Hum. Genet. 115, 91-96, 2004 Molekulargenetische Untersuchungen 33 Achondroplasie FGFR3-Gen (Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor 3) Genort: 4p16.3; OMIM # 100800) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Achondroplasie ist ein disproportioniertes Minderwuchssyndrom. Charakteristische Symptome umfassen vor allem proximal verkürzte Extremitäten, ein groß wirkender Kopf mit prominenter Stirn sowie eine Mittelgesichtshypoplasie mit eingesunkenem Nasenrücken. Die Häufigkeit der Erkrankung wird mit ca. 1:20 000 angegeben. Ursächlich ist eine Entwicklungsstörung des Knorpel- und Knochengewebes, die auf Mutationen im Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-3-Gen (fibroblast growth factor receptor 3=FGFR3) zurückzuführen ist. Obgleich die Achondroplasie autosomal dominant erblich ist, finden sich bei nur ca. 20% der Fälle weitere Betroffenen innerhalb der Familie. Ca. 80 % der Fälle sind auf Neumutationen zurückzuführen, wobei ein Zusammenhang zu einem erhöhten väterlichen Alter beschrieben wurde. Bei etwa 99% der Patienten mit Achondroplasie werden Mutationen im Codon 380 des FGFR3-Gens in der Position 1138 gefunden, die zu einem Aminosäureaustausch von Glycin zu Arginin führen (98% der Fälle zeigen hierbei eine G(1138)A und ca. 1% eine G(1138)C Punktmutation). Weitere, sehr seltene Mutationen (z. B. Ser279Cys, Gly346Glu, Gly375Cys) wurden in der Literatur beschrieben. Indikation Dysproportionierter Minderwuchs mit kurzen Extremitäten, großer Kopf mit typischen fazialen Auffälligkeiten Mutationen G1138A (Gly380Arg), G1138C (Gly380Arg), G1123T (Gly375Cys) Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Exon 10 des methode FGFR3-Gens wird mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Die Exonsequenz wird auf das Vorliegen der G1138A bzw. G1138C Mutation untersucht. Mit der Untersuchung wird zusätzlich auch die seltene G1123T Mutation für den Aminosäureaustausch an Position 375 erfasst. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Rousseau et al., Nature, 371:252- 254, 1994 Ikegawa et al., Hum Genet (3):309- 311, 1996 Shiang et al., Cell 78:335- 342, 1994 34 Molekulargenetische Untersuchungen Adrenogenitales Syndrom (21-Hydroxylase-Defizienz) CYP21A2-Gen (21-Hydroxylase-Gen; Genort: 6p21.3; OMIM # 201910) CYP11B1-Gen (11-Beta-Hydroxylase-Gen; Genort: 8q24.3; OMIM #202010) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Das Krankheitsbild des Adrenogenitalen Syndroms (AGS) wird in etwa 90% aller Fälle durch Mutationen in dem CYP-21-Gen verursacht, die zu einem Verlust der 21-Hydroxylase-Enzymaktivität führen. Als katalytisches Enzym wird 21-Hydroxylase in der Cortisol-Biosynthese benötigt. In seltenen Fällen werden auch Mutationen in anderen Genen z. B. 11 beta-Hydroxylase (CYP11B1), StAR-Gen oder 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase nachgewiesen. Die AGS-Symptomatik wird durch einen Mangel an Cortisol und Aldosteron und durch die vermehrte Synthese von Androgen ausgelöst. Bei dem AGS werden zwei Verlaufsformen unterschieden: das klassische AGS mit und ohne Salzverlust und die mildere Form des „late onset“ AGS. Bei dem klassischen AGS führt ein Androgenüberschuss bereits pränatal bei weiblichen Feten zu einer Virilisierung des äußeren Genitals. Dies kann durch frühzeitige Gabe von Dexamethason zu Beginn der Schwangerschaft verhindert werden, wenn bereits vor einer Schwangerschaft bekannt ist, dass beide Eltern Anlagenträger sind. Zeigt die Pränataldiagnostik, dass es sich um einen männlichen Feten oder einen gesunden weiblichen Feten handelt, kann die Dexamethason-Behandlung beendet werden. Postnatal kann es in den ersten Lebenswochen zu einem lebensbedrohlichen Salzverlust kommen, bei dem im Blut ein Überschuss an Kalium und eine Übersäuerung nachweisbar ist. Eine Hormonkonzentrationsbestimmung im Blut zeigt in diesen Fällen wenige Tage nach Geburt stark erhöhte Werte für 17-Hydroxy-Progesteron. Ohne Behandlung kommt es in den ersten Lebensjahren zu einem verstärkten Größenwachstum. Die Körpergröße im Erwachsenenalter liegt jedoch durch einen vorzeitigen Verschluss der Epiphysenfugen unterhalb der Norm. Sowohl männliche als auch weibliche Patienten zeigen bereits im Kindesalter eine scheinbar vorzeitige Pubertätsentwicklung (Pseudopubertas pracox) und haben eine reduzierte Fertilität. Bei rechtzeitiger Diagnosestellung ist die Symptomatik eines AGS jedoch durch eine lebenslange Hormon-Substitutionstherapie gut behandelbar. Die „late onset“ Form eines AGS zeichnet sich durch einen wesentlich milderen Verlauf aus und wird häufig erst im Erwachsenenalter durch Fertilitätsstörungen wahrgenommen. Bei etwa 30% Patientinnen mit late onset AGS lässt sich eine Cyp21-Genmutation in nur einem Allel (heterozygot) nachweisen. Welche zusätzlichen Faktoren hierbei eine Rolle spielen ist derzeit nicht bekannt. Molekulargenetische Untersuchungen 35 Indikation Bei Verdacht auf ein klassisches oder late-onset AGS (erhöhte 17-Hydroxy-Progesteron Werte im Neugeborenenscreening, Salzverlustsyndrom, intersexuelles Genitale bzw. Mädchen mit Virilisierung, Kinder mit Pseudopubertas praecox); erwachsene Patientinnen mit V. a. late-onset AGS (Hirsutismus, Oligo- oder Amenorrhoe, PCO-Syndrom); Untersuchung des Partners/ der Partnerin und der Geschwister eines AGS-Indexpatienten insbesondere bei Kinderwunsch; pränatal bei bekannter Mutation beider Eltern. Mutationen Innerhalb des CYP21-Gens wurden bisher mehr als 100 Mutationen (Punktmutationen, Deletionen, Insertionen und komplexe Rearrangements) beschrieben. Häufigste Mutationen: große Deletionen, Duplikationen oder Genkonversionen (ca. 20-30%); c.293-13A>G oder c.293-13C>G (splice-site Mutation 19 bp vor dem 3’ Ende im Intron 2, ca. 20%-30%); Ile173Asn (Exon 4: c.518T>A) Material 2-5 ml EDTA-Blut (bei Kindern) Untersuchungs- CYP21: Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Es erfolgt methode eine Untersuchung auf Deletionen mittels MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) und eine Mutationssuche durch vollständige Sequenzierung der kodierenden Bereiche (10 Exons) des CYP21-Gens inklusive der Promotorregion und aller Exon/Intron Grenzen. CYP11B1: PCR und Sequenzierung des kodierenden Genbereichs (9 Exons) sowie des Promotors Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen, bei bekannten Mutationen in der Familie 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Nimkarn and New, in GeneReviews (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1171/) Höppner, Med Genet 16:292-298, 2004; Forest et al., Endocr Res 15:277-301, 1989 Alpha-1-Antitrypsindefizienz PI-Gen (Protease-Inhibitor; Genort: 14q32.1; OMIM *107400) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die Alpha-1-Antitrypsindefizienz ist die häufigste Erbkrankheit der weißen Bevölkerung Alpha-1-Antitrypsin ist ein Inhibitor-Protein, welches als Hauptfunktion eine proteolytische Schädigung des Lungengewebes verhindert. Ein Mangel dieses Proteins führt zu einem gehäuften Auftreten von chronischer obstruktiver Lungenerkrankung und in der Folge zu Emphysemen, die sich im Erwachsenenalter und sehr selten schon im frühen Kindesalter entwickeln. Weitere Komplikationen sind Hepatitis und Leberzirrhose, ca. 18% der Kinder entwickeln Lebersymptome, wie verlängerter Neugeborenenikterus, Hyperbilirubinämie erhöhte Transaminasen oder Hepatosplenomegalie. 36 Molekulargenetische Untersuchungen Die sogenannte Z-Mutation (Aminosäureaustausch von Glutamin in Position 342 zu Lysin) führt in homozygoter Form zu einem schweren Krankheitsbild mit einer resultierenden Protein-Konzentrationserniedrigung von mehr als 80%. Dieser Phänotyp (Proteinase-Inhibitor) PI ZZ tritt mit einer Prävalenz von 1:2000 bis 1:7000 in der kaukasischen Bevölkerung Nordund Mitteleuropas auf. Liegt die Z-Mutation heterozygot vor, entweder in Kombination mit einem normalen Allel (PI MZ) oder mit der sogenannten S-Mutation (Aminosäureaustausch von Glutamin in Position 264 zu Valin) (PI SZ), so führt dies zu einem leichteren Krankheitsbild, bei einer Erniedrigung des Alpha-1-Antitrypsins um nicht mehr als 75% des Sollwertes wird das Lungenemphysem nur durch pulmonale Noxen (Infekte, Rauchen) ausgelöst. In seltenen Fällen findet man „Null-Allele“, von denen kein Alpha-1-Antitrypsin gebildet werden kann, z. B. durch Deletionen, Splice- oder Stopp-Mutationen. Indikation Patienten mit erniedrigten Blutplasmaspiegeln von Alpha-1-AT oder positiver Familienanamnese, Neugeborene und Kinder mit chronischer Hepatitis unklarer Genese Mutationen Z-Mutation: G11940A (Glu342Lys); S Mutation: A9628T (Glu264Val) Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Zwei Abschnitte methode des PI-Gens, die beide Mutationsstellen umfassen, werden mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das Vorhandensein der Mutationen wird durch eine reverse Hybridisierung nachgewiesen. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Perlmutter et al., Sem Liver Dis 18:217- 225, 1998 Braun et al., Eur J Clin Chem Clin Biochem 34:761- 764, 1996 Alzheimer-Demenz, familiäre APP-Gen (Amyloid-Precursor-Protein; Genort: 21q21.3; OMIM *104760) PSEN1-Gen (Presenilin 1; Genort: 14q24.2; OMIM *104311) PSEN2-Gen (Presenilin 2; Genort: 1q42.13; OMIM *600759) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Der Morbus Alzheimer ist durch eine im Erwachsenenalter einsetzende progressive Demenz charakterisiert, welche mit kortikaler Atrophie, Bildung von beta-Amyloid-Plaques und von intrazellulären Neurofibrillen einhergeht. Molekulargenetische Untersuchungen 37 Klinische Bedeutung Zu Beginn steht eine Einschränkung intellektueller Funktionen (Neugedächtnis, räumliche und zeitliche Orientierung, Sprache, Benutzung von Gegenständen usw.), zunehmend geht so die Autonomie verloren. Familiäre Formen sind selten. Von den bekannten Faktoren ist der Genotyp des Apolipoproteins E am wichtigsten. Rein monogene Formen sind noch seltener. Sie treten in der Regel vor dem 60. Lebensjahr auf und werden autosomal-dominant vererbt. Die drei bisher identifizierten Gene kodieren für die Preseniline 1 und 2 und für das Amyloid Precursor Protein. Mutationen des PSEN1-Gens finden sich in 30-70 %, des PSEN2-Gens in weniger als 5% und Mutationen des APP-Gens in 10-15 % der früh einsetzenden familiären Alzheimer Fälle. Weniger als 1% der etwa 400.000 französischen Alzheimer-Patienten haben eine dieser monogenen Formen.. Indikation V. a. erbliche, frühmanifeste primäre Demenz Erkrankung Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Stufendiagnostik: methode 1. Amyloid-Vorläuferprotein-Gen (APP): PCR und Sequenzierung der Exons 16, 17. Duplikationsscreening über MLPA 2. Präsenilin 1 (PSEN1) 3. Präsenilin 2 (PSEN2): PCR und Sequenzierung der jeweils 10 kodierenden Exons. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Sennvik, K. et al., Neurosci. Lett. 278: 169-172, 2000 Stokin, G. B. et al., Science 307: 1282-1288, 2005 Rossi, G. et al., Neurology 63: 910-912, 2004 P. A. Brice, www.orpha.net Angelman-Syndrom (AS) UBE3A (E6-AP-Ubiquitin-Proteinligase; Genort: 15q11-q13; OMIM # 105830, *601623) Erbgang Autosomal-dominant bei maternaler Vererbung; überwiegend sporadische Fälle Klinische Bedeutung In der Chromosomenregion 15q11-q13 befindet sich eine Gruppe von Genen, die dem „genomic imprinting“ unterliegen. Bei imprinteten Genen ist entweder nur das von der Mutter oder nur das vom Vater stammende Allel aktiv, während jeweils von dem zweiten Elternteil ein durch Methylierung inaktiviertes Allel vererbt wird (s. a. Prader Willi-Syndrom). 38 Molekulargenetische Untersuchungen Angelman-Syndrom (AS) ist eine schwere psychomotorische Entwicklungsstörung die durch den Funktionsverlust des mütterlich ererbten UBE3AGens in 15q11.2 ausgelöst wird. Die expressive Sprachentwicklung ist stark eingeschränkt oder fehlt vollständig, während das Sprachverständnis relativ gut ausgebildet ist. Typische Merkmale bei AS-Patienten sind objektiv grundlose Lachattacken und ataktische Extremitätenbewegungen. Epileptische Anfälle und Mikrozephalie und Progenie werden häufig beobachtet. Neurologisch lässt sich ein auffälliges EEG nachweisen. Ein positiver Gentest kann die Verdachtsdiagnose eines Angelman-Syndroms bestätigen, ein Ausschluss ist jedoch nicht möglich. In ca. 70% aller Fälle liegt eine de-novo Deletion im mütterlich ererbten Chromosom 15 im Bereich der Banden q11 bis q13 vor. Eine uniparentale paternale Disomie (beide UBE3A-Allele stammen vom Vater), eine fehlerhafte Methylierung infolge von Imprintig-Center Mutationen oder Mutationen im UBE3A-Gen findet man bei ca. 10% der Patienten. Bei 20% der Patienten mit V. a. AS lässt sich keine Veränderung nachweisen. Differentialdiagnostisch ist in diesen Fällen an AS-ähnliche Krankheitsbilder zu denken z. B. an das Rett-Syndrom (MECP2-Genmutation). Indikation Psychomotorische Retardierung mit fehlender Sprachentwicklung, unmotivierte Lachattacken; epileptische Anfälle, ataktische Bewegungsmuster, auffällige EEG-Werte. Mutationen 70% maternale Deletion 15q11-q13 1% paternale uniparentale Disomie [upd(15)pat] 3% Imprintingdefekt 15% Mutationen im UBE3A-Gen 10% andere Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. methode Stufe 1: Methylierungsspezifische MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) zum Nachweis einer Deletion, eines Imprintingdefektes oder einer paternalen uniparentalen Disomie in 15q11-13. Stufe 2: PCR und Sequenzierung der 9 kodierenden Exons von UBE3A zur Erfassung von Punktmutationen. Untersuchungs- Ca. 2-3 Wochen dauer Literaturhinweise Horsthemke et al., Medgen 22:282-286, 2010 Kishino et al., Nat Genet 15:70-73, 1997 Molekulargenetische Untersuchungen 39 Angioödem hereditäres (Serpin G1, C1-Esteraseinhibitor) C1-Esterase-Inhibitor (C1-INH-Mangel) SERPING1 u. F12-Gen (Genorte: 11q12.1-, 5q35.3; OMIM *606860, *610619) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Angioödeme bezeichnen verschiedene Krankheitsformen, bei denen es rezidivierend zu Ödemen der Haut, seltener auch der Zunge, der Glottis bzw. des Larynx, des Magen-Darm-Trakt und seltener auch anderer Weichteilorgane kommen kann. Unterschiedliche pathogenetische Prozesse werden beschrieben, wobei z. B. eine histaminvermittelte von einer kininvermittelten Genese der Angioödeme unterschieden werden kann. Zum Teil ist die Genese jedoch noch nicht hinreichend geklärt. Das hereditäre Angioödem (HAE) durch C1-Esterase-Inhibitor-(C1-INH)Mangel stellt hierunter ein besonders schweres Krankheitsbild dar, bei dem zahlreiche Erstickungsfällen beobachtet wurden. Gewöhnlich beginnt die Symptomatik im Schulalter, wobei neben den Ödemen eine viszerale Symptomatik mit krampfartigen abdominellen Schmerzen, Erbrechen und Durchfall isoliert auftreten kann. Die meisten Betroffenen können eine kommende Attacke vorhersagen. Diese kann sich durch Stimmungsschwankungen, Angst oder Erschöpfung ankündigen. Auslöser sind zum Beispiel hormonelle Faktoren, Traumen oder emotionaler Stress. Die Inzidenz des HAE wird auf etwa 1:50.000 geschätzt. Unterschieden werden hierbei hauptsächlich 2 Formen: Ca. 85% der Patienten leiden unter einem Synthesedefekt des C1-INH, so dass dieses stark vermindert vorliegt. Dieser Typ wird als HAE Typ I bezeichnet. Üblicherweise findet sich bei diesen Patienten eine Deletion, Insertion oder eine Stop-KodonMutation auf einem Allel des Gens. Eine funktionelle Insuffizienz des C1-INH wird bei etwa 15% der Patienten beobachtet und als HAE Typ II bezeichnet. In diesem Falle wird von dem defekten Allel als Folge eines Aminosäure-Austausches ein dysfunktionelles Protein synthetisiert. Im Plasma finden sich normale oder sogar erhöhter Konzentrationen des C1-INH. Klinisch lassen sich diese beiden Typen jedoch nicht unterscheiden, da in beiden Fällen die C1-Esterase-InhibitorFunktion auf 5-30% der Normwerte reduziert ist. Auch die C4-Spiegel sind erniedrigt, die C3-Konzentrationen dagegen normal. Die klinische Symptomatik des HAE III ähnelt den oben genannten und sind ebenfalls durch rezidivierende Hautschwellungen, schmerzhafte Magen-Darm-Attacken und, selten, lebensbedrohliche Larynxödeme gekennzeichnet. 40 Molekulargenetische Untersuchungen Bei einem Teil der Frauen wird die Symptomatik wie beim hereditären Angioödem durch Cl-Inhibitor-Mangel durch äußerlich zugeführte Östrogene im Rahmen von oralen Antikonzeptiva oder einer hormonalen Substitutionstherapie ausgelöst. Indikation HAE I und HAE II: Differentialdiagnose histaminvermittelter vs. hereditärer Ödeme durch einen angeborenen Mangel an (funkt.) C1-Esterase-Inhibitor, 20% der Patienten mit HAE ohne Familienanamnese. HAE III: V. a. östrogensensitives Angioödem mit unauffälliger Biochemie des C1-Esteraseinhibitors Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- 1. SERPING1: PCR und Sequenzierung der Exons 1-8 und des Promotors, methode Duplikations- und Deletionsscreening mit MLPA 2. F12: vorzugsweise bei Frauen ggf. Untersuchung von Faktor XII bei HAEIII durch PCR und Sequenzierung des Exons 9 Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Davis, A. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 3161-3165, 1986 Zahedi, K. et al., Behring Inst. Mitt. 93: 115-119, 1993. Dewald, G., Bork, K., Biochem. Biophys. Res. Commun. 343: 1286-1289, 2006 Allergo J. et al., 21 (2): 109–118, 2012 Antithrombin III (Serpin C1) SERPINC1 -Gen, Antithrombin III (ATIII; 107300) Genort: 1q23-q25; OMIM # 613118 Klinische Bedeutung Der angeborene Antithrombin III (ATIII)-Mangel stellt eine seltene, autosomal dominant erbliche Ursache der Thromboseneigung dar. Laut Literaturangaben ist in etwa jeder 1:500 bis 1:5000 hiervon betroffen. Insbesondere das Risiko für tiefe Beinvenenthrombosen ist durch einen ATIII-Mangel erhöht, aber auch Fehlgeburten kommen gehäuft vor. Arterielle Thrombosen sind hingegen eher selten. Bei Betroffenen liegt in etwa 80% der Fälle ein quantitativer ATIII-Mangel Typ I vor. Ein qualitativer Mangel vom Typ II, bei dem die Funktion des Proteins gestört ist, ist seltener. Dieser kann bei einem ATIII-Antigentest unentdeckt bleiben. Die AT-III-Aktivität ist bei den meisten Patienten mit einer angeborenen heterozygoten ATIII-Defizienz auf 40-60%.reduziert. Indikation Hereditärer Antithrombin-Mangel, Thrombophilie, Differential-diagnostisch zur Unterscheidung zwischen erworbenem und angeborenem ATIIIMangel Molekulargenetische Untersuchungen 41 Mutationen Der Typ I des ATIII-Mangels wird zumeist durch kurze Deletionen von 1-30 bp Länge oder Insertionen und seltener durch Punktmutationen verursacht, welche als Nonsense-oder Splice-Mutationen imponieren. Typ II des ATIII-Mangels beruht oft auf Missensmutationen, die zum einen die reaktive Domaine (Typ Ia) oder die Heparin-bindende Domaine (Type IIb) betreffen oder an verschiedene Lokalisationen zu pleiotropen Effekten(Typ IIc) führen. Material 2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR, Sequenzierung des SERPINC1-Gens, MPLA methode Untersuchungs- 2-4 Wochen dauer Literaturhinweise Corral J. et al.; Blood 109(10): 4258-4263, 2007 Patnaik M.M. and S. Moll Haemophilia, 14 1229–1239, 2008 Apolipoprotein B APOB-Gen (Apolipoprotein B; Genort: 2p24; OMIM # 144010) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Mit einer Häufigkeit von 1:500 ist die Fam. Hypercholesterinämie (FH) eine der häufigsten monogenen Erkrankungen. Das Apolipoprotein B-100 (ApoB-100) ist ein wesentlicher Bestandteil des LDL-Cholesterins, es beeinflusst die Struktur der LDL-Partikel und die Bindung an den LDL-Rezeptor auf den Hepatozyten. Heterozygote Träger von ApoB-100 Mutationen weisen einen Cholesteringehalt von 200-450 mg/dl auf, bei homozygoten Trägern können die Werte auch höher sein. Die häufigste ApoB-100 Mutation ist die R3500Q-Mutation mit einer Frequenz von 1:500, seltener ist die R3531C-Mutation mit einer Frequenz von 1:3000. Indikation Verdacht auf familiäre Hypercholesterinämie (FH); Blutsverwandte von Patienten mit FH; Hypercholesterinämie unklarer Genese Mutationen Häufigste Mutationen: im APOB-Gen: R3500Q und R3531C Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels methode PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. 42 Molekulargenetische Untersuchungen Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Goldstein, J. L., Brown, M. S.; J. Biol. Chem. 249: 5153-5162, 1974. Hansen, P. S et al.; Arteriosclerosis Thromb. Vasc. Biol. 17: 741-747, 1997. Higgins, M. J. P., Lecamwasam, D. S., Galton, D. J.; Lancet 306: 737-740, 1975. Apolipoprotein E Apolipoprotein E-Gen (APOE; Genort: 19q13.2; OMIM +107741) Erbgang Autosomal-kodominant Klinische Bedeutung Apolipop E ist ein 299 Aminosäuren langes Plasmaprotein und wird in der Leber, dem Gehirn und verschiedenen anderen Zellen synthetisiert. Es besteht ein genetischer Polymorphismus mit drei Allelen, Apo E2, Apo E3 und Apo E4, die sich jeweils nur in einer Aminosäure unterscheiden. Hieraus ergeben sich sechs Genotypen (Apo E2/2 (1%), E2/3 (11%), E2/4 (3%), E3/3 (63%), E3/4 (20%), E4/4 (2%)). Apo E ist Bestandteil verschiedener Lipoproteine (Chylomikronen, VLDL, VLDL-Remnants (IDL) und HDL). Neben Apo B ist Apo E ein Ligand des LDL(Apo B/E)-Rezeptors. Apo E ist relevant für den Stoffwechsel von Chylomikronen und VLDLRemnant-Partikeln. Die Isoform E2 gehört zu den Artheriosklerose Risikofaktoren. Ein Teil der homozygoten Träger entwickeln eine Dysbetalipoproteinämie (Typ III Hyperlipidämie nach Fredrickson). Tritt die Isoform E4 homozygot auf, besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit an Morbus Alzheimer zu erkranken, bei gleichzeitiger Senkung des Erkrankungsalters. Die Häufigkeit des E4-Allels beträgt bei Alzheimerpatienten 30-42%, in Kontrollgruppen dagegen nur 10%. Die genauen Pathomechanismen sind noch ungeklärt. Bei homozygotem und heterozygotem E3-Genotyp besteht ein normales Arteriosklerose-Risiko. Indikation Dyslipoproteinämie, Hypercholesterinämie; Morbus Alzheimer Mutationen Drei Hauptallele bekannt: E2, E3, E4 Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels methode PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Saunders, A.M. et al. (1993); Neurology 43:1467-1472. Davignon J. et al. (1988); Arteriosclerosis 8:1-21 Molekulargenetische Untersuchungen 43 Azoospermiefaktor AZF-a-, AZF-b-, AZF-c- Regionen (Yq11.23; MIM #415000) DAZ-Gen ("Deleted In Azoospermia"; Genort: Yq11; MIM *400003) Erbgang Y-Chromosomal; in der Regel de novo Deletionen; Söhne erben bei erfolgreicher in vitro Fertilisation das deletierte Y-Chromosom mit entsprechenden Konsequenzen für deren Fertilität. Klinische Bedeutung Der Azoospermiefaktor (AZF) beschreibt drei Regionen auf dem langen Arm des Y-Chromosoms, in denen bereits einige Gene lokalisiert wurden, die wahrscheinlich für die Spermatogenese verantwortlich sind. Bisher konnten bei 66% der Männer mit Azoospermie oder schwerer Oligozoospermie und bei ca. 7,3% der infertilen Männer de novo Mikrodeletionen in der AZF Region (AZF a-c) nachgewiesen werden. Durch die Untersuchung von 8 ausgewählten STS-Loci lassen sich mehr als 90% aller Deletionen innerhalb der drei AZF-Regionen nachweisen. Deletionen außerhalb dieser Regionen sind mit dieser Untersuchung nicht erkennbar. Bei der Mehrzahl dieser Fälle kann molekulargenetisch eine Deletion der gesamten AZFc Region nachgewiesen werden, die zum Verlust aller 4 Kopien des DAZ-Gens (Deleted in Azoospermia) führt. Klinische Bedeutung Durch die Untersuchung von sechs ausgewählten STS-Loci plus zwei Kontroll-Loci lassen sich mehr als 90% aller Deletionen innerhalb der drei AZFRegionen nachweisen. Deletionen außerhalb dieser Regionen sind mit dieser Untersuchung nicht erkennbar. Indikation Infertilität aufgrund von nicht-obstruktiver Azoospermie, Kryptozoospermie oder Oligozoospermie. Eine Indikation zum Deletionsscreening bieten in erster Linie Patienten, die sich einer Intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) unterziehen werden. Mutationen Deletionen in den 3 Abschnitten der AZF-Region (AZF a, b und c) Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Anschließend methode werden acht Regionen mittels zweier getrennter Multiplex-PCR Ansätze amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte werden über eine Gelelektrophorese analysiert. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Simoni et al., Int J of Androl 27:240-249, 2004; Simoni et al., Int J of Androl 22:292-299, 1999; Vogt et al., Hum Mol Genet 5:933-943, 1996 44 Molekulargenetische Untersuchungen Catechol-O-Methyltransferase COMT-Gen (Catechol-O-Methyltransferase; Genort: 22q11.21; OMIM Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Das Phase II-Enzym COMT katalysiert die Übertragung von Methylgruppen auf endogene und exogene Catecholamine und ist damit Teil des Katecholamin- und des Fremdstoffmetabolismus. Das Enzym ist maßgeblich am Abbau von Neurotransmittern wie Dopamin und Noradrenalin beteiligt, wodurch die verfügbare Menge dieser Stoffe im Körper reguliert wird. Es wird daher angenommen, dass COMT-Gen-Polymorphismen für die Entstehung von psychischen Erkrankungen wie Angststörungen, Schizophrenie, ADHS etc., mitverantwortlich sein könnten. Indikation Verdacht auf gestörten Catecholamin-Metabolismus Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Genotypisierung methode Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Gogos, J. A. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 9991-9996, 1998 Alsobrook, J. P. et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiat. Genet.) 114: 116-120, 2002 CBAVD (congenitale bilaterale Vas deferens Aplasie) CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; Genort: 7q31.2; OMIM #277180, *602421) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Durch die große phänotypische Variabilität der Mukoviszidose (Cystische Fibrose = CF) werden auch zunehmend atypische Formen bekannt. Eine der häufigsten Sonderformen der CF stellt die CBAVD dar, welche man bei infertilen, sonst „gesunden“ Männern ohne klinische Zeichen von CF beobachten kann. Bei den meisten Fällen (ca. 87%) der CBAVD ohne Nierenbeteiligung lassen sich Mutationen in einem oder beiden Allelen des CFTR-Gens nachweisen. Indikation Männliche Infertilität unklarer Genese Mutationen In der Regel Kombination einer schweren und einer milden CFTR-Mutation oder Kombination zweier milder Mutationen Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Anschließend wermethode den die relevanten Sequenzbereiche mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) arnplifiziert. Molekulargenetische Untersuchungen 45 Untersuchungs- Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebunmethode dene allelspezifische Sonden bzw. unter Verwendung des „Oligo-LigationAssays“ (OLA-Methode, Abbott). Untersuchungs- Ca. 5-8 Tage dauer Literaturhinweise Holsclaw et al., J Urol 106:568- 574, 1971 ; Stuhrmann, Reproduktionsmedizin 14:5465, 1998; Stuhrmann-Spangenberg et al., Medgen 21:268-275, 2009 Cholinesterase, atypische BCHE-Gen (Butyrylcholinesterase; Genort: 3q26.1; OMIM +177400) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Ein Butyrylcholinesterase (BChE)-Mangel verursacht eine Verzögerung im Metabolismus von z. B. der Muskelrelaxantien Suxamethonium oder Mivacurium und gewisser Lokalanästhetika (z. B. Procain). Postoperativ kann dies zu einer verlängerten Apnoe führen. Die Dauer der Apnoe variiert abhängig vom Ausmaß des Enzymdefektes erheblich. Zwischen 3,4 und 4% der europäischen Bevölkerung haben haben einen partiellen Mangel, der zu leicht verlängerter Apnoe (5 Minuten bis 1 Stunde) führt. Eines von etwa 2.500 Individuen hat eine auf mehr als 1 Stunde verlängerte Apnoe. Bei BChE-Aktivitäten unterhalb der Nachweisgrenze dauern die Apnoen mehr als 8 Stunden. Die Prävalenz dieser schwersten Form wird auf 1:100.000 geschätzt. Der BChE-Mangel kann durch erbliche und/oder nicht-erbliche Ursachen bedingt sein. Der genetisch bedingte Mangel, mit Mutationen im BCHEGen, wird autosomal-rezessiv vererbt. Ein nichterblicher BChE-Mangel kann während der Schwangerschaft, bei Neugeborenen oder auch z. B. bei chronischen Infektionen, Mangelernährung, Lebererkrankungen und Malignomen auftreten. Die Betroffenen zeigen keinerlei klinische Symptomatik, solange sie nicht mit den oben genannten Medikamenten behandelt werden. Indikation Erniedrigte Cholinesterase-Aktivität, verringerte Dibucain- bzw. Fluoridzahl, verlängerte neuromuskuläre Blockade bzw. Apnoe nach Gabe von Muskelrelaxantien z. B. Succinylcholin, Vecuronium, Pancuronium Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 4 Exons methode Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Rubinstein, H. M.et al., J. Clin. Invest. 49: 479-486, 1970 Weinshilboum, R., New Eng. J. Med. 348: 529-537, 2003 Yen, T. et al., Clin. Chem. 49: 1297-1308, 2003 De Lonlay P., www.orpha.net 46 Molekulargenetische Untersuchungen Chorea Huntington HTT-Gen (Huntingtin-Gen; Genort: 4p16.3; OMIM #143100, *613004) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Chorea Huntington ist eine neurodegenerative Erkrankung mit autosomal dominantem Erbgang. Die Inzidenz beträgt 4-7:100.000. Charakteristisch ist ein progressiver Krankheitsverlauf mit Hyperkinesien, die sich später zu choreatiformen Bewegungsstörungen entwickeln können. Hinzu kommen Persönlichkeitsveränderungen bis hin zur Demenz. Neuropathologisch beobachtet man eine Degeneration von Neuronen, die präferentiell im Corpus striatum und im Cortex auftritt. Das für die Erkrankung verantwortliche Huntingtin-Gen beinhaltet bei Normalpersonen 10-35 aufeinander folgende CAG-Nukleotide im kodierenden Bereich, die im Huntington-Protein als Glutaminreste erscheinen. Bei Patienten mit klinischen Symptomen der Chorea Huntington findet man in nahezu 100% der Fälle eine pathologische Verlängerung dieser Nukleotidfolge auf 36-121 CAG-Tripletts. Nukleotidverlängerungen von 27-35 Tripletts werden als „Intermediärallele“ („mutable normal allel“) bezeichnet. Hierbei besteht für den Träger kein Erkrankungsrisiko, aber in der Folgegeneration kann es zu einer Expansion der Triplettrepeat-Region kommen. Huntingtin-Allele mit 36-39 Tripletts haben eine reduzierte Penetranz, da es Personen aus Chorea HuntingtonFamilien gibt, die mit dieser Triplettzahl bis ins hohe Alter keine Symptome der Erkrankung zeigen, während andere mit dieser Triplettzahl erkrankt sind. Überwiegend liegt das Manifestationsalter zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr. Je größer die Anzahl der Glutamine, desto stärker wird die Ausprägung des Krankheitsbildes und/oder desto früher beginnt die Erkrankung. Bei erkrankten Kindern findet man z. B. mehr als 70 Tripletts. In der Regel kann jedoch keine Aussage über das voraussichtliche Erkrankungsalter getroffen werden. Eine prädiktive molekulargenetische Diagnostik sollte im Rahmen der IHA(International Huntington‘s Association) und der WFN- (World Federation of Neurology) Richtlinien erfolgen. Diese lauten: • Zunächst sollte der Ratsuchende eine genetische Beratung durch einen Facharzt erhalten. •Daneben sollte eine psychotherapeutische Betreuung gewährleistet sein. • Vor Untersuchungsbeginn und Befundmitteilung muss der Betreuer bestätigen, dass der Ratsuchende nach ausreichender Bedenkzeit auch auf eine ungünstige Befundmitteilung vorbereitet ist. • Das Ergebnis wird vom genetischen Berater mitgeteilt. Auf Wunsch des/ der Ratsuchenden kann dies im Beisein des Betreuers oder einer anderen Vertrauensperson geschehen. Molekulargenetische Untersuchungen 47 Klinische Bedeutung Eine pränatale Untersuchung hinsichtlich Chorea Huntington darf laut Gendiagnostikgesetz §15 nicht durchgeführt werden. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein Abschnitt des methode Huntingtin- Gens, der die CAG-Triplettwiederholung beinhaltet, wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Die Längenbestimmung des PCR- Produktes und die Ermittlung der daraus resultierenden Anzahl der CAG-Nukleotidtripletts erfolgt mittels Kapillarelektrophorese. Untersuchungs- Ca. 2 Wochen dauer Literaturhinweise McNeil et al., Hum Mol Genet 6:775-779, 1997 Rubinsztein et al., Am J Hum Genet 59:16-22, 1996 Gellera et al., Am J Hum Genet 59:475-477, 1996 The Huntington‘s Disease Collaborative Research Group, Cell 72:971-983, 1993 Col1A1-Gen (SP1-Polymorphismus) COL1A1-Gen Genort: 17q21,31-q22; MID: # 166200, +120150 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die Osteoporose ist definiert als Untergang bestimmter Knochenanteile (Demineralisierung), wobei auch genetisch bedingte Formen (50-80% der Fälle) bekannt sind. Vor allem bei jüngeren Betroffenen muss nach Stoffwechselerkrankungen und/oder einer hormonellen Regulationsstörung gesucht werden. Ungefähr 75% der an einer Osteoporose Erkrankten weisen Veränderungen im Collagen A- und/oder im VDR-Gen auf. Da das Typ I-Collagen das im Knochen mengenmäßig am stärksten vertretene Strukturprotein darstellt, beeinflussen Mutationen oder veränderte Transkriptionsraten dieser Genfamilie die Knochendichte. Eine Heterozygotie bedingt eine leichtere und die Homozygotie eine deutlich erhöhte Neigung zur Osteoporose. Die Ausprägung zeigt sich im Regelfall verstärkt im weiblichen Geschlecht. Indikation V. a. Osteoporose Mutationen Der Sp1- oder Ss-Polymorphismus (PM) im COL1A1-Gen wird durch einen G>T-Austausch an der Bindestelle des Transkriptionsfaktors Sp1 im ersten Intron des Gens verursacht und führt zu den Genotypen: G/G → SS-PM, G/T → Ss-PM bzw. T/T → s/s-PM. Da das s-Allel mit einer deutlich verminderten Knochendichte assoziiert ist, besitzen homozygote ss-Anlageträger ein erhöhtes und heterozygote Ss-Patienten ein mittleres Risiko für die Entwicklung einer Osteoporose und/oder für Knochenbrüche Material 2-5 ml EDTA-Blut 48 Molekulargenetische Untersuchungen Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereich mittels PCR methode amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 4-6 Tage nach Probenerhalt dauer Literaturhinweise Grant et al., Nature Genetics 14, 203-206, 1996 Uitterlinden et al., New Engl J Med 338, 1016-1021, 1998 Cumarin-Sensitivität VKORC1-Gen (Vit. K-Epoxid-reductase-complex; Genort: 16p11.2; OMIM *608547) CYP2C9-Gen (Cytochrome P450 Subfamily IIC, Polypeptide 9; Genort: 10q23.33; OMIM *601130) Klinische Bedeutung Die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) spielt eine wichtige Rolle für den Vitamin K Stoffwechsel und ist der eigentliche Angriffspunkt von Cumarinen. Ein genetischer Polymorphismus der Nähe des VKORC1 Gens (VKORC1-1639G>A) hat einen starken Einfluss auf die individuelle Cumarin Dosis. Das Cytochrom CYP2C9 ist für den Abbau von Cumarinen verantwortlich. Neben der normalen Variante des CYP2C9 Gens, die als CYP2C9*1 bezeichnet wird, sind in Europa auch zwei häufige Varianten mit verringert Aktivität bekannt (CYP2C9*2 und CYP2C9*3). Träger dieser Varianten benötigen geringere Dosen von Cumarinen, um einen therapeutisch wirksamen Spiegel aufrechtzuerhalten Indikation Verdacht auf Therapieresistenz bzw. Überdosierung mit Cumarin Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Genotypisierung methode Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Ross, K. A. et al., J. Hum. Genet. 55: 582-589, 2010 Rieder, M. J. et al., New Eng. J. Med. 352: 2285-2293, 2005 Rost, S. et al., Nature 427: 537-541, 2004 Molekulargenetische Untersuchungen 49 Cytochrom P 450 CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A5, CYP4F2, CYP19A1 Klinische Bedeutung Cytochrome P450 (CYP) kommen ubiquitär vor, sind also bei praktisch allen lebenden Organismen wie Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien nachweisbar. Beim Menschen sind CYP vor allem in der Leber zu finden, aber auch im Darm, den Nieren und der Lunge. Dabei sind die Enzyme in der Mem­ bran des endoplasmatischen Retikulums im Innern der jeweiligen Zellen lokalisiert. Cytochrome P450 sind Chromoprote­ine, die aus etwa 500 Aminosäuren bestehen und Häme (Komplexverbindungen aus einem Porphyrin-Molekül und einem zentralen Eisenion) als prosthetische Gruppe enthalten. Diese bildet das aktive Zentrum, in dem die katalytische Reaktion stattfindet. Viele schwer wasserlösliche Stoffe, zum Beispiel zahlreiche Medikamente, werden in der Leber über den Prozess der Biotransformation abgebaut. Diese verläuft in zwei Phasen: Zuerst werden die Stoffe in den sogenannten Phase-I-Reaktionen durch Oxidation, Reduktion, Hydrolyse oder Hydratation mit einer polaren Gruppe versehen und so hydrophiler gemacht. Die entstehenden Verbindungen werden in den sich anschließenden Phase-IIReaktionen mit körpereigenen Stoffen wie Glucuronsäure konjugiert und dann über Nieren oder Galle ausgeschieden. Einige Cytochrome P450, zum Beispiel CYP2D6 und CYP2C19, weisen eine große genetische Variabilität auf. Bei den codierenden Genen treten also häufiger Polymorphismen auf, die zu stärker beziehungsweise schwächer aktiven oder funktionslosen Varianten der Enzyme führen. Aus den jeweils vorliegenden genetischen CYP-Varianten eines Patienten wiederum lässt sich sein sogenannter Metabolisiererstatus ableiten, also die Geschwindigkeit, mit der er die entsprechenden pharmazeutischen Wirkstoffe verstoffwechseln kann. So werden für CYP2D6 vier Typen von Metabolisierern unterschieden: Langsame Metabolisierer (etwa 7% der Bevölkerung) besitzen zwei nicht funktionelle Allele des CYP2D6-Gens. Es wird kein Protein gebildet und der Metabolismus verläuft extrem langsam. Bei Gabe der Standarddosierung kann es daher zu Nebenwirkungen kommen, da sich der Wirkstoff anreichert. Oder aber die Wirksamkeit der Therapie ist nicht ausreichend, wenn es sich bei dem Medikament um ein Prodrug handelt, das erst durch die Biotransformation in seine aktive Wirkform umgewandelt werden muss. Intermediäre Metabolisierer (etwa 5 bis 10% der Bevölkerung) besitzen ein nicht und ein eingeschränkt funktionelles Allel. Medikamente werden daher mit reduzierter Aktivität verstoffwechselt. Extensive (»normale«) Metabolisierer (etwa 80% der Bevölkerung) besitzen ein oder zwei voll funktionsfähige Allele. Bei ultraschnellen Metabolisierern (etwa 2 bis 3% der Bevölkerung) sind aufgrund einer Genamplifikation drei oder mehr Kopien funktionsfähiger Gene vorhanden. Sie bauen Arzneimittel so schnell ab, dass die Standarddosis kaum wirken kann. 50 Molekulargenetische Untersuchungen Auswahl von Wirkstoffen, die als Substrate der Enzyme CYP2D6, CYP2C9 oder CYP2C19 dienen CYP2D6 CYP2C9 CYP2C19 Antiarrhythmika (z. B. Flecainid) NSAR und Coxibe (z. B. Diclofenac, Ibuprofen, Celecoxib, Meloxicam) Protonenpumpenhemmer (Lansoprazol, Omeprazol, Pantoprazol, Rabeprazol) Antidepressiva (z. B. Amitriptylin, Clomipramin, Fluoxetin, Venlafaxin) Orale Antidiabetika (z. B. Glibenclamid, Tolbutamid) Antiepileptika (z. B. Diazepam, Phenytoin) Antipsychotika (z. B. Haloperidol, Perphenazin, Risperidon) Angiotensin-II-Blocker (Losartan, Irbesartan) Antidepressiva (z. B. Amitriptylin, Citalopram, Clomipramin) Betarezeptorenblocker (z. B. Carvedilol, Metoprolol, Propranolol) weitere Wirkstoffe (z. B. Amitriptylin, Fluvastatin, Tamoxifen, Warfarin) Malariamittel (Proguanil) Opioide (z. B. Codein, Oxycodon, Dextromethorphan, Tramadol) weitere Wirkstoffe (z. B. Cyclophosphamid, Indometacin, Nelfinavir, Progesteron, Propranolol, Moclobemid) weitere Wirkstoffe (z. B. Chlorpromazin, Metoclopramid, Ondansetron, Tamoxifen) Quelle: Flockhart DA. Drug Interactions: Cytochrome P450 Drug Interaction Table. Indiana University School of Medicine (2007) Indikation Diskrepanz Medikamentendosierung und Serumspiegel, fehlende Medikamentenwirkung, unerwartete Nebenwirkungen (UAW), Dosisanpassungen Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR, Genotypisierung, Auftragsspezifikation durch Medikamentenangabe methode Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Nelson, D. R. et al., Pharmacogenetics 6: 1-42, 1996 Blaisdell, J. et al., Pharmacogenetics 12: 703-711, 2002 Wrighton, S. A. et al., Arch. Biochem. Biophys. 306: 240-245, 1993 Molekulargenetische Untersuchungen 51 Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Atrophie (DRPLA) DRPLA-Gen / ATN1-Gen (Atrophin 1-Gen; Genort: 12p13.31; OMIM #125370, *607462) Erbgang Autosoma-dominant Klinische Bedeutung Diese neurodegenerative in westlichen Ländern sehr selten auftretende Erkrankung betrifft überwiegend die japanische Bevölkerungsgruppe. Der Erbgang ist autosomal dominant und überlappt klinisch mit der Chorea Huntington. Das Symptomspektrum kann innerhalb einer Familie sehr variabel sein, es umfasst Myoklonus-Epilepsie, Ataxie, Choreoathetose und Demenz bei fortgeschrittener Erkrankung. Neuropathologisch wird eine kombinierte Degeneration des dentatorubralen und pallidoluysialen Systems des ZNS beobachtet. Das Manifestationsalter liegt vorwiegend in der zweiten Dekade. Die Krankheit folgt dem Phänomen der sogenannten genetischen „Antizipation“, d. h. in aufeinanderfolgenden Generationen kommt es, insbesondere bei Vererbung über den Vater, zu immer früherer Krankheitsmanifestation. Molekulargenetisch kann eine CAG-Triplett-Verlängerung im kodierenden Bereich des verantwortlichen Atrophin-1- Gens nachgewiesen werden. Normale Wiederholungen von 7 bis 35 CAG- Einheiten expandieren zu 48 bis 93 Tripletts und führen im entsprechenden Protein zu einer pathologischen verlängerten Abfolge von PolyglutaminResten. Indikation Vorliegen einer DRPLA-entsprechenden neurologischen Symptomatik Mutationen CAG-Trinukleotidexpansion auf 48 bis 93 Repeats Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe (ca. 2 ml EDTA-Blut) wird die genomische DNA isomethode liert. Ein den CAG-Triplett-Bereich beinhaltender Abschnitt des AtrophinGens wird mir Hilfe der PCR-Reaktion aus der genomischen DNA amplifiziert. Zur Bestimmung der Triplett-Länge wird eine Kapillarelektrophorese des PCR-Produkts durchgeführt. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Naito et al., Neurology 32:798- 807, 1982 Nagafuchi et al., Nat Genet 6:14- 18, 1994 Komure et al., Neurology 45:143- 149, 1995 Wood et al., J Cell Biol. 150(5):938- 948, 2000 DPD-Defizienz siehe 5-Fluorouracil-Sensitivität 52 Molekulargenetische Untersuchungen Ehlers-Danlos-Syndrom (klassischer Subtyp) EDS Typ I und II (COL5A1, Collagen V, alpha 1; Genort: 9q34.2-q34.3; COL5A2, Collagen V, alpha 2; Genort: 2q31; OMIM #130000, *120215, *120190) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Ehlers-Danlos-Syndrom ist eine heterogene Gruppe von genetisch bedingten Bindegewebserkrankungen infolge einer Störung der Kollagenbiosynthese oder Kollagenvernetzung. Gemeinsame Kennzeichen sind die Hyperelastizität der Haut mit erhöhter Zerreissbarkeit, eine Überstreckbarkeit der Gelenke, sowie die Neigung zu Hämatombildungen bis hin zu Rupturen der inneren Organe und der Gefäße. Nach der „Villefranche-Klassifikation“ (s. Beighton et al., 1998) wurde das Ehlers-Danlos Syndrom in sechs Haupttypen unterteilt. Diese Subtypen unterscheiden sich in den für die Erkrankung verantwortlichen Genen. Eine klare Abgrenzung zwischen den einzelnen Subtypen aufgrund der Symtomatik ist durch die hohe phänotypische Variabilität der Erkrankung of schwierig. Durch eine elektronenmikroskopische Untersuchung des Bindegewebes aus einer Hautbiopsie gelingt häufig die Zuordnung aufgrund spezifischer Veränderungen der Kollagenfibrillen. Der molekulargenetische Nachweis eines Gendefektes erlaubt ebenfalls eine eindeutige Typisierung und ermöglicht zum anderen eine gezielte Untersuchung von Familienangehörigen und gegebenenfalls eine Pränataldiagnostik. Etwa 80% der Patienten mit Ehlers-Danlos-Syndrom weisen den „klassischen“ Subtyp (ehemals EDS Typ I und II) auf. Das Krankheitsbild ist gekennzeichnet durch eine starke Überdehnbarkeit und leichte Verletzbarkeit der Haut mit Neigung zu Hämatombildung auf, eine abnorme Wundheilung und eine atrophe Narbenbildung („ZigarettenPapier Narben“). Die Gelenke zeigen eine Hypermobilität und sowohl Gefäße als auch innere Organe können ebenfalls betroffen sein. Typ II unterscheidet sich von Typ I nur durch einen milderen Grad der Ausprägung. Bei etwa 50% der Patienten mit einem klassischen Typ des Ehlers-Danlos-Syndroms sind Mutationen im COL5A1-Gen oder im COL5A2-Gen nachweisbar, die zu einer verminderten Bildung oder der Bildung von funktional defektem Typ 5 Kollagen führen. Mehr als 80% der gefundenen Mutationen betreffen das COL5A1-Gen. Neumutationen und ererbte Mutationen sind dabei jeweils zur Hälfte vertreten. In Einzelfällen wurden auch Mutationen im COL1A1-Gen nachgewiesen. Indikation Klinischer Verdacht auf ein Ehlers-Danlos-Syndrom Typ I oder II. Mutationen Punktmutationen innerhalb von COL5A1 und COL5A2 Material 2-5 ml EDTA-Blut Molekulargenetische Untersuchungen 53 Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird genomische DNA isoliert und alle Exons des jemethode weiligen Kollagen-Gens einschließlich der Exon/Intron-Spleissstellen amplifiziert. Die Mutationssuche erfolgt durch direkte DNA-Sequenzanalyse der Amplifikationsprodukte. Untersuchungs- Ca. 8-12 Wochen, bei bekannter familiärer Mutation 2 Wochen dauer Literaturhinweise Wenstrup and De Paepe, in GeneReviews (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1244/) Malfait et al., Genet Med 12:597-605, 2010; Richards et al., J Med Genet 35:846-848, 1998; Beighton et al., Am J Med Genet 77:31-37, 1998 Faktor V-LEIDEN-Mutation (APC-Resistenz) Faktor V-Gen (Genort: 1q23; MIM +227400) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Der bislang am häufigsten beschriebene genetisch bedingte Risikofaktor für Thrombose ist die Resistenz gegen aktiviertes Protein C (APC). Bei der zugrundeliegenden Mutation (die sog. Faktor V-LEIDEN-Mutation) handelt es sich um einen Basenaustausch (G → A) an Position 1691 im Faktor V- Gen. Dieser führt zu einem Aminosäurenaustausch von Arginin an Position 506 zu Glutamin im Faktor V-Protein, wodurch die Inaktivierung des Gerinnungsfaktors V durch APC vermindert ist. Die hohe Prävalenz dieser Mutation in der kaukasischen Bevölkerung führt dazu, dass etwa jeder Zwanzigste heterozygoter Mutationsträger ist und nach bisherigen Berechnungen ein ca. 5-10fach erhöhtes Thromboembolierisiko hat. Ca. 60% der Patienten mit einer familiär gehäuften Neigung zu Venenthrombosen zeigen diesen Defekt in heterozygoter Form. Sehr selten findet sich eine Homozygotie, die das Thromboembolierisiko um bis zu 80fach erhöht. Rund 15-25 Prozent aller Träger einer Faktor-V-LEIDEN-Mutation tragen zusätzlich eine Mutation im Faktor-II-Gen. Es erscheint daher sinnvoll, im Fall einer FaktorV-Überprüfung parallel eine Faktor-II-Austestung zu veranlassen. Indikation Siehe Heriditäre Thrombose-Risiken Mutationen G1691A-Mutation Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA wird ein Abschnitt des Faktor V-Gens, der den methode Mutationsort beinhaltet, mittels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 2-4 Tage dauer Literaturhinweise Bertina et al., Nature 369:64- 67, 1994; De Stefano et al., Semin Thromb Hemost 24:367379, 1998; Rosendaal , Blood 85:1504- 1508, 1995; Spannagl, Münch med Wschr 138(43):703/31, 1998 54 Molekulargenetische Untersuchungen 5-Fluorouracil-Sensitivität (DPD-Defizienz) DPYD-Gen (Dihydropyrimidin-Dehydrogenase-Gen; Genort: 1p21.3; OMIM #274270) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Zur Behandlung maligner Tumoren werden häufig 5-Fluorouracil (5-FU)haltige Zytostatika verwendet. Im Normalfall kann 5-FU in der Leber der Patienten rasch zu inaktiven Produkten abgebaut werden, wobei das Enzym Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) eine wesentliche Rolle spielt. Patienten mit erniedrigter DPD-Aktivität metabolisieren 5-FU schlechter, was zu stark erhöhten 5-FU Plasmaspiegeln und zu schwersten bis lebensbedrohlichen Nebenwirkungen führen kann. Im DPYD-Gen wurden mehrere Mutationen als Ursache einer verminderten Enzym-Aktivität beschrieben. Dabei findet man bei ca. 50% aller Mutationsträger mit einer DPD-Defizienz eine oder zwei Mutationen an Position c.1905+1 (IVS14+1G>A, „Exon 14-Skipping Mutation“) im DPYD-Gen. Infolge der Mutation kommt es zu einem fehlerhaften Herausschneiden (splicing) von Exon 14 aus der mRNA und damit zur Synthese eines inaktiven Proteins. Die Heterozygotenfrequenz dieser DPYD-Mutation liegt bei ca. 1,4%. Durch den Nachweis der Mutation vor einer Behandlung mit 5-FU können schwere Nebenwirkungen durch eine entsprechend angepasste Therapie vermieden werden. Die Untersuchung der Exon 14-skipping Mutation erfasst etwa 50% der Risikopatienten. Andere Mutationen im DPYD-Gen sind daher nicht ausgeschlossen. Darüberhinaus ist eine erhöhte 5-FU Sensitivität nicht immer auf eine DPYD-Defizienz zurückzuführen. Indikation Geplante Chemotherapie mit Fluoropyrimidin-haltigen Medikamenten Mutationen IVS14+1G>A Mutation (c.1905+1G>A, “DPYD Exon 14-skipping”) Material 1-2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Innerhalb des methode DPYD-Gens auf Chromosom 1p21.3 wird ein Abschnitt, der den Mutationsort beinhaltet, mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Der Nachweis der IVS14+1G>A Mutation erfolgt mittels Restriktionsendonukleaseverdau und Agarosegelelektrophorese Untersuchungs- 3-5 Tage dauer Literaturhinweise Amstutz et al., Pharmacogenomics, 12:1321-1336, 2011 Kumar et al., Int J Pharmacol 3:130-136, 2007 Bosch et al., Mol Diag Ther 11:105-108, 2007 Molekulargenetische Untersuchungen 55 Fragiles-X-Syndrom (Martin-Bell-Syndrom, Marker-X-Syndrom) FMR1-Gen (Fragile X Mental Retardation-1; Genort: Xq27.3; OMIM +309550, #300624) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang X-chromosomal semidominant Klinische Bedeutung Das Fragile-X Syndrom ist eine der häufigsten genetisch bedingten Ursachen für geistige Behinderung mit einer geschätzten Häufigkeit von etwa 1:4000 bis 1:6000. Ursache der Erkrankung ist fast immer die Verlängerung einer Trinukleotidsequenz (CGG-Repeat) im 5’-untranslatierten Bereich des FMR1-Gens, das auf dem X-Chromosom lokalisiert ist (FRAXA-Locus). Normalpersonen haben 5 bis 49 CGG-Kopien. Allele mit 50 bis 54 CGGRepeats bezeichnet man als Grauzonenallele, bei denen eine Expansion zur Vollmutation in der Folgegeneration bisher nicht beobachtet wurde. Eine Verlängerung auf 55 bis 200 CGG-Tripletts wird als Prämutation bezeichnet, die keine Auswirkung auf die neuronale Entwicklung hat. Jedoch können infolge von Überexpression prämutierter FMR1-Allele neurodegenerative Veränderungen hervorrufen werden und zum Fragilen-X-assoziierten Tremor/Ataxie-Syndrom (FXTAS) führen. Beim Vorliegen einer Prämutation tritt bei Frauen häufiger eine vorzeitige Ovarialinsuffizienz (Fragile-X associated Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI) auf, wobei für längere Allele ein niedrigeres Risiko beschrieben wurde. Die Vererbung eines prämutierten FMR1-Allels über die Mutter führt mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer weiteren Expansion der CGGRepeats auf 200 und mehr Tripletts (Vollmutation) und zur Symptomatik des Fragilen-X-Syndroms. Während Frauen mit einer Vollmutation auch asymptomatisch sein können, weisen Männer mit einer Vollmutation immer eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Symptomatik des Fragilen-X Syndroms auf. Im Gegensatz zu FXTAS und FXPOI, die assoziiert sind mit einer Erhöhung der m-RNA für FMR1 bei vorliegender Prämutation, wird bei einer Vollmutation der Promotorbereich des FMR1-Gens meist methyliert und damit die Translation des FMR1-Proteins (FMRP) blockiert. In seltenen Fällen sind Deletionen oder Punktmutationen für den Verlust des funktionellen FMR1-Genproduktes beim Fragilen-X-Syndrom verantwortlich. Indikation Mentale Retardierung/Entwicklungsverzögerung, Lernschwierigkeiten, Sprachstörungen, Hyperaktivität, faziale Dysmorphien, Makroorchidie, Autismus, spätmanifestes Tremor/Ataxie-Syndrom, prämature Menopause Mutationen CGG-Trinukleotid-Expansion auf mehr als 200 Repeats (Vollmutation) CGG-Trinukleotid-Expansion von 55-200 Repeats (Prämutation) Material 10 ml EDTA-Blut 56 Molekulargenetische Untersuchungen Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. methode Stufe 1: Die Anzahl der CGG-Repeats wird zunächst mittels PCR und anschließender Kapillarelektrophorese bestimmt. Stufe 2: Falls bei weiblichen Patienten nur eine Allelgröße oder bei männlichen Patienten kein PCR-Produkt nachweisbar ist, wird die DNA zusätzlich mittels Southern-Blot-Hybridisierung auf verlängerte CGG-Repeats untersucht. Eine pränatale Untersuchung ist bei einer bekannten maternalen CGG-Repeatexpansion möglich. Bei Chorionzotten muss gleichzeitig eine mütterliche Kontamination durch eine Untersuchung von mütterlichem Blut ausgeschlossen werden. Untersuchungs- Stufe 1: PCR 1-2 Wochen dauer ggf. Stufe 2: Southern Blot 3-4 Wochen Literaturhinweise Steinbach and Gläser, medgen 21:276-283, 2009 Oostra and Willemsen, Biochim Biophys Acta 1790:467-477, 2009 Fernandez-Carvajal et al., J Mol Diagnos 11:306-310, 2009 Wells, J BiolChem 284:7407-7411, 2009 Nolin et al., Am J Hum Genet 72:454-464, 2003 Friedreich'sche Ataxie FXN-Gen (Frataxin; Genort: 9q13; OMIM *606829, #229300) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die Friedreich‘sche Ataxie (FRDA) ist eine neurodegenerative Erkrankung mit einer Inzidenz von 1:50.000 die am häufigsten vorkommende Form der hereditären Ataxie in der kaukasischen Bevölkerung. Betroffene zeigen eine progressive Gang- und Extremitätenataxie, Areflexie, Muskelschwäche, Verlust des Lageempfindens, Dysarthrie und einen pathologischen Babinskireflex. Oft wird eine hypertrophe Kardiomyopathie als Todesursache festgestellt. Erste Symptome treten meist in der Pubertät und typischerweise vor dem 25. Lebensjahr auf, es sind auch Fälle mit verspäteter Erstmanifestation bekannt. Bei FRDA sind die größten Neurone im menschlichen Körper von Läsionen betroffen. Hierbei handelt es sich um die in den dorsalen Wurzelganglien des Rückenmarks lokalisierten Neurone und ihre korrespondierenden Axone, welche von den peripheren sensorischen Endigungen durch die sensorischen Nerven und die Hinterstränge des Rückenmarks bis zur Medulla oblongata verlaufen. Des Weiteren degenerieren Neurone der spinocerebellären Bahn und der Pyramidenbahnen. Bei ca. 96% der Patienten kann molekulargenetisch eine homozygote Expansion einer GAA-Nukleotidfolge im ersten Intron des FXN-Gens nachgewiesen werden. Molekulargenetische Untersuchungen 57 Klinische Bedeutung Bei Normalpersonen finden sich ca. 5 bis 33 GAA-Tripletts im FXN-Gen. Krankheitsverursachende Verlängerungen von ca. 66 bis 1700 Tripletts entstehen durch Expansion prämutierter Allele von ca. 34 bis 65 ununterbrochenen GAA-Tripletts. Der Schweregrad der Erkrankung korreliert mit der Anzahl der GAA-Tripletts. Die Expansion bewirkt eine Unterdrückung der FXN-Genexpression und somit den Ausfall des entsprechenden Proteins. Infolgedessen wird zudem das Eisen-Gleichgewicht in den Mitochondrien gestört und die Anfälligkeit für oxidativen Stress erhöht. Ob diese Dysregulation auch für die Entstehung der FRDA eine ursächliche Rolle spielt, ist derzeit noch nicht geklärt. Indikation V. a. Friedreich‘sche Ataxie Mutationen GAA-Repeat-Expansion im FXN-Gen Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein die GAA-Trimethode plettwiederholung beinhaltender Abschnitt des FXN-Gens wird mittels PCR amplifiziert. Die Längenbestimmung des PCR-Produktes und die daraus resultierende Anzahl der GAA-Repeats erfolgt mittels Agarosegelelektrophorese. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Schmucker and Puccio, Hum Mol Genet 19: R103-R110, 2010 Epplen et al., Hum Genet 99:834-836, 1997 Montermini et al., Hum Mol Genet 6:1261-1266, 1997 Campuzano et al., Science 271:1423-1427, 1996 Fruktoseintoleranz Aldolase B-Gen (ALDOB; Genort: Locus 9q22.3; OMIM #229600) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Hereditäre Fruktoseintoleranz (HFI) tritt bis zu schätzungsweise bei einem von 20.000 Neugeborenen auf. Durch den Mangel bzw. Aktivitätsverlust eines Enzyms für die Fruktoseverwertung kann es nach Aufnahme von Fruktose primär zu verschiedensten Magen-Darm-Störungen kommen und auch zur Hypoglykämie, deren Folgen u. a. Übelkeit, Erbrechen, Zittern, Schwitzen, Blässe, Lethargie und Krampfanfälle sein können. Bei einer weiteren Aufnahme von Fructose können schwere Schäden an Leber (z. B. Hepatomegalie oder Ikterus) und Niere wie z. B. Proteinurie die Folge sein. Die Entwicklung derartiger Schädigungen ist progredient. Von invasiven Diagnoseverfahren wie dem Fruktosetoleranz-Test oder der Messung der Aldolase B Enzymaktivität in einer Leberbiopsie ist vor allem bei Neugeborenen mit Verdacht auf HFI abzuraten. 58 Molekulargenetische Untersuchungen Indikation Gastrointestinale Beschwerden und Hypoglykämie mit Übelkeit, Erbrechen, Blässe, Schwitzen, Zittern, Lethargie und z. T. Krampfanfällen nach fruktosehaltigen Mahlzeiten Mutationen Bislang wurden 35 Mutationen in 8 kodierenden Exons des Alodolase BGens beschrieben, wobei allerdings ca. 95% der HFI auf vier Mutationen zurückzuführen sind: A149P und A174D (Exon 5) sowie N334K und D4E4 (Exon 9). Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Die DNA-Bereiche werden mittels PCR amplifiziert und Biotin markiert. methode Der spezifische Nachweis erfolgt durch eine reverse Hybridisierung der Amplifikate mit allelspezifischen auf einer Membran fixierten Sonden. Die DNA-Fragmente werden mit Hilfe von an Streptavidin gekoppelter alkalischer Phospatase in einer Farbreaktion nachgewiesen. Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Esposito, G et al.; Hum Mutat 24:534, 2004. Santer, R. et al.; Hum Mutat 25:594 2005. Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel G6PD-Gen (Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase; Genort: Xq28; OMIM +305900) Erbgang X-chromosomal, meist dominant Klinische Bedeutung Der Gendefekt manifestiert sich in einer Verminderung der Glukose-6Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität (G6PD) insbesondere in den Erythrozyten. Dadurch kommt es zu einer Störung des GIukose-6-Phosphat-Abbaus über den Pentoseweg und damit zu einer verminderten Bereitstellung des Coenzyms NADPH, das eine Rolle bei der Stablisierung des reduzierten Glutathions spielt. Auf diese Weise entsteht eine erhöhte Anfälligkeit für Oxydationsschäden, die vor allem in älteren Erythrozyten bei Einwirkung bestimmter oxydationsfördernder Substanzen zum hämolytischen Zerfall führt. Die Stabilitäts- bzw. Aktivitätsminderung der meisten über 300 bekannten Isoenzyme ist unterschiedlich, und damit variiert die Schwere des Krankheitsbildes. Bei den beiden Haupttypen besteht noch eine Aktivität von 3-4% (mediterraner Typ, in Mittelmeerländern und bei der mongoloiden Rasse) bzw. 15% (afrikanischer Typ) des Normalwertes. Das Auftreten dieser Defekte ist in Malaria-Regionen deutlich erhöht und betrifft ca. 400 Millionen Menschen weltweit. Bei Einwirkung bestimmter Medikamente und Verbindungen und zusätzlich beim mediterranen Typ (Favismus) bei Verzehr und Berührung von Faba-Bohnen kommt es zur hämolytischen Krise, deren Schwere durch die Art des G6PD-Defektes und durch andere genetische und peristatische Faktoren (Blutglukose-Konzentration, Infektionen) bestimmt wird. Akute Phasen mit vor allem Oberbauchbeschwerden, Anämie und prolongiertem Ikterus können schon bei Neugeborenen auftreten. Molekulargenetische Untersuchungen 59 Indikation Angeborene, nicht-sphärozytäre, hämolytische Anämien, auch durch Medikamentenunverträglichkeit oder Infektionen hervorgerufene, akut auftretende hämolytische Krisen Mutationen Man kennt bisher über 300, meist regional begrenzt auftretende Varianten der G6PD. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung der kodierenden Exons 2-13 methode Untersuchungs- Ca. 2 Wochen dauer Literaturhinweise Boyer, S. H., Porter, I. H., Weilbaecher, R. G., Proc. Nat. Acad. Sci. 48: 1868-1876, 1962 Beutler, E., Mathai, C. K., Smith, J. E., Blood 31: 131-150, 1968 Prokop O. et al., Lexikon der Syndrome und Fehlbildungen; Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York; 7. Auflage S. 475-476 Glutathion-S-Transferase (M1, P1, T1) GSTM1-Gen (Glutathion-S-Transfer. M1; Genort: 1p13.3; OMIM *138350) GSTP1-Gen (Glutathion-S-Transfer. P1; Genort: 11q13.2; OMIM *134660) GSTT1-Gen (Glutathion-S-Transfer. T1; Genort: 22q11.23; OMIM *600436) Klinische Bedeutung Glutathion S-Transferasen sind Enzyme, die in vielen Geweben vorkommen und reduziertes Glutathion an körpereigene und körperfremde Substanzen konjugieren. Dadurch werden die Substanzen weniger toxisch und es entsteht eine erhöhte Wasserlöslichkeit. Die Ausscheidung körpereigener und körperfremder Stoffe wird dadurch erleichtert. Etwa 50% der europäischen Bevölkerung tragen eine homozygote Deletion des GSTM1-Gens. Bei Exposition mit Fremdstoffen wie z. B. Benzpyren, polyzyklischen Kohlenwasserstoffen kann eine fehlende GSTM1 Enzymaktivität zu einer verstärkten Toxizität aufgrund DNA-schädigender Intermediärprodukte beitragen. Typische Fremdstoffe, die durch die Enzyme der Glutathion S-Transferasen T1 metbolisiert werden, sind Methylbromid, Methylchlorid, Methyliodid, Ethylendibromid, Propylenoxid, Ethylenoxid, Dichlormethan, Bromodichlormethan sowie weitere halogenierte Kohlenwasserstoffe, Organophophate und Epoxide. Etwa ein Drittel der Kaukasier weisen eine homozygote Deletion des GSTT1 Gens auf. GSTP1 ist die vorherrschende GST in extrahepatischen Geweben wie Lunge und Oesophagus und konjugiert reaktive Metabolite aus der zur Gruppe der Alkylanzien gehörenden Zytostatika (z. B. Ifosfamid, Busulfan und Chlorambucil). Das Risiko, nach einer Chemotherapie an einer akute sekundären myeloischen Leukämie zu erkranken, ist für Personen, die eine Variation im GSTP1-Gen tragen, zwei- bis dreifach erhöht. Auch eine Assoziation zum Oesophagus-Ca konnte nachgewiesen werden. 60 Molekulargenetische Untersuchungen Indikation Intoxikation, unerwartete Nebenwirkungen nach Medikamentengabe, verstärkte Reaktion bei Umweltgiften Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden die Sequenzbereiche von GSTM1, methode GSTP1 und GSTT1 mittels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Mannervik, B., Adv. Enzym. Relat. Areas Molec. Biol. 57: 357-417, 1985 Allan, J. M.et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 98: 11592-11597, 2001 Pemble, S. et al., Biochem. J. 300: 271-276, 1994 Li et al. BMC Genetics 2010, 11:47 Hereditäre Hämochromatose HFE-Gen Genort: 6p21.3; MIM +235200 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die hereditäre Hämochromatose ist eine angeborene Eisenspeicherkrankheit mit autosomal-rezessivem Erbgang. Eine frühzeitige Diagnosestellung und entsprechende Therapie kann die schweren Organschäden (Leberzirrhose, hepatozelluläres Karzinom, u. a.) verhindern, die als Folge der unbehandelten Erkrankung auftreten können. In der kaukasischen Bevölkerung beträgt die Heterozygotenfrequenz ca. 1:10 und die Homozygotenfrequenz 1:200 bis 1:400. Bei ca. 64-92% der Hämochromatose-Patienten findet man im sog. HFEGen eine homozygote Punktmutation, die im entsprechenden Protein zu einem Aminosäureaustausch von Cystein nach Tyrosin an Position 282 (C282Y) führt. Hier konnte man ein deutliches Nord- Süd- Gefälle der Mutationsfrequenz (64% in Italien, 92% in Schweden) beobachten. Außerdem findet man bei weiteren 4-5% der Patienten die C282Y- Mutation nur auf einem Allel und auf dem anderen Allel eine zweite Punktmutation, die zu einer Substitution des Histidins an Position 63 zu Asparaginsäure (H63D) führt. Diese kombinierte Heterozygotie C282Y/H63D führt zu einem erhöhten Risiko, eine hereditäre Hämochromatose zu entwickeln, jedoch mit einer geringen Penetranz von 0,5-1%. Selten entwickeln H63D Homozygote eine signifikante Eisenüberladung. Eine dritte Mutation, die an Position 65 zu einem Austausch von Serin durch Cystein führt (S65C) kann ebenfalls in seltenen Fällen zu einer Hämochromatose führen. Vergleichbar mit H63D ist auch die S65C-Mutation in Kombination mit einer heterozygot vorliegenden C282Y-Mutation mit einer milden Form der Hämochromatose assoziiert. Die sehr seltene E168X-Mutation enthält ein Stopcodon und kommt vorwiegend in Südeuropa vor. Molekulargenetische Untersuchungen 61 Indikation Klinisch und laborchemisch begründeter Verdacht auf Hämochromatose, vor allem bei Hepatopathien Mutationen C282Y, H63D, S65C, E168X Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche (C282Y, methode H63D, S65C, E168X) mittels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 2-4 Tage dauer Literaturhinweise Frosst et al., Nat Genet 10:111- 113, 1995; Fodinger et al., J Nephr 13(1):20- 33, 2000; Fletcher, Kessling, Hum Genet 103:11- 21,1998 Hereditäre Thromboembolie-Risiken Die Ursachen für eine erhöhte Thromboseneigung können genetisch bedingt (hereditär) oder erworben sein. Erworbene Risikofaktoren, die die Thromboseneigung verstärken sind: • erhöhtes Alter • erhöhte Gerinnungsaktivität durch Einnahme oraler östrogenhaltiger Kontrazeptiva • Immobilisation bei Krankheit oder nach operativen Eingriffen •Rauchen •Adipositas •Gravidität •Tumorerkrankungen •Varizen •Infektionen • vorangegangene Thrombembolie •Anti-Phospholipid-Syndrom Zu den wichtigsten und häufigsten genetischen Risikofaktoren für Venenthrombosen zählen die Faktor V-LEIDEN-Mutation (siehe dort) und die Prothrombin- Mutation G20210A (siehe dort). Wesentlich seltener (bei weniger als 10% der Patienten mit Thrombosen) findet man Defekte wie Protein C-, Protein S- sowie AT III- Defizienz. Zudem ergaben wissenschaftliche Studien bisher kontrovers diskutierte Ergebnisse über die Beteiligung der MTHFR (Methylentetrahydrofolat-Reduktase) C677T- und A1298CMutation (Hyperhomocysteinämie) (siehe dort) und der PAI-Mutation (siehe dort) an der Neigung zu venösen Thrombosen. 62 Molekulargenetische Untersuchungen Indikationen für • das Auftreten von Thromboembolien bereits im jüngeren Alter (<45 die Abklärung Jahre) eines geneti• familiäre Thromboembolieneigung schen Risikos • Thromboembolien im Zusammenhang mit einer Schwangerschaft sind: • Thromboembolien im Zusammenhang mit der Einnahme oraler Kontrazeptiva • Thromboembolien an atypischen Stellen (z. B. Sinusvenenthrombose) • mehrere vorangegangene gynäkologisch ungeklärte Fehlgeburten •Plazentainsuffizienz, vorzeitige Plazentalösung, Gestose Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv LDLRAP1-Gens (ARH-Gen) Genort: 1p36.11 ; OMIM 603813 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung In selteneren Fällen kann eine Hypercholesterinämie auch auf autosomalrezessive Mutationen im LDLRAP (ARH)-Gen zurückzuführen sein. Dieses Gen kodiert für ein LDL-Rezeptor-Adaptor-Protein, welches für die Aufnahme der „low-density“-Lipoproteine (LDL) in die Zelle mitverantwortlich ist. Klinisch ähnelt der Phänotyp dem der LDLR-Mutation, typischerweise sind Gesamt- und LDL-Cholesterin-Werte jedoch weniger stark erhöht und die Triglyzerid-Werte zumeist normal. Bei einem Drittel der Patienten ist das HDL-Cholesterin stark erniedrigt. Klinisch können tuberöse, tendinöse und planare Xanthome, ein Arcus lipoides corneae und Xanthelasmen auftreten. Auch über Gelenkschmerzen wird berichtet. ARH-Patienten sprechen deutlich besser auf eine lipidsenkende Therapie an als Träger einer LDLRMutation. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Nach Isolierung der genomischen DNA des Patienten werden die neun methode Exons des LDLRAP1-Gens amplifiziert und sequenziert. Untersuchungs- Ca. 2 Wochen dauer Literaturhinweise Nagai M et al., Mol. Biol. Cell 1, vol. 14 no. 12 4984-4996, 2003; Eden, E.R: ET AL., Am. J. Hum. Genet. 68: 653-660, 2001; Garcia, C. K. et al., Science 292: 1394-1398, 2001; Tada et al., Circ. Cardiovasc. Genet. 5: 35-41, 2012 Molekulargenetische Untersuchungen 63 Hyperhomocysteinämie (MTHFR C677T und A1298C-Mutationen) Methylentetrahydrofolat Reduktase-Gen Genort: 1p36.3; MIM +236250 Klinische Bedeutung Das Enzym 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase wird durch eine C → T Punktmutation an Position 677 des entsprechenden Gens und dem daraus resultierenden Aminosäureaustausch von Alanin an Position 223 durch Valin zu einer thermolabilen Variante mit 50% erniedrigter Aktivität. Eine zweite Punktmutation A → C an Position 1298 führt ebenfalls zu einer signifikanten Aktivitätsverminderung des Enzyms. Letztendliche Folge ist die Entstehung einer Hyperhomocysteinämie durch eine beeinträchtigte Regeneration von Methionin aus Homocystein. Einige epidemiologische Studien konnten zeigen, dass bei homozygoten Träger der MTHFR (C677T)- oder der MTHFR (A1298C)-Mutation oder kombiniert heterozygoten Trägern beider MTHFR-Mutationen (CompoundHeterozygotie) dann ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Thrombosen und arteriosklerotischen Gefäßveränderungen vorhanden ist, wenn infolge dieser Mutationen durch eine beeinträchtigte Regeneration von Methionin aus Homocystein eine Hyperhomocysteinämie vorliegt. Frauen mit einer homozygoten A1298C- oder C677T-Mutation oder mit beiden Mutationen (Compound-Heterozygotie) und bestehender Hyperhomocystinämie(!) haben zusätzlich eine Risikoerhöhung für wiederholte Aborte und bei vorhandener genetischer Prädisposition – auch Nachkommen mit Neuralrohrdefekten (Dysraphie-Syndrom) Indikation V. a. Hyperhomocysteinämie Mutationen A1298C- und C677T-Mutation Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomische DNA werden innerhalb des MTHFR-Gens zwei Abmethode schnitte, die jeweils einen der beiden Mutationsorte beinhalten, mit Hilfe der PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 2-4 Tage dauer Literaturhinweise Feder et al., Nat Genet 13:399- 408, 1996 Jazwinska et al., Nat Genet 14:249- 251, 1996 Beutler, Lancet 349:296- 297, 1997 Beutler, Am J Hum Genet 61:762- 764, 1997 64 Molekulargenetische Untersuchungen Hypochondroplasie FGFR3-Gen (Fibroblastenwachstumsfaktor Rezeptor 3; Genort: 4p16.3; OMIM #146000) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Hypochondroplasie ist eine autosomal dominant ererbte Chondrodystrophie. Der Phänotyp ist der Achondroplasie ähnlich, aber meist milder. Die klinische Diagnose bzw. die Unterscheidung dieser zwei Skelettdysplasien bleibt trotz klinischer Charakteristika und radiologischer Hintergrundbefunde oft unsicher. Der Schädel ist normal groß oder häufiger übergroß mit normaler Gesichtsbildung. Bei ca. 70% der Betroffenen konnten zwei prädominante Punktmutationen (Transitionen) von C1620A oder C1620G im FGFR3- (fibroblast growth factor receptor) Gen nachgewiesen werden. Im entsprechenden Protein führen beide o. g. Mutationen zu einem Aminosäureaustausch von Asparagin in Position 540 durch Lysin. 30% der Patienten haben entweder Mutationen an anderen Positionen des FGFR3 -Gens oder in anderen Genen. Da eine klare Abgrenzung zwischen einer Hypochondroplasie und einer milden Form der Achondroplasie oft nicht möglich ist, sollte bei Patienten mit Verdacht auf Hypochondroplasie nach einem Ausschluss der Asn540Lys und Ile538Val-Mutationen ggf. auch eine Achondroplasie-Diagnostik durchgeführt werden. Ähnlich wie bei der Achondroplasie wird auch bei Hypochondroplasie eine Zunahme der Neumutatiosrate bei erhöhtem väterlichem Alter beobachtet. Indikation Dysproportionierter Kleinwuchs mit verkürzten Gliedmaßen; weniger ausgeprägte Symptomatik als bei Achondroplasie. Mutationen C1620A bzw. C1620G (Asn540Lys), A1612G (Ile538Val) Material Ca. 2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Exon 13 des methode FGFR3-Gens wird mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Die Exonsequenz wird auf das Vorliegen von Mutationen an den Nukleotidpositionen 1612 und 1620 untersucht. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Grigelioniene et al., Hum Mut 11:333, 1998 Bellus et al., Nature Genet. 10:357-359, 1995 Prinos et al., Hum Mol Genet 4:2097-2101, 1995 Molekulargenetische Untersuchungen 65 IL28B (Interleukin 28B Genotypisierung) IL28B-Gen, Interferon-lambda-3 (IFN-lambda-3) Genort: OMIM 609532 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Das Hepatitis C-Virus (HCV) verursacht eine Infektionskrankheit mit 5000 Erstinfektionen pro Jahr, die sich durch eine hohe Chronifizierung auszeichnet und im Verlauf zu Leberzirrhose und Leberzellkarzinom führen kann. Es wurde festgestellt, daß SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) in der IL28B Genregion auf Chromosom 19 als Prognosemarker für die Therapie identifiziert wurden. Der IL28B-Polymorphismus (C/C, C/T, T/T) in der Region des IL28B-Gens rs12979860 (recessive spotting) im menschlichen Genom ist mit der Wirksamkeit (Sustained Virological Response) assoziiert. Patienten mit dem C/C-Genotyp zeigen einen deutlich erhöhten dauerhaften IFN/RBV-Therapieerfolg als Patienten, die das T-Allel tragen. Die C/C-Allel-Träger erreichen eine höhere Rate an Spontanremissionen der Erkrankung. Indikation Akute Hepatitis C-Infektion: Nachweis IL28B-C/T-Polymorphismus und Entscheidungshinweis über den optimalen Zeitpunkt der antiviralen Therapie Chronische Hepatitis C-Infektion: Abschätzung des Erfolgs bei Therapiebeginn und -verlauf Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA wird ein Abschnitt im Bereich der IL28B-Genmethode region amplifiziert. Der Nachweis des IL28B-Polymorphismus erfolgt durch Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Thomas DL, et al.; Nature 2009; 461(7165): 798-801 Ge D, et al.; Nature 2009; 461(7262): 399-401 Suppiah V, et al.; Nature Genetics 2009; 41: 1100 – 1104 66 Molekulargenetische Untersuchungen Interleukin 1-Polymorphismus IL1A-, IL1B-, IL1RN-Gen (Interleukin-Gencluster; Genort: 2q14; OMIM *147760, *147720, *147679) Klinische Bedeutung IL1A ist 1 von 2 strukturell verschiedenen Formen von IL1, die andere ist IL1B (147720). Die IL1A- und die IL1B-Proteine werden durch eine Vielfalt von Zelltypen synthetisiert, einschließlich aktivierten Macrophagen, Keratinocyten, stimulierten B Lymphozyten und Fibroblasten, sie sind starke Vermittler der Entzündung und Immunität. Der Interleukin-1-Rezeptorantagonist ist ein Protein welches an den IL1Rezeptor bindet und die Bindung der Interleukine IL1-alpha und IL1-beta verhindert. Als Folge wird die biologische Aktivität dieser beiden Zytokine bei immunologischen und entzündlichen Antworten neutralisiert. Assoziation von IL1A Polymorphismen mit Parodontitis: Kornman u. a. (1997) wiesen darauf hin, dass genetischer Polymorphisms der IL1A- und der IL1B-Gene mit dem Ausmaß der Parodontitis bei erwachsenen Nichtrauchern korreliert werden kann. Der IL1B-Polymorphismus wurde IL1B+3953 genannt, und der IL1A-Polymorphism wurde IL1A889 genannt. Wie man beobachtete, hatten Nichtraucher im Alter vom 40 bis 60 Jahren, die das ‚2‘ Allel (entweder homozygot oder heterozygot) an beiden Loci trugen, ein fast 19mal höheres Risiko einer schweren Periodontitis zu entwickeln im Vergleich zu Homozygoten für ‚1‘ Allel entweder an einem oder beiden dieser Loci. Indikation V. a. erhöhte Parodontitis-Anfälligkeit Mutationen IL1A C889T; IL1B C3953T; IL1RN T2018C Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- DNA-Isolierung aus der Patientenprobe – Multiplex-Amplifikation mit methode Biotin-markierten Primern – Nachweis der Polymorphismen IL1A-889, IL1B+3953 und IL1RN +2018 mittels reverser Hybridisierung Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Kornman, K. Set et al.; J. Clin. Periodont. 24: 72-77, 1997 Molekulargenetische Untersuchungen 67 Kardiomyopathie, familiär hypertroph MYH7-, MYBPC3-, TNNT2-, TNNI3-Gene (Genorte: 14q11.2, 11p11.2, 1q32.1, 19q13.42; OMIM #192600, *160760, *600958, *191045, *191044) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) wird typischerweise durch die Anwesenheit einer nicht erklärbaren linksventrikulärer Hypertrophie definiert, die in Abwesenheit einer anderen kardialen oder systemischen Erkrankung auftritt, welche fähig wäre diese Erkrankung zu verursachen. Die klinischen Manifestationen reichen von Dyspnoe, Synkope, Kollaps, unangenehmen Herzklopfen und Thoraxschmerz bis hin zum plötzlichen Herztod infolge einer ventrikulären Tachyarrhythmie. Sie werden leicht durch körperliche Belastung ausgelöst. Die Krankheit führt zu leichter bis mäßiger Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit. Die HCM wird autosomal-dominant mit variabler Penetranz und Expressivität vererbt. Ursächlich beteiligt sind die Gene für eine ganze Anzahl von SarkomerProteinen (Schwere Kette des Beta-Myosins, Leichte Kette des Myosins, Kardiale Troponine T und I, Kardiales Protein C, Alpha- Tropomyosin, Kardiales Aktin, Titin).. Indikation Verdacht auf familiär bedingte hypertrophe Kardiomyopathie Mutationen Bislang wurden im Zusammenhang mit HCM ca. 650 ursächliche Mutationen in 15 verschiedenen Genen identifiziert, die bis auf zwei Gene ausschließlich für kardiale Proteine der Sarkomere kodieren. Über 85% der bisher beschriebenen Mutationen befinden sich in den Genen für die schwere Kette des ß-Myosins (MYH7), das Myosinbindeprotein-C (MYBPC3), Troponin T (TNNT2) und Troponin I (TNNI3). Ca. 50% der Mutationen können in der ersten Stufe der Diagnostik, welche eine Mutationssuche in 16 Exons einschließt, detektiert werden. Insgesamt können derzeit im Rahmen der Routinediagnostik Mutationen in ca. 55% aller HCM-Fälle nachgewiesen werden. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus genomischer DNA werden 16 Exons des MYH7- und des MYBPC3methode Gens einschließlich der Intron/Exon-Spleißstellen amplifiziert und sequenziert (Stufe I (Sensitivität ca. 50%). Die Stufe II (Sensitivität ca. 90%): umfasst die restlichen 79 Exons des MYH7-, MYBPC3-,TNNT2- und TNNI3-Gens. Untersuchungs- Stufe I: 3-4 Wochen nach Probeneingang dauer Stufe II: zusätzlich 3 Wochen Literaturhinweise Seidman, J. G., Seidman, C., Cell 104: 557-567, 2001 Maron, B. J., New Eng. J. Med. 349: 1064-1075, 2003 Erdmann, J. et al., Clin. Genet. 64: 339-349, 2003 Charron, P.. www.orpha.net 68 Molekulargenetische Untersuchungen Laktoseintoleranz LCT-Gen (Lactase-Gen; Genort: 2q21; OMIM #223000) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Weltweit leiden etwa 50% der Bevölkerung an mehr oder minder ausgeprägter Laktoseintoleranz, die sich klinisch durch Unverträglichkeit von Milch oder milchhaltigen Lebensmitteln mit Übelkeit, Bauchschmerzen, Blähungen und Durchfällen zeigt. Oftmals gehen mit der Intoleranz für das Disaccharid Laktose auch unspezifische Symptome wie z. B. Kopfschmerzen oder auch Kreislaufprobleme einher. Drei Formen der Laktoseintoleranz lassen sich unterscheiden: 1. erworbener Laktasemangel (Laktaseproduktion lässt im Laufe des Lebens nach), 2. primärer Laktasemangel (der Organismus ist von Geburt an nicht in der Lage ausreichend Laktase zu bilden) und 3. sekundärer Laktasemangel als Folge von Darmerkrankung wie z. B. Morbus Crohn oder Zöliakie. Pimäre Laktoseintoleranz wird autosomal-rezessiv vererbt. In zwei finnischen Familien konnten im Enhancer-Bereich des Laktase-Gens (LCT) zwei Polymorphismen (-13910T>C und -22018A>G) entdeckt werden, die das Expressionsverhalten des Laktase-Gens steuern. Die homozygoten Genotypen C/C an der Position -13910 (bezogen auf das LCT-Startkodon) und G/G an der Position -22018 führen dabei zu einer Laktoseintoleranz. Indikation Laktoseintoleranz; Blähungen, Durchfall und starke Darmkrämpfe nach dem Verzehr von laktosehaltigen Nahrungsmitteln Mutationen C13910T-, G22018A-Mutationen Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels methode PCR amplifiziert. Der Nachweis beider Polymorphismen 13910T>C und 22018A>G erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 2-4 Tage dauer Literaturhinweise Robayo-Torres et Nichols, Nutr Rev 65:95 (2007) Järvelä, Ann Med 37:179 (2005) Bersaglieri et al, Am J Hum Genet 74:1111 (2004) Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) siehe SHOX Molekulargenetische Untersuchungen 69 Marfan Syndrom Typ 1 FBN1-Gen (Fibrillin-1; Genort: 15q21.1; OMIM #154700, *134797) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Das Marfan-Syndrom ist eine genetisch bedingte Erkrankung infolge einer Strukturanomalie der Mikrofibrillen des Bindegewebes. Mutationen im Fibrillin-1-Gen führen zu einem Mangel an Fibrillin-1 oder zu einem veränderten Genprodukt. Die daraus resultierenden abnormen Mikrofibrillen in der extrazellulären Matrix des Bindegewebes führen zu Beeinträchtigungen des Aufbaus der betroffenen Gewebe. Die Inzidenz des Marfan-Syndroms liegt bei etwa 1:10.000 Geburten. Das individuelle Krankheitsbild ist sehr variabel und umfasst Skelettanomalien (überlange Gliedmaßen, Trichter- oder Kielbrust, schmaler Kiefer mit schief stehenden Zähnen, Veränderungen an der Wirbelsäule, z. B. Skoliosen oder Kyphosen), überdehnbare Gelenke, Augenveränderungen (Linsendislokation, Myopie, Glaukom, Netzhautablösung), die zu Sehstörungen bis zur Erblindung führen können und als Hauptursache für lebensbedrohliche Situationen Veränderungen im Bereich der Gefäße (Aneurismenbildung bis zu Rissen in der Aorta) sowie Veränderungen an Herzklappen und Lunge. Im Rahmen der sog. „Genter Nosologie“ wurden 1996 Haupt- und Nebenkriterien zur klinischen Diagnosestellung eines Marfan Syndroms festgelegt (De Paepe et al., 1996). Die 2010 von Loeys et al. überarbeiteten Kriterien ermöglichen eine exaktere Diagnosestellung und eine bessere Abgrenzung zu ähnlichen Erkrankungen. Dabei werden die Hauptkriterien Ectopia lentis (dislozierte Augenlinse) und Dilatation (bzw. Dissektion) der Aortenwurzel stärker bewertet als andere Kriterien und auch die genetische Untersuchung hat an Bedeutung gewonnen. Etwa 90%-95% der Patienten, bei denen die klinische Diagnose eines Marfan Syndroms Typ 1 nach den Genter Kriterien gestellt wurde, weisen bei der molekulargenetischen Untersuchung Mutationen im Fibrillin (FBN1)Gen auf. Der Anteil an Neumutationen liegt bei ca. 30%. Bei etwa 70% der Fälle handelt es sich um Mutationen, die von einem Elternteil ererbt wurden. Marfan-ähnliche Symptome ohne Augenbeteiligung weisen auf ein Marfan-Syndrom Typ 2 (Loeys-Dietz Syndrom, LDS) hin, das durch Mutationen im im TGFBR1- und TGFBR2-Gen verursacht wird. Indikation Klinischer Verdacht auf ein Marfan Syndrom; familiäres Risiko Mutationen Derzeit sind mehr als 600 verschiedene Punktmutationen, Deletionen und Insertionen im FBN1-Gen beschrieben 70 Molekulargenetische Untersuchungen Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. methode Stufe 1: PCR und Sequenzierung der 65 Exons des FBN1-Gens zur Erfassung von Punktmutationen. Stufe 2: Untersuchung des FBN1-Gen auf Deletionen oder Duplikationen mittels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification). Untersuchungs- Stufe 1: Ca. 2 Wochen dauer Stufe 2: Ca. 4-5 Wochen Literaturhinweise Loeys et al., J Med Genet, 47: 476-485, 2010 Robinson and Godfrey, J Med Genet 37:9-25, 2000 De Paepe et al., Am J Med Genet 62:417-426, 1996 Dietz et al., Nature 352:337-339, 1991 Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) siehe SHOX Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) HNF1A-Gen (Hepatocyte nucl. factor-1a-Gen; Genort: 12q24.31; OMIM #600496) GCK-Gen (Glucokinase-Gen; Genort: 7p13; OMIM #125851) HNF4A-Gen (Hepatocyte nucl. factor-4a-Gen; Genort: 20q13.12; OMIM #125850) HNF1B-Gen (Hepatocyte nucl. factor-1ß-Gen; Genort: 17q12; OMIM #137920) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Das MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young)-Syndrom ist eine monogen erbliche Form des nicht-insulinabhängigen (Typ 2) Diabetes. Es wird autosomal-dominant vererbt und beginnt im Kindes- oder frühen Erwachsenenalter. Bisher wurden sechs genetisch unterschiedliche Formen des Syndroms beschrieben. Am häufigsten sind MODY2 und MODY3. MODY3: (~69% aller MODY Patienten), schlanke Patienten, schwer und progressiv verlaufend, mikrovaskuläre Komplikationen, renale Glukosurie und herabgesetzte Nierenschwelle für Glukose. MODY2: (ca. 14% aller MODY Patienten), schlanke Patienten, meist eher mild verlaufend, selten diabetische Spätkomplikationen, gehäuft bei Gestationsdiabetes MODY1: (~3% aller MODY Patienten), schlanke Patienten, schwer und progressiv verlaufend, mikrovaskuläre Komplikationen und Retinopathie, erniedrigte Serumspiegel von Triglyzeriden, Apolipoprotein AII und CII sowie Lp(a) Molekulargenetische Untersuchungen 71 Klinische Bedeutung MODY5: (~3% aller MODY Patienten), variabler klinischer Verlauf: vom leichten Typ2 Diabetes bis schwer und progressiv verlaufend, Nierendefekte und genitale Malformationen Indikation Verdacht auf Typ II-Diabetes im Kindes- oder Jugendalter Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung der entsprechenden Exons und Promotoren, Demethode letionsscreening über MLPA. Untersuchungs- 4-6 Wochen (Stufendiagnostik entsprechend der Häufigkeit möglich) dauer Literaturhinweise Fajans, S. S. et al., New Eng. J. Med. 345: 971-980, 2001 Ellard, S., Hum. Mutat. 16: 377-385, 2000 Froguel, P. et al., Nature 356: 162-164, 1992 Mittelmeerfieber, hereditäres MEFV-Gen Genort: 16p13; OMIM #249100 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Das familiäre Mittelmeerfieber ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die gehäuft bei Bewohnern der östlichen Mittelmeerregion (Türken, sephardische Juden, Nordafrikaner, Araber, seltener Griechen und Italiener) auftritt. Bis zu einem Sechstel nordafrikanischer Juden und bis zu einem Siebtel der armenischen Bevölkerung sind Merkmalsträger. In der Türkei wird die Prävalenz der Erkrankung auf etwa 0,1% der Bevölkerung geschätzt. Sie ist gekennzeichnet durch periodisch wiederkehrende Fieberschübe mit begleitender Entzündung der Serosa, was zu starken Bauch-, Brust- oder Gelenkschmerzen führt. Die meisten Patienten haben ihre ersten Fieberschübe im frühen Kindes- und Jugendalter. Die Attacken dauern etwa ein bis drei Tage an und bilden sich dann von alleine wieder zurück. Es zeigen sich unspezifische Entzündungszeichen wie CRP-Erhöhung, BSG-Anstieg und Leukozytose. Zwischen den Attacken sind die Patienten symptomfrei und fühlen sich gesund. Unbehandelt ist die häufigste Komplikation des familiären Mittelmeerfiebers eine progressive sekundäre Amyloidose, wodurch sich die Lebenserwartung der Patienten verkürzt: Beim akuten Schub findet sich besonders viel Amyloid im Blut, welches sich in unterschiedlichen Organen (vor allem der Niere) ablagern und über eine Niereninsuffizienz zum Tode führen kann. 72 Molekulargenetische Untersuchungen Indikation Wiederholte Fieberschübe mit Schmerzen in Abdomen, Brust und Gelenken, Peritonitis, unklare Arthritis, Amyloidose Mutationen Es sind über 80 verschiedene Mutationen bekannt, wobei es Hot Spots in bestimmten Genregionen gibt. Etwa 93% aller publizierten Mutationen betreffen Exon 2, 3, 5 und 10 des MEFV-Gens. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 10 Exons des Marenostrin-Gens, Stufendiamethode gnostik möglich Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Aksentijevich, I. et al.: Linkage disequilibrium in the familial Mediterranean fever candidate region. Am. J. Hum. Genet. 51 (suppl.): A181, 1992 Bonyadi, M. et al. MEFV mutations in Iranian Azeri Turkish patients with familial Mediterranean fever. Clin. Genet. 76: 477-480, 2009 Morbus Fabry, Alpha-Galactosidase A-Mangel GLA-Gen (Alpha-Galactosidase A-Gen OMIM # ; Genort: Xq22.1-; OMIM # 301500 Erbgang X-chromosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Der Morbus Fabry ist eine seltene erblich bedingte lysosomale Speicherkrankheit, die auf einem Mangel des Enzyms α-Galaktosidase A (α-GAL A) beruht. Durch Ablagerung von Glykosphingolipiden in zahlreichen Geweben und Organen kommt es zu vielfältigen klinischen Beschwerden. Die Symptome der Erkrankung umfassen unter anderem Schlaganfälle, Herzinfarkte und Nierenfunktionseinschränkung bis hin zur Dialysepflicht, rötlich-violette Hautveränderungen, sog. Angiokeratome, Funktionminderung der Schweißdrüsen, Ablagerungen im Bereich der Cornea, sowie brennende Parästhesien im Bereich der Hände und Füße. Obgleich erste Symptome oft schon im Kindes- oder Jugendalter auftreten, erfolgt eine Diagnosestellung aufgrund der unspezifischen klinischen Symptomatik oft erst spät. Zur Vermeidung schwerwiegender Komplikationen ist jedoch eine frühzeitige Diagnosestellung zur Therapieeinleitung von großer Bedeutung. Die Prävalenz der Erkrankung wird mit ca. 2-5:100.000 angegeben. Neuere Untersuchungen deuten jedoch auf eine wesentlich höhere Häufigkeit hin. Obgleich der M. Fabry X-chromosomal-rezessiv vererbt wird, können auch heterozygote Frauen Symptome der Erkrankung zeigen. Männliche Betroffene mit der klassischen Form der Erkrankung haben in der Regel eine sehr niedrige α-Galaktosidase-Aktivität, welche verlässlich mittels eines Enzymtestes an Leukozyten aus dem Blut bestimmt werden kann. Molekulargenetische Untersuchungen 73 Klinische Bedeutung Bei attenuierten Formen der Erkrankung können sich jedoch deutliche Restaktivitäten des Enzyms finden, so dass eine Mutationsanalyse zur Diagnosesicherung erfolgen sollte. Auch eine Pseudodefizienz der α-Galaktosidase-Aktivität (zum Beispiel bei Männern, die nicht-Krankheitsverursachende Mutation p.D313Y tragen), kann ebenfalls zu einer verminderten α-Galaktosidase-Aktivität führen und erfordert eine molekulargenetische Testung. Da die Enzymaktivität bei weiblichen Anlageträgerinnen unauffällig sein kann, ist hier eine molekulargenetische Analyse unabdingbar. Diese gilt ebenso zur Verifizierung einer krankheitsverursachenden Mutation vor Einleitung einer enzymatischen Ersatztherapie. Indikation Verdacht auf M. Fabry, Differentialdiagnose Mutationen Zumeist Punktmutationen (70%) ohne hot spot, kleinere Rearrangements (< 60 bp) in ca. 28% der Fälle und ca. 2% größere Rearrangements (>=60 bp) 2-5 ml EDTA-Blut Material Untersuchungs- Stufe I: PCR und Sequenzierung der 7 kodierenden Exons methode Stufe II: Deletionen und Duplikationenscreening mittels MLPA . Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Gal A. et al., European Journal of Human Genetics) 20(2012) Lidove O..et al., Genet Med 12: 668–679 (2010) Wang R.Y. et al., Genetics in Medicine 13: 457–484(2011) Morbus Meulengracht UGT1A1-Gen (Uridindiphosphat-Glucuronosyltransferase 1A1-Gen; Genort: 2q37; OMIM # 143500, *191740 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Morbus Meulengracht oder Gilbert-Syndrom ist eine benigne Stoffwechselstörung, die häufig in Stress-Situationen, bei verminderter Nahrungsaufnahme oder in Verbindung mit Nikotin und Alkohol zu einer Hyperbilirubinämie führt (3-5fach erhöhter Bilirubinspiegel (unkonjugiertes Bilirubin) im Blut). Eine Therapie ist nicht erforderlich, jedoch sind Fasten, Stress, Nikotin und Alkohol zu vermeiden. Molekulargenetisch kann bei dem Gilbert Syndrom in beiden Allelen des UGT1A1-Gens eine Dinukleotid-Verlängerung im Promotor nachgewiesen werden [A(TA)6TAA → A(TA)7TAA]. Dies führt zu einer erniedrigten UDP-Glucuronosyltransferase (UDP-GT1-A1) Aktivität und damit zu einer verminderten Konjugation von Bilirubin an Glucuronsäure, wodurch der Serumspiegel des indirekten Bilirubins ansteigt. Aufgrund eines gestörten Stoffwechsels von einigen Medikamenten sollte jede Medikamenteneinnahme mit einem Arzt besprochen werden. Beispielsweise ist die UDPGlucuronosyltransferase entscheidend an dem körpereigenen Abbau des Chemotherapeutikums Irinotecan (CPT-11) beteiligt. 74 Molekulargenetische Untersuchungen Patienten mit Morbus Meulengracht haben nach Angaben in der Literatur ein hohes Risiko, bei einer Behandlung mit CPT-11 starke Nebenwirkungen zu erleiden. Bei cystischer Fibrose erhöht der UGT1A1 Promotor-Polymorphismus die Wahrscheinlichkeit für Gallensteine. Indikation Patienten mit Sklerenikterus und Hyperbilirubinämie bei normalen Leberwerten und ohne Zeichen einer Hämolyse oder einer Hepatitis-Infektion. Mutationen A(TA)7TAA und A(TA)8TAA Promotor-Polymorphismus im UGT1A1-Gen Material 1-2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Promotorremethode gion des UGT1A1-Gens wird mittels real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) und Schmelzkurvenanalyse unter Verwendung der fluorescence resonance energy transfer (FRET) Technik nachgewiesen. Bei fraglichen Ergebnissen wird die Veränderung im Promotor durch Sequenzanalyse näher untersucht. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Rouits et al., Clin Canc Res 10: 5151-5159, 2004; Borlak et al., Hepatology 32:792-795, 2000; Burchell and Hume, Gastroenterol Hepatol 14:960-966, 1999 Morbus Wilson ATP7B Gen (ATPase-7b Kupfertransporter; Genort: 13q14.3-q21.1; # OMIM 277900, *606882) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Bei Morbus Wilson liegt eine Störung im Kupferstoffwechsel vor durch einen Defekt in beiden Allelen des ATPase-7b Kupfertransporter-Gens (ATP7B). Überschüssiges Kupfer, das mit der Nahrung aufgenommen wird, kann nicht mehr ausreichend ausgeschieden werden und reichert sich mit entsprechend toxischer Wirkung in verschiedenen Organen an. Zusätzlich kommt es durch den Funktionsverlust des ATP7B-Proteins auch zu einer Störung der Coeruloplasmin-Synthese. Der Erkrankungsverlauf ist hinsichtlich Schweregrad und Symptomatik sehr variabel. Das Erkrankungsalter liegt in der Regel zwischen 5. und 45. Lebensjahr. Hinsichtlich der Symptomatik wird zwischen nicht-neurologischem (hepatischem) und neurologischem Verlaufstyp unterschieden. Bei der Manifestation vor dem 10. Lebensjahr stehen initial akute oder chronische Leberentzündungen im Vordergrund, während die Patienten bei späterer Erstmanifestation primär durch neurologische Symptome auffallen (Parkinson- oder Chorea-artiger Tremor, teilweise Spastiken, Koordinationsstörungen und verwaschene Sprache, im späteren Krankheitsverlauf Depressionen, Psychosen und demenzielle Veränderungen). Zusätzlich werden durch Kupferablagerungen u. a. auch Veränderungen in der Niere und in den Augen („Kayser-Fleischer-Kornealring“) beobachtet. Molekulargenetische Untersuchungen 75 Klinische Bedeutung Bei Morbus-Wilson Patienten wurden inzwischen über 250 verschiedene Mutationen innerhalb des ATP7B-Gens nachgewiesen. Als häufigste Mutation in Europa mit einer Allelfrequenz von ca. 60% liegt ein C → A Basenaustausch im Exon 14 vor, der im ATPase-7b Kupfertransporter-Protein an Position 1069 zu einem Aminosäureaustausch von Histidin durch Glutamin führt. Indikation Auffällige Leberwerte im Kindesalter nach Ausschluss einer infektiöses Hepatitis; erhöhte Ausscheidung von Kupfer im Urin und erniedrigte Werte für Kupfer und Coeruloplasmin im Serum; Augensymptome: „Kayser-Fleischer-Kornealring“ in der Regel zusammen mit neurologischen Symptomen (unklare Bewegungsstörungen und Verhaltensänderungen); bei einigen Patienten auch Skelettveränderungen (Osteoporose, degenerative Gelekveränderungen) oder Kardiomyopathien; präsymptomatische Diagnostik bei Geschwistern und Kindern von Patienten mit molekulargenetisch nachgewiesener ATP7B-Genmutation. Mutationen Häufigste Mutation: c.3207C>A (p.His1069Gln); es sind über 250 weitere Mutationen im ATP7B-Gen bekannt Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. methode Stufe 1: Untersuchung der häufigsten Mutation: C3207A (His1069Gln) im Exon 14 des ATP7B-Gens durch real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) und Schmelzkurvenanalyse unter Verwendung der fluorescence resonance energy transfer (FRET) Technik Stufe 2: Komplettsequenzierung aller 21 Exons des ATP7B-Gens. Untersuchungs- 4-6 Wochen dauer Literaturhinweise Kucinskas et al., World J Gastroenterol 14:5876-5879, 2008; Caca et al., J Hepatol 35:575-581, 2001; AWMF-Leitlinien in: Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie, 2008 G. Thieme Verlag, Stuttgart Mukoviszidose (Cystische Fibrose) CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; Genort: 7q31.2; MIM # 219700) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung CF ist mit einer Inzidenz von ca. 1:2500 eine der häufigsten autosomalrezessiven Erkrankungen in der weißen Bevölkerung. Ca. jede 25. Person ist heterozygoter Träger (und damit selbst gesund, aber Überträger) einer Mutation in dem für diese Erkrankung verantwortlichen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)- Gen, welches die Chloridionenkanal-Funktion reguliert. Der Gendefekt führt hauptsächlich zur Beeinträchtigung des Bronchialsystems mit häufig wiederkehrenden Infekten bis hin zur Zerstörung des Lungengewebes. 76 Molekulargenetische Untersuchungen 10% der erkrankten Neugeborenen zeigen einen Mekonium-Ileus. Als weiteres typisches Symptom wird eine exokrine Pankreasinsuffizienz bei ca. 85% der Patienten beschrieben (s. Hereditäre Pankreatitis). Schweregrad und Manifestationsalter der Erkrankung sind äußerst variabel. Mehr als 95% der Männer mit CF sind aufgrund einer Azoospermie infertil, die durch eine CBAVD verursacht wird (s. dort). Betroffene Frauen zeigen eine wesentlich geringere Einschränkung der Fertilität. Bei ca. 70% der Erkrankten in Mitteleuropa lässt sich eine prädominante Mutation (F508del) molekulargenetisch nachweisen. Insgesamt sind derzeit weltweit mehr als 1500 verschiedene Mutationen bekannt, wovon in der deutschen Bevölkerung nur wenige mit einer Häufigkeit von mehr als 1-2% gefunden werden. Das Verteilungsspektrum der Mutationen ist populationsabhängig. Durch die hier durchgeführte Untersuchung von bis zu 35 Mutationen und das 5T-Allel können über 90% der Mutationsträger aus der kaukasischen Bevölkerung erfasst werden. Indikation Klinischer Verdacht auf Mukoviszidose bzw. entsprechende Familienanamnese, auch als pränatale Untersuchung bei bekannter Mutation beider Eltern. Mutationen Häufigste Mutation: F508del, Sensitivität ca. 73%. Über 1500 weitere Mutationen im CFTR-Gen sind bekannt, die mit unterschiedlicher Häufigkeit auftreten Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Anschließend wermethode den die relevanten Sequenzbereiche mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) arnplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden bzw. unter Verwendung des „Oligo-Ligation-Assays“ (OLA-Methode, Abbott). Untersuchungs- Ca. 5-8 Tage dauer (bei Fruchtwasser zusätzlich ca. 2 Wochen für die Zellkultur) Literaturhinweise Welsh et al., in Scriver et al (eds) The metabolic and molecular bases of inherited disease, Chapter 127, 1997; Stuhrmann et al., Med Genet 9:552- 559, 1997; Stuhrmann et al., Internist 40:476- 485, 1999 Muskeldystrophie Typ Duchenne oder Becker DMD-Gen (Duchenne muscular dystrophy-Gen; Genort: Xp21.2-p21.1; OMIM *300377) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang X-chromosomal Klinische Bedeutung Die Duchenne- und Becker-Muskeldystrophien (DMD und BMD) sind neuromuskuläre Erkrankungen mit progredientem Skelettmuskelschwund, wobei jedoch auch Herzmuskulatur und glatte Muskulatur betroffen sein können. Molekulargenetische Untersuchungen 77 Klinische Bedeutung Die DMD ist häufiger, manifestiert sich früher und verläuft schwerer als die BMD. Die Prävalenz unter männlichen Neugeborenen liegt bei der DMD bei 1:3.300, die Prävalenz der BMD schwankt zwischen 1:18.000 und 1:31.000. In Deutschland leben 1.500 bis 2.000 Betroffene, jährlich muss mit etwa 100 Neuerkrankungen gerechnet werden. Kinder mit DMD lernen oft verspätet laufen. Kognitive Funktionen können eingeschränkt sein sein. Die Diagnose wird meist im Alter von 5 Jahren gestellt, wenn watschelnder Gang, Spitzfuß (Pes equinus), Wadenhypertrophie und positives Gowers-Zeichen auffallen. Ohne Therapie werden die Patienten im Alter von 10-12 Jahren rollstuhlpflichtig. Zunehmend werden Skoliose, Kardiomyopathie und restriktive respiratorische Insuffizienz manifest. Die BMD tritt erst später im 2. Lebensjahrzehnt mit proximaler, unterschiedlich progredienter Muskelschwäche in Erscheinung. Die Gehfähigkeit kann bis in das Erwachsenenalter, erhalten bleiben. Erstes Symptom können auch kardiale Probleme sein. Es können auch andere klinische Formen auftreten wie isolierte Kardiomyopathie, Belastungsintoleranz, und sehr seltene symptomatische Formen bei heterozygoten Frauen. Beide Krankheiten werden X-chromosomal-rezessiv vererbt und sind verursacht durch einen Mangel des Dystrophins in der Skelett- und Herzmuskulatur, der progredient zu nekrotischen Läsionen sowie einem Ersatz durch Binde- und Fettgewebe. Das DMD-Gen (Xp21.2) kodiert verschiedene Dystrophin-Isoformen. Die Creatin-Phoshokinase (CPK) ist bei DMD 50 bis 200fach, bei BMD 10 bis 35fach erhöht. Die Muskelbiopsie zeigt dystrophische Veränderungen (nekrotische und regenerierende Fasern). Immunhistochemisch wird bei DMD ein völliges Fehlen, bei BMD eine veränderte Quantität und/oder Qualität des Dystrophins nachgewiesen. Molekulargenetisch sind am häufigsten Deletionen des DMD-Gens nachweisbar. Differentialdiagnostisch müssen die Sarkoglykanopathien abgegrenzt werden. Essentiell ist in den Familien die Suche nach heterozygoten Frauen. Indikation Klinischer V. a. DMD (ausgeprägte Form, Erkrankungsalter 2-4 J.) oder BMD (mildere Form, Erkrankungsalter 1.-3. Lebensjahrzehnt) Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- MLPA-Analyse aller 79 kodierenden Exons zur Erfassung von Deletionen methode und Duplikationen einzelner oder mehrerer Exons Untersuchungs- 3-6 Wochen dauer Literaturhinweise Emery, A. E. H., Lancet 359: 687-695, 2002 Monaco, A. P. et al., Genomics 2: 90-95, 1988 Grain, L. et al., Neuromusc. Disord. 11: 186-191, 2001 Boulay C.; Chabrol B., www.orpha.net 78 Molekulargenetische Untersuchungen Myotone Dystrophie Typ 1 DMPK-Gen (Dystrophia myotonica protein kinase-Gen; Genort: 19q13.32; OMIM #160900) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Myotone Dystrophie Typ 1 (Curschmann-Steinert), ist eine Muskelkrankheit mit Myotonie und Funktionsstörungen einer Vielzahl von Organen. Als Symptome treten unter anderem Muskelschwäche, Reizleitungsstörungen des Herzens, Katarakt, endokrine Störungen, Schlafstörungen und Stirnglatze auf. Von den übrigen Muskeldystrophien kann sie dadurch abgegrenzt werden, dass nach einer Muskelkontraktion sich die Relaxation verzögert. Es ist die häufigste der im Erwachsenenalter beginnenden Muskeldystrophien. Die Prävalenz wird auf 1:20.000 geschätzt. Die Erkrankung ist mit Genanomalien der Chromosomenregion 19q13.2-q13.3 assoziiert. Antizipation, d. h. Vorverlagerung des Erkrankungsalters und/oder Zunahme des Ausprägungsgrades in aufeinander folgenden Generationen, ist möglich. Die große Variabilität des klinischen Bildes auch innerhalb einer Familie kann die genetische Beratung erschweren. Die Krankheit verläuft meist langsam progredient, aber gelegentlich werden auch rapide Verschlechterungen gesehen. Wegen der erhöhten Mortalität pulmonaler und kardialer Komplikationen ist die Lebenserwartung reduziert. Indikation Muskelerkrankung des Erwachsenenalters, die durch Symptome eine distal betonte Muskelschwäche, eine Atrophie der Gesichtsmuskulatur sowie der Nacken- und Pharynxmuskulatur charakterisiert wird Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR zur Längenbestimmung des CTG-Repeats in der 3’-untranslatierten methode Region von DMPK Untersuchungs- 3-6 Wochen dauer Literaturhinweise Musova, Z. et al., Am. J. Med. Genet. 149A: 1365-1374, 2009 Harper, P. S.Myotonic Dystrophy.Philadelphia: W. B. Saunders (pub.) (2nd ed.) : 1989 Harley, H. G. et al., Am. J. Hum. Genet. 52: 1164-1174, 1993 Bost M. et al. www.orpha.net Molekulargenetische Untersuchungen 79 Myotone Dystrophie Typ 2 ZNF9-Gen (Zinc finger protein 9; Genort: 3q21.3; OMIM #602668) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Myotone Dystrophie Typ 2, auch Proximale myotone Myopathie genannt, ist eine multisystemische Erkrankung mit proximaler Muskelschwäche, Myotonie, kardialen Symptomen und frühen Katarakten in Erscheinung tritt. Die Patienten werden meist erst als Erwachsene, zwischen dem 40. und 50. Lebensjahr, auffällig. Es gibt keine Berichte über angeborene oder kindliche Fälle, aber eine seltene juvenile Form wurde beschrieben. Die Ausprägung der Krankheit ist unterschiedlich und gekennzeichnet durch: (i) proximale Muskelschwäche unter Einschluss des Becken- und Schultergürtels mit häufigen Myalgien, die oft zur Diagnose führen. (Über Myotonie wird in 75% der Fälle berichtet, die Gesichtsmuskeln sind nur in 12% der Patienten betroffen); (ii) Tremor bei 20-30% der Fälle; (iii) kardiale Manifestationen mit Arrhythmie und Reizleitungsstörungen, in einigen Fällen Kardiomyopathie, weshalb alle Patienten kardiologisch überwacht werden müssen; (iv) hintere Linsen-Kapseltrübung; (v) endokrine Störungen mit Hyperhidrose, Hodenatrophie, Insulinresistenz und Diabetes; (vi) selten zentralnervöse Störungen (räumliches Sehen); (vii) biochemische Anomalien (Hypogammaglobulinämie, Cholestase). Die Krankheit wird autosomal-dominant vererbt. Ursache ist die Expansion eines CCTG-Repeats im Intron 1 des CNBP-Gens (3q21). Die Zahl der Wiederholungen scheint nicht mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Indikation Verdacht auf DM2, eine multisystemische Erkrankung vorwiegend ab der 3. Lebensdekade, die die Muskulatur, die Augen (nahezu alle Betroffenen haben eine Katarakt), das Gehör (20%) und das endokrine System (20% Diabetes mellitus, Fertilität) betreffen kann. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung verschiedener Repeat-Polymorphismen in Intron methode I von ZNF9 Untersuchungs- 3-6 Wochen dauer Literaturhinweise Udd, B. et al., Neuromusc. Disord. 13: 589-596, 2003 Bonsch, D. et al., Clin. Genet. 63: 73-75, 2003 Bachinski, L. L. et al., Neurology 72: 490-497, 2009 Bouhour F., www.orpha.net 80 Molekulargenetische Untersuchungen N-Acetyltransferase NAT1-Gen (N-Acetyltransferase 1; Genort: 8p22; OMIM *108345) NAT2-Gen (N-Acetyltransferase 2; Genort: 8p22; OMIM *612182) Klinische Bedeutung Die N-Acetyltransferase 2 (NAT2) ist ein Enzym des Phase II-Stoffwechsels, welches die Konjugation diverser Pharmaka und Xenobiotica mit einer Acetylgruppe vermittelt. Es finden sich sogenannte Schnell- und Langsamacetylierern sowie intermediäre Typen. Die Frequenz dieser Phänotypen in verschiedenen Populationen variiert erheblich. In der europäischen Bevölkerung beträgt der Anteil der Langsamacytlyierer zwischen 40 und 70%, in der arabischen Bevölkerung bis zu 95%. Der Phänotyp des „langsamen Acetylierers“ ist durch homozygote oder zusammengesetzt-heterozygote Mutationen in der kodierenden Region des NAT2-Gens bedingt. Die häufigsten Mutationen die mit dem SA-Phänotyp assoziiert sind umfassen G191A (NAT2*14A), C481T (NAT2*5A), G590A (NAT2*6A) und G857A (NAT2*7A/B). Am Beispiel von Isoniazid konnte gezeigt werden, daß sich die therapeutische Wirkung und das Auftreten von Nebenwirkungen bei Langsam- und Schnellacetylierern unterscheiden. Eine klinisch relevante Nebenwirkung der Isoniazidtherapie ist die periphere Neuropathie bei langsamen Acetylierern, bei schnellen Acetylierern kann es zu einer Hypersensitivität gegenüber Sulfonamiden sowie zu einer Leukopenie unter Amonafid kommen. Das Enzym NAT1 wird in mehr Zellarten gefunden als NAT2. NAT1 ist in der Lage karzinogene Amine zu entgiften. Bestimmte Allele sind mit einem erhöhten Risiko für Colon- und Harnblasenkarzinom assoziiert. Indikation Diskrepanz Medikamentendosierung und Serumspiegel, fehlende Medikamentenwirkung, unerwartete Nebenwirkungen (UAW); Acetyliererstatus, verstärkte Reaktionen gegenüber Umweltgiften Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR, Genotypisierung methode Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Blum, M.et al., DNA Cell Biol. 9: 193-203, 1990 Bouchardy, C.et al., Pharmacogenetics 8: 291-298, 1998 Chan, D. K. Y. et al., Neurology 60: 1002-1005, 2003 Noonan-Syndrom PTPN11-Gen (Protein-Tyrosine Phosphatase, nonreceptor-type 11; Genort: 12q24; OMIM *176876, #163950) Erbgang Autosomal-dominant Molekulargenetische Untersuchungen 81 Klinische Bedeutung Das Noonan-Syndrom ist ein Dysmorphie-Syndrom, welches durch faziale Dysmorphien mit Hypertelorismus, Ptosis, großen und tief sitzenden Ohren auffällt. Charakteristisch sind Kleinwuchs, Skelettdeformationen und ein breites Spektrum von Herzfehlern. Die Symptomatik zeigt eine außergewöhnliche Variabilität. Die Inzidenz des Noonan-Syndroms wird auf 1:1000 bis 1:2500 Geburten geschätzt. Beide Geschlechter sind gleich häufig betroffen. Aufgrund der phänotypischen Ähnlichkeiten zum Ulrich-Turner-Syndrom wurde das Noonan-Syndrom auch als Male-Turner-Syndrom bezeichnet, wobei die Chromosomen beim Noonan-Syndrom aber unauffällig sind. Bei ca. 50% aller Noonan-Patienten liegen Mutationen im PTPN11-Gen vor, die fast alle zu Aminosäureaustauschen führen. Das Genprodukt, das SHP2 (Src homology 2)-Protein, ist eine nicht membranständige RezeptorPhosphotyrosin-Phosphorylase, mit zentraler Regulatorfunktion in fast allen Signaltransduktionswegen von Wachstumsfaktoren, einschließlich der RASMAPK-Kaskade. Weniger als 3% der Noonan-Patienten zeigen Mutationen im KRAS (Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog)-Gen, wobei diese überwiegend mit schwerwiegenden Phänotypen assoziiert zu sein scheinen. Bei etwa 20% der Noonan-Patienten, die keine Mutation in PTPN11 oder KRAS aufwiesen, wurden mittlerweile Mutationen im SOS1 (Son of Sevenless)-Gen nachgewiesen. Bei Patienten mit SOS1-Mutationen werden häufiger ektodermale Anomalien (z. B. Keratose) gefunden, das Längenwachstum und die mentale Entwicklung verlaufen meist normal und die Herzfehler sind weniger stark ausgeprägt. Indikation Klinischer Verdacht auf ein Noonan-Syndrom, auch als pränatale Untersuchung. Mutationen Punktmutationen im PTPN11-Gen Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Entsprechend der methode Häufigkeit der einzelnen Mutationen erfolgt eine Untersuchung der 15 Exons mittels Amplifikation und Sequenzanalyse über Kapillarelektrophorese in zwei Stufen. Stufe 1: Untersuchung von Exon 3 und 8 mit den häufigsten PTPN11Mutationen Stufe 2: Komplettsequenzierung der restlichen 13 Exons des PTPN11Gens. Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Sznajer et al., Pediatrics 119: e1325-1331, 2007; Tartaglia et al., Mol Syndromol 1:2-26, 2010; Tartaglia et al., Nat Genet 29:465-468, 2001 Osteoporose siehe Vitamin D-Rezeptor und Col1A1-Gen 82 Molekulargenetische Untersuchungen Pankreatitis, hereditäre (HP) PRSS1-Gen (kationisches Trypsinogen; Genort: 7q35; MIM +276000) SPINK1- (PSTI-) Gen (Serinprotease-Inhibitor, Kazal-Typ 1/ Pancreatic secretory trypsin inhibitor, Genort: 5q32; MIM *167790) Erbgang Autosomal dominant / rezessiv / digenisch (je nach Mutation) Klinische Bedeutung In industrialisierten Ländern wird eine chronische Pankreatitis in 70-80% der Fälle durch langfristigen Alkoholmissbrauch ausgelöst. 10-30% der Fälle werden als „idiopathisch“ klassifiziert, darunter auch die der Patienten mit hereditärer Pankreatitis. Die Inzidenz der chronischen Pankreatitis wird in industrialisierten Ländern auf 3,5 bis 10 pro 100 000 Einwohner geschätzt. Klinisch wird die Erkrankung charakterisiert durch wiederkehrende oder persistierende Abdominalschmerzen, obwohl auch schmerzfreie Patienten beobachtet werden. Morphologisch zeigt das Pankreas eine unregelmäßige Sklerose mit fokaler, segmentaler oder diffuser Zerstörung des Parenchyms. Das Auftreten klinischer Symptome bereits in der Kindheit und/oder eine familiäre Häufung der Erkrankung kann auf eine hereditäre Pankreatitis hindeuten. Das Risiko der Entwicklung eines Pankreaskarzinoms ab dem 50. Lebensjahr ist erhöht. Bisher konnten drei für die Erkrankung verantwortliche Gene identifiziert werden: Etwa 1% der Patienten tragen autosomal dominante Mutationen im kationischen Trypsinogen (PRSS1)-Gen auf Chromosom 7. Das Trypsinogen-Protein ist die inaktive Vorstufe des Trypsins, das bei vorzeitiger Autoaktivierung eine Gewebeschädigung des Pankreas verursacht. Bei dem zweiten Gen handelt es sich um das SerinProtease-Inhibitor, Kazal Typ 1 (SPINK1)-Gen oder pankreatisch-sekretorisches Trypsin-Inhibitor (PSTI)-Gen auf Chromosom 5. Das Genprodukt hat eine physiologische Schutzfunktion, indem es Trypsin im Pankeas inaktiviert. Die häufigste Mutation im SPINK1-Gen (N34S) ist in homozygoter Form mit 5-10% bei Pankreatitis-Patienten wesentlich häufiger vorzufinden als bei Gesunden (1/10000). Weitere seltene SPINK1-Varianten sind beschrieben, von denen jedoch der Vererbungsmodus und die Krankheitsrelevanz noch nicht sicher geklärt sind. Des Weiteren wurde bei 25-30% der Patienten mindestens eine Mutation im CFTR-Gen (für Cystische Fibrose) gefunden, wobei etwa bei einem Drittel davon zwei CFTR-Mutationen in compound heterozygoter Form auftreten. Bei einigen Patienten (ca. 9%) liegt eine Kombination von Mutationen dieser Gene vor (digenische Vererbung). Indikation Akute Pankreatitis in Kindheit und Jugend und / oder positive Familienanamnese; rezidivierende Pankreatitiden; Pankreaskarzinom vor dem 45. Lebensjahr, chronische Pankreatitis vor dem 35. Lebensjahr Mutationen Mutationen des PRSS1- und SPINK1 (PSTI)-Gens Material 2-5 ml EDTA-Blut Molekulargenetische Untersuchungen 83 Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Diagnostik ermethode folgt stufenweise durch Amplifikation der entsprechenden Exons mittels PCR und Sequenzierung: Stufe 1: Untersuchung der häufigsten Mutationen im PRSS1-Gen: R122H (Exon 3), N29I (Exon 2), A16V (Exon 1) und im SPINK1-Gen: N34S (Exon 3) Stufe 2: Komplettsequenzierung des PRSS1-Gens (Exons 1-5) und des SPINK1-Gens (Exons 1-4 mit Promotorregion) inklusive aller Exon/Intron Grenzen Stufe 3: (nach Rücksprache): Untersuchung der 33 in der kaukasischen Bevölkerung häufigsten Mutationen des CFTR-Gens. Untersuchungs- 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Keim, World J Gastroenterol 14:1011-1015, 2008; Keiles and Kammerscheidt, Pancreas 33:221-227, 2006; Whitcomb et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287:G315G319, 2004; Witt, Gut 52:31-45, 2003 Audrezet et al., Eur J Hum Genet 10:100-106, 2002; Witt et al., Nat Genet 25:213-216, 2000 Phenylketonurie PAH-Gen (Phenylalanin-Hydroxylase-Gen; Genort: 12q23.2; OMIM #261600) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die klassische Phenylketonurie ist eine erbliche Stoffwechselkrankheit, die zu geistiger Retardierung und anderen neurologischen Problemen führt, wenn die Behandlung nicht in den ersten Lebenswochen beginnt. Die Inzidenz in der Allgemeinbevölkerung Europas variiert zwischen 1:5000 bis 1:15000. Ursache der Krankheit ist ein Mangel der Phenylalanin-Hydroxylase, welche die essentielle Aminosäure Phenylalanin in die Aminosäure Tyrosin umwandelt. Ein Defekt dieser Umwandlung führt zum Anstau von Phenylalanin, wodurch Phenylpyruvat, Phenylacetat oder Phenyllactat entstehen. Was jedoch genau die Schädigung des ZNS bewirkt, ist nicht bekannt. Der Enzymmangel ist von Patient zu Patient unterschiedlich schwer ausgeprägt. Die genetische Untersuchung dient zur Feststellung eines möglichen Carrier-Status sowie der weiteren Abklärung bei grenzwertigen Phenylalaninkonzentrationen im Serum. Indikation Hyperphenylalaninämien, insbesondere Phenylketonurie Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 13 Exons, Duplikations- und Deletionsscreemethode ning mit MLPA Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Scriver, C. R., Hum. Mutat. 28: 831-845, 2007 Zurfluh, M. R. et al., Hum. Mutat. 29: 167-175, 2008 www.orpha.net 84 Molekulargenetische Untersuchungen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI) SERPIN 1-Gen Genort: q21.3-q22; MIM ID: *173360 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Für die Neigung zur Thrombose/Thromboembolie und auch für eine erhöhte Abortneigung werden neben äußeren Einflüssen genetische Dispositionen verantwortlich gemacht. Meist sind Veränderungen (Mutationen) in verschiedenen Genen (z. B. Faktor-II, Faktor-V-LEIDEN, MTHFR (MethylenTetrahydrofolat-Reduktase) und PAI (Plasminogen-Aktivator-Inhibitor)-1) ursächlich vorhanden. Diese „mutierten“ Gene trägt ein höherer Prozentsatz der Bevölkerung und wird sie mit der Wahrscheinlichkeit von 50% auch wieder an eigene Kinder vererben. Insgesamt zeigt die Ausprägung eine „Bevorzugung“ des weiblichen Geschlechts. Der vom SERPIN1-Gen codierte endotheliale Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) hemmt den gewebespezifischen Plasminogenaktivator (t-PA) und den Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (u-PA). Da der t-PA und der u-PA im fibrinolytischen System die Auflösung von Blutgerinnseln bewirken, führt eine gesteigerte PAI-1-Aktivität zur Beeinträchtigung der Fibrinolyse. Der 4G/5G-Insertions/Deletions-Polymorphismus an Position -675 des SERPIN1-Gens liegt im regulatorischen Bereich. Das 4G-Allel ist mit einer erhöhten Transkriptionsrate und damit einer erhöhten PAI1-Expression bzw. -Aktivität assoziiert. Für den G>A-Polymorphismus an Position –844 wurde nachgewiesen, dass die Homozygotie des Allels A (A/A) gehäuft bei Faktor V-Anlageträgern mit Venenthrombosen vorliegt, während bei Vorliegen des G-Allels kein erhöhtes Thromboserisiko besteht. Eine erhöhte Konzentration des PAI-1 findet sich auch bei Personen mit Adipositas. Indikation V. a. Thrombophilie, Adipositas Mutationen Der 4G/5G-Insertions/Deletions-Polymorphismus an Position -675 und der Basenaustausch G/A an Position –844 des SERPIN1-Gens Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden die relevanten Sequenzbereiche mitmethode tels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Kohler und Grant, New Engl J Med 342, 1792-1801, 2000 Margaglione et al., Arterioscler Thromb Vasc. Biol 18, 152-156, 1998 Hermans et al., Lancet 354, 556-560, 1999 Molekulargenetische Untersuchungen 85 Prader-Willi-Syndrom (PWS) SNRPN (Small nuclear ribonucleoprotein N; Genort: 15q11-q13; OMIM #176270, *182279) Erbgang Autosomal-dominant bei paternaler Vererbung, überwiegend sporadische Fälle Klinische Bedeutung Das Prader-Willi-Syndrom ist wie das Angelman Syndrom (s. o.) eine neurogenetische Erkrankung, die durch den Funktionsverlust von elternspezifisch geprägten Genen im langen Arms von Chromosom 15q11.2-12 verursacht wird. Im Gegensatz zu dem AS sind die verantwortlichen Gene für das PWS nur auf dem väterlich ererbten Chromosom aktiv. Neugeborene haben ein geringes Geburtsgewicht und einen reduzierten Muskeltonus und weisen in den ersten Lebendmonaten eine Trinkschwäche auf. Mit 1½ bis 2 Jahren entwickelt sich eine Hyperphagie die ohne entsprechende Kontrolle der Kalorienzufuhr zu einer massiven Adipositas und daraus resultierenden Folgeerkrankungen führen kann. Der schwer beherrschbare Essdrang wird zu einem zentralen Problem bei Kindern mit PWS. Bereits im Kleinkindalter fallen die verhältnismäßig kleinen Hände und Füße, eine geringe Körpergröße und faziale Besonderheiten (mandelförmige Augen, herabgezogene Mundwinkel) auf. PWS-Patienten zeigen eine verminderte Intelligenz, die von einer niedrigen normalen Intelligenz bis hin zu einer schweren mentalen Retardierung reichen kann. Die Sprachentwicklung ist deutlich verzögert und Verhaltensauffälligkeiten beinhalten vor allem Wutausbrüche, ablehnendes Verhalten und Stehlen von Essen. Nahezu bei allen PWS Patienten lässt sich eine Veränderung auf dem väterlich erebten Chromosom 15 nachweisen. Bei ca. 70% liegt eine 3-4 Megabasen große Deletion (del 15q11-q13) vor, bei ca. 25-30% der Patienten findet man anstelle eines väterlichen Chromosoms 15 ein zweites mütterliches Chromosom (uniparentale Disomie 15) und 1% der Fälle haben einen Imprinting-Fehler, bei dem das väterliche Chromosom 15 eine mütterliche Prägung aufweist. In weniger als 1% der Fälle lässt sich die genetische Ursache nicht klären. Welche der väterlich geprägten Gene in 15q11-13 für die jeweiligen phänotypischen Veränderungen des PWS verantwortlich sind, ist derzeit noch nicht bekannt. Eine Schlüsselfunktion scheint das SNORD116-Gen (HBII-85 snoRNA Gen) zu haben. Indikation Geringes Geburtsgewicht, ausgeprägte Hypotonie („floppy infant“) und Trinkschwäche im Säuglingsalter; Hyperphagie mit resultierender Adipositas ca. ab dem 18. Lebensmonat; kleine Hände und Füße, geringe Körpergröße, faziale Auffälligkeiten, Hypogenitalismus, Hodenhochstand, Entwicklungsverzögerung bis mentale Retardierung. 86 Molekulargenetische Untersuchungen Mutationen 70% Paternale Deletion 15q11-q13 25-30% Maternale uniparentale Disomie 15 1% Imprintingdefekt Selten balanzierte Translokation mit Bruchpunkt im SNRPN-Locus Material Ca. 2-5 ml EDTA-Blut Für eine Unterscheidung zwischen Imprinting-Defekt und uniparentaler Disomie ist zusätzlich EDTA-Blut von beiden Eltern erforderlich. Untersuchungs- Methylierungsspezifische MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Ammethode plification) zum Nachweis einer Deletion, eines Imprintingdefektes oder einer maternalen uniparentalen Disomie in 15q11.2-12. Untersuchungs- Ca. 2 Wochen dauer Literaturhinweise Jin, Korean J Pediatr 54:55-63, 2011 Horsthemke et al., Medgen 22:282-286, 2010 Buiting, Am J Med Genet C Semin Med Genet 154C:365-376, 2010 Protein C PROC-Gen Genort: 2q13-14; OMIM #176860 Erbgang Autosomal-rezessiv oder -dominant Klinische Bedeutung Protein C ist Teil eines Multifaktorkomplexes. Der gebundene und aktivierte Protein C-Komplex degradiert die aktivierten Faktoren Va und VIIIa. Der heterozygote Protein C-Mangel ist durch wiederkehrende venöse Thrombosen gekennzeichnet. Jedoch können viele Erwachsene mit einem heterozygotem Mangel asymptomatisch sein. Indikation V. a. angeborenen Protein C-Mangel, rezidivierende Thromboembolien und tiefe Venenthrombosen unklarer Ätiologie. Mutationen Mehr als 160 verschiedene Mutationen sind bislang geschrieben. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 9 Exons, Deletions- und Duplikationsscreemethode ning über MLPA Untersuchungs- 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Millar, D. S. et al.;Hum. Genet. 106: 646-653, 2000 Rocchi, M. et al.; Hum. Genet. 74: 30-33, 1986 Molekulargenetische Untersuchungen 87 Protein S PROS1-Gen; Genort: 3q11-; OMIM # 176880 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Protein S ist ein körpereigenes Vitamin-K-abhängiges Antikoagulans, welches im Blut normalerweise zu ca. 60% an das C4b Bindungsprotein gebunden vorliegt. Das freie Protein S dient hingegen dem Protein C als Kofaktor bei der Inaktivierung der Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa. Ein Mangel an Protein S führt daher zu einer erhöhten venösen Thromboseneigung. Erniedrigte Protein S-Werte können auf angeborenen Synthesestörungen beruhen oder auf verschiedene physiologische oder pathologische Umständen zurückzuführen sein. So sind Protein S-Spiegel physiologischerweise während der Schwangerschaft erniedrigt. Auch unter oraler Kontrazeption, bei allen fortgeschrittenen Leberfunktionsstörungen, bei Vitamin K Mangel und unter Cumarin-Therapie finden sich verminderte Werte. Ein angeborene Protein S-Mangel ist hingegen mit einer Prävalenz von ca. 0,16% - 0,21% eher selten, führt aber bei 50% der heterozygot Betroffenen häufig schon vor dem 45. Lebensjahr zu tiefen Venenthrombosen und pulmonalen Embolien. Unter Cumarin-Therapie wurden bei diesen Patienten schwere Nekrosen beschrieben. Ein homozygote Protein S-Mangel scheint mit dem Leben nur bedingt vereinbar und kann sich im Neugeborenen Alter durch eine Purpura fulminans manifestieren. Art und Lokalisation von Mutationen im PROS1-Gen beeinflussen die klinische Ausprägung des Protein S-Mangels. Diagnostisch werden verschiedene Formen unterschieden: Typ Defekt Protein S-Antigen gesamt Protein-S funktionell Protein S-Antigen frei I quantitativ erniedrigt erniedrigt erniedriegt II qualitativ normal erniedrigt normal III quantitativ normal erniedrigt erniedrigt 88 Molekulargenetische Untersuchungen Indikation V. a. hereditären Protein S-Mangel, rezidivierende Thromboembolien und tiefe Venenthrombosen unklarer Ätiologie. Als relative Kontraindikation ist ein mäßig erniedrigter Wert während einer Schwangerschaft anzusehen. Mutationen In Korrelation zum Phänotyp werden Missense oder Nonsensemutationen sowie größere Deletionen einzelner Exons oder des gesamten Gens gefunden. 2-5 ml EDTA-Blut Material Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 15 Exons, Deletionsscreening über MLPA methode Untersuchungs- 4-6 Wochen dauer Literaturhinweise Duebgen S. et al., Am J Clin Pathol, 137:178-184 (2012) Lundwall, A. et al.;. Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 6716-6720 (1986) Schmidel, D. K. et al., Biochemistry 29: 7845-7852 (1990) Prothrombin (Gerinnungsfaktor II) Dimorphismus Faktor II-Gen Genort: 11p11-q12; OMIM +176930 Klinische Bedeutung Der Blutgerinnungsfaktor II (Prothrombin) ist eine inaktive Vorstufe des Thrombins. Prothrombin wird gespalten und damit in die aktive Form Thrombin überführt, welches Fibrinogen in Fibrin umwandelt. Dies ist der letzte Schritt der Gerinnungskaskade. Ein G → A Basenaustausch an Position 20210 in der 3‘- nichttranslatierten Sequenz des Prothrombin-Gens führt zu einem erhöhten Prothrombin- Spiegel mit einer vermehrten Prothrombin-Aktivität, welche mit einem moderat erhöhten Risiko für venöse Thrombosen assoziiert ist. Im Vergleich zur Normalbevölkerung haben heterozygote Träger dieser Mutation ein 3 bis 4fach erhöhtes Thromboserisiko. Bei einem Zusammenwirken mehrerer Risikofaktoren (z. B. Rauchen oder Einnahme oraler Kontrazeptiva) bzw. einer Kombination dieser o. g. Mutation mit der Faktor V-Leiden-Mutation in heterozygoter oder homozygoter Form, erhöht sich das Risiko für Venenthrombosen um ein Vielfaches. Indikation V. a. familiäre Thrombophilie Mutationen G20210A-Mutation Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein Abschnitt des methode Prothrombingens, der den Mutationsort beinhaltet, wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das Vorhandensein der Mutation wird durch eine reverse Hybridisierung nachgewiesen. Untersuchungs- 2-4 Tage dauer Literaturhinweise Poor et al., Blood 88(10):368- 3703, 1996 De Stefano et al., New Eng J of Med 341(11):801- 806, 1999 Molekulargenetische Untersuchungen 89 Pyruvatkinase, erythrozytäre PKLR-Gen (Pyruvatkinase; Genort: 1q22; OMIM #266200) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Dieser Enzymdefekt ist seltener als der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel. Er soll bevorzugt bei Nordeuropäern vorkommen.Es handelt sich um den häufigsten Defekt der erythrozytären Glykolyse. Unterbrochen wird die biochemische Kaskade vom Glycerinaldehyd zum Pyruvat und Ljctat. Reife Erythrozyten haben keine Mitochondrien mehr, deshalb ist die Glykolyse sehr wichtig zur Energiegewinnung. Der resultierende ATP-Mangel kann die Zellform und Membranstruktur der Erythrozyten nicht mehr sichern. Die Erythrozyten werden im rerikuloendothelialen System vorzeitig abgebaut. Die hämolytische Anämie bei Pyruvatkinasemangel wird besser toleriert als andere Anämien mit gleich niedrigem Hämoglobin, weil der Enzymdefekt sekundär den Gehalt der Erythrozyten an 2.3-Biphosphoglycerat (2.3-BPG) erhöht. 2.3-BPG verschiebt die Sauerstoff-HämoglobinDissoziationskurve nach rechts und erleichtert die Freisetzung von Sauerstoff aus dem Hämoglobin. Die Hämolyse kann schon im Kindesalter, in manchen Fällen auch erst nach dem 20. Lebensjahr manifest werden. Man findet dann die typischen Zeichen der Hämolyse. Im Kindesalter kommen Skelettveränderungen ähnlich wie bei der homozygoten Form der Thalassämie vor. Indikation Verdacht auf angeborene, nicht-sphärozytäre, chronisch hämolytische Anämien, zum Teil auch durch Medikamentenunverträglichkeit oder Infektionen hervorgerufene, akut auftretende hämolytische Krisen. Mutationen Bisher wurden mehr als 190 ursächliche PKLR-Mutationen beschrieben. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- PCR und Sequenzierung der kodierenden Exons 1-12 methode Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Baronciani, L., Bianchi, P., Zanella, A., Blood Cells Molecules Dis. 22: 85-89, 1996. Beutler, E., Baronciani, L., Hum. Mutat. 7: 1-6, 1996. RETT-Syndrom MECP2-Gen (Methyl-CpG-binding protein 2; Genort: Xq28; OMIM *300005, #312750) Erbgang X-chromosomal-dominant Klinische Bedeutung Bei dem Rett-Syndrom handelt es sich um eine Encephalopathie mit schwerwiegender mentaler Retardierung, die mit einer Inzidenz von 1:10.000 bis 1:15.000 hauptsächlich Mädchen betrifft. 90 Molekulargenetische Untersuchungen Zunächst entwickeln sich die Kinder normal, bis im Alter von 6 bis 18 Monaten ein Entwicklungsstillstand eintritt. Es folgt ein Rückgang bereits erworbener sprachlicher und motorischer Fertigkeiten und der Fähigkeit zu sozialer Interaktion. Typisch ist das Auftreten von stereotypen Handbewegungen. Weitere Symptome sind verzögertes Wachstum, Mikrozephalie, Skoliose, Gangataxien, Krampfanfälle, respiratorische Störungen und Autismus. Das Ausmaß dieser Verluste ist sehr variabel und neben der klassischen Form des Rett-Syndroms werden atypische Varianten beobachtet. Krankheitsrelevant sind Mutationen des MECP2-Gen, die meist de novo auftreten. Das Genprodukt ist ein DNA-bindendes Protein, das für die normale Funktion der Nervenzellen und für die Gehirnentwicklung essentiell ist. Bei ca. 90% bis 95% der Patienten mit klassischem Rett-Syndrom und 30% bis 40% mit atypischem Rett-Syndrom können Mutationen im MECP2-Gen nachgewiesen werden. In ca. 10% der Fälle werden auch Deletionen, bei einigen männlichen Patienten auch Duplikationen des gesamten MECP2-Gens, zum Teil mit Duplikation von benachbarten Regionen, festgestellt. MECP2-Punktmutationen können auch bei 1,3% bis 1,7% männlicher Kinder zu einem breiten Spektrum von neurologischen Erkrankungen von milder mentaler Retardierung bis hin zu neonatal letalen Encephalopathien führen, wobei Jungen mit typischer Rett-Symptomatik nur selten beschrieben sind. Bei asymptomatischen Frauen wurde gezeigt, dass MECP2-Mutationen in Kombination mit einer weitgehend verschobenen X-Chromosom-Inaktivierung vorlagen, die den Schweregrad der Erkrankung beeinflusst. Gelegentlich finden sich auch bei Patienten mit einem unspezifischen klinischen Bild des Angelman-Syndroms oder einer XLMR (X-linked mental retardation) sowie bei Makroorchidismus (PPM-X-Syndrom) Mutationen im MECP2-Gen. Indikation V. a. Rett-Syndrom; männliche Säuglinge mit unklarer schwerer Enzephalopathie Mutationen Punktmutationen, Deletionen und Duplikationen im MECP2-Gen; 70% aller Mutationen betreffen die 8 häufigsten Mutationen (R106W, R133C, T158M, R168X, R255X, R270X, R294X, R306C) Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Exons 1 bis 4 methode des MECP2-Gens werden mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung analysiert. Das Vorliegen von Deletionen oder Duplikationen wird mittels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) untersucht. Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Villard L, J Med Genet 44:417-423, 2007; Williamson and Christodoulou, Eur J Hum Genet 14:896-903, 2006; Van Esch et al., Am J Hum Genet 77:442-453, 2005; Amir et al., Nature Genetics 42:e15, 1999; Wan et al., Am J Hum Genet 65:1520-1529, 1999. Molekulargenetische Untersuchungen 91 SHOX-(Short Stature Homeobox) Haploinsuffizienz, LeriWeill Dyschondrosteosis (LWD), Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) SHOX-Gen (Short stature homeobox, Genort: Xpter-p22.32; Ypter-p11.2, OMIM *312865, #127300, #249700, #302950) Erbgang Pseudoautosomal-dominant Klinische Bedeutung Wachstumsstörungen sind mit einer Inzidenz von 3:100 relativ häufig. Die Körpergröße eines Menschen wird durch verschiedene genetische und umweltbedingte Faktoren beeinflusst. Minderwuchs kann durch Wachstumshormon-Mangel, Wachstumshormon-Rezeptor-Defekte und Mutationen in Genen, die zu Skeletterkrankungen führen, verursacht werden. Eine SHOX-Haploinsuffizienz mit heterozygot vorliegenden Mutationen im SHOX-Gen wurde nachgewiesen bei 2% bis 15% der Patienten mit idiopatischem Kleinwuchs, bei 50% bis 90% der Patienten mit Leri-Weill Dyschondrosteosis und bei fast 100% der Mädchen mit Turner-Syndrom. Patienten mit dem schwerwiegenderen Phänotyp der Langer Dysplasie weisen SHOX-Gen-Mutationen in homozygoter Form auf. Das SHOX-Gen liegt in der pseudoautosomalen Region (PAR1) der X- und Y-Chromosomen und entgeht der X-Inaktivierung. Durch alternatives Spleißen werden zwei Isoformen gebildet, von denen nur das längere Genprodukt (SHOXa) als Transkriptionsaktivator wirksam ist. SHOX-Mutationen können auch innerhalb einer Familie zu variablen Phänotypen führen. Indikation Minderwuchs, idiopathischer Kleinwuchs (Körpergröße unter der 3. Perzentile für das chronologische Alter), dispropotioniertes Wachstum, Mesomelie (Verkürzung von Unterarmen und Unterschenkeln), MadelungDeformität (Knochenfehlbildungen der Handgelenke) Mutationen Deletionen, Duplikationen und Punktmutationen im SHOX-Gen Etwa 80% aller SHOX-Mutationen sind Deletionen mit einer Größe zwischen 90 kb und 2.5 Mb oder mehr. Die häufigsten Punktmutationen werden in Exon 3 und 4 gefunden, die den Bereich der Homeodomäne kodieren. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert und zunächst mitmethode tels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplifikation) nach vorliegenden Deletionen bzw. Duplikationen des SHOX-Gens untersucht. Bei negativem Ergebnis werden die Exons 2 bis 6a des SHOXa-Gens mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht 92 Molekulargenetische Untersuchungen Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Binder, Horm Res Peadiatr 75:81-89, 2011; Schneider et al., Am J Hum Genet 77:89-96, 2005; Rappold et al., J Clin Endocrin & Metab, 3:1402-1406, 2002; Rao et al., Nat Genet 16:54-63, 1997 Spinobulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy Syndrom) Androgenrezeptor-Gen (AR, Genort: Xq11-q12; OMIM #313200) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang X-chromosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Patienten mit Spinobulbärer Muskelatrophie (SBMA) zeigen eine proximale Muskelschwäche und -atrophie, sowie Faszikulationen, die hauptsächlich die perioralen Muskeln betreffen. Weitere häufig auftretende Merkmale sind Intentionstremor, Muskelkrämpfe, Schluckbeschwerden, eine periphere Androgenresistenz mit Hodenatrophie, eingeschränkter Fruchtbarkeit und Gynäkomastie. Die neurologische Symptomatik beginnt meist zwischen dem 20. und 50. Lebensjahr und verläuft langsam progressiv. In der Regel betrifft die Erkrankung an SBMA nur Männer, Frauen mit einem heterozygot vorliegenden verlängerten Allel zeigen keine Symptome, können aber diese Krankheit übertragen. Eine verlängerte CAG-Nukleotidfolge im translatierten Bereich des Androgenrezeptor-Gens ist die für die Krankheit verantwortliche Mutation. Diese hat den Einbau einer zu langen Abfolge von Glutaminresten in das Androgenrezeptor- Protein zufolge. Das Protein verliert seine ursprüngliche Struktur und damit seine eigentliche Funktion in spinal und bulbär lokalisierten Motoneuronen. Pathophysiologisch wird eine Degeneration der Spinalwurzelganglien beobachtet. Während man bei Normalpersonen eine Folge von weniger als 34 Tripletts findet, tragen Betroffene 38 und mehr CAG-Kopien. Indikation Muskelschwäche und -atrophie (v. a. perioral) Mutationen CAG-Expansion im AR-Gen Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein Abschnitt des methode Androgenrezeptor-Gens, der die CAG-Triplettwiederholung beinhaltet, wird mittels PCR amplifiziert. Aus der Längenbestimmung des PCR-Produktes über Kapillarelektrophorese wird die Anzahl der CAG-Nukleotidtripletts ermittelt. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Atsuta et al., Brain. 129:1446–55, 2006; Kreß et al., Med Genetik: 5:269- 270, 1993; La Spada et al., Nature 352:77- 79, 1991 Molekulargenetische Untersuchungen 93 Spinocerebelläre Ataxien (SCA, Olivopontocerebelläre Atrophien) SCA1, SCA2, SCA3 (Machado-Joseph disease (MJD)), SCA6 und SCA7 SCA1: ATXN1-Gen (Genort: 6p23; OMIM *601556, #164400) SCA2: ATXN2-Gen (Genort: 12q24; OMIM *601517, #183090) SCA3: ATXN3-Gen (Genort: 14q24.3-q31; OMIM *607047, #109150) SCA6: CACNA1A-Gen (Genort: 19p13; OMIM *601011, #183086) SCA7: ATXN7-Gen (Genort: 3p21.1-p12; OMIM *607640, #164500) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die spinocerebellären Ataxien sind eine Gruppe heterogener neurodegenerativer Erkrankungen mit progressiven neuronalen Verlusten, die in unterschiedlichem Ausmaß das Kleinhirn, die Hirnstammkerne und den Tractus spinocerebellaris betreffen. Das klinische Bild ist meist gekennzeichnet durch Stand- und Gangataxie, Dysarthrie, Schluckschwierigkeiten u. a.. Darüber hinaus weisen einige Patienten eine Ophthalmoplegie, ein erniedrigtes Vibrationsempfinden und eine Sphinkter-Funktionsstörung auf. Bei der SCA7 ist die Ataxie assoziiert mit einer retinalen Degeneration. Das relativ späte Manifestationsalter liegt in der Regel zwischen dem 30. oder 40. Lebensjahr, kann aber auch innerhalb einer Familie sehr variabel sein. Bisher konnten einige Gene identifiziert werden, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind und für die Entstehung verschiedener SCA-Typen verantwortlich sind. Allen hier untersuchten SCA-Genen liegt als krankheitsverursachende Mutation die Verlängerung einer CAG-Nukleotidfolge zugrunde. Die Anzahl der CAG-Nukleotidwiederholungen bei Normalpersonen ist je nach Gen variabel. Krankheitsrelevante Symptome treten auf, wenn die jeweils kritische Triplettanzahl von CAG-Nukleotiden überschritten wird. Die Triplettwiederholung liegt im translatierten Bereich der Gene und bewirkt bei pathologischer Triplettverlängerung den Einbau einer zu großen Anzahl von Glutaminresten in das entsprechende Protein. Dies führt höchstwahrscheinlich zu einer sogenannten ‚gain of function‘, wobei das dann toxische Protein einen neuronen- und krankheitsspezifischen Zelltod verursacht. Indikation Störung der Bewegungskoordination (Stand- und Gangataxie), Sprechstörungen Mutationen CAG-Expansion in den Genen ATXN1 (für SCA1), ATXN2 (für SCA2), ATXN3 (für SCA3), CACNA1A (für SCA6) und ATXN7 (für SCA7) Material 2-5 ml EDTA-Blut 94 Molekulargenetische Untersuchungen Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein die CAGmethode Triplettwiederholung beinhaltender Abschnitt des Ataxin-1- (SCA1), Ataxin-2- (SCA2), Ataxin-3- (SCA3/MJD), a1A Calcium- Kanal- (SCA6) oder des Ataxin-7-Gens wird mittels PCR amplifiziert. Die Längenbestimmung des jeweiligen PCR-Produktes und die daraus resultierende Anzahl der CAG-Nukleotidtripletts erfolgt mittels Kapillarelektrophorese. Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Sequeiros J et al., Eur J Hum Genet. 18:1188-1195, 2010 Riess et al., Deutsches Ärzteblatt 98: A1546-1558, 2001 SCA1: Orr et al., Nat Genet 4:221-226, 1993 SCA2: Imbert et al., Nat Genet 14:285-291, 1996 SCA3: Kawaguchi et al., Nat Genet 8:221-227, 1994 SCA6: Zhuchenko et al., Nat Genet 15:62-69, 1997 SCA7: David et al., Nat Genet 17:65-70, 1997 Taubheit, nicht syndromisch, neurosensorisch, DFNB1 (DeaFNess Typ B1) GJB2-Gen / Connexin 26 (Genort: 13q11-q12; OMIM *121011) GJB6-Gen / Connexin 30 (Genort: 13q12; OMIM *604418) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Eines von 650 Kindern wird mit einem schwerwiegenden kongenitalen Gehörverlust geboren, etwa die Hälfte der Ursachen ist genetischen Ursprungs. Die autosomal rezessive, nicht syndromische, neurosensorische Taubheit ist die häufigste Form von vererbter Taubheit im Kindesalter. Die Erkrankung zeigt eine weitreichende genetische Heterogenität (ca. 100 Loci) und nur beschränkte klinische Differenzierungsmöglichkeiten. Im Lokus DFNB1 (deafness neurosensory, autosomal recessive 1) auf Chromosom 13 konnten die beiden Gene GJB2 (gap junction beta-2) und GJB6 identifiziert werden. Mutationen in dem GJB2-Gen können bei bis zu 50% der Patienten mit autosomal rezessiver, nicht syndromischer, neurosensorischer Taubheit nachgewiesen werden. GJB2 kodiert für das Protein Connexin 26 aus der Connexin-Familie. Diese Transmembranproteine bilden spezialisierte Strukturen auf Plasmamembranen (sog. ‚gap junctions‘). Aus diesen Porenproteinen entsteht ein Netzwerk, durch das eine Interaktion und Kommunikation von Zellen im Zellverband ermöglicht wird (z. B. zur Erhaltung der K+ Homeostase der Innenohrzellen von Säugern). Die GJB2-Mutationsträger zeigen normale Intelligenz und einen unauffälligen Phänotyp ohne äußere Ohrfehlbildungen. Die Schwere des Gehörschadens ist sehr variabel und kann selbst innerhalb einer Familie nicht vorhergesagt werden. Molekulargenetische Untersuchungen 95 Klinische Bedeutung Die häufigste, in verschiedenen Bevölkerungsgruppen (u. a. Kaukasiern) vorkommende GJB2-Mutation (ca. 70% der Allele) betrifft die Deletion der Base G (Guanin) in Position 35 in einer Abfolge von 6 Guaninen (35delG). Diese Mutation findet man auch als Neumutation. Weitere Mutationen in der gesamten kodierenden Sequenz des GJB2-Gens sind beschrieben, die in homozygoter oder zusammengesetzt heterozygoter Form vorliegen können. Bei Patienten mit nur einer GJB2-Mutation in heterozygoter Form zeigen 10-50% (in Abhängigkeit von ihrer ethnischen Herkunft) zusätzlich eine Deletion des GJB6-Gens (digenische Vererbung). Selten wurde diese Deletion (del(GJB6-D13S1830)) auch in homozygoter Form beobachtet. Indikation Schwerhörigkeit (congenital, nicht progressiv, neurosensorisch) Mutationen GJB2-Mutationen in den Exons 1 und 2, GJB6-Deletion [del(GJB6D13S1830)] Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. methode Stufe 1: Mittels PCR wird zuerst das Exon 2 und ggf auch Exon 1 des GJB2Gens amplifiziert und sequenziert. Stufe 2: Untersuchung auf eine Deletion [del(GJB6-D13S1830)] im GJB6Gen mittels Multiplex-PCR und Agarosegelelektophorese. Untersuchungs- Ca. 2-3 Wochen dauer Literaturhinweise Snoeckx et al., Am J Hum Genet, 77:945-957, 2005 Roux et al., BMC Medical Genetics, 5, 2004 (http://www.biomedcentral.com/1471-2350/5/5) Del Castillo et al., Am J Hum Genet, 73: 1452-8, 2003 Denoyelle et al., Hum Mol Genet, 6:2173-2177, 1997 Kelsell et al., Nature 387:80-83, 1997 Thalassämie (alpha) HBA-Gen (Hämoglobin alpha, Alpha-Globin; Genort: 16p13.3; OMIM +141800, *141850) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Alpha-Thalassämie gehört zu den Hämoglobinopathien, und kommt wie alle Thalassämien besonders häufig in Malaria-Endemiegebieten (SüdostAsien, Arabien, Afrika und Mittelmeerländer) vor. Die häufigste molekulargenetische Ursache für Alpha-Thalassämie ist die Deletion eines oder mehrerer alpha-Globin-Gene. In seltenen Fällen können auch Punktmutationen bzw. kleinere Deletionen und Insertionen in den alpha-GlobinGenen für eine alpha-Thalassämie ursächlich sein. Durch ein Defizit an alpha-Globinketten kommt es zur vermehrten Bildung von gamma- und beta-Globinen, die zu pathologischen Hämoglobinvarianten führen und maßgeblich am Krankheitsbild der Alpha-Thalassämie beteiligt sind. 96 Molekulargenetische Untersuchungen Da in der normalen menschlichen Zelle der alpha-Globin-Genkomplex aus vier alpha-Globin-Genen besteht (je ein HBA1- und ein HBA2-Gen auf jedem Chromosom 16), ist der Schweregrad des Krankheitsbildes abhängig von der Anzahl der deletierten bzw. defekten alpha-Globin-Gene: •Asymptomatische α-Thalassaemia minima (= heterozygote α+ (-α/αα) Thalassämie). Eine fehlende oder defekte Gen-Kopie hat keine klinischen Auswirkungen. • Bei Patienten mit α-Thalassaemia minor liegen zwei defekte und zwei normale alpha-Globin-Genen vor entweder als heterozygote α° Form (--/αα) oder als homozygote α+ Form (-α/-α). Die Patienten weisen eine Mikrozytose und Hypochromasie in unterschiedlicher Ausprägung und häufig eine leichte Anämie auf. • Patienten mit drei inaktiven Genen haben die „HbH-Krankheit“. Der Mangel an alpha-Ketten führt zur vermehrten Bildung von Tetrameren aus vier beta-Ketten (Hämoglobin H). Die klinischen Symptome werden einerseits durch die geringe Löslichkeit von Hämoglobin H verursacht, die zu einem vorzeitigen Abbau der Erythrozyten führt. Zum anderen hat die erhöhte Sauerstoffaffinität von Hämoglobin H einen Sauerstoffmangel im Gewebe zu Folge. In Abhängigkeit von der Konzentration an Hämoglobin H ist der Schweregrad der Erkrankung sehr variabel und reicht von einer nicht behandlungsbedürftigen Form bis zu einer ausgeprägten chronischen Hämolyse, die mit Bluttransfusionen behandelt werden muss. • Die schwerste Form der α-Thalassämie, das Hb-Bart‘s Hydrops fetalis Syndrom (= homozygote α° Form (--/--)) führt häufig schon während der Schwangerschaft oder perinatal zum Tod des Kindes. Durch das vollständige Fehlen der alpha-Ketten werden Tetrameren aus gammaGlobinketten (Hämoglobin Bart) gebildet, einer Hämoglobinvariante, die für den Sauerstofftransport nutzlos ist. Indikation Auffällige Hb-Elektrophorese und auffälliges Blutbild mit Verdacht auf α-Thalassämie, hypochrome mikrozytäre Anämie; pränatal bei bekannter Mutation beider Eltern. Mutationen Häufigste Form: vollständige Deletion eines oder mehrerer der insgesamt vier α-Globin-Genkopien. Zusätzlich wurden mehr als 50 Punktmutationen oder kleinere Deletionen bzw. Insertionen innerhalb des Gens beschrieben. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert und das α-Globinmethode Gen zunächst mittels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) auf Deletionen untersucht. Bei negativem Ergebnis werden die drei kodierenden Exons von α-Globin inklusive Exon/Introngrenzen mit PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht. Molekulargenetische Untersuchungen 97 Untersuchungs- Ca. 4-6 Wochen dauer Literaturhinweise Galanello, in: GeneReviews (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1435/) Muncie and Campbell, Am Fam Physician 80:339-344, 2009 Chui et al., Blood 101:791-800, 2003 Chui and Waye, Blood 91:2213-2222, 1998 Thalassämie (beta) und Sichelzellanämie HBB-Gen (Hämoglobin beta, Beta-Globin; Genort: 11p15.5; OMIM +141900) Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die β-Thalassämie beruht auf Gendefekten im β-Globin-Gen auf Chromosom 11, die zu einer verminderten oder fehlenden β-Globin-Synthese führen. • Heterozgote Mutationsträger mit einer „Thalassaemia minor“ weisen mit einer leichten Blutarmut und teilweise leicht vergrößerten Milz in der Regel keine therapiebedürftige Symptomatik auf. • Homozygote Mutationsträger haben die schwere Form der „Thalassaemia major“, (= Cooley-Anämie) die bereits im ersten Lebensjahr zu Gedeihstörung, Blässe, Ikterus und Hepatosplenomegalie führt. Diese Patienten sind lebenslang transfusionsbedürftig. Eine Knochenmarktransplantation ist die einzige kurative Behandlung. • Eine Zwischenform ist die „Thalassaemia intermedia“ mit einem relativ variablen Spektrum bezüglich des Phänotyps und dem Zeitpunkt des Auftretens der ersten Symptome. Bei der Thalassaemia intermedia sind auch autosomal dominant vererbbare Formen bekannt. Eine Mutation im β-Globin in heterozygoter Form kann in Kombination mit einer Veränderung in einem anderen Globin-Gen (z. B. einer alphaGlobin-Genduplikation) vorliegen. In Asien wird häufig ein Aminosäureaustausch von Glutaminsäure durch Lysin an Position 26 der b-Globinkette (= HbE-Mutation) beobachtet. Die Sichelzellenanämie ist eine Multisystem-Erkrankung, die Episoden akuter Krankheit und progressiven Organ-Schaden vereinigt. Hämoglobin-Polymerisierung, die zu Erythrozytenrigidität und Gefäßverschlüssen führt, ist wesentlich bezüglich der Pathophysiologie der Krankheit. Auch chronische Anämie, Hämolyse und Vasculopathien werden beschrieben. Die häufigste Ursache der Sichelzellenanämie ist die HbS Variante mit der HämoglobinSS-Krankheit, die hauptsächlich bei Afrikanern vorkommt. 98 Molekulargenetische Untersuchungen Indikation Blässe, Ikterus, Infektneigung, Gedeihstörung und Hepatosplenomegalie im Verlauf des ersten Lebensjahres mit V. a. beta-Thalassämie; erhöhter Anteil von HbF in der Hb-Elektrophorese V. a. Sichelzellanämie Mutationen Es sind mehr als 400 Punktmutationen oder kleinere Deletionen bzw. Insertionen innerhalb des Gens beschrieben; längere Deletionen werden nur selten nachgewiesen. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die drei kodiemethode renden Exons inklusive Exon/Introngrenzen des ß-Globin Gen werden mit PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht. Untersuchungs- 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Kohne et Kleihauer, Dtsch Arztebl Int 107: 65-71, 2010 Weatherall, Am J Hum Genet 74:385-392, 2004 Huber et al., Schweiz Med Forum 4:947-952, 2004 Cario et al., Ann Hematol 79:7-12, 2000 Kulozik et al., Br J Haematol 66: 109-112, 1987 Thiopurin-Methyltransferase (TPMT)-Defizienz TPMT-Gen (Thiopurin-Methyltransferase Gen; Genort: 6p22.3; OMIM #610460) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Verschiedene Thiopurine (z. B. 6-Mercaptopurin, Azathioprin oder 6-Thioguanin) werden als Immunosuppressiva bei der Behandlung von chronischer autoimmuner Entzündungen (Lupus erythematodes, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen), zur Prävention von Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen oder als Chemotherapeutika zur Behandlung von Leukämien verwendet. Aus den zunächst inaktiven Substanzen werden intrazellulär Thioguanin-Nukleotide gebildet, die bei Einbau in die DNA zytotoxisch wirken. Alternativ werden Thiopurine durch Methylierung in inaktive Metaboliten überführt und dem Aktivierungsweg zu ThioguaninNukleotiden entzogen. Ein wesentliches Enzym in diesem Abbauweg ist die Thiopurin S-Methyltransferase (TPMT). Verminderte oder fehlende Enzymaktivität infolge von Mutationen innerhalb des TMPT-Gens erhöht das Risiko für toxische Nebenwirkungen in Abhängigkeit von Art und Dosis der Medikation. Dies kann zu Grippe-ähnlicher Symptomatik, zu Lebertoxizität, Pankreatitis bis zu Myelosuppression mit tödlichem Ausgang führen. Molekulargenetische Untersuchungen 99 Klinische Bedeutung Derzeit sind mindestens 30 Mutationen des TMPT-Gens bekannt. Dabei lassen sich die vier häufigsten Allele (*2,*3A, *3B, and *3C) bei 80 bis 95% aller Kaukasier, Asiaten und Afrikaner mit verminderter TPMT-Aktivität nachweisen. Heterozygot vorliegende Mutationen mit einer reduzierten Enzymaktivität findet man in ca. 5-15% der Bevölkerung, während Mutationen in beiden Allelen mit geringer bis fehlender Enzymaktivität bei etwa 0,3% nachgewiesen werden können. Nur ein Teil der Nebenwirkungen von Thiopurinen beruht jedoch auf einer TPMT-Defizienz. Indikation Geplante Behandlung mit Thiopurin-Derivaten (z. B. 6-Mercaptopurin, Azathioprin, 6-Thioguanin) Mutationen Punktmutationen innerhalb von Exon 4, 6 und 9 einschließlich der Veränderungen in den TPMT Allelen *2,*3A, *3B, *3C und 3*D (238G>C (Ala80Pro), 460G>A (Ala154Thr) und 719A>G (Tyr240Cys)) Material 1-2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Exons 4, 6 und methode 9 des TPMT-Gens werden mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorhandensein von Punktmutationen analysiert. Untersuchungs- Ca. 3-5 Tage dauer Literaturhinweise Evidence Report no. 196, ARQH, 2010 (www.ahrq.gov/downloads/pub/evidence/pdf/ tpmt/tpmt.pdf) Yates et al., Ann Intern Med 126:608-614, 1997 Tai et al., Am J Hum Genet 58:694-702,1996 Vitamin-D-Rezeptor (B/b-Polymorphismus) Vitamin D Rezeptor-Gen; Genort: 12q12-q14; MIM ID: *601769 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung Die Osteoporose ist definiert als Untergang bestimmter Knochenanteile (Demineralisierung), wobei neben „Alterserscheinungen“ auch genetisch bedingte Formen (50-80% der Fälle) bekannt sind. Vor allem bei jüngeren Betroffenen muss nach Stoffwechselerkrankungen und/oder einer hormonellen Regulationsstörung gesucht werden. Ungefähr 75% der an einer Osteoporose Erkrankten weisen Veränderungen im Collagen A- und/oder im VDR-Gen auf. 100 Molekulargenetische Untersuchungen Durch UV-Licht wird das in der Haut befindliche 7-Dehydrocholesterol zunächst in Calciol (Cholecalciferol, Vitamin D3) umgewandelt. Durch anschließende Hydoxylierungen in Leber und Niere entsteht daraus Calcitriol, die „aktive Form“. Der im Cytoplasma vorliegende Vitamin-D-Rezeptor (VDR) bindet Calcitriol mit hoher Affinität, der Rezeptor-Hormon-Komplex wandert in den Zellkern und wirkt dort als Transkriptionsfaktor bei der Regulation verschiedener Gene. Vitamin D spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulierung des Calcium-Spiegels im Blut und beim Knochenaufbau, hat aber in anderen Geweben auch weitere allgemeine Funktionen bei Zell-Differenzierung und -Proliferation und Apoptose. Indikation Der bb-Genotyp ist mit einer höheren Knochendichte assoziiert, während Individuen mit dem Genotyp BB eine erhöhtes Risiko für Frakturen aufweisen. Mutationen In einem Intron des VDR-Gens liegt der B/b-Polymorphismus für das Restriktionsenzym BsmI, wobei eine vorhandene BsmI-Schnittstelle den Genotyp bb definiert. Beim Genotyp BB sind die Schnittstellen durch einen Basenaustausch verändert. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels methode PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 4-6 Tage dauer Literaturhinweise Morrison et al., Nature 367, 284-287, 1994 Uitterlinden et al., J Bone Mineral Res 16, 379-385, 2001 Molekulargenetische Untersuchungen 101 Erweiterte Diagnostik Hämatoonkologische Erkrankungen – Erweiterte Diagnostik Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie ermöglicht den Nachweis und die Charakterisierung verschiedener Zellpopulationen im peripheren Blut und Knochenmark, unabhängig von ihrer Morphologie, mit dem Ziel maligne von benignen Erkrankungen zu unterscheiden. Man kann so verschiedene Leukämien und Lymphome diagnostizieren und klassifizieren. Zusammen mit der Zytomorphologie, Zytogenetik und der Molekulargenetik ist sie eine ergänzende Diagnostik der hämatologischen Erkrankungen. Dafür werden intrazytoplasmatische oder membrangebundene Zellantigene (CDCluster of Differentiation) mit monoklonalen Antikörper markiert (Immunphänotypisierung). Letztere sind an Fluorochrome gebunden. Durch Laseranregung wird so Licht verschiedener Wellenlängen ausgestrahlt und von Detektoren erfasst. Die so dargestellten CD-Antigene einer Zelle ergeben deren Immunphänotyp. Material: 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungsdauer: 2-3 Tage nach Probenerhalt Fluoreszenz in situ Hybridisierung – FISH Die FISH-Technik verwendet sogenannte DNA-Sonden, die spezifische chromosomale Strukturen identifizieren. Dabei wird sowohl die DNA der eingesetzten Sonden als auch die zu untersuchende Patienten-DNA denaturiert. Die Sonden-DNA bindet an die komplementäre Patienten-DNA (Hybridisierung). Die DNA-Sonden sind mit einem Fluorochrom markiert, so dass die zu untersuchenden Chromosomstrukturen mittels Fluoreszenz-Signale ausgewertet werden können. Vorteil: schnelle und zuverlässige Methode zur Beantwortung gezielter Fragen (z. B. der Nachweis der Translokation t(15;17)(q22;q12) bei dem Verdacht auf das Vorliegen einer akuten Promyelozyten-Leukämie) Nachteil:Informationen sind auf Chromosomen/Gene beschränkt, für die die Sonden eingesetzt wurden. Material: 5-10 ml peripheres Blut oder Knochenmark (EDTA oder Heparin). Chromosomenanalyse Die Chromosomenanalyse ist für die Diagnose der hämatologischen Neoplasien obligat. Sie sichert die Diagnose und ermöglicht prognostische Aussagen. Idealerweise erfolgt die Chromosomenanalyse aus 5 bis 10 ml mit Heparin antikoaguliertem Knochenmark. Die Knochenmarkzellen werden in der Metaphase arretiert. Es werden 20-25 Metaphasen analysiert. Mittels Bänderungstechnik wird anschließend jedes einzelne Chromosom identifiziert. 102 Hämatoonkologische Erkrankungen Hämatoonkologische Erkrankungen 1. Akute lymphatische Leukämie Die Diagnostik der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beruht auf Zytomorphologie/Zytochemie, Immunphänotypisierung, Chromosomenanalyse, FISH und Molekulargenetik a) Zytomorphologie und Zytochemie: sichern die Diagnose einer akuten lymphatischen Leukämie und grenzen diese gegenüber einer AML ab; ferner spielen sie eine wichtige Rolle zur Beurteilung der Remission. Morphologisch lassen sich undifferenzierte Blasten darstellen (MPO- und unspez. Esterase negativ). Eine eindeutige Zuordnung zur lymphatischen Linie und die Abgrenzung gegenüber einer AML M0 und M7 ist jedoch nur mittels Immunphänotypisierung möglich. b)Immunphänotypisierung: ermöglicht die Abgrenzung gegenüber der AML sowie eine erweiterte Subklassifizierung der ALL (prognostisch und therapeutisch relevant). Die Bestimmung des „Leukämie-assoziierter Immunphänotyp“ (LAIP) ist Voraussetzung für die Verlaufsbeobachtung unter Therapie. ALL-Typen mit Markerexpressionsmustern Zellreihe B T Kriterien Subtyp Kriterien CD19 Pro-B-ALL keine Expression anderer Differenzierungsantigene der B-Zellreihe CD79a Common-ALL CD19, CD79a, cyCD22+, CD10+ cyCD22 Prä-B-ALL CD19, CD79a, cyCD22+, cyIgM+ Reife B-ALL CD19, CD79a, cyCD22+ zytoplasmatische oder membranständige Expression von Kappaoder Lambda-Leichtketten Pro-T-ALL cyCD3+ CD7+ Prä-T-ALL cyCD3+ CD2 u/o CD5+ u/o CD8+ Kortikale-T-ALL cyCD3+ CD1a+ Reife T-ALL cyCD3+ membranständigCD3+, CD1a- cyCD3 (nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 451) Hämatoonkologische Erkrankungen 103 Immunphänotypisierung zur Detektion der minimalen Resterkrankung (MRD): Der Nachweis residueller Leukämiezellen spricht für ein erhöhtes Rezidivrisiko. Voraussetzung für die MRD-Diagnostik ist die Bestimmung des „Leukämie-assoziierten Immunphänotyps“ (LAIP) zum Zeitpunkt der Diagnose. Folgende Phänotypen eignen sich zur Detektion der MRD: B-Vorläufer-ALL: Koexpression der Antigene CD19 und CD1 aberrante Koexpression myeloischer Antigene, Expression von CD34 T-Vorläufer-ALL: Koexpression von cCD3 und TdT (Quelle: Haferlach T: ,,Diagnostic Methods in Leukaemias and Lymphomas“,2009, S. 90) c) Die Chromosomenanalyse erfolgt zur Klassifizierung der Leukämie nach WHOKriterien sowie zur Prognosebeurteilung. Nach Anzahl der Chromosomen ist eine Einteilung in Ploidiegruppen möglich (z. B. Hypodiploidie, Hyperdiploidie, usw.). Ferner können strukturelle Aberrationen dargestellt werden: Vorläufer-B-lymphoblastische Leukämie/ -lymphoblastisches Lymphom Immunphänotyp Typische Aberrationen Pro-B-ALL Common-ALL Prä-B-ALL t(9;22)(q34;q11.2) t(4;11)(variabel;11q23) t(12;21)(p13;q22) t(1;19)(q23;p13.3) ALL-hypodiploid (<45 Chromosomen) ALL-hyperdiploid (> 50 Chromosomen) (nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 449) Vorläufer-T-lymphoblastische Leukämie/ -lymphoblastisches Lymphom Immunphänotyp Typische Aberrationen Prä-/Pro-T-ALL Kortikale T-ALL Reife T-ALL t(10;14)(q24;q11) t(1;14)(p32;q11) t(11;14)(p15;q11) (nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 449) 104 Hämatoonkologische Erkrankungen d)FISH: wird häufig als Ergänzung zur klassischen Chromosomenanalyse durchgeführt. Innerhalb von 24 Stunden kann z. B. das Vorliegen einer PhiladelphiaTranslokation t(9;22)(q34;q11) nachgewiesen werden. Ein FISH-Screening auf häufige Aberrationen wird bei nicht eindeutigen Chromosomenanalysen eingesetzt. Zum Nachweis von Residualzellen wird FISH in Fällen mit unbalancierten Karyotypen verwendet. e) Die Molekulargenetik: weist Fusionsgene sowie Immunglobulin- und T-ZellRezeptorgen-Rearrangements nach. Subtyp Fusionsgen Pro-B-ALL AF4-MLL Common-ALL BCR-ABL Prä-B-ALL BCR-ABL, MLL-ENL Reife B-ALL cMYC-IgH Pro-/Prä-T-ALL HOX11-TCRα/δ Kortikale T-ALL RHOM1/TCRα/δ Reife T-ALL TAL1/TCRα/δ (nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 450) Molekulargenetik MRD: erfolgt mittels „Real-time“-PCR und dient dem Nachweis von reziproken Fusionsgenen; relevant bei der BCR-ABL1-positiven ALL. 2. Akute myeloische Leukämie (AML) Die Diagnose der AML erfolgt in einem Stufenprogramm: -Zytomorphologie/Zytochemie -Immunphänotypisierung -Chromosomenanalyse -FISH -Molekulargenetik Hämatoonkologische Erkrankungen 105 a)Zytomorphologie/Zytochemie: beim Verdacht auf eine akute Leukämie ist eine Knochenmarkpunktion erforderlich. Diagnostische Kriterien sind : ≥ 20% Blasten mit Auerstäbchen/Granula sowie zytochemische Eigenschaften (Myeloperoxidase und Esterase). Außerdem ist die Zytomorphologie das Hauptkriterium der Remissionsbeurteilung nach erfolgter Therapie. b)Immunphänotypisierung: ermöglicht eine erweiterte Diagnostik: Abgrenzung der AML / ALL • Myeloische Marker sind: cyMPO. Sichert die myeloische Herkunft. CD33, CD13, CD65s (jedoch aberrant auch bei lymphatischen Neoplasien nachweisbar) Die Identifikation des FAB-Subtyps AML M0 un M7 sowie einiger zytogenetisch definierten AML-Formen (jedoch nur als Orientierungshilfe). Beispiele: • AML M0: die Expression u. a. von CD13, CD33 und CD117 grenzt von einer ALL ab, wenn lymphatische Marker nicht gleichzeitig exprimiert werden; MPO kann durchflusszytometrisch nachgewiesen werden (trotz zytochemischer Negatvität für Myeloperoxidase). • AML M7: Expression von CD41 oder CD61 • AML mit t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1: Blastäre Marker: CD34, CD117 Myeloische Antigene: MPO, CD13, CD33, CD65, CD15 Aberrante Koexpression CD19,CD56 • AML M3 t(15;17) Expression von CD13, CD33, CD64dim, CD117dim Fehlen von CD34, HLA-DR, CD11a, CD11b, CD15, CD65, CD11c Aberrante Koexpression: CD2, CD56 (Quelle: Leach M, Drummond M, Doig A: Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis, 2013, S. 56-58) Bestimmung eines LAIP („Leukämie-assoziierter Immunphänotyp“) zum Zeitpunkt der Diagnose, der nach Therapie zum Nachweis einer MRD („minimal residual disease“) verwendet wird. Der MRD-Level erlaubt dann prognostische Einschätzungen zum rezidiv-freien Überleben. 106 Hämatoonkologische Erkrankungen c)Chromosomenanalyse: seit 2001 wird die Zytogenetik für die Subklassifizierung der AML mit einbezogen, es resultieren AML-Subtypen, bei denen die Zytologie und die Anzahl der Blasten nicht diagnosebestimmend sind. Die sogenannte „AML mit rekurrenten genetischen Veränderungen“ umfasst folgende Subtypen: • • • • • • • AML mit inv(16)(p13.1;q22) oder t(16;16)(p13.1;q22) akute Promyelozytenleukämie mit t(15;17)(q22;q12) AML mit t(6;9)(p23;q34) megakaryoblastäre AML mit t(1;22)(p13;q13) AML mit t(8;21)(q22;q22) AML mit t(9;11)(p22;q23) AML mit inv(3)(q21;q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2) d)FISH-Analyse: ergänzt die Chromosomenanalyse und wird bei gezielten Fragestellungen eingesetzt. Der Befund dient dann als Ausgangsparameter zur Verlaufskontrolle. Nachgewiesen werden u. a.: t(15;17)(q22;q12) t(8;21)(q22;q22) inv(16)(p13q22) Ferner hat die FISH-Diagnostik bei komplex aberranten Karyotypen zum Nachweis von Residualzellen einen wichtigen Stellenwert. e) Die Molekulargenetik ermöglicht: • Nachweis von Fusionsgenen: mittels RT-PCR (reverse Transkriptions-PCR) können u. a. folgende Fusionsgene nachgewiesen werden: RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO) CBFB-MYH11 PML-RARA • Nachweis molekularer Mutationen: z. B. Mutationen im Nucleophosmin (NPM1)-Gen, Tandemduplikationen im MLL-Gen (MLL-PTD), Längenmutationen im FLT3-Gen (Labor LabPMM GmbH), Mutationen im Transkriptionsfaktor CEBPA, Mutationen im TET2-Gen (“TET oncogene family member 2”), Mutationen der Isocitrat-Dehydrogenase-1 (IDH1) und IDH2-Gene. • Detektion der minimaler Resterkrankung (MRD)-idealerweise mittels RealTime-PCR. Relevanz: Prognosebeurteilung und frühzeitige Rezidivdetektion. Qunatifiziert werden: Fusionstranskripte z. B. RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11, PML-RARA Mutationen z. B. NPM1-Mutationen Hämatoonkologische Erkrankungen 107 3. Chronische lymphatische Leukämie (CLL) Die Diagnostik der CLL beruht in erster Linie auf Zytomorphologie und Immunphänotypisierung in peripherem Blut und Knochenmark. Außerdem werden Chromosomenanalyse, FISH und Molekulargenetik zur Beurteilung von Prognose und Verlauf eingesetzt. a)Zytomorphologie: Peripheres Blut: Lymphozyten >5000/µl, reifzellige Lymphozyten (klein, hohe Kern-Zytoplasma-Relation, Chromatin verklumpt), Kernschatten. Blastäre Zellen im Falle einer Richter-Transformation. Knochenmark: > 30% kleine Lymphozyten b)Immunphänotypisierung: CLL-Phänotyp: Expression von CD19 Koexpression von CD5 und CD23 schwache oder fehlende Expression von CD20, CD79b, FMC7 Monoklonalität von IgKappa oder IgLambda Darüber hinaus wird die Immunphänotypisierug zum Nachweis einer minimalen Resterkrankung (MRD) sowie zur Darstellung von prognostisch relevanten Markern: CD38, zytoplasmatische Expression von ZAP70 (prognostisch ungünstig) herangezogen. (Quelle: http://www.dgho-onkopedia.de/de/onkopedia/leitlinien/cll) c) Die FISH-Analyse dient dem Nachweis von t(11;14)/IGH-CCND1 zur Abgrenzung zwischen CLL und Mantelzelllymphom sowie zur Erfassung von prognostisch relevanten genomischen Aberrationen: Aberration Med. ÜL/Mo 17p-Deletion 32 11q-Deletion 79 Trisomie 12 114 Norm. Karyotyp 111 13q-Deletion 133 (nach Döhner H et al. NEJM 2000; 343:1910-16) 108 Hämatoonkologische Erkrankungen d) Die Chromosomenanalyse ergänzt die FISH-Analyse indem sie komplex aberrante Karyotypen (Aberrationen ) darstellen kann (prognostisch relevant). (Rigolin et. al., Blood 2012) e)Molekulargenetik: IgVH-Mutationsstatus (somatische Mutationen in der variablen Region der Immunglobulin-Schwerketten-Gene) - IGHV unmutiert: kürzere mediane Überlebenszeit - GHV mutiert: längere mediane Überlebenszeit (T. J. Hamblin et al. Blood 1999; R.N. Damle et al. Blood 1999) 4. Reifzellige B- und T-Zell-Lymphome Diagnostik: a) Zytomorphologie und Histologie: Reifegrad und Infiltrationsgrad im Knochenmark/peripheres Blut b)Immunphänotypisierung zur Abgrenzung einer reaktiven Veränderung und Feststellung der Linienzugehörigkeit (B oder T-Linie) sowie zur näheren Charakterisierung. c) Chromosomenanalyse, FISH: Detektion charakteristischer Rearrangements bei B-Zell-Lymphomen. d)Molekulargenetik: Nachweis balancierter Rearrangements mittels RT-PCR Wichtige Merkmale der lymphoproliferativen Erkrankungen Diagnose Immunphänotypisierung Genetik B-CLL CD19+, CD5+, CD23+ sIg+ (niedrige Antigendichte) CD20+ (niedrige Antigendichte) Del (13q) Del (11q) Del (17q) Trisomie 12 B-Prolymphozytenleukämie CD19+, CD5±, CD23sIg+ (sehr hohe Antigendichte) CD20+ (sehr hohe Antigendichte) FMC7+ T(11;14) Del(11q23), del(13q14) P53-Mutationen Hämatoonkologische Erkrankungen 109 Diagnose Immunphänotypisierung Genetik Lymphoplasmazytisches Lymphom CD19+, CD5-, CD38+ Immunozytom CD23-(in der Regel) sIg+ (hohe Antigendichte) CD20+ (hohe Antigendichte) T(9;14)(p13;q32) PAX-5-Gen-Rearrangement Haarzell-Leukämie CD19+, CD5CD25+ (hohe Antigendichte) CD103+ CD11c+ (hohe Antigendichte) sIg+ (hohe Antigendichte) CD20+ (sehr hohe Antigendichte) FMC7+ Variantform: CD19+, CD5-, CD25, CD103± CD11c (hohe Antigendichte) sIg+ (sehr hohe Antigendichte) CD20+ (sehr hohe Antigendichte) FMC7+ MantelzellLymphom CD19+, CD5+, CD23-, CD10sIg+ (lambda häufiger als kappa) CD20+ FMC7+ t(11;14)(q13;q32) Cyclin-D1-Überexpression (IgH/bcl1) Del17p,del13(q14), Trisomie +12 Follikuläres Lymphom CD19+, CD5-, CD10+, CD23±, CD11csIg+(sehr hohe Antigendichte) CD20+ t(14;18) bcl-2-Überexpression Marginalzonenlymphom/ CD19+, CD5-, CD10-, CD23, CD25CD103-,CD11c+ sIg+ (mäßig hohe Antigendichte) CD20+ t(11;18) del 7(q21-32), Trisomie +3 (SLVL) Splenisches Marginalzonenlymphom mit villösen Lymphozyten(SLVL) CD2+, CD3+, CD5+, CD4+, CD8± CD7- Anomalien Chromosom 14 und 8 T-CLL/T-Prolymphozytenleukämie CD2+, CD3+, CD5+, CD4+, CD8± CD7 Anomalien Chromosom 14 und 8 110 Hämatoonkologische Erkrankungen Diagnose Immunphänotypisierung Genetik Large granular lymphocyte-Leukämie (LGL-Leukämie) T-LGL-Typ: CD2+, CD3+, CD8+, TCRαß+, CD16+ CD4-, CD5-, CD56CD7NK-LGL-Typ: CD2+, CD16+, CD56+ CD3-, CD4-, CD5-, TCRαßVarianten: CD8+, CD56-, CD57CD8±CD56-CD57+ Klonales Rearrangement des TCR-ß-Gens Adulte T-Zell-Leukämie/Lymphom CD2+, CD3+, CD4+, CD5+ CD7-, CD8- Klonales Rearrangement des TCR-Gens Mycosis fungoides/ Sezary-Syndrom CD2+, CD3+, CD5+, CD4+ CD7-(75% d.Fälle), CD8- Klonales Rearrangement des TCR-ß-Gens (nach Sack U, Taranok A, Rothe G: Zelluläre Diagnostik.Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie. Basel, Karger,2007, S. 1018-1026) 5. Plasmazellmyelom Die Labordiagnostik beim Plasmazellmyelom umfasst neben der Zytomorphologie die Histologie sowie Immunfixation oder Immunelektrophorese. Als ergänzende Methoden werden Durchflusszytometrie, FISH und Zytogenetik eingesetzt. Immunphänotypisierung (Myelomzellen): Forwardscatter(FSC): klein bis mittelgroß Sidescatter(SSC) : fehlende zytoplasmatische Granulation Antigenexpressionsmuster: CD38+, CD138+, CD45+ CD19-, CD20-, CD10Keine Immunglobuline auf der Zelloberfläche Zytoplasmatische Leichtkettenrestriktion Teilweise aberrante CD56-Expression (nach R. Fuchs, P. Staib,T.Brümmendorf: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage,S.628) Hämatoonkologische Erkrankungen 111 FISH-Analyse und Zytogenetik: Da Myelomzellen eine niedrige proliferative Aktivität besitzen, ist die konventionelle Zytogenetik nur begrenzt einsetzbar. Die Methode der Wahl zum Nachweis genomischer Aberrationen ist die FISH-Analyse. Wichtige Veränderungen sind: - prognostisch ungünstige Translokationen: t(4;14)(p16;q32) t(14;16)(q32;q23) - prognostisch intermediäre Translokationen: t(11;14)(q23;q32) - 13q-Deletionen: prognostisch ungünstig in Verbindung mit einer 17p Deletion oder einer Translokation t(4;14) - 17p-Deletion: prognostisch sehr ungünstig, da schlechtes Ansprechen auf Therapie - 16q-Deletionen: prognostisch ungünstig 6. Myelodysplastisches Syndrom (MDS) Die Diagnose des MDS basiert in erster Linie auf die Zytomorphologie, sie wird aber durch Chromosomenanalyse und Immunphänotypisierung ergänzt. a) Die Zytomorphologie erfolgt aus peripherem Blut und Knochenmark. Im peripheren Blut besteht eine Zytopenie einer oder mehreren Zellreihen. Typische Dysplasiemerkmale sind u. a. Pseudo-Pelger-Neutrophile, Hypogranulierung, Ringsideroblasten, Mikromegakaryozyten, Riesenthrombozyten. Die Zahl der Blasten ist wichtig für die weitere Klassifizierung und für die Abgrenzung zur akuten Leukämie. Die Dysplasiezeichen sollten mindestens 10% der Zellen betragen. Die Eisenfärbung ist bei einem MDS zur Darstellung der Ringsideroblasten erforderlich. 112 Hämatoonkologische Erkrankungen b) Die Chromosomenanalyse ist für die Klassifizierung und für die Einschätzung der Prognose sowie für die Abgrenzung zu reaktiv-toxischen Prozessen hilfreich. Für die MDS-Diagnostik stellt sie ein obligates Verfahren dar. Allerdings ist das MDS auch zytogenetisch eine heterogene Gruppe. Typische Aberrationen sind: - - - - - - Der Nachweis dieser Chromosomenanomalien ist Voraussetzung für die Einteilung in verschiedene Risikogruppen (günstig, ungünstig, intermediär). Verlust des Y-Chromosoms, Del 5q Del 20q Anomalien des Chromosom 7 Trisomie 8 Komplexe Aberrationen c) Die Molekulargenetik spielt in der Routinediagnostik des MDS eine untergeordnete Rolle. Mögliche Aberrationen sind: RUNX1- (=AML1)-Gen-Mutation, die partielle MLL-Tandemduplikation (MLL-PTD), FLT3-Längenmutationen (Labor LabPMM GmbH), sowie Mutationen von NPM1, RAS und CEBPA. Je mehr Mutationen vorhanden sind, desto schlechter ist die Prognose. Der Anstieg der WT1-Genexpression in der Real-Time PCR korreliert mit der Progression des MDS. Ferner sind molekulargenetische Untersuchungen (BCR/ABL, JAK2V617F) indiziert, wenn eine Abgrenzung gegenüber myeloproliferativen Neoplasien erforderlich ist. d) Die Immunphänotypisierung eignet sich als ergänzende Methode zur Zytomorphologie. Sie ist insbesondere bei morphologisch schwierig einzuordnenden Fällen hilfreich . Die Immunphänotypisierung ermöglicht u. a.: - die Beurteilung der Granulation im Side-Scatter - Aberrante Expressionsmustern die mit den Dysplasien korrelieren und die Klonalität bestätigen - Quantifizierung der Blasten. Ausschlaggebend ist jedoch die prozentuelle Blastenbestimmung im Ausstrich! (die durchflusszytometrische Präanalytik führt zum Zellverlust) Hämatoonkologische Erkrankungen 113 7. Myeloproliferative Neoplasien (MPN) Zur Diagnostik der MPN sind Zytomorphologie, Histopathologie, Chromosomenanalyse, FISH und Molekulargenetik erforderlich. a) Zytomorphologie/Zytochemie und Histopatologie helfen bei der Abgrenzung der verschiedenen MPN untereinander. Außerdem wird die Zytomorphologie zu Beurteilung der Remission unter Therapie herangezogen. Insbesondere der Blastenanteil ist hier wichtig. Die Histopathologie ermöglicht die Beurteilung der Knochenmarkarchitektur. b) Die Chromosomenanalyse dient zur Bestimmung des Karyotyps sowie der bei der MPN auftretenden Karyotyp-Veränderungen: Chronische myeloische Leukämie (CML): - Philadelphia-Translokation: t(9;22)(q34;q11) (bis zu 95% der Patienten) - variante Philadelphia-Translokationen • Philadelphia-negative BCR-ABL1-positive CML (normaler Karyotyp aber BCR-ABL1-Fusionsgen vorhanden) • in der Akzelerationsphase/Blastenkrise: zusätzliche Karyotyp-Veränderungen im Philadelphia-positiven Klon, z. B.: Trisomie 8, Trisomie 19 (prognostisch ungünstig). Beurteilung der zytogenetischen Remission nach Auswertung von mindesens 20 Metaphasen. Sind keine Ph+Metaphasen nachweisbar, wird von einer kompletten Remission ausgegangen. Polyzythämia vera(PV): • Deletionen im langen Arm eines Chromosoms 20 (20q), • Zugewinne des kurzen Armes von Chromosom 9 • numerische Zugewinne der Chromosomen 8 und 9 Primäre Myelofibrose (PMF): - numerische Veränderungen der Chromosomen 7, 8 und 9 • strukturelle Aberrationen der Chromosomenabschnitte 1q und 5q • Deletionen der Chromosomenabschnitte 13q und 20q Essentielle Thrombozythämie (ET): - Zugewinn eines Chromosoms 9 114 Hämatoonkologische Erkrankungen c) Die FISH-Analyse ergänzt die klassische Chromosomenanalyse ohne sie dabei ersetzen zu können. Sie wird zur Beantwortung gezielter Fragen eingesetzt: • Vorliegen eines BCR-ABL1-Rearrangements (insbesondere relevant bei Patienten mit Philadelphia-negativer, BCR-ABL1-positiver CML ) • Beurteilung der residuellen Resterkrankung d) Die Molekulargenetik wird in erster Linie zum Nachweis eines BCR-ABL1-Rearrangement eingesetzt. Mittels PCR kann außerdem eine Quantifizierung der BCR-ABL1 Expression erfolgen, die dann als Ausgangswert für die Verlaufskontrolle unter Therapie dient. Das Monitoring erfolgt aus peripherem Blut, vorerst in 3-monatigen, später in 6-monatigen Abständen. Ein Wiederanstieg der BCR-ABL1-Expression spricht für das Auftreten einer Resistenz gegenüber dem Tyrosinkinaseinhibitor. In diesem Fall hilft die Sequenzierung des ABL1-Anteils zum Nachweis sekundärer Mutationen für weitere therapeutische Maßnahmen. Bei den BCR-ABL1-negativen MPN erfolgt die Untersuchung der V617F-Mutation im JAK2-Gen (>95% aller Patienten mit PV, ca. 50% aller ET und PMF). Außerdem eignet sich die JAK2V617F-Mutation zur MRD-Verlaufsdiagnostik mittels Real-Time PCR, sowie zum Nachweis seltener Mutationen (z. B. Mutationen im Exon 12 des JAK2-Gens). c) Die Immunphänotypisierung kommt in der Blastenkrise der CML zum Einsatz, mit dem Ziel, myeloische von lymphatischen Blasten zu unterscheiden (therapeutische Relevanz). Quellenverzeichnis: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Fuchs R., Staib P., Brümmendorf T. Manual Hämatologie 2013, 23 Auflage, Nora-Verlag, S. 449-451, 628. Sack U, Taranok A, Rothe G:Zelluläre Diagnostik.Grundlagen,Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie. Basel, Karger, 2007, S. 1018-1026). Leitlinien CLL, http://www.dgho-onkopedia.de/de/onkopedia/leitlinien/cll Döhner H et al. NEJM 2000; 343: S. 1910-16 Haferlach T: ,,Diagnostic Methods in Leukaemias and Lymphomas“, 2009, S. 90 Leach M, Drummond M, Doig A: Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis, 2013, S. 56-58 Hämatoonkologische Erkrankungen 115 Chronisch lymphatische Leukämie, IGHV-Status IGH-Locus (IgG Heavy Chain Locus; Genort: 14q32.33; OMIM *147100) Indikation Der variable Bereich der Immunglobulin-Schwerketten wird im Laufe der B-Zell-Entwicklung aus verschiedenen Genen (Variable (V)-, Diversity (D)- und Joining (J)-Gene) rearrangiert (somatische Rekombination). Eine Antigenexposition führt zur Affinitätssteigerung durch somatische Hypermutation der rearrangierten Gene. Das rearrangierte IGHV-Gen im B-CLLKlon kann nun in unmutierter oder hypermutierter Form vorliegen. Dieser Mutationsstatus zeigt deutliche Auswirkungen auf die Prognose. Patienten mit hypermutierten IGH-Mutationsstatus zeigen im Median ein auf 293 Monate verlängertes Überleben im Vergleich zu 117 Monaten im unmutierten Fall. Ein hypermutiertes IGHV-Gen weist mindestens 2% Differenz zur Keimbahnsequenz auf. B-CLL Material 2-5 ml EDTA-Knochenmark, 10 ml EDTA-Blut Klinische Bedeutung Untersuchungs- Multiplex-RT-PCR und Sequenzierung, Datenbankabgleich, statistische methode Auswertung Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Hamblin et al., Blood 94: 1848-54, 1999; Damle et al., Blood 94: 1840-47, 1999; Ghia et al., Leukemia 21: 1-3, 2007 Chronisch myeloische Leukämie Philadelphia-Translokation (BCR-ABL; Genort: t(9;22); OMIM *151410, 608232) Erbgang Klinische Bedeutung Somatische Mutation Die Chronisch Myeloische Leukämie verläuft chronisch und geht im Verlauf und zuletzt in akute Krisen über. Bei etwa 90% der Patienten enthalten die betroffenen Zellen des Knochenmarks ein Chromosom 22 mit einem verkürzten langen Arm, verursacht durch die sog. Philadelphia-Translokation. Sie findet sich bei über 95% aller Patienten mit einer CML, bei circa 2% der Patienten mit einer AML (akute myeloische Leukämie) und bei etwa 25% der Erwachsenen bzw. 5% der Kinder mit einer ALL (akute lymphoblastische Leukämie). Die Philadelphia-Translokation t(9;22) (q34;q11) entspricht auf der molekularen Ebene einer Fusion von zwei Genen (reziproke Translokation zwischen Chromosom 22 und Chromosom 9). Hierbei wird das Onkogen c-abl von Chromosom 9 in die sogenannte bcr-Region (breakpoint cluster region) auf Chromosom 22 verlagert. Aus der Fusion von kodierenden Sequenzen des ABL-Gens und des BCR-Gens wird ein Hybridgen gebildet, dessen Transkriptionsprodukt als BCR/ABL-mRNA in den betroffenen Zellen zur Bildung eines veränderten c-abl-Proteins mit gesteigerter Tyrosinkinase-Aktivität und damit zu erhöhter Teilungsrate führt. 116 Hämatoonkologische Erkrankungen Während das Bruchereignis auf Chromosom 9 jeweils innerhalb eines Exons des c-abl-Gens lokalisiert ist, finden sich auf Chromosom 22 unterschiedliche Bruchpunkte des BCR-Gens in der major-(M-bcr), der mikro(µ-bcr) oder der minor-(m-bcr) breakpoint cluster region. Über 99% der Bruchpunkte der CML-Patienten sind vom M-bcr-Typ, bei der Ph-positiven ALL des Erwachsenen sind ca. 50-80% M-bcr, während sich bei der Ph-positiven ALL im Kindesalter zu 90% m-bcr findet. Der Nachweis der Philadelphia-Translokation bei der ALL ist mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Sofern eine Philadelphia-Translokation nachgewiesen wird, erfolgt eine Quantifizierung der Fusionstransskripte. Indikation • Erstdiagnostik bei Verdacht auf das Vorliegen einer CML, AML oder ALL • Quantifizierung als Verlaufskontrolle nach erfolgter Therapie Mutationen Material Fusionsgen BCR/ABL 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Real Time-PCR methode Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Vardiman et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (2008); O’Hare et al, Blood 110:2242 (2007); Pricl et al, Mol Cancer Ther 4:1157 (2005) von Bubnoff et al, Cancer Research 63:6395 (2003) Chronische myelomonozytäre Leukämie / Myelodysplastische Syndrome TET2-Gen (TET Oncogene Family, Member 2; Genort: 4q24; OMIM *612839) Klinische Bedeutung Bei den TET2-Mutationen handelt es sich somit um die häufigste bisher bekannte molekulare Aberration beim MDS. Neben dem MDS weisen auch andere myeloische Erkrankungen, darunter Myeloproliferative Neoplasien, Systemische Mastozytose, Chronische Myelomonozytäre Leukämie (CMML), Akute Myeloische Leukämie (AML) und Refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten und Thrombozytose (RARS-T) Mutationen im TET2-Gen auf. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Vorhandensein von mutiertem TET2 einen statistisch signifikant positiven Einfluss auf das progressionsfreie- und Gesamt-Überleben bei MDS Patienten hat (Kosmider et al., Blood 2009). Eine besonders hohe TET2-Mutationsrate von bis zu 42% weisen Patienten mit CMML auf. Kosmider et al. konnten zeigen, dass TET2-Mutationen bei CMML-1 Patienten (nach WHO) mit einer statistisch signifikant ungünstigeren Prognose einhergehen (Kosmider et al., Haematologica 2009). In einem anderen Kollektiv von 82 CMML Patienten wurde in Übereinstimmung mit den Daten zur Prognose bei MDS hingegen eine günstige Prognose für Patienten mit TET2-Mutationen gezeigt Hämatoonkologische Erkrankungen 117 Indikation Chronische Myelomonozytäre Leukämie, Myelodysplastische Syndrome Material 2-5 ml EDTA-Knochenmark, 10 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Stufendiagnostik: methode PCR und Sequenzierung der Exons 3-10, FISH zum Nachweis von Deletionen Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Kosmider et al., Blood 2009, 114:3285-3291 Kosmider et al., Haematologica 2009 Nagase, T., Kikuno, R., Nakayama, M., Hirosawa, M., Ohara, O., DNA Res. 7: 273-281, 2000 Delhommeau, F. et al., New Eng. J. Med. 360: 2289-2301, 2009 Januskinase 2 siehe Myeloproliferative Erkrankungen Multiplex-Aberrationsscreening Indikation Zur Differentialdiagnose bei Hämoblastosen (z.B. ALL, CML, Hinweis AML) mit zytogenetisch unzureichendem Befund oder zur Bestätigung einer zytogenetisch geäußerten Verdachtsdiagnose. Material 2-5 ml EDTA-Knochenmark, 10 ml EDTA-Blut Untersuchungs- mDX® HemaVision® System; Nachweisbare Aberrationen: methode t(1;11)(p32;q23): MLL/EPS15 (syn. MLL/AF1p) t(1;11)(q21;q23): MLL/MLLT11 (syn. MLL/AF1q) t(1;19)(q23;p13): E2A/PBX1 t(3;21)(q26;q22): AML/EAP/MDS/EVI1 t(3;5)(q25.1;q34): NPM/MLF1 t(4;11)(q21;q23): MLL/MLLT2 (syn. MLL/AF4) t(5;12)(q33;p13): ETV6/PD6FRB (syn. TEL/PDGFRb) t(5;17)(q35;q21): NPM/RARa t(6:11)(q27;q23): MLL/MLLT4 (syn. MLL/AF6) t(6;9)(p23;q34): DEK/NUP214 (syn. DEK/CAN) t(8;21)(q22;q22): RUNX1/RUNX1T1 (syn. AML1/MGT8) t(9;11)(q22;q23): MLL/MLLT3 (syn. MLL/AF9) t(9;12)(q34;p13): TEL/ABL t(9;22)(q34;q11): BCR/ABL t(9;9)(q34;q34): SET/NUP214 (syn. SET/CAN) t(10;11)(p12;q23): MLL/MLLT10 (syn. MLL/AF10) t(11;17)(q23;q21): MLL/MLLT6 (syn. MLL/AF17) t(11;17)(q23;q21): ZBTB16/RARA (syn. PLZF/RARa) t(11;19)(q23;p13.1): MLL/ELL t(11;19)(q23;p13.3): MLL/ENL t(12;21)(p13;q22): ETV6/RUNX1 (syn. TEL/AML1) t(12;22)(p13;q11): ETV6/MN1 (syn. TEL/MN1) 118 Hämatoonkologische Erkrankungen t(15;17)(q22;q21: PML/ RARa t(16;21)(q11;q22): TLS/ERG t(17;19)(q22;p13): E2A/HLF inv(16)(p13;q22): CBFb/MYH11 t(X;11)(q13;q23): MLL/AFX TAL1deletion(p34): SIL/TAL1 Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Myeloproliferative Erkrankungen Januskinase 2-Gen (JAK2; Genort: 9p24; OMIM *147796) Erbgang Erworbene Punktmutation Klinische Bedeutung Eine Punktmutation (V617F) im Exon 14 des Janus-Kinase 2-Gens (JAK2 = signalübermittelnde, cytoplasmatische Tyrosinkinase) lässt sich bei über 9095% der Patienten mit Polycythaemia vera und ca. 50-60% der Patienten mit chronisch idiopathischer Myelofibrose oder essentieller Thrombozythämie nachweisen. Daher ist diese JAK2-V617F-Punktmutation ein wichtiger Marker für die Diagnose der Philadelphia-negativen, chronisch myeloproliferativen Erkrankungen. Die V617F-Mutation im JAK2-Gen (1849G → T) führt zu einem Austausch der Aminosäuren Valin gegen Phenylalanin, was zu einer Erhöhung der JAK2-Tyrosinkinaseaktivität führt. Letztlich resultiert dies in einer gesteigerten Teilungsrate bei den betroffenen Zellen. Indikation V. a. und DD Polyzythämia vera Mutationen V617F Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Real-Time PCR methode Untersuchungs- 3-4 Tage dauer Literaturhinweise Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al.; Lancet 2005; 365: 1054-1061. Scott LM, Tong W, Levine RL, et al.; New Engl J Med 2007; 356:459-468 Hämatoonkologische Erkrankungen 119 Genetische Krebsrisiken Genetische Krebsrisiken Colonkarzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom) MLH1-Gen, Genort: 3p21.3; MSH2-Gen, Genort: 2p21-p22; MSH6-Gen, Genort: 2p16; PMS2, Genort: 7p22.2 (OMIM #120435) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung In Deutschland erkranken ungefähr 50.000 Personen jährlich an einem Kolonkarzinom. 5-10% aller kolorektalen Karzinome sind ererbt. Das hereditäre kolorektale Karzinom ohne Polyposis „HNPCC“ (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) ist die häufigste Form der autosomal- dominant vererbten Dickdarmkrebserkrankungen. Bei Patienten mit klinischem Verdacht auf HNPCC, wird nach den Bethesda Richtlinien (überarbeitet 2004) eine molekulargenetische Untersuchung empfohlen, wenn eines der folgenden Kriterien erfüllt ist: • Patienten mit kolorektalem Karzinom vor dem 50. Lebensjahr • Patienten mit synchronen und metachronen kolorektalen Karzinomen oder HNPCC-assoziierten Tumoren*, unabhängig vom Alter. • Patienten mit kolorektalem Karzinom mit MSI-h Histologie vor dem 60. Lebensjahr. • Patienten mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der einen Verwandten 1. Grades mit einem kolorektalen Karzinom oder einem HNPCC-assoziierten Tumor* vor dem 50. Lebensjahr hat. • Patienten mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der mindestens zwei Verwandte 1. oder 2. Grades hat, bei denen ein kolorektales Karzinom oder ein HNPCC assoziierter Tumor* (unabhängig vom Alter) diagnostiziert wurde. * (Endometrium, Magen, Ovarien, Pankreas, Urothel, Dünndarm, Gallengang, Gehirn [meist Glioblastome], Talgdrüsenadenome und Keratoakanthome) Indikation V. a. erblichen Darmkrebs (HNPCC / Lynch-Syndrom) Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Stufendiagnostik durch Sequenzierung und/oder MLPA der methode Gene MLH1, MSH2, MSH6 (und PMS2: nur MLPA) Untersuchungs- 4-5 Monate dauer Literaturhinweise Locker et al, J Clin Oncol 24:5313 (2006; Schmiegel, Dt Ärzteblatt 34/35:A2234 (2000); Bronner et al, Nature 368:258 (1994); Fishel et al, Cell 75:1027 (1993); Leach et al, Cell 75:1215 (1993); Miyoshi et al, PNAS 89:4452 (1992); Powell et al, Nature 359:235 (1992); Groden et al, Cell 66:589 (1991 120 Genetische Krebsrisiken Darmkrebsscreening: Septin 9 Test mSEPT9-Gen (Septin 9; Genort: 17q25.2-q25.3; OMIM *604061) Klinische Bedeutung Der Septin 9 Test basiert auf dem spezifischen Nachweis von methylierter DNA der V2-Region des Septin 9 Gens (mSEPT9) im Blutplasma. Die DNAMethylierung reguliert die Genexpression und die Stabilität der Gene. Jeder Zelltyp verfügt über einen einzigartigen DNA-Methylierungs-Fingerabdruck, der sich in biologischen Prozessen und auch bei Krebserkrankungen verändert. Im Darmkrebsgewebe sind die Cytosinreste der V2-Region des Septin 9 Gens methyliert, nicht aber in der normalen Darmschleimhaut. Die Darmtumor-DNA wird von den Tumorzellen ins Blut abgegeben, wo sie spezifisch nachgewiesen werden kann. Die zweite Generation dieses Testes erkennt mit einer Sensitivität von 81% und einer Spezifität von 99% im Vergleich mit dem Hämoccult-Stuhltest mehr als doppelt so viele Darmkrebserkrankungen im Frühstadium. Der Test ist kein Ersatz für die Koloskopie. Aber der Test ermöglicht all den Menschen eine sinnvolle Darmkrebsvorsorge, die Vorbehalte gegen eine Koloskopie oder Stuhluntersuchungen haben. Außerdem kann der Test eine sinnvolle Ergänzung während der 10jährigen Intervalle zwischen den koloskopischen Vorsorgeterminen sein. Der Test liefert ein qualitatives Ergebnis, Rückschlüsse auf die Schwere der Erkrankung sind somit nicht möglich. Patienten mit einem positiven Ergebnis sollten zeitnah koloskopiert werden. Indikation Darmkrebsvorsorge Hinweis Der Septin 9 Test sollte nicht bei schwangeren Frauen durchgeführt werden, da aufgrund der Schwangerschaft eine hohe Konzentration von methyliertem Septin 9 im Serum zu einem falsch positiven Ergebnis führt. Auch chronische Entzündungen des Darmtraktes (Colitis ulcerosa, Morbus Crohn) führen zu deutlich erhöhten Raten an falsch positiven Ergebnissen des Septin 9 Testes. Material 2 x 8,5 ml CPDA-Blut (Kostenloser Bezug der CPDA-Röhrchen über uns) CPDA-Blut ist 48 h bei 2-25°C haltbar Es wird keine Einverständniserklärung des Patienten gem. Gendiagnostikgesetz benötigt. Untersuchungs- Präparation der freien Plasma-DNA, Bisulfitbehandlung, Präparation der methode konvertierten DNA, methylspezifische Real-time PCR für Septin 9 und Beta-Actin Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Esteller, M., The Lancet Oncology 4, 351–358, 2003; Model, F. et al., Mol Cancer Res 5, 153–163, 2007; Gru¨tzmann R. et al., PLoS ONE 3(11), 2008 Genetische Krebsrisiken 121 Familiäre adenomatöse Polyposis coli APC-Gen (adenomatous polyposis of colon; Genort: 5q22.2; OMIM #175100) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Familiäre adenomatöse Polypose (FAP) ist durch die Entwicklung von Hunderten bis Tausenden Adenomen im Rektum und Kolon während des zweiten Lebensjahrzehnts gekennzeichnet, wobei das Entartungsrisiko nahezu bei 100% liegt. In beiden Geschlechtern ist die Manifestation gleich häufig. Unter den Fällen mit kolorektalem Krebs macht die FAP weniger als 1% aus. Es wird geschätzt, dass 5-10 von 100.000 Menschen von der Genmutation betroffen sind. Die meisten Patienten haben über Jahre keine Symptome, bis die Adenome groß und zahlreich geworden sind und rektale Blutungen, Schleimabgänge, Bauchschmerzen oder sogar Anämie erzeugen. Im allgemeinen beginnt die Entwicklung eines Karzinoms etwa 10 Jahre nach dem Auftreten der Polypen. Die FAP kann auch Symptome außerhalb des Intestinums zeigen, z. B. Osteome, Zahnanomalien, kongenitale Hypertrophie des Pigmentepithels (CHRPE), Desmoidtumoren und extrakolonische Tumoren (Thyroidea, Leber, Gallenwege und ZNS). Eine weniger aggressive Variante der FAP, die attenuierte FAP (AFAP), ist gekennzeichnet durch eine geringere Zahl kolorektaler Adenome (gewöhnlich 10 bis 100), höheres Alter beim Auftreten der Adenome und ein geringeres Lebenszeitrisiko bezüglich der Entstehung eines kolorektalem Karzinoms. Osteome des Schädels und der Mandibula, Zahnanomalien sowie Fibrome an Kopfhaut, Schultern, Armen und Rücken sind neben den Adenomen Merkmale der Gardner-Variante. Die Assoziation von FAP und Medulloblastom wird als Turcot-Syndrom bezeichnet. Die klassische FAP wird autosomal-dominant vererbt und ist die Folge von Keimbahnmutationen im APC-Gen (5q21-q22). Viele Patienten (~70%) haben Verwandte mit kolorektalen Polypen und Krebs. Bei einer Untergruppe von Patienten mit Mutationen im MUTYH-Gen (1p34.1) wird die Polypose rezessiv vererbt. Die biallelen MUTYH Mutationen sind in der Regel mit einem abgeschwächten Polyposis-Phänotyp assoziiert. Die Diagnose basiert auf der Familienanamnese, den klinischen Befunden, einer Initialen Sigmoidoskopie und gegebenenfalls einer kompletten Koloskopie. Wenn möglich, sollte die klinische Diagnose durch eine molekulargenetische Untersuchung bestätigt werden. Unerlässlich ist eine Überweisung zur humangenetischen Beratung. Differentialdiagnosen sind andere Krankheiten mit multiplen Polypen (Peutz-Jeghers-Syndrom, Familiäre juvenile Polypose oder Hyperplastische Polypose, Syndrom der Hereditären gemischten Polypose, Lynch-Syndrom). 122 Genetische Krebsrisiken Indikation V. a. familiäre Polyposis coli, frühe Manifestation, teilweise extrakolonisch (Duodenum, congenitale Hypertrophie des retinalen Pigmentepithels, Epidermoidzysten, Hepatoblastom). Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- FAP Stufendiagnostik: methode 1. PCR und Sequenzierung relevanter Bereiche von Exon 15 2. Deletionsnachweis mittels MLPA 3. PCR und Sequenz. der kodier. Exons 1-14 und fehlende Bereiche des Exons 15 AFAP Stufendiagnostik: wie FAP, aber ohne MLPA, dafür ggf. Analyse MUTYH-Gen (Exon 1-16) Untersuchungs- 1-2 Monate dauer Literaturhinweise Rustgi, A. K., Genes Dev. 21: 2525-2538, 2007; Krush, A. J. et al., Am. J. Med. Genet. 29: 323-332, 1988; Giardiello, F. M. et al., Gut 40: 521-525, 1997; Bercovich D. et al., www.orpha.net Tumorprotein p53, Li-Fraumeni-Syndrom TP53-Gen (Apolipoprotein B; Genort: 17p13.1; OMIM *191170) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Das Li-Fraumeni-Syndrom (LFS) ist eine sehr seltene autosomal-dominant vererbte Prädisposition junger Menschen zu einer Vielzahl verschiedener Tumoren. Die Häufigkeit wird auf ca. 1 in 15.000 Lebendgeburten geschätzt. Die Diagnose eines LFS wird gemäß den revidierten ChompretKriterien klinisch gestellt. • ein (Index-) Patient mit einem Tumor aus dem LFS-Tumorspektrum (Weichteilsarkom, Osteosarkom, Brustkrebs, Hirntumor, Nebennierensarkom, Leukämie, bronchoalveoläres Lungenkarzinom) vor dem 46. Lebensjahr. • und mindestens ein erst- oder zweitgradiger Verwandter mit einem LFSTumor (nicht Mamma-Ca, wenn der erste Tumor ebenfalls ein MammaCa ist) vor dem 56. Lebensjahr. Oder multiple Primärtumoren aus dem LFS-Tumorspektrum bei einer Person (altersunabhängig) • oder ein Patient mit multiplen Tumoren bei dem einer vor dem 46. Lebensjahr diagnostiziert wurde und zwei weitere die dem LFS-Tumorspektrum zuzuordnen sind • oder ein Patient mit einem Karzinom des Plexus coroideus oder einem Nebennierenkarzinom unabhängig von der Familienanamnese. Genetische Krebsrisiken 123 Klinische Bedeutung Die charakteristischsten Tumoren sind bei jungen Menschen Tumore der Nebenniere, Weichteilsarkome, Leukämien und ZNS-Tumore. Im Erwachsenenalter treten häufig Osteosarkome, Brustkrebs und Lungenkrebs auf. Tatsächlich kann aber jede Art von Tumor in jedem Alter vorkommen. Eine Keimbahn-Mutation im TP53-Gen wird in etwa 70% der LFS-Familien gefunden, aber auch bei einigen Patienten und in Familien mit Verdacht auf LFS, die die Kriterien nicht strikt erfüllten. In einigen Familien wurde eine Keimbahnmutation im CHK2-Gen (Tumorsuppressionsgen) nachgewiesen. Für Träger einer pathogenen Mutation im TP53-Gen ist das Risiko, mit Krebs zu erkranken, 15% im Alter von 15 Jahren, 80% für 50-jährige Frauen und 40% für gleichaltrige Männer. Dieser signifikante Unterschied zwischen beiden Geschlechtern wird fast vollständig durch die Fälle von Brustkrebs erklärt. Das Risiko für einen Zweittumor ist hoch, besonders auch nach Bestrahlung. Indikation Verdacht auf Li-Fraumeni-Syndrom, im fühen Lebensalter auftretende bzw. schnell progrediente CLL Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- CLL: Stufendiagnostik durch Sequenzierung der Exons 5-9 von TP53 methode Li-Fraumeni-Syndrom: Stufendiagnostik durch Sequenzierung der Exons 1-10 und MLPA des Gens TP53. Untersuchungs- Ca. 1 Woche dauer Literaturhinweise Vousden, K. H., Lane, D. P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8: 275-283, 2007 Bourdon, J.-C., Brit. J. Cancer 97: 277-282, 2007 Toledo, F., Wahl, G. M., Nat. Rev. Cancer 6: 909-923, 2006 Mammakarzinom (Familiärer Brustkrebs) BRCA1-Gen (Genort: 17q21; OMIM #113705), BRCA2-Gen (Genort: 13q12.3; OMIM #600185) Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32 Erbgang Autosomal-dominant (mit unterschiedlicher Penetranz) Klinische Bedeutung Bei etwa 5-10 % aller Frauen mit einem Mammakarzinom liegt eine genetische Disposition im Sinne eines autosomal dominanten Erbgangs vor. Am häufigsten finden sich hierbei Mutationen in den Genen BRCA1, resp. BRCA2, die nach neueren Erkenntnissen bei ca. 25% der familiären Fälle von Brust-und Eierstockkrebs nachgewiesen werden können. Die Genprodukte von BRCA1 und BRCA2 sind an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt. 124 Genetische Krebsrisiken Klinische Bedeutung Wird eine mutierte Anlage geerbt, kann der Ausfall des zweiten intakten Allels zur Tumorentstehung führen (Loss of Heterozygosity, LOH). Das lebenslange Risiko für Trägerinnen einer BRCA-Keimbahnmutation an einem Tumor zu erkranken ist somit erhöht (es in der Literatur unterschiedlich mit 50-80 % angegeben. Männliche Anlageträger haben eine Erkrankungswahrscheinlichkeit von ca. 5% für Brustkrebs. Zudem ist das Risiko für weitere Krebserkrankungen erhöht, insbesondere für Prostata-, Pankreas-, Magen- und kolorektale Karzinome. Eine Beratung und genetische Testung soll derzeit laut S3-Leitlinie Brustkrebs angeboten werden, wenn in einer Linie der Familie: • mindestens 3 Frauen an Brustkrebs erkrankt sind • mindestens 2 Frauen an Brustkrebs erkrankt sind, davon 1 vor dem 51. Lebensjahr • mindestens 1 Frau an Brustkrebs und 1 Frau an Eierstockkrebs erkrankt sind • mindestens 2 Frauen an Eierstockkrebs erkrankt sind • mindestens 1 Frau an Brust- und Eierstockkrebs erkrankt ist • mindestens 1 Frau mit 35 Jahren oder jünger an Brustkrebs erkrankt ist • mindestens 1 Frau mit 50 Jahren oder jünger an bilateralem Brustkrebs erkrankt • mindestens 1 Mann mit Brustkrebs und eine Frau mit Brust- oder Eierstockkrebs Bezüglich der Möglichkeit der Testung von Familien mit nur einem an Brustkrebs erkrankten Mann sowie der BRCA-Analyse bei triplenegativem Mammakarziom auch ohne familiäre Belastung bitten wir um Rücksprache. Bei Nachweis einer pathogenen Mutation kann bei jedem ratsuchenden Familienangehörigen nach der entsprechenden Veränderung gesucht werden. Wenn in der Familie keine Mutation in den Genen BRCA 1 oder BRCA 2 als Ursache der Krebserkrankung gefunden wird, kann aber leider das Vorliegen einer Erbanlage für Brust- und Eierstockkrebs nicht ausgeschlossen werden, da die genannten Veränderungen nur für ca. 25% der erblichen Brustkrebserkrankungen verantwortlich sind. In diesem Fall richten sich die Vorsorgeempfehlungen nach dem statistischen Risiko. Ein hohes Risiko liegt vor, wenn das Lebenszeitrisiko zu erkranken größer als 30 Prozent ist oder das Risiko für eine Anlageträgerschaft für eine Mutation über 20% liegt. Für Hochrisikopatientinnen werden intensivierte Früherkennungsmaßnahmen empfohlen. Zudem bestehen operative Optionen (Mastektomie, Salpingo-Oophorektomie) zur Risikosenkung, die interdisziplinär erörtert werden sollten. Mutationsträgerinnen wird eine prophylaktische beidseitige Salpingo-Oophorektomie um das 40. Lebensjahr sowie nach abgeschlossener Familienplanung empfohlen mit anschließender Hormonersatztherapie bis zum 50. Lebensjahr. Genetische Krebsrisiken 125 Klinische Bedeutung Weitere Brustkrebshoch- wie auch niedrigrisikogene sind beschrieben und führen in teils komplexen Interaktionen zur Tumorentstehung. 2010 konnte ein drittes Hochrisikogen, RAD51C, identifizieren werden. 41 weitere Gendefekte sind derzeit bekannt, die aber wahrscheinlich überwiegend mit einer eher moderaten Risikoerhöhung einhergehen. Es kann davon ausgegangen werden, dass in den nächsten 2 bis 5 Jahren mehrere 100 das Brustkrebsrisiko erhöhende Gendefekte entdeckt werden, die vermutlich alle moderate Risikogene sind. Indikation Diagnostik bei V. a. erblichen Brustkrebs und/oder Ovarialkrebs (siehe oben) Mutationen Über 1600 Veränderungen für das BRCA1-Gen und über 1800 BRCA2Veränderungen sind in der BIC Datenbank gespeichert (Stand: September 2010). Häufigste Mutationen in der deutschen Bevölkerung sind im BRCA1-Gen c.181T>G (p.Cys61Gly) (Exon 5) und c.5385_5386insC (Exon 20); im BRCA2-Gen finden sich Häufungen in den Exons 10, 11 und 23 Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Stufendiagnostik durch Sequenzierung und MLPA der Gene BRCA1 und methode BRCA2; ggfs. NGS, ggfs. auch molekulargenetische Diagnostik weiterer Gene Untersuchungs- 2-3 Wochen (Untersuchung auf bekannte familiäre Mutation) dauer 4-5 Monate (vollständige Analyse) Literaturhinweise Boulton SJ, Biochemical Society Transactions, 34: 633-45; 2006 Hall JM et al, Science, 250: 1684–9 (1990) Hemminki K; International Journal of Cancer, 108: 109-14 (2004) Leitlinie Brustkrebs, Juli 2012 Diagnostik; Ahlborn C., Bericht über das 2. Symposium Familiärer Brust-und Eierstockkrebs am 29.6.2013 in München, Zusammenfassung; newsletter, Ausgabe 1 September 2013 des Zentrums „Familiärer Brust-und Eierstockkrebs“ der Universität Köln, R. Schmutzler Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1) Tumorsuppressor-Gen MEN1 (Menin) Genort: 11q13. #13110 Erbgang Autosomal-dominant, sporadisch Klinische Bedeutung Die Multiple Endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1) ist ein seltenes erbliches Tumor-Syndrom, von dem etwa 1 von 30 000 Personen betroffen ist. 126 Genetische Krebsrisiken Typischerweise kommt es zur variablen Bildung von Tumoren in unterschiedlichen endokrinen Geweben, darunter vor allem in der Nebenschilddrüsen, dem endokrinen Pankreas und dem Hypophysen-Vorderlappen. Häufig ist eine Hyperkalzämie ein erstes Syndrom der Erkrankung und kann bereits im Jugendalter auftreten. Zum Spektrum der Erkrankung zählen außer den genannten typischen Tumoren z. B. auch Tumoren der Nebennierenrinde, Karzinoide der Bronchien, des Magendarmtraktes und des Thymus, sowie nicht-endokrine Neubildungen wie Lipome, Angiofibrome und Kollagenome. Wenn bei einem einzelnen Patienten zwei der drei prinzipiell zur MEN1 gehörigen Tumore (Adenome der Nebenschilddrüsen, Darm-PankreasTumoren, Hypophysentumoren) beobachtet werden, bedingt dies den Verdacht auf das Vorliegen von MEN 1. Ist die Krankheit bereits bei einem oder mehreren Familienmitgliedern festgestellt worden, gilt bei den Angehörigen schon die Entwicklung eines einzelnen endokrinen Tumors als Anzeichen für das Vorliegen von MEN 1. Ursächlich für das MEN1-Syndrom sind Funktionsverlust-Mutationen im Tumorsuppressor-Gen MEN1. Die Vererbung erfolgt autosomal-dominant, wobei es sich in ca. 10% der Fälle um Neumutationen handelt. Indikation Fragliche MEN 1-Patienten und auch bisher gesunde Verwandte von MEN 1-Patienten. Bei ca. 10% der Fälle lässt sich trotz klinischer Diagnose keine Mutation im Menin-Gen nachweisen. Mutationen Alle Exons sowie deren flankierende Bereiche werden mittels DNA-Sequenzierung untersucht. Zur Erfassung von Deletionen ein oder mehrerer Exons wird eine MLPA-Analyse für alle Exons des MEN1-Gens durchgeführt. Material 2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Sequenzierung aller Exons sowie deren flankierende Bereiche, Deletionsmethode screening mittels MPLA. Mutationen bei > 90% aller MEN 1-Patienten nachweisbar Untersuchungs- Ca. 3 Wochen dauer Literaturhinweise Thakker R. V et al., Clinical Practice Guidelines for Multiple Endocrine Neoplasia Type 1 (MEN1) J Clin Endocrinol Metab 97: 2990-3011, 2012 Gaztambide S et al., Minerva Endocrinol. Diagnosis and treatment of multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1), 2013 Mar; 38(1):17-28 Genetische Krebsrisiken 127 Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN2) MEN2A (Sipple-Syndrom), MEN2B (Wagenmann-FroböseSyndrom), Familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom (FMTC) RET (Rearranged during Transfection)-Protooncogen Genort: 10q11.2; OMIM #171400, +164761 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die MEN2-Erkrankung ist mit einer Prävalenz von 1:30.000 eine seltene, genetisch bedingte Krebserkrankung. Je nach klinischer Ausprägung werden bezüglich Erkrankungsalter und Tumorbefall verschiedener endokriner Organe Unterformen unterschieden: Die MEN2A betrifft etwa 70% - 80% der MEN2-Familien. Betroffene entwickeln ein medulläres Schilddrüsenkarzinom (MTC), ein meist beidseitiges Phäochromocytom und / oder einen primären Hyperparathyroidismus. Als eine Variante der MEN2A wird das familiäre medulläre Schilddrüsenkarzinom (FMTC) angesehen, bei dem nur ein isoliertes MTC vorliegt. Das FMTC tritt bei etwa 10% -15% der MEN2-Patienten auf. Nur etwa 5% der MEN2-Familien zeigen die MEN2B-Unterform mit frühzeitiger Erkrankung an einem MTC und deutlich agressiverem klinischen Verlauf. Auch hier treten Phäochromocytome auf, zusätzlich zeigen viele Kinder mukokutane Neurome, diffuse Ganglioneuromatose im Darm und einen marfanoiden Habitus. Die häufigsten Mutationen des RET-Protoonkogens bei MEN2A / FMTC können in einem von 5 Codons für hochkonservierte Cysteine des entsprechenden Proteins nachgewiesen werden (Aminosäureposition 609, 611, 618, 620 und 634). Die meisten MEN2B-Patienten zeigen die Punktmutation M918T, seltener wird die A883F-Mutation oder eine zusätzliche Mutation kombiniert mit der MEN2A-Mutation V804M vorgefunden. Andere seltene Punktmutationen des RET-Protoonkogens sind in der Literatur beschrieben. Indikation MTC, Phäochromocytom, Hyperparathyroidismus Mutationen Mutationen im RET-Protooncogen in den Exons 5, 8, 10, 11, 13, 14, 15 und 16 Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Mittels PCR wermethode den bei Verdacht auf MEN2A / FMTC die Exons 5, 8, 10, 11, 13, 14, 15 und 16 und bei MEN2B die Exons 14, 15 und 16 des RET-Gens amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht. 128 Genetische Krebsrisiken Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen dauer Literaturhinweise Wohllk et al., Best Practice Res Clin Endocrinol Metabol 24:371-387, 2010 Pacini et al., Clin Oncol (RCollRadiol) 22:475-485, 2010 Castellone et al., Clin Endocrinol 73:529-534, 2010 Ritter and Höppner, Internist 40:486-492, 1999 Neurofibromatose Typ1 / Morbus Recklinghausen NF1-Gen (Neurofibromatosis type I; Genort: 17q11.2; OMIM #162200) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) oder von-Recklinghausen-Krankheit, ist eine der häufigsten genetischen Krankheiten. Betroffen sind 1/4.000 bis 1/3.000 Individuen. Mit 5 Jahren ist die Penetranz nahezu vollständig. Ursache sind Mutationen im NF1-Gen, dem menschlichen Gen mit der höchsten Mutaionsrate. Es ist ein großes (350 kb, 60 Exone) Tumorsuppressor-Gen, welches für das zytoplasmatische Protein Neurofibromin kodiert. Die pathogenen Keimbahn-Mutationen sind über das ganze Gen verteilt und werden meist nur in einer Familie gefunden. Die Mutationsrate ist besonders hoch und fast die Hälfte der Fälle ist durch Neumutationen verursacht. Der Phänotyp variiert sehr stark, auch innerhalb einer Familie. Für eine klinische Diagnose sollten mindestens 2 der folgenden 7 Kriterien erfüllt sein: • 6 oder mehr Café-au-lait-Flecken mit einem größten Durchmesser von mehr als 5 mm vor der Pubertät, bzw. mehr als 15 mm nach der Pubertät • 2 oder mehr Neurofibrome oder mindestens ein plexiformes Neurofibrom • sommersprossartige Pigmentierungen in der Achselhöhle oder in der Leistengegend (Freckling) • Tumor am Sehnerv (Optikusgliom) • Pigmentanreicherungen auf der Regenbogenhaut des Auges (LischKnötchen) • Typische Knochenveränderungen (Keilbeinflügeldysplasie, Verkrümmung der langen Röhrenknochen) • Verwandter ersten Grades (Elternteil, Geschwister, Kind) mit der Diagnose Neurofibromatose Typ 1 aufgrund dieser Kriterien Indikation Verdacht auf Neurofibromatose Material 2-5 ml EDTA-Blut Genetische Krebsrisiken 129 Untersuchungs- Stufendiagnostik: methode 1. PCR und Sequenzierung der 60 Exons des NF1-Gens 2. Deletions-/Duplikationsanalyse mit MLPA Untersuchungs- 1-2 Monate dauer Literaturhinweise Williams, V. C. et al., Pediatrics 123: 124-133, 2009 McGaughran, J. M.et al., J. Med. Genet. 36: 197-203, 1999 King, A. A.et al., Am. J. Med. Genet. 93: 388-392, 2000 Pinson S., www.orpha.net Peutz-Jeghers-Syndrom STK11-Gen (Serin/Threonin-Kinase 11; Genort: 19p13.3; OMIM *602216) Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Das typische klinische Bild des Peutz-Jeghers-Syndroms umfasst Hyperpigmentierungen im Lippenbereich und auf der Wangenschleimhaut in Kombination mit einer gastrointestinalen hamartomatösen Polyposis. Die Hyperpigmentierungen fehlen jedoch bei einigen Patienten. Des Weiteren können Ovarial-, Pankreas- und Hodenkarzinome auftreten. Die Patienten haben ein erhöhtes Risiko für Tumoren des Ovars (Granulosazelltumoren), der Hoden (Sertoli-Zelltumore), der Zervix und des Pankreas und evtl. auch ein erhöhtes Risiko für Brust- und Schilddrüsenkrebs. Kriterien für die Diagnosestellung eines Peutz-Jeghers-Syndroms sind derzeit folgende: • mindestens drei histologisch gesicherte Peutz-Jeghers-Polypen oder • mindestens ein Peutz-Jeghers-Polyp bei entsprechend positiver Familienanamnese oder • eine typische Lippenpigmentierung bei entsprechend positiver Familienanamnese oder • mindestens ein Peutz-Jeghers-Polyp in Kombination mit der typischen Lippenpigmentierung. Das Syndrom ist selten, wahrscheinlich liegt die Prävalenz unter 1:50.000. 70% der Familien haben eine Mutation im STK11-Gen in der Chromosomenregion 19p13.3. Bei 10-20% der Patienten lässt sich keine Familienanamnese erheben, was auf Neumutationen hinweist. Das Gen kodiert für eine Serin-Protein-Kinase. In den hamartösen Läsionen ist das Gen auf beiden Chromosomen inaktiviert. Es ist dies der erste Hinweis, daß auch Proteinkinasen als Tumor-Suppressoren wirken können. 130 Genetische Krebsrisiken Mutationen wurden im gesamten kodierenden Bereich des STK11-Gens gefunden. Eine Beziehung zwischen Ort und Art der Mutation und den pathologischen Befunden ist jedoch nicht erkennbar. Indikation Verdacht auf Peutz-Jeghers-Syndrom Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Stufendiagnostik: 1. Sequenzierung aller 10 Exons und 2. MLPA methode Untersuchungs- 1-2 Monate dauer Literaturhinweise Karuman, P. et al., Molec. Cell 7: 1307-1319, 2001 Jenne, D. E. et al., Nature Genet. 18: 38-43, 1998 Amos, C. I. et al., J. Med. Genet. 41: 327-333, 2004 Olschwang S., www.orpha.net Prostatakarzinom (PCA3) PCA3-Gen (Prostatakrebs-Gen 3; Genort: 9q21-q22; OMIM *604845) Klinische Bedeutung Seit der routinemäßigen Einführung des PSA wurde die Früherkennung des Prostatakarzinoms revolutioniert. Der PSA-Wert ist ein organ- und tumorspezifischer Marker. Neben dem Malignom kann die PSA-Konzentration durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden. Bei PSA-Werten über 4 ng/ml liegt die Karzinomfindung bei etwa 25%. Bei negativer Biopsie und erhöhten PSA-Werten besteht dennoch ein erhöhtes Risiko für eine Erkrankung, da 25% der Prostatakarzinome bei einer einmaligen Biopsie nicht diagnostiziert werden. Daher sind ggf. weitere Biopsien notwendig. Um die Erkennung eines möglicherweise vorhandenen Prostatakarzinoms nach negativen Biopsien zu verbessern, wurden und werden zahlreiche bildgebende und andere Verfahren untersucht. PCA3 ist ein Gen, das ausschließlich in Prostatagewebe exprimiert wird. Wenn Prostatazellen entarten, wird PCA3 überexprimiert. Prostatakarzinomzellen synthetisieren dabei 60-100fach mehr PCA3-mRNA als normales Prostatagewebe. Als Ergebnis erhält man einen hochinformativen PCA3-Score, der unter Berücksichtigung der Krankengeschichte als Biomarker für eine Biopsieentscheidung Verwendung findet. Genetische Krebsrisiken 131 Klinische Bedeutung Der PCA3-Score ist im Gegensatz zum PSA vom Prostatavolumen unabhängig, scheint aber mit der Größe des Karzinoms zu korrelieren. Die Ergebnisse einer amerikanischen Studie an 233 Männern mit erhöhten PSAWerten und negativer Biopsie zeigten, dass eine Wiederholungsbiopsie in ca. 27% positiv ausfällt (1). Die Sensitivität des PCA3-Scores bei einem Cut-off von 35 betrug 58% bei einer Spezifität von 72%. Der PCA3-Score ist der PSA bzw. freien PSA-Bestimmung zur Vorhersage eines Ergebnisses einer Wiederholungsbiopsie überlegen (1, 2). Die Wahrscheinlichkeit eines positiven Biopsieergebnisses korreliert dabei mit der Höhe des PCA3-Scores. Indikation Zusätzliche Information, wenn PSA und die digital rektale Untersuchung (DRU) keine eindeutigen Informationen liefern. Entscheidungshilfe zu einer erneuten Biopsie Mutationen Im Median 66fache Überexprimierung der PCA3-mRNA in Prostatakarzinomzellen Material Urin, der nach einer standardisierten DRU in einem neutralen Gefäß aufgefangen wird und in ein spezielles Transportröhrchen, das Sie bei uns anfordern können, umgefüllt wird. Untersuchungs- Hybridisierung der Zielsequenzen aus dem Urin, anschließende Überfühmethode rung in cDNA mittels reverser Transkriptase, Amplifikation, Detektion der Amplifikate durch HPA (chemilumineszenzmarkierte Nukleinsäuresonden), Ermittlung des PCA3-Scores aus den quantitativen Ergebnissen von PCA3- und PSA-mRNA Untersuchungs- 1 Woche dauer Literaturhinweise Marks et al.: PCA3 molecular urine assay for prostate cancer in men undergoing repeat biopsy. Urology, 2007, 69 (3): 532-535 Haese et al.: The value of the PCA3 assay in guiding decision which men with a negative prostat 132 Genetische Krebsrisiken HLA-Assoziationen HLA-Assoziationen Abacavir-Hypersensitivitätsreaktion (HLA-B*5701) HLA-B-Gen (Human leukocyte antigen B; Genort: 6p21.33; OMIM +142830) Klinische Bedeutung Ca. 5% der Patienten entwickeln unter Behandlung mit dem nukleosidalen Reverse-Transkriptase-Hemmer Abacavir, welcher seit 1999 einen wichtigen Bestandteil der Therapie von HIV-Patienten darstellt, eine Hypersensitivitätsreaktion, die in einigen Fällen sogar tödlich verläuft. Als wesentliche Ursache dafür, wurde eine genetische Variante im humanen Leukozyten Antigen-System (HLA), das Allel HLA-B*5701, identifiziert. Die prospektive PREDICT-1-Studie, an der 1956 Patienten aus 165 Zentren in 19 Ländern teilgenommen hatten, belegt den klinischen Nutzen der HLA-B*5701-Testung zur Vermeidung von HSR: Die Studie ergab, dass eine Testung auf das Allel vor Therapiebeginn mit nachfolgendem Ausschluss HLA-B*5701 positiver Patienten von der Abacavir-Therapie zu einer signifikanten Verringerung der Häufigkeit Abacavir-induzierter Überempfindlichkeiten führt. Ca. 48-61% der Patienten mit dem HLA-B*5701-Allel entwickeln eine HSR auf Abacavir, verglichen mit 0% bis 4% der Patienten, die nicht Träger des HLA-B*5701-Allels sind. Es ist wichtig zu beachten, dass auch ein kleiner Teil der Patienten, die nicht Träger des HLA-B*5701-Alles sind, eine HSR entwickeln können. Daher ist bei klinischem Verdacht auf eine HSR, auch nach Ausschluss des HLA-B*5701-Allels, Abacavir abzusetzen und eine erneute Behandlung mit Abacavir zu vermeiden. Hypersensitivitätsreaktion: Abacavir-induzierte Überempfindlichkeitsreaktionen treten in den ersten sechs Wochen der Behandlung auf und können lebensbedrohliche Verläufe nehmen. Die Symptome weisen auf eine Multiorganbeteiligung hin. Fast immer treten Fieber und / oder Hautausschlag auf. Weitere unspezifische respiratorische sowie gastrointestinale Symptome (Dyspnoe, Halsschmerzen, Husten, abnorme Röntgenthoraxbefunde, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhöe, Bauchschmerzen) können fälschlicherweise als respiratorische Erkrankung oder Gastroenteritis diagnostiziert werden. Nach Absetzen der Behandlung mit Abacavir verschwinden die Symptome für gewöhnlich. Eine erneute Behandlung mit Abacavir nach Abbruch aufgrund einer HSR führt zu einem schnellen Wiederauftreten und schwerwiegenderem Verlauf der Symptome innerhalb weniger Stunden und ist deshalb kontraindiziert. Indikation Verpflichtender Test vor Beginn einer Abacavir-Therapie Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- HLA-B*5701 Typisierung mittels PCR und Gelelektrophorese methode Untersuchungs- 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise NN: Gentest ist Pflicht vor Therapie mit Abacavir, DÄ, 2008, 12: 644 http://www.bfarm.de/nn_1095560/SharedDocs/Publikationen/DE/Pharmakovigilanz/roteHandBriefe/2008/abacavir,templateId=raw,property=publicationFile.pdf/abacavir.pdf Mallal S et al., N Engl J Med, 2008, 358: 637-9 HLA-Assoziationen 133 Morbus Behcet (HLA-B51) Genort: 6p21.3 OMIM #109650 Erbgang Multifaktoriell Klinische Bedeutung Der M. Behcet ist eine chronische Gefäßentzündung, die typischerweise zu rezidivierenden schmerzhaften Aphthen im Mund und Genitalbereich führt. Aber auch Entzündungen von Uvea und Iris des Auges bis hin zu nachfolgender Erblindung werden beobachtet. In selteneren Fällen treten Haut- und Gelenkaffektionen auf. Bei Beteiligung von Gehirn, Lunge oder anderer lebenswichtiger Organe kann der M. Behcet unbehandelt auch zum Tode führen. Die Prävalenz in der Bevölkerung ist stark vom ethnischen Hintergrund abhängig und beträgt in der Türkei ca. 190/100.000, in Japan 10/100.000 und 5-10/100.000 in Europa. Etwa 5% der Fälle treten familiär auf. Obgleich die genaue Genese der Erkrankung bislang nicht bekannt ist, besteht eine starke genetische Disposition sowie eine Assoziation mit dem HLA B-51-Gen.So sind ca. 29% der rheumatologischen und 57% der neurologischen Behcet-Patienten HLA B*51 Carrier. 2012 wurde bei einer genomweiten Assoziationsstudie unter anderem ERAP1 als Risikogen für den M. Behcet entdeckt, welches zusammen mit HLA-Molekülen bei der Antigenpräsentation der Immunabwehr eine Rolle spielt. Das Risiko für einen M. Behcet wurde bei Vorliegen einer ERAP1-Variante allerdings nur dann erhöht gefunden, wenn sie in Kombination mit einem HLA B-51-Serotyp vorlag. Weitere Ergebnisse bleiben abzuwarten. Indikation Differentialdiagnose zu reaktive Arthritiden (Reiter-Syndrom), habituelle orale Aphthose, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, Lichen ruber planus, Pemphigoid. Mutationen Verschiedene Allele des HLA-B51 wie B*5101, B*5108, B*5105 und B*5104 sind mit M. Behcet assoziert. Bei Homozygotie für B51 scheint das Risiko deutlich erhöht als Hinweis auf einen möglichen Gen-Dosis-Effekt. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Nachweis von HLA-B51-Allelen wie B*5101, B*5108, B*5105 und B*5104 methode über PCR mit sequenzspezifischen Primern, Gelelektrophorese Untersuchungs- 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Kirino Y. et al., Nature Genetics 45: 202-208 (2013) Travis H. et al., Nature Genetics 45: 319–324(2013) Saadoun D. & W.Wechsler, Orphanet Journal of Rare Diseases 7:20 (2012) 134 HLA-Assoziationen Narkolepsie (HLA-DQB1, HLA-DRB1) HLA-DQB1 und -DRB1-Allele Genort: 6p21.3; OMIM # 161400, *604305, *142857 Klinische Bedeutung Bei der Narkolepsie sind die für die Schlaf-Wach-Regulation zuständigen Gehirn-Zentren gestört. Es besteht eine ausgeprägte Tagesschläfrigkeit mit plötzlichen Schlafanfällen, gegen die sich die Erkrankten nicht wehren können. Dieser Schlaf unterscheidet sich vom normalen Schlaf durch den sofortigen Eintritt in die REM-Phase (REM = rapid eye movements). Die Häufigkeit wird zwischen 5 und 50 Fällen auf 10.000 Menschen angegeben. Die Ursache der Narkolepsie ist nicht abschließend geklärt. Häufig findet sich jedoch insbesondere bei schweren Fällen von Narkolepsie eine genetische Variante, das DQB1*0602-Allel. Da dieses wie die Krankheit selbst familiär gehäuft auftritt, wurde bisher eine genetische Veranlagung für Nakolepsie angenommen. Neuere Forschungen belegen einen Mangel an Orexinen als mögliche Ursache. Orexin A und Orexin B sind im Hypothalamus gebildete PeptidHormone, die großen Einfluss auf den Schlaf-Wach-Zyklus besitzen. Sie werden auch als Weckhormone bezeichnet. Es wird von einem Mangel an Orexin-bildenden Zellen als eigentlichem Ursprung dieser Erkrankung ausgegangen, wobei ein Absterben dieser Zellen wie auch ein genetisch bedingter Mangel in Frage kommt Indikation Ausschluss der Narkolepsie Mutationen Etwa 95% der kaukasischen Narkolepsiepatienten tragen das Allel DQB1*0602 und 25-35% der Normalbevölkerung. Die HLA-Typisierung eignet sich daher nicht zur Risikoabschätzung bei Gesunden. Vielmehr ist ein negatives Ergebnis in der HLA-Typisierung Anlass, die Diagnose Narkolepsie zu überdenken. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Nachweis der HLA-Allele DQB1*0602 und DRB1*1501 über PCR mit semethode quenzspezifischen Primern (SSP), Gelelektrophorese Untersuchungs- 1-2 Wochen dauer Literaturhinweise Lin L, et al.; Cell 1999;98:365–76 Chemelli RM et al.; Cell 1999; 98: 437–51 Nishino S. et al.; Lancet 2000;355:39–40 Marcel Hungs and Emmanuel Mignot; BioEssays 23:397±408, Maret S., Tafti M.; SWISS MED WKLY 2005;135:662–665 HLA-Assoziationen 135 Rheumatoide Arthritis (HLA DR4, shared epitope) HLA-DRB1-Allele; Genort: 6p21.31; MIM ID: # 180300 Erbgang Autosomal-rezessiv Klinische Bedeutung In Europa zeigen 0,5-2 Prozent der Erwachsenen eine rheumatoide Arthritis (RA) oder Polyarthritis. Die Erstausprägung beginnt meist nach dem 20. Lebensjahr, wobei eine „Bevorzugung“ des weiblichen Geschlechts auffällt. Im Regelfall ist keine familiäre Häufung von Betroffenen nachweisbar (sporadisches Vorkommen). Die Beteiligung genetischer Faktoren wird im Sinne einer Disposition angenommen (multi-faktorieller Erbgang). Der Krankheitsverlauf kann individuell sehr unterschiedlich sein. Die Symptome umfassen Gelenkentzündung, Versteifung und Bewegungseinschränkung. Die Krankheit kann sich aber auch außerhalb des Bewegungsapparates manifestieren wie z. B. durch Gefäßentzündung (Vaskulitis). Indikation V. a. rheumatoide Arthritis Mutationen Die Prädisposition für RA ist genetisch durch das Vorliegen bestimmter Allele der HLA-DR-Region bedingt. Ein besonders hohes Risiko an RA zu erkranken haben Individuen, die das DR4-Antigen exprimieren, das durch bestimmte Allele der HLA-DRB1*04-Gruppe codiert wird (*0401, *0404, *0405, *0408). Jedoch auch DRB1-Allele anderer Gruppen (z. B. *0101, *0102 und *1001) können mit dem Risiko assoziiert sein. Die vorstehend genannten Allele codieren alle ein DRB1-Polypeptid, das in seiner dritten hypervariablen Region das sog. „shared epitope“ (SE) aufweist. Diese Aminosäuresequenz umfasst die Motive: QKRAA, QRRAA oder RRRAA (Q = Glutamin, K = Lysin, R = Arginin, A = Alanin). Die verschiedenen Allele, ihre unterschiedlichen Kombinationen sowie ihre Anzahl (hetero- bzw. homozygot) beeinflussen die Ausprägungswahrscheinlichkeit und die Schwere der Erkrankung. Patienten mit dem homozygoten Genotyp *04-QKRAA/*04-QKRAA haben ein sehr hohes Erkrankungsrisiko und oft einen schwereren Verlauf, während Patienten mit einem heterozygoten Genotyp oder mit Allelen der *01-Gruppe nur ein mittleres bis geringes Erkrankungsrisiko aufweisen. Material 2-5 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Die Untersuchung erfolgt in zwei Stufen, wobei in der ersten nur auf das methode Vorliegen von HLA-DRB1*04-Allelen getestet wird, ohne diese allelspezifisch aufzulösen (d. h. bis auf die Ebene *0401, *0402 usw.). Dazu werden eventuell vorhandene DRB1*04-Allele mittels PCR amplifiziert und Gelelektrophorese analysiert. 136 HLA-Assoziationen In einer zweiten Stufe werden die Allele auf das Vorhandensein des SEMotivs ausgetestet und die Anzahl der Allele (Homozygotie, Heterozygotie) bestimmt. Dabei werden auch Allele der Gruppen *01 und *10 erfasst. Dabei werden DRB1-Allele mittels PCR amplifiziert und Allele mit einem SE über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden nachgewiesen. Untersuchungs- 3-5 Tage (Stufe 1) dauer 5-8 Tage (Stufe 2) Literaturhinweise Gormann et al., Arthritis & Rheumatism 50, 400-412, 2004 Tezenas du Montcel et al., Arthritis & Rheumatism 52, 1063-1068, 2005 Morgan et al., Arthritis & Rheumatism 58, 1275-1283, 2008 Seronegative Arthritiden (HLA B27) Major Histocompatibility Complex Genort: 6p21.3; OMIM # 106300 Erbgang Autosomal-dominant Klinische Bedeutung Träger des HLA-B27-Allels zeigen ein stark erhöhtes relatives Risiko für Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew), für die Trias Urethritis-Konjunktivitis-Arthritis (Morbus Reiter), akute Uveitis und reaktive Arthritiden nach Infektionen mit Yersinien, Salmonellen, Shigellen bzw. Gonokokken oder Chlamydien. Die genaue Pathogenese dieser arthritischen Erkrankungen ist nach wie vor unbekannt. Es gibt aber Hinweise auf autoimmune Prozesse sowie Proteinsequenzhomologien zwischen gramnegativen Enterobakterien und HLA-B27. Die Prävalenz des HLA-B27-Allels in der kaukasischen Bevölkerung beträgt etwa 7-9 %, davon entwickelt aber nur ein geringer Prozentsatz (ca. 2%) Morbus Bechterew. Etwa 90-95 % der Patienten mit Spondylitis ankylosans sind HLA-B27-positiv, bei Morbus Reiter und postinfektiösen Arthritiden beträgt die Assoziation mit HLA-B27 60-90%. HLA-B27-positive Merkmalsträger zeigen gegenüber Nichtträgern ein erhöhtes relatives Risiko für Morbus Bechterew (85-90fach), Morbus Reiter (35-40fach), postinfektiöse Arthritiden (15-20fach) und Uveitis (10fach). Die HLA-B27-Bestimmung ist kein Screeningtest für Morbus Bechterew sondern unterstützt bei entsprechendem Beschwerdebild die Differentialdiagnostik. Im Einzelfall ist der HLA-B27-Befund im Rahmen des klinischen Beschwerdebildes und des Röntgenbefundes des Patienten zu bewerten. Eine ähnliche Betrachtungsweise der HLA-B27-Analyse ist für die übrigen angeführten seronegativen Arthritiden angezeigt. HLA-Assoziationen 137 Indikation Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew) Trias Urethritis-Konjunktivitis-Arthritis (Morbus Reiter) diverser postinfektiöser Arthritiden akuter Uveitis Mutationen Ca. 36 Allele bekannt Material 2 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Von einer genomischen DNA-Probe werden mit Hilfe der PCR in zwei pamethode rallelen Reaktionen mehrere Abschnitte der HLA-DQA1- und HLA-DQB1Gene amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 1 Tag dauer Literaturhinweise Brewerton Daetv al. (1973); Lancet 1 (7809), 904-907 Frankenberger B et al. (1996); J Rheumatol 24, 899-903 Gonzalez-Roces S et al. (1997);Tissue Antigens 49, 116-123 Gran JT, Husby G (1995); J Med Genet 32, 497-501 Zöliakie (HLA DQ2, DQ8) HLA-DQ-Allele; Genort: 6p21.3; MIM ID: #212750 Erbgang Multifaktoriell Klinische Bedeutung Die Zöliakie des Kindes, bei Erwachsenen Sprue genannt, ist charakterisiert durch eine lebenslange Überempfindlichkeit gegen das Klebereiweiß Gluten, das in verschiedenen Getreidesorten (Weizen, Roggen, Gerste und Hafer) zu finden ist und als „Bindemittel“ in vielen Lebensmitteln eingesetzt wird. Immunologische Reaktionen führen zur chronischen Entzündung der Dünndarmschleimhaut. Als Folge zeigen sich Durchfallerkrankungen, Fettstühle und Gewichtsverlust. Nur mit einer glutenfreien Diät sind die gefürchteten Spätfolgen (Rückbildung der Darmschleimhaut, Mangelkrankheiten etc.) zu vermeiden. In den meisten europäischen Ländern ist jeder 1.000-2.000 betroffen. Die Erkrankung tritt familiär gehäuft auf, d. h. 10-15% der Verwandten ersten Grades eines/r Betroffenen erkranken gleichfalls. Die Zöliakie/Sprue hat eine starke genetische Komponente. Als Prädispositionsfaktoren gelten Änderungen (Mutationen) im Immunsystem (Allele im HLA-System). Rund 95% der Zöliakie-Patienten tragen im HLA-System ein sogenanntes „DQ2-Heterodimer“, die überwiegende Mehrzahl der verbleibenden 5% das sogenannte „DQ8-Heterodimer“ und/oder das Risikoallel „DRB1*04“. Es sollte im Verdachtsfall eine HLA-Typisierung (Genkomplex RDB 2065) durchgeführt werden. 138 HLA-Assoziationen Indikation V. a. Zöliakie / Sprue Mutationen Bestimmte HLA-DQ-Allele codieren heterodimere Proteinkomplexe, die aus einer alpha- und einer beta-Untereinheit bestehen und an der Zelloberfläche lokalisiert sind. Diese spielen bei der immunologischen Erkennung durch T-Helferzellen eine wichtige Rolle. Die alpha-Kette wird durch HLA-DQA1- und die beta-Kette durch HLA-DQB1-Allele codiert. Serologisch kann zwischen den Heterodimeren DQ1 bis DQ9 unterschieden werden. Eine Assoziation mit der Zöliakie wurde für DQ2 und DQ8 beschrieben. Das bei der Zöliakie am häufigsten vorhandenen DQ2-Heterodimer kann sich aus den in cis-Konfiguration vorliegenden Allelen DQA1*0501 und DQB1*0201 bilden, in seltenen Fällen auch aus den Allelen DQA1*0505 und DQB1*0202, wenn diese in trans vorliegen. Das DQ8-Heterodimer wird von den Allelen DQA1*0301 und DQB1*0302 codiert Material 1 ml EDTA-Blut Untersuchungs- Von einer genomischen DNA-Probe werden mit Hilfe der PCR in zwei pamethode rallelen Reaktionen mehrere Abschnitte der HLA-DQA1- und HLA-DQB1Gene amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden. Untersuchungs- 3-4 Tage dauer Literaturhinweise Sollid, Nature Rev Immunol 2, 647-655, 2002 Green und Jabri, Lancet 362, 383-391, 2003 HLA-Assoziationen 139 Molekularpathologierkrankungen Molekularpathologie In der Molekularpathologie werden Untersuchungsmethoden (z. B. PolymeraseKetten-Reaktion, Sequenzierung, in-situ-Hybridisierung) auf molekularer Ebene an formalinfixiertem und in Paraffin eingebetteten Gewebsschnitten durchgeführt. Die molekularbiologische Untersuchungen bestätigen und typisieren maligne Tumoren. Die genetische Veränderungen spielen eine wichtige Rolle in der individuellen Therapie sowie der Prognose des Patienten. BRAF (B-RAF-Protein) Klinische Bedeutung Ca. 50% der malignen Melanome zeigen eine BRAF-V600-Mutation, die für eine Therapie mit dem BRAF-Inhibitor Vemurafenib spricht. 10% aller metastasierten kolorektalen Karzinome weisen eine BRAF V600E-Mutation auf. Die Hilfe einer BRAF-Mutationsanalyse ist insbesondere bei schlechtem Therapieansprechen und rechtsseitiger Lokalisation des Karzinoms sinnvoll. Indikation Die Untersuchung wird bei lokal fortgeschrittenen oder metastasierten malignem Melanomen und kolorektalen Karzinomen empfohlen, damit die Patienten von einer entsprechenden Therapie profitieren können. Material Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat Untersuchungs- PCR-Amplifikation und Sequenzierung methode Untersuchungs- 2 Wochen dauer Literaturhinweise Chapman et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. NEJM 2011 Jun 30; 364(26): 2507-16. Kudchadkar et al. Targeting mutant BRAF in melanoma: current status and future development of combination therapy strategies. Cancer J 2012 March; 18(2): 124-31. Solus JF, Kraft S. Ras, Raf, And MAP kinase in melanoma. Adv Anat Pathol 2013 Jul; 20(4): 217-26. Zlobec et al. Combined analysis of specific KRAS mutation, BRAF and microsatellite instability identifies prognostic subgroups of sporadic and hereditary colorectal cancer. Int J Cancer 2010 Dec 1; 127(11): 2569-75. 140 Molekularpathologie EGFR (epidermal growth factor receptor) Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist eine Tyrosinkinase, die die extrazelluläre Wachstumssignale aktiviert und wiederum Proliferation, Angiogenese und Motilität vermittelt. Viele Tumoren zeigen somatische Mutationen in der Tyrosinkinasedomäne mit Aktivierung des EGFR-Signalwegs um das Zellüberleben zu favorisieren. Klinische Bedeutung Der EGFR wird in mehr als 80% der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome (NSCLC) überexprimiert. Ca. 10% der Fälle zeigen EGFR-Mutationen, insbesondere bei Adenokarzinomen von Nichtrauchern und Frauen. Die Patienten mit mutiertem EGFR können von einer Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)-Therapie (z. B. Gefinitib, Erlotinib) hinsichtlich der Überlebenszeit profitieren. Indikation Lungenkarzinom (NSCLC), TKI-Therapie-Response Material Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat. Zytologische Proben weisen eine geringere Spezifität auf (BAL 37,5%; transthorakale Feinnadelaspirate 90-95%; transbronchiale Feinnadelaspirate >90%). Untersuchungs- PCR-Amplifikation der Exons 18, 19, 20 und 21, Fragmentanalyse und Semethode quenzierung Untersuchungs- 2 Wochen dauer Literaturhinweise Tapia et al. EGFR Mutationsanalyse beim nichtkleinzelligen Lungenkarzinom.. Pathologe 2009 Sep; 30(5): 384-92. Wart et al. Molekularpathologische Diagnostik in der Zytopathologie des nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms. Standardisierung der Materialprozessierung. Pathologe 2013 Jul; 34(4): 310-17. HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer)/ Lynch-Syndrom Klinische Bedeutung Das Hereditäre non-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) oder LynchSyndrom ist die häufigste erbliche Form des kolorektalen Karzinoms (CRC). HNPCC-Mutationsträgern haben ein lebenslang erhöhtes Karzinomrisiko auch für andere Tumore, z. B. Endometrium, Magen, Ovar, Harnwege, Dünndarm, Gehirn und das hepatobiliäres System. Microsatelliteninstabilität (MSI) ist eine Mutation von Microsatelliten-Regionen durch Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide oder Wiederholungseinheiten, welche aus einer Fehlanlage von nicht komplementären Basen-Paaren resultiert („mismatch“). Molekularpathologie 141 Klinische Bedeutung Das Mismatch-Reparatur-System (MMRS) ist ein DNA-Korrekturlesesystem, das fehlerhafte DNA-Nukleotiden erkennen und korrigieren kann. Mismatch-Reparatur-Defekt (MMRD) sowie epigenetische hMLH1-Inaktivierung durch Promotor-Methylierung führen zur Anhäufung von spontanen Mutationen, die eine maligne Progression favorisieren. Die klinische Diagnose von Patienten mit hereditärem nicht polypösem Kolonkarzinom (HNPCC) kann gestellt werden, wenn in der Familie der Betroffenen die Amsterdam-Kriterien erfüllt sind. Die Bethesda-Kriterien erfassen weitere Patientengruppen, bei denen aufgrund eines frühen Manifestationsalters ein Verdacht auf ein HNPCC besteht. Amsterdam II-Kriterien Alle Kriterien müssen erfüllt sein. • Mindestens drei Familienangehörige mit HNPCC-assoziiertem Karzinom (Kolon/ Rektum, Endometrium, Dünndarm, Nierenbecken/Ureter) • Einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen • Erkrankungen in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Generationen • Mindestens ein Patient mit der Diagnose eines Karzinoms vor dem 50. Lebensjahr • Ausschluss einer familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) Bethesda Kriterien Mindestens ein Kriterium muss erfüllt sein. Tumoren von Patienten sollten auf das Vorliegen einer Mikrostatelliten-Instabilität in folgenden Fällen untersucht werden: • Patienten mit kolorektalem Karzinom vor dem 50. Lebensjahr. • Patienten mit synchronen oder metachronen kolorektalen Karzinomen oder anderen HNPCC-assoziierten Tumoren)*, unabhängig vom Alter. • Patienten mit kolorektalem Karzinom mit MSI-H Histologie)** vor dem 60. Lebensjahr. • Patient mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der einen Verwandten 1. Grades mit einem kolorektalen Karzinom oder einem HNPCC-assoziierten Tumor vor dem 50. Lebensjahr hat. • Patient mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der mindestens zwei Verwandte 1. oder 2. Grades hat, bei denen ein kolorektales Karzinom oder ein HNPCC-assoziierter Tumor (unabhängig vom Alter) diagnostiziert wurde. )*zu den HNPCC-assoziierten Tumoren gehören Tumoren in: Kolorektum, Endometrium, Magen, Ovarien, Pankreas, Ureter oder Nierenbecken, Gallengang, Dünndarm und Gehirn (meist Glioblastome wie bei Turcot-Syndrom) sowie Talgdrüsenadenome und Keratoakanthome (bei Muir-Torre-Syndrom) )** Vorliegen von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten, Crohn-ähnlicher lymphozytärer Reaktion, muzinöser/Siegelring-Differenzierung, oder medullärem Wachstumsmuster 142 Molekularpathologie Algorithmus: Genetische Diagnostik und Vorsorge Positive Amsterdam-/Bethesda-Kriterien + nachgewiesene MSI# V. a. HNPCC/LYNCH-SYNDROM Aufklärung gemäß GenDG oder Genetische Beratung* Keimbahnmutationsanalyse## Ergebnismitteilung im Rahmen einer Genetischen Beratung* Nachweis einer pathogenen MMR-Gen-Mutation Dignose Lynch-Syndrom kein Nachweis einer pathogenen MMR-Gen-Mutation Dignose HNPCC-Syndrom Prädiktive Testung weiterer Familienmitglieder nach Genetischer Beratung**## Prädiktive Testung weiterer Familienmitglieder nicht möglich Ausschluss der pathogenen Mutation Nachwies der pathogenen Mutation Vorsorge entspr. asympt. Bevölkerung * HNPCC-Vorsorge Eine diagnostische Keimbahnuntersuchung erfordert gemäß GenDG eine Aufklärung und Dokumentation der Gesprächsinhalte durch den veranlassenden Arzt. Alternativ kann eine genetische Beratung erfolgen. Die Ergebnismitteilung muss gemäß GenDG im Rahmen einer genetischen Beratung erfolgen. ** Eine prädiktive genetische Keimbahndiagnostik bei asymptomatischen Individuen darf gemäß GenDG nur nach einer genetischen Beratung erfolgen. Die Ergebnismitteilung muß gemäß GenDG ebenfalls im Rahmen einer genetischen Beratung erfolgen. # Bei hochgradigem V. a. HNPCC/Lynch-Syndrom (z. B. positive Amsterdam-Kriterien) und Nichtvorhandensein von Tumorgewebe kann auch direkt eine Mutationsanalyse erfolgen. ## Sofern eine Keimbahndiagnostik vom Patienten nicht gewünscht wird, ist unabhängig davon in jedem Fall die HNPCC-Vorsorge zu empfehlen. Abbildung 1: Algorithmus zum Ablauf der genetischen Diagnostik bei Patienten mit V. a. ein hereditäres Tumordispositions-Syndrom am Beispiel des HNPCC-/Lynch-Syndroms. Zum Nachweis der MSI bei V. a. HNPCC-/Lynch-Syndroms wird auf Abbildung 2 verwiesen. Aus S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Kurzversion 1.6.2013 Molekularpathologie 143 Testalgorithmus Immunhistochemie / MSI zur Abklärung Mismatch-Reparatur-Defekt Positive Amsterdam-/ revidierte Bethesda-Kriterien Immunhistochemie Tumorgewebe (Biopsie/Resektat) MLH1/ PMS2 MSH2/MSH6 vorhanden* MSH2 MSH6 PMS2 fehlt** fehlt** BRAF-Testung MSI-Testung stabil MLH1 instabil Wildtyp 9 9 9 V. a. HNPCC/LYNCH-SYNDROM MSS KRK mutiert Sporadisch MSI KRK * In jeweils >10% der Tumorzellen nukleär positiv ** In <10% der Tumorzellen nukleär positiv Abbildung 2: Algorithmus zum Ablauf der molekularpathologischen Abklärung eines Mismatch-Reparaturdefektes bei klinischem V. a. HNPCC-/Lynch-Syndrom. Zur sich ggf. anschließenden genetischen Diagnostik wird auf Abbildung 1 verwiesen. Aus S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Kurzversion 1.6.2013 Klinische Bedeutung Karzinome im Rahmen eines HNPCC gehören durchwegs zur Gruppe MSI-H. Histopathologische Hinweise für ein MSI-H-Karzinom sind: 1. Medulläres Karzinom, 2. Muzinöses Adenokarzinom im proximalen Kolon (Flexura lienalis und oral hiervon), 3. Schlecht differenziertes Adenokarzinom im proximalen Kolon, 4. Karzinom mit ausgeprägter intratumoröser lymphoider Infiltration und/ oder Crohn-ähnlicher lymphoider Reaktion. 144 Molekularpathologie Klinische Bedeutung MSI-H-Karzinome verhalten sich (sowohl wenn sie sporadisch auftreten als auch bei HNPCC) prognostisch günstiger als die anderen molekularen Gruppen. Die unabhängige prognostische Bedeutung des Mikrosatellitenstatus bedarf aber noch weiterer Untersuchungen. MSI-H-Karzinome zeigen aber eine höhere Tendenz zur Entwicklung multipler syn- und metachroner kolorektaler Karzinome und sprechen wahrscheinlich auch weniger auf Chemotherapie an. Medulläres Karzinom ist ein spezielles Subtyp von CRC mit günstiger Prognose und besserer Überlebenswahrscheinlichkeit (Fernmetastasierungsrisiko unter 2%, Fünfjahresüberleben von bis zu 100% bei R0-Resektion), trotz undifferenzierter Histologie (G4). 90% der Fälle zeigen eine MSI-H und fehlende Expression von p53 und ß-Catenin. Bei Patienten mit medullärem Karzinom und nachgewiesenem MMRD bzw. MSI-H wird eine adjuvante 5-Fluorouracil-Monotherapie contraindiziert. Indikation Verdacht auf HNPCC, Bethesda-Kriterien-positive Patienten. Kolonadenome, medulläres Kolonkarzinom Beurteilung Immunhistochemische Untersuchung der Mismatch-Reparatur-Gene (hMLH1, hMSH2, hMSH6, PMS-2): Expressionverlust in >10% der Tumorzellen spricht für ein HNPCC-assoziierter Gendefekt. Mikrosatellitenanalyse der Mononukleotidwiederholungen (BAT25, BAT26, NR-21, NR-24, NR-27): für einen MSI-H-Befund müssen mindestens zwei von fünf Markern eine Instabilität zeigen. Material Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat Untersuchungs- Immunhistologie und Multiplex-PCR-Amplifikation sowie Fragmentanalyse methode Untersuchungs- 2 Wochen dauer Literaturhinweise Benatti et al. Microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. Clin Cancer Res, 2005; 11:8332-40. Boland et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familiar predisposition : Development of international criteria for the determination of Microsatellite Instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5248-57. Des Guetz et al. Does microsatellite instability predict the efficacy of adjuvant chemotherapy in colorectal cancer ? A systematic review with meta-analyses. Eur J Cancer, 2009; 45: 1890-96. Kirchner T & Jung A. Pathological diagnosis fro individualized therapy of colorectal cancer. Pathologe 2010 Feb ; 31(1) : 16-21. Pox et al. S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Kurzversion 1.6.2013. AWMF-Registernummer: 021/0070L. Molekularpathologie 145 KRAS Klinische Bedeutung Eine Blockade des EGR-Rezeptors ist nur sinnvoll bei Wildtyp-Status des nachgeschalteten RAS-Signalwegs, da ansonsten eine primäre Resistenz gegenüber einer EGFR-Inhibition besteht. Indikation Geplante anti-EGFR-Therapie mit Cetuximab, Matuzumab oder Panitumumab bei CRC Material Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat Untersuchungs- Realtime-PCR mit high-resolution-melting und Sequenzierung methode Untersuchungs- 2 Wochen dauer Literaturhinweise Amado et al. Wild-type KRAS is required for panitumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 1626-34. Laurent-Puig et al. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer. J Clin Oncol 2009; 27: 5924-30. 146 Molekularpathologie Abstammungsdiagnostik Neben den Genen gibt es in unserem Erbgut (Genom) Bereiche mit bisher weitgehend unbekannter Funktion. So findet man immer wieder Abschnitte innerhalb der DNA, in denen sich 2, 3, 4 oder mehr DNA-Bausteine mehrfach in der gleichen Reihenfolge wiederholen. Diese werden als Mikrosatelliten (oder auch als short tandem repeats = STR-Systeme) bezeichnet. Innerhalb der Bevölkerung ist die Anzahl der Wiederholungen und die daraus resultierende Länge dieser Mikrosatelliten sehr variabel. Jedes Individuum hat eine nahezu einzigartige Kombination von Mikrosatelliten verschiedener Länge, die zur Hälfte vom Vater und zur Hälfte von der Mutter ererbt wurde. Daher ist die Untersuchung der Mikrosatelliten-Komposition geeignet, um, ähnlich wie bei einem Fingerabdruck, die Identität eines Individuums zweifelsfrei festzustellen und Verwandtschaftsbeziehungen, insbesondere die Frage nach einer Vaterschaft oder der Eineiigkeit von Zwillingen zu untersuchen. Vaterschaftssanalyse Bei Abstammungsanalysen werden Mikrosatelliten aus mindestens 12 verschiedenen DNA-Abschnitten (Mikrosatelliten-Loci) untersucht, um eine Abstammung (Vaterschaft, seltener auch Mutterschaft im Rahmen von Familienzusammenführungen durch Ausländerbehörden) mit mehr als 99,9% Wahrscheinlichkeit nachweisen zu können. In der Regel sind für eine Vaterschaftsanalyse die DNA-Proben von dem Kind, der Kindsmutter und dem möglichen Vater (Putativ-Vater) zu untersuchen (Triofall). Voraussetzung für alle privaten Vaterschaftsanalysen ist ein schriftliches Einverständnis der beteiligten Personen bzw. bei minderjährigen Kindern das Einverständnis aller sorgeberechtigten Personen. „Geheime“ Tests dürfen nicht durchgeführt werden. Bei dem Gutachten werden Mikrosatelliten aus mindestens 12 verschiedenen DNA-Abschnitten untersucht, von denen davon zur Absicherung der Ergebnisse mindestens zwei STR-Systeme doppelt bestimmt werden. Für eine Verwertbarkeit der Ergebnisse ist darauf zu achten, dass bei der Probenentnahme eine Identitätssicherung gemäß den Richtlinien der Arbeitsgemeinschaft für Abstammungsgutachten vorgenommen werden muss. Um dies zu gewährleisten, ist eine Probenabnahme in einem unserer Labore, in einer Arztpraxis bzw. einem Gesundheitsamt erforderlich. Die Kosten für die Probenentnahme und die Identitätssicherung der zu untersuchenden Personen sind im Gutachten nicht enthalten. 147 Abstammungsdiagnostik Bei allen privaten Untersuchungsaufträgen ist eine Bezahlung vor Beginn der Analyse notwendig. Für Ihren Untersuchungsauftrag fordern Sie bitte die dazu notwendigen Unterlagen an. Die Formulare können auch von unserer Homepage (www.labor-staber.de) heruntergeladen werden. Eine vorgeburtliche Untersuchung zur Klärung der Abstammung des Kindes darf laut Gendiagnostikgesetz §15(1) und §17(6) nur dann durchgeführt werden, wenn die Schwangerschaft auf einer Straftat gemäß StGB §§176-179 beruht. Analyse der Eineiigkeit bei Zwillingen Eineiige Zwillinge sind in ihren genetischen Eigenschaften identisch, d.h. sie haben das gleiche Erbgut, so auch identische Mikrosatelliten-Längen (-Allele) in jedem DNA-Ort (Lokus). Zweieiige Zwillinge sind genetisch wie andere Geschwister einzustufen, die sich in ihren Mikrosatelliten-Allelen unterscheiden können. Vergleicht man die Mikrosatelliten-Längen von mutmaßlichen Zwillingen, so ist deren Eineiigkeit praktisch ausgeschlossen, wenn an mehr als einem untersuchten Lokus die Allele nicht übereinstimmen. Eine vollständige Längenübereinstimmung aller untersuchten Mikrosatelliten-Loci weist mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit auf eine Eineiigkeit von Zwillingen hin. In sehr seltenen Fällen können auch normale Geschwister identische Mikrosatelliten-Längen in den untersuchten Loci zeigen. Indikation Nachweis bzw. Ausschluss der Abstammung Material 3 Mundschleimhautabstriche oder 1-2 ml Blut Untersuchungsmethode Aus den Mundschleimhautabstrichen wird die genomische DNA isoliert und verschiedene Mikrosatelliten über Multiplex-Polymerase Kettenreaktionen (PCR) amplifiziert. Die Analyse der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgt mittels Kapillarelektrophorese. Untersuchungsdauer Ca. 2 Wochen nach Eingang des Rechnungsbetrages und Erhalt des Untersuchungsmaterials 148 Stichworte in alphabetischer Reihenfolge A Abacavir-Hypersensitivitätsreaktion (HLA-B*5701) Abstammungsdiagnostik ACE-Polymorphismus Achondroplasie Adrenogenitales Syndrom (21-Hydroxylase-Defizienz) Akute Lymphatische Leukämie Akute myeloische Leukämie Alpha-1-Antitrypsindefizienz Alzheimer-Demenz, familiäre Amniozentesen Angelman-Syndrom Angioödem hereditäres Antithrombin III Apolipoprotein B Apolipoprotein E Array CGH Azoospermiefaktor 133 147 33 34 35 103 105 36 37 21 38 40 41 42 43 30 44 B BRAF (B-RAF-Protein) 140 C Catechol-O-Methyltransferase CBAVD (congenitale bilaterale Vas deferens Aplasie) Cholinesterase, atypische Chorea Huntington Chromosomenanalyse Chronische lymphatische Leukämie (CLL) Chronische myelomonozytäre Leukämie / Myelodysplastische Syndrome Chronisch lymphatische Leukämie Chronisch myeloische Leukämie Col1A1-Gen (SP1-Polymorphismus) Colonkarzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom) Cumarin-Sensitivität Cytochrom P 450 45 45 46 47 102 108 117 116 116 48 120 49 50 Stichwortverzeichnis 149 D Darmkrebsscreening: Septin 9 Test Deletions-Syndrom Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Atrophie Durchflusszytometrie Dysmorphie-Syndrome 121 27, 29 52 102 18 E EGFR (epidermal growth factor receptor) Ehlers-Danlos-Syndrom Eineiigkeit bei Zwillingen Erkrankungen des Bindegewebes, der Muskulatur u. des Stützapparates 141 53 148 19 F Faktor V-LEIDEN-Mutation (APC-Resistenz) Familiäre adenomatöse Polyposis coli Familiärer Brustkrebs Fertilitätsstörungen Fettstoffwechsel FISH-Schnelltest Fluoreszenz in situ Hybridisierung Fragiles-X-Syndrom Friedreich‘sche Ataxie Fruchtwasserdiagnostik Fruktoseintoleranz Fünf-Fluorouracil-Sensitivität (DPD-Defizienz) 54 122 124 17 17 23 102 56 57 21 58 55 G Gerinnungsstörungen Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel Glutathion-S-Transferase (M1, P1, T1) 16 59 60 H Hämatologie Hämatonkologische Systemerkrankungen Hereditäre Hämochromatose Hereditäre Thromboembolie-Risiken HNPCC / Lynch-Syndrom Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv 150 Stichwortverzeichnis 16 16 61 62 141 63 Hyperhomocysteinämie (MTHFR C677T und A1298C-Mutationen) Hypochondroplasie 64 65 I IL28B (Interleukin 28B Genotypisierung) Interleukin 1-Polymorphismus 66 67 J Januskinase 2 siehe Myeloproliferative Erkrankungen 118 K Kardiomyopathie, familiär hypertroph Kardiovaskuläres Risiko KRAS 68 17 146 L Laktoseintoleranz Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) siehe SHOX 69 69 M Mammakarzinom (Familiärer Brustkrebs) 124 Marfan Syndrom Typ 1 70 Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) 71 Mentale Retardierung 18 Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) siehe SHOX 71 Mikrodeletionen 27 Miller-Dieker-Syndrom 28 Mittelmeerfieber, hereditäres 72 Molekulare Zytogenetik 20, 26 Morbus Behcet (HLA-B51) 134 Morbus Fabry , Alpha-Galactosidase A-Mangel 73 Morbus Meulengracht 74 Morbus Wilson 75 MTHFR64 Mukoviszidose (Cystische Fibrose) 76 Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1) 126 Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN2) 128 Multiplex-Aberrationsscreening 118 Muskeldystrophie Typ Duchenne oder Becker 77 Myelodysplastisches Syndrom 112 Stichwortverzeichnis 151 Myeloproliferative Erkrankungen Myeloproliferative Neoplasien Myotone Dystrophie Typ 1 Myotone Dystrophie Typ 2 119 114 79 80 N N-Acetyltransferase Narkolepsie (HLA-DQB1, HLA-DRB1) Neurofibromatose Typ1 / Morbus Recklinghausen Neurologische/neuromuskuläre Erkrankungen Noonan-Syndrom Nutrigenetik 81 135 129 18 81 18 O Osteoporose siehe Vitamin D-Rezeptor und Col1A1-Gen 82 P Pankreatitis, hereditäre PD-Defizienz siehe 5-Fluorouracil-Sensitivität Peutz-Jeghers-Syndrom Pharmakogenetik Phenylketonurie Plasmazellmyelom Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Prader-Willi-Syndrom Prostatakarzinom (PCA3) Protein C Protein S Prothrombin (Gerinnungsfaktor II) Dimorphismus Pyruvatkinase, erythrozytäre 83 52 130 18 84 111 85 86 131 87 88 89 90 R Reifzellige B- und T-Zell-Lymphome RETT-Syndrom Rheumatoide Arthritis (HLA DR4, shared epitope) 109 90 136 S Seronegative Arthritiden 137 SHOX-Haploinsuffizienz, Leri-Weill Dyschondrosteosis, Mesomele Dysplasie Typ Langer 92 Smith-Magenis-Syndrom 28 152 Stichwortverzeichnis Spinobulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy Syndrom) Spinocerebelläre Ataxien (SCA, Olivopontocerebelläre Atrophien) Stoffwechselerkrankungen 93 94 17 T Taubheit, nicht syndromisch, neurosensorisch, DFNB1 (DeaFNess Typ B1) Thalassämie (alpha) Thalassämie (beta) und Sichelzellanämie Thiopurin-Methyltransferase (TPMT)-Defizienz Tumorerkrankungen Tumorprotein p53, Li-Fraumeni-Syndrom 95 96 98 99 19 123 V Vaterschaftssanalyse Vitamin-D-Rezeptor (B/b-Polymorphismus) 147 100 W Williams-Beuren-Syndrom 28 Z Zöliakie Zytogenetik 138 20, 24 Stichwortverzeichnis 153
