Untersuchungsprogramm Humangenetik

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Labor Staber
Labormedizin
Transfusionsmedizin
Mikrobiologie/Hygiene Humangenetik
Pathologie/Zytologie
Onkogenetik
Untersuchungsprogramm Humangenetik 2014
www.labor-staber.de
Genetische Beratung
In einer genetischen Beratung werden persönliche, sowie Daten zur Familie erhoben
(Stammbaum). Ergeben sich hieraus Risiken,
werden mögliche diagnostische Schritte erläutert und die sich daraus ergebenden Konsequenzen besprochen.
Eine genetische Beratung wird empfohlen bei:
• Erbkrankheiten in der Familie,
• geistigen/körperlichen Entwicklungsauffälligkeiten,
• Auffälligkeiten in der Schwangerschaft,
• unerfülltem Kinderwunsch,
• Blutsverwandtschaft und Kinderwunsch
• Zustand nach Aborten oder Totgeburten
• familiären Krebserkrankungen (z. B. Brustkrebs, Darmkrebs)
• unerfülltem Kinderwunsch, insbesondere vor geplanter IVF- oder ICSI-Therapie,
• Fragen der Teratogenität (z. B. Medikamenteneinnahme, Strahlenexposition
oder Drogenabusus vor / in der Schwangerschaft),
• im Rahmen der Präimplantationsdiagnostik.
Vor und nach jeder humangenetischen Diagnostik sollte, bei pränatalen oder prädiktiven Analysen muss laut Gendiagnostikgesetz §10 eine genetische Beratung
angeboten werden. Um eine vorherige telefonische Anmeldung und Terminabsprache wird gebeten.
3
Genetische Beratung Labor Dr. Staber und Kollegen
Bayern
Terminvergabe
Augsburg (nur montags)
Praxis Dr. Müller-Koch
Halderstraße 29
86150 Augsburg
0821-3446513
Bayreuth
Labor Dr. Staber
Wilhelm-Pitz-Straße 1
95448 Bayreuth
0941-53710
Deggendorf
Kinderklinik
Perlasberger Straße 41
94469 Deggendorf
0941-53710
Landshut
Krankenhaus Landshut-Achdorf
Achdorfer Weg 3
84036 Landshut
0941-53710
München
Labor Dr. Staber
Hofer Straße 15
81737 München
089 630238-0
Nürnberg
Labor Dr. Staber
Deutschherrnstraße 15-19
90429 Nürnberg
0911944700
Pocking
Praxis Dr. Werner
Berger Straße 1
94060 Pocking
0941-53710
Regensburg
Labor Dr. Staber
Bahnhofstraße 13
93047 Regensburg
0941-53710
Weiden
Klinikum Weiden – Kinderklinik
Söllnerstraße 16
92637 Weiden
0941-53710
Holzmühlenstraße 86
22041 Hamburg
040 6003876-0
Herkulesstraße 34A
34119 Kassel
0561 9188-0
Schönkirchenerstr 78
24149 Kiel
0431 21838-0
Hamburg
Labor Dr. Staber
Hessen
Kassel
Labor Dr. Staber
Schleswig-Holstein
Kiel
Labor Dr. Staber
4
Labor Staber
Labormedizin
Transfusionsmedizin
Mikrobiologie/Hygiene Humangenetik
Pathologie/Zytologie
Onkogenetik
Labor Bayreuth
Wilhem-Pitz-Straße 1
95448 Bayreuth
E-Mail: bayreuth@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale / Büro
Telefax
0921 5072045-0
0921 5072045-45
Labor Hof (LG)
Telefon
Telefax
0921 5072045-0
0921 5072045-45
Labor Dresden-Klipphausen
Bremer Straße 9
01665 Klipphausen
E-Mail: klipphausen@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale
035204 635-0
Auftragsnachforderung Laborarztpraxis
035204 635-0
Telefax Cito-Platz
Telefax Büro
035204 63-555
035204 63-586
DFÜ (analog)
035204 63-535
Labor Potsdam (LG)
Wetzlarer Straße 34
14482 Potsdam
Telefon
Telefax
E-Mail: potsdam@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
0331 7049100-0
0331 11710173
Telefonverbindungen 5
Labor Hamburg
Holzmühlenstraße 86
22041 Hamburg
E-Mail: hamburg@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale
040 6003876-0
Auftragsnachforderung
040 6003876-0
Bakteriologie
Serologie/ Klinische Chemie
040 6003876-16
040 6003876-19
Fahrdienst
040 6003876-17
Telefax
040 6003876-22
DFÜ (analog/ISDN)
040 27886209
Labor Heilbronn
Hausanschrift:
Postanschrift:
Sülmer Straße 60
74072 Heilbronn
Postfach 14 63
74004 Heilbronn
E-Mail: heilbronn@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale
07131 20375-0
Auftragsnachforderung Klinische Chemie Bakteriologie
07131 20375-0
07131 20375-15
07131 20375-50
Telefax
07131 163911
DFÜ (analog)
DFÜ (ISDN)
07131 629988
07131 676170
6 Telefonverbindungen
Labor Kassel
Hausanschrift:
Postanschrift:
Herkulesstr. 34a 34119 Kassel
Postfach 101 707 34017 Kassel
E-Mail: kassel@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale
0561 9188-0
Auftragsnachforderung / Befundauskunft
Bakteriologie
Blutgruppen-Serologie
0561 9188-108
0561 9188-132
0561 9188-123
Fahrdienst
0561 9188-213
Materialwirtschaft
0561 9188-116
0561 9188-212
DFÜ-Bereitstellung / Auskunft
0561 9188-151
Telefax
0561 9188-199
Labor Gießen-Lich (LG)
Goethestraße 4
35423 Lich
Telefon
Telefax
E-Mail: giessen@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
06404 81574
06404 81501
Telefonverbindungen 7
Labor Kiel
Hausanschrift:
Postanschrift:
Schönkirchener Str. 78
24149 Kiel
Postfach 1420
24019 Kiel
E-Mail: kiel@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale
Bestellannahme
0431 21838-0
0431 21838-50
Telefax (Vorzimmer)
Telefax - Büro
0431 21838-41
0431 21838-42
Labor München
Hausanschrift:
Postanschrift:
Hofer Straße 15 81737 München
Postfach 830821 81708 München
E-Mail: muenchen@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale / Büro
089 630238-0
Auftragsnachforderung Laborarztpraxis
Bakteriologie Varia
Stuhl
Serologie
089 630238-0
089 630238-37
089 630238-38
089 630238-34
Telefax-Büro
089 6731836
DFÜ (analog)
DFÜ (ISDN)
089 6731941
089 67920056
Labor Augsburg (LG)
Telefon
Telefax
8 Telefonverbindungen
0821 5998600
0821 59986029
Labor Nürnberg
Deutschherrnstraße 15-19
90429 Nürnberg
E-Mail: nuernberg@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
Telefonzentrale von 7:30 – 19:00 Uhr
0911 94470-0
ab 19:00 Uhr bis Dienstschluss
Samstag: von 9:00- 12:00 Uhr
0911 94470–36
0911 94470–16
Telefax
DFÜ
0911 94470-41
0911 94470-484
Labor Regensburg (Humangenetik)
Bahnhofstraße 13
93047 Regensburg
E-Mail: genetik@staber-kollegen.de
Internet: www.labor-staber.de
www.genetik-regensburg.de
Telefonzentrale
0941 53710
Telefax0941/53708
Telefonverbindungen 9
Inhaltsverzeichnis
Genetische Beratung Labor Dr. Staber und Kollegen
4
Untersuchungen nach Fachgebieten geordnet
16
Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“
21
Zytogenetische Untersuchungen
24
Molekulare Zytogenetik (FISH)
26
FISH bei numerischen Chromosomenaberrationen
26
Pränataler FISH-Schnelltest bei Amniozentese
26
Diagnostik an Mundschleimhautzellen
26
FISH an Urothelzellen zur Diagnostik des Harnblasenkarzinoms
(UroVysion™-Test)26
FISH bei strukturellen Chromosomenaberrationen
27
Mikrodeletionen (submikroskopische Deletionen)
27
Translokationen29
Array CGH (Comparative Genomic Hybridisation)
30
Molekulargenetische Untersuchungen
31
ACE-Polymorphismus33
Achondroplasie34
Adrenogenitales Syndrom (21-Hydroxylase-Defizienz)
35
Alpha-1-Antitrypsindefizienz36
Alzheimer-Demenz, familiäre
37
Angelman-Syndrom (AS)
38
Angioödem hereditäres (Serpin G1, C1-Esteraseinhibitor)
40
Antithrombin III (Serpin C1)
41
Apolipoprotein B
42
Apolipoprotein E
43
Azoospermiefaktor44
Catechol-O-Methyltransferase45
CBAVD (congenitale bilaterale Vas deferens Aplasie)
45
Cholinesterase, atypische
46
Chorea Huntington
47
Col1A1-Gen (SP1-Polymorphismus)
48
Cumarin-Sensitivität49
Cytochrom P 450
50
Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Atrophie (DRPLA)
52
DPD-Defizienz siehe 5-Fluorouracil-Sensitivität
52
Ehlers-Danlos-Syndrom (klassischer Subtyp)
53
Faktor V-LEIDEN-Mutation (APC-Resistenz)
54
5-Fluorouracil-Sensitivität (DPD-Defizienz)
55
10
Inhaltsverzeichnis
Fragiles-X-Syndrom56
(Martin-Bell-Syndrom, Marker-X-Syndrom)
56
Friedreich'sche Ataxie
57
Fruktoseintoleranz58
Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel59
Glutathion-S-Transferase (M1, P1, T1)
60
Hereditäre Hämochromatose
61
Hereditäre Thromboembolie-Risiken
62
Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv
63
Hyperhomocysteinämie (MTHFR C677T und
64
A1298C-Mutationen) 64
Hypochondroplasie65
IL28B (Interleukin 28B Genotypisierung)
66
Interleukin 1-Polymorphismus
67
Kardiomyopathie, familiär hypertroph
68
Laktoseintoleranz69
Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) siehe SHOX
69
Marfan Syndrom Typ 1
70
Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) siehe SHOX
71
Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY)
71
Mittelmeerfieber, hereditäres
72
Morbus Fabry , Alpha-Galactosidase A-Mangel 73
Morbus Meulengracht
74
Morbus Wilson
75
Mukoviszidose (Cystische Fibrose)
76
Muskeldystrophie Typ Duchenne oder Becker
77
Myotone Dystrophie Typ 1
79
Myotone Dystrophie Typ 2
80
N-Acetyltransferase81
Noonan-Syndrom81
Osteoporose siehe Vitamin D-Rezeptor und Col1A1-Gen
82
Pankreatitis, hereditäre (HP)
83
Phenylketonurie84
Plasminogen-Aktivator-Inhibitor85
Prader-Willi-Syndrom (PWS)
86
Protein C
87
Protein S
88
Prothrombin (Gerinnungsfaktor II) Dimorphismus
89
11
Inhaltsverzeichnis
Pyruvatkinase, erythrozytäre
90
RETT-Syndrom90
SHOX-(Short Stature Homeobox) Haploinsuffizienz, Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD), Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD)
92
Spinobulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy Syndrom)
93
Spinocerebelläre Ataxien (SCA, Olivopontocerebelläre Atrophien) 94
SCA1, SCA2, SCA3 (Machado-Joseph disease (MJD)), SCA6 und SCA7 94
Taubheit, nicht syndromisch, neurosensorisch, DFNB1 (DeaFNess Typ B1)
95
Thalassämie (alpha)
96
Thalassämie (beta) und Sichelzellanämie
98
Thiopurin-Methyltransferase (TPMT)-Defizienz
99
Vitamin-D-Rezeptor (B/b-Polymorphismus)
100
Hämatoonkologische Erkrankungen
102
Erweiterte Diagnostik
102
Chronisch lymphatische Leukämie, IGHV-Status
116
Chronisch myeloische Leukämie
116
Chronische myelomonozytäre Leukämie /
117
Myelodysplastische Syndrome
117
Januskinase 2 siehe Myeloproliferative Erkrankungen
118
Multiplex-Aberrationsscreening118
Myeloproliferative Erkrankungen
119
Genetische Krebsrisiken
120
Colonkarzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom)
120
Darmkrebsscreening: Septin 9 Test
121
Familiäre adenomatöse Polyposis coli
122
Tumorprotein p53, Li-Fraumeni-Syndrom
123
Mammakarzinom (Familiärer Brustkrebs)
124
Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1)
126
Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN2)
128
MEN2A (Sipple-Syndrom), MEN2B (Wagenmann-Froböse-Syndrom), Familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom (FMTC)
128
Neurofibromatose Typ1 / Morbus Recklinghausen
129
Peutz-Jeghers-Syndrom130
Prostatakarzinom (PCA3)
131
12
Inhaltsverzeichnis
HLA-Assoziationen133
Abacavir-Hypersensitivitätsreaktion (HLA-B*5701)
133
Morbus Behcet (HLA-B51)
134
Narkolepsie (HLA-DQB1, HLA-DRB1)
135
Rheumatoide Arthritis (HLA DR4, shared epitope)
136
Seronegative Arthritiden (HLA B27)
137
Zöliakie (HLA DQ2, DQ8)
138
Molekularpathologierkrankungen140
BRAF (B-RAF-Protein)
140
EGFR (epidermal growth factor receptor)
141
HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer)/ Lynch-Syndrom141
KRAS146
Abstammungsdiagnostik147
Vaterschaftssanalyse147
Analyse der Eineiigkeit bei Zwillingen
148
Stichworte in alphabetischer Reihenfolge
149
13
Glossar
Array CGH: siehe Artikel Seite 30
Exon: Abschnitt eines Gens, der auf messengerRNA übertragen wird.
Haplotyp: Eine Reihe von Allelen an gekoppelten Loci auf einem einzigen Chromosom.
Intron: Nichtcodierende DNA, die in einem Gen benachbarte Exons voneinander
trennt.
MIM-Nummer: Listennummer eines Gens oder eines mendelnden Merkmals, wie
sie in der OMIM-Datenbank aufgeführt sind.
MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification. Mit ihr lassen sich schon
anhand kleinster DNA-Mengen größere Dosisunterschiede an einem zuvor definierten Ort im Genom nachweisen. Dazu zählen Deletionen/Duplikationen einzelner
Genabschnitte (Exons), bzw. ganzer Gene. Dieses gendiagnostische Verfahren erlaubt daher ein Screening auf Deletionen oder Amplifikationen in krankheitsspezifischen Genen. Dabei wird ein Sondenpaar (»MLPA-Probes«) an die TemplateDNA hybridisiert. Ihre Sequenzen sind so gewählt, dass sie direkt nebeneinander
zu liegen kommen und daher von einer thermostabilen Ligase verknüpft werden
können. In einem zweiten Schritt werden die ligierten Sondenpaare dann per PCR
amplifiziert. Ist die Zielsequenz mutiert, können sich die Sondenpaare nicht zusammenlagern und es entsteht kein PCR-Produkt.
OMIM: Zentrale Datenbank für menschliche Gene und mendelnde Merkmale: Online Mendelian Inheritance in Man (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim)
PCR: Ein in vitro-Verfahren zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen mithilfe definierter Oligonucleotid-Primer. Nach ldentifizierung einer zu amplifizierenden Sequenz (die Zielsequenz) stellt man Primer her, die komplementär zu Sequenzen auf
den jeweils gegenüberliegenden DNA-Strängen sind und die Zielsequenz flankieren. Das PCR-Verfahren besteht aus Zyklen mit den Schritten Denaturierung, AnIagerung der Primer (annealing) und schließlich DNA-Synthese, bei der die Primer
in die neu synthetisierten DNA-Stränge eingehen. Der erste Zyklus führt zu zwei
14
Glossar
neuen DNA-Strängen (N), deren 5‘-Enden durch die Positionen der OligonucleotidPrimer festgelegt sind, deren 3‘-Enden aber unterschiedlich sind. Nach dem zweiten
Zyklus umfassen die vier neuen Stränge zwei neue Produkte mit unterschiedlichen
3‘-Enden (wie beim ersten Zyklus) und zwei neuen Strängen mit definierten Enden
(5‘- und 3‘-Ende). die durch die Primer vorgegeben sind. Nach dem dritten Zyklus
haben sechs der acht Stränge die gewünschte Länge, und nach 30 Zyklen sind von
dem richtigen Produkt sehr große Mengen vorhanden (Amplifizierung).
Penetranz: Häufigkeit, mit der sich ein Genotyp in einem bestimmten Phänotyp
manifestiert.
Realtime-PCR: Eine Art quantitative PCR, bei der die Reaktionszyklen mit Hilfe
eines Fluoreszenzdetektors verfolgt werden. So ist es möglich, mehrere spezifische
Nucleinsäuresequenzen zu amplifizieren und gleichzeitig ihre Konzentration zu
messen.
Uniparenterale Disomie: Wenn bei einer Zelle oder einem Organismus beide Kopien eines bestimmten Chromosoms von nur einem Elternteil stammen.
15
Untersuchungen nach Fachgebieten geordnet
MOLEKULARGENETIK
Hämatologie
Anämie. akut hämolyt. (Gluc-6-P-Dehydrogenase)
Anämie, chronisch hämolytische (Pyruvatkinase)
a-Thalassämie HBA1-U. HBA2-Gen
ß-Thalassämie (HBB-Gen)
Sichelzellanämie (HBB-Gen)
Hämatonkologische Systemerkrankungen
CMML (TET2)
B-CLL Prognosemarker (IgHV-Status)
Chronisch myeloische Leukämie (BCR-ABL)
Myeloproliferatives Syndrom (BCR-ABL)
Myeloproliferatives Syndrom (JAK2)
Multiplex-Aberrationsscreening (27 Aberrationen)
Gerinnungsstörungen
Antithrombin (SERPlNC 1-Gen)
Faktor V-Leiden
Hyperhomocysteinämie (MTHFR-Gen)
Plasminogen-Aktivator-Inhibitor PAI
Protein C-Mangel (PROC-Gen)
Protein S-Mangel (PROS1-Gen)
Prothrombin (=Faktor II) (G20210A)
16 Hämatoonkologische Erkrankungen
Kardiovaskuläres Risiko / Fettstoffwechsel
ACE-Polymorphismus
Dysbetalipoproteinämie (Apolipoprotein E)
Hypercholesterinämie, LDLRAP1-Gens (ARH-Gen)
Hypertrophe Kardiomyopathie
Familiäre Hypercholesterinämie ApoB 100
LDL-Rezeptor (LDLR)
Fertilitätsstörungen
Adrenogenitales Syndrom (AGS-; CYP21A2-Gen, CYP11B1-Gen)
Azoospermiefaktor (AZF)
CBAVD (Vas deferens-Aplasie)
Stoffwechselerkrankungen
Adrenogenitales Syndrom (AGS; CYP21A2-Gen, CYP11B1-Gen)
Angioödem, hereditäres (SERPING1-Gen, F12-Gen)
Alpha-1-Antitrypsin (AAT-Gen)
Hämochromatose (HFE-Gen)
Hyperhomocysteinämie (MTHFR-Gen)
Mittelmeerfieber, familiäres (Marenostrin-Gen)
Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY)
Morbus Fabry (a-Galaktosidase-Gen)
Morbus Meulengracht (UGT1A1-Gen)
Morbus Wilson (ATP7B-Gen)
Pankreatitis, hereditäre (PRSS1-Gen, SPINK1/PSTI-Gen)
Phenylketonurie (PAH-Gen)
Zystische Fibrose (=Mukoviszidose)
Hämatoonkologische Erkrankungen 17
Mentale Retardierung / Dysmorphie-Syndrome
Angelman-Syndrom
Array CGH-Diagnostik (molekulare Karyotypisierung)
Fragiles X-Syndrom (FMR1-Gen: CGG-Expansion)
Noonan-Syndrom (PTPN11-Gen)
Prader-Willi-Syndrom
RETT-Syndrom (MECP2-Gen)
Nutrigenetik
Fruktoseintoleranz (Aldolase B-Gen)
Laktoseintoleranz
Zöliakie (HLA-Assoziationen)
Neurologische / neuromuskuläre Erkrankungen
Alzheimer-Demenz, familiäre, Frühform
Chorea Huntington (Huntington-Gen, CAG-Expansion)
Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Athrophie (Atrophin 1-Gen)
Friedreich'sche Ataxie (FXN-Gen: GAA-Expansion)
Kennedy-Disease (Spinobulb. Muskelatrophie; AR-Gen)
Muskeldystrophie Duchenne-Becker (DMD-Gen)
MyotoneDystrophie
Narkolepsie
Sensoneurale Schwerhörigkeit (Typ DFNB1; GJB2-Gen, GJB6-Gen)
Spinocerebelläre Ataxien (ATXN1-3 u. 7-Gen, CACNA1A-Gen)
Pharmakogenetik
Abacavir Hypersensitivitätsreaktion(HLA-B*5701)
Cholinesterase, atypische
Catechol-O-Methyltransferase (COMT)
18 Hämatoonkologische Erkrankungen
Cumarin-Sensitivität
Cytochrom P450
5-Fluorouracil-Toxizität (DPD-Gen)
Glutathion-S-Transferase
N-Acetyltransferase (NAT2-Gen)
Thiopurin-S-Methylferase (TPMT-Gen)
Erkrankungen des Bindegewebes, der Muskulatur u. des Stützapparates
Achondroplasie (FGFR3-Gen: G375C, G380R)
Hypochrondroplasie (FGFR3-Gen: I539V, N540K)
M. Bechterew (HLA B27)
M. Behçet (HLA B51)
Osteoporose (Vitamin D-Rezeptor und Collagen Typ I a1)
Parodontose (Interleukin 1-Polymorphismus)
Rheumatoide Arthritis
SHOX Haploinsuffizienz (SHOX-Gen)
Tumorerkrankungen
Darmkrebsscreening (SEPT9)
Familiäre adenomatöse Polyposis coli
HNPCC Stufendiagnostik
Li-Fraumeni-Syndrom (TP53)
Mamma-Ca. familiär (BRCA1 und 2)
Multiple endokrine Neoplasie Typ 1, 2A, 2B
Neurofibromatose Typ 1 (NF1-Gen)
PCA3 (Prostata Cancer-Gen3)
Peutz-Jeghers-Syndrom (STK11-Gen)
Hämatoonkologische Erkrankungen 19
ZYTOGENETIK
Konventionelle Chromosomenanalyse
MOLEKULARE ZYTOGENETIK
(Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
Deletionssyndrom 22q11.2 (DiGeorge-Syndrom)
Mikrodeletions-Syndrom 1p36
Miller-Dieker-Syndrom 17p13.3
Smith-Magenis-Syndrom 17p11.2
Williams-Beuren-Syndrom 7q11.2
Weitere spezifische Sonden nach Rücksprache
Harnblasenkarzinom (FISH)
Array-CGH
20 Hämatoonkologische Erkrankungen
Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“
Bei der Amniozentese (Fruchtwasserdiagnostik)
werden kindliche Zellen aus dem Fruchtwasser
gewonnen. Die fetalen Zellen werden in mehreren getrennten Zellkulturen angezüchtet und
hinsichtlich numerischer und struktureller Chromosomenanomalien untersucht. Die häufigste
numerische Aberration, die zu lebensfähigen Individuen mit geistigen und körperlichen Behinderungen unterschiedlicher Ausprägung führt, ist
das Down-Syndrom (Trisomie 21), weniger häufig sind eine Trisomie 13 und 18. Die klinische
Bedeutung von Gonosomenaberrationen (Geschlechtschromosomveränderungen) muss individuell diskutiert werden.
Das Risiko für ein Kind mit einer Trisomie steigt mit zunehmendem mütterlichen
Alter, sodass jede Schwangere über 35 Jahren auf das altersbedingte Risiko hingewiesen werden muss und aufgrund des altersbedingten Risikos eine pränatale Diagnostik angeboten werden sollte. Die Diagnostik wird auch vor dem 35.
Lebensjahr ohne Vorliegen eines erhöhten Risikos für Chromosomenanomalien
durchgeführt, wenn dies eine Patientin wünscht.
Darüber hinaus besteht die Empfehlung zur pränatalen Diagnostik bei:
• bekanntem Vorliegen einer Chromosomenanomalie im Karyotyp der Schwangeren oder ihres Partners (Kindsvaters),
• einem vorangegangenen Kind mit einer Chromosomenanomalie,
• einer familiär vorliegenden Stoffwechselstörung oder einem molekulargenetisch nachweisbaren Gendefekt in der Verwandtschaft,
• Ultraschallauffälligkeiten, die auf eine Chromosomenanomalie oder einen
Gendefekt hindeuten können,
• auffälligen Serumparametern im mütterlichen Blut.
Nach einer Amniozentese dauert es in der Regel zwei bis drei Wochen bis das
Ergebnis der zytogenetischen Analyse vorliegt.
21
Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“
Neben der chromosomalen Auswertung erfolgt auf Wunsch auch eine Bestimmung des Alpha-Fetoproteins und der Acetylcholinesterase aus dem Fruchtwasser.
Auffällige Werte können Hinweis auf Entwicklungsstörungen, wie z. B. einen Neuralrohrdefekt geben.
Für Einsendungen von Fruchtwasserproben
können Sie das notwendige Versandmaterial
bei uns bestellen.
In Regensburg bieten wir die Fruchtwasserpunktionen ab der 15. SSW an. Um eine
vorherige telefonische Terminabsprache wird
gebeten.
In Gießen und Friedberg erfolgt die Amniozentese in den Praxen langjährig kooperierender und pränatal spezialisierter Gynäkologen.
Die Fruchtwasserentnahme wird in Gießen ab
der 14. Schwangerschaftswoche und in Friedberg ab der 15./16. Woche angeboten.
Jeder Amnionprobe muss gemäß Gendiagnostik-Gesetz (GenDG) eine von der
Patientin unterschriebene Einwilligungserklärung beiliegen. Benötigt werden weiterhin ein gelber und ein weißer Überweisungsschein (Muster 06 und 10).
22
Amniozentesen, Fruchtwasserdiagnostik, „FISH-Schnelltest“
Pränataler Schnelltest (FISH-Schnelltest)
Etwa 90% aller Chromosomenaberrationen, die bei einer pränatalen zytogenetischen Diagnostik gefunden werden, sind numerische Aberrationen der Chromosomen 13, 18, 21, X oder Y.
Mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) kann die Anzahl dieser
fünf Chromosomen pro Zelle auch in unkultivierten Interphase-Zellen sichtbar
gemacht werden.
Auf diese Weise lässt sich bereits nach 24 Stunden ermitteln, ob in den Zellen
eine Trisomie 13, 18, 21 oder auch eine numerische Aberration der Chromosomen X und Y vorliegt. Hierzu wird von dem Fruchtwasser bis zu 3 ml abgezweigt.
Die Mindestmenge für die FISH-Diagnostik hängt von der Schwangerschaftswoche ab. In der 14. Woche ist die Zellzahl im Fruchtwasser noch sehr gering, d. h.
hier wird entsprechend mehr Fruchtwasser als in einer späteren Woche benötigt,
um genügend Zellkerne für die Auswertung zur Verfügung zu haben. Bei allen
Bemühungen um ein schnelleres Ergebnis muss aber auf jeden Fall sichergestellt
sein, dass für die konventionelle Chromosomenanalyse eine ausreichende Zahl
an Zellen zur Kultivierung zur Verfügung steht. Im Extremfall kann das bedeuten,
dass die FISH-Analyse nicht durchführbar ist, oder zu keinem Ergebnis führt, wenn
die verfügbare Zellzahl zu gering ist. Eine nachfolgende zytogenetische Analyse ist
in jedem Fall zwingend vorgeschrieben, da die FISH-Untersuchung weder strukturelle Aberrationen noch numerische Aberrationen der übrigen Chromosomen
erfasst. Auch Zellmosaike mit numerischen Aberrationen der fünf untersuchten
Chromosomen lassen sich mit dem FISH-Test nicht sicher nachweisen. Gänzlich
ungeeignet für die FISH-Methode ist Fruchtwasser, das mit Blut kontaminiert ist,
weil dadurch die Gefahr besteht, dass bei der Auswertung mütterliche Zellen analysiert werden.
Bei der Einsendung von Fruchtwasser mit der Anforderung einer Schnelldiagnostik
in Hinblick auf numerische Aberrationen der Chromosomen 13, 18, 21, X und Y
(FISH-Test) ist zu beachten, dass es sich hierbei um keine Kassenleistung handelt
und die Patientin die Leistung, wenn sie diese routinemäßig wünscht, selbst bezahlen muss.
Dazu benötigen wir eine von der Patientin unterschriebene Einverständnis- und
Kostenübernahme-Erklärung, die zusammen mit dem Fruchtwasser zugeschickt
werden müssen.
23
Zytogenetische Untersuchungen
Allgemeine Grundlagen zur Zytogenetik
Bei zytogenetischen Untersuchungen werden die Chromosomen aus bestimmten
Körperzellen (in der Regel Zellen aus Blut, Bindegewebe, Fruchtwasser oder aus
Chorionzotten) unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Untersuchungsziel ist die
Untersuchung des Chromosomensatzes (Karyotyps) auf zahlenmäßige oder strukturelle Veränderungen.
Normale Körperzellen des Menschen enthalten in ihrem Zellkern 46 Chromosomen, in denen sich der Hauptteil der genetischen Information befindet. 44 dieser
Chromosomen lassen sich paarweise anordnen. Im weiblichen Geschlecht liegt
ein 23. Chromosomenpaar bestehend aus den beiden X-Chromosomen vor, während im männlichen Geschlecht ein X und ein Y-Chromosom zu finden sind. Der
unten abgebildete Chromosomensatz zeigt einen normalen männlichen Karyotyp,
der mit der Karyotypformel 46,XY beschrieben wird.
Folgende Untersuchungen können in unserem zytogenetischen Labor vorgenommen werden:
Chromosomenanalysen aus
•
•
•
•
•
Blutlymphozyten
Amnionzellen
Chorionzotten
Fibroblasten (Hautbiopsien)
Abortgewebe
Zur Chromosomenuntersuchung müssen die Zellen in aller Regel vorher im Labor
in einer Zellkultur vermehrt werden. Dazu ist es wichtig, dass das Zellmaterial steril bleibt und ungekühlt innerhalb einer möglichst kurzen Zeit das Labor erreicht
(Fruchtwasser und Heparin-Blut spätestens 48 Stunden nach Entnahme, Chorionzotten und Abortgewebe spätestens nach 24 Stunden). Bei Chorionzottenbiopsien bitten wir immer um telefonische Voranmeldung. Vor Feiertagen bitten wir,
auch alle anderen Proben für die Zytogenetik anzumelden.
24
Zytogenetische Untersuchungen
Blutproben für die Chromosomenanalyse
(ca. 5 ml bzw. bei Säuglingen ca. 1-2 ml)
bitten wir entweder in unseren vorgefertigten Heparinröhrchen zu verschicken
oder ausschließlich mit Natrium-Heparin (Heparin novo oder Liquemin) im
Verhältnis 1:10 zu versetzen (bitte kein
Ammonium-Heparin, EDTA oder Citrat
verwenden).
Chorionzottengewebe, Abortmaterial und Fibroblasten sollten steril in den von
uns mit Medium vorbereiteten Versandröhrchen verschickt werden. Sofern Sie
kein Versandmaterial vorrätig haben, kann ersatzweise sterile Kochsalzlösung verwendet werden, wenn ein rasches Eintreffen in unserem Labor gewährleistet ist.
Alle Spritzen und Probenröhrchen sind bitte unbedingt mit dem Namen des Patienten zu beschriften. Bei Kassenpatienten wird ein Überweisungsschein (Nr. 10)
benötigt.
Eine humangenetische Untersuchung darf nur vorgenommen werden, wenn der
Patient / die Patientin von der verantwortlichen ärztlichen Person über Wesen,
Bedeutung und Tragweite der genetischen Untersuchung hinreichend aufgeklärt
wurde und eine schriftliche Einwilligung des Patienten zur Untersuchung und der
Gewinnung der dafür erforderlichen Probe vorliegt.
Durchschnittliche Untersuchungsdauer in der Zytogenetik:
Chromosomenanalyse aus
Fruchtwasser
Blutlymphozyten
Abortgewebe
sonstiges Gewebe
Chorionzotten: Direktpräparation
Chorionzotten: Langzeitkultur
14 Tage
14-20 Tage
2-4 Wochen
2-4 Wochen
2 Werktage
2-4 Wochen
25
Molekulare Zytogenetik (FISH)
Die Technik der „Fluoreszenz in situ Hybridisierung“ (FISH) ermöglicht es, die
Anzahl bestimmter DNA-Abschnitte in einzelnen Zellen und deren Position
innerhalb der Chromosomen sichtbar zu machen. Damit lassen sich numerische und strukturelle Chromosomenaberrationen näher definieren.
FISH bei numerischen Chromosomenaberrationen
Pränataler FISH-Schnelltest bei Amniozentese
Hierbei werden einzelne Chromosomen in unkultivierten Interphasezellkernen in
ihrer Anzahl bestimmt. Für Details zur Methode siehe 2. Amniozentesen.
Diagnostik an Mundschleimhautzellen
Mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Zellkernen aus Mundschleimhautzellen ist die Untersuchung eines, neben Blutlymphozyten einfach zu gewinnenden, zweiten Zelltyps möglich. Dies dient hauptsächlich zur Abklärung von
numerischen Aberrationen der Geschlechtschromosomen bei Verdacht auf ein
Zellmosaik.
Für die Entnahme fordern Sie bitte vorgefertigte Versandröhrchen im Labor an.
Der Versand ins Labor sollte möglichst rasch erfolgen (bitte nicht vor Wochenenden oder Feiertagen verschicken und vor Wärme schützen).
FISH an Urothelzellen zur Diagnostik des Harnblasenkarzinoms
(UroVysion™-Test)
Der Verlust oder Zugewinn ganzer Chromosomen und auch die Deletion oder
Duplikation bestimmter Gene ist ein charakteristisches Merkmal von Tumorzellen. In frühen Stadien des Harnblasenkarzinoms lassen sich gehäuft Deletionen in
der Chromosomenregion 9p21 nachweisen. Hierbei kommt es zu einem Verlust
zweier Tumorsuppressor-Gene p16/INK4a und ARF, die eine wichtige Rolle bei
der Regulation des Zellzyklus spielen. Besonders häufig findet man bei Harnblasenkarzinomen auch zusätzliche Chromosomen 3, 7 und 17. Der UroVysion™
FISH-Test (Abbott) enthält DNA-Sonden, die Aneuploidien der Chromosomen 3,
7 und 17 und den Verlust des 9p21-Locus auf einfache Weise an unkultivierten
Urothelzellen aus dem Urin der Patienten erkennen lassen.
26
Molekulare Zytogenetik (FISH)
Indikationen sind:
• weitere Abklärung auffälliger zytologischer Befunde mit Verdacht auf ein Harnblasenkarzinom,
• Überwachung von Patienten mit Blasenkarzinom zur frühzeitigen Diagnose
von Rezidiven.
Material: 50 ml Urin (keinen Morgenurin) in Spezialbehälter mit Konservierungsflüssigkeit (bitte im Labor anfordern).
Zur Erhöhung der Zellzahl im Urin empfiehlt sich körperliche Bewegung vor Entleeren der Blase. Ein möglichst rascher Versand ins Labor sollte gewährleistet sein (bitte nicht vor Wochenenden oder Feiertagen verschicken und vor Wärme schützen).
FISH bei strukturellen Chromosomenaberrationen
Mikrodeletionen (submikroskopische Deletionen)
Hierbei gelingt der Nachweis kleinster chromosomaler Deletionen (Stückverluste)
bei definierten Syndromen (übergeordneten Krankheitsbildern), die auf konventionelle zytogenetische Weise nicht erkennbar sind.
1p36 Deletions-Syndrom (Mikrodeletion 1p36; OMIM #607872)
Die Mikrodeletion 1p36 ist gekennzeichnet durch eine mehr oder weniger stark
ausgeprägte Entwicklungsverzögerung. Die motorische Entwicklung ist dabei häufig weniger beeinträchtigt als die Sprachentwicklung. Darüber hinaus haben viele Patienten u. a. eine Mikrozephalie und Brachyzephalie, faziale Auffälligkeiten
(Ohrmuscheldysplasien, tief angesetzte Ohren, tief liegende Augen, Lippen-Kiefer-Gaumenspalten, spitzes Kinn, breite und flache Nasenwurzel), Minderwuchs,
Herzfehler, Nierenfehlbildungen, Genitalfehlbildungen sowie Seh- und Hörstörungen.
Bisher konnte keine eindeutige Korrelation zwischen dem Ausmaß der jeweiligen
Deletion und dem Auftreten einzelner Symptome gefunden werden, so dass eine
Prognose für die Entwicklung eines Patienten nur eingeschränkt möglich ist.
27
Molekulare Zytogenetik (FISH)
Williams-Beuren-Syndrom (Mikrodeletion 7q11.23; OMIM #194050)
Bei dem Williams-Beuren-Syndrom handelt es sich um ein „Contiguous gene“Syndrom, bei dem unterschiedliche, dem Elastin-Gen benachbarte Gene, in die
Mikrodeletion 7q11.23 einbezogen sind. Neben dem häufig zu findenden Herzfehler (typisch Aortenstenose) finden sich ein Minderwuchs, eine Muskelhypotonie, sowie eine typische Gesichtsdysmorphie. Mit einer Einschränkung der geistigen Entwicklung muss in der Regel gerechnet werden. Die Sprachentwicklung ist
verzögert, die Betroffenen sind jedoch verbal sehr gewandt und kontaktfreudig.
Es besteht eine Empfindlichkeit gegenüber lauten Geräuschen, wobei die Betroffenen häufig sehr musikliebend sind. Die Inzidenz des Williams-Beuren-Syndroms
wird auf 1:30.000 geschätzt.
Smith-Magenis-Syndrom (Mikrodeletion 17p11.2; OMIM #182290)
Zu den klinischen Merkmalen des Smith-Magenis-Syndroms (SMS) gehören Brachyzephalie, Mittelgesichtshypoplasie, Prognathie, eine rauhe Stimme, mentale
Retardierung, eine Sprachentwicklungsverzögerung mit oder ohne Hörstörungen, Hyperaktivität und ein stereotypes autoaggressives Verhalten. Bei einem Teil
der Patienten werden Zeichen einer peripheren Neuropathie sowie signifikante
Schlafstörungen beobachtet. Das Smith-Magenis-Syndrom wird durch eine Deletion von 2 bis 9 Megabasen in 17p11.2 verursacht. Das RAI1-Gen innerhalb
der kritischen Region scheint dabei für einen Hauptteil der Symptomatik verantwortlich zu sei, da Punktmutationen innerhalb von RAI1 zu einem Smith-Magenis
ähnlichen Phänotyp führen können. Die Inzidenz für SMS liegt bei ca. 1:25 000
Geburten.
Miller-Dieker-Syndrom (Mikrodeletion 17p13.3; OMIM #247200)
Infolge einer Entwicklungsstörung der Großhirnrinde findet man bei allen Patienten mit einem Miller-Dieker-Syndrom eine Lissenzephalie (fehlende oder zumindest unvollständig ausgebildete Hirnwindungen) in Kombination mit typischen fazialen Anomalien (hohe Stirn, bitemporale Eindellungen, prominente Oberlippe).
Die Patienten haben eine schwerwiegende mentale Retardierung und leiden häufig an epileptischen Anfällen. Zusätzlich können auch Fehlbildungen des Herzens,
der Nieren und des Gastrointestinaltraktes voliegen. Das Miller-Dieker-Syndrom
wird durch eine Mikrodeletion in 17p13.3 verursacht. In mehr als 90% der Fälle
ist ein Verlust des LIS1-Gens (PAFAH1B1= Platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform 1B, alpha subunit 1 nachweisbar.
28
Molekulare Zytogenetik (FISH)
22q11.2-Deletions-Syndrom (Mikrodeletion 22q11.2; OMIM #188400,
#192430)
Bei der Verdachtsdiagnose eines 22q11.2-Deletions Syndroms (CATCH22-Syndrom, Velo-Cardio-Faciales Syndrom, Di-George Syndrom) kann eine Mikrodeletion innerhalb der für dieses Syndrom kritischen Chromosomenregion (22q11.2)
mit Hilfe einer spezifischen DNA-Sonde (TUPLE 1) nachgewiesen werden. Es
handelt sich um eine Mikrodeletion, die unterschiedliche Genabschnitte umfasst.
Daher ist die klinische Symptomatik sehr variabel. Symptome des 22q11.2-Deletions-Syndroms können unter anderem eine Sprachentwicklungsverzögerung,
charakteristische Gesichtszüge, angeborene Herzfehler (Ventrikel- Septum Defekt,
Fallot‘sche Tetralogie u. a.), ein hoher Gaumen, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, eine
mehr oder weniger stark ausgeprägte mentale Retardierung, eine Immunschwäche unter Umständen aufgrund einer Thymusaplasie sein. Da das Krankheitsbild
auch innerhalb einer Familie sehr variabel sein kann, wird zum Beispiel bei familiär vorliegenden Herzfehlern die Ausschlussdiagnose eines 22q11.2-DeletionsSyndroms empfohlen.
Die Abklärung weiterer Mikrodeletionssyndrome kann individuell nach telefonischer Rücksprache erfolgen.
Translokationen
Zur Abklärung einer Translokation (Stückaustausch zweier Chromosomen) können
Lokus-spezifische fluoreszenz-markierte Sonden zytogenetisch eingesetzt werden.
Balanzierte reziproke Translokationen
Bei Vorliegen einer augenscheinlich balanzierten Translokation wird zum Ausschluss eines komplexeren chromosomalen Umbaus eine komplette Färbung
der beteiligten Chromosomen mit so genannten „whole chromosome painting
(=wcp)“ Sonden durchgeführt.
Derivative Chromosomen
Findet sich in der zytogenetischen Analyse ein auffälliges Chromosom, dessen Zusammensetzung mit konventionellen zytogenetischen Methoden nicht vollständig
geklärt werden kann, wird eine FISH-Diagnostik durchgeführt.
29
Molekulare Zytogenetik (FISH)
Je nach Auffälligkeit können dabei „painting“-Sonden bei Verdacht auf einen innerchromosomalen Umbau oder spezifische DNA-Sonden aus der Subtelomerregion bei Verdacht auf eine unbalanzierte Translokation oder eine telomernahe
Deletion eingesetzt werden.
Ein neueres Verfahren der molekularen Karyotypisierung erlaubt die Abklärung
von Deletionen und Duplikationen mit sehr hoher Auflösung (s. Array CGH).
Array CGH (Comparative Genomic Hybridisation)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Bei Kindern mit mentaler Retardierung und zusätzlichen Dysmorphiezeichen
führt eine Chromosomenanalyse häufig zu einem unauffälligen zytogenetischen
Befund. In der zytogenetischen Analyse sind Deletionen und Duplikationen in der
Regel erst ab ca. 5-10 Mb zu erkennen. Weiterführende FISH-Untersuchungen
zur Identifizierung submikroskopischer Chromosomenveränderungen bleiben
bei Patienten, deren Symptomatik nicht eindeutig auf ein spezifisches Mikrodeletionssyndrom hindeutet, in vielen Fällen ebenfalls ohne Nachweis einer Chromosomenveränderung. Die Array CGH erlaubt einen Nachweis von Imbalancen
(Verlust oder Zugewinn kleinerer chromosomaler Abschnitte) mit einer extrem
hohen Auflösung (ca. 20 Kilobasen). Bei auffälligen Chromosomenbefunden kann
die Array CGH für eine weitere Abklärung und zur genaueren Bestimmung einer
Deletion oder Duplikation eingesetzt werden.
Methode:
Etwa gleiche Mengen genomischer Patienten-DNA und DNA einer gesunden
Kontrollperson werden mit unterschiedlichen Fluorochromen (Patienten-DNA mit
CY3=rot, Kontroll-DNA mit CY5=grün) chemisch über das Universal-LinkageSystem (ULS, Agilent) markiert und gemeinsam auf einem Subarray (Oligo-Array,
Bluegnome) hybridisiert.
Durch Messung der Intensitätsverhältnisse der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind Dosisunterschiede, also Deletionen und Duplikationen nachweisbar. Der
Nachweis einer Imbalance mit möglicher Relevanz für die Symptomatik des Patienten wird, soweit dies möglich ist, durch FISH mit einer entsprechenden Sonde
bestätigt und/oder ggf. über eine Elternuntersuchung weiter abgeklärt.
30
Molekulare Zytogenetik
Durchschnittliche Bearbeitungsdauer in der molekularen Zytogenetik
Pränataler Schnelltest/Schnelltest Trisomie 21:
24 h (nächster Werktag) bei Eingang bis 16 Uhr
Mikrodeletionssyndrome:
2 Tage (nach der Fertigstellung der Chromosomenanalyse)
wcp (whole chromosome painting):
2 Tage (nach der Fertigstellung der Chromosomenanalyse)
Mundschleimhautzellen (FISH Gonosomen): 1 Woche
Array CGH: ca. 2 Monate
Molekulargenetische Untersuchungen
Im Gegensatz zur zytogenetischen Diagnostik, bei welcher der gesamte Karyotyp eines Patienten analysiert wird, erfordert die molekulargenetische Diagnostik konkrete Hinweise auf das Vorliegen eines bestimmten Gendefektes, um
diesen spezifisch mit molekulargenetischen Methoden untersuchen zu können.
Grundsätzlich erfordert eine molekulargenetische Untersuchung das Einverständnis des Patienten. Daher bitten wir, die Einverständniserklärung unterschrieben
vom Patienten bzw. dessen Erziehungsberechtigten zur Diagnostik mit einzusenden.
Das erforderliche Formblatt kann online ausgedruckt werden, oder wird auch gerne von uns zugeschickt.
Die angegebenen OMIM-Zahlen beziehen sich auf die Angaben in „Online Mendelian Inheritance In Man“ (OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM/).
Die vorangestellten Symbole charakterisieren den Eintrag weiter:
Ein Stern * vor der Nummer verweist auf ein Gen.
Eine Raute # verweist auf ein beschreibenden Eintrag, in der Regel ein Phänotyp.
Ein Pluszeichen + verweist auf ein Gen mit bekannter Sequenz und Phänotyp.
31
Molekulargenetische Untersuchungen – Hinweise
Hinweise zu Untersuchungen, die nach Kapitel 11.4.2 EBM abgerechnet werden:
Eine molekulargenetische Untersuchung darf erst dann durchgeführt werden,
wenn die Indikationsstellung aus den Auftragshinweisen geprüft und beurteilt
werden kann. Die Auftragshinweise müssen mindestens folgende Informationen
enthalten:
• Nachweis über die Aufklärung und Einwilligung des Patienten oder seines gesetzlichen Vertreters zur Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen
• Angabe, ob es sich um eine diagnostische, prädiktive oder vorgeburtliche Untersuchung handelt
• Angabe zu molekulargenetischen Voruntersuchungen des Patienten in Bezug
auf die aktuelle Indikationsstellung
• Angabe, ob ein Indexfall bekannt ist; wenn ja, Angabe von molekulargenetischen Vorbefunden
• Art des Untersuchungsmaterials und Entnahmedatum
• die für die Prüfung des Auftrags erforderlichen klinischen und anamnestischen
Angaben
Die Untersuchungen dürfen erst dann durchgeführt werden, wenn aus den vollständigen Auftragsunterlagen hervorgeht, dass die im Anhang aufgeführten Kriterien an die Indikationsstellung erfüllt sind.
32
ACE-Polymorphismus
Gen:
Angiotensin converting enzyme
Genort: 17q23 MIM ID: +106180
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Das Angiotensin Converting Enzyme (ACE) ist mit der wichtigste Regulator im Blutdrucksystem, im so genannten Renin-Angiotensin-AldosteronSystem. Das Enzym ACE wandelt das „inaktive“ Angiotensin I in die physiologisch aktive Form Angiotensin II um, das dann in den Erfolgsorganen
Herz, Niere und den Gefäßwänden seine stark gefäßzusammenziehende
(vasokonstriktorische) Wirkung entfaltet. Parallel wird der Abbau des gefäßerweiternde (vasodilatierende) Gegenspielers Bradykinin verstärkt, was
die vasokonstriktorische Wirkung verstärkt. Der Test bestimmt den jeweils
vorliegenden Genotyp im ACE-Gen. Damit ist einerseits eine Aussage zum
Risiko eines Bluthochdrucks möglich und andererseits ergibt sich aus dem
ermittelten Genotyp auch eine Aussage zum individuellen therapeutischen
Ansatz. Die homozygote I/I- und meist auch die heterozygote I/D-Konstellation ist therapeutischen Interventionen gut zugänglich. Die homozygote D/D-Konstellation ist mit deutlich höheren und einer Therapie schwer
zugänglichen Enzymspiegeln im Blut verbunden. Dies bedeutet ein wesentlich erhöhtes Risiko für einen erhöhten Blutdruck und kardiovaskuläre
Erkrankungen
Indikation
Hypertonie, kardiovaskuläre Erkrankungen – medikamentöse Therapieplanung
Mutationen
Nachweis von Insertions(I)- und Deletions (D)-Polymorphismus im ACEGen: Genotypen: I/I-, I/D- und D/D
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Die extrahierte genomische DNA wird auf den Insertions-/Deletions-Pomethode
lymorphismus im ACE-Gen untersucht. Die spezifischen DNA-Fragmente
werden mittels PCR amplifiziert und anschließend durch eine AgaroseGelelektrophorese aufgetrennt. Der Nachweis erfolgt durch Färbung der
Fragmente mit Ethidiumbromid und Vergleich mit einem DNA-Längenmarker.
Untersuchungs- 3-5 Tage
dauer
Literaturhinweise
Tiret et al., Am. J. Hum. Genet. 51, 197-205, 1992
Singer et al., Cirulation 94, 236-239, 1996
Suehiro et al., Hum. Genet. 115, 91-96, 2004
Molekulargenetische Untersuchungen 33
Achondroplasie
FGFR3-Gen (Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor 3)
Genort: 4p16.3; OMIM # 100800)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Achondroplasie ist ein disproportioniertes Minderwuchssyndrom. Charakteristische Symptome umfassen vor allem proximal verkürzte Extremitäten, ein groß wirkender Kopf mit prominenter Stirn sowie eine Mittelgesichtshypoplasie mit eingesunkenem Nasenrücken. Die Häufigkeit der
Erkrankung wird mit ca. 1:20 000 angegeben.
Ursächlich ist eine Entwicklungsstörung des Knorpel- und Knochengewebes, die auf Mutationen im Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-3-Gen
(fibroblast growth factor receptor 3=FGFR3) zurückzuführen ist.
Obgleich die Achondroplasie autosomal dominant erblich ist, finden sich
bei nur ca. 20% der Fälle weitere Betroffenen innerhalb der Familie. Ca.
80 % der Fälle sind auf Neumutationen zurückzuführen, wobei ein Zusammenhang zu einem erhöhten väterlichen Alter beschrieben wurde.
Bei etwa 99% der Patienten mit Achondroplasie werden Mutationen im
Codon 380 des FGFR3-Gens in der Position 1138 gefunden, die zu einem
Aminosäureaustausch von Glycin zu Arginin führen (98% der Fälle zeigen
hierbei eine G(1138)A und ca. 1% eine G(1138)C Punktmutation). Weitere, sehr seltene Mutationen (z. B. Ser279Cys, Gly346Glu, Gly375Cys)
wurden in der Literatur beschrieben.
Indikation
Dysproportionierter Minderwuchs mit kurzen Extremitäten, großer Kopf
mit typischen fazialen Auffälligkeiten
Mutationen
G1138A (Gly380Arg), G1138C (Gly380Arg), G1123T (Gly375Cys)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Exon 10 des
methode
FGFR3-Gens wird mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert.
Die Exonsequenz wird auf das Vorliegen der G1138A bzw. G1138C Mutation untersucht. Mit der Untersuchung wird zusätzlich auch die seltene
G1123T Mutation für den Aminosäureaustausch an Position 375 erfasst.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Rousseau et al., Nature, 371:252- 254, 1994
Ikegawa et al., Hum Genet (3):309- 311, 1996
Shiang et al., Cell 78:335- 342, 1994
34 Molekulargenetische Untersuchungen
Adrenogenitales Syndrom (21-Hydroxylase-Defizienz)
CYP21A2-Gen (21-Hydroxylase-Gen; Genort: 6p21.3; OMIM # 201910)
CYP11B1-Gen (11-Beta-Hydroxylase-Gen; Genort: 8q24.3; OMIM #202010)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Das Krankheitsbild des Adrenogenitalen Syndroms (AGS) wird in etwa 90%
aller Fälle durch Mutationen in dem CYP-21-Gen verursacht, die zu einem
Verlust der 21-Hydroxylase-Enzymaktivität führen. Als katalytisches Enzym wird 21-Hydroxylase in der Cortisol-Biosynthese benötigt. In seltenen
Fällen werden auch Mutationen in anderen Genen z. B. 11 beta-Hydroxylase (CYP11B1), StAR-Gen oder 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase nachgewiesen. Die AGS-Symptomatik wird durch einen Mangel an Cortisol und
Aldosteron und durch die vermehrte Synthese von Androgen ausgelöst.
Bei dem AGS werden zwei Verlaufsformen unterschieden: das klassische
AGS mit und ohne Salzverlust und die mildere Form des „late onset“ AGS.
Bei dem klassischen AGS führt ein Androgenüberschuss bereits pränatal
bei weiblichen Feten zu einer Virilisierung des äußeren Genitals. Dies kann
durch frühzeitige Gabe von Dexamethason zu Beginn der Schwangerschaft
verhindert werden, wenn bereits vor einer Schwangerschaft bekannt ist,
dass beide Eltern Anlagenträger sind. Zeigt die Pränataldiagnostik, dass es
sich um einen männlichen Feten oder einen gesunden weiblichen Feten
handelt, kann die Dexamethason-Behandlung beendet werden.
Postnatal kann es in den ersten Lebenswochen zu einem lebensbedrohlichen Salzverlust kommen, bei dem im Blut ein Überschuss an Kalium
und eine Übersäuerung nachweisbar ist. Eine Hormonkonzentrationsbestimmung im Blut zeigt in diesen Fällen wenige Tage nach Geburt stark
erhöhte Werte für 17-Hydroxy-Progesteron. Ohne Behandlung kommt es
in den ersten Lebensjahren zu einem verstärkten Größenwachstum. Die
Körpergröße im Erwachsenenalter liegt jedoch durch einen vorzeitigen
Verschluss der Epiphysenfugen unterhalb der Norm. Sowohl männliche
als auch weibliche Patienten zeigen bereits im Kindesalter eine scheinbar
vorzeitige Pubertätsentwicklung (Pseudopubertas pracox) und haben eine
reduzierte Fertilität. Bei rechtzeitiger Diagnosestellung ist die Symptomatik
eines AGS jedoch durch eine lebenslange Hormon-Substitutionstherapie
gut behandelbar.
Die „late onset“ Form eines AGS zeichnet sich durch einen wesentlich
milderen Verlauf aus und wird häufig erst im Erwachsenenalter durch Fertilitätsstörungen wahrgenommen. Bei etwa 30% Patientinnen mit late onset
AGS lässt sich eine Cyp21-Genmutation in nur einem Allel (heterozygot)
nachweisen. Welche zusätzlichen Faktoren hierbei eine Rolle spielen ist
derzeit nicht bekannt.
Molekulargenetische Untersuchungen 35
Indikation
Bei Verdacht auf ein klassisches oder late-onset AGS (erhöhte 17-Hydroxy-Progesteron Werte im Neugeborenenscreening, Salzverlustsyndrom,
intersexuelles Genitale bzw. Mädchen mit Virilisierung, Kinder mit Pseudopubertas praecox); erwachsene Patientinnen mit V. a. late-onset AGS
(Hirsutismus, Oligo- oder Amenorrhoe, PCO-Syndrom); Untersuchung
des Partners/ der Partnerin und der Geschwister eines AGS-Indexpatienten
insbesondere bei Kinderwunsch; pränatal bei bekannter Mutation beider
Eltern.
Mutationen
Innerhalb des CYP21-Gens wurden bisher mehr als 100 Mutationen
(Punktmutationen, Deletionen, Insertionen und komplexe Rearrangements) beschrieben.
Häufigste Mutationen:
große Deletionen, Duplikationen oder Genkonversionen (ca. 20-30%);
c.293-13A>G oder c.293-13C>G (splice-site Mutation 19 bp vor dem 3’
Ende im Intron 2, ca. 20%-30%); Ile173Asn (Exon 4: c.518T>A)
Material
2-5 ml EDTA-Blut (bei Kindern)
Untersuchungs- CYP21: Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Es erfolgt
methode
eine Untersuchung auf Deletionen mittels MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) und eine Mutationssuche durch vollständige
Sequenzierung der kodierenden Bereiche (10 Exons) des CYP21-Gens inklusive der Promotorregion und aller Exon/Intron Grenzen.
CYP11B1: PCR und Sequenzierung des kodierenden Genbereichs
(9 Exons) sowie des Promotors
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen, bei bekannten Mutationen in der Familie 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Nimkarn and New, in GeneReviews (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1171/)
Höppner, Med Genet 16:292-298, 2004; Forest et al., Endocr Res 15:277-301, 1989
Alpha-1-Antitrypsindefizienz
PI-Gen (Protease-Inhibitor;
Genort: 14q32.1; OMIM *107400)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die Alpha-1-Antitrypsindefizienz ist die häufigste Erbkrankheit der weißen Bevölkerung Alpha-1-Antitrypsin ist ein Inhibitor-Protein, welches als
Hauptfunktion eine proteolytische Schädigung des Lungengewebes verhindert. Ein Mangel dieses Proteins führt zu einem gehäuften Auftreten
von chronischer obstruktiver Lungenerkrankung und in der Folge zu Emphysemen, die sich im Erwachsenenalter und sehr selten schon im frühen
Kindesalter entwickeln. Weitere Komplikationen sind Hepatitis und Leberzirrhose, ca. 18% der Kinder entwickeln Lebersymptome, wie verlängerter
Neugeborenenikterus, Hyperbilirubinämie erhöhte Transaminasen oder
Hepatosplenomegalie.
36 Molekulargenetische Untersuchungen
Die sogenannte Z-Mutation (Aminosäureaustausch von Glutamin in Position 342 zu Lysin) führt in homozygoter Form zu einem schweren Krankheitsbild mit einer resultierenden Protein-Konzentrationserniedrigung von
mehr als 80%. Dieser Phänotyp (Proteinase-Inhibitor) PI ZZ tritt mit einer
Prävalenz von 1:2000 bis 1:7000 in der kaukasischen Bevölkerung Nordund Mitteleuropas auf.
Liegt die Z-Mutation heterozygot vor, entweder in Kombination mit einem
normalen Allel (PI MZ) oder mit der sogenannten S-Mutation (Aminosäureaustausch von Glutamin in Position 264 zu Valin) (PI SZ), so führt dies zu
einem leichteren Krankheitsbild, bei einer Erniedrigung des Alpha-1-Antitrypsins um nicht mehr als 75% des Sollwertes wird das Lungenemphysem
nur durch pulmonale Noxen (Infekte, Rauchen) ausgelöst. In seltenen Fällen findet man „Null-Allele“, von denen kein Alpha-1-Antitrypsin gebildet
werden kann, z. B. durch Deletionen, Splice- oder Stopp-Mutationen.
Indikation
Patienten mit erniedrigten Blutplasmaspiegeln von Alpha-1-AT oder positiver Familienanamnese, Neugeborene und Kinder mit chronischer Hepatitis
unklarer Genese
Mutationen
Z-Mutation: G11940A (Glu342Lys); S Mutation: A9628T (Glu264Val)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Zwei Abschnitte
methode
des PI-Gens, die beide Mutationsstellen umfassen, werden mit Hilfe der
Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das Vorhandensein der Mutationen wird durch eine reverse Hybridisierung nachgewiesen.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Perlmutter et al., Sem Liver Dis 18:217- 225, 1998
Braun et al., Eur J Clin Chem Clin Biochem 34:761- 764, 1996
Alzheimer-Demenz, familiäre
APP-Gen (Amyloid-Precursor-Protein; Genort: 21q21.3; OMIM *104760)
PSEN1-Gen (Presenilin 1; Genort: 14q24.2; OMIM *104311)
PSEN2-Gen (Presenilin 2; Genort: 1q42.13; OMIM *600759)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Der Morbus Alzheimer ist durch eine im Erwachsenenalter einsetzende
progressive Demenz charakterisiert, welche mit kortikaler Atrophie, Bildung von beta-Amyloid-Plaques und von intrazellulären Neurofibrillen
einhergeht.
Molekulargenetische Untersuchungen 37
Klinische
Bedeutung
Zu Beginn steht eine Einschränkung intellektueller Funktionen (Neugedächtnis, räumliche und zeitliche Orientierung, Sprache, Benutzung von
Gegenständen usw.), zunehmend geht so die Autonomie verloren. Familiäre Formen sind selten. Von den bekannten Faktoren ist der Genotyp
des Apolipoproteins E am wichtigsten. Rein monogene Formen sind noch
seltener. Sie treten in der Regel vor dem 60. Lebensjahr auf und werden
autosomal-dominant vererbt. Die drei bisher identifizierten Gene kodieren
für die Preseniline 1 und 2 und für das Amyloid Precursor Protein. Mutationen des PSEN1-Gens finden sich in 30-70 %, des PSEN2-Gens in weniger
als 5% und Mutationen des APP-Gens in 10-15 % der früh einsetzenden familiären Alzheimer Fälle. Weniger als 1% der etwa 400.000 französischen
Alzheimer-Patienten haben eine dieser monogenen Formen..
Indikation
V. a. erbliche, frühmanifeste primäre Demenz Erkrankung
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Stufendiagnostik:
methode
1. Amyloid-Vorläuferprotein-Gen (APP): PCR und Sequenzierung
der Exons 16, 17. Duplikationsscreening über MLPA
2. Präsenilin 1 (PSEN1)
3. Präsenilin 2 (PSEN2): PCR und Sequenzierung der jeweils 10 kodierenden Exons.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Sennvik, K. et al., Neurosci. Lett. 278: 169-172, 2000
Stokin, G. B. et al., Science 307: 1282-1288, 2005
Rossi, G. et al., Neurology 63: 910-912, 2004
P. A. Brice, www.orpha.net
Angelman-Syndrom (AS)
UBE3A (E6-AP-Ubiquitin-Proteinligase;
Genort: 15q11-q13; OMIM # 105830, *601623)
Erbgang
Autosomal-dominant bei maternaler Vererbung; überwiegend sporadische
Fälle
Klinische
Bedeutung
In der Chromosomenregion 15q11-q13 befindet sich eine Gruppe von Genen, die dem „genomic imprinting“ unterliegen. Bei imprinteten Genen ist
entweder nur das von der Mutter oder nur das vom Vater stammende Allel
aktiv, während jeweils von dem zweiten Elternteil ein durch Methylierung
inaktiviertes Allel vererbt wird (s. a. Prader Willi-Syndrom).
38 Molekulargenetische Untersuchungen
Angelman-Syndrom (AS) ist eine schwere psychomotorische Entwicklungsstörung die durch den Funktionsverlust des mütterlich ererbten UBE3AGens in 15q11.2 ausgelöst wird.
Die expressive Sprachentwicklung ist stark eingeschränkt oder fehlt vollständig, während das Sprachverständnis relativ gut ausgebildet ist. Typische Merkmale bei AS-Patienten sind objektiv grundlose Lachattacken und
ataktische Extremitätenbewegungen. Epileptische Anfälle und Mikrozephalie und Progenie werden häufig beobachtet. Neurologisch lässt sich ein
auffälliges EEG nachweisen. Ein positiver Gentest kann die Verdachtsdiagnose eines Angelman-Syndroms bestätigen, ein Ausschluss ist jedoch nicht
möglich.
In ca. 70% aller Fälle liegt eine de-novo Deletion im mütterlich ererbten
Chromosom 15 im Bereich der Banden q11 bis q13 vor. Eine uniparentale
paternale Disomie (beide UBE3A-Allele stammen vom Vater), eine fehlerhafte Methylierung infolge von Imprintig-Center Mutationen oder Mutationen im UBE3A-Gen findet man bei ca. 10% der Patienten. Bei 20% der
Patienten mit V. a. AS lässt sich keine Veränderung nachweisen.
Differentialdiagnostisch ist in diesen Fällen an AS-ähnliche Krankheitsbilder
zu denken z. B. an das Rett-Syndrom (MECP2-Genmutation).
Indikation
Psychomotorische Retardierung mit fehlender Sprachentwicklung, unmotivierte Lachattacken; epileptische Anfälle, ataktische Bewegungsmuster,
auffällige EEG-Werte.
Mutationen
70% maternale Deletion 15q11-q13
1% paternale uniparentale Disomie [upd(15)pat]
3% Imprintingdefekt
15% Mutationen im UBE3A-Gen
10% andere
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert.
methode
Stufe 1: Methylierungsspezifische MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) zum Nachweis einer Deletion, eines Imprintingdefektes
oder einer paternalen uniparentalen Disomie in 15q11-13.
Stufe 2: PCR und Sequenzierung der 9 kodierenden Exons von UBE3A zur
Erfassung von Punktmutationen.
Untersuchungs- Ca. 2-3 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Horsthemke et al., Medgen 22:282-286, 2010
Kishino et al., Nat Genet 15:70-73, 1997
Molekulargenetische Untersuchungen 39
Angioödem hereditäres (Serpin G1, C1-Esteraseinhibitor)
C1-Esterase-Inhibitor (C1-INH-Mangel) SERPING1 u. F12-Gen
(Genorte: 11q12.1-, 5q35.3; OMIM *606860, *610619)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Angioödeme bezeichnen verschiedene Krankheitsformen, bei denen es
rezidivierend zu Ödemen der Haut, seltener auch der Zunge, der Glottis
bzw. des Larynx, des Magen-Darm-Trakt und seltener auch anderer Weichteilorgane kommen kann. Unterschiedliche pathogenetische Prozesse werden beschrieben, wobei z. B. eine histaminvermittelte von einer kininvermittelten Genese der Angioödeme unterschieden werden kann. Zum Teil
ist die Genese jedoch noch nicht hinreichend geklärt.
Das hereditäre Angioödem (HAE) durch C1-Esterase-Inhibitor-(C1-INH)Mangel stellt hierunter ein besonders schweres Krankheitsbild dar, bei dem
zahlreiche Erstickungsfällen beobachtet wurden.
Gewöhnlich beginnt die Symptomatik im Schulalter, wobei neben den
Ödemen eine viszerale Symptomatik mit krampfartigen abdominellen
Schmerzen, Erbrechen und Durchfall isoliert auftreten kann. Die meisten
Betroffenen können eine kommende Attacke vorhersagen. Diese kann
sich durch Stimmungsschwankungen, Angst oder Erschöpfung ankündigen.
Auslöser sind zum Beispiel hormonelle Faktoren, Traumen oder emotionaler Stress.
Die Inzidenz des HAE wird auf etwa 1:50.000 geschätzt. Unterschieden
werden hierbei hauptsächlich 2 Formen: Ca. 85% der Patienten leiden
unter einem Synthesedefekt des C1-INH, so dass dieses stark vermindert
vorliegt. Dieser Typ wird als HAE Typ I bezeichnet. Üblicherweise findet
sich bei diesen Patienten eine Deletion, Insertion oder eine Stop-KodonMutation auf einem Allel des Gens.
Eine funktionelle Insuffizienz des C1-INH wird bei etwa 15% der Patienten
beobachtet und als HAE Typ II bezeichnet. In diesem Falle wird von dem
defekten Allel als Folge eines Aminosäure-Austausches ein dysfunktionelles
Protein synthetisiert. Im Plasma finden sich normale oder sogar erhöhter
Konzentrationen des C1-INH. Klinisch lassen sich diese beiden Typen jedoch nicht unterscheiden, da in beiden Fällen die C1-Esterase-InhibitorFunktion auf 5-30% der Normwerte reduziert ist. Auch die C4-Spiegel sind
erniedrigt, die C3-Konzentrationen dagegen normal.
Die klinische Symptomatik des HAE III ähnelt den oben genannten und
sind ebenfalls durch rezidivierende Hautschwellungen, schmerzhafte Magen-Darm-Attacken und, selten, lebensbedrohliche Larynxödeme gekennzeichnet.
40 Molekulargenetische Untersuchungen
Bei einem Teil der Frauen wird die Symptomatik wie beim hereditären Angioödem durch Cl-Inhibitor-Mangel durch äußerlich zugeführte Östrogene
im Rahmen von oralen Antikonzeptiva oder einer hormonalen Substitutionstherapie ausgelöst.
Indikation
HAE I und HAE II: Differentialdiagnose histaminvermittelter vs. hereditärer
Ödeme durch einen angeborenen Mangel an (funkt.) C1-Esterase-Inhibitor, 20% der Patienten mit HAE ohne Familienanamnese.
HAE III: V. a. östrogensensitives Angioödem mit unauffälliger Biochemie
des C1-Esteraseinhibitors
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- 1. SERPING1: PCR und Sequenzierung der Exons 1-8 und des Promotors,
methode
Duplikations- und Deletionsscreening mit MLPA
2. F12: vorzugsweise bei Frauen ggf. Untersuchung von Faktor XII bei HAEIII durch PCR und Sequenzierung des Exons 9
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Davis, A. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 3161-3165, 1986
Zahedi, K. et al., Behring Inst. Mitt. 93: 115-119, 1993.
Dewald, G., Bork, K., Biochem. Biophys. Res. Commun. 343: 1286-1289, 2006
Allergo J. et al., 21 (2): 109–118, 2012
Antithrombin III (Serpin C1)
SERPINC1 -Gen, Antithrombin III (ATIII; 107300)
Genort: 1q23-q25; OMIM # 613118
Klinische
Bedeutung
Der angeborene Antithrombin III (ATIII)-Mangel stellt eine seltene, autosomal dominant erbliche Ursache der Thromboseneigung dar. Laut Literaturangaben ist in etwa jeder 1:500 bis 1:5000 hiervon betroffen. Insbesondere das Risiko für tiefe Beinvenenthrombosen ist durch einen ATIII-Mangel
erhöht, aber auch Fehlgeburten kommen gehäuft vor. Arterielle Thrombosen sind hingegen eher selten. Bei Betroffenen liegt in etwa 80% der Fälle
ein quantitativer ATIII-Mangel Typ I vor. Ein qualitativer Mangel vom Typ II,
bei dem die Funktion des Proteins gestört ist, ist seltener. Dieser kann bei
einem ATIII-Antigentest unentdeckt bleiben. Die AT-III-Aktivität ist bei den
meisten Patienten mit einer angeborenen heterozygoten ATIII-Defizienz
auf 40-60%.reduziert.
Indikation
Hereditärer Antithrombin-Mangel, Thrombophilie, Differential-diagnostisch zur Unterscheidung zwischen erworbenem und angeborenem ATIIIMangel
Molekulargenetische Untersuchungen 41
Mutationen
Der Typ I des ATIII-Mangels wird zumeist durch kurze Deletionen von
1-30 bp Länge oder Insertionen und seltener durch Punktmutationen verursacht, welche als Nonsense-oder Splice-Mutationen imponieren. Typ II
des ATIII-Mangels beruht oft auf Missensmutationen, die zum einen die
reaktive Domaine (Typ Ia) oder die Heparin-bindende Domaine (Type IIb)
betreffen oder an verschiedene Lokalisationen zu pleiotropen Effekten(Typ
IIc) führen.
Material
2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR, Sequenzierung des SERPINC1-Gens, MPLA
methode
Untersuchungs- 2-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Corral J. et al.; Blood 109(10): 4258-4263, 2007
Patnaik M.M. and S. Moll Haemophilia, 14 1229–1239, 2008
Apolipoprotein B
APOB-Gen (Apolipoprotein B;
Genort: 2p24; OMIM # 144010)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Mit einer Häufigkeit von 1:500 ist die Fam. Hypercholesterinämie (FH)
eine der häufigsten monogenen Erkrankungen. Das Apolipoprotein B-100
(ApoB-100) ist ein wesentlicher Bestandteil des LDL-Cholesterins, es beeinflusst die Struktur der LDL-Partikel und die Bindung an den LDL-Rezeptor
auf den Hepatozyten. Heterozygote Träger von ApoB-100 Mutationen
weisen einen Cholesteringehalt von 200-450 mg/dl auf, bei homozygoten
Trägern können die Werte auch höher sein. Die häufigste ApoB-100 Mutation ist die R3500Q-Mutation mit einer Frequenz von 1:500, seltener ist
die R3531C-Mutation mit einer Frequenz von 1:3000.
Indikation
Verdacht auf familiäre Hypercholesterinämie (FH); Blutsverwandte von Patienten mit FH; Hypercholesterinämie unklarer Genese
Mutationen
Häufigste Mutationen: im APOB-Gen: R3500Q und R3531C
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels
methode
PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an
membrangebundene allelspezifische Sonden.
42 Molekulargenetische Untersuchungen
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Goldstein, J. L., Brown, M. S.; J. Biol. Chem. 249: 5153-5162, 1974.
Hansen, P. S et al.; Arteriosclerosis Thromb. Vasc. Biol. 17: 741-747, 1997.
Higgins, M. J. P., Lecamwasam, D. S., Galton, D. J.; Lancet 306: 737-740, 1975.
Apolipoprotein E
Apolipoprotein E-Gen (APOE; Genort: 19q13.2; OMIM +107741)
Erbgang
Autosomal-kodominant
Klinische
Bedeutung
Apolipop E ist ein 299 Aminosäuren langes Plasmaprotein und wird in der
Leber, dem Gehirn und verschiedenen anderen Zellen synthetisiert. Es besteht ein genetischer Polymorphismus mit drei Allelen, Apo E2, Apo E3 und
Apo E4, die sich jeweils nur in einer Aminosäure unterscheiden. Hieraus
ergeben sich sechs Genotypen (Apo E2/2 (1%), E2/3 (11%), E2/4 (3%), E3/3
(63%), E3/4 (20%), E4/4 (2%)). Apo E ist Bestandteil verschiedener Lipoproteine (Chylomikronen, VLDL, VLDL-Remnants (IDL) und HDL). Neben
Apo B ist Apo E ein Ligand des LDL(Apo B/E)-Rezeptors.
Apo E ist relevant für den Stoffwechsel von Chylomikronen und VLDLRemnant-Partikeln.
Die Isoform E2 gehört zu den Artheriosklerose Risikofaktoren. Ein Teil der
homozygoten Träger entwickeln eine Dysbetalipoproteinämie (Typ III Hyperlipidämie nach Fredrickson). Tritt die Isoform E4 homozygot auf, besteht
eine höhere Wahrscheinlichkeit an Morbus Alzheimer zu erkranken, bei
gleichzeitiger Senkung des Erkrankungsalters. Die Häufigkeit des E4-Allels
beträgt bei Alzheimerpatienten 30-42%, in Kontrollgruppen dagegen nur
10%. Die genauen Pathomechanismen sind noch ungeklärt. Bei homozygotem und heterozygotem E3-Genotyp besteht ein normales Arteriosklerose-Risiko.
Indikation
Dyslipoproteinämie, Hypercholesterinämie; Morbus Alzheimer
Mutationen
Drei Hauptallele bekannt: E2, E3, E4
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels
methode
PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an
membrangebundene allelspezifische Sonden
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Saunders, A.M. et al. (1993); Neurology 43:1467-1472.
Davignon J. et al. (1988); Arteriosclerosis 8:1-21
Molekulargenetische Untersuchungen 43
Azoospermiefaktor
AZF-a-, AZF-b-, AZF-c- Regionen (Yq11.23; MIM #415000) DAZ-Gen ("Deleted In Azoospermia"; Genort: Yq11; MIM *400003)
Erbgang
Y-Chromosomal; in der Regel de novo Deletionen; Söhne erben bei erfolgreicher in vitro Fertilisation das deletierte Y-Chromosom mit entsprechenden Konsequenzen für deren Fertilität.
Klinische
Bedeutung
Der Azoospermiefaktor (AZF) beschreibt drei Regionen auf dem langen
Arm des Y-Chromosoms, in denen bereits einige Gene lokalisiert wurden,
die wahrscheinlich für die Spermatogenese verantwortlich sind.
Bisher konnten bei 66% der Männer mit Azoospermie oder schwerer Oligozoospermie und bei ca. 7,3% der infertilen Männer de novo Mikrodeletionen in der AZF Region (AZF a-c) nachgewiesen werden. Durch die
Untersuchung von 8 ausgewählten STS-Loci lassen sich mehr als 90% aller
Deletionen innerhalb der drei AZF-Regionen nachweisen. Deletionen außerhalb dieser Regionen sind mit dieser Untersuchung nicht erkennbar. Bei
der Mehrzahl dieser Fälle kann molekulargenetisch eine Deletion der gesamten AZFc Region nachgewiesen werden, die zum Verlust aller 4 Kopien
des DAZ-Gens (Deleted in Azoospermia) führt.
Klinische
Bedeutung
Durch die Untersuchung von sechs ausgewählten STS-Loci plus zwei Kontroll-Loci lassen sich mehr als 90% aller Deletionen innerhalb der drei AZFRegionen nachweisen. Deletionen außerhalb dieser Regionen sind mit
dieser Untersuchung nicht erkennbar.
Indikation
Infertilität aufgrund von nicht-obstruktiver Azoospermie, Kryptozoospermie oder Oligozoospermie. Eine Indikation zum Deletionsscreening bieten
in erster Linie Patienten, die sich einer Intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) unterziehen werden.
Mutationen
Deletionen in den 3 Abschnitten der AZF-Region (AZF a, b und c)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Anschließend
methode
werden acht Regionen mittels zweier getrennter Multiplex-PCR Ansätze
amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte werden über eine Gelelektrophorese analysiert.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Simoni et al., Int J of Androl 27:240-249, 2004; Simoni et al., Int J of Androl 22:292-299,
1999; Vogt et al., Hum Mol Genet 5:933-943, 1996
44 Molekulargenetische Untersuchungen
Catechol-O-Methyltransferase
COMT-Gen (Catechol-O-Methyltransferase;
Genort: 22q11.21; OMIM
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Das Phase II-Enzym COMT katalysiert die Übertragung von Methylgruppen auf endogene und exogene Catecholamine und ist damit Teil des Katecholamin- und des Fremdstoffmetabolismus. Das Enzym ist maßgeblich
am Abbau von Neurotransmittern wie Dopamin und Noradrenalin beteiligt, wodurch die verfügbare Menge dieser Stoffe im Körper reguliert wird.
Es wird daher angenommen, dass COMT-Gen-Polymorphismen für die
Entstehung von psychischen Erkrankungen wie Angststörungen, Schizophrenie, ADHS etc., mitverantwortlich sein könnten.
Indikation
Verdacht auf gestörten Catecholamin-Metabolismus
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Genotypisierung
methode
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Gogos, J. A. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 9991-9996, 1998
Alsobrook, J. P. et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiat. Genet.) 114: 116-120, 2002
CBAVD (congenitale bilaterale Vas deferens Aplasie)
CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator;
Genort: 7q31.2; OMIM #277180, *602421)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Durch die große phänotypische Variabilität der Mukoviszidose (Cystische
Fibrose = CF) werden auch zunehmend atypische Formen bekannt. Eine
der häufigsten Sonderformen der CF stellt die CBAVD dar, welche man
bei infertilen, sonst „gesunden“ Männern ohne klinische Zeichen von CF
beobachten kann. Bei den meisten Fällen (ca. 87%) der CBAVD ohne Nierenbeteiligung lassen sich Mutationen in einem oder beiden Allelen des
CFTR-Gens nachweisen.
Indikation
Männliche Infertilität unklarer Genese
Mutationen
In der Regel Kombination einer schweren und einer milden CFTR-Mutation oder Kombination zweier milder Mutationen
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Anschließend wermethode
den die relevanten Sequenzbereiche mittels Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) arnplifiziert.
Molekulargenetische Untersuchungen 45
Untersuchungs- Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebunmethode
dene allelspezifische Sonden bzw. unter Verwendung des „Oligo-LigationAssays“ (OLA-Methode, Abbott).
Untersuchungs- Ca. 5-8 Tage
dauer
Literaturhinweise
Holsclaw et al., J Urol 106:568- 574, 1971 ; Stuhrmann, Reproduktionsmedizin 14:5465, 1998; Stuhrmann-Spangenberg et al., Medgen 21:268-275, 2009
Cholinesterase, atypische
BCHE-Gen (Butyrylcholinesterase;
Genort: 3q26.1; OMIM +177400)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Ein Butyrylcholinesterase (BChE)-Mangel verursacht eine Verzögerung im
Metabolismus von z. B. der Muskelrelaxantien Suxamethonium oder Mivacurium und gewisser Lokalanästhetika (z. B. Procain). Postoperativ kann
dies zu einer verlängerten Apnoe führen. Die Dauer der Apnoe variiert
abhängig vom Ausmaß des Enzymdefektes erheblich. Zwischen 3,4 und
4% der europäischen Bevölkerung haben haben einen partiellen Mangel,
der zu leicht verlängerter Apnoe (5 Minuten bis 1 Stunde) führt. Eines von
etwa 2.500 Individuen hat eine auf mehr als 1 Stunde verlängerte Apnoe.
Bei BChE-Aktivitäten unterhalb der Nachweisgrenze dauern die Apnoen mehr als 8 Stunden. Die Prävalenz dieser schwersten Form wird auf
1:100.000 geschätzt.
Der BChE-Mangel kann durch erbliche und/oder nicht-erbliche Ursachen
bedingt sein. Der genetisch bedingte Mangel, mit Mutationen im BCHEGen, wird autosomal-rezessiv vererbt. Ein nichterblicher BChE-Mangel
kann während der Schwangerschaft, bei Neugeborenen oder auch z. B.
bei chronischen Infektionen, Mangelernährung, Lebererkrankungen und
Malignomen auftreten. Die Betroffenen zeigen keinerlei klinische Symptomatik, solange sie nicht mit den oben genannten Medikamenten behandelt
werden.
Indikation
Erniedrigte Cholinesterase-Aktivität, verringerte Dibucain- bzw. Fluoridzahl, verlängerte neuromuskuläre Blockade bzw. Apnoe nach Gabe von
Muskelrelaxantien z. B. Succinylcholin, Vecuronium, Pancuronium
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 4 Exons
methode
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Rubinstein, H. M.et al., J. Clin. Invest. 49: 479-486, 1970
Weinshilboum, R., New Eng. J. Med. 348: 529-537, 2003
Yen, T. et al., Clin. Chem. 49: 1297-1308, 2003
De Lonlay P., www.orpha.net
46 Molekulargenetische Untersuchungen
Chorea Huntington
HTT-Gen (Huntingtin-Gen;
Genort: 4p16.3; OMIM #143100, *613004)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Chorea Huntington ist eine neurodegenerative Erkrankung mit autosomal dominantem Erbgang. Die Inzidenz beträgt 4-7:100.000. Charakteristisch ist ein progressiver Krankheitsverlauf mit Hyperkinesien, die sich
später zu choreatiformen Bewegungsstörungen entwickeln können. Hinzu
kommen Persönlichkeitsveränderungen bis hin zur Demenz. Neuropathologisch beobachtet man eine Degeneration von Neuronen, die präferentiell im Corpus striatum und im Cortex auftritt. Das für die Erkrankung
verantwortliche Huntingtin-Gen beinhaltet bei Normalpersonen 10-35
aufeinander folgende CAG-Nukleotide im kodierenden Bereich, die im
Huntington-Protein als Glutaminreste erscheinen.
Bei Patienten mit klinischen Symptomen der Chorea Huntington findet
man in nahezu 100% der Fälle eine pathologische Verlängerung dieser Nukleotidfolge auf 36-121 CAG-Tripletts.
Nukleotidverlängerungen von 27-35 Tripletts werden als „Intermediärallele“ („mutable normal allel“) bezeichnet. Hierbei besteht für den Träger kein
Erkrankungsrisiko, aber in der Folgegeneration kann es zu einer Expansion
der Triplettrepeat-Region kommen. Huntingtin-Allele mit 36-39 Tripletts
haben eine reduzierte Penetranz, da es Personen aus Chorea HuntingtonFamilien gibt, die mit dieser Triplettzahl bis ins hohe Alter keine Symptome der Erkrankung zeigen, während andere mit dieser Triplettzahl erkrankt
sind.
Überwiegend liegt das Manifestationsalter zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr. Je größer die Anzahl der Glutamine, desto stärker wird die Ausprägung des Krankheitsbildes und/oder desto früher beginnt die Erkrankung.
Bei erkrankten Kindern findet man z. B. mehr als 70 Tripletts. In der Regel
kann jedoch keine Aussage über das voraussichtliche Erkrankungsalter getroffen werden.
Eine prädiktive molekulargenetische Diagnostik sollte im Rahmen der IHA(International Huntington‘s Association) und der WFN- (World Federation
of Neurology) Richtlinien erfolgen. Diese lauten:
• Zunächst sollte der Ratsuchende eine genetische Beratung durch einen
Facharzt erhalten.
•Daneben sollte eine psychotherapeutische Betreuung gewährleistet
sein.
• Vor Untersuchungsbeginn und Befundmitteilung muss der Betreuer bestätigen, dass der Ratsuchende nach ausreichender Bedenkzeit auch auf
eine ungünstige Befundmitteilung vorbereitet ist.
• Das Ergebnis wird vom genetischen Berater mitgeteilt. Auf Wunsch des/
der Ratsuchenden kann dies im Beisein des Betreuers oder einer anderen Vertrauensperson geschehen.
Molekulargenetische Untersuchungen 47
Klinische
Bedeutung
Eine pränatale Untersuchung hinsichtlich Chorea Huntington darf laut
Gendiagnostikgesetz §15 nicht durchgeführt werden.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein Abschnitt des
methode
Huntingtin- Gens, der die CAG-Triplettwiederholung beinhaltet, wird mit
Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Die Längenbestimmung
des PCR- Produktes und die Ermittlung der daraus resultierenden Anzahl
der CAG-Nukleotidtripletts erfolgt mittels Kapillarelektrophorese.
Untersuchungs- Ca. 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
McNeil et al., Hum Mol Genet 6:775-779, 1997
Rubinsztein et al., Am J Hum Genet 59:16-22, 1996
Gellera et al., Am J Hum Genet 59:475-477, 1996
The Huntington‘s Disease Collaborative Research Group, Cell 72:971-983, 1993
Col1A1-Gen (SP1-Polymorphismus)
COL1A1-Gen
Genort: 17q21,31-q22; MID: # 166200, +120150
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die Osteoporose ist definiert als Untergang bestimmter Knochenanteile
(Demineralisierung), wobei auch genetisch bedingte Formen (50-80% der
Fälle) bekannt sind. Vor allem bei jüngeren Betroffenen muss nach Stoffwechselerkrankungen und/oder einer hormonellen Regulationsstörung gesucht werden. Ungefähr 75% der an einer Osteoporose Erkrankten weisen
Veränderungen im Collagen A- und/oder im VDR-Gen auf.
Da das Typ I-Collagen das im Knochen mengenmäßig am stärksten vertretene Strukturprotein darstellt, beeinflussen Mutationen oder veränderte
Transkriptionsraten dieser Genfamilie die Knochendichte. Eine Heterozygotie bedingt eine leichtere und die Homozygotie eine deutlich erhöhte
Neigung zur Osteoporose. Die Ausprägung zeigt sich im Regelfall verstärkt
im weiblichen Geschlecht.
Indikation
V. a. Osteoporose
Mutationen
Der Sp1- oder Ss-Polymorphismus (PM) im COL1A1-Gen wird durch einen
G>T-Austausch an der Bindestelle des Transkriptionsfaktors Sp1 im ersten
Intron des Gens verursacht und führt zu den Genotypen: G/G → SS-PM,
G/T → Ss-PM bzw. T/T → s/s-PM. Da das s-Allel mit einer deutlich verminderten Knochendichte assoziiert ist, besitzen homozygote ss-Anlageträger
ein erhöhtes und heterozygote Ss-Patienten ein mittleres Risiko für die Entwicklung einer Osteoporose und/oder für Knochenbrüche
Material
2-5 ml EDTA-Blut
48 Molekulargenetische Untersuchungen
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereich mittels PCR
methode
amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an
membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 4-6 Tage nach Probenerhalt
dauer
Literaturhinweise
Grant et al., Nature Genetics 14, 203-206, 1996
Uitterlinden et al., New Engl J Med 338, 1016-1021, 1998
Cumarin-Sensitivität
VKORC1-Gen (Vit. K-Epoxid-reductase-complex;
Genort: 16p11.2; OMIM *608547)
CYP2C9-Gen (Cytochrome P450 Subfamily IIC, Polypeptide 9;
Genort: 10q23.33; OMIM *601130)
Klinische
Bedeutung
Die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) spielt eine wichtige Rolle für
den Vitamin K Stoffwechsel und ist der eigentliche Angriffspunkt von Cumarinen. Ein genetischer Polymorphismus der Nähe des VKORC1 Gens
(VKORC1-1639G>A) hat einen starken Einfluss auf die individuelle Cumarin Dosis. Das Cytochrom CYP2C9 ist für den Abbau von Cumarinen
verantwortlich. Neben der normalen Variante des CYP2C9 Gens, die als
CYP2C9*1 bezeichnet wird, sind in Europa auch zwei häufige Varianten
mit verringert Aktivität bekannt (CYP2C9*2 und CYP2C9*3). Träger dieser
Varianten benötigen geringere Dosen von Cumarinen, um einen therapeutisch wirksamen Spiegel aufrechtzuerhalten
Indikation
Verdacht auf Therapieresistenz bzw. Überdosierung mit Cumarin
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Genotypisierung
methode
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Ross, K. A. et al., J. Hum. Genet. 55: 582-589, 2010
Rieder, M. J. et al., New Eng. J. Med. 352: 2285-2293, 2005
Rost, S. et al., Nature 427: 537-541, 2004
Molekulargenetische Untersuchungen 49
Cytochrom P 450
CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A5, CYP4F2,
CYP19A1
Klinische
Bedeutung
Cytochrome P450 (CYP) kommen ubiquitär vor, sind also bei praktisch
allen lebenden Organismen wie Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien nachweisbar. Beim Menschen sind CYP vor allem in der Leber zu finden, aber
auch im Darm, den Nieren und der Lunge. Dabei sind die Enzyme in der
Mem­
bran des endoplasmatischen Retikulums im Innern der jeweiligen
Zellen lokalisiert. Cytochrome P450 sind Chromoprote­ine, die aus etwa
500 Aminosäuren bestehen und Häme (Komplexverbindungen aus einem
Porphyrin-Molekül und einem zentralen Eisenion) als prosthetische Gruppe
enthalten. Diese bildet das aktive Zentrum, in dem die katalytische Reaktion stattfindet. Viele schwer wasserlösliche Stoffe, zum Beispiel zahlreiche
Medikamente, werden in der Leber über den Prozess der Biotransformation
abgebaut.
Diese verläuft in zwei Phasen: Zuerst werden die Stoffe in den sogenannten
Phase-I-Reaktionen durch Oxidation, Reduktion, Hydrolyse oder Hydratation mit einer polaren Gruppe versehen und so hydrophiler gemacht. Die
entstehenden Verbindungen werden in den sich anschließenden Phase-IIReaktionen mit körpereigenen Stoffen wie Glucuronsäure konjugiert und
dann über Nieren oder Galle ausgeschieden. Einige Cytochrome P450, zum
Beispiel CYP2D6 und CYP2C19, weisen eine große genetische Variabilität auf. Bei den codierenden Genen treten also häufiger Polymorphismen
auf, die zu stärker beziehungsweise schwächer aktiven oder funktionslosen
Varianten der Enzyme führen. Aus den jeweils vorliegenden genetischen
CYP-Varianten eines Patienten wiederum lässt sich sein sogenannter Metabolisiererstatus ableiten, also die Geschwindigkeit, mit der er die entsprechenden pharmazeutischen Wirkstoffe verstoffwechseln kann. So werden
für CYP2D6 vier Typen von Metabolisierern unterschieden:
Langsame Metabolisierer (etwa 7% der Bevölkerung) besitzen zwei nicht
funktionelle Allele des CYP2D6-Gens. Es wird kein Protein gebildet und
der Metabolismus verläuft extrem langsam. Bei Gabe der Standarddosierung kann es daher zu Nebenwirkungen kommen, da sich der Wirkstoff
anreichert. Oder aber die Wirksamkeit der Therapie ist nicht ausreichend,
wenn es sich bei dem Medikament um ein Prodrug handelt, das erst durch
die Biotransformation in seine aktive Wirkform umgewandelt werden muss.
Intermediäre Metabolisierer (etwa 5 bis 10% der Bevölkerung) besitzen
ein nicht und ein eingeschränkt funktionelles Allel. Medikamente werden
daher mit reduzierter Aktivität verstoffwechselt.
Extensive (»normale«) Metabolisierer (etwa 80% der Bevölkerung) besitzen ein oder zwei voll funktionsfähige Allele.
Bei ultraschnellen Metabolisierern (etwa 2 bis 3% der Bevölkerung) sind
aufgrund einer Genamplifikation drei oder mehr Kopien funktionsfähiger
Gene vorhanden. Sie bauen Arzneimittel so schnell ab, dass die Standarddosis kaum wirken kann.
50 Molekulargenetische Untersuchungen
Auswahl von Wirkstoffen, die als Substrate der Enzyme CYP2D6, CYP2C9
oder CYP2C19 dienen
CYP2D6
CYP2C9
CYP2C19
Antiarrhythmika
(z. B. Flecainid)
NSAR und Coxibe
(z. B. Diclofenac, Ibuprofen, Celecoxib, Meloxicam)
Protonenpumpenhemmer
(Lansoprazol, Omeprazol,
Pantoprazol, Rabeprazol)
Antidepressiva
(z. B. Amitriptylin,
Clomipramin, Fluoxetin,
Venlafaxin)
Orale Antidiabetika
(z. B. Glibenclamid, Tolbutamid)
Antiepileptika
(z. B. Diazepam, Phenytoin)
Antipsychotika
(z. B. Haloperidol, Perphenazin, Risperidon)
Angiotensin-II-Blocker
(Losartan, Irbesartan)
Antidepressiva
(z. B. Amitriptylin, Citalopram, Clomipramin)
Betarezeptorenblocker (z.
B. Carvedilol, Metoprolol,
Propranolol)
weitere Wirkstoffe
(z. B. Amitriptylin, Fluvastatin, Tamoxifen, Warfarin)
Malariamittel (Proguanil)
Opioide
(z. B. Codein, Oxycodon, Dextromethorphan,
Tramadol)
weitere Wirkstoffe
(z. B. Cyclophosphamid,
Indometacin, Nelfinavir,
Progesteron, Propranolol,
Moclobemid)
weitere Wirkstoffe
(z. B. Chlorpromazin, Metoclopramid, Ondansetron,
Tamoxifen)
Quelle: Flockhart DA. Drug Interactions: Cytochrome P450 Drug Interaction Table. Indiana University School of Medicine (2007)
Indikation
Diskrepanz Medikamentendosierung und Serumspiegel, fehlende Medikamentenwirkung, unerwartete Nebenwirkungen (UAW), Dosisanpassungen
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR, Genotypisierung, Auftragsspezifikation durch Medikamentenangabe
methode
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Nelson, D. R. et al., Pharmacogenetics 6: 1-42, 1996
Blaisdell, J. et al., Pharmacogenetics 12: 703-711, 2002
Wrighton, S. A. et al., Arch. Biochem. Biophys. 306: 240-245, 1993
Molekulargenetische Untersuchungen 51
Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Atrophie (DRPLA)
DRPLA-Gen / ATN1-Gen (Atrophin 1-Gen;
Genort: 12p13.31; OMIM #125370, *607462)
Erbgang
Autosoma-dominant
Klinische
Bedeutung
Diese neurodegenerative in westlichen Ländern sehr selten auftretende
Erkrankung betrifft überwiegend die japanische Bevölkerungsgruppe. Der
Erbgang ist autosomal dominant und überlappt klinisch mit der Chorea
Huntington. Das Symptomspektrum kann innerhalb einer Familie sehr variabel sein, es umfasst Myoklonus-Epilepsie, Ataxie, Choreoathetose und
Demenz bei fortgeschrittener Erkrankung. Neuropathologisch wird eine
kombinierte Degeneration des dentatorubralen und pallidoluysialen Systems des ZNS beobachtet. Das Manifestationsalter liegt vorwiegend in der
zweiten Dekade. Die Krankheit folgt dem Phänomen der sogenannten
genetischen „Antizipation“, d. h. in aufeinanderfolgenden Generationen
kommt es, insbesondere bei Vererbung über den Vater, zu immer früherer
Krankheitsmanifestation. Molekulargenetisch kann eine CAG-Triplett-Verlängerung im kodierenden Bereich des verantwortlichen Atrophin-1- Gens
nachgewiesen werden. Normale Wiederholungen von 7 bis 35 CAG- Einheiten expandieren zu 48 bis 93 Tripletts und führen im entsprechenden
Protein zu einer pathologischen verlängerten Abfolge von PolyglutaminResten.
Indikation
Vorliegen einer DRPLA-entsprechenden neurologischen Symptomatik
Mutationen
CAG-Trinukleotidexpansion auf 48 bis 93 Repeats
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe (ca. 2 ml EDTA-Blut) wird die genomische DNA isomethode
liert. Ein den CAG-Triplett-Bereich beinhaltender Abschnitt des AtrophinGens wird mir Hilfe der PCR-Reaktion aus der genomischen DNA amplifiziert. Zur Bestimmung der Triplett-Länge wird eine Kapillarelektrophorese
des PCR-Produkts durchgeführt.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Naito et al., Neurology 32:798- 807, 1982
Nagafuchi et al., Nat Genet 6:14- 18, 1994
Komure et al., Neurology 45:143- 149, 1995
Wood et al., J Cell Biol. 150(5):938- 948, 2000
DPD-Defizienz siehe 5-Fluorouracil-Sensitivität
52 Molekulargenetische Untersuchungen
Ehlers-Danlos-Syndrom (klassischer Subtyp)
EDS Typ I und II
(COL5A1, Collagen V, alpha 1; Genort: 9q34.2-q34.3; COL5A2, Collagen V,
alpha 2; Genort: 2q31; OMIM #130000, *120215, *120190)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Ehlers-Danlos-Syndrom ist eine heterogene Gruppe von genetisch bedingten Bindegewebserkrankungen infolge einer Störung der Kollagenbiosynthese oder Kollagenvernetzung. Gemeinsame Kennzeichen sind die Hyperelastizität der Haut mit erhöhter Zerreissbarkeit, eine Überstreckbarkeit
der Gelenke, sowie die Neigung zu Hämatombildungen bis hin zu Rupturen der inneren Organe und der Gefäße.
Nach der „Villefranche-Klassifikation“ (s. Beighton et al., 1998) wurde das
Ehlers-Danlos Syndrom in sechs Haupttypen unterteilt. Diese Subtypen unterscheiden sich in den für die Erkrankung verantwortlichen Genen. Eine
klare Abgrenzung zwischen den einzelnen Subtypen aufgrund der Symtomatik ist durch die hohe phänotypische Variabilität der Erkrankung of
schwierig. Durch eine elektronenmikroskopische Untersuchung des Bindegewebes aus einer Hautbiopsie gelingt häufig die Zuordnung aufgrund
spezifischer Veränderungen der Kollagenfibrillen. Der molekulargenetische
Nachweis eines Gendefektes erlaubt ebenfalls eine eindeutige Typisierung
und ermöglicht zum anderen eine gezielte Untersuchung von Familienangehörigen und gegebenenfalls eine Pränataldiagnostik.
Etwa 80% der Patienten mit Ehlers-Danlos-Syndrom weisen den „klassischen“ Subtyp (ehemals EDS Typ I und II) auf.
Das Krankheitsbild ist gekennzeichnet durch eine starke Überdehnbarkeit
und leichte Verletzbarkeit der Haut mit Neigung zu Hämatombildung auf,
eine abnorme Wundheilung und eine atrophe Narbenbildung („ZigarettenPapier Narben“). Die Gelenke zeigen eine Hypermobilität und sowohl Gefäße als auch innere Organe können ebenfalls betroffen sein. Typ II unterscheidet sich von Typ I nur durch einen milderen Grad der Ausprägung.
Bei etwa 50% der Patienten mit einem klassischen Typ des Ehlers-Danlos-Syndroms sind Mutationen im COL5A1-Gen oder im COL5A2-Gen
nachweisbar, die zu einer verminderten Bildung oder der Bildung von
funktional defektem Typ 5 Kollagen führen. Mehr als 80% der gefundenen Mutationen betreffen das COL5A1-Gen. Neumutationen und ererbte
Mutationen sind dabei jeweils zur Hälfte vertreten. In Einzelfällen wurden
auch Mutationen im COL1A1-Gen nachgewiesen.
Indikation
Klinischer Verdacht auf ein Ehlers-Danlos-Syndrom Typ I oder II.
Mutationen
Punktmutationen innerhalb von COL5A1 und COL5A2
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Molekulargenetische Untersuchungen 53
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird genomische DNA isoliert und alle Exons des jemethode
weiligen Kollagen-Gens einschließlich der Exon/Intron-Spleissstellen amplifiziert. Die Mutationssuche erfolgt durch direkte DNA-Sequenzanalyse der
Amplifikationsprodukte.
Untersuchungs- Ca. 8-12 Wochen, bei bekannter familiärer Mutation 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Wenstrup and De Paepe, in GeneReviews (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1244/)
Malfait et al., Genet Med 12:597-605, 2010; Richards et al., J Med Genet 35:846-848,
1998; Beighton et al., Am J Med Genet 77:31-37, 1998
Faktor V-LEIDEN-Mutation (APC-Resistenz)
Faktor V-Gen (Genort: 1q23; MIM +227400)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Der bislang am häufigsten beschriebene genetisch bedingte Risikofaktor für
Thrombose ist die Resistenz gegen aktiviertes Protein C (APC). Bei der zugrundeliegenden Mutation (die sog. Faktor V-LEIDEN-Mutation) handelt es
sich um einen Basenaustausch (G → A) an Position 1691 im Faktor V- Gen.
Dieser führt zu einem Aminosäurenaustausch von Arginin an Position 506
zu Glutamin im Faktor V-Protein, wodurch die Inaktivierung des Gerinnungsfaktors V durch APC vermindert ist. Die hohe Prävalenz dieser Mutation in der kaukasischen Bevölkerung führt dazu, dass etwa jeder Zwanzigste
heterozygoter Mutationsträger ist und nach bisherigen Berechnungen ein
ca. 5-10fach erhöhtes Thromboembolierisiko hat. Ca. 60% der Patienten
mit einer familiär gehäuften Neigung zu Venenthrombosen zeigen diesen
Defekt in heterozygoter Form. Sehr selten findet sich eine Homozygotie,
die das Thromboembolierisiko um bis zu 80fach erhöht. Rund 15-25 Prozent aller Träger einer Faktor-V-LEIDEN-Mutation tragen zusätzlich eine
Mutation im Faktor-II-Gen. Es erscheint daher sinnvoll, im Fall einer FaktorV-Überprüfung parallel eine Faktor-II-Austestung zu veranlassen.
Indikation
Siehe Heriditäre Thrombose-Risiken
Mutationen
G1691A-Mutation
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA wird ein Abschnitt des Faktor V-Gens, der den
methode
Mutationsort beinhaltet, mittels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt
über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische
Sonden.
Untersuchungs- 2-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Bertina et al., Nature 369:64- 67, 1994; De Stefano et al., Semin Thromb Hemost 24:367379, 1998; Rosendaal , Blood 85:1504- 1508, 1995; Spannagl, Münch med Wschr
138(43):703/31, 1998
54 Molekulargenetische Untersuchungen
5-Fluorouracil-Sensitivität (DPD-Defizienz)
DPYD-Gen (Dihydropyrimidin-Dehydrogenase-Gen;
Genort: 1p21.3; OMIM #274270)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Zur Behandlung maligner Tumoren werden häufig 5-Fluorouracil (5-FU)haltige Zytostatika verwendet. Im Normalfall kann 5-FU in der Leber der
Patienten rasch zu inaktiven Produkten abgebaut werden, wobei das
Enzym Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) eine wesentliche Rolle spielt. Patienten mit erniedrigter DPD-Aktivität metabolisieren 5-FU
schlechter, was zu stark erhöhten 5-FU Plasmaspiegeln und zu schwersten bis lebensbedrohlichen Nebenwirkungen führen kann. Im DPYD-Gen
wurden mehrere Mutationen als Ursache einer verminderten Enzym-Aktivität beschrieben. Dabei findet man bei ca. 50% aller Mutationsträger mit
einer DPD-Defizienz eine oder zwei Mutationen an Position c.1905+1
(IVS14+1G>A, „Exon 14-Skipping Mutation“) im DPYD-Gen. Infolge der
Mutation kommt es zu einem fehlerhaften Herausschneiden (splicing) von
Exon 14 aus der mRNA und damit zur Synthese eines inaktiven Proteins. Die Heterozygotenfrequenz dieser DPYD-Mutation liegt bei ca. 1,4%.
Durch den Nachweis der Mutation vor einer Behandlung mit 5-FU können
schwere Nebenwirkungen durch eine entsprechend angepasste Therapie
vermieden werden. Die Untersuchung der Exon 14-skipping Mutation
erfasst etwa 50% der Risikopatienten. Andere Mutationen im DPYD-Gen
sind daher nicht ausgeschlossen. Darüberhinaus ist eine erhöhte 5-FU Sensitivität nicht immer auf eine DPYD-Defizienz zurückzuführen.
Indikation
Geplante Chemotherapie mit Fluoropyrimidin-haltigen Medikamenten
Mutationen
IVS14+1G>A Mutation (c.1905+1G>A, “DPYD Exon 14-skipping”)
Material
1-2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Innerhalb des
methode
DPYD-Gens auf Chromosom 1p21.3 wird ein Abschnitt, der den Mutationsort beinhaltet, mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Der Nachweis der IVS14+1G>A Mutation erfolgt mittels Restriktionsendonukleaseverdau und Agarosegelelektrophorese
Untersuchungs- 3-5 Tage
dauer
Literaturhinweise
Amstutz et al., Pharmacogenomics, 12:1321-1336, 2011
Kumar et al., Int J Pharmacol 3:130-136, 2007
Bosch et al., Mol Diag Ther 11:105-108, 2007
Molekulargenetische Untersuchungen 55
Fragiles-X-Syndrom
(Martin-Bell-Syndrom, Marker-X-Syndrom)
FMR1-Gen (Fragile X Mental Retardation-1;
Genort: Xq27.3; OMIM +309550, #300624)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
X-chromosomal semidominant
Klinische
Bedeutung
Das Fragile-X Syndrom ist eine der häufigsten genetisch bedingten Ursachen für geistige Behinderung mit einer geschätzten Häufigkeit von etwa
1:4000 bis 1:6000. Ursache der Erkrankung ist fast immer die Verlängerung
einer Trinukleotidsequenz (CGG-Repeat) im 5’-untranslatierten Bereich
des FMR1-Gens, das auf dem X-Chromosom lokalisiert ist (FRAXA-Locus).
Normalpersonen haben 5 bis 49 CGG-Kopien. Allele mit 50 bis 54 CGGRepeats bezeichnet man als Grauzonenallele, bei denen eine Expansion
zur Vollmutation in der Folgegeneration bisher nicht beobachtet wurde.
Eine Verlängerung auf 55 bis 200 CGG-Tripletts wird als Prämutation bezeichnet, die keine Auswirkung auf die neuronale Entwicklung hat. Jedoch
können infolge von Überexpression prämutierter FMR1-Allele neurodegenerative Veränderungen hervorrufen werden und zum Fragilen-X-assoziierten Tremor/Ataxie-Syndrom (FXTAS) führen.
Beim Vorliegen einer Prämutation tritt bei Frauen häufiger eine vorzeitige Ovarialinsuffizienz (Fragile-X associated Primary Ovarian Insufficiency,
FXPOI) auf, wobei für längere Allele ein niedrigeres Risiko beschrieben
wurde. Die Vererbung eines prämutierten FMR1-Allels über die Mutter
führt mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer weiteren Expansion der CGGRepeats auf 200 und mehr Tripletts (Vollmutation) und zur Symptomatik
des Fragilen-X-Syndroms.
Während Frauen mit einer Vollmutation auch asymptomatisch sein können, weisen Männer mit einer Vollmutation immer eine mehr oder weniger
stark ausgeprägte Symptomatik des Fragilen-X Syndroms auf. Im Gegensatz
zu FXTAS und FXPOI, die assoziiert sind mit einer Erhöhung der m-RNA für
FMR1 bei vorliegender Prämutation, wird bei einer Vollmutation der Promotorbereich des FMR1-Gens meist methyliert und damit die Translation
des FMR1-Proteins (FMRP) blockiert. In seltenen Fällen sind Deletionen
oder Punktmutationen für den Verlust des funktionellen FMR1-Genproduktes beim Fragilen-X-Syndrom verantwortlich.
Indikation
Mentale Retardierung/Entwicklungsverzögerung, Lernschwierigkeiten,
Sprachstörungen, Hyperaktivität, faziale Dysmorphien, Makroorchidie,
Autismus, spätmanifestes Tremor/Ataxie-Syndrom, prämature Menopause
Mutationen
CGG-Trinukleotid-Expansion auf mehr als 200 Repeats (Vollmutation)
CGG-Trinukleotid-Expansion von 55-200 Repeats (Prämutation)
Material
10 ml EDTA-Blut
56 Molekulargenetische Untersuchungen
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert.
methode
Stufe 1: Die Anzahl der CGG-Repeats wird zunächst mittels PCR und anschließender Kapillarelektrophorese bestimmt.
Stufe 2: Falls bei weiblichen Patienten nur eine Allelgröße oder bei männlichen Patienten kein PCR-Produkt nachweisbar ist, wird die DNA zusätzlich
mittels Southern-Blot-Hybridisierung auf verlängerte CGG-Repeats untersucht.
Eine pränatale Untersuchung ist bei einer bekannten maternalen CGG-Repeatexpansion möglich. Bei Chorionzotten muss gleichzeitig eine mütterliche Kontamination durch eine Untersuchung von mütterlichem Blut ausgeschlossen werden.
Untersuchungs- Stufe 1:
PCR 1-2 Wochen
dauer
ggf. Stufe 2: Southern Blot 3-4 Wochen
Literaturhinweise
Steinbach and Gläser, medgen 21:276-283, 2009
Oostra and Willemsen, Biochim Biophys Acta 1790:467-477, 2009
Fernandez-Carvajal et al., J Mol Diagnos 11:306-310, 2009
Wells, J BiolChem 284:7407-7411, 2009
Nolin et al., Am J Hum Genet 72:454-464, 2003
Friedreich'sche Ataxie
FXN-Gen (Frataxin;
Genort: 9q13; OMIM *606829, #229300)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die Friedreich‘sche Ataxie (FRDA) ist eine neurodegenerative Erkrankung
mit einer Inzidenz von 1:50.000 die am häufigsten vorkommende Form
der hereditären Ataxie in der kaukasischen Bevölkerung.
Betroffene zeigen eine progressive Gang- und Extremitätenataxie, Areflexie, Muskelschwäche, Verlust des Lageempfindens, Dysarthrie und einen
pathologischen Babinskireflex. Oft wird eine hypertrophe Kardiomyopathie als Todesursache festgestellt. Erste Symptome treten meist in der Pubertät und typischerweise vor dem 25. Lebensjahr auf, es sind auch Fälle
mit verspäteter Erstmanifestation bekannt.
Bei FRDA sind die größten Neurone im menschlichen Körper von Läsionen
betroffen. Hierbei handelt es sich um die in den dorsalen Wurzelganglien
des Rückenmarks lokalisierten Neurone und ihre korrespondierenden Axone, welche von den peripheren sensorischen Endigungen durch die sensorischen Nerven und die Hinterstränge des Rückenmarks bis zur Medulla
oblongata verlaufen. Des Weiteren degenerieren Neurone der spinocerebellären Bahn und der Pyramidenbahnen.
Bei ca. 96% der Patienten kann molekulargenetisch eine homozygote Expansion einer GAA-Nukleotidfolge im ersten Intron des FXN-Gens nachgewiesen werden.
Molekulargenetische Untersuchungen 57
Klinische
Bedeutung
Bei Normalpersonen finden sich ca. 5 bis 33 GAA-Tripletts im FXN-Gen.
Krankheitsverursachende Verlängerungen von ca. 66 bis 1700 Tripletts entstehen durch Expansion prämutierter Allele von ca. 34 bis 65 ununterbrochenen GAA-Tripletts. Der Schweregrad der Erkrankung korreliert mit der
Anzahl der GAA-Tripletts.
Die Expansion bewirkt eine Unterdrückung der FXN-Genexpression und
somit den Ausfall des entsprechenden Proteins. Infolgedessen wird zudem
das Eisen-Gleichgewicht in den Mitochondrien gestört und die Anfälligkeit
für oxidativen Stress erhöht. Ob diese Dysregulation auch für die Entstehung der FRDA eine ursächliche Rolle spielt, ist derzeit noch nicht geklärt.
Indikation
V. a. Friedreich‘sche Ataxie
Mutationen
GAA-Repeat-Expansion im FXN-Gen
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein die GAA-Trimethode
plettwiederholung beinhaltender Abschnitt des FXN-Gens wird mittels PCR
amplifiziert. Die Längenbestimmung des PCR-Produktes und die daraus
resultierende Anzahl der GAA-Repeats erfolgt mittels Agarosegelelektrophorese.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Schmucker and Puccio, Hum Mol Genet 19: R103-R110, 2010
Epplen et al., Hum Genet 99:834-836, 1997
Montermini et al., Hum Mol Genet 6:1261-1266, 1997
Campuzano et al., Science 271:1423-1427, 1996
Fruktoseintoleranz
Aldolase B-Gen (ALDOB; Genort: Locus 9q22.3; OMIM #229600)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Hereditäre Fruktoseintoleranz (HFI) tritt bis zu schätzungsweise bei einem
von 20.000 Neugeborenen auf. Durch den Mangel bzw. Aktivitätsverlust
eines Enzyms für die Fruktoseverwertung kann es nach Aufnahme von
Fruktose primär zu verschiedensten Magen-Darm-Störungen kommen und
auch zur Hypoglykämie, deren Folgen u. a. Übelkeit, Erbrechen, Zittern,
Schwitzen, Blässe, Lethargie und Krampfanfälle sein können. Bei einer
weiteren Aufnahme von Fructose können schwere Schäden an Leber (z.
B. Hepatomegalie oder Ikterus) und Niere wie z. B. Proteinurie die Folge
sein. Die Entwicklung derartiger Schädigungen ist progredient. Von invasiven Diagnoseverfahren wie dem Fruktosetoleranz-Test oder der Messung
der Aldolase B Enzymaktivität in einer Leberbiopsie ist vor allem bei Neugeborenen mit Verdacht auf HFI abzuraten.
58 Molekulargenetische Untersuchungen
Indikation
Gastrointestinale Beschwerden und Hypoglykämie mit Übelkeit, Erbrechen, Blässe, Schwitzen, Zittern, Lethargie und z. T. Krampfanfällen nach
fruktosehaltigen Mahlzeiten
Mutationen
Bislang wurden 35 Mutationen in 8 kodierenden Exons des Alodolase BGens beschrieben, wobei allerdings ca. 95% der HFI auf vier Mutationen
zurückzuführen sind: A149P und A174D (Exon 5) sowie N334K und D4E4
(Exon 9).
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Die DNA-Bereiche werden mittels PCR amplifiziert und Biotin markiert.
methode
Der spezifische Nachweis erfolgt durch eine reverse Hybridisierung der
Amplifikate mit allelspezifischen auf einer Membran fixierten Sonden. Die
DNA-Fragmente werden mit Hilfe von an Streptavidin gekoppelter alkalischer Phospatase in einer Farbreaktion nachgewiesen.
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Esposito, G et al.; Hum Mutat 24:534, 2004. Santer, R. et al.; Hum Mutat 25:594 2005.
Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel
G6PD-Gen (Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase;
Genort: Xq28; OMIM +305900)
Erbgang
X-chromosomal, meist dominant
Klinische
Bedeutung
Der Gendefekt manifestiert sich in einer Verminderung der Glukose-6Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität (G6PD) insbesondere in den Erythrozyten. Dadurch kommt es zu einer Störung des GIukose-6-Phosphat-Abbaus
über den Pentoseweg und damit zu einer verminderten Bereitstellung des
Coenzyms NADPH, das eine Rolle bei der Stablisierung des reduzierten
Glutathions spielt. Auf diese Weise entsteht eine erhöhte Anfälligkeit für
Oxydationsschäden, die vor allem in älteren Erythrozyten bei Einwirkung
bestimmter oxydationsfördernder Substanzen zum hämolytischen Zerfall
führt.
Die Stabilitäts- bzw. Aktivitätsminderung der meisten über 300 bekannten
Isoenzyme ist unterschiedlich, und damit variiert die Schwere des Krankheitsbildes. Bei den beiden Haupttypen besteht noch eine Aktivität von
3-4% (mediterraner Typ, in Mittelmeerländern und bei der mongoloiden
Rasse) bzw. 15% (afrikanischer Typ) des Normalwertes. Das Auftreten dieser Defekte ist in Malaria-Regionen deutlich erhöht und betrifft ca. 400
Millionen Menschen weltweit.
Bei Einwirkung bestimmter Medikamente und Verbindungen und zusätzlich beim mediterranen Typ (Favismus) bei Verzehr und Berührung von
Faba-Bohnen kommt es zur hämolytischen Krise, deren Schwere durch die
Art des G6PD-Defektes und durch andere genetische und peristatische
Faktoren (Blutglukose-Konzentration, Infektionen) bestimmt wird. Akute
Phasen mit vor allem Oberbauchbeschwerden, Anämie und prolongiertem
Ikterus können schon bei Neugeborenen auftreten.
Molekulargenetische Untersuchungen 59
Indikation
Angeborene, nicht-sphärozytäre, hämolytische Anämien, auch durch Medikamentenunverträglichkeit oder Infektionen hervorgerufene, akut auftretende hämolytische Krisen
Mutationen
Man kennt bisher über 300, meist regional begrenzt auftretende Varianten
der G6PD.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung der kodierenden Exons 2-13
methode
Untersuchungs- Ca. 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Boyer, S. H., Porter, I. H., Weilbaecher, R. G., Proc. Nat. Acad. Sci. 48: 1868-1876, 1962
Beutler, E., Mathai, C. K., Smith, J. E., Blood 31: 131-150, 1968
Prokop O. et al., Lexikon der Syndrome und Fehlbildungen; Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York; 7. Auflage S. 475-476
Glutathion-S-Transferase (M1, P1, T1)
GSTM1-Gen (Glutathion-S-Transfer. M1; Genort: 1p13.3; OMIM *138350)
GSTP1-Gen (Glutathion-S-Transfer. P1; Genort: 11q13.2; OMIM *134660)
GSTT1-Gen (Glutathion-S-Transfer. T1; Genort: 22q11.23; OMIM *600436)
Klinische
Bedeutung
Glutathion S-Transferasen sind Enzyme, die in vielen Geweben vorkommen und reduziertes Glutathion an körpereigene und körperfremde Substanzen konjugieren. Dadurch werden die Substanzen weniger toxisch und
es entsteht eine erhöhte Wasserlöslichkeit. Die Ausscheidung körpereigener und körperfremder Stoffe wird dadurch erleichtert.
Etwa 50% der europäischen Bevölkerung tragen eine homozygote Deletion
des GSTM1-Gens. Bei Exposition mit Fremdstoffen wie z. B. Benzpyren,
polyzyklischen Kohlenwasserstoffen kann eine fehlende GSTM1 Enzymaktivität zu einer verstärkten Toxizität aufgrund DNA-schädigender Intermediärprodukte beitragen.
Typische Fremdstoffe, die durch die Enzyme der Glutathion S-Transferasen
T1 metbolisiert werden, sind Methylbromid, Methylchlorid, Methyliodid,
Ethylendibromid, Propylenoxid, Ethylenoxid, Dichlormethan, Bromodichlormethan sowie weitere halogenierte Kohlenwasserstoffe, Organophophate und Epoxide. Etwa ein Drittel der Kaukasier weisen eine homozygote Deletion des GSTT1 Gens auf.
GSTP1 ist die vorherrschende GST in extrahepatischen Geweben wie Lunge und Oesophagus und konjugiert reaktive Metabolite aus der zur Gruppe der Alkylanzien gehörenden Zytostatika (z. B. Ifosfamid, Busulfan und
Chlorambucil). Das Risiko, nach einer Chemotherapie an einer akute sekundären myeloischen Leukämie zu erkranken, ist für Personen, die eine
Variation im GSTP1-Gen tragen, zwei- bis dreifach erhöht. Auch eine Assoziation zum Oesophagus-Ca konnte nachgewiesen werden.
60 Molekulargenetische Untersuchungen
Indikation
Intoxikation, unerwartete Nebenwirkungen nach Medikamentengabe, verstärkte Reaktion bei Umweltgiften
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden die Sequenzbereiche von GSTM1,
methode
GSTP1 und GSTT1 mittels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über
eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Mannervik, B., Adv. Enzym. Relat. Areas Molec. Biol. 57: 357-417, 1985
Allan, J. M.et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 98: 11592-11597, 2001
Pemble, S. et al., Biochem. J. 300: 271-276, 1994
Li et al. BMC Genetics 2010, 11:47
Hereditäre Hämochromatose
HFE-Gen
Genort: 6p21.3; MIM +235200
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die hereditäre Hämochromatose ist eine angeborene Eisenspeicherkrankheit mit autosomal-rezessivem Erbgang. Eine frühzeitige Diagnosestellung
und entsprechende Therapie kann die schweren Organschäden (Leberzirrhose, hepatozelluläres Karzinom, u. a.) verhindern, die als Folge der
unbehandelten Erkrankung auftreten können. In der kaukasischen Bevölkerung beträgt die Heterozygotenfrequenz ca. 1:10 und die Homozygotenfrequenz 1:200 bis 1:400.
Bei ca. 64-92% der Hämochromatose-Patienten findet man im sog. HFEGen eine homozygote Punktmutation, die im entsprechenden Protein zu
einem Aminosäureaustausch von Cystein nach Tyrosin an Position 282
(C282Y) führt. Hier konnte man ein deutliches Nord- Süd- Gefälle der Mutationsfrequenz (64% in Italien, 92% in Schweden) beobachten.
Außerdem findet man bei weiteren 4-5% der Patienten die C282Y- Mutation nur auf einem Allel und auf dem anderen Allel eine zweite Punktmutation, die zu einer Substitution des Histidins an Position 63 zu Asparaginsäure (H63D) führt. Diese kombinierte Heterozygotie C282Y/H63D führt zu
einem erhöhten Risiko, eine hereditäre Hämochromatose zu entwickeln,
jedoch mit einer geringen Penetranz von 0,5-1%. Selten entwickeln H63D
Homozygote eine signifikante Eisenüberladung.
Eine dritte Mutation, die an Position 65 zu einem Austausch von Serin
durch Cystein führt (S65C) kann ebenfalls in seltenen Fällen zu einer Hämochromatose führen. Vergleichbar mit H63D ist auch die S65C-Mutation in Kombination mit einer heterozygot vorliegenden C282Y-Mutation
mit einer milden Form der Hämochromatose assoziiert. Die sehr seltene
E168X-Mutation enthält ein Stopcodon und kommt vorwiegend in Südeuropa vor.
Molekulargenetische Untersuchungen 61
Indikation
Klinisch und laborchemisch begründeter Verdacht auf Hämochromatose,
vor allem bei Hepatopathien
Mutationen
C282Y, H63D, S65C, E168X
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche (C282Y,
methode
H63D, S65C, E168X) mittels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über
eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 2-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Frosst et al., Nat Genet 10:111- 113, 1995; Fodinger et al., J Nephr 13(1):20- 33, 2000;
Fletcher, Kessling, Hum Genet 103:11- 21,1998
Hereditäre Thromboembolie-Risiken
Die Ursachen für eine erhöhte Thromboseneigung können genetisch bedingt (hereditär) oder erworben sein.
Erworbene
Risikofaktoren,
die die Thromboseneigung
verstärken sind:
• erhöhtes Alter
• erhöhte Gerinnungsaktivität durch Einnahme oraler östrogenhaltiger
Kontrazeptiva
• Immobilisation bei Krankheit oder nach operativen Eingriffen
•Rauchen
•Adipositas
•Gravidität
•Tumorerkrankungen
•Varizen
•Infektionen
• vorangegangene Thrombembolie
•Anti-Phospholipid-Syndrom
Zu den wichtigsten und häufigsten genetischen Risikofaktoren für Venenthrombosen zählen die Faktor V-LEIDEN-Mutation (siehe dort) und die
Prothrombin- Mutation G20210A (siehe dort). Wesentlich seltener (bei
weniger als 10% der Patienten mit Thrombosen) findet man Defekte wie
Protein C-, Protein S- sowie AT III- Defizienz. Zudem ergaben wissenschaftliche Studien bisher kontrovers diskutierte Ergebnisse über die Beteiligung
der MTHFR (Methylentetrahydrofolat-Reduktase) C677T- und A1298CMutation (Hyperhomocysteinämie) (siehe dort) und der PAI-Mutation
(siehe dort) an der Neigung zu venösen Thrombosen.
62 Molekulargenetische Untersuchungen
Indikationen für • das Auftreten von Thromboembolien bereits im jüngeren Alter (<45
die Abklärung
Jahre)
eines geneti• familiäre Thromboembolieneigung
schen Risikos
• Thromboembolien im Zusammenhang mit einer Schwangerschaft
sind:
• Thromboembolien im Zusammenhang mit der Einnahme oraler Kontrazeptiva
• Thromboembolien an atypischen Stellen (z. B. Sinusvenenthrombose)
• mehrere vorangegangene gynäkologisch ungeklärte Fehlgeburten
•Plazentainsuffizienz, vorzeitige Plazentalösung, Gestose
Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv
LDLRAP1-Gens (ARH-Gen)
Genort: 1p36.11 ; OMIM 603813
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
In selteneren Fällen kann eine Hypercholesterinämie auch auf autosomalrezessive Mutationen im LDLRAP (ARH)-Gen zurückzuführen sein. Dieses
Gen kodiert für ein LDL-Rezeptor-Adaptor-Protein, welches für die Aufnahme der „low-density“-Lipoproteine (LDL) in die Zelle mitverantwortlich ist.
Klinisch ähnelt der Phänotyp dem der LDLR-Mutation, typischerweise sind
Gesamt- und LDL-Cholesterin-Werte jedoch weniger stark erhöht und die
Triglyzerid-Werte zumeist normal. Bei einem Drittel der Patienten ist das
HDL-Cholesterin stark erniedrigt. Klinisch können tuberöse, tendinöse und
planare Xanthome, ein Arcus lipoides corneae und Xanthelasmen auftreten. Auch über Gelenkschmerzen wird berichtet. ARH-Patienten sprechen
deutlich besser auf eine lipidsenkende Therapie an als Träger einer LDLRMutation.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Nach Isolierung der genomischen DNA des Patienten werden die neun
methode
Exons des LDLRAP1-Gens amplifiziert und sequenziert.
Untersuchungs- Ca. 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Nagai M et al., Mol. Biol. Cell 1, vol. 14 no. 12 4984-4996, 2003;
Eden, E.R: ET AL., Am. J. Hum. Genet. 68: 653-660, 2001;
Garcia, C. K. et al., Science 292: 1394-1398, 2001;
Tada et al., Circ. Cardiovasc. Genet. 5: 35-41, 2012
Molekulargenetische Untersuchungen 63
Hyperhomocysteinämie (MTHFR C677T und
A1298C-Mutationen)
Methylentetrahydrofolat Reduktase-Gen
Genort: 1p36.3; MIM +236250
Klinische
Bedeutung
Das Enzym 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase wird durch eine C →
T Punktmutation an Position 677 des entsprechenden Gens und dem daraus resultierenden Aminosäureaustausch von Alanin an Position 223 durch
Valin zu einer thermolabilen Variante mit 50% erniedrigter Aktivität. Eine
zweite Punktmutation A → C an Position 1298 führt ebenfalls zu einer
signifikanten Aktivitätsverminderung des Enzyms. Letztendliche Folge ist
die Entstehung einer Hyperhomocysteinämie durch eine beeinträchtigte
Regeneration von Methionin aus Homocystein.
Einige epidemiologische Studien konnten zeigen, dass bei homozygoten
Träger der MTHFR (C677T)- oder der MTHFR (A1298C)-Mutation oder
kombiniert heterozygoten Trägern beider MTHFR-Mutationen (CompoundHeterozygotie) dann ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Thrombosen und arteriosklerotischen Gefäßveränderungen vorhanden ist, wenn
infolge dieser Mutationen durch eine beeinträchtigte Regeneration von
Methionin aus Homocystein eine Hyperhomocysteinämie vorliegt. Frauen
mit einer homozygoten A1298C- oder C677T-Mutation oder mit beiden
Mutationen (Compound-Heterozygotie) und bestehender Hyperhomocystinämie(!) haben zusätzlich eine Risikoerhöhung für wiederholte Aborte
und bei vorhandener genetischer Prädisposition – auch Nachkommen mit
Neuralrohrdefekten (Dysraphie-Syndrom)
Indikation
V. a. Hyperhomocysteinämie
Mutationen
A1298C- und C677T-Mutation
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomische DNA werden innerhalb des MTHFR-Gens zwei Abmethode
schnitte, die jeweils einen der beiden Mutationsorte beinhalten, mit Hilfe
der PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 2-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Feder et al., Nat Genet 13:399- 408, 1996
Jazwinska et al., Nat Genet 14:249- 251, 1996
Beutler, Lancet 349:296- 297, 1997
Beutler, Am J Hum Genet 61:762- 764, 1997
64 Molekulargenetische Untersuchungen
Hypochondroplasie
FGFR3-Gen (Fibroblastenwachstumsfaktor Rezeptor 3;
Genort: 4p16.3; OMIM #146000)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Hypochondroplasie ist eine autosomal dominant ererbte Chondrodystrophie. Der Phänotyp ist der Achondroplasie ähnlich, aber meist milder.
Die klinische Diagnose bzw. die Unterscheidung dieser zwei Skelettdysplasien bleibt trotz klinischer Charakteristika und radiologischer Hintergrundbefunde oft unsicher. Der Schädel ist normal groß oder häufiger übergroß
mit normaler Gesichtsbildung. Bei ca. 70% der Betroffenen konnten zwei
prädominante Punktmutationen (Transitionen) von C1620A oder C1620G
im FGFR3- (fibroblast growth factor receptor) Gen nachgewiesen werden.
Im entsprechenden Protein führen beide o. g. Mutationen zu einem Aminosäureaustausch von Asparagin in Position 540 durch Lysin. 30% der
Patienten haben entweder Mutationen an anderen Positionen des FGFR3
-Gens oder in anderen Genen. Da eine klare Abgrenzung zwischen einer
Hypochondroplasie und einer milden Form der Achondroplasie oft nicht
möglich ist, sollte bei Patienten mit Verdacht auf Hypochondroplasie nach
einem Ausschluss der Asn540Lys und Ile538Val-Mutationen ggf. auch eine
Achondroplasie-Diagnostik durchgeführt werden.
Ähnlich wie bei der Achondroplasie wird auch bei Hypochondroplasie
eine Zunahme der Neumutatiosrate bei erhöhtem väterlichem Alter beobachtet.
Indikation
Dysproportionierter Kleinwuchs mit verkürzten Gliedmaßen; weniger ausgeprägte Symptomatik als bei Achondroplasie.
Mutationen
C1620A bzw. C1620G (Asn540Lys), A1612G (Ile538Val)
Material
Ca. 2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Exon 13 des
methode
FGFR3-Gens wird mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert.
Die Exonsequenz wird auf das Vorliegen von Mutationen an den Nukleotidpositionen 1612 und 1620 untersucht.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Grigelioniene et al., Hum Mut 11:333, 1998
Bellus et al., Nature Genet. 10:357-359, 1995
Prinos et al., Hum Mol Genet 4:2097-2101, 1995
Molekulargenetische Untersuchungen 65
IL28B (Interleukin 28B Genotypisierung)
IL28B-Gen, Interferon-lambda-3 (IFN-lambda-3)
Genort: OMIM 609532
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Das Hepatitis C-Virus (HCV) verursacht eine Infektionskrankheit mit 5000
Erstinfektionen pro Jahr, die sich durch eine hohe Chronifizierung auszeichnet und im Verlauf zu Leberzirrhose und Leberzellkarzinom führen
kann. Es wurde festgestellt, daß SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
in der IL28B Genregion auf Chromosom 19 als Prognosemarker für die
Therapie identifiziert wurden.
Der IL28B-Polymorphismus (C/C, C/T, T/T) in der Region des IL28B-Gens
rs12979860 (recessive spotting) im menschlichen Genom ist mit der Wirksamkeit (Sustained Virological Response) assoziiert. Patienten mit dem
C/C-Genotyp zeigen einen deutlich erhöhten dauerhaften IFN/RBV-Therapieerfolg als Patienten, die das T-Allel tragen. Die C/C-Allel-Träger erreichen
eine höhere Rate an Spontanremissionen der Erkrankung.
Indikation
Akute Hepatitis C-Infektion:
Nachweis IL28B-C/T-Polymorphismus und Entscheidungshinweis über den
optimalen Zeitpunkt der antiviralen Therapie
Chronische Hepatitis C-Infektion:
Abschätzung des Erfolgs bei Therapiebeginn und -verlauf
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA wird ein Abschnitt im Bereich der IL28B-Genmethode
region amplifiziert. Der Nachweis des IL28B-Polymorphismus erfolgt durch
Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Thomas DL, et al.; Nature 2009; 461(7165): 798-801
Ge D, et al.; Nature 2009; 461(7262): 399-401
Suppiah V, et al.; Nature Genetics 2009; 41: 1100 – 1104
66 Molekulargenetische Untersuchungen
Interleukin 1-Polymorphismus
IL1A-, IL1B-, IL1RN-Gen (Interleukin-Gencluster;
Genort: 2q14; OMIM *147760, *147720, *147679)
Klinische
Bedeutung
IL1A ist 1 von 2 strukturell verschiedenen Formen von IL1, die andere ist
IL1B (147720). Die IL1A- und die IL1B-Proteine werden durch eine Vielfalt
von Zelltypen synthetisiert, einschließlich aktivierten Macrophagen, Keratinocyten, stimulierten B Lymphozyten und Fibroblasten, sie sind starke
Vermittler der Entzündung und Immunität.
Der Interleukin-1-Rezeptorantagonist ist ein Protein welches an den IL1Rezeptor bindet und die Bindung der Interleukine IL1-alpha und IL1-beta
verhindert. Als Folge wird die biologische Aktivität dieser beiden Zytokine
bei immunologischen und entzündlichen Antworten neutralisiert.
Assoziation von IL1A Polymorphismen mit Parodontitis:
Kornman u. a. (1997) wiesen darauf hin, dass genetischer Polymorphisms
der IL1A- und der IL1B-Gene mit dem Ausmaß der Parodontitis bei erwachsenen Nichtrauchern korreliert werden kann. Der IL1B-Polymorphismus wurde IL1B+3953 genannt, und der IL1A-Polymorphism wurde IL1A889 genannt. Wie man beobachtete, hatten Nichtraucher im Alter vom 40
bis 60 Jahren, die das ‚2‘ Allel (entweder homozygot oder heterozygot) an
beiden Loci trugen, ein fast 19mal höheres Risiko einer schweren Periodontitis zu entwickeln im Vergleich zu Homozygoten für ‚1‘ Allel entweder
an einem oder beiden dieser Loci.
Indikation
V. a. erhöhte Parodontitis-Anfälligkeit
Mutationen
IL1A C889T; IL1B C3953T; IL1RN T2018C
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- DNA-Isolierung aus der Patientenprobe – Multiplex-Amplifikation mit
methode
Biotin-markierten Primern – Nachweis der Polymorphismen IL1A-889,
IL1B+3953 und IL1RN +2018 mittels reverser Hybridisierung
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Kornman, K. Set et al.; J. Clin. Periodont. 24: 72-77, 1997
Molekulargenetische Untersuchungen 67
Kardiomyopathie, familiär hypertroph
MYH7-, MYBPC3-, TNNT2-, TNNI3-Gene (Genorte: 14q11.2, 11p11.2,
1q32.1, 19q13.42; OMIM #192600, *160760, *600958, *191045, *191044)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) wird typischerweise durch
die Anwesenheit einer nicht erklärbaren linksventrikulärer Hypertrophie
definiert, die in Abwesenheit einer anderen kardialen oder systemischen
Erkrankung auftritt, welche fähig wäre diese Erkrankung zu verursachen.
Die klinischen Manifestationen reichen von Dyspnoe, Synkope, Kollaps,
unangenehmen Herzklopfen und Thoraxschmerz bis hin zum plötzlichen
Herztod infolge einer ventrikulären Tachyarrhythmie. Sie werden leicht
durch körperliche Belastung ausgelöst. Die Krankheit führt zu leichter bis
mäßiger Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit. Die HCM wird
autosomal-dominant mit variabler Penetranz und Expressivität vererbt.
Ursächlich beteiligt sind die Gene für eine ganze Anzahl von SarkomerProteinen (Schwere Kette des Beta-Myosins, Leichte Kette des Myosins,
Kardiale Troponine T und I, Kardiales Protein C, Alpha- Tropomyosin, Kardiales Aktin, Titin)..
Indikation
Verdacht auf familiär bedingte hypertrophe Kardiomyopathie
Mutationen
Bislang wurden im Zusammenhang mit HCM ca. 650 ursächliche Mutationen in 15 verschiedenen Genen identifiziert, die bis auf zwei Gene
ausschließlich für kardiale Proteine der Sarkomere kodieren. Über 85%
der bisher beschriebenen Mutationen befinden sich in den Genen für die
schwere Kette des ß-Myosins (MYH7), das Myosinbindeprotein-C (MYBPC3), Troponin T (TNNT2) und Troponin I (TNNI3). Ca. 50% der Mutationen können in der ersten Stufe der Diagnostik, welche eine Mutationssuche in 16 Exons einschließt, detektiert werden. Insgesamt können derzeit
im Rahmen der Routinediagnostik Mutationen in ca. 55% aller HCM-Fälle
nachgewiesen werden.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus genomischer DNA werden 16 Exons des MYH7- und des MYBPC3methode
Gens einschließlich der Intron/Exon-Spleißstellen amplifiziert und sequenziert (Stufe I (Sensitivität ca. 50%). Die Stufe II (Sensitivität ca. 90%): umfasst
die restlichen 79 Exons des MYH7-, MYBPC3-,TNNT2- und TNNI3-Gens.
Untersuchungs- Stufe I: 3-4 Wochen nach Probeneingang
dauer
Stufe II: zusätzlich 3 Wochen
Literaturhinweise
Seidman, J. G., Seidman, C., Cell 104: 557-567, 2001
Maron, B. J., New Eng. J. Med. 349: 1064-1075, 2003
Erdmann, J. et al., Clin. Genet. 64: 339-349, 2003
Charron, P.. www.orpha.net
68 Molekulargenetische Untersuchungen
Laktoseintoleranz
LCT-Gen (Lactase-Gen;
Genort: 2q21; OMIM #223000)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Weltweit leiden etwa 50% der Bevölkerung an mehr oder minder ausgeprägter Laktoseintoleranz, die sich klinisch durch Unverträglichkeit von
Milch oder milchhaltigen Lebensmitteln mit Übelkeit, Bauchschmerzen,
Blähungen und Durchfällen zeigt. Oftmals gehen mit der Intoleranz für das
Disaccharid Laktose auch unspezifische Symptome wie z. B. Kopfschmerzen oder auch Kreislaufprobleme einher. Drei Formen der Laktoseintoleranz lassen sich unterscheiden: 1. erworbener Laktasemangel (Laktaseproduktion lässt im Laufe des Lebens nach), 2. primärer Laktasemangel (der
Organismus ist von Geburt an nicht in der Lage ausreichend Laktase zu
bilden) und 3. sekundärer Laktasemangel als Folge von Darmerkrankung
wie z. B. Morbus Crohn oder Zöliakie.
Pimäre Laktoseintoleranz wird autosomal-rezessiv vererbt. In zwei finnischen Familien konnten im Enhancer-Bereich des Laktase-Gens (LCT) zwei
Polymorphismen (-13910T>C und -22018A>G) entdeckt werden, die das
Expressionsverhalten des Laktase-Gens steuern. Die homozygoten Genotypen C/C an der Position -13910 (bezogen auf das LCT-Startkodon) und
G/G an der Position -22018 führen dabei zu einer Laktoseintoleranz.
Indikation
Laktoseintoleranz; Blähungen, Durchfall und starke Darmkrämpfe nach
dem Verzehr von laktosehaltigen Nahrungsmitteln
Mutationen
C13910T-, G22018A-Mutationen
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels
methode
PCR amplifiziert. Der Nachweis beider Polymorphismen 13910T>C und
22018A>G erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 2-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Robayo-Torres et Nichols, Nutr Rev 65:95 (2007)
Järvelä, Ann Med 37:179 (2005)
Bersaglieri et al, Am J Hum Genet 74:1111 (2004)
Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) siehe SHOX
Molekulargenetische Untersuchungen 69
Marfan Syndrom Typ 1
FBN1-Gen (Fibrillin-1;
Genort: 15q21.1; OMIM #154700, *134797)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Das Marfan-Syndrom ist eine genetisch bedingte Erkrankung infolge einer
Strukturanomalie der Mikrofibrillen des Bindegewebes. Mutationen im
Fibrillin-1-Gen führen zu einem Mangel an Fibrillin-1 oder zu einem veränderten Genprodukt. Die daraus resultierenden abnormen Mikrofibrillen
in der extrazellulären Matrix des Bindegewebes führen zu Beeinträchtigungen des Aufbaus der betroffenen Gewebe.
Die Inzidenz des Marfan-Syndroms liegt bei etwa 1:10.000 Geburten.
Das individuelle Krankheitsbild ist sehr variabel und umfasst Skelettanomalien (überlange Gliedmaßen, Trichter- oder Kielbrust, schmaler Kiefer
mit schief stehenden Zähnen, Veränderungen an der Wirbelsäule, z. B.
Skoliosen oder Kyphosen), überdehnbare Gelenke, Augenveränderungen
(Linsendislokation, Myopie, Glaukom, Netzhautablösung), die zu Sehstörungen bis zur Erblindung führen können und als Hauptursache für
lebensbedrohliche Situationen Veränderungen im Bereich der Gefäße
(Aneurismenbildung bis zu Rissen in der Aorta) sowie Veränderungen an
Herzklappen und Lunge.
Im Rahmen der sog. „Genter Nosologie“ wurden 1996 Haupt- und Nebenkriterien zur klinischen Diagnosestellung eines Marfan Syndroms festgelegt
(De Paepe et al., 1996). Die 2010 von Loeys et al. überarbeiteten Kriterien
ermöglichen eine exaktere Diagnosestellung und eine bessere Abgrenzung
zu ähnlichen Erkrankungen. Dabei werden die Hauptkriterien Ectopia lentis (dislozierte Augenlinse) und Dilatation (bzw. Dissektion) der Aortenwurzel stärker bewertet als andere Kriterien und auch die genetische Untersuchung hat an Bedeutung gewonnen.
Etwa 90%-95% der Patienten, bei denen die klinische Diagnose eines Marfan Syndroms Typ 1 nach den Genter Kriterien gestellt wurde, weisen bei
der molekulargenetischen Untersuchung Mutationen im Fibrillin (FBN1)Gen auf. Der Anteil an Neumutationen liegt bei ca. 30%. Bei etwa 70%
der Fälle handelt es sich um Mutationen, die von einem Elternteil ererbt
wurden.
Marfan-ähnliche Symptome ohne Augenbeteiligung weisen auf ein Marfan-Syndrom Typ 2 (Loeys-Dietz Syndrom, LDS) hin, das durch Mutationen
im im TGFBR1- und TGFBR2-Gen verursacht wird.
Indikation
Klinischer Verdacht auf ein Marfan Syndrom; familiäres Risiko
Mutationen
Derzeit sind mehr als 600 verschiedene Punktmutationen, Deletionen und
Insertionen im FBN1-Gen beschrieben
70 Molekulargenetische Untersuchungen
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert.
methode
Stufe 1: PCR und Sequenzierung der 65 Exons des FBN1-Gens zur Erfassung von Punktmutationen.
Stufe 2: Untersuchung des FBN1-Gen auf Deletionen oder Duplikationen
mittels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification).
Untersuchungs- Stufe 1: Ca. 2 Wochen
dauer
Stufe 2: Ca. 4-5 Wochen
Literaturhinweise
Loeys et al., J Med Genet, 47: 476-485, 2010
Robinson and Godfrey, J Med Genet 37:9-25, 2000
De Paepe et al., Am J Med Genet 62:417-426, 1996
Dietz et al., Nature 352:337-339, 1991
Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) siehe SHOX
Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY)
HNF1A-Gen (Hepatocyte nucl. factor-1a-Gen;
Genort: 12q24.31; OMIM #600496)
GCK-Gen (Glucokinase-Gen;
Genort: 7p13; OMIM #125851)
HNF4A-Gen (Hepatocyte nucl. factor-4a-Gen;
Genort: 20q13.12; OMIM #125850)
HNF1B-Gen (Hepatocyte nucl. factor-1ß-Gen;
Genort: 17q12; OMIM #137920)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Das MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young)-Syndrom ist eine monogen erbliche Form des nicht-insulinabhängigen (Typ 2) Diabetes. Es wird
autosomal-dominant vererbt und beginnt im Kindes- oder frühen Erwachsenenalter. Bisher wurden sechs genetisch unterschiedliche Formen des
Syndroms beschrieben. Am häufigsten sind MODY2 und MODY3.
MODY3: (~69% aller MODY Patienten), schlanke Patienten, schwer und
progressiv verlaufend, mikrovaskuläre Komplikationen, renale Glukosurie
und herabgesetzte Nierenschwelle für Glukose.
MODY2: (ca. 14% aller MODY Patienten), schlanke Patienten, meist eher
mild verlaufend, selten diabetische Spätkomplikationen, gehäuft bei Gestationsdiabetes
MODY1: (~3% aller MODY Patienten), schlanke Patienten, schwer und
progressiv verlaufend, mikrovaskuläre Komplikationen und Retinopathie,
erniedrigte Serumspiegel von Triglyzeriden, Apolipoprotein AII und CII sowie Lp(a)
Molekulargenetische Untersuchungen 71
Klinische
Bedeutung
MODY5: (~3% aller MODY Patienten), variabler klinischer Verlauf: vom
leichten Typ2 Diabetes bis schwer und progressiv verlaufend, Nierendefekte und genitale Malformationen
Indikation
Verdacht auf Typ II-Diabetes im Kindes- oder Jugendalter
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung der entsprechenden Exons und Promotoren, Demethode
letionsscreening über MLPA.
Untersuchungs- 4-6 Wochen (Stufendiagnostik entsprechend der Häufigkeit möglich)
dauer
Literaturhinweise
Fajans, S. S. et al., New Eng. J. Med. 345: 971-980, 2001
Ellard, S., Hum. Mutat. 16: 377-385, 2000
Froguel, P. et al., Nature 356: 162-164, 1992
Mittelmeerfieber, hereditäres
MEFV-Gen
Genort: 16p13; OMIM #249100
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Das familiäre Mittelmeerfieber ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die
gehäuft bei Bewohnern der östlichen Mittelmeerregion (Türken, sephardische Juden, Nordafrikaner, Araber, seltener Griechen und Italiener) auftritt.
Bis zu einem Sechstel nordafrikanischer Juden und bis zu einem Siebtel
der armenischen Bevölkerung sind Merkmalsträger. In der Türkei wird die
Prävalenz der Erkrankung auf etwa 0,1% der Bevölkerung geschätzt. Sie
ist gekennzeichnet durch periodisch wiederkehrende Fieberschübe mit
begleitender Entzündung der Serosa, was zu starken Bauch-, Brust- oder
Gelenkschmerzen führt.
Die meisten Patienten haben ihre ersten Fieberschübe im frühen Kindes- und Jugendalter. Die Attacken dauern etwa ein bis drei Tage an und
bilden sich dann von alleine wieder zurück. Es zeigen sich unspezifische
Entzündungszeichen wie CRP-Erhöhung, BSG-Anstieg und Leukozytose.
Zwischen den Attacken sind die Patienten symptomfrei und fühlen sich
gesund.
Unbehandelt ist die häufigste Komplikation des familiären Mittelmeerfiebers eine progressive sekundäre Amyloidose, wodurch sich die Lebenserwartung der Patienten verkürzt: Beim akuten Schub findet sich besonders
viel Amyloid im Blut, welches sich in unterschiedlichen Organen (vor allem
der Niere) ablagern und über eine Niereninsuffizienz zum Tode führen
kann.
72 Molekulargenetische Untersuchungen
Indikation
Wiederholte Fieberschübe mit Schmerzen in Abdomen, Brust und Gelenken, Peritonitis, unklare Arthritis, Amyloidose
Mutationen
Es sind über 80 verschiedene Mutationen bekannt, wobei es Hot Spots
in bestimmten Genregionen gibt. Etwa 93% aller publizierten Mutationen
betreffen Exon 2, 3, 5 und 10 des MEFV-Gens.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 10 Exons des Marenostrin-Gens, Stufendiamethode
gnostik möglich
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Aksentijevich, I. et al.: Linkage disequilibrium in the familial Mediterranean fever candidate region. Am. J. Hum. Genet. 51 (suppl.): A181, 1992
Bonyadi, M. et al. MEFV mutations in Iranian Azeri Turkish patients with familial Mediterranean fever. Clin. Genet. 76: 477-480, 2009
Morbus Fabry, Alpha-Galactosidase A-Mangel
GLA-Gen (Alpha-Galactosidase A-Gen OMIM # ;
Genort: Xq22.1-; OMIM # 301500
Erbgang
X-chromosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Der Morbus Fabry ist eine seltene erblich bedingte lysosomale Speicherkrankheit, die auf einem Mangel des Enzyms α-Galaktosidase A (α-GAL A)
beruht. Durch Ablagerung von Glykosphingolipiden in zahlreichen Geweben und Organen kommt es zu vielfältigen klinischen Beschwerden. Die
Symptome der Erkrankung umfassen unter anderem Schlaganfälle, Herzinfarkte und Nierenfunktionseinschränkung bis hin zur Dialysepflicht, rötlich-violette Hautveränderungen, sog. Angiokeratome, Funktionminderung
der Schweißdrüsen, Ablagerungen im Bereich der Cornea, sowie brennende Parästhesien im Bereich der Hände und Füße.
Obgleich erste Symptome oft schon im Kindes- oder Jugendalter auftreten,
erfolgt eine Diagnosestellung aufgrund der unspezifischen klinischen Symptomatik oft erst spät. Zur Vermeidung schwerwiegender Komplikationen
ist jedoch eine frühzeitige Diagnosestellung zur Therapieeinleitung von
großer Bedeutung.
Die Prävalenz der Erkrankung wird mit ca. 2-5:100.000 angegeben. Neuere Untersuchungen deuten jedoch auf eine wesentlich höhere Häufigkeit
hin. Obgleich der M. Fabry X-chromosomal-rezessiv vererbt wird, können
auch heterozygote Frauen Symptome der Erkrankung zeigen.
Männliche Betroffene mit der klassischen Form der Erkrankung haben in
der Regel eine sehr niedrige α-Galaktosidase-Aktivität, welche verlässlich
mittels eines Enzymtestes an Leukozyten aus dem Blut bestimmt werden
kann.
Molekulargenetische Untersuchungen 73
Klinische
Bedeutung
Bei attenuierten Formen der Erkrankung können sich jedoch deutliche Restaktivitäten des Enzyms finden, so dass eine Mutationsanalyse
zur Diagnosesicherung erfolgen sollte. Auch eine Pseudodefizienz der
α-Galaktosidase-Aktivität (zum Beispiel bei Männern, die nicht-Krankheitsverursachende Mutation p.D313Y tragen), kann ebenfalls zu einer verminderten α-Galaktosidase-Aktivität führen und erfordert eine molekulargenetische Testung. Da die Enzymaktivität bei weiblichen Anlageträgerinnen
unauffällig sein kann, ist hier eine molekulargenetische Analyse unabdingbar. Diese gilt ebenso zur Verifizierung einer krankheitsverursachenden
Mutation vor Einleitung einer enzymatischen Ersatztherapie.
Indikation
Verdacht auf M. Fabry, Differentialdiagnose
Mutationen
Zumeist Punktmutationen (70%) ohne hot spot, kleinere Rearrangements
(< 60 bp) in ca. 28% der Fälle und ca. 2% größere Rearrangements (>=60
bp)
2-5 ml EDTA-Blut
Material
Untersuchungs- Stufe I: PCR und Sequenzierung der 7 kodierenden Exons
methode
Stufe II: Deletionen und Duplikationenscreening mittels MLPA .
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Gal A. et al., European Journal of Human Genetics) 20(2012)
Lidove O..et al., Genet Med 12: 668–679 (2010)
Wang R.Y. et al., Genetics in Medicine 13: 457–484(2011)
Morbus Meulengracht
UGT1A1-Gen (Uridindiphosphat-Glucuronosyltransferase 1A1-Gen;
Genort: 2q37; OMIM # 143500, *191740
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Morbus Meulengracht oder Gilbert-Syndrom ist eine benigne Stoffwechselstörung, die häufig in Stress-Situationen, bei verminderter Nahrungsaufnahme oder in Verbindung mit Nikotin und Alkohol zu einer Hyperbilirubinämie führt (3-5fach erhöhter Bilirubinspiegel (unkonjugiertes Bilirubin)
im Blut). Eine Therapie ist nicht erforderlich, jedoch sind Fasten, Stress,
Nikotin und Alkohol zu vermeiden.
Molekulargenetisch kann bei dem Gilbert Syndrom in beiden Allelen des
UGT1A1-Gens eine Dinukleotid-Verlängerung im Promotor nachgewiesen werden [A(TA)6TAA → A(TA)7TAA]. Dies führt zu einer erniedrigten
UDP-Glucuronosyltransferase (UDP-GT1-A1) Aktivität und damit zu einer
verminderten Konjugation von Bilirubin an Glucuronsäure, wodurch der
Serumspiegel des indirekten Bilirubins ansteigt. Aufgrund eines gestörten
Stoffwechsels von einigen Medikamenten sollte jede Medikamenteneinnahme mit einem Arzt besprochen werden. Beispielsweise ist die UDPGlucuronosyltransferase entscheidend an dem körpereigenen Abbau des
Chemotherapeutikums Irinotecan (CPT-11) beteiligt.
74 Molekulargenetische Untersuchungen
Patienten mit Morbus Meulengracht haben nach Angaben in der Literatur
ein hohes Risiko, bei einer Behandlung mit CPT-11 starke Nebenwirkungen zu erleiden. Bei cystischer Fibrose erhöht der UGT1A1 Promotor-Polymorphismus die Wahrscheinlichkeit für Gallensteine.
Indikation
Patienten mit Sklerenikterus und Hyperbilirubinämie bei normalen Leberwerten und ohne Zeichen einer Hämolyse oder einer Hepatitis-Infektion.
Mutationen
A(TA)7TAA und A(TA)8TAA Promotor-Polymorphismus im UGT1A1-Gen
Material
1-2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Promotorremethode
gion des UGT1A1-Gens wird mittels real-time Polymerasekettenreaktion
(PCR) und Schmelzkurvenanalyse unter Verwendung der fluorescence resonance energy transfer (FRET) Technik nachgewiesen. Bei fraglichen Ergebnissen wird die Veränderung im Promotor durch Sequenzanalyse näher
untersucht.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Rouits et al., Clin Canc Res 10: 5151-5159, 2004; Borlak et al., Hepatology 32:792-795,
2000; Burchell and Hume, Gastroenterol Hepatol 14:960-966, 1999
Morbus Wilson
ATP7B Gen (ATPase-7b Kupfertransporter;
Genort: 13q14.3-q21.1; # OMIM 277900, *606882)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Bei Morbus Wilson liegt eine Störung im Kupferstoffwechsel vor durch einen Defekt in beiden Allelen des ATPase-7b Kupfertransporter-Gens (ATP7B). Überschüssiges Kupfer, das mit der Nahrung aufgenommen wird,
kann nicht mehr ausreichend ausgeschieden werden und reichert sich mit
entsprechend toxischer Wirkung in verschiedenen Organen an. Zusätzlich
kommt es durch den Funktionsverlust des ATP7B-Proteins auch zu einer
Störung der Coeruloplasmin-Synthese.
Der Erkrankungsverlauf ist hinsichtlich Schweregrad und Symptomatik
sehr variabel. Das Erkrankungsalter liegt in der Regel zwischen 5. und 45.
Lebensjahr. Hinsichtlich der Symptomatik wird zwischen nicht-neurologischem (hepatischem) und neurologischem Verlaufstyp unterschieden. Bei
der Manifestation vor dem 10. Lebensjahr stehen initial akute oder chronische Leberentzündungen im Vordergrund, während die Patienten bei
späterer Erstmanifestation primär durch neurologische Symptome auffallen
(Parkinson- oder Chorea-artiger Tremor, teilweise Spastiken, Koordinationsstörungen und verwaschene Sprache, im späteren Krankheitsverlauf Depressionen, Psychosen und demenzielle Veränderungen). Zusätzlich werden durch Kupferablagerungen u. a. auch Veränderungen in der Niere und
in den Augen („Kayser-Fleischer-Kornealring“) beobachtet.
Molekulargenetische Untersuchungen 75
Klinische
Bedeutung
Bei Morbus-Wilson Patienten wurden inzwischen über 250 verschiedene
Mutationen innerhalb des ATP7B-Gens nachgewiesen. Als häufigste Mutation in Europa mit einer Allelfrequenz von ca. 60% liegt ein C → A Basenaustausch im Exon 14 vor, der im ATPase-7b Kupfertransporter-Protein
an Position 1069 zu einem Aminosäureaustausch von Histidin durch Glutamin führt.
Indikation
Auffällige Leberwerte im Kindesalter nach Ausschluss einer infektiöses Hepatitis; erhöhte Ausscheidung von Kupfer im Urin und erniedrigte Werte
für Kupfer und Coeruloplasmin im Serum; Augensymptome: „Kayser-Fleischer-Kornealring“ in der Regel zusammen mit neurologischen Symptomen
(unklare Bewegungsstörungen und Verhaltensänderungen); bei einigen Patienten auch Skelettveränderungen (Osteoporose, degenerative Gelekveränderungen) oder Kardiomyopathien; präsymptomatische Diagnostik bei
Geschwistern und Kindern von Patienten mit molekulargenetisch nachgewiesener ATP7B-Genmutation.
Mutationen
Häufigste Mutation: c.3207C>A (p.His1069Gln); es sind über 250 weitere
Mutationen im ATP7B-Gen bekannt
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert.
methode
Stufe 1: Untersuchung der häufigsten Mutation: C3207A (His1069Gln) im
Exon 14 des ATP7B-Gens durch real-time Polymerasekettenreaktion (PCR)
und Schmelzkurvenanalyse unter Verwendung der fluorescence resonance
energy transfer (FRET) Technik
Stufe 2: Komplettsequenzierung aller 21 Exons des ATP7B-Gens.
Untersuchungs- 4-6 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Kucinskas et al., World J Gastroenterol 14:5876-5879, 2008; Caca et al., J Hepatol
35:575-581, 2001; AWMF-Leitlinien in: Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der
Neurologie, 2008 G. Thieme Verlag, Stuttgart
Mukoviszidose (Cystische Fibrose)
CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator;
Genort: 7q31.2; MIM # 219700)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
CF ist mit einer Inzidenz von ca. 1:2500 eine der häufigsten autosomalrezessiven Erkrankungen in der weißen Bevölkerung. Ca. jede 25. Person
ist heterozygoter Träger (und damit selbst gesund, aber Überträger) einer
Mutation in dem für diese Erkrankung verantwortlichen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)- Gen, welches die Chloridionenkanal-Funktion reguliert. Der Gendefekt führt hauptsächlich zur Beeinträchtigung des Bronchialsystems mit häufig wiederkehrenden Infekten bis
hin zur Zerstörung des Lungengewebes.
76 Molekulargenetische Untersuchungen
10% der erkrankten Neugeborenen zeigen einen Mekonium-Ileus. Als
weiteres typisches Symptom wird eine exokrine Pankreasinsuffizienz bei
ca. 85% der Patienten beschrieben (s. Hereditäre Pankreatitis). Schweregrad und Manifestationsalter der Erkrankung sind äußerst variabel. Mehr
als 95% der Männer mit CF sind aufgrund einer Azoospermie infertil, die
durch eine CBAVD verursacht wird (s. dort). Betroffene Frauen zeigen eine
wesentlich geringere Einschränkung der Fertilität.
Bei ca. 70% der Erkrankten in Mitteleuropa lässt sich eine prädominante
Mutation (F508del) molekulargenetisch nachweisen. Insgesamt sind derzeit weltweit mehr als 1500 verschiedene Mutationen bekannt, wovon in
der deutschen Bevölkerung nur wenige mit einer Häufigkeit von mehr als
1-2% gefunden werden. Das Verteilungsspektrum der Mutationen ist populationsabhängig. Durch die hier durchgeführte Untersuchung von bis zu
35 Mutationen und das 5T-Allel können über 90% der Mutationsträger aus
der kaukasischen Bevölkerung erfasst werden.
Indikation
Klinischer Verdacht auf Mukoviszidose bzw. entsprechende Familienanamnese, auch als pränatale Untersuchung bei bekannter Mutation beider Eltern.
Mutationen
Häufigste Mutation: F508del, Sensitivität ca. 73%. Über 1500 weitere Mutationen im CFTR-Gen sind bekannt, die mit unterschiedlicher Häufigkeit
auftreten
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Anschließend wermethode
den die relevanten Sequenzbereiche mittels Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) arnplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung
an membrangebundene allelspezifische Sonden bzw. unter Verwendung
des „Oligo-Ligation-Assays“ (OLA-Methode, Abbott).
Untersuchungs- Ca. 5-8 Tage
dauer
(bei Fruchtwasser zusätzlich ca. 2 Wochen für die Zellkultur)
Literaturhinweise
Welsh et al., in Scriver et al (eds) The metabolic and molecular bases of inherited disease,
Chapter 127, 1997; Stuhrmann et al., Med Genet 9:552- 559, 1997;
Stuhrmann et al., Internist 40:476- 485, 1999
Muskeldystrophie Typ Duchenne oder Becker
DMD-Gen (Duchenne muscular dystrophy-Gen;
Genort: Xp21.2-p21.1; OMIM *300377)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
X-chromosomal
Klinische
Bedeutung
Die Duchenne- und Becker-Muskeldystrophien (DMD und BMD) sind
neuromuskuläre Erkrankungen mit progredientem Skelettmuskelschwund,
wobei jedoch auch Herzmuskulatur und glatte Muskulatur betroffen sein
können.
Molekulargenetische Untersuchungen 77
Klinische
Bedeutung
Die DMD ist häufiger, manifestiert sich früher und verläuft schwerer als die
BMD. Die Prävalenz unter männlichen Neugeborenen liegt bei der DMD
bei 1:3.300, die Prävalenz der BMD schwankt zwischen 1:18.000 und
1:31.000. In Deutschland leben 1.500 bis 2.000 Betroffene, jährlich muss
mit etwa 100 Neuerkrankungen gerechnet werden.
Kinder mit DMD lernen oft verspätet laufen. Kognitive Funktionen können
eingeschränkt sein sein. Die Diagnose wird meist im Alter von 5 Jahren
gestellt, wenn watschelnder Gang, Spitzfuß (Pes equinus), Wadenhypertrophie und positives Gowers-Zeichen auffallen. Ohne Therapie werden die
Patienten im Alter von 10-12 Jahren rollstuhlpflichtig. Zunehmend werden
Skoliose, Kardiomyopathie und restriktive respiratorische Insuffizienz manifest.
Die BMD tritt erst später im 2. Lebensjahrzehnt mit proximaler, unterschiedlich progredienter Muskelschwäche in Erscheinung. Die Gehfähigkeit kann bis in das Erwachsenenalter, erhalten bleiben. Erstes Symptom
können auch kardiale Probleme sein.
Es können auch andere klinische Formen auftreten wie isolierte Kardiomyopathie, Belastungsintoleranz, und sehr seltene symptomatische Formen bei heterozygoten Frauen.
Beide Krankheiten werden X-chromosomal-rezessiv vererbt und sind verursacht durch einen Mangel des Dystrophins in der Skelett- und Herzmuskulatur, der progredient zu nekrotischen Läsionen sowie einem Ersatz
durch Binde- und Fettgewebe. Das DMD-Gen (Xp21.2) kodiert verschiedene Dystrophin-Isoformen.
Die Creatin-Phoshokinase (CPK) ist bei DMD 50 bis 200fach, bei BMD 10
bis 35fach erhöht. Die Muskelbiopsie zeigt dystrophische Veränderungen
(nekrotische und regenerierende Fasern). Immunhistochemisch wird bei
DMD ein völliges Fehlen, bei BMD eine veränderte Quantität und/oder
Qualität des Dystrophins nachgewiesen. Molekulargenetisch sind am häufigsten Deletionen des DMD-Gens nachweisbar. Differentialdiagnostisch
müssen die Sarkoglykanopathien abgegrenzt werden. Essentiell ist in den
Familien die Suche nach heterozygoten Frauen.
Indikation
Klinischer V. a. DMD (ausgeprägte Form, Erkrankungsalter 2-4 J.) oder BMD
(mildere Form, Erkrankungsalter 1.-3. Lebensjahrzehnt)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- MLPA-Analyse aller 79 kodierenden Exons zur Erfassung von Deletionen
methode
und Duplikationen einzelner oder mehrerer Exons
Untersuchungs- 3-6 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Emery, A. E. H., Lancet 359: 687-695, 2002
Monaco, A. P. et al., Genomics 2: 90-95, 1988
Grain, L. et al., Neuromusc. Disord. 11: 186-191, 2001
Boulay C.; Chabrol B., www.orpha.net
78 Molekulargenetische Untersuchungen
Myotone Dystrophie Typ 1
DMPK-Gen (Dystrophia myotonica protein kinase-Gen;
Genort: 19q13.32; OMIM #160900)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Myotone Dystrophie Typ 1 (Curschmann-Steinert), ist eine Muskelkrankheit mit Myotonie und Funktionsstörungen einer Vielzahl von Organen. Als Symptome treten unter anderem Muskelschwäche, Reizleitungsstörungen des Herzens, Katarakt, endokrine Störungen, Schlafstörungen
und Stirnglatze auf. Von den übrigen Muskeldystrophien kann sie dadurch
abgegrenzt werden, dass nach einer Muskelkontraktion sich die Relaxation
verzögert. Es ist die häufigste der im Erwachsenenalter beginnenden Muskeldystrophien. Die Prävalenz wird auf 1:20.000 geschätzt. Die Erkrankung
ist mit Genanomalien der Chromosomenregion 19q13.2-q13.3 assoziiert.
Antizipation, d. h. Vorverlagerung des Erkrankungsalters und/oder Zunahme des Ausprägungsgrades in aufeinander folgenden Generationen, ist
möglich. Die große Variabilität des klinischen Bildes auch innerhalb einer
Familie kann die genetische Beratung erschweren.
Die Krankheit verläuft meist langsam progredient, aber gelegentlich werden auch rapide Verschlechterungen gesehen. Wegen der erhöhten Mortalität pulmonaler und kardialer Komplikationen ist die Lebenserwartung
reduziert.
Indikation
Muskelerkrankung des Erwachsenenalters, die durch Symptome eine distal
betonte Muskelschwäche, eine Atrophie der Gesichtsmuskulatur sowie der
Nacken- und Pharynxmuskulatur charakterisiert wird
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR zur Längenbestimmung des CTG-Repeats in der 3’-untranslatierten
methode
Region von DMPK
Untersuchungs- 3-6 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Musova, Z. et al., Am. J. Med. Genet. 149A: 1365-1374, 2009
Harper, P. S.Myotonic Dystrophy.Philadelphia: W. B. Saunders (pub.) (2nd ed.) : 1989
Harley, H. G. et al., Am. J. Hum. Genet. 52: 1164-1174, 1993
Bost M. et al. www.orpha.net
Molekulargenetische Untersuchungen 79
Myotone Dystrophie Typ 2
ZNF9-Gen (Zinc finger protein 9;
Genort: 3q21.3; OMIM #602668)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Myotone Dystrophie Typ 2, auch Proximale myotone Myopathie genannt, ist eine multisystemische Erkrankung mit proximaler Muskelschwäche, Myotonie, kardialen Symptomen und frühen Katarakten in Erscheinung tritt. Die Patienten werden meist erst als Erwachsene, zwischen dem
40. und 50. Lebensjahr, auffällig. Es gibt keine Berichte über angeborene
oder kindliche Fälle, aber eine seltene juvenile Form wurde beschrieben.
Die Ausprägung der Krankheit ist unterschiedlich und gekennzeichnet
durch: (i) proximale Muskelschwäche unter Einschluss des Becken- und
Schultergürtels mit häufigen Myalgien, die oft zur Diagnose führen. (Über
Myotonie wird in 75% der Fälle berichtet, die Gesichtsmuskeln sind nur in
12% der Patienten betroffen); (ii) Tremor bei 20-30% der Fälle; (iii) kardiale Manifestationen mit Arrhythmie und Reizleitungsstörungen, in einigen
Fällen Kardiomyopathie, weshalb alle Patienten kardiologisch überwacht
werden müssen; (iv) hintere Linsen-Kapseltrübung; (v) endokrine Störungen mit Hyperhidrose, Hodenatrophie, Insulinresistenz und Diabetes; (vi)
selten zentralnervöse Störungen (räumliches Sehen); (vii) biochemische
Anomalien (Hypogammaglobulinämie, Cholestase).
Die Krankheit wird autosomal-dominant vererbt. Ursache ist die Expansion eines CCTG-Repeats im Intron 1 des CNBP-Gens (3q21). Die Zahl der
Wiederholungen scheint nicht mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren.
Indikation
Verdacht auf DM2, eine multisystemische Erkrankung vorwiegend ab der
3. Lebensdekade, die die Muskulatur, die Augen (nahezu alle Betroffenen
haben eine Katarakt), das Gehör (20%) und das endokrine System (20%
Diabetes mellitus, Fertilität) betreffen kann.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung verschiedener Repeat-Polymorphismen in Intron
methode
I von ZNF9
Untersuchungs- 3-6 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Udd, B. et al., Neuromusc. Disord. 13: 589-596, 2003
Bonsch, D. et al., Clin. Genet. 63: 73-75, 2003
Bachinski, L. L. et al., Neurology 72: 490-497, 2009
Bouhour F., www.orpha.net
80 Molekulargenetische Untersuchungen
N-Acetyltransferase
NAT1-Gen (N-Acetyltransferase 1; Genort: 8p22; OMIM *108345)
NAT2-Gen (N-Acetyltransferase 2; Genort: 8p22; OMIM *612182)
Klinische
Bedeutung
Die N-Acetyltransferase 2 (NAT2) ist ein Enzym des Phase II-Stoffwechsels,
welches die Konjugation diverser Pharmaka und Xenobiotica mit einer
Acetylgruppe vermittelt. Es finden sich sogenannte Schnell- und Langsamacetylierern sowie intermediäre Typen. Die Frequenz dieser Phänotypen
in verschiedenen Populationen variiert erheblich. In der europäischen Bevölkerung beträgt der Anteil der Langsamacytlyierer zwischen 40 und 70%,
in der arabischen Bevölkerung bis zu 95%. Der Phänotyp des „langsamen
Acetylierers“ ist durch homozygote oder zusammengesetzt-heterozygote Mutationen in der kodierenden Region des NAT2-Gens bedingt. Die
häufigsten Mutationen die mit dem SA-Phänotyp assoziiert sind umfassen
G191A (NAT2*14A), C481T (NAT2*5A), G590A (NAT2*6A) und G857A
(NAT2*7A/B). Am Beispiel von Isoniazid konnte gezeigt werden, daß sich
die therapeutische Wirkung und das Auftreten von Nebenwirkungen bei
Langsam- und Schnellacetylierern unterscheiden. Eine klinisch relevante
Nebenwirkung der Isoniazidtherapie ist die periphere Neuropathie bei
langsamen Acetylierern, bei schnellen Acetylierern kann es zu einer Hypersensitivität gegenüber Sulfonamiden sowie zu einer Leukopenie unter
Amonafid kommen.
Das Enzym NAT1 wird in mehr Zellarten gefunden als NAT2. NAT1 ist in
der Lage karzinogene Amine zu entgiften. Bestimmte Allele sind mit einem
erhöhten Risiko für Colon- und Harnblasenkarzinom assoziiert.
Indikation
Diskrepanz Medikamentendosierung und Serumspiegel, fehlende Medikamentenwirkung, unerwartete Nebenwirkungen (UAW); Acetyliererstatus,
verstärkte Reaktionen gegenüber Umweltgiften
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR, Genotypisierung
methode
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Blum, M.et al., DNA Cell Biol. 9: 193-203, 1990
Bouchardy, C.et al., Pharmacogenetics 8: 291-298, 1998
Chan, D. K. Y. et al., Neurology 60: 1002-1005, 2003
Noonan-Syndrom
PTPN11-Gen (Protein-Tyrosine Phosphatase, nonreceptor-type 11;
Genort: 12q24; OMIM *176876, #163950)
Erbgang
Autosomal-dominant
Molekulargenetische Untersuchungen 81
Klinische
Bedeutung
Das Noonan-Syndrom ist ein Dysmorphie-Syndrom, welches durch faziale Dysmorphien mit Hypertelorismus, Ptosis, großen und tief sitzenden
Ohren auffällt. Charakteristisch sind Kleinwuchs, Skelettdeformationen
und ein breites Spektrum von Herzfehlern. Die Symptomatik zeigt eine
außergewöhnliche Variabilität. Die Inzidenz des Noonan-Syndroms wird
auf 1:1000 bis 1:2500 Geburten geschätzt. Beide Geschlechter sind gleich
häufig betroffen.
Aufgrund der phänotypischen Ähnlichkeiten zum Ulrich-Turner-Syndrom
wurde das Noonan-Syndrom auch als Male-Turner-Syndrom bezeichnet,
wobei die Chromosomen beim Noonan-Syndrom aber unauffällig sind.
Bei ca. 50% aller Noonan-Patienten liegen Mutationen im PTPN11-Gen
vor, die fast alle zu Aminosäureaustauschen führen. Das Genprodukt, das
SHP2 (Src homology 2)-Protein, ist eine nicht membranständige RezeptorPhosphotyrosin-Phosphorylase, mit zentraler Regulatorfunktion in fast allen
Signaltransduktionswegen von Wachstumsfaktoren, einschließlich der RASMAPK-Kaskade.
Weniger als 3% der Noonan-Patienten zeigen Mutationen im KRAS (Kirsten
Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog)-Gen, wobei diese überwiegend
mit schwerwiegenden Phänotypen assoziiert zu sein scheinen. Bei etwa
20% der Noonan-Patienten, die keine Mutation in PTPN11 oder KRAS aufwiesen, wurden mittlerweile Mutationen im SOS1 (Son of Sevenless)-Gen
nachgewiesen. Bei Patienten mit SOS1-Mutationen werden häufiger ektodermale Anomalien (z. B. Keratose) gefunden, das Längenwachstum und
die mentale Entwicklung verlaufen meist normal und die Herzfehler sind
weniger stark ausgeprägt.
Indikation
Klinischer Verdacht auf ein Noonan-Syndrom, auch als pränatale Untersuchung.
Mutationen
Punktmutationen im PTPN11-Gen
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Entsprechend der
methode
Häufigkeit der einzelnen Mutationen erfolgt eine Untersuchung der 15
Exons mittels Amplifikation und Sequenzanalyse über Kapillarelektrophorese in zwei Stufen.
Stufe 1: Untersuchung von Exon 3 und 8 mit den häufigsten PTPN11Mutationen
Stufe 2: Komplettsequenzierung der restlichen 13 Exons des PTPN11Gens.
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Sznajer et al., Pediatrics 119: e1325-1331, 2007; Tartaglia et al., Mol Syndromol 1:2-26,
2010; Tartaglia et al., Nat Genet 29:465-468, 2001
Osteoporose siehe Vitamin D-Rezeptor und Col1A1-Gen
82 Molekulargenetische Untersuchungen
Pankreatitis, hereditäre (HP)
PRSS1-Gen (kationisches Trypsinogen; Genort: 7q35; MIM +276000)
SPINK1- (PSTI-) Gen (Serinprotease-Inhibitor, Kazal-Typ 1/ Pancreatic secretory trypsin inhibitor, Genort: 5q32; MIM *167790)
Erbgang
Autosomal dominant / rezessiv / digenisch (je nach Mutation)
Klinische
Bedeutung
In industrialisierten Ländern wird eine chronische Pankreatitis in 70-80%
der Fälle durch langfristigen Alkoholmissbrauch ausgelöst. 10-30% der Fälle werden als „idiopathisch“ klassifiziert, darunter auch die der Patienten
mit hereditärer Pankreatitis. Die Inzidenz der chronischen Pankreatitis wird
in industrialisierten Ländern auf 3,5 bis 10 pro 100 000 Einwohner geschätzt.
Klinisch wird die Erkrankung charakterisiert durch wiederkehrende oder
persistierende Abdominalschmerzen, obwohl auch schmerzfreie Patienten
beobachtet werden. Morphologisch zeigt das Pankreas eine unregelmäßige Sklerose mit fokaler, segmentaler oder diffuser Zerstörung des Parenchyms.
Das Auftreten klinischer Symptome bereits in der Kindheit und/oder eine
familiäre Häufung der Erkrankung kann auf eine hereditäre Pankreatitis
hindeuten. Das Risiko der Entwicklung eines Pankreaskarzinoms ab dem
50. Lebensjahr ist erhöht. Bisher konnten drei für die Erkrankung verantwortliche Gene identifiziert werden: Etwa 1% der Patienten tragen autosomal dominante Mutationen im kationischen Trypsinogen (PRSS1)-Gen
auf Chromosom 7. Das Trypsinogen-Protein ist die inaktive Vorstufe des
Trypsins, das bei vorzeitiger Autoaktivierung eine Gewebeschädigung des
Pankreas verursacht. Bei dem zweiten Gen handelt es sich um das SerinProtease-Inhibitor, Kazal Typ 1 (SPINK1)-Gen oder pankreatisch-sekretorisches Trypsin-Inhibitor (PSTI)-Gen auf Chromosom 5. Das Genprodukt hat
eine physiologische Schutzfunktion, indem es Trypsin im Pankeas inaktiviert. Die häufigste Mutation im SPINK1-Gen (N34S) ist in homozygoter
Form mit 5-10% bei Pankreatitis-Patienten wesentlich häufiger vorzufinden
als bei Gesunden (1/10000). Weitere seltene SPINK1-Varianten sind beschrieben, von denen jedoch der Vererbungsmodus und die Krankheitsrelevanz noch nicht sicher geklärt sind. Des Weiteren wurde bei 25-30% der
Patienten mindestens eine Mutation im CFTR-Gen (für Cystische Fibrose)
gefunden, wobei etwa bei einem Drittel davon zwei CFTR-Mutationen in
compound heterozygoter Form auftreten. Bei einigen Patienten (ca. 9%)
liegt eine Kombination von Mutationen dieser Gene vor (digenische Vererbung).
Indikation
Akute Pankreatitis in Kindheit und Jugend und / oder positive Familienanamnese; rezidivierende Pankreatitiden; Pankreaskarzinom vor dem 45.
Lebensjahr, chronische Pankreatitis vor dem 35. Lebensjahr
Mutationen
Mutationen des PRSS1- und SPINK1 (PSTI)-Gens
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Molekulargenetische Untersuchungen 83
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Diagnostik ermethode
folgt stufenweise durch Amplifikation der entsprechenden Exons mittels
PCR und Sequenzierung:
Stufe 1: Untersuchung der häufigsten Mutationen im PRSS1-Gen: R122H
(Exon 3), N29I (Exon 2), A16V (Exon 1) und im SPINK1-Gen: N34S (Exon 3)
Stufe 2: Komplettsequenzierung des PRSS1-Gens (Exons 1-5) und des
SPINK1-Gens (Exons 1-4 mit Promotorregion) inklusive aller Exon/Intron
Grenzen
Stufe 3: (nach Rücksprache): Untersuchung der 33 in der kaukasischen
Bevölkerung häufigsten Mutationen des CFTR-Gens.
Untersuchungs- 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Keim, World J Gastroenterol 14:1011-1015, 2008; Keiles and Kammerscheidt, Pancreas
33:221-227, 2006; Whitcomb et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287:G315G319, 2004; Witt, Gut 52:31-45, 2003 Audrezet et al., Eur J Hum Genet 10:100-106,
2002; Witt et al., Nat Genet 25:213-216, 2000
Phenylketonurie
PAH-Gen (Phenylalanin-Hydroxylase-Gen;
Genort: 12q23.2; OMIM #261600)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die klassische Phenylketonurie ist eine erbliche Stoffwechselkrankheit, die
zu geistiger Retardierung und anderen neurologischen Problemen führt,
wenn die Behandlung nicht in den ersten Lebenswochen beginnt. Die Inzidenz in der Allgemeinbevölkerung Europas variiert zwischen 1:5000 bis
1:15000. Ursache der Krankheit ist ein Mangel der Phenylalanin-Hydroxylase, welche die essentielle Aminosäure Phenylalanin in die Aminosäure
Tyrosin umwandelt. Ein Defekt dieser Umwandlung führt zum Anstau von
Phenylalanin, wodurch Phenylpyruvat, Phenylacetat oder Phenyllactat entstehen. Was jedoch genau die Schädigung des ZNS bewirkt, ist nicht bekannt. Der Enzymmangel ist von Patient zu Patient unterschiedlich schwer
ausgeprägt. Die genetische Untersuchung dient zur Feststellung eines möglichen Carrier-Status sowie der weiteren Abklärung bei grenzwertigen Phenylalaninkonzentrationen im Serum.
Indikation
Hyperphenylalaninämien, insbesondere Phenylketonurie
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 13 Exons, Duplikations- und Deletionsscreemethode
ning mit MLPA
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Scriver, C. R., Hum. Mutat. 28: 831-845, 2007
Zurfluh, M. R. et al., Hum. Mutat. 29: 167-175, 2008
www.orpha.net
84 Molekulargenetische Untersuchungen
Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI)
SERPIN 1-Gen
Genort: q21.3-q22; MIM ID: *173360
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Für die Neigung zur Thrombose/Thromboembolie und auch für eine erhöhte Abortneigung werden neben äußeren Einflüssen genetische Dispositionen verantwortlich gemacht. Meist sind Veränderungen (Mutationen) in
verschiedenen Genen (z. B. Faktor-II, Faktor-V-LEIDEN, MTHFR (MethylenTetrahydrofolat-Reduktase) und PAI (Plasminogen-Aktivator-Inhibitor)-1)
ursächlich vorhanden. Diese „mutierten“ Gene trägt ein höherer Prozentsatz der Bevölkerung und wird sie mit der Wahrscheinlichkeit von 50%
auch wieder an eigene Kinder vererben. Insgesamt zeigt die Ausprägung
eine „Bevorzugung“ des weiblichen Geschlechts.
Der vom SERPIN1-Gen codierte endotheliale Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) hemmt den gewebespezifischen Plasminogenaktivator (t-PA)
und den Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (u-PA). Da der t-PA und
der u-PA im fibrinolytischen System die Auflösung von Blutgerinnseln bewirken, führt eine gesteigerte PAI-1-Aktivität zur Beeinträchtigung der Fibrinolyse. Der 4G/5G-Insertions/Deletions-Polymorphismus an Position -675
des SERPIN1-Gens liegt im regulatorischen Bereich. Das 4G-Allel ist mit einer erhöhten Transkriptionsrate und damit einer erhöhten PAI1-Expression
bzw. -Aktivität assoziiert. Für den G>A-Polymorphismus an Position –844
wurde nachgewiesen, dass die Homozygotie des Allels A (A/A) gehäuft bei
Faktor V-Anlageträgern mit Venenthrombosen vorliegt, während bei Vorliegen des G-Allels kein erhöhtes Thromboserisiko besteht.
Eine erhöhte Konzentration des PAI-1 findet sich auch bei Personen mit
Adipositas.
Indikation
V. a. Thrombophilie, Adipositas
Mutationen
Der 4G/5G-Insertions/Deletions-Polymorphismus an Position -675 und der
Basenaustausch G/A an Position –844 des SERPIN1-Gens
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden die relevanten Sequenzbereiche mitmethode
tels PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Kohler und Grant, New Engl J Med 342, 1792-1801, 2000
Margaglione et al., Arterioscler Thromb Vasc. Biol 18, 152-156, 1998
Hermans et al., Lancet 354, 556-560, 1999
Molekulargenetische Untersuchungen 85
Prader-Willi-Syndrom (PWS)
SNRPN (Small nuclear ribonucleoprotein N;
Genort: 15q11-q13; OMIM #176270, *182279)
Erbgang
Autosomal-dominant bei paternaler Vererbung, überwiegend sporadische
Fälle
Klinische
Bedeutung
Das Prader-Willi-Syndrom ist wie das Angelman Syndrom (s. o.) eine neurogenetische Erkrankung, die durch den Funktionsverlust von elternspezifisch geprägten Genen im langen Arms von Chromosom 15q11.2-12 verursacht wird. Im Gegensatz zu dem AS sind die verantwortlichen Gene für
das PWS nur auf dem väterlich ererbten Chromosom aktiv.
Neugeborene haben ein geringes Geburtsgewicht und einen reduzierten
Muskeltonus und weisen in den ersten Lebendmonaten eine Trinkschwäche auf.
Mit 1½ bis 2 Jahren entwickelt sich eine Hyperphagie die ohne entsprechende Kontrolle der Kalorienzufuhr zu einer massiven Adipositas und
daraus resultierenden Folgeerkrankungen führen kann. Der schwer beherrschbare Essdrang wird zu einem zentralen Problem bei Kindern mit
PWS. Bereits im Kleinkindalter fallen die verhältnismäßig kleinen Hände
und Füße, eine geringe Körpergröße und faziale Besonderheiten (mandelförmige Augen, herabgezogene Mundwinkel) auf.
PWS-Patienten zeigen eine verminderte Intelligenz, die von einer niedrigen normalen Intelligenz bis hin zu einer schweren mentalen Retardierung
reichen kann. Die Sprachentwicklung ist deutlich verzögert und Verhaltensauffälligkeiten beinhalten vor allem Wutausbrüche, ablehnendes Verhalten und Stehlen von Essen.
Nahezu bei allen PWS Patienten lässt sich eine Veränderung auf dem väterlich erebten Chromosom 15 nachweisen. Bei ca. 70% liegt eine 3-4 Megabasen große Deletion (del 15q11-q13) vor, bei ca. 25-30% der Patienten
findet man anstelle eines väterlichen Chromosoms 15 ein zweites mütterliches Chromosom (uniparentale Disomie 15) und 1% der Fälle haben einen
Imprinting-Fehler, bei dem das väterliche Chromosom 15 eine mütterliche Prägung aufweist. In weniger als 1% der Fälle lässt sich die genetische
Ursache nicht klären. Welche der väterlich geprägten Gene in 15q11-13
für die jeweiligen phänotypischen Veränderungen des PWS verantwortlich sind, ist derzeit noch nicht bekannt. Eine Schlüsselfunktion scheint das
SNORD116-Gen (HBII-85 snoRNA Gen) zu haben.
Indikation
Geringes Geburtsgewicht, ausgeprägte Hypotonie („floppy infant“) und
Trinkschwäche im Säuglingsalter; Hyperphagie mit resultierender Adipositas ca. ab dem 18. Lebensmonat; kleine Hände und Füße, geringe
Körpergröße, faziale Auffälligkeiten, Hypogenitalismus, Hodenhochstand,
Entwicklungsverzögerung bis mentale Retardierung.
86 Molekulargenetische Untersuchungen
Mutationen
70% Paternale Deletion 15q11-q13
25-30% Maternale uniparentale Disomie 15
1% Imprintingdefekt
Selten balanzierte Translokation mit Bruchpunkt im SNRPN-Locus
Material
Ca. 2-5 ml EDTA-Blut
Für eine Unterscheidung zwischen Imprinting-Defekt und uniparentaler
Disomie ist zusätzlich EDTA-Blut von beiden Eltern erforderlich.
Untersuchungs- Methylierungsspezifische MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Ammethode
plification) zum Nachweis einer Deletion, eines Imprintingdefektes oder
einer maternalen uniparentalen Disomie in 15q11.2-12.
Untersuchungs- Ca. 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Jin, Korean J Pediatr 54:55-63, 2011
Horsthemke et al., Medgen 22:282-286, 2010
Buiting, Am J Med Genet C Semin Med Genet 154C:365-376, 2010
Protein C
PROC-Gen
Genort: 2q13-14; OMIM #176860
Erbgang
Autosomal-rezessiv oder -dominant
Klinische
Bedeutung
Protein C ist Teil eines Multifaktorkomplexes. Der gebundene und aktivierte Protein C-Komplex degradiert die aktivierten Faktoren Va und VIIIa.
Der heterozygote Protein C-Mangel ist durch wiederkehrende venöse
Thrombosen gekennzeichnet. Jedoch können viele Erwachsene mit einem
heterozygotem Mangel asymptomatisch sein.
Indikation
V. a. angeborenen Protein C-Mangel, rezidivierende Thromboembolien
und tiefe Venenthrombosen unklarer Ätiologie.
Mutationen
Mehr als 160 verschiedene Mutationen sind bislang geschrieben.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 9 Exons, Deletions- und Duplikationsscreemethode
ning über MLPA
Untersuchungs- 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Millar, D. S. et al.;Hum. Genet. 106: 646-653, 2000
Rocchi, M. et al.; Hum. Genet. 74: 30-33, 1986
Molekulargenetische Untersuchungen 87
Protein S
PROS1-Gen;
Genort: 3q11-; OMIM # 176880
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Protein S ist ein körpereigenes Vitamin-K-abhängiges Antikoagulans, welches im Blut normalerweise zu ca. 60% an das C4b Bindungsprotein gebunden vorliegt. Das freie Protein S dient hingegen dem Protein C als Kofaktor
bei der Inaktivierung der Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa. Ein Mangel an
Protein S führt daher zu einer erhöhten venösen Thromboseneigung.
Erniedrigte Protein S-Werte können auf angeborenen Synthesestörungen
beruhen oder auf verschiedene physiologische oder pathologische Umständen zurückzuführen sein. So sind Protein S-Spiegel physiologischerweise während der Schwangerschaft erniedrigt. Auch unter oraler Kontrazeption, bei allen fortgeschrittenen Leberfunktionsstörungen, bei Vitamin K
Mangel und unter Cumarin-Therapie finden sich verminderte Werte.
Ein angeborene Protein S-Mangel ist hingegen mit einer Prävalenz von ca.
0,16% - 0,21% eher selten, führt aber bei 50% der heterozygot Betroffenen
häufig schon vor dem 45. Lebensjahr zu tiefen Venenthrombosen und pulmonalen Embolien. Unter Cumarin-Therapie wurden bei diesen Patienten
schwere Nekrosen beschrieben. Ein homozygote Protein S-Mangel scheint
mit dem Leben nur bedingt vereinbar und kann sich im Neugeborenen
Alter durch eine Purpura fulminans manifestieren.
Art und Lokalisation von Mutationen im PROS1-Gen beeinflussen die klinische Ausprägung des Protein S-Mangels. Diagnostisch werden verschiedene Formen unterschieden:
Typ
Defekt
Protein S-Antigen
gesamt
Protein-S
funktionell
Protein
S-Antigen
frei
I
quantitativ
erniedrigt
erniedrigt
erniedriegt
II
qualitativ
normal
erniedrigt
normal
III
quantitativ
normal
erniedrigt
erniedrigt
88 Molekulargenetische Untersuchungen
Indikation
V. a. hereditären Protein S-Mangel, rezidivierende Thromboembolien und
tiefe Venenthrombosen unklarer Ätiologie. Als relative Kontraindikation ist
ein mäßig erniedrigter Wert während einer Schwangerschaft anzusehen.
Mutationen
In Korrelation zum Phänotyp werden Missense oder Nonsensemutationen
sowie größere Deletionen einzelner Exons oder des gesamten Gens gefunden.
2-5 ml EDTA-Blut
Material
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung aller 15 Exons, Deletionsscreening über MLPA
methode
Untersuchungs- 4-6 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Duebgen S. et al., Am J Clin Pathol, 137:178-184 (2012)
Lundwall, A. et al.;. Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 6716-6720 (1986)
Schmidel, D. K. et al., Biochemistry 29: 7845-7852 (1990)
Prothrombin (Gerinnungsfaktor II) Dimorphismus
Faktor II-Gen
Genort: 11p11-q12; OMIM +176930
Klinische
Bedeutung
Der Blutgerinnungsfaktor II (Prothrombin) ist eine inaktive Vorstufe des
Thrombins. Prothrombin wird gespalten und damit in die aktive Form
Thrombin überführt, welches Fibrinogen in Fibrin umwandelt. Dies ist der
letzte Schritt der Gerinnungskaskade. Ein G → A Basenaustausch an Position 20210 in der 3‘- nichttranslatierten Sequenz des Prothrombin-Gens
führt zu einem erhöhten Prothrombin- Spiegel mit einer vermehrten Prothrombin-Aktivität, welche mit einem moderat erhöhten Risiko für venöse Thrombosen assoziiert ist. Im Vergleich zur Normalbevölkerung haben
heterozygote Träger dieser Mutation ein 3 bis 4fach erhöhtes Thromboserisiko. Bei einem Zusammenwirken mehrerer Risikofaktoren (z. B. Rauchen oder Einnahme oraler Kontrazeptiva) bzw. einer Kombination dieser
o. g. Mutation mit der Faktor V-Leiden-Mutation in heterozygoter oder
homozygoter Form, erhöht sich das Risiko für Venenthrombosen um ein
Vielfaches.
Indikation
V. a. familiäre Thrombophilie
Mutationen
G20210A-Mutation
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein Abschnitt des
methode
Prothrombingens, der den Mutationsort beinhaltet, wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das Vorhandensein der Mutation
wird durch eine reverse Hybridisierung nachgewiesen.
Untersuchungs- 2-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Poor et al., Blood 88(10):368- 3703, 1996
De Stefano et al., New Eng J of Med 341(11):801- 806, 1999
Molekulargenetische Untersuchungen 89
Pyruvatkinase, erythrozytäre
PKLR-Gen (Pyruvatkinase; Genort: 1q22; OMIM #266200)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Dieser Enzymdefekt ist seltener als der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel. Er soll bevorzugt bei Nordeuropäern vorkommen.Es handelt
sich um den häufigsten Defekt der erythrozytären Glykolyse. Unterbrochen
wird die biochemische Kaskade vom Glycerinaldehyd zum Pyruvat und
Ljctat. Reife Erythrozyten haben keine Mitochondrien mehr, deshalb ist die
Glykolyse sehr wichtig zur Energiegewinnung. Der resultierende ATP-Mangel kann die Zellform und Membranstruktur der Erythrozyten nicht mehr
sichern. Die Erythrozyten werden im rerikuloendothelialen System vorzeitig abgebaut. Die hämolytische Anämie bei Pyruvatkinasemangel wird
besser toleriert als andere Anämien mit gleich niedrigem Hämoglobin, weil
der Enzymdefekt sekundär den Gehalt der Erythrozyten an 2.3-Biphosphoglycerat (2.3-BPG) erhöht. 2.3-BPG verschiebt die Sauerstoff-HämoglobinDissoziationskurve nach rechts und erleichtert die Freisetzung von Sauerstoff aus dem Hämoglobin. Die Hämolyse kann schon im Kindesalter, in
manchen Fällen auch erst nach dem 20. Lebensjahr manifest werden. Man
findet dann die typischen Zeichen der Hämolyse. Im Kindesalter kommen
Skelettveränderungen ähnlich wie bei der homozygoten Form der Thalassämie vor.
Indikation
Verdacht auf angeborene, nicht-sphärozytäre, chronisch hämolytische Anämien, zum Teil auch durch Medikamentenunverträglichkeit oder Infektionen hervorgerufene, akut auftretende hämolytische Krisen.
Mutationen
Bisher wurden mehr als 190 ursächliche PKLR-Mutationen beschrieben.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- PCR und Sequenzierung der kodierenden Exons 1-12
methode
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Baronciani, L., Bianchi, P., Zanella, A., Blood Cells Molecules Dis. 22: 85-89, 1996.
Beutler, E., Baronciani, L., Hum. Mutat. 7: 1-6, 1996.
RETT-Syndrom
MECP2-Gen (Methyl-CpG-binding protein 2;
Genort: Xq28; OMIM *300005, #312750)
Erbgang
X-chromosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Bei dem Rett-Syndrom handelt es sich um eine Encephalopathie mit
schwerwiegender mentaler Retardierung, die mit einer Inzidenz von
1:10.000 bis 1:15.000 hauptsächlich Mädchen betrifft.
90 Molekulargenetische Untersuchungen
Zunächst entwickeln sich die Kinder normal, bis im Alter von 6 bis 18
Monaten ein Entwicklungsstillstand eintritt. Es folgt ein Rückgang bereits
erworbener sprachlicher und motorischer Fertigkeiten und der Fähigkeit zu
sozialer Interaktion. Typisch ist das Auftreten von stereotypen Handbewegungen. Weitere Symptome sind verzögertes Wachstum, Mikrozephalie,
Skoliose, Gangataxien, Krampfanfälle, respiratorische Störungen und Autismus. Das Ausmaß dieser Verluste ist sehr variabel und neben der klassischen Form des Rett-Syndroms werden atypische Varianten beobachtet.
Krankheitsrelevant sind Mutationen des MECP2-Gen, die meist de novo
auftreten. Das Genprodukt ist ein DNA-bindendes Protein, das für die normale Funktion der Nervenzellen und für die Gehirnentwicklung essentiell ist. Bei ca. 90% bis 95% der Patienten mit klassischem Rett-Syndrom
und 30% bis 40% mit atypischem Rett-Syndrom können Mutationen im
MECP2-Gen nachgewiesen werden.
In ca. 10% der Fälle werden auch Deletionen, bei einigen männlichen Patienten auch Duplikationen des gesamten MECP2-Gens, zum Teil mit Duplikation von benachbarten Regionen, festgestellt. MECP2-Punktmutationen
können auch bei 1,3% bis 1,7% männlicher Kinder zu einem breiten Spektrum von neurologischen Erkrankungen von milder mentaler Retardierung
bis hin zu neonatal letalen Encephalopathien führen, wobei Jungen mit
typischer Rett-Symptomatik nur selten beschrieben sind. Bei asymptomatischen Frauen wurde gezeigt, dass MECP2-Mutationen in Kombination mit
einer weitgehend verschobenen X-Chromosom-Inaktivierung vorlagen, die
den Schweregrad der Erkrankung beeinflusst.
Gelegentlich finden sich auch bei Patienten mit einem unspezifischen klinischen Bild des Angelman-Syndroms oder einer XLMR (X-linked mental
retardation) sowie bei Makroorchidismus (PPM-X-Syndrom) Mutationen im
MECP2-Gen.
Indikation
V. a. Rett-Syndrom; männliche Säuglinge mit unklarer schwerer Enzephalopathie
Mutationen
Punktmutationen, Deletionen und Duplikationen im MECP2-Gen; 70%
aller Mutationen betreffen die 8 häufigsten Mutationen (R106W, R133C,
T158M, R168X, R255X, R270X, R294X, R306C)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Exons 1 bis 4
methode
des MECP2-Gens werden mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung analysiert. Das Vorliegen von Deletionen oder Duplikationen wird
mittels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) untersucht.
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Villard L, J Med Genet 44:417-423, 2007; Williamson and Christodoulou, Eur J Hum
Genet 14:896-903, 2006; Van Esch et al., Am J Hum Genet 77:442-453, 2005; Amir et
al., Nature Genetics 42:e15, 1999; Wan et al., Am J Hum Genet 65:1520-1529, 1999.
Molekulargenetische Untersuchungen 91
SHOX-(Short Stature Homeobox) Haploinsuffizienz, LeriWeill Dyschondrosteosis (LWD), Mesomele Dysplasie Typ
Langer (LD)
SHOX-Gen (Short stature homeobox, Genort: Xpter-p22.32; Ypter-p11.2,
OMIM *312865, #127300, #249700, #302950)
Erbgang
Pseudoautosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Wachstumsstörungen sind mit einer Inzidenz von 3:100 relativ häufig.
Die Körpergröße eines Menschen wird durch verschiedene genetische und
umweltbedingte Faktoren beeinflusst. Minderwuchs kann durch Wachstumshormon-Mangel, Wachstumshormon-Rezeptor-Defekte und Mutationen in Genen, die zu Skeletterkrankungen führen, verursacht werden.
Eine SHOX-Haploinsuffizienz mit heterozygot vorliegenden Mutationen im
SHOX-Gen wurde nachgewiesen bei 2% bis 15% der Patienten mit idiopatischem Kleinwuchs, bei 50% bis 90% der Patienten mit Leri-Weill Dyschondrosteosis und bei fast 100% der Mädchen mit Turner-Syndrom. Patienten mit dem schwerwiegenderen Phänotyp der Langer Dysplasie weisen
SHOX-Gen-Mutationen in homozygoter Form auf.
Das SHOX-Gen liegt in der pseudoautosomalen Region (PAR1) der X- und
Y-Chromosomen und entgeht der X-Inaktivierung. Durch alternatives Spleißen werden zwei Isoformen gebildet, von denen nur das längere Genprodukt (SHOXa) als Transkriptionsaktivator wirksam ist. SHOX-Mutationen
können auch innerhalb einer Familie zu variablen Phänotypen führen.
Indikation
Minderwuchs, idiopathischer Kleinwuchs (Körpergröße unter der 3. Perzentile für das chronologische Alter), dispropotioniertes Wachstum, Mesomelie (Verkürzung von Unterarmen und Unterschenkeln), MadelungDeformität (Knochenfehlbildungen der Handgelenke)
Mutationen
Deletionen, Duplikationen und Punktmutationen im SHOX-Gen
Etwa 80% aller SHOX-Mutationen sind Deletionen mit einer Größe zwischen 90 kb und 2.5 Mb oder mehr. Die häufigsten Punktmutationen
werden in Exon 3 und 4 gefunden, die den Bereich der Homeodomäne
kodieren.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert und zunächst mitmethode
tels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplifikation) nach vorliegenden Deletionen bzw. Duplikationen des SHOX-Gens untersucht. Bei
negativem Ergebnis werden die Exons 2 bis 6a des SHOXa-Gens mittels
PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht
92 Molekulargenetische Untersuchungen
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Binder, Horm Res Peadiatr 75:81-89, 2011; Schneider et al., Am J Hum Genet 77:89-96,
2005; Rappold et al., J Clin Endocrin & Metab, 3:1402-1406, 2002;
Rao et al., Nat Genet 16:54-63, 1997
Spinobulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy Syndrom)
Androgenrezeptor-Gen (AR, Genort: Xq11-q12; OMIM #313200)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
X-chromosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Patienten mit Spinobulbärer Muskelatrophie (SBMA) zeigen eine proximale
Muskelschwäche und -atrophie, sowie Faszikulationen, die hauptsächlich
die perioralen Muskeln betreffen. Weitere häufig auftretende Merkmale
sind Intentionstremor, Muskelkrämpfe, Schluckbeschwerden, eine periphere Androgenresistenz mit Hodenatrophie, eingeschränkter Fruchtbarkeit und Gynäkomastie. Die neurologische Symptomatik beginnt meist
zwischen dem 20. und 50. Lebensjahr und verläuft langsam progressiv. In
der Regel betrifft die Erkrankung an SBMA nur Männer, Frauen mit einem
heterozygot vorliegenden verlängerten Allel zeigen keine Symptome, können aber diese Krankheit übertragen.
Eine verlängerte CAG-Nukleotidfolge im translatierten Bereich des Androgenrezeptor-Gens ist die für die Krankheit verantwortliche Mutation.
Diese hat den Einbau einer zu langen Abfolge von Glutaminresten in das
Androgenrezeptor- Protein zufolge. Das Protein verliert seine ursprüngliche Struktur und damit seine eigentliche Funktion in spinal und bulbär
lokalisierten Motoneuronen. Pathophysiologisch wird eine Degeneration
der Spinalwurzelganglien beobachtet. Während man bei Normalpersonen
eine Folge von weniger als 34 Tripletts findet, tragen Betroffene 38 und
mehr CAG-Kopien.
Indikation
Muskelschwäche und -atrophie (v. a. perioral)
Mutationen
CAG-Expansion im AR-Gen
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein Abschnitt des
methode
Androgenrezeptor-Gens, der die CAG-Triplettwiederholung beinhaltet,
wird mittels PCR amplifiziert. Aus der Längenbestimmung des PCR-Produktes über Kapillarelektrophorese wird die Anzahl der CAG-Nukleotidtripletts ermittelt.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Atsuta et al., Brain. 129:1446–55, 2006; Kreß et al., Med Genetik: 5:269- 270, 1993;
La Spada et al., Nature 352:77- 79, 1991
Molekulargenetische Untersuchungen 93
Spinocerebelläre Ataxien (SCA, Olivopontocerebelläre
Atrophien)
SCA1, SCA2, SCA3 (Machado-Joseph disease (MJD)), SCA6
und SCA7
SCA1: ATXN1-Gen (Genort: 6p23; OMIM *601556, #164400)
SCA2: ATXN2-Gen (Genort: 12q24; OMIM *601517, #183090)
SCA3: ATXN3-Gen (Genort: 14q24.3-q31; OMIM *607047, #109150)
SCA6: CACNA1A-Gen (Genort: 19p13; OMIM *601011, #183086)
SCA7: ATXN7-Gen (Genort: 3p21.1-p12; OMIM *607640, #164500)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die spinocerebellären Ataxien sind eine Gruppe heterogener neurodegenerativer Erkrankungen mit progressiven neuronalen Verlusten, die in
unterschiedlichem Ausmaß das Kleinhirn, die Hirnstammkerne und den
Tractus spinocerebellaris betreffen.
Das klinische Bild ist meist gekennzeichnet durch Stand- und Gangataxie,
Dysarthrie, Schluckschwierigkeiten u. a.. Darüber hinaus weisen einige Patienten eine Ophthalmoplegie, ein erniedrigtes Vibrationsempfinden und
eine Sphinkter-Funktionsstörung auf. Bei der SCA7 ist die Ataxie assoziiert
mit einer retinalen Degeneration. Das relativ späte Manifestationsalter liegt
in der Regel zwischen dem 30. oder 40. Lebensjahr, kann aber auch innerhalb einer Familie sehr variabel sein.
Bisher konnten einige Gene identifiziert werden, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind und für die Entstehung verschiedener
SCA-Typen verantwortlich sind. Allen hier untersuchten SCA-Genen liegt
als krankheitsverursachende Mutation die Verlängerung einer CAG-Nukleotidfolge zugrunde. Die Anzahl der CAG-Nukleotidwiederholungen bei
Normalpersonen ist je nach Gen variabel. Krankheitsrelevante Symptome
treten auf, wenn die jeweils kritische Triplettanzahl von CAG-Nukleotiden
überschritten wird. Die Triplettwiederholung liegt im translatierten Bereich
der Gene und bewirkt bei pathologischer Triplettverlängerung den Einbau
einer zu großen Anzahl von Glutaminresten in das entsprechende Protein.
Dies führt höchstwahrscheinlich zu einer sogenannten ‚gain of function‘,
wobei das dann toxische Protein einen neuronen- und krankheitsspezifischen Zelltod verursacht.
Indikation
Störung der Bewegungskoordination (Stand- und Gangataxie), Sprechstörungen
Mutationen
CAG-Expansion in den Genen ATXN1 (für SCA1), ATXN2 (für SCA2),
ATXN3 (für SCA3), CACNA1A (für SCA6) und ATXN7 (für SCA7)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
94 Molekulargenetische Untersuchungen
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Ein die CAGmethode
Triplettwiederholung beinhaltender Abschnitt des Ataxin-1- (SCA1), Ataxin-2- (SCA2), Ataxin-3- (SCA3/MJD), a1A Calcium- Kanal- (SCA6) oder
des Ataxin-7-Gens wird mittels PCR amplifiziert.
Die Längenbestimmung des jeweiligen PCR-Produktes und die daraus resultierende Anzahl der CAG-Nukleotidtripletts erfolgt mittels Kapillarelektrophorese.
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Sequeiros J et al., Eur J Hum Genet. 18:1188-1195, 2010
Riess et al., Deutsches Ärzteblatt 98: A1546-1558, 2001
SCA1: Orr et al., Nat Genet 4:221-226, 1993
SCA2: Imbert et al., Nat Genet 14:285-291, 1996
SCA3: Kawaguchi et al., Nat Genet 8:221-227, 1994
SCA6: Zhuchenko et al., Nat Genet 15:62-69, 1997
SCA7: David et al., Nat Genet 17:65-70, 1997
Taubheit, nicht syndromisch, neurosensorisch, DFNB1
(DeaFNess Typ B1)
GJB2-Gen / Connexin 26 (Genort: 13q11-q12; OMIM *121011)
GJB6-Gen / Connexin 30 (Genort: 13q12; OMIM *604418)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Eines von 650 Kindern wird mit einem schwerwiegenden kongenitalen
Gehörverlust geboren, etwa die Hälfte der Ursachen ist genetischen Ursprungs. Die autosomal rezessive, nicht syndromische, neurosensorische
Taubheit ist die häufigste Form von vererbter Taubheit im Kindesalter. Die
Erkrankung zeigt eine weitreichende genetische Heterogenität (ca. 100
Loci) und nur beschränkte klinische Differenzierungsmöglichkeiten. Im
Lokus DFNB1 (deafness neurosensory, autosomal recessive 1) auf Chromosom 13 konnten die beiden Gene GJB2 (gap junction beta-2) und GJB6
identifiziert werden. Mutationen in dem GJB2-Gen können bei bis zu 50%
der Patienten mit autosomal rezessiver, nicht syndromischer, neurosensorischer Taubheit nachgewiesen werden. GJB2 kodiert für das Protein Connexin 26 aus der Connexin-Familie. Diese Transmembranproteine bilden
spezialisierte Strukturen auf Plasmamembranen (sog. ‚gap junctions‘). Aus
diesen Porenproteinen entsteht ein Netzwerk, durch das eine Interaktion
und Kommunikation von Zellen im Zellverband ermöglicht wird (z. B. zur
Erhaltung der K+ Homeostase der Innenohrzellen von Säugern).
Die GJB2-Mutationsträger zeigen normale Intelligenz und einen unauffälligen Phänotyp ohne äußere Ohrfehlbildungen. Die Schwere des Gehörschadens ist sehr variabel und kann selbst innerhalb einer Familie nicht
vorhergesagt werden.
Molekulargenetische Untersuchungen 95
Klinische
Bedeutung
Die häufigste, in verschiedenen Bevölkerungsgruppen (u. a. Kaukasiern)
vorkommende GJB2-Mutation (ca. 70% der Allele) betrifft die Deletion der
Base G (Guanin) in Position 35 in einer Abfolge von 6 Guaninen (35delG).
Diese Mutation findet man auch als Neumutation. Weitere Mutationen
in der gesamten kodierenden Sequenz des GJB2-Gens sind beschrieben,
die in homozygoter oder zusammengesetzt heterozygoter Form vorliegen
können. Bei Patienten mit nur einer GJB2-Mutation in heterozygoter Form
zeigen 10-50% (in Abhängigkeit von ihrer ethnischen Herkunft) zusätzlich
eine Deletion des GJB6-Gens (digenische Vererbung). Selten wurde diese
Deletion (del(GJB6-D13S1830)) auch in homozygoter Form beobachtet.
Indikation
Schwerhörigkeit (congenital, nicht progressiv, neurosensorisch)
Mutationen
GJB2-Mutationen in den Exons 1 und 2, GJB6-Deletion [del(GJB6D13S1830)]
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert.
methode
Stufe 1: Mittels PCR wird zuerst das Exon 2 und ggf auch Exon 1 des GJB2Gens amplifiziert und sequenziert.
Stufe 2: Untersuchung auf eine Deletion [del(GJB6-D13S1830)] im GJB6Gen mittels Multiplex-PCR und Agarosegelelektophorese.
Untersuchungs- Ca. 2-3 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Snoeckx et al., Am J Hum Genet, 77:945-957, 2005
Roux et al., BMC Medical Genetics, 5, 2004 (http://www.biomedcentral.com/1471-2350/5/5)
Del Castillo et al., Am J Hum Genet, 73: 1452-8, 2003
Denoyelle et al., Hum Mol Genet, 6:2173-2177, 1997
Kelsell et al., Nature 387:80-83, 1997
Thalassämie (alpha)
HBA-Gen (Hämoglobin alpha, Alpha-Globin;
Genort: 16p13.3; OMIM +141800, *141850)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Alpha-Thalassämie gehört zu den Hämoglobinopathien, und kommt wie
alle Thalassämien besonders häufig in Malaria-Endemiegebieten (SüdostAsien, Arabien, Afrika und Mittelmeerländer) vor. Die häufigste molekulargenetische Ursache für Alpha-Thalassämie ist die Deletion eines oder
mehrerer alpha-Globin-Gene. In seltenen Fällen können auch Punktmutationen bzw. kleinere Deletionen und Insertionen in den alpha-GlobinGenen für eine alpha-Thalassämie ursächlich sein. Durch ein Defizit an
alpha-Globinketten kommt es zur vermehrten Bildung von gamma- und
beta-Globinen, die zu pathologischen Hämoglobinvarianten führen und
maßgeblich am Krankheitsbild der Alpha-Thalassämie beteiligt sind.
96 Molekulargenetische Untersuchungen
Da in der normalen menschlichen Zelle der alpha-Globin-Genkomplex
aus vier alpha-Globin-Genen besteht (je ein HBA1- und ein HBA2-Gen auf
jedem Chromosom 16), ist der Schweregrad des Krankheitsbildes abhängig
von der Anzahl der deletierten bzw. defekten alpha-Globin-Gene:
•Asymptomatische α-Thalassaemia minima (= heterozygote α+ (-α/αα)
Thalassämie). Eine fehlende oder defekte Gen-Kopie hat keine klinischen Auswirkungen.
• Bei Patienten mit α-Thalassaemia minor liegen zwei defekte und zwei
normale alpha-Globin-Genen vor entweder als heterozygote α° Form
(--/αα) oder als homozygote α+ Form (-α/-α). Die Patienten weisen
eine Mikrozytose und Hypochromasie in unterschiedlicher Ausprägung
und häufig eine leichte Anämie auf.
• Patienten mit drei inaktiven Genen haben die „HbH-Krankheit“. Der
Mangel an alpha-Ketten führt zur vermehrten Bildung von Tetrameren
aus vier beta-Ketten (Hämoglobin H). Die klinischen Symptome werden
einerseits durch die geringe Löslichkeit von Hämoglobin H verursacht,
die zu einem vorzeitigen Abbau der Erythrozyten führt. Zum anderen
hat die erhöhte Sauerstoffaffinität von Hämoglobin H einen Sauerstoffmangel im Gewebe zu Folge. In Abhängigkeit von der Konzentration an
Hämoglobin H ist der Schweregrad der Erkrankung sehr variabel und
reicht von einer nicht behandlungsbedürftigen Form bis zu einer ausgeprägten chronischen Hämolyse, die mit Bluttransfusionen behandelt
werden muss.
• Die schwerste Form der α-Thalassämie, das Hb-Bart‘s Hydrops fetalis
Syndrom (= homozygote α° Form (--/--)) führt häufig schon während
der Schwangerschaft oder perinatal zum Tod des Kindes. Durch das
vollständige Fehlen der alpha-Ketten werden Tetrameren aus gammaGlobinketten (Hämoglobin Bart) gebildet, einer Hämoglobinvariante,
die für den Sauerstofftransport nutzlos ist.
Indikation
Auffällige Hb-Elektrophorese und auffälliges Blutbild mit Verdacht auf
α-Thalassämie, hypochrome mikrozytäre Anämie; pränatal bei bekannter
Mutation beider Eltern.
Mutationen
Häufigste Form: vollständige Deletion eines oder mehrerer der insgesamt
vier α-Globin-Genkopien. Zusätzlich wurden mehr als 50 Punktmutationen oder kleinere Deletionen bzw. Insertionen innerhalb des Gens beschrieben.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert und das α-Globinmethode
Gen zunächst mittels MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) auf Deletionen untersucht. Bei negativem Ergebnis werden die drei
kodierenden Exons von α-Globin inklusive Exon/Introngrenzen mit PCR
amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen
untersucht.
Molekulargenetische Untersuchungen 97
Untersuchungs- Ca. 4-6 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Galanello, in: GeneReviews (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1435/)
Muncie and Campbell, Am Fam Physician 80:339-344, 2009
Chui et al., Blood 101:791-800, 2003
Chui and Waye, Blood 91:2213-2222, 1998
Thalassämie (beta) und Sichelzellanämie
HBB-Gen (Hämoglobin beta, Beta-Globin;
Genort: 11p15.5; OMIM +141900)
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die β-Thalassämie beruht auf Gendefekten im β-Globin-Gen auf Chromosom 11, die zu einer verminderten oder fehlenden β-Globin-Synthese
führen.
• Heterozgote Mutationsträger mit einer „Thalassaemia minor“ weisen mit einer leichten Blutarmut und teilweise leicht vergrößerten Milz
in der Regel keine therapiebedürftige Symptomatik auf.
• Homozygote Mutationsträger haben die schwere Form der „Thalassaemia major“, (= Cooley-Anämie) die bereits im ersten Lebensjahr
zu Gedeihstörung, Blässe, Ikterus und Hepatosplenomegalie führt.
Diese Patienten sind lebenslang transfusionsbedürftig. Eine Knochenmarktransplantation ist die einzige kurative Behandlung.
• Eine Zwischenform ist die „Thalassaemia intermedia“ mit einem relativ variablen Spektrum bezüglich des Phänotyps und dem Zeitpunkt
des Auftretens der ersten Symptome. Bei der Thalassaemia intermedia sind auch autosomal dominant vererbbare Formen bekannt. Eine
Mutation im β-Globin in heterozygoter Form kann in Kombination mit
einer Veränderung in einem anderen Globin-Gen (z. B. einer alphaGlobin-Genduplikation) vorliegen. In Asien wird häufig ein Aminosäureaustausch von Glutaminsäure durch Lysin an Position 26 der b-Globinkette (= HbE-Mutation) beobachtet.
Die Sichelzellenanämie ist eine Multisystem-Erkrankung, die Episoden akuter Krankheit und progressiven Organ-Schaden vereinigt. Hämoglobin-Polymerisierung, die zu Erythrozytenrigidität und Gefäßverschlüssen führt, ist
wesentlich bezüglich der Pathophysiologie der Krankheit. Auch chronische
Anämie, Hämolyse und Vasculopathien werden beschrieben. Die häufigste
Ursache der Sichelzellenanämie ist die HbS Variante mit der HämoglobinSS-Krankheit, die hauptsächlich bei Afrikanern vorkommt.
98 Molekulargenetische Untersuchungen
Indikation
Blässe, Ikterus, Infektneigung, Gedeihstörung und Hepatosplenomegalie
im Verlauf des ersten Lebensjahres mit V. a. beta-Thalassämie; erhöhter
Anteil von HbF in der Hb-Elektrophorese V. a. Sichelzellanämie
Mutationen
Es sind mehr als 400 Punktmutationen oder kleinere Deletionen bzw. Insertionen innerhalb des Gens beschrieben; längere Deletionen werden nur
selten nachgewiesen.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die drei kodiemethode
renden Exons inklusive Exon/Introngrenzen des ß-Globin Gen werden mit
PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht.
Untersuchungs- 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Kohne et Kleihauer, Dtsch Arztebl Int 107: 65-71, 2010
Weatherall, Am J Hum Genet 74:385-392, 2004
Huber et al., Schweiz Med Forum 4:947-952, 2004
Cario et al., Ann Hematol 79:7-12, 2000
Kulozik et al., Br J Haematol 66: 109-112, 1987
Thiopurin-Methyltransferase (TPMT)-Defizienz
TPMT-Gen (Thiopurin-Methyltransferase Gen;
Genort: 6p22.3; OMIM #610460)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Verschiedene Thiopurine (z. B. 6-Mercaptopurin, Azathioprin oder 6-Thioguanin) werden als Immunosuppressiva bei der Behandlung von chronischer autoimmuner Entzündungen (Lupus erythematodes, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen), zur Prävention von Abstoßungsreaktionen
nach Organtransplantationen oder als Chemotherapeutika zur Behandlung
von Leukämien verwendet. Aus den zunächst inaktiven Substanzen werden
intrazellulär Thioguanin-Nukleotide gebildet, die bei Einbau in die DNA
zytotoxisch wirken. Alternativ werden Thiopurine durch Methylierung in
inaktive Metaboliten überführt und dem Aktivierungsweg zu ThioguaninNukleotiden entzogen. Ein wesentliches Enzym in diesem Abbauweg ist
die Thiopurin S-Methyltransferase (TPMT).
Verminderte oder fehlende Enzymaktivität infolge von Mutationen innerhalb des TMPT-Gens erhöht das Risiko für toxische Nebenwirkungen in
Abhängigkeit von Art und Dosis der Medikation. Dies kann zu Grippe-ähnlicher Symptomatik, zu Lebertoxizität, Pankreatitis bis zu Myelosuppression
mit tödlichem Ausgang führen.
Molekulargenetische Untersuchungen 99
Klinische
Bedeutung
Derzeit sind mindestens 30 Mutationen des TMPT-Gens bekannt. Dabei
lassen sich die vier häufigsten Allele (*2,*3A, *3B, and *3C) bei 80 bis
95% aller Kaukasier, Asiaten und Afrikaner mit verminderter TPMT-Aktivität
nachweisen.
Heterozygot vorliegende Mutationen mit einer reduzierten Enzymaktivität
findet man in ca. 5-15% der Bevölkerung, während Mutationen in beiden
Allelen mit geringer bis fehlender Enzymaktivität bei etwa 0,3% nachgewiesen werden können. Nur ein Teil der Nebenwirkungen von Thiopurinen
beruht jedoch auf einer TPMT-Defizienz.
Indikation
Geplante Behandlung mit Thiopurin-Derivaten (z. B. 6-Mercaptopurin,
Azathioprin, 6-Thioguanin)
Mutationen
Punktmutationen innerhalb von Exon 4, 6 und 9 einschließlich der Veränderungen in den TPMT Allelen *2,*3A, *3B, *3C und 3*D (238G>C
(Ala80Pro), 460G>A (Ala154Thr) und 719A>G (Tyr240Cys))
Material
1-2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Die Exons 4, 6 und
methode
9 des TPMT-Gens werden mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung auf das Vorhandensein von Punktmutationen analysiert.
Untersuchungs- Ca. 3-5 Tage
dauer
Literaturhinweise
Evidence Report no. 196, ARQH, 2010 (www.ahrq.gov/downloads/pub/evidence/pdf/
tpmt/tpmt.pdf)
Yates et al., Ann Intern Med 126:608-614, 1997
Tai et al., Am J Hum Genet 58:694-702,1996
Vitamin-D-Rezeptor (B/b-Polymorphismus)
Vitamin D Rezeptor-Gen;
Genort: 12q12-q14; MIM ID: *601769
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
Die Osteoporose ist definiert als Untergang bestimmter Knochenanteile
(Demineralisierung), wobei neben „Alterserscheinungen“ auch genetisch
bedingte Formen (50-80% der Fälle) bekannt sind. Vor allem bei jüngeren
Betroffenen muss nach Stoffwechselerkrankungen und/oder einer hormonellen Regulationsstörung gesucht werden. Ungefähr 75% der an einer Osteoporose Erkrankten weisen Veränderungen im Collagen A- und/oder im
VDR-Gen auf.
100 Molekulargenetische Untersuchungen
Durch UV-Licht wird das in der Haut befindliche 7-Dehydrocholesterol
zunächst in Calciol (Cholecalciferol, Vitamin D3) umgewandelt. Durch anschließende Hydoxylierungen in Leber und Niere entsteht daraus Calcitriol, die „aktive Form“. Der im Cytoplasma vorliegende Vitamin-D-Rezeptor
(VDR) bindet Calcitriol mit hoher Affinität, der Rezeptor-Hormon-Komplex
wandert in den Zellkern und wirkt dort als Transkriptionsfaktor bei der Regulation verschiedener Gene. Vitamin D spielt eine wesentliche Rolle bei
der Regulierung des Calcium-Spiegels im Blut und beim Knochenaufbau,
hat aber in anderen Geweben auch weitere allgemeine Funktionen bei
Zell-Differenzierung und -Proliferation und Apoptose.
Indikation
Der bb-Genotyp ist mit einer höheren Knochendichte assoziiert, während
Individuen mit dem Genotyp BB eine erhöhtes Risiko für Frakturen aufweisen.
Mutationen
In einem Intron des VDR-Gens liegt der B/b-Polymorphismus für das Restriktionsenzym BsmI, wobei eine vorhandene BsmI-Schnittstelle den Genotyp bb definiert. Beim Genotyp BB sind die Schnittstellen durch einen
Basenaustausch verändert.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus der genomischen DNA werden relevante Sequenzbereiche mittels
methode
PCR amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an
membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 4-6 Tage
dauer
Literaturhinweise
Morrison et al., Nature 367, 284-287, 1994
Uitterlinden et al., J Bone Mineral Res 16, 379-385, 2001
Molekulargenetische Untersuchungen 101
Erweiterte Diagnostik
Hämatoonkologische Erkrankungen – Erweiterte Diagnostik
Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ermöglicht den Nachweis und die Charakterisierung verschiedener Zellpopulationen im peripheren Blut und Knochenmark, unabhängig
von ihrer Morphologie, mit dem Ziel maligne von benignen Erkrankungen zu unterscheiden. Man kann so verschiedene Leukämien und Lymphome diagnostizieren
und klassifizieren. Zusammen mit der Zytomorphologie, Zytogenetik und der Molekulargenetik ist sie eine ergänzende Diagnostik der hämatologischen Erkrankungen.
Dafür werden intrazytoplasmatische oder membrangebundene Zellantigene (CDCluster of Differentiation) mit monoklonalen Antikörper markiert (Immunphänotypisierung). Letztere sind an Fluorochrome gebunden. Durch Laseranregung wird so
Licht verschiedener Wellenlängen ausgestrahlt und von Detektoren erfasst. Die so
dargestellten CD-Antigene einer Zelle ergeben deren Immunphänotyp.
Material:
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungsdauer: 2-3 Tage nach Probenerhalt
Fluoreszenz in situ Hybridisierung – FISH
Die FISH-Technik verwendet sogenannte DNA-Sonden, die spezifische chromosomale Strukturen identifizieren. Dabei wird sowohl die DNA der eingesetzten Sonden als auch die zu untersuchende Patienten-DNA denaturiert. Die Sonden-DNA
bindet an die komplementäre Patienten-DNA (Hybridisierung). Die DNA-Sonden
sind mit einem Fluorochrom markiert, so dass die zu untersuchenden Chromosomstrukturen mittels Fluoreszenz-Signale ausgewertet werden können.
Vorteil: schnelle und zuverlässige Methode zur Beantwortung gezielter Fragen
(z. B. der Nachweis der Translokation t(15;17)(q22;q12) bei dem Verdacht
auf das Vorliegen einer akuten Promyelozyten-Leukämie)
Nachteil:Informationen sind auf Chromosomen/Gene beschränkt, für die die Sonden eingesetzt wurden.
Material: 5-10 ml peripheres Blut oder Knochenmark (EDTA oder Heparin).
Chromosomenanalyse
Die Chromosomenanalyse ist für die Diagnose der hämatologischen Neoplasien obligat. Sie sichert die Diagnose und ermöglicht prognostische Aussagen. Idealerweise
erfolgt die Chromosomenanalyse aus 5 bis 10 ml mit Heparin antikoaguliertem Knochenmark. Die Knochenmarkzellen werden in der Metaphase arretiert. Es werden
20-25 Metaphasen analysiert. Mittels Bänderungstechnik wird anschließend jedes
einzelne Chromosom identifiziert.
102 Hämatoonkologische Erkrankungen
Hämatoonkologische Erkrankungen
1. Akute lymphatische Leukämie
Die Diagnostik der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beruht auf Zytomorphologie/Zytochemie, Immunphänotypisierung, Chromosomenanalyse, FISH und Molekulargenetik
a) Zytomorphologie und Zytochemie: sichern die Diagnose einer akuten lymphatischen Leukämie und grenzen diese gegenüber einer AML ab; ferner spielen sie
eine wichtige Rolle zur Beurteilung der Remission. Morphologisch lassen sich
undifferenzierte Blasten darstellen (MPO- und unspez. Esterase negativ). Eine
eindeutige Zuordnung zur lymphatischen Linie und die Abgrenzung gegenüber
einer AML M0 und M7 ist jedoch nur mittels Immunphänotypisierung möglich.
b)Immunphänotypisierung: ermöglicht die Abgrenzung gegenüber der AML sowie eine erweiterte Subklassifizierung der ALL (prognostisch und therapeutisch
relevant). Die Bestimmung des „Leukämie-assoziierter Immunphänotyp“ (LAIP)
ist Voraussetzung für die Verlaufsbeobachtung unter Therapie.
ALL-Typen mit Markerexpressionsmustern
Zellreihe
B
T
Kriterien
Subtyp
Kriterien
CD19
Pro-B-ALL
keine Expression anderer Differenzierungsantigene der B-Zellreihe
CD79a
Common-ALL
CD19, CD79a, cyCD22+, CD10+
cyCD22
Prä-B-ALL
CD19, CD79a, cyCD22+, cyIgM+
Reife B-ALL
CD19, CD79a, cyCD22+ zytoplasmatische
oder membranständige Expression von Kappaoder Lambda-Leichtketten
Pro-T-ALL
cyCD3+ CD7+
Prä-T-ALL
cyCD3+ CD2 u/o CD5+ u/o CD8+
Kortikale-T-ALL
cyCD3+ CD1a+
Reife T-ALL
cyCD3+ membranständigCD3+, CD1a-
cyCD3
(nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 451)
Hämatoonkologische Erkrankungen 103
Immunphänotypisierung zur Detektion der minimalen Resterkrankung
(MRD):
Der Nachweis residueller Leukämiezellen spricht für ein erhöhtes Rezidivrisiko.
Voraussetzung für die MRD-Diagnostik ist die Bestimmung des „Leukämie-assoziierten Immunphänotyps“ (LAIP) zum Zeitpunkt der Diagnose.
Folgende Phänotypen eignen sich zur Detektion der MRD:
B-Vorläufer-ALL:
Koexpression der Antigene CD19 und CD1 aberrante Koexpression myeloischer
Antigene, Expression von CD34
T-Vorläufer-ALL:
Koexpression von cCD3 und TdT
(Quelle: Haferlach T: ,,Diagnostic Methods in Leukaemias and Lymphomas“,2009, S. 90)
c) Die Chromosomenanalyse erfolgt zur Klassifizierung der Leukämie nach WHOKriterien sowie zur Prognosebeurteilung. Nach Anzahl der Chromosomen ist
eine Einteilung in Ploidiegruppen möglich (z. B. Hypodiploidie, Hyperdiploidie,
usw.). Ferner können strukturelle Aberrationen dargestellt werden:
Vorläufer-B-lymphoblastische Leukämie/ -lymphoblastisches Lymphom
Immunphänotyp
Typische Aberrationen
Pro-B-ALL
Common-ALL
Prä-B-ALL
t(9;22)(q34;q11.2)
t(4;11)(variabel;11q23)
t(12;21)(p13;q22)
t(1;19)(q23;p13.3)
ALL-hypodiploid (<45 Chromosomen)
ALL-hyperdiploid (> 50 Chromosomen)
(nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 449)
Vorläufer-T-lymphoblastische Leukämie/ -lymphoblastisches Lymphom
Immunphänotyp
Typische Aberrationen
Prä-/Pro-T-ALL
Kortikale T-ALL
Reife T-ALL
t(10;14)(q24;q11)
t(1;14)(p32;q11)
t(11;14)(p15;q11)
(nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 449)
104 Hämatoonkologische Erkrankungen
d)FISH: wird häufig als Ergänzung zur klassischen Chromosomenanalyse durchgeführt. Innerhalb von 24 Stunden kann z. B. das Vorliegen einer PhiladelphiaTranslokation t(9;22)(q34;q11) nachgewiesen werden. Ein FISH-Screening auf
häufige Aberrationen wird bei nicht eindeutigen Chromosomenanalysen eingesetzt. Zum Nachweis von Residualzellen wird FISH in Fällen mit unbalancierten
Karyotypen verwendet.
e) Die Molekulargenetik: weist Fusionsgene sowie Immunglobulin- und T-ZellRezeptorgen-Rearrangements nach.
Subtyp
Fusionsgen
Pro-B-ALL
AF4-MLL
Common-ALL
BCR-ABL
Prä-B-ALL
BCR-ABL, MLL-ENL
Reife B-ALL
cMYC-IgH
Pro-/Prä-T-ALL
HOX11-TCRα/δ
Kortikale T-ALL
RHOM1/TCRα/δ
Reife T-ALL
TAL1/TCRα/δ
(nach Fuchs R., Staib P, Brümmendorf T.: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage, S. 450)
Molekulargenetik MRD: erfolgt mittels „Real-time“-PCR und dient dem Nachweis von reziproken Fusionsgenen; relevant bei der BCR-ABL1-positiven ALL.
2. Akute myeloische Leukämie (AML)
Die Diagnose der AML erfolgt in einem Stufenprogramm:
-Zytomorphologie/Zytochemie
-Immunphänotypisierung
-Chromosomenanalyse
-FISH
-Molekulargenetik
Hämatoonkologische Erkrankungen 105
a)Zytomorphologie/Zytochemie: beim Verdacht auf eine akute Leukämie ist
eine Knochenmarkpunktion erforderlich. Diagnostische Kriterien sind : ≥ 20%
Blasten mit Auerstäbchen/Granula sowie zytochemische Eigenschaften (Myeloperoxidase und Esterase). Außerdem ist die Zytomorphologie das Hauptkriterium der Remissionsbeurteilung nach erfolgter Therapie.
b)Immunphänotypisierung: ermöglicht eine erweiterte Diagnostik:
Abgrenzung der AML / ALL
• Myeloische Marker sind:
cyMPO. Sichert die myeloische Herkunft.
CD33, CD13, CD65s (jedoch aberrant auch bei lymphatischen Neoplasien
nachweisbar)
Die Identifikation des FAB-Subtyps AML M0 un M7 sowie einiger zytogenetisch
definierten AML-Formen (jedoch nur als Orientierungshilfe).
Beispiele:
• AML M0: die Expression u. a. von CD13, CD33 und CD117 grenzt von
einer ALL ab, wenn lymphatische Marker nicht gleichzeitig exprimiert werden; MPO kann durchflusszytometrisch nachgewiesen werden (trotz zytochemischer Negatvität für Myeloperoxidase).
• AML M7: Expression von CD41 oder CD61
• AML mit t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1:
Blastäre Marker: CD34, CD117
Myeloische Antigene: MPO, CD13, CD33, CD65, CD15
Aberrante Koexpression CD19,CD56
• AML M3 t(15;17)
Expression von CD13, CD33, CD64dim, CD117dim
Fehlen von CD34, HLA-DR, CD11a, CD11b, CD15, CD65, CD11c
Aberrante Koexpression: CD2, CD56
(Quelle: Leach M, Drummond M, Doig A: Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis, 2013, S. 56-58)
Bestimmung eines LAIP („Leukämie-assoziierter Immunphänotyp“) zum Zeitpunkt der Diagnose, der nach Therapie zum Nachweis einer MRD („minimal
residual disease“) verwendet wird. Der MRD-Level erlaubt dann prognostische
Einschätzungen zum rezidiv-freien Überleben.
106 Hämatoonkologische Erkrankungen
c)Chromosomenanalyse: seit 2001 wird die Zytogenetik für die Subklassifizierung
der AML mit einbezogen, es resultieren AML-Subtypen, bei denen die Zytologie
und die Anzahl der Blasten nicht diagnosebestimmend sind. Die sogenannte
„AML mit rekurrenten genetischen Veränderungen“ umfasst folgende Subtypen:
•
•
•
•
•
•
•
AML mit inv(16)(p13.1;q22) oder t(16;16)(p13.1;q22)
akute Promyelozytenleukämie mit t(15;17)(q22;q12)
AML mit t(6;9)(p23;q34)
megakaryoblastäre AML mit t(1;22)(p13;q13)
AML mit t(8;21)(q22;q22)
AML mit t(9;11)(p22;q23)
AML mit inv(3)(q21;q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2)
d)FISH-Analyse: ergänzt die Chromosomenanalyse und wird bei gezielten Fragestellungen eingesetzt. Der Befund dient dann als Ausgangsparameter zur Verlaufskontrolle. Nachgewiesen werden u. a.:
t(15;17)(q22;q12)
t(8;21)(q22;q22)
inv(16)(p13q22)
Ferner hat die FISH-Diagnostik bei komplex aberranten Karyotypen zum Nachweis von Residualzellen einen wichtigen Stellenwert.
e) Die Molekulargenetik ermöglicht:
• Nachweis von Fusionsgenen: mittels RT-PCR (reverse Transkriptions-PCR)
können u. a. folgende Fusionsgene nachgewiesen werden: RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO)
CBFB-MYH11
PML-RARA
• Nachweis molekularer Mutationen: z. B. Mutationen im Nucleophosmin
(NPM1)-Gen, Tandemduplikationen im MLL-Gen (MLL-PTD), Längenmutationen im FLT3-Gen (Labor LabPMM GmbH), Mutationen im Transkriptionsfaktor CEBPA, Mutationen im TET2-Gen (“TET oncogene family member
2”), Mutationen der Isocitrat-Dehydrogenase-1 (IDH1) und IDH2-Gene.
• Detektion der minimaler Resterkrankung (MRD)-idealerweise mittels RealTime-PCR. Relevanz: Prognosebeurteilung und frühzeitige Rezidivdetektion. Qunatifiziert werden:
Fusionstranskripte z. B. RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11, PML-RARA
Mutationen z. B. NPM1-Mutationen
Hämatoonkologische Erkrankungen 107
3. Chronische lymphatische Leukämie (CLL)
Die Diagnostik der CLL beruht in erster Linie auf Zytomorphologie und Immunphänotypisierung in peripherem Blut und Knochenmark. Außerdem werden Chromosomenanalyse, FISH und Molekulargenetik zur Beurteilung von Prognose und
Verlauf eingesetzt.
a)Zytomorphologie:
Peripheres Blut: Lymphozyten >5000/µl, reifzellige Lymphozyten (klein, hohe
Kern-Zytoplasma-Relation, Chromatin verklumpt), Kernschatten. Blastäre Zellen
im Falle einer Richter-Transformation.
Knochenmark: > 30% kleine Lymphozyten
b)Immunphänotypisierung:
CLL-Phänotyp:
Expression von CD19
Koexpression von CD5 und CD23
schwache oder fehlende Expression von CD20, CD79b, FMC7
Monoklonalität von IgKappa oder IgLambda
Darüber hinaus wird die Immunphänotypisierug zum Nachweis einer minimalen Resterkrankung (MRD) sowie zur Darstellung von prognostisch relevanten
Markern: CD38, zytoplasmatische Expression von ZAP70 (prognostisch ungünstig) herangezogen.
(Quelle: http://www.dgho-onkopedia.de/de/onkopedia/leitlinien/cll)
c) Die FISH-Analyse dient dem Nachweis von t(11;14)/IGH-CCND1 zur Abgrenzung zwischen CLL und Mantelzelllymphom sowie zur Erfassung von prognostisch relevanten genomischen Aberrationen:
Aberration
Med. ÜL/Mo
17p-Deletion
32
11q-Deletion
79
Trisomie 12
114
Norm. Karyotyp
111
13q-Deletion
133
(nach Döhner H et al. NEJM 2000; 343:1910-16)
108 Hämatoonkologische Erkrankungen
d) Die Chromosomenanalyse ergänzt die FISH-Analyse indem sie komplex aberrante Karyotypen (Aberrationen ) darstellen kann (prognostisch relevant). (Rigolin et. al., Blood 2012)
e)Molekulargenetik:
IgVH-Mutationsstatus (somatische Mutationen in der variablen Region der Immunglobulin-Schwerketten-Gene)
- IGHV unmutiert: kürzere mediane Überlebenszeit
- GHV mutiert: längere mediane Überlebenszeit
(T. J. Hamblin et al. Blood 1999; R.N. Damle et al. Blood 1999)
4. Reifzellige B- und T-Zell-Lymphome
Diagnostik:
a) Zytomorphologie und Histologie: Reifegrad und Infiltrationsgrad im Knochenmark/peripheres Blut
b)Immunphänotypisierung zur Abgrenzung einer reaktiven Veränderung und
Feststellung der Linienzugehörigkeit (B oder T-Linie) sowie zur näheren Charakterisierung.
c) Chromosomenanalyse, FISH: Detektion charakteristischer Rearrangements bei
B-Zell-Lymphomen.
d)Molekulargenetik: Nachweis balancierter Rearrangements mittels RT-PCR
Wichtige Merkmale der lymphoproliferativen Erkrankungen
Diagnose
Immunphänotypisierung
Genetik
B-CLL
CD19+, CD5+, CD23+
sIg+ (niedrige Antigendichte)
CD20+ (niedrige Antigendichte)
Del (13q)
Del (11q)
Del (17q)
Trisomie 12
B-Prolymphozytenleukämie
CD19+, CD5±, CD23sIg+ (sehr hohe Antigendichte)
CD20+ (sehr hohe Antigendichte)
FMC7+
T(11;14)
Del(11q23), del(13q14)
P53-Mutationen
Hämatoonkologische Erkrankungen 109
Diagnose
Immunphänotypisierung
Genetik
Lymphoplasmazytisches Lymphom
CD19+, CD5-, CD38+
Immunozytom CD23-(in der Regel)
sIg+ (hohe Antigendichte)
CD20+ (hohe Antigendichte)
T(9;14)(p13;q32)
PAX-5-Gen-Rearrangement
Haarzell-Leukämie
CD19+, CD5CD25+ (hohe Antigendichte)
CD103+
CD11c+ (hohe Antigendichte)
sIg+ (hohe Antigendichte)
CD20+ (sehr hohe Antigendichte)
FMC7+
Variantform:
CD19+, CD5-, CD25, CD103±
CD11c (hohe Antigendichte)
sIg+ (sehr hohe Antigendichte)
CD20+ (sehr hohe Antigendichte)
FMC7+
MantelzellLymphom
CD19+, CD5+, CD23-, CD10sIg+ (lambda häufiger als kappa)
CD20+
FMC7+
t(11;14)(q13;q32)
Cyclin-D1-Überexpression
(IgH/bcl1)
Del17p,del13(q14),
Trisomie +12
Follikuläres
Lymphom
CD19+, CD5-, CD10+, CD23±,
CD11csIg+(sehr hohe Antigendichte)
CD20+
t(14;18)
bcl-2-Überexpression
Marginalzonenlymphom/
CD19+, CD5-, CD10-, CD23,
CD25CD103-,CD11c+
sIg+ (mäßig hohe Antigendichte)
CD20+
t(11;18)
del 7(q21-32), Trisomie +3
(SLVL)
Splenisches
Marginalzonenlymphom mit villösen
Lymphozyten(SLVL)
CD2+, CD3+, CD5+, CD4+,
CD8±
CD7-
Anomalien Chromosom 14
und 8
T-CLL/T-Prolymphozytenleukämie
CD2+, CD3+, CD5+, CD4+,
CD8±
CD7
Anomalien Chromosom 14
und 8
110 Hämatoonkologische Erkrankungen
Diagnose
Immunphänotypisierung
Genetik
Large granular lymphocyte-Leukämie
(LGL-Leukämie)
T-LGL-Typ:
CD2+, CD3+, CD8+, TCRαß+,
CD16+
CD4-, CD5-, CD56CD7NK-LGL-Typ:
CD2+, CD16+, CD56+
CD3-, CD4-, CD5-, TCRαßVarianten:
CD8+, CD56-, CD57CD8±CD56-CD57+
Klonales Rearrangement
des TCR-ß-Gens
Adulte T-Zell-Leukämie/Lymphom
CD2+, CD3+, CD4+, CD5+
CD7-, CD8-
Klonales Rearrangement
des TCR-Gens
Mycosis fungoides/
Sezary-Syndrom
CD2+, CD3+, CD5+, CD4+
CD7-(75% d.Fälle), CD8-
Klonales Rearrangement
des TCR-ß-Gens
(nach Sack U, Taranok A, Rothe G: Zelluläre Diagnostik.Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie. Basel, Karger,2007, S. 1018-1026)
5. Plasmazellmyelom
Die Labordiagnostik beim Plasmazellmyelom umfasst neben der Zytomorphologie
die Histologie sowie Immunfixation oder Immunelektrophorese.
Als ergänzende Methoden werden Durchflusszytometrie, FISH und Zytogenetik eingesetzt.
Immunphänotypisierung (Myelomzellen):
Forwardscatter(FSC): klein bis mittelgroß
Sidescatter(SSC) : fehlende zytoplasmatische Granulation
Antigenexpressionsmuster:
CD38+, CD138+, CD45+
CD19-, CD20-, CD10Keine Immunglobuline auf der Zelloberfläche
Zytoplasmatische Leichtkettenrestriktion
Teilweise aberrante CD56-Expression
(nach R. Fuchs, P. Staib,T.Brümmendorf: Manual Hämatologie 2013, 23. Auflage,S.628)
Hämatoonkologische Erkrankungen 111
FISH-Analyse und Zytogenetik:
Da Myelomzellen eine niedrige proliferative Aktivität besitzen, ist die konventionelle Zytogenetik nur begrenzt einsetzbar. Die Methode der Wahl zum Nachweis
genomischer Aberrationen ist die FISH-Analyse.
Wichtige Veränderungen sind:
- prognostisch ungünstige Translokationen:
t(4;14)(p16;q32)
t(14;16)(q32;q23)
- prognostisch intermediäre Translokationen:
t(11;14)(q23;q32)
- 13q-Deletionen:
prognostisch ungünstig in Verbindung mit einer 17p Deletion oder einer Translokation t(4;14)
- 17p-Deletion:
prognostisch sehr ungünstig, da schlechtes Ansprechen auf Therapie
- 16q-Deletionen:
prognostisch ungünstig
6. Myelodysplastisches Syndrom (MDS)
Die Diagnose des MDS basiert in erster Linie auf die Zytomorphologie, sie wird aber
durch Chromosomenanalyse und Immunphänotypisierung ergänzt.
a) Die Zytomorphologie erfolgt aus peripherem Blut und Knochenmark. Im peripheren Blut besteht eine Zytopenie einer oder mehreren Zellreihen. Typische
Dysplasiemerkmale sind u. a. Pseudo-Pelger-Neutrophile, Hypogranulierung,
Ringsideroblasten, Mikromegakaryozyten, Riesenthrombozyten. Die Zahl der
Blasten ist wichtig für die weitere Klassifizierung und für die Abgrenzung zur
akuten Leukämie. Die Dysplasiezeichen sollten mindestens 10% der Zellen betragen. Die Eisenfärbung ist bei einem MDS zur Darstellung der Ringsideroblasten erforderlich.
112 Hämatoonkologische Erkrankungen
b) Die Chromosomenanalyse ist für die Klassifizierung und für die Einschätzung
der Prognose sowie für die Abgrenzung zu reaktiv-toxischen Prozessen hilfreich.
Für die MDS-Diagnostik stellt sie ein obligates Verfahren dar. Allerdings ist das
MDS auch zytogenetisch eine heterogene Gruppe.
Typische Aberrationen sind:
-
-
-
-
-
-
Der Nachweis dieser Chromosomenanomalien ist Voraussetzung für die Einteilung in verschiedene Risikogruppen (günstig, ungünstig, intermediär).
Verlust des Y-Chromosoms,
Del 5q
Del 20q
Anomalien des Chromosom 7
Trisomie 8
Komplexe Aberrationen
c) Die Molekulargenetik spielt in der Routinediagnostik des MDS eine untergeordnete Rolle. Mögliche Aberrationen sind: RUNX1- (=AML1)-Gen-Mutation,
die partielle MLL-Tandemduplikation (MLL-PTD), FLT3-Längenmutationen (Labor LabPMM GmbH), sowie Mutationen von NPM1, RAS und CEBPA. Je mehr
Mutationen vorhanden sind, desto schlechter ist die Prognose. Der Anstieg der
WT1-Genexpression in der Real-Time PCR korreliert mit der Progression des
MDS. Ferner sind molekulargenetische Untersuchungen (BCR/ABL, JAK2V617F)
indiziert, wenn eine Abgrenzung gegenüber myeloproliferativen Neoplasien erforderlich ist.
d) Die Immunphänotypisierung eignet sich als ergänzende Methode zur Zytomorphologie. Sie ist insbesondere bei morphologisch schwierig einzuordnenden
Fällen hilfreich .
Die Immunphänotypisierung ermöglicht u. a.:
-
die Beurteilung der Granulation im Side-Scatter
-
Aberrante Expressionsmustern die mit den Dysplasien korrelieren und die Klonalität bestätigen
-
Quantifizierung der Blasten. Ausschlaggebend ist jedoch die prozentuelle Blastenbestimmung im Ausstrich! (die durchflusszytometrische Präanalytik führt zum Zellverlust)
Hämatoonkologische Erkrankungen 113
7. Myeloproliferative Neoplasien (MPN)
Zur Diagnostik der MPN sind Zytomorphologie, Histopathologie, Chromosomenanalyse, FISH und Molekulargenetik erforderlich.
a) Zytomorphologie/Zytochemie und Histopatologie helfen bei der Abgrenzung
der verschiedenen MPN untereinander. Außerdem wird die Zytomorphologie
zu Beurteilung der Remission unter Therapie herangezogen. Insbesondere der
Blastenanteil ist hier wichtig. Die Histopathologie ermöglicht die Beurteilung der
Knochenmarkarchitektur.
b) Die Chromosomenanalyse dient zur Bestimmung des Karyotyps sowie der bei
der MPN auftretenden Karyotyp-Veränderungen:
Chronische myeloische Leukämie (CML):
- Philadelphia-Translokation: t(9;22)(q34;q11) (bis zu 95% der Patienten)
- variante Philadelphia-Translokationen
• Philadelphia-negative BCR-ABL1-positive CML (normaler Karyotyp aber
BCR-ABL1-Fusionsgen vorhanden)
• in der Akzelerationsphase/Blastenkrise: zusätzliche Karyotyp-Veränderungen im Philadelphia-positiven Klon, z. B.: Trisomie 8, Trisomie 19
(prognostisch ungünstig).
Beurteilung der zytogenetischen Remission nach Auswertung von mindesens 20 Metaphasen. Sind keine Ph+Metaphasen nachweisbar, wird
von einer kompletten Remission ausgegangen.
Polyzythämia vera(PV):
• Deletionen im langen Arm eines Chromosoms 20 (20q),
• Zugewinne des kurzen Armes von Chromosom 9
• numerische Zugewinne der Chromosomen 8 und 9
Primäre Myelofibrose (PMF):
- numerische Veränderungen der Chromosomen 7, 8 und 9
• strukturelle Aberrationen der Chromosomenabschnitte 1q und 5q
• Deletionen der Chromosomenabschnitte 13q und 20q
Essentielle Thrombozythämie (ET):
- Zugewinn eines Chromosoms 9
114 Hämatoonkologische Erkrankungen
c) Die FISH-Analyse ergänzt die klassische Chromosomenanalyse ohne sie dabei
ersetzen zu können. Sie wird zur Beantwortung gezielter Fragen eingesetzt:
• Vorliegen eines BCR-ABL1-Rearrangements (insbesondere relevant bei Patienten mit Philadelphia-negativer, BCR-ABL1-positiver CML )
• Beurteilung der residuellen Resterkrankung
d) Die Molekulargenetik wird in erster Linie zum Nachweis eines BCR-ABL1-Rearrangement eingesetzt. Mittels PCR kann außerdem eine Quantifizierung der
BCR-ABL1 Expression erfolgen, die dann als Ausgangswert für die Verlaufskontrolle unter Therapie dient. Das Monitoring erfolgt aus peripherem Blut, vorerst
in 3-monatigen, später in 6-monatigen Abständen.
Ein Wiederanstieg der BCR-ABL1-Expression spricht für das Auftreten einer Resistenz gegenüber dem Tyrosinkinaseinhibitor. In diesem Fall hilft die Sequenzierung des ABL1-Anteils zum Nachweis sekundärer Mutationen für weitere therapeutische Maßnahmen.
Bei den BCR-ABL1-negativen MPN erfolgt die Untersuchung der V617F-Mutation im JAK2-Gen (>95% aller Patienten mit PV, ca. 50% aller ET und PMF). Außerdem eignet sich die JAK2V617F-Mutation zur MRD-Verlaufsdiagnostik mittels
Real-Time PCR, sowie zum Nachweis seltener Mutationen (z. B. Mutationen im
Exon 12 des JAK2-Gens).
c) Die Immunphänotypisierung kommt in der Blastenkrise der CML zum Einsatz,
mit dem Ziel, myeloische von lymphatischen Blasten zu unterscheiden (therapeutische Relevanz).
Quellenverzeichnis:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Fuchs R., Staib P., Brümmendorf T. Manual Hämatologie 2013, 23 Auflage, Nora-Verlag, S. 449-451, 628.
Sack U, Taranok A, Rothe G:Zelluläre Diagnostik.Grundlagen,Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie. Basel, Karger, 2007, S. 1018-1026).
Leitlinien CLL, http://www.dgho-onkopedia.de/de/onkopedia/leitlinien/cll
Döhner H et al. NEJM 2000; 343: S. 1910-16
Haferlach T: ,,Diagnostic Methods in Leukaemias and Lymphomas“, 2009, S. 90
Leach M, Drummond M, Doig A: Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis, 2013, S. 56-58
Hämatoonkologische Erkrankungen 115
Chronisch lymphatische Leukämie, IGHV-Status
IGH-Locus (IgG Heavy Chain Locus; Genort: 14q32.33; OMIM *147100)
Indikation
Der variable Bereich der Immunglobulin-Schwerketten wird im Laufe
der B-Zell-Entwicklung aus verschiedenen Genen (Variable (V)-, Diversity (D)- und Joining (J)-Gene) rearrangiert (somatische Rekombination). Eine
Antigenexposition führt zur Affinitätssteigerung durch somatische Hypermutation der rearrangierten Gene. Das rearrangierte IGHV-Gen im B-CLLKlon kann nun in unmutierter oder hypermutierter Form vorliegen. Dieser
Mutationsstatus zeigt deutliche Auswirkungen auf die Prognose. Patienten
mit hypermutierten IGH-Mutationsstatus zeigen im Median ein auf 293
Monate verlängertes Überleben im Vergleich zu 117 Monaten im unmutierten Fall. Ein hypermutiertes IGHV-Gen weist mindestens 2% Differenz
zur Keimbahnsequenz auf.
B-CLL
Material
2-5 ml EDTA-Knochenmark, 10 ml EDTA-Blut
Klinische
Bedeutung
Untersuchungs- Multiplex-RT-PCR und Sequenzierung, Datenbankabgleich, statistische
methode
Auswertung
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Hamblin et al., Blood 94: 1848-54, 1999; Damle et al., Blood 94: 1840-47, 1999;
Ghia et al., Leukemia 21: 1-3, 2007
Chronisch myeloische Leukämie
Philadelphia-Translokation (BCR-ABL;
Genort: t(9;22); OMIM *151410, 608232)
Erbgang
Klinische
Bedeutung
Somatische Mutation
Die Chronisch Myeloische Leukämie verläuft chronisch und geht im Verlauf und zuletzt in akute Krisen über. Bei etwa 90% der Patienten enthalten
die betroffenen Zellen des Knochenmarks ein Chromosom 22 mit einem
verkürzten langen Arm, verursacht durch die sog. Philadelphia-Translokation. Sie findet sich bei über 95% aller Patienten mit einer CML, bei circa 2%
der Patienten mit einer AML (akute myeloische Leukämie) und bei etwa
25% der Erwachsenen bzw. 5% der Kinder mit einer ALL (akute lymphoblastische Leukämie).
Die Philadelphia-Translokation t(9;22) (q34;q11) entspricht auf der molekularen Ebene einer Fusion von zwei Genen (reziproke Translokation
zwischen Chromosom 22 und Chromosom 9). Hierbei wird das Onkogen
c-abl von Chromosom 9 in die sogenannte bcr-Region (breakpoint cluster
region) auf Chromosom 22 verlagert. Aus der Fusion von kodierenden Sequenzen des ABL-Gens und des BCR-Gens wird ein Hybridgen gebildet,
dessen Transkriptionsprodukt als BCR/ABL-mRNA in den betroffenen Zellen zur Bildung eines veränderten c-abl-Proteins mit gesteigerter Tyrosinkinase-Aktivität und damit zu erhöhter Teilungsrate führt.
116 Hämatoonkologische Erkrankungen
Während das Bruchereignis auf Chromosom 9 jeweils innerhalb eines
Exons des c-abl-Gens lokalisiert ist, finden sich auf Chromosom 22 unterschiedliche Bruchpunkte des BCR-Gens in der major-(M-bcr), der mikro(µ-bcr) oder der minor-(m-bcr) breakpoint cluster region. Über 99% der
Bruchpunkte der CML-Patienten sind vom M-bcr-Typ, bei der Ph-positiven ALL des Erwachsenen sind ca. 50-80% M-bcr, während sich bei der
Ph-positiven ALL im Kindesalter zu 90% m-bcr findet. Der Nachweis der
Philadelphia-Translokation bei der ALL ist mit einer ungünstigen Prognose
assoziiert. Sofern eine Philadelphia-Translokation nachgewiesen wird, erfolgt eine Quantifizierung der Fusionstransskripte.
Indikation
• Erstdiagnostik bei Verdacht auf das Vorliegen einer CML, AML oder ALL
• Quantifizierung als Verlaufskontrolle nach erfolgter Therapie
Mutationen
Material
Fusionsgen BCR/ABL
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Real Time-PCR
methode
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Vardiman et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues
(2008); O’Hare et al, Blood 110:2242 (2007); Pricl et al, Mol Cancer Ther 4:1157 (2005)
von Bubnoff et al, Cancer Research 63:6395 (2003)
Chronische myelomonozytäre Leukämie /
Myelodysplastische Syndrome
TET2-Gen (TET Oncogene Family, Member 2;
Genort: 4q24; OMIM *612839)
Klinische
Bedeutung
Bei den TET2-Mutationen handelt es sich somit um die häufigste bisher bekannte molekulare Aberration beim MDS. Neben dem MDS weisen auch
andere myeloische Erkrankungen, darunter Myeloproliferative Neoplasien, Systemische Mastozytose, Chronische Myelomonozytäre Leukämie
(CMML), Akute Myeloische Leukämie (AML) und Refraktäre Anämie mit
Ringsideroblasten und Thrombozytose (RARS-T) Mutationen im TET2-Gen
auf. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Vorhandensein von mutiertem TET2 einen statistisch signifikant positiven Einfluss auf das progressionsfreie- und Gesamt-Überleben bei MDS Patienten hat (Kosmider et al.,
Blood 2009).
Eine besonders hohe TET2-Mutationsrate von bis zu 42% weisen Patienten
mit CMML auf. Kosmider et al. konnten zeigen, dass TET2-Mutationen bei
CMML-1 Patienten (nach WHO) mit einer statistisch signifikant ungünstigeren Prognose einhergehen (Kosmider et al., Haematologica 2009). In
einem anderen Kollektiv von 82 CMML Patienten wurde in Übereinstimmung mit den Daten zur Prognose bei MDS hingegen eine günstige Prognose für Patienten mit TET2-Mutationen gezeigt
Hämatoonkologische Erkrankungen 117
Indikation
Chronische Myelomonozytäre Leukämie, Myelodysplastische Syndrome
Material
2-5 ml EDTA-Knochenmark, 10 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Stufendiagnostik:
methode
PCR und Sequenzierung der Exons 3-10,
FISH zum Nachweis von Deletionen
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Kosmider et al., Blood 2009, 114:3285-3291
Kosmider et al., Haematologica 2009
Nagase, T., Kikuno, R., Nakayama, M., Hirosawa, M., Ohara, O., DNA Res. 7: 273-281, 2000
Delhommeau, F. et al., New Eng. J. Med. 360: 2289-2301, 2009
Januskinase 2 siehe Myeloproliferative Erkrankungen
Multiplex-Aberrationsscreening
Indikation
Zur Differentialdiagnose bei Hämoblastosen (z.B. ALL, CML, Hinweis AML)
mit zytogenetisch unzureichendem Befund oder zur Bestätigung einer zytogenetisch geäußerten Verdachtsdiagnose.
Material
2-5 ml EDTA-Knochenmark, 10 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- mDX® HemaVision® System; Nachweisbare Aberrationen:
methode
t(1;11)(p32;q23): MLL/EPS15 (syn. MLL/AF1p)
t(1;11)(q21;q23): MLL/MLLT11 (syn. MLL/AF1q)
t(1;19)(q23;p13): E2A/PBX1
t(3;21)(q26;q22): AML/EAP/MDS/EVI1
t(3;5)(q25.1;q34): NPM/MLF1
t(4;11)(q21;q23): MLL/MLLT2 (syn. MLL/AF4)
t(5;12)(q33;p13): ETV6/PD6FRB (syn. TEL/PDGFRb)
t(5;17)(q35;q21): NPM/RARa
t(6:11)(q27;q23): MLL/MLLT4 (syn. MLL/AF6)
t(6;9)(p23;q34): DEK/NUP214 (syn. DEK/CAN)
t(8;21)(q22;q22): RUNX1/RUNX1T1 (syn. AML1/MGT8)
t(9;11)(q22;q23): MLL/MLLT3 (syn. MLL/AF9)
t(9;12)(q34;p13): TEL/ABL
t(9;22)(q34;q11): BCR/ABL
t(9;9)(q34;q34): SET/NUP214 (syn. SET/CAN)
t(10;11)(p12;q23): MLL/MLLT10 (syn. MLL/AF10)
t(11;17)(q23;q21): MLL/MLLT6 (syn. MLL/AF17)
t(11;17)(q23;q21): ZBTB16/RARA (syn. PLZF/RARa)
t(11;19)(q23;p13.1): MLL/ELL
t(11;19)(q23;p13.3): MLL/ENL
t(12;21)(p13;q22): ETV6/RUNX1 (syn. TEL/AML1)
t(12;22)(p13;q11): ETV6/MN1 (syn. TEL/MN1)
118 Hämatoonkologische Erkrankungen
t(15;17)(q22;q21: PML/ RARa
t(16;21)(q11;q22): TLS/ERG
t(17;19)(q22;p13): E2A/HLF
inv(16)(p13;q22): CBFb/MYH11
t(X;11)(q13;q23): MLL/AFX
TAL1deletion(p34): SIL/TAL1
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Myeloproliferative Erkrankungen
Januskinase 2-Gen (JAK2;
Genort: 9p24; OMIM *147796)
Erbgang
Erworbene Punktmutation
Klinische
Bedeutung
Eine Punktmutation (V617F) im Exon 14 des Janus-Kinase 2-Gens (JAK2 =
signalübermittelnde, cytoplasmatische Tyrosinkinase) lässt sich bei über 9095% der Patienten mit Polycythaemia vera und ca. 50-60% der Patienten
mit chronisch idiopathischer Myelofibrose oder essentieller Thrombozythämie nachweisen. Daher ist diese JAK2-V617F-Punktmutation ein wichtiger
Marker für die Diagnose der Philadelphia-negativen, chronisch myeloproliferativen Erkrankungen.
Die V617F-Mutation im JAK2-Gen (1849G → T) führt zu einem Austausch
der Aminosäuren Valin gegen Phenylalanin, was zu einer Erhöhung der
JAK2-Tyrosinkinaseaktivität führt. Letztlich resultiert dies in einer gesteigerten Teilungsrate bei den betroffenen Zellen.
Indikation
V. a. und DD Polyzythämia vera
Mutationen
V617F
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Real-Time PCR
methode
Untersuchungs- 3-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al.; Lancet 2005; 365: 1054-1061.
Scott LM, Tong W, Levine RL, et al.; New Engl J Med 2007; 356:459-468
Hämatoonkologische Erkrankungen 119
Genetische Krebsrisiken
Genetische Krebsrisiken
Colonkarzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom)
MLH1-Gen, Genort: 3p21.3; MSH2-Gen, Genort: 2p21-p22;
MSH6-Gen, Genort: 2p16; PMS2, Genort: 7p22.2 (OMIM #120435)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
In Deutschland erkranken ungefähr 50.000 Personen jährlich an einem
Kolonkarzinom. 5-10% aller kolorektalen Karzinome sind ererbt. Das hereditäre kolorektale Karzinom ohne Polyposis „HNPCC“ (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) ist die häufigste Form der autosomal- dominant vererbten Dickdarmkrebserkrankungen. Bei Patienten mit klinischem
Verdacht auf HNPCC, wird nach den Bethesda Richtlinien (überarbeitet
2004) eine molekulargenetische Untersuchung empfohlen, wenn eines der
folgenden Kriterien erfüllt ist:
• Patienten mit kolorektalem Karzinom vor dem 50. Lebensjahr
• Patienten mit synchronen und metachronen kolorektalen Karzinomen
oder HNPCC-assoziierten Tumoren*, unabhängig vom Alter.
• Patienten mit kolorektalem Karzinom mit MSI-h Histologie vor dem 60.
Lebensjahr.
• Patienten mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der einen Verwandten 1. Grades mit einem kolorektalen Karzinom oder einem HNPCC-assoziierten Tumor* vor dem 50. Lebensjahr hat.
• Patienten mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der mindestens zwei Verwandte 1. oder 2. Grades hat, bei denen ein kolorektales Karzinom oder ein HNPCC assoziierter Tumor* (unabhängig vom
Alter) diagnostiziert wurde.
* (Endometrium, Magen, Ovarien, Pankreas, Urothel, Dünndarm, Gallengang, Gehirn [meist Glioblastome], Talgdrüsenadenome und Keratoakanthome)
Indikation
V. a. erblichen Darmkrebs (HNPCC / Lynch-Syndrom)
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Stufendiagnostik durch Sequenzierung und/oder MLPA der
methode
Gene MLH1, MSH2, MSH6 (und PMS2: nur MLPA)
Untersuchungs- 4-5 Monate
dauer
Literaturhinweise
Locker et al, J Clin Oncol 24:5313 (2006; Schmiegel, Dt Ärzteblatt 34/35:A2234 (2000);
Bronner et al, Nature 368:258 (1994); Fishel et al, Cell 75:1027 (1993);
Leach et al, Cell 75:1215 (1993); Miyoshi et al, PNAS 89:4452 (1992);
Powell et al, Nature 359:235 (1992); Groden et al, Cell 66:589 (1991
120 Genetische Krebsrisiken
Darmkrebsscreening: Septin 9 Test
mSEPT9-Gen (Septin 9; Genort: 17q25.2-q25.3; OMIM *604061)
Klinische
Bedeutung
Der Septin 9 Test basiert auf dem spezifischen Nachweis von methylierter
DNA der V2-Region des Septin 9 Gens (mSEPT9) im Blutplasma. Die DNAMethylierung reguliert die Genexpression und die Stabilität der Gene. Jeder Zelltyp verfügt über einen einzigartigen DNA-Methylierungs-Fingerabdruck, der sich in biologischen Prozessen und auch bei Krebserkrankungen
verändert. Im Darmkrebsgewebe sind die Cytosinreste der V2-Region des
Septin 9 Gens methyliert, nicht aber in der normalen Darmschleimhaut.
Die Darmtumor-DNA wird von den Tumorzellen ins Blut abgegeben, wo
sie spezifisch nachgewiesen werden kann.
Die zweite Generation dieses Testes erkennt mit einer Sensitivität von 81%
und einer Spezifität von 99% im Vergleich mit dem Hämoccult-Stuhltest
mehr als doppelt so viele Darmkrebserkrankungen im Frühstadium.
Der Test ist kein Ersatz für die Koloskopie. Aber der Test ermöglicht all den
Menschen eine sinnvolle Darmkrebsvorsorge, die Vorbehalte gegen eine
Koloskopie oder Stuhluntersuchungen haben. Außerdem kann der Test
eine sinnvolle Ergänzung während der 10jährigen Intervalle zwischen den
koloskopischen Vorsorgeterminen sein.
Der Test liefert ein qualitatives Ergebnis, Rückschlüsse auf die Schwere der
Erkrankung sind somit nicht möglich. Patienten mit einem positiven Ergebnis sollten zeitnah koloskopiert werden.
Indikation
Darmkrebsvorsorge
Hinweis
Der Septin 9 Test sollte nicht bei schwangeren Frauen durchgeführt werden, da aufgrund der Schwangerschaft eine hohe Konzentration von methyliertem Septin 9 im Serum zu einem falsch positiven Ergebnis führt.
Auch chronische Entzündungen des Darmtraktes (Colitis ulcerosa, Morbus
Crohn) führen zu deutlich erhöhten Raten an falsch positiven Ergebnissen
des Septin 9 Testes.
Material
2 x 8,5 ml CPDA-Blut (Kostenloser Bezug der CPDA-Röhrchen über uns)
CPDA-Blut ist 48 h bei 2-25°C haltbar Es wird keine Einverständniserklärung des Patienten gem. Gendiagnostikgesetz benötigt.
Untersuchungs- Präparation der freien Plasma-DNA, Bisulfitbehandlung, Präparation der
methode
konvertierten DNA, methylspezifische Real-time PCR für Septin 9 und
Beta-Actin
Untersuchungs- Ca. 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Esteller, M., The Lancet Oncology 4, 351–358, 2003; Model, F. et al., Mol Cancer Res 5,
153–163, 2007; Gru¨tzmann R. et al., PLoS ONE 3(11), 2008
Genetische Krebsrisiken 121
Familiäre adenomatöse Polyposis coli
APC-Gen (adenomatous polyposis of colon;
Genort: 5q22.2; OMIM #175100)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Familiäre adenomatöse Polypose (FAP) ist durch die Entwicklung von
Hunderten bis Tausenden Adenomen im Rektum und Kolon während des
zweiten Lebensjahrzehnts gekennzeichnet, wobei das Entartungsrisiko nahezu bei 100% liegt. In beiden Geschlechtern ist die Manifestation gleich
häufig. Unter den Fällen mit kolorektalem Krebs macht die FAP weniger
als 1% aus. Es wird geschätzt, dass 5-10 von 100.000 Menschen von der
Genmutation betroffen sind.
Die meisten Patienten haben über Jahre keine Symptome, bis die Adenome
groß und zahlreich geworden sind und rektale Blutungen, Schleimabgänge,
Bauchschmerzen oder sogar Anämie erzeugen. Im allgemeinen beginnt die
Entwicklung eines Karzinoms etwa 10 Jahre nach dem Auftreten der Polypen. Die FAP kann auch Symptome außerhalb des Intestinums zeigen, z. B.
Osteome, Zahnanomalien, kongenitale Hypertrophie des Pigmentepithels
(CHRPE), Desmoidtumoren und extrakolonische Tumoren (Thyroidea, Leber, Gallenwege und ZNS).
Eine weniger aggressive Variante der FAP, die attenuierte FAP (AFAP), ist
gekennzeichnet durch eine geringere Zahl kolorektaler Adenome (gewöhnlich 10 bis 100), höheres Alter beim Auftreten der Adenome und ein
geringeres Lebenszeitrisiko bezüglich der Entstehung eines kolorektalem
Karzinoms.
Osteome des Schädels und der Mandibula, Zahnanomalien sowie Fibrome
an Kopfhaut, Schultern, Armen und Rücken sind neben den Adenomen
Merkmale der Gardner-Variante. Die Assoziation von FAP und Medulloblastom wird als Turcot-Syndrom bezeichnet.
Die klassische FAP wird autosomal-dominant vererbt und ist die Folge von
Keimbahnmutationen im APC-Gen (5q21-q22). Viele Patienten (~70%)
haben Verwandte mit kolorektalen Polypen und Krebs.
Bei einer Untergruppe von Patienten mit Mutationen im MUTYH-Gen
(1p34.1) wird die Polypose rezessiv vererbt. Die biallelen MUTYH Mutationen sind in der Regel mit einem abgeschwächten Polyposis-Phänotyp
assoziiert.
Die Diagnose basiert auf der Familienanamnese, den klinischen Befunden,
einer Initialen Sigmoidoskopie und gegebenenfalls einer kompletten Koloskopie. Wenn möglich, sollte die klinische Diagnose durch eine molekulargenetische Untersuchung bestätigt werden. Unerlässlich ist eine Überweisung zur humangenetischen Beratung. Differentialdiagnosen sind andere
Krankheiten mit multiplen Polypen (Peutz-Jeghers-Syndrom, Familiäre juvenile Polypose oder Hyperplastische Polypose, Syndrom der Hereditären
gemischten Polypose, Lynch-Syndrom).
122 Genetische Krebsrisiken
Indikation
V. a. familiäre Polyposis coli, frühe Manifestation, teilweise extrakolonisch
(Duodenum, congenitale Hypertrophie des retinalen Pigmentepithels, Epidermoidzysten, Hepatoblastom).
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- FAP Stufendiagnostik:
methode
1. PCR und Sequenzierung relevanter Bereiche von Exon 15
2. Deletionsnachweis mittels MLPA
3. PCR und Sequenz. der kodier. Exons 1-14 und fehlende Bereiche des
Exons 15
AFAP Stufendiagnostik:
wie FAP, aber ohne MLPA, dafür ggf. Analyse MUTYH-Gen (Exon 1-16)
Untersuchungs- 1-2 Monate
dauer
Literaturhinweise
Rustgi, A. K., Genes Dev. 21: 2525-2538, 2007; Krush, A. J. et al., Am. J. Med. Genet. 29:
323-332, 1988; Giardiello, F. M. et al., Gut 40: 521-525, 1997;
Bercovich D. et al., www.orpha.net
Tumorprotein p53, Li-Fraumeni-Syndrom
TP53-Gen (Apolipoprotein B; Genort: 17p13.1; OMIM *191170)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Das Li-Fraumeni-Syndrom (LFS) ist eine sehr seltene autosomal-dominant
vererbte Prädisposition junger Menschen zu einer Vielzahl verschiedener
Tumoren. Die Häufigkeit wird auf ca. 1 in 15.000 Lebendgeburten geschätzt. Die Diagnose eines LFS wird gemäß den revidierten ChompretKriterien klinisch gestellt.
• ein (Index-) Patient mit einem Tumor aus dem LFS-Tumorspektrum
(Weichteilsarkom, Osteosarkom, Brustkrebs, Hirntumor, Nebennierensarkom, Leukämie, bronchoalveoläres Lungenkarzinom) vor dem
46. Lebensjahr.
• und mindestens ein erst- oder zweitgradiger Verwandter mit einem LFSTumor (nicht Mamma-Ca, wenn der erste Tumor ebenfalls ein MammaCa ist) vor dem 56. Lebensjahr. Oder multiple Primärtumoren aus dem
LFS-Tumorspektrum bei einer Person (altersunabhängig)
• oder ein Patient mit multiplen Tumoren bei dem einer vor dem 46.
Lebensjahr diagnostiziert wurde und zwei weitere die dem LFS-Tumorspektrum zuzuordnen sind
• oder ein Patient mit einem Karzinom des Plexus coroideus oder einem
Nebennierenkarzinom unabhängig von der Familienanamnese.
Genetische Krebsrisiken 123
Klinische
Bedeutung
Die charakteristischsten Tumoren sind bei jungen Menschen Tumore der
Nebenniere, Weichteilsarkome, Leukämien und ZNS-Tumore. Im Erwachsenenalter treten häufig Osteosarkome, Brustkrebs und Lungenkrebs auf.
Tatsächlich kann aber jede Art von Tumor in jedem Alter vorkommen. Eine
Keimbahn-Mutation im TP53-Gen wird in etwa 70% der LFS-Familien gefunden, aber auch bei einigen Patienten und in Familien mit Verdacht auf
LFS, die die Kriterien nicht strikt erfüllten. In einigen Familien wurde eine
Keimbahnmutation im CHK2-Gen (Tumorsuppressionsgen) nachgewiesen. Für Träger einer pathogenen Mutation im TP53-Gen ist das Risiko,
mit Krebs zu erkranken, 15% im Alter von 15 Jahren, 80% für 50-jährige
Frauen und 40% für gleichaltrige Männer. Dieser signifikante Unterschied
zwischen beiden Geschlechtern wird fast vollständig durch die Fälle von
Brustkrebs erklärt. Das Risiko für einen Zweittumor ist hoch, besonders
auch nach Bestrahlung.
Indikation
Verdacht auf Li-Fraumeni-Syndrom, im fühen Lebensalter auftretende bzw.
schnell progrediente CLL
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- CLL: Stufendiagnostik durch Sequenzierung der Exons 5-9 von TP53
methode
Li-Fraumeni-Syndrom: Stufendiagnostik durch Sequenzierung der Exons
1-10 und MLPA des Gens TP53.
Untersuchungs- Ca. 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Vousden, K. H., Lane, D. P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8: 275-283, 2007
Bourdon, J.-C., Brit. J. Cancer 97: 277-282, 2007
Toledo, F., Wahl, G. M., Nat. Rev. Cancer 6: 909-923, 2006
Mammakarzinom (Familiärer Brustkrebs)
BRCA1-Gen (Genort: 17q21; OMIM #113705),
BRCA2-Gen (Genort: 13q12.3; OMIM #600185)
Siehe auch Hinweis zu Kapitel 11.4.2 EBM auf S. 32
Erbgang
Autosomal-dominant (mit unterschiedlicher Penetranz)
Klinische
Bedeutung
Bei etwa 5-10 % aller Frauen mit einem Mammakarzinom liegt eine genetische Disposition im Sinne eines autosomal dominanten Erbgangs vor.
Am häufigsten finden sich hierbei Mutationen in den Genen BRCA1, resp.
BRCA2, die nach neueren Erkenntnissen bei ca. 25% der familiären Fälle
von Brust-und Eierstockkrebs nachgewiesen werden können. Die Genprodukte von BRCA1 und BRCA2 sind an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt.
124 Genetische Krebsrisiken
Klinische
Bedeutung
Wird eine mutierte Anlage geerbt, kann der Ausfall des zweiten intakten
Allels zur Tumorentstehung führen (Loss of Heterozygosity, LOH). Das lebenslange Risiko für Trägerinnen einer BRCA-Keimbahnmutation an einem
Tumor zu erkranken ist somit erhöht (es in der Literatur unterschiedlich
mit 50-80 % angegeben. Männliche Anlageträger haben eine Erkrankungswahrscheinlichkeit von ca. 5% für Brustkrebs. Zudem ist das Risiko für
weitere Krebserkrankungen erhöht, insbesondere für Prostata-, Pankreas-,
Magen- und kolorektale Karzinome.
Eine Beratung und genetische Testung soll derzeit laut S3-Leitlinie Brustkrebs angeboten werden, wenn in einer Linie der Familie:
• mindestens 3 Frauen an Brustkrebs erkrankt sind
• mindestens 2 Frauen an Brustkrebs erkrankt sind, davon 1 vor dem 51.
Lebensjahr
• mindestens 1 Frau an Brustkrebs und 1 Frau an Eierstockkrebs erkrankt
sind
• mindestens 2 Frauen an Eierstockkrebs erkrankt sind
• mindestens 1 Frau an Brust- und Eierstockkrebs erkrankt ist
• mindestens 1 Frau mit 35 Jahren oder jünger an Brustkrebs erkrankt ist
• mindestens 1 Frau mit 50 Jahren oder jünger an bilateralem Brustkrebs
erkrankt
• mindestens 1 Mann mit Brustkrebs und eine Frau mit Brust- oder Eierstockkrebs
Bezüglich der Möglichkeit der Testung von Familien mit nur einem an
Brustkrebs erkrankten Mann sowie der BRCA-Analyse bei triplenegativem
Mammakarziom auch ohne familiäre Belastung bitten wir um Rücksprache.
Bei Nachweis einer pathogenen Mutation kann bei jedem ratsuchenden
Familienangehörigen nach der entsprechenden Veränderung gesucht werden. Wenn in der Familie keine Mutation in den Genen BRCA 1 oder
BRCA 2 als Ursache der Krebserkrankung gefunden wird, kann aber leider das Vorliegen einer Erbanlage für Brust- und Eierstockkrebs nicht ausgeschlossen werden, da die genannten Veränderungen nur für ca. 25%
der erblichen Brustkrebserkrankungen verantwortlich sind. In diesem Fall
richten sich die Vorsorgeempfehlungen nach dem statistischen Risiko. Ein
hohes Risiko liegt vor, wenn das Lebenszeitrisiko zu erkranken größer als
30 Prozent ist oder das Risiko für eine Anlageträgerschaft für eine Mutation
über 20% liegt.
Für Hochrisikopatientinnen werden intensivierte Früherkennungsmaßnahmen empfohlen. Zudem bestehen operative Optionen (Mastektomie,
Salpingo-Oophorektomie) zur Risikosenkung, die interdisziplinär erörtert
werden sollten. Mutationsträgerinnen wird eine prophylaktische beidseitige Salpingo-Oophorektomie um das 40. Lebensjahr sowie nach abgeschlossener Familienplanung empfohlen mit anschließender Hormonersatztherapie bis zum 50. Lebensjahr.
Genetische Krebsrisiken 125
Klinische
Bedeutung
Weitere Brustkrebshoch- wie auch niedrigrisikogene sind beschrieben und
führen in teils komplexen Interaktionen zur Tumorentstehung. 2010 konnte ein drittes Hochrisikogen, RAD51C, identifizieren werden. 41 weitere
Gendefekte sind derzeit bekannt, die aber wahrscheinlich überwiegend
mit einer eher moderaten Risikoerhöhung einhergehen. Es kann davon
ausgegangen werden, dass in den nächsten 2 bis 5 Jahren mehrere 100 das
Brustkrebsrisiko erhöhende Gendefekte entdeckt werden, die vermutlich
alle moderate Risikogene sind.
Indikation
Diagnostik bei V. a. erblichen Brustkrebs und/oder Ovarialkrebs (siehe
oben)
Mutationen
Über 1600 Veränderungen für das BRCA1-Gen und über 1800 BRCA2Veränderungen sind in der BIC Datenbank gespeichert (Stand: September 2010). Häufigste Mutationen in der deutschen Bevölkerung sind im
BRCA1-Gen c.181T>G (p.Cys61Gly) (Exon 5) und c.5385_5386insC (Exon
20); im BRCA2-Gen finden sich Häufungen in den Exons 10, 11 und 23
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Stufendiagnostik durch Sequenzierung und MLPA der Gene BRCA1 und
methode
BRCA2; ggfs. NGS, ggfs. auch molekulargenetische Diagnostik weiterer
Gene
Untersuchungs- 2-3 Wochen (Untersuchung auf bekannte familiäre Mutation)
dauer
4-5 Monate (vollständige Analyse)
Literaturhinweise
Boulton SJ, Biochemical Society Transactions, 34: 633-45; 2006
Hall JM et al, Science, 250: 1684–9 (1990)
Hemminki K; International Journal of Cancer, 108: 109-14 (2004)
Leitlinie Brustkrebs, Juli 2012 Diagnostik;
Ahlborn C., Bericht über das 2. Symposium Familiärer Brust-und Eierstockkrebs am
29.6.2013 in München, Zusammenfassung;
newsletter, Ausgabe 1 September 2013 des Zentrums „Familiärer Brust-und Eierstockkrebs“ der Universität Köln, R. Schmutzler
Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1)
Tumorsuppressor-Gen MEN1 (Menin)
Genort: 11q13. #13110
Erbgang
Autosomal-dominant, sporadisch
Klinische
Bedeutung
Die Multiple Endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1) ist ein seltenes erbliches
Tumor-Syndrom, von dem etwa 1 von 30 000 Personen betroffen ist.
126 Genetische Krebsrisiken
Typischerweise kommt es zur variablen Bildung von Tumoren in unterschiedlichen endokrinen Geweben, darunter vor allem in der Nebenschilddrüsen, dem endokrinen Pankreas und dem Hypophysen-Vorderlappen. Häufig ist eine Hyperkalzämie ein erstes Syndrom der Erkrankung und
kann bereits im Jugendalter auftreten.
Zum Spektrum der Erkrankung zählen außer den genannten typischen Tumoren z. B. auch Tumoren der Nebennierenrinde, Karzinoide der Bronchien, des Magendarmtraktes und des Thymus, sowie nicht-endokrine Neubildungen wie Lipome, Angiofibrome und Kollagenome.
Wenn bei einem einzelnen Patienten zwei der drei prinzipiell zur MEN1
gehörigen Tumore (Adenome der Nebenschilddrüsen, Darm-PankreasTumoren, Hypophysentumoren) beobachtet werden, bedingt dies den
Verdacht auf das Vorliegen von MEN 1. Ist die Krankheit bereits bei einem
oder mehreren Familienmitgliedern festgestellt worden, gilt bei den Angehörigen schon die Entwicklung eines einzelnen endokrinen Tumors als
Anzeichen für das Vorliegen von MEN 1.
Ursächlich für das MEN1-Syndrom sind Funktionsverlust-Mutationen im
Tumorsuppressor-Gen MEN1. Die Vererbung erfolgt autosomal-dominant,
wobei es sich in ca. 10% der Fälle um Neumutationen handelt.
Indikation
Fragliche MEN 1-Patienten und auch bisher gesunde Verwandte von MEN
1-Patienten. Bei ca. 10% der Fälle lässt sich trotz klinischer Diagnose keine
Mutation im Menin-Gen nachweisen.
Mutationen
Alle Exons sowie deren flankierende Bereiche werden mittels DNA-Sequenzierung untersucht. Zur Erfassung von Deletionen ein oder mehrerer
Exons wird eine MLPA-Analyse für alle Exons des MEN1-Gens durchgeführt.
Material
2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Sequenzierung aller Exons sowie deren flankierende Bereiche, Deletionsmethode
screening mittels MPLA. Mutationen bei > 90% aller MEN 1-Patienten
nachweisbar
Untersuchungs- Ca. 3 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Thakker R. V et al., Clinical Practice Guidelines for Multiple Endocrine Neoplasia Type 1
(MEN1) J Clin Endocrinol Metab 97: 2990-3011, 2012
Gaztambide S et al., Minerva Endocrinol. Diagnosis and treatment of multiple endocrine
neoplasia type 1 (MEN1), 2013 Mar; 38(1):17-28
Genetische Krebsrisiken 127
Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN2)
MEN2A (Sipple-Syndrom), MEN2B (Wagenmann-FroböseSyndrom), Familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom
(FMTC)
RET (Rearranged during Transfection)-Protooncogen
Genort: 10q11.2; OMIM #171400, +164761
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die MEN2-Erkrankung ist mit einer Prävalenz von 1:30.000 eine seltene,
genetisch bedingte Krebserkrankung. Je nach klinischer Ausprägung werden bezüglich Erkrankungsalter und Tumorbefall verschiedener endokriner
Organe Unterformen unterschieden:
Die MEN2A betrifft etwa 70% - 80% der MEN2-Familien. Betroffene entwickeln ein medulläres Schilddrüsenkarzinom (MTC), ein meist beidseitiges
Phäochromocytom und / oder einen primären Hyperparathyroidismus. Als
eine Variante der MEN2A wird das familiäre medulläre Schilddrüsenkarzinom (FMTC) angesehen, bei dem nur ein isoliertes MTC vorliegt. Das
FMTC tritt bei etwa 10% -15% der MEN2-Patienten auf.
Nur etwa 5% der MEN2-Familien zeigen die MEN2B-Unterform mit frühzeitiger Erkrankung an einem MTC und deutlich agressiverem klinischen
Verlauf. Auch hier treten Phäochromocytome auf, zusätzlich zeigen viele
Kinder mukokutane Neurome, diffuse Ganglioneuromatose im Darm und
einen marfanoiden Habitus.
Die häufigsten Mutationen des RET-Protoonkogens bei MEN2A / FMTC
können in einem von 5 Codons für hochkonservierte Cysteine des entsprechenden Proteins nachgewiesen werden (Aminosäureposition 609,
611, 618, 620 und 634). Die meisten MEN2B-Patienten zeigen die Punktmutation M918T, seltener wird die A883F-Mutation oder eine zusätzliche
Mutation kombiniert mit der MEN2A-Mutation V804M vorgefunden. Andere seltene Punktmutationen des RET-Protoonkogens sind in der Literatur
beschrieben.
Indikation
MTC, Phäochromocytom, Hyperparathyroidismus
Mutationen
Mutationen im RET-Protooncogen in den Exons 5, 8, 10, 11, 13, 14, 15
und 16
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Aus einer Blutprobe wird die genomische DNA isoliert. Mittels PCR wermethode
den bei Verdacht auf MEN2A / FMTC die Exons 5, 8, 10, 11, 13, 14, 15
und 16 und bei MEN2B die Exons 14, 15 und 16 des RET-Gens amplifiziert
und durch Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen untersucht.
128 Genetische Krebsrisiken
Untersuchungs- Ca. 3-4 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Wohllk et al., Best Practice Res Clin Endocrinol Metabol 24:371-387, 2010
Pacini et al., Clin Oncol (RCollRadiol) 22:475-485, 2010
Castellone et al., Clin Endocrinol 73:529-534, 2010
Ritter and Höppner, Internist 40:486-492, 1999
Neurofibromatose Typ1 / Morbus Recklinghausen
NF1-Gen (Neurofibromatosis type I;
Genort: 17q11.2; OMIM #162200)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) oder von-Recklinghausen-Krankheit,
ist eine der häufigsten genetischen Krankheiten. Betroffen sind 1/4.000
bis 1/3.000 Individuen. Mit 5 Jahren ist die Penetranz nahezu vollständig. Ursache sind Mutationen im NF1-Gen, dem menschlichen Gen mit
der höchsten Mutaionsrate. Es ist ein großes (350 kb, 60 Exone) Tumorsuppressor-Gen, welches für das zytoplasmatische Protein Neurofibromin
kodiert. Die pathogenen Keimbahn-Mutationen sind über das ganze Gen
verteilt und werden meist nur in einer Familie gefunden. Die Mutationsrate
ist besonders hoch und fast die Hälfte der Fälle ist durch Neumutationen
verursacht.
Der Phänotyp variiert sehr stark, auch innerhalb einer Familie.
Für eine klinische Diagnose sollten mindestens 2 der folgenden 7 Kriterien
erfüllt sein:
• 6 oder mehr Café-au-lait-Flecken mit einem größten Durchmesser von
mehr als 5 mm vor der Pubertät, bzw. mehr als 15 mm nach der Pubertät
• 2 oder mehr Neurofibrome oder mindestens ein plexiformes Neurofibrom
• sommersprossartige Pigmentierungen in der Achselhöhle oder in der
Leistengegend (Freckling)
• Tumor am Sehnerv (Optikusgliom)
• Pigmentanreicherungen auf der Regenbogenhaut des Auges (LischKnötchen)
• Typische Knochenveränderungen (Keilbeinflügeldysplasie, Verkrümmung der langen Röhrenknochen)
• Verwandter ersten Grades (Elternteil, Geschwister, Kind) mit der Diagnose Neurofibromatose Typ 1 aufgrund dieser Kriterien
Indikation
Verdacht auf Neurofibromatose
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Genetische Krebsrisiken 129
Untersuchungs- Stufendiagnostik:
methode
1. PCR und Sequenzierung der 60 Exons des NF1-Gens
2. Deletions-/Duplikationsanalyse mit MLPA
Untersuchungs- 1-2 Monate
dauer
Literaturhinweise
Williams, V. C. et al., Pediatrics 123: 124-133, 2009
McGaughran, J. M.et al., J. Med. Genet. 36: 197-203, 1999
King, A. A.et al., Am. J. Med. Genet. 93: 388-392, 2000
Pinson S., www.orpha.net
Peutz-Jeghers-Syndrom
STK11-Gen (Serin/Threonin-Kinase 11;
Genort: 19p13.3; OMIM *602216)
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Das typische klinische Bild des Peutz-Jeghers-Syndroms umfasst Hyperpigmentierungen im Lippenbereich und auf der Wangenschleimhaut in
Kombination mit einer gastrointestinalen hamartomatösen Polyposis. Die
Hyperpigmentierungen fehlen jedoch bei einigen Patienten. Des Weiteren
können Ovarial-, Pankreas- und Hodenkarzinome auftreten. Die Patienten
haben ein erhöhtes Risiko für Tumoren des Ovars (Granulosazelltumoren),
der Hoden (Sertoli-Zelltumore), der Zervix und des Pankreas und evtl.
auch ein erhöhtes Risiko für Brust- und Schilddrüsenkrebs.
Kriterien für die Diagnosestellung eines Peutz-Jeghers-Syndroms sind derzeit folgende:
• mindestens drei histologisch gesicherte Peutz-Jeghers-Polypen oder
• mindestens ein Peutz-Jeghers-Polyp bei entsprechend positiver Familienanamnese oder
• eine typische Lippenpigmentierung bei entsprechend positiver Familienanamnese oder
• mindestens ein Peutz-Jeghers-Polyp in Kombination mit der typischen
Lippenpigmentierung.
Das Syndrom ist selten, wahrscheinlich liegt die Prävalenz unter 1:50.000.
70% der Familien haben eine Mutation im STK11-Gen in der Chromosomenregion 19p13.3. Bei 10-20% der Patienten lässt sich keine Familienanamnese erheben, was auf Neumutationen hinweist.
Das Gen kodiert für eine Serin-Protein-Kinase. In den hamartösen Läsionen ist das Gen auf beiden Chromosomen inaktiviert. Es ist dies der erste
Hinweis, daß auch Proteinkinasen als Tumor-Suppressoren wirken können.
130 Genetische Krebsrisiken
Mutationen wurden im gesamten kodierenden Bereich des STK11-Gens
gefunden. Eine Beziehung zwischen Ort und Art der Mutation und den
pathologischen Befunden ist jedoch nicht erkennbar.
Indikation
Verdacht auf Peutz-Jeghers-Syndrom
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Stufendiagnostik: 1. Sequenzierung aller 10 Exons und 2. MLPA
methode
Untersuchungs- 1-2 Monate
dauer
Literaturhinweise
Karuman, P. et al., Molec. Cell 7: 1307-1319, 2001
Jenne, D. E. et al., Nature Genet. 18: 38-43, 1998
Amos, C. I. et al., J. Med. Genet. 41: 327-333, 2004
Olschwang S., www.orpha.net
Prostatakarzinom (PCA3)
PCA3-Gen (Prostatakrebs-Gen 3;
Genort: 9q21-q22; OMIM *604845)
Klinische
Bedeutung
Seit der routinemäßigen Einführung des PSA wurde die Früherkennung des
Prostatakarzinoms revolutioniert. Der PSA-Wert ist ein organ- und tumorspezifischer Marker. Neben dem Malignom kann die PSA-Konzentration
durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden.
Bei PSA-Werten über 4 ng/ml liegt die Karzinomfindung bei etwa 25%. Bei
negativer Biopsie und erhöhten PSA-Werten besteht dennoch ein erhöhtes
Risiko für eine Erkrankung, da 25% der Prostatakarzinome bei einer einmaligen Biopsie nicht diagnostiziert werden. Daher sind ggf. weitere Biopsien
notwendig. Um die Erkennung eines möglicherweise vorhandenen Prostatakarzinoms nach negativen Biopsien zu verbessern, wurden und werden
zahlreiche bildgebende und andere Verfahren untersucht.
PCA3 ist ein Gen, das ausschließlich in Prostatagewebe exprimiert wird.
Wenn Prostatazellen entarten, wird PCA3 überexprimiert. Prostatakarzinomzellen synthetisieren dabei 60-100fach mehr PCA3-mRNA als normales Prostatagewebe. Als Ergebnis erhält man einen hochinformativen
PCA3-Score, der unter Berücksichtigung der Krankengeschichte als Biomarker für eine Biopsieentscheidung Verwendung findet.
Genetische Krebsrisiken 131
Klinische
Bedeutung
Der PCA3-Score ist im Gegensatz zum PSA vom Prostatavolumen unabhängig, scheint aber mit der Größe des Karzinoms zu korrelieren. Die Ergebnisse einer amerikanischen Studie an 233 Männern mit erhöhten PSAWerten und negativer Biopsie zeigten, dass eine Wiederholungsbiopsie in
ca. 27% positiv ausfällt (1). Die Sensitivität des PCA3-Scores bei einem
Cut-off von 35 betrug 58% bei einer Spezifität von 72%.
Der PCA3-Score ist der PSA bzw. freien PSA-Bestimmung zur Vorhersage
eines Ergebnisses einer Wiederholungsbiopsie überlegen (1, 2). Die Wahrscheinlichkeit eines positiven Biopsieergebnisses korreliert dabei mit der
Höhe des PCA3-Scores.
Indikation
Zusätzliche Information, wenn PSA und die digital rektale Untersuchung
(DRU) keine eindeutigen Informationen liefern.
Entscheidungshilfe zu einer erneuten Biopsie
Mutationen
Im Median 66fache Überexprimierung der PCA3-mRNA in Prostatakarzinomzellen
Material
Urin, der nach einer standardisierten DRU in einem neutralen Gefäß aufgefangen wird und in ein spezielles Transportröhrchen, das Sie bei uns anfordern können, umgefüllt wird.
Untersuchungs- Hybridisierung der Zielsequenzen aus dem Urin, anschließende Überfühmethode
rung in cDNA mittels reverser Transkriptase, Amplifikation, Detektion der
Amplifikate durch HPA (chemilumineszenzmarkierte Nukleinsäuresonden), Ermittlung des PCA3-Scores aus den quantitativen Ergebnissen von
PCA3- und PSA-mRNA
Untersuchungs- 1 Woche
dauer
Literaturhinweise
Marks et al.: PCA3 molecular urine assay for prostate cancer in men undergoing repeat
biopsy. Urology, 2007, 69 (3): 532-535
Haese et al.: The value of the PCA3 assay in guiding decision which men with a negative
prostat
132 Genetische Krebsrisiken
HLA-Assoziationen
HLA-Assoziationen
Abacavir-Hypersensitivitätsreaktion (HLA-B*5701)
HLA-B-Gen (Human leukocyte antigen B;
Genort: 6p21.33; OMIM +142830)
Klinische
Bedeutung
Ca. 5% der Patienten entwickeln unter Behandlung mit dem nukleosidalen
Reverse-Transkriptase-Hemmer Abacavir, welcher seit 1999 einen wichtigen Bestandteil der Therapie von HIV-Patienten darstellt, eine Hypersensitivitätsreaktion, die in einigen Fällen sogar tödlich verläuft. Als wesentliche
Ursache dafür, wurde eine genetische Variante im humanen Leukozyten
Antigen-System (HLA), das Allel HLA-B*5701, identifiziert. Die prospektive
PREDICT-1-Studie, an der 1956 Patienten aus 165 Zentren in 19 Ländern
teilgenommen hatten, belegt den klinischen Nutzen der HLA-B*5701-Testung zur Vermeidung von HSR: Die Studie ergab, dass eine Testung auf
das Allel vor Therapiebeginn mit nachfolgendem Ausschluss HLA-B*5701
positiver Patienten von der Abacavir-Therapie zu einer signifikanten Verringerung der Häufigkeit Abacavir-induzierter Überempfindlichkeiten führt.
Ca. 48-61% der Patienten mit dem HLA-B*5701-Allel entwickeln eine HSR
auf Abacavir, verglichen mit 0% bis 4% der Patienten, die nicht Träger des
HLA-B*5701-Allels sind. Es ist wichtig zu beachten, dass auch ein kleiner
Teil der Patienten, die nicht Träger des HLA-B*5701-Alles sind, eine HSR
entwickeln können. Daher ist bei klinischem Verdacht auf eine HSR, auch
nach Ausschluss des HLA-B*5701-Allels, Abacavir abzusetzen und eine erneute Behandlung mit Abacavir zu vermeiden. Hypersensitivitätsreaktion:
Abacavir-induzierte Überempfindlichkeitsreaktionen treten in den ersten
sechs Wochen der Behandlung auf und können lebensbedrohliche Verläufe nehmen. Die Symptome weisen auf eine Multiorganbeteiligung hin. Fast
immer treten Fieber und / oder Hautausschlag auf. Weitere unspezifische
respiratorische sowie gastrointestinale Symptome (Dyspnoe, Halsschmerzen, Husten, abnorme Röntgenthoraxbefunde, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhöe, Bauchschmerzen) können fälschlicherweise als respiratorische Erkrankung oder Gastroenteritis diagnostiziert werden. Nach Absetzen der
Behandlung mit Abacavir verschwinden die Symptome für gewöhnlich.
Eine erneute Behandlung mit Abacavir nach Abbruch aufgrund einer HSR
führt zu einem schnellen Wiederauftreten und schwerwiegenderem Verlauf
der Symptome innerhalb weniger Stunden und ist deshalb kontraindiziert.
Indikation
Verpflichtender Test vor Beginn einer Abacavir-Therapie
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- HLA-B*5701 Typisierung mittels PCR und Gelelektrophorese
methode
Untersuchungs- 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
NN: Gentest ist Pflicht vor Therapie mit Abacavir, DÄ, 2008, 12: 644
http://www.bfarm.de/nn_1095560/SharedDocs/Publikationen/DE/Pharmakovigilanz/roteHandBriefe/2008/abacavir,templateId=raw,property=publicationFile.pdf/abacavir.pdf
Mallal S et al., N Engl J Med, 2008, 358: 637-9
HLA-Assoziationen 133
Morbus Behcet (HLA-B51)
Genort: 6p21.3 OMIM #109650
Erbgang
Multifaktoriell
Klinische
Bedeutung
Der M. Behcet ist eine chronische Gefäßentzündung, die typischerweise
zu rezidivierenden schmerzhaften Aphthen im Mund und Genitalbereich
führt. Aber auch Entzündungen von Uvea und Iris des Auges bis hin zu
nachfolgender Erblindung werden beobachtet. In selteneren Fällen treten
Haut- und Gelenkaffektionen auf. Bei Beteiligung von Gehirn, Lunge oder
anderer lebenswichtiger Organe kann der M. Behcet unbehandelt auch
zum Tode führen.
Die Prävalenz in der Bevölkerung ist stark vom ethnischen Hintergrund
abhängig und beträgt in der Türkei ca. 190/100.000, in Japan 10/100.000
und 5-10/100.000 in Europa. Etwa 5% der Fälle treten familiär auf.
Obgleich die genaue Genese der Erkrankung bislang nicht bekannt ist, besteht eine starke genetische Disposition sowie eine Assoziation mit dem
HLA B-51-Gen.So sind ca. 29% der rheumatologischen und 57% der neurologischen Behcet-Patienten HLA B*51 Carrier.
2012 wurde bei einer genomweiten Assoziationsstudie unter anderem
ERAP1 als Risikogen für den M. Behcet entdeckt, welches zusammen mit
HLA-Molekülen bei der Antigenpräsentation der Immunabwehr eine Rolle
spielt. Das Risiko für einen M. Behcet wurde bei Vorliegen einer ERAP1-Variante allerdings nur dann erhöht gefunden, wenn sie in Kombination mit
einem HLA B-51-Serotyp vorlag. Weitere Ergebnisse bleiben abzuwarten.
Indikation
Differentialdiagnose zu reaktive Arthritiden (Reiter-Syndrom), habituelle
orale Aphthose, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, Lichen ruber
planus, Pemphigoid.
Mutationen
Verschiedene Allele des HLA-B51 wie B*5101, B*5108, B*5105 und
B*5104 sind mit M. Behcet assoziert. Bei Homozygotie für B51 scheint das
Risiko deutlich erhöht als Hinweis auf einen möglichen Gen-Dosis-Effekt.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Nachweis von HLA-B51-Allelen wie B*5101, B*5108, B*5105 und B*5104
methode
über PCR mit sequenzspezifischen Primern, Gelelektrophorese
Untersuchungs- 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Kirino Y. et al., Nature Genetics 45: 202-208 (2013)
Travis H. et al., Nature Genetics 45: 319–324(2013)
Saadoun D. & W.Wechsler, Orphanet Journal of Rare Diseases 7:20 (2012)
134 HLA-Assoziationen
Narkolepsie (HLA-DQB1, HLA-DRB1)
HLA-DQB1 und -DRB1-Allele
Genort: 6p21.3; OMIM # 161400, *604305, *142857
Klinische
Bedeutung
Bei der Narkolepsie sind die für die Schlaf-Wach-Regulation zuständigen
Gehirn-Zentren gestört. Es besteht eine ausgeprägte Tagesschläfrigkeit mit
plötzlichen Schlafanfällen, gegen die sich die Erkrankten nicht wehren können. Dieser Schlaf unterscheidet sich vom normalen Schlaf durch den
sofortigen Eintritt in die REM-Phase (REM = rapid eye movements). Die
Häufigkeit wird zwischen 5 und 50 Fällen auf 10.000 Menschen angegeben. Die Ursache der Narkolepsie ist nicht abschließend geklärt.
Häufig findet sich jedoch insbesondere bei schweren Fällen von Narkolepsie eine genetische Variante, das DQB1*0602-Allel. Da dieses wie die
Krankheit selbst familiär gehäuft auftritt, wurde bisher eine genetische Veranlagung für Nakolepsie angenommen.
Neuere Forschungen belegen einen Mangel an Orexinen als mögliche Ursache. Orexin A und Orexin B sind im Hypothalamus gebildete PeptidHormone, die großen Einfluss auf den Schlaf-Wach-Zyklus besitzen. Sie
werden auch als Weckhormone bezeichnet. Es wird von einem Mangel
an Orexin-bildenden Zellen als eigentlichem Ursprung dieser Erkrankung
ausgegangen, wobei ein Absterben dieser Zellen wie auch ein genetisch
bedingter Mangel in Frage kommt
Indikation
Ausschluss der Narkolepsie
Mutationen
Etwa 95% der kaukasischen Narkolepsiepatienten tragen das Allel
DQB1*0602 und 25-35% der Normalbevölkerung. Die HLA-Typisierung
eignet sich daher nicht zur Risikoabschätzung bei Gesunden. Vielmehr ist
ein negatives Ergebnis in der HLA-Typisierung Anlass, die Diagnose Narkolepsie zu überdenken.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Nachweis der HLA-Allele DQB1*0602 und DRB1*1501 über PCR mit semethode
quenzspezifischen Primern (SSP), Gelelektrophorese
Untersuchungs- 1-2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Lin L, et al.; Cell 1999;98:365–76
Chemelli RM et al.; Cell 1999; 98: 437–51
Nishino S. et al.; Lancet 2000;355:39–40
Marcel Hungs and Emmanuel Mignot; BioEssays 23:397±408,
Maret S., Tafti M.; SWISS MED WKLY 2005;135:662–665
HLA-Assoziationen 135
Rheumatoide Arthritis (HLA DR4, shared epitope)
HLA-DRB1-Allele;
Genort: 6p21.31; MIM ID: # 180300
Erbgang
Autosomal-rezessiv
Klinische
Bedeutung
In Europa zeigen 0,5-2 Prozent der Erwachsenen eine rheumatoide Arthritis (RA) oder Polyarthritis. Die Erstausprägung beginnt meist nach dem
20. Lebensjahr, wobei eine „Bevorzugung“ des weiblichen Geschlechts
auffällt. Im Regelfall ist keine familiäre Häufung von Betroffenen nachweisbar (sporadisches Vorkommen). Die Beteiligung genetischer Faktoren wird
im Sinne einer Disposition angenommen (multi-faktorieller Erbgang). Der
Krankheitsverlauf kann individuell sehr unterschiedlich sein. Die Symptome umfassen Gelenkentzündung, Versteifung und Bewegungseinschränkung. Die Krankheit kann sich aber auch außerhalb des Bewegungsapparates manifestieren wie z. B. durch Gefäßentzündung (Vaskulitis).
Indikation
V. a. rheumatoide Arthritis
Mutationen
Die Prädisposition für RA ist genetisch durch das Vorliegen bestimmter Allele der HLA-DR-Region bedingt. Ein besonders hohes Risiko an RA zu
erkranken haben Individuen, die das DR4-Antigen exprimieren, das durch
bestimmte Allele der HLA-DRB1*04-Gruppe codiert wird (*0401, *0404,
*0405, *0408). Jedoch auch DRB1-Allele anderer Gruppen (z. B. *0101,
*0102 und *1001) können mit dem Risiko assoziiert sein.
Die vorstehend genannten Allele codieren alle ein DRB1-Polypeptid, das
in seiner dritten hypervariablen Region das sog. „shared epitope“ (SE) aufweist. Diese Aminosäuresequenz umfasst die Motive: QKRAA, QRRAA
oder RRRAA (Q = Glutamin, K = Lysin, R = Arginin, A = Alanin). Die verschiedenen Allele, ihre unterschiedlichen Kombinationen sowie ihre Anzahl (hetero- bzw. homozygot) beeinflussen die Ausprägungswahrscheinlichkeit und die Schwere der Erkrankung.
Patienten mit dem homozygoten Genotyp *04-QKRAA/*04-QKRAA haben ein sehr hohes Erkrankungsrisiko und oft einen schwereren Verlauf,
während Patienten mit einem heterozygoten Genotyp oder mit Allelen der
*01-Gruppe nur ein mittleres bis geringes Erkrankungsrisiko aufweisen.
Material
2-5 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Die Untersuchung erfolgt in zwei Stufen, wobei in der ersten nur auf das
methode
Vorliegen von HLA-DRB1*04-Allelen getestet wird, ohne diese allelspezifisch aufzulösen (d. h. bis auf die Ebene *0401, *0402 usw.). Dazu werden eventuell vorhandene DRB1*04-Allele mittels PCR amplifiziert und
Gelelektrophorese analysiert.
136 HLA-Assoziationen
In einer zweiten Stufe werden die Allele auf das Vorhandensein des SEMotivs ausgetestet und die Anzahl der Allele (Homozygotie, Heterozygotie)
bestimmt. Dabei werden auch Allele der Gruppen *01 und *10 erfasst.
Dabei werden DRB1-Allele mittels PCR amplifiziert und Allele mit einem
SE über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden nachgewiesen.
Untersuchungs- 3-5 Tage (Stufe 1)
dauer
5-8 Tage (Stufe 2)
Literaturhinweise
Gormann et al., Arthritis & Rheumatism 50, 400-412, 2004
Tezenas du Montcel et al., Arthritis & Rheumatism 52, 1063-1068, 2005
Morgan et al., Arthritis & Rheumatism 58, 1275-1283, 2008
Seronegative Arthritiden (HLA B27)
Major Histocompatibility Complex
Genort: 6p21.3; OMIM # 106300
Erbgang
Autosomal-dominant
Klinische
Bedeutung
Träger des HLA-B27-Allels zeigen ein stark erhöhtes relatives Risiko für
Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew), für die Trias Urethritis-Konjunktivitis-Arthritis (Morbus Reiter), akute Uveitis und reaktive Arthritiden
nach Infektionen mit Yersinien, Salmonellen, Shigellen bzw. Gonokokken
oder Chlamydien. Die genaue Pathogenese dieser arthritischen Erkrankungen ist nach wie vor unbekannt. Es gibt aber Hinweise auf autoimmune
Prozesse sowie Proteinsequenzhomologien zwischen gramnegativen Enterobakterien und HLA-B27.
Die Prävalenz des HLA-B27-Allels in der kaukasischen Bevölkerung beträgt
etwa 7-9 %, davon entwickelt aber nur ein geringer Prozentsatz (ca. 2%)
Morbus Bechterew. Etwa 90-95 % der Patienten mit Spondylitis ankylosans
sind HLA-B27-positiv, bei Morbus Reiter und postinfektiösen Arthritiden
beträgt die Assoziation mit HLA-B27 60-90%. HLA-B27-positive Merkmalsträger zeigen gegenüber Nichtträgern ein erhöhtes relatives Risiko für
Morbus Bechterew (85-90fach), Morbus Reiter (35-40fach), postinfektiöse
Arthritiden (15-20fach) und Uveitis (10fach). Die HLA-B27-Bestimmung ist
kein Screeningtest für Morbus Bechterew sondern unterstützt bei entsprechendem Beschwerdebild die Differentialdiagnostik.
Im Einzelfall ist der HLA-B27-Befund im Rahmen des klinischen Beschwerdebildes und des Röntgenbefundes des Patienten zu bewerten. Eine ähnliche Betrachtungsweise der HLA-B27-Analyse ist für die übrigen angeführten seronegativen Arthritiden angezeigt.
HLA-Assoziationen 137
Indikation
Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew)
Trias Urethritis-Konjunktivitis-Arthritis (Morbus Reiter)
diverser postinfektiöser Arthritiden
akuter Uveitis
Mutationen
Ca. 36 Allele bekannt
Material
2 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Von einer genomischen DNA-Probe werden mit Hilfe der PCR in zwei pamethode
rallelen Reaktionen mehrere Abschnitte der HLA-DQA1- und HLA-DQB1Gene amplifiziert. Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung
an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 1 Tag
dauer
Literaturhinweise
Brewerton Daetv al. (1973); Lancet 1 (7809), 904-907
Frankenberger B et al. (1996); J Rheumatol 24, 899-903
Gonzalez-Roces S et al. (1997);Tissue Antigens 49, 116-123
Gran JT, Husby G (1995); J Med Genet 32, 497-501
Zöliakie (HLA DQ2, DQ8)
HLA-DQ-Allele;
Genort: 6p21.3; MIM ID: #212750
Erbgang
Multifaktoriell
Klinische
Bedeutung
Die Zöliakie des Kindes, bei Erwachsenen Sprue genannt, ist charakterisiert durch eine lebenslange Überempfindlichkeit gegen das Klebereiweiß
Gluten, das in verschiedenen Getreidesorten (Weizen, Roggen, Gerste und
Hafer) zu finden ist und als „Bindemittel“ in vielen Lebensmitteln eingesetzt
wird. Immunologische Reaktionen führen zur chronischen Entzündung der
Dünndarmschleimhaut. Als Folge zeigen sich Durchfallerkrankungen, Fettstühle und Gewichtsverlust. Nur mit einer glutenfreien Diät sind die gefürchteten Spätfolgen (Rückbildung der Darmschleimhaut, Mangelkrankheiten etc.) zu vermeiden.
In den meisten europäischen Ländern ist jeder 1.000-2.000 betroffen. Die
Erkrankung tritt familiär gehäuft auf, d. h. 10-15% der Verwandten ersten
Grades eines/r Betroffenen erkranken gleichfalls.
Die Zöliakie/Sprue hat eine starke genetische Komponente. Als Prädispositionsfaktoren gelten Änderungen (Mutationen) im Immunsystem (Allele
im HLA-System). Rund 95% der Zöliakie-Patienten tragen im HLA-System
ein sogenanntes „DQ2-Heterodimer“, die überwiegende Mehrzahl der
verbleibenden 5% das sogenannte „DQ8-Heterodimer“ und/oder das Risikoallel „DRB1*04“. Es sollte im Verdachtsfall eine HLA-Typisierung (Genkomplex RDB 2065) durchgeführt werden.
138 HLA-Assoziationen
Indikation
V. a. Zöliakie / Sprue
Mutationen
Bestimmte HLA-DQ-Allele codieren heterodimere Proteinkomplexe, die
aus einer alpha- und einer beta-Untereinheit bestehen und an der Zelloberfläche lokalisiert sind. Diese spielen bei der immunologischen Erkennung durch T-Helferzellen eine wichtige Rolle. Die alpha-Kette wird
durch HLA-DQA1- und die beta-Kette durch HLA-DQB1-Allele codiert.
Serologisch kann zwischen den Heterodimeren DQ1 bis DQ9 unterschieden werden. Eine Assoziation mit der Zöliakie wurde für DQ2 und DQ8
beschrieben.
Das bei der Zöliakie am häufigsten vorhandenen DQ2-Heterodimer kann
sich aus den in cis-Konfiguration vorliegenden Allelen DQA1*0501 und
DQB1*0201 bilden, in seltenen Fällen auch aus den Allelen DQA1*0505
und DQB1*0202, wenn diese in trans vorliegen. Das DQ8-Heterodimer
wird von den Allelen DQA1*0301 und DQB1*0302 codiert
Material
1 ml EDTA-Blut
Untersuchungs- Von einer genomischen DNA-Probe werden mit Hilfe der PCR in zwei pamethode
rallelen Reaktionen mehrere Abschnitte der HLA-DQA1- und HLA-DQB1Gene amplifiziert.
Der Nachweis erfolgt über eine reverse Hybridisierung an membrangebundene allelspezifische Sonden.
Untersuchungs- 3-4 Tage
dauer
Literaturhinweise
Sollid, Nature Rev Immunol 2, 647-655, 2002
Green und Jabri, Lancet 362, 383-391, 2003
HLA-Assoziationen 139
Molekularpathologierkrankungen
Molekularpathologie
In der Molekularpathologie werden Untersuchungsmethoden (z. B. PolymeraseKetten-Reaktion, Sequenzierung, in-situ-Hybridisierung) auf molekularer Ebene
an formalinfixiertem und in Paraffin eingebetteten Gewebsschnitten durchgeführt.
Die molekularbiologische Untersuchungen bestätigen und typisieren maligne
Tumoren. Die genetische Veränderungen spielen eine wichtige Rolle in der individuellen Therapie sowie der Prognose des Patienten.
BRAF (B-RAF-Protein)
Klinische
Bedeutung
Ca. 50% der malignen Melanome zeigen eine BRAF-V600-Mutation, die
für eine Therapie mit dem BRAF-Inhibitor Vemurafenib spricht.
10% aller metastasierten kolorektalen Karzinome weisen eine BRAF
V600E-Mutation auf. Die Hilfe einer BRAF-Mutationsanalyse ist insbesondere bei schlechtem Therapieansprechen und rechtsseitiger Lokalisation
des Karzinoms sinnvoll.
Indikation
Die Untersuchung wird bei lokal fortgeschrittenen oder metastasierten malignem Melanomen und kolorektalen Karzinomen empfohlen, damit die
Patienten von einer entsprechenden Therapie profitieren können.
Material
Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat
Untersuchungs- PCR-Amplifikation und Sequenzierung
methode
Untersuchungs- 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Chapman et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E
mutation. NEJM 2011 Jun 30; 364(26): 2507-16.
Kudchadkar et al. Targeting mutant BRAF in melanoma: current status and future development of combination therapy strategies. Cancer J 2012 March; 18(2): 124-31.
Solus JF, Kraft S. Ras, Raf, And MAP kinase in melanoma. Adv Anat Pathol 2013 Jul; 20(4):
217-26.
Zlobec et al. Combined analysis of specific KRAS mutation, BRAF and microsatellite
instability identifies prognostic subgroups of sporadic and hereditary colorectal cancer. Int
J Cancer 2010 Dec 1; 127(11): 2569-75.
140 Molekularpathologie
EGFR (epidermal growth factor receptor)
Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist eine Tyrosinkinase, die die extrazelluläre
Wachstumssignale aktiviert und wiederum Proliferation, Angiogenese und Motilität vermittelt.
Viele Tumoren zeigen somatische Mutationen in der Tyrosinkinasedomäne mit Aktivierung des
EGFR-Signalwegs um das Zellüberleben zu favorisieren.
Klinische
Bedeutung
Der EGFR wird in mehr als 80% der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome
(NSCLC) überexprimiert. Ca. 10% der Fälle zeigen EGFR-Mutationen, insbesondere bei Adenokarzinomen von Nichtrauchern und Frauen.
Die Patienten mit mutiertem EGFR können von einer Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)-Therapie (z. B. Gefinitib, Erlotinib) hinsichtlich der Überlebenszeit profitieren.
Indikation
Lungenkarzinom (NSCLC), TKI-Therapie-Response
Material
Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat.
Zytologische Proben weisen eine geringere Spezifität auf (BAL 37,5%;
transthorakale Feinnadelaspirate 90-95%; transbronchiale Feinnadelaspirate >90%).
Untersuchungs- PCR-Amplifikation der Exons 18, 19, 20 und 21, Fragmentanalyse und Semethode
quenzierung
Untersuchungs- 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Tapia et al. EGFR Mutationsanalyse beim nichtkleinzelligen Lungenkarzinom.. Pathologe
2009 Sep; 30(5): 384-92.
Wart et al. Molekularpathologische Diagnostik in der Zytopathologie des nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms. Standardisierung der Materialprozessierung. Pathologe 2013 Jul;
34(4): 310-17.
HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer)/
Lynch-Syndrom
Klinische
Bedeutung
Das Hereditäre non-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) oder LynchSyndrom ist die häufigste erbliche Form des kolorektalen Karzinoms (CRC).
HNPCC-Mutationsträgern haben ein lebenslang erhöhtes Karzinomrisiko
auch für andere Tumore, z. B. Endometrium, Magen, Ovar, Harnwege,
Dünndarm, Gehirn und das hepatobiliäres System.
Microsatelliteninstabilität (MSI) ist eine Mutation von Microsatelliten-Regionen durch Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide oder Wiederholungseinheiten, welche aus einer Fehlanlage von nicht komplementären
Basen-Paaren resultiert („mismatch“).
Molekularpathologie 141
Klinische
Bedeutung
Das Mismatch-Reparatur-System (MMRS) ist ein DNA-Korrekturlesesystem,
das fehlerhafte DNA-Nukleotiden erkennen und korrigieren kann. Mismatch-Reparatur-Defekt (MMRD) sowie epigenetische hMLH1-Inaktivierung durch Promotor-Methylierung führen zur Anhäufung von spontanen
Mutationen, die eine maligne Progression favorisieren.
Die klinische Diagnose von Patienten mit hereditärem nicht polypösem
Kolonkarzinom (HNPCC) kann gestellt werden, wenn in der Familie der
Betroffenen die Amsterdam-Kriterien erfüllt sind. Die Bethesda-Kriterien
erfassen weitere Patientengruppen, bei denen aufgrund eines frühen Manifestationsalters ein Verdacht auf ein HNPCC besteht.
Amsterdam II-Kriterien
Alle Kriterien müssen erfüllt sein.
• Mindestens drei Familienangehörige mit HNPCC-assoziiertem Karzinom (Kolon/ Rektum, Endometrium, Dünndarm, Nierenbecken/Ureter)
• Einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen
• Erkrankungen in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Generationen
• Mindestens ein Patient mit der Diagnose eines Karzinoms vor dem 50.
Lebensjahr
• Ausschluss einer familiäre adenomatöse Polyposis (FAP)
Bethesda Kriterien
Mindestens ein Kriterium muss erfüllt sein. Tumoren von Patienten sollten
auf das Vorliegen einer Mikrostatelliten-Instabilität in folgenden Fällen untersucht werden:
• Patienten mit kolorektalem Karzinom vor dem 50. Lebensjahr.
• Patienten mit synchronen oder metachronen kolorektalen Karzinomen
oder anderen HNPCC-assoziierten Tumoren)*, unabhängig vom Alter.
• Patienten mit kolorektalem Karzinom mit MSI-H Histologie)** vor dem
60. Lebensjahr.
• Patient mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der einen
Verwandten 1. Grades mit einem kolorektalen Karzinom oder einem
HNPCC-assoziierten Tumor vor dem 50. Lebensjahr hat.
• Patient mit kolorektalem Karzinom (unabhängig vom Alter), der mindestens zwei Verwandte 1. oder 2. Grades hat, bei denen ein kolorektales Karzinom oder ein HNPCC-assoziierter Tumor (unabhängig vom
Alter) diagnostiziert wurde.
)*zu den HNPCC-assoziierten Tumoren gehören Tumoren in: Kolorektum, Endometrium,
Magen, Ovarien, Pankreas, Ureter oder Nierenbecken, Gallengang, Dünndarm und Gehirn
(meist Glioblastome wie bei Turcot-Syndrom) sowie Talgdrüsenadenome und Keratoakanthome (bei Muir-Torre-Syndrom)
)** Vorliegen von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten, Crohn-ähnlicher lymphozytärer Reaktion, muzinöser/Siegelring-Differenzierung, oder medullärem Wachstumsmuster
142 Molekularpathologie
Algorithmus: Genetische Diagnostik und Vorsorge
Positive Amsterdam-/Bethesda-Kriterien + nachgewiesene MSI#
V. a. HNPCC/LYNCH-SYNDROM
Aufklärung gemäß GenDG oder Genetische Beratung*
Keimbahnmutationsanalyse##
Ergebnismitteilung im Rahmen einer Genetischen Beratung*
Nachweis einer
pathogenen MMR-Gen-Mutation
Dignose Lynch-Syndrom
kein Nachweis einer
pathogenen MMR-Gen-Mutation
Dignose HNPCC-Syndrom
Prädiktive Testung
weiterer Familienmitglieder
nach Genetischer Beratung**##
Prädiktive Testung
weiterer Familienmitglieder
nicht möglich
Ausschluss der
pathogenen
Mutation
Nachwies der
pathogenen
Mutation
Vorsorge
entspr. asympt.
Bevölkerung
*
HNPCC-Vorsorge
Eine diagnostische Keimbahnuntersuchung erfordert gemäß GenDG eine Aufklärung
und Dokumentation der Gesprächsinhalte durch den veranlassenden Arzt. Alternativ kann eine genetische Beratung erfolgen. Die Ergebnismitteilung muss gemäß
GenDG im Rahmen einer genetischen Beratung erfolgen.
** Eine prädiktive genetische Keimbahndiagnostik bei asymptomatischen Individuen
darf gemäß GenDG nur nach einer genetischen Beratung erfolgen. Die Ergebnismitteilung muß gemäß GenDG ebenfalls im Rahmen einer genetischen Beratung
erfolgen.
# Bei hochgradigem V. a. HNPCC/Lynch-Syndrom (z. B. positive Amsterdam-Kriterien)
und Nichtvorhandensein von Tumorgewebe kann auch direkt eine Mutationsanalyse
erfolgen.
## Sofern eine Keimbahndiagnostik vom Patienten nicht gewünscht wird, ist unabhängig davon in jedem Fall die HNPCC-Vorsorge zu empfehlen.
Abbildung 1: Algorithmus zum Ablauf der genetischen Diagnostik bei Patienten mit V. a.
ein hereditäres Tumordispositions-Syndrom am Beispiel des HNPCC-/Lynch-Syndroms.
Zum Nachweis der MSI bei V. a. HNPCC-/Lynch-Syndroms wird auf Abbildung 2 verwiesen.
Aus S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Kurzversion 1.6.2013
Molekularpathologie 143
Testalgorithmus Immunhistochemie / MSI zur Abklärung
Mismatch-Reparatur-Defekt
Positive Amsterdam-/ revidierte Bethesda-Kriterien
Immunhistochemie Tumorgewebe (Biopsie/Resektat)
MLH1/ PMS2
MSH2/MSH6
vorhanden*
MSH2
MSH6
PMS2
fehlt**
fehlt**
BRAF-Testung
MSI-Testung
stabil
MLH1
instabil
Wildtyp
9
9
9
V. a. HNPCC/LYNCH-SYNDROM
MSS KRK
mutiert
Sporadisch
MSI KRK
* In jeweils >10% der Tumorzellen nukleär positiv
** In <10% der Tumorzellen nukleär positiv
Abbildung 2: Algorithmus zum Ablauf der molekularpathologischen Abklärung eines
Mismatch-Reparaturdefektes bei klinischem V. a. HNPCC-/Lynch-Syndrom. Zur sich ggf.
anschließenden genetischen Diagnostik wird auf Abbildung 1 verwiesen.
Aus S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Kurzversion 1.6.2013
Klinische
Bedeutung
Karzinome im Rahmen eines HNPCC gehören durchwegs zur Gruppe
MSI-H.
Histopathologische Hinweise für ein MSI-H-Karzinom sind:
1. Medulläres Karzinom,
2. Muzinöses Adenokarzinom im proximalen Kolon (Flexura lienalis und
oral hiervon),
3. Schlecht differenziertes Adenokarzinom im proximalen Kolon,
4. Karzinom mit ausgeprägter intratumoröser lymphoider Infiltration und/
oder Crohn-ähnlicher lymphoider Reaktion.
144 Molekularpathologie
Klinische
Bedeutung
MSI-H-Karzinome verhalten sich (sowohl wenn sie sporadisch auftreten
als auch bei HNPCC) prognostisch günstiger als die anderen molekularen
Gruppen. Die unabhängige prognostische Bedeutung des Mikrosatellitenstatus bedarf aber noch weiterer Untersuchungen. MSI-H-Karzinome
zeigen aber eine höhere Tendenz zur Entwicklung multipler syn- und metachroner kolorektaler Karzinome und sprechen wahrscheinlich auch weniger auf Chemotherapie an.
Medulläres Karzinom ist ein spezielles Subtyp von CRC mit günstiger Prognose und besserer Überlebenswahrscheinlichkeit (Fernmetastasierungsrisiko unter 2%, Fünfjahresüberleben von bis zu 100% bei R0-Resektion), trotz
undifferenzierter Histologie (G4). 90% der Fälle zeigen eine MSI-H und
fehlende Expression von p53 und ß-Catenin. Bei Patienten mit medullärem
Karzinom und nachgewiesenem MMRD bzw. MSI-H wird eine adjuvante
5-Fluorouracil-Monotherapie contraindiziert.
Indikation
Verdacht auf HNPCC, Bethesda-Kriterien-positive Patienten. Kolonadenome, medulläres Kolonkarzinom
Beurteilung
Immunhistochemische Untersuchung der Mismatch-Reparatur-Gene
(hMLH1, hMSH2, hMSH6, PMS-2): Expressionverlust in >10% der Tumorzellen spricht für ein HNPCC-assoziierter Gendefekt.
Mikrosatellitenanalyse der Mononukleotidwiederholungen (BAT25,
BAT26, NR-21, NR-24, NR-27): für einen MSI-H-Befund müssen mindestens zwei von fünf Markern eine Instabilität zeigen.
Material
Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat
Untersuchungs- Immunhistologie und Multiplex-PCR-Amplifikation sowie Fragmentanalyse
methode
Untersuchungs- 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Benatti et al. Microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. Clin Cancer Res,
2005; 11:8332-40.
Boland et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer
detection and familiar predisposition : Development of international criteria for the determination of Microsatellite Instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5248-57.
Des Guetz et al. Does microsatellite instability predict the efficacy of adjuvant chemotherapy in colorectal cancer ? A systematic review with meta-analyses. Eur J Cancer, 2009;
45: 1890-96.
Kirchner T & Jung A. Pathological diagnosis fro individualized therapy of colorectal cancer.
Pathologe 2010 Feb ; 31(1) : 16-21.
Pox et al. S3-Leitlinie Kolorektales Karzinom. Kurzversion 1.6.2013. AWMF-Registernummer: 021/0070L.
Molekularpathologie 145
KRAS
Klinische
Bedeutung
Eine Blockade des EGR-Rezeptors ist nur sinnvoll bei Wildtyp-Status des
nachgeschalteten RAS-Signalwegs, da ansonsten eine primäre Resistenz
gegenüber einer EGFR-Inhibition besteht.
Indikation
Geplante anti-EGFR-Therapie mit Cetuximab, Matuzumab oder Panitumumab bei CRC
Material
Formalin-fixiertes Tumorgewebe aus PE oder OP-Präparat
Untersuchungs- Realtime-PCR mit high-resolution-melting und Sequenzierung
methode
Untersuchungs- 2 Wochen
dauer
Literaturhinweise
Amado et al. Wild-type KRAS is required for panitumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 1626-34.
Laurent-Puig et al. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from
cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer. J Clin Oncol 2009; 27:
5924-30.
146 Molekularpathologie
Abstammungsdiagnostik
Neben den Genen gibt es in unserem Erbgut (Genom) Bereiche mit bisher weitgehend unbekannter Funktion. So findet man immer wieder Abschnitte innerhalb
der DNA, in denen sich 2, 3, 4 oder mehr DNA-Bausteine mehrfach in der gleichen Reihenfolge wiederholen. Diese werden als Mikrosatelliten (oder auch als
short tandem repeats = STR-Systeme) bezeichnet. Innerhalb der Bevölkerung ist
die Anzahl der Wiederholungen und die daraus resultierende Länge dieser Mikrosatelliten sehr variabel. Jedes Individuum hat eine nahezu einzigartige Kombination von Mikrosatelliten verschiedener Länge, die zur Hälfte vom Vater und zur
Hälfte von der Mutter ererbt wurde. Daher ist die Untersuchung der Mikrosatelliten-Komposition geeignet, um, ähnlich wie bei einem Fingerabdruck, die Identität eines Individuums zweifelsfrei festzustellen und Verwandtschaftsbeziehungen,
insbesondere die Frage nach einer Vaterschaft oder der Eineiigkeit von Zwillingen
zu untersuchen.
Vaterschaftssanalyse
Bei Abstammungsanalysen werden Mikrosatelliten aus mindestens 12 verschiedenen DNA-Abschnitten (Mikrosatelliten-Loci) untersucht, um eine Abstammung
(Vaterschaft, seltener auch Mutterschaft im Rahmen von Familienzusammenführungen durch Ausländerbehörden) mit mehr als 99,9% Wahrscheinlichkeit nachweisen zu können.
In der Regel sind für eine Vaterschaftsanalyse die DNA-Proben von dem Kind, der
Kindsmutter und dem möglichen Vater (Putativ-Vater) zu untersuchen (Triofall).
Voraussetzung für alle privaten Vaterschaftsanalysen ist ein schriftliches Einverständnis der beteiligten Personen bzw. bei minderjährigen Kindern das Einverständnis aller sorgeberechtigten Personen. „Geheime“ Tests dürfen nicht durchgeführt werden.
Bei dem Gutachten werden Mikrosatelliten aus mindestens 12 verschiedenen
DNA-Abschnitten untersucht, von denen davon zur Absicherung der Ergebnisse
mindestens zwei STR-Systeme doppelt bestimmt werden.
Für eine Verwertbarkeit der Ergebnisse ist darauf zu achten, dass bei der Probenentnahme eine Identitätssicherung gemäß den Richtlinien der Arbeitsgemeinschaft für Abstammungsgutachten vorgenommen werden muss. Um dies zu gewährleisten, ist eine Probenabnahme in einem unserer Labore, in einer Arztpraxis
bzw. einem Gesundheitsamt erforderlich. Die Kosten für die Probenentnahme
und die Identitätssicherung der zu untersuchenden Personen sind im Gutachten
nicht enthalten.
147
Abstammungsdiagnostik
Bei allen privaten Untersuchungsaufträgen ist eine Bezahlung vor Beginn der Analyse notwendig. Für Ihren Untersuchungsauftrag fordern Sie bitte die dazu notwendigen Unterlagen an. Die Formulare können auch von unserer Homepage
(www.labor-staber.de) heruntergeladen werden.
Eine vorgeburtliche Untersuchung zur Klärung der Abstammung des Kindes darf
laut Gendiagnostikgesetz §15(1) und §17(6) nur dann durchgeführt werden, wenn
die Schwangerschaft auf einer Straftat gemäß StGB §§176-179 beruht.
Analyse der Eineiigkeit bei Zwillingen
Eineiige Zwillinge sind in ihren genetischen Eigenschaften identisch, d.h. sie haben das gleiche Erbgut, so auch identische Mikrosatelliten-Längen (-Allele) in jedem DNA-Ort (Lokus). Zweieiige Zwillinge sind genetisch wie andere Geschwister
einzustufen, die sich in ihren Mikrosatelliten-Allelen unterscheiden können.
Vergleicht man die Mikrosatelliten-Längen von mutmaßlichen Zwillingen, so ist
deren Eineiigkeit praktisch ausgeschlossen, wenn an mehr als einem untersuchten
Lokus die Allele nicht übereinstimmen.
Eine vollständige Längenübereinstimmung aller untersuchten Mikrosatelliten-Loci
weist mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit auf eine Eineiigkeit von Zwillingen
hin. In sehr seltenen Fällen können auch normale Geschwister identische Mikrosatelliten-Längen in den untersuchten Loci zeigen.
Indikation
Nachweis bzw. Ausschluss der Abstammung
Material
3 Mundschleimhautabstriche oder 1-2 ml Blut
Untersuchungsmethode
Aus den Mundschleimhautabstrichen wird die genomische DNA isoliert und
verschiedene Mikrosatelliten über Multiplex-Polymerase Kettenreaktionen (PCR)
amplifiziert. Die Analyse der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgt mittels Kapillarelektrophorese.
Untersuchungsdauer
Ca. 2 Wochen nach Eingang des Rechnungsbetrages und Erhalt des Untersuchungsmaterials
148
Stichworte in alphabetischer Reihenfolge
A
Abacavir-Hypersensitivitätsreaktion (HLA-B*5701)
Abstammungsdiagnostik
ACE-Polymorphismus
Achondroplasie
Adrenogenitales Syndrom (21-Hydroxylase-Defizienz)
Akute Lymphatische Leukämie
Akute myeloische Leukämie
Alpha-1-Antitrypsindefizienz
Alzheimer-Demenz, familiäre
Amniozentesen
Angelman-Syndrom
Angioödem hereditäres
Antithrombin III
Apolipoprotein B
Apolipoprotein E
Array CGH
Azoospermiefaktor
133
147
33
34
35
103
105
36
37
21
38
40
41
42
43
30
44
B
BRAF (B-RAF-Protein)
140
C
Catechol-O-Methyltransferase
CBAVD (congenitale bilaterale Vas deferens Aplasie)
Cholinesterase, atypische
Chorea Huntington
Chromosomenanalyse
Chronische lymphatische Leukämie (CLL)
Chronische myelomonozytäre Leukämie /
Myelodysplastische Syndrome
Chronisch lymphatische Leukämie
Chronisch myeloische Leukämie
Col1A1-Gen (SP1-Polymorphismus)
Colonkarzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom)
Cumarin-Sensitivität
Cytochrom P 450
45
45
46
47
102
108
117
116
116
48
120
49
50
Stichwortverzeichnis 149
D
Darmkrebsscreening: Septin 9 Test
Deletions-Syndrom
Dentato-Rubrale Pallido-Luysische Atrophie
Durchflusszytometrie
Dysmorphie-Syndrome
121
27, 29
52
102
18
E
EGFR (epidermal growth factor receptor)
Ehlers-Danlos-Syndrom
Eineiigkeit bei Zwillingen
Erkrankungen des Bindegewebes, der Muskulatur u. des Stützapparates
141
53
148
19
F
Faktor V-LEIDEN-Mutation (APC-Resistenz)
Familiäre adenomatöse Polyposis coli
Familiärer Brustkrebs
Fertilitätsstörungen
Fettstoffwechsel
FISH-Schnelltest
Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Fragiles-X-Syndrom
Friedreich‘sche Ataxie
Fruchtwasserdiagnostik
Fruktoseintoleranz
Fünf-Fluorouracil-Sensitivität (DPD-Defizienz)
54
122
124
17
17
23
102
56
57
21
58
55
G
Gerinnungsstörungen
Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel
Glutathion-S-Transferase (M1, P1, T1)
16
59
60
H
Hämatologie
Hämatonkologische Systemerkrankungen
Hereditäre Hämochromatose
Hereditäre Thromboembolie-Risiken
HNPCC / Lynch-Syndrom
Hypercholesterinämie, autosomal rezessiv
150 Stichwortverzeichnis
16
16
61
62
141
63
Hyperhomocysteinämie (MTHFR C677T und A1298C-Mutationen)
Hypochondroplasie
64
65
I
IL28B (Interleukin 28B Genotypisierung)
Interleukin 1-Polymorphismus
66
67
J
Januskinase 2 siehe Myeloproliferative Erkrankungen
118
K
Kardiomyopathie, familiär hypertroph
Kardiovaskuläres Risiko
KRAS
68
17
146
L
Laktoseintoleranz
Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) siehe SHOX
69
69
M
Mammakarzinom (Familiärer Brustkrebs)
124
Marfan Syndrom Typ 1
70
Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY)
71
Mentale Retardierung
18
Mesomele Dysplasie Typ Langer (LD) siehe SHOX
71
Mikrodeletionen
27
Miller-Dieker-Syndrom
28
Mittelmeerfieber, hereditäres
72
Molekulare Zytogenetik
20, 26
Morbus Behcet (HLA-B51)
134
Morbus Fabry , Alpha-Galactosidase A-Mangel
73
Morbus Meulengracht
74
Morbus Wilson
75
MTHFR64
Mukoviszidose (Cystische Fibrose)
76
Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1)
126
Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN2)
128
Multiplex-Aberrationsscreening
118
Muskeldystrophie Typ Duchenne oder Becker
77
Myelodysplastisches Syndrom
112
Stichwortverzeichnis 151
Myeloproliferative Erkrankungen
Myeloproliferative Neoplasien
Myotone Dystrophie Typ 1
Myotone Dystrophie Typ 2
119
114
79
80
N
N-Acetyltransferase
Narkolepsie (HLA-DQB1, HLA-DRB1)
Neurofibromatose Typ1 / Morbus Recklinghausen
Neurologische/neuromuskuläre Erkrankungen
Noonan-Syndrom
Nutrigenetik
81
135
129
18
81
18
O
Osteoporose siehe Vitamin D-Rezeptor und Col1A1-Gen
82
P
Pankreatitis, hereditäre
PD-Defizienz siehe 5-Fluorouracil-Sensitivität
Peutz-Jeghers-Syndrom
Pharmakogenetik
Phenylketonurie
Plasmazellmyelom
Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
Prader-Willi-Syndrom
Prostatakarzinom (PCA3)
Protein C
Protein S
Prothrombin (Gerinnungsfaktor II) Dimorphismus
Pyruvatkinase, erythrozytäre
83
52
130
18
84
111
85
86
131
87
88
89
90
R
Reifzellige B- und T-Zell-Lymphome
RETT-Syndrom
Rheumatoide Arthritis (HLA DR4, shared epitope)
109
90
136
S
Seronegative Arthritiden
137
SHOX-Haploinsuffizienz, Leri-Weill Dyschondrosteosis, Mesomele Dysplasie Typ Langer 92
Smith-Magenis-Syndrom
28
152 Stichwortverzeichnis
Spinobulbäre Muskelatrophie (SBMA, Kennedy Syndrom)
Spinocerebelläre Ataxien (SCA, Olivopontocerebelläre Atrophien)
Stoffwechselerkrankungen
93
94
17
T
Taubheit, nicht syndromisch, neurosensorisch, DFNB1 (DeaFNess Typ B1)
Thalassämie (alpha)
Thalassämie (beta) und Sichelzellanämie
Thiopurin-Methyltransferase (TPMT)-Defizienz
Tumorerkrankungen
Tumorprotein p53, Li-Fraumeni-Syndrom
95
96
98
99
19
123
V
Vaterschaftssanalyse
Vitamin-D-Rezeptor (B/b-Polymorphismus)
147
100
W
Williams-Beuren-Syndrom
28
Z
Zöliakie
Zytogenetik
138
20, 24
Stichwortverzeichnis 153
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