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bioelisa
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bioelisa CMV IgG
3000-1216
96 tests
ELISA-Test zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von IgG Antikörpern gegen CMV in
Humanserum oder –plasma.
Zusammenfassung
Das humane Cytomegalievirus (CMV) gehört zur Familie der Herpesviren. Das CMV ist ein allgegenwärtiger
Erreger, der normalerweise Individuen in verschiedenen geografischen und gesellschaftlichen Bereichen infiziert.
Der Großteil der Bevölkerung wird irgendwann in ihrem Leben von dem Virus befallen; bis zu 81% der über
35-Jährigen in den Vereinigten Staaten haben den Virus in ihrem Körper.
Eine Besonderheit des CMV besteht darin, dass das Virus nach einer Primärinfektion über sehr lange Zeit latent
bleiben und sich zu einem bestimmten Zeitpunkt reaktivieren kann. Die Infektion, Reinfektion oder Reaktivierung des
CMV verläuft bei normalen Erwachsenen und Kindern in der Regel leicht oder symptomlos. Bei Patienten mit erhöhter
Infektionsgefahr oder bei kongenital infizierten Kindern können Infektionen allerdings zu klinisch ernsten
Krankheitsfällen werden. Für alle vorzeitig geborenen Neugeborenen mit Untergewicht, Empfänger von
Transplantationen, Patienten, die eine das Infektionsrisiko erhöhende Chemotherapie erhalten oder AIDS-Patienten
besteht ein hohes Risiko für eine ernsthafte CMV-Erkrankung.
Die serologischen Tests zum Nachweis von Anti-CMV-Antikörpern sind wichtig bei der Bestimmung der Existenz
einer früheren Infektion, bei der Diagnose einer akuten oder kurz zurückliegenden Infektion und bei der
Blutanalyse, um Transfusionen für Neugeborene und immungeschwächte Empfänger durchzuführen.
Prinzip
bioelisa CMV IgG ist ein ELISA-Test zur Bestimmung von anti-CMV IgG-Antikörpern im Humanserum oder -plasma.
Den mit CMV-Antigenen beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte werden verdünnte Proben hinzugegeben
und inkubiert. Wenn die Probe anti-CMV IgG-Antikörpern aufweist, gehen diese mit dem Antigen der Vertiefungen
eine Bindung ein. Anschließend werden die Vertiefungen ausgewaschen, um die Restprobe zu beseitigen und es
werden enzymmarkierte (konjugierte) menschliche IgG Antikörper hinzugegeben. Das Konjugat wird sich
immunologisch an die IgG Anti-CMV, die sich während der ersten Inkubation mit den Antigenen der Vertiefungen
verbunden haben, binden. Anschließend wird die Vertiefung erneut ausgewaschen, um das ungebundene Material zu
beseitigen und es wird mit Chromogen enthaltendem Enzymsubstrat inkubiert. Diese Lösung wird blaue Farbe
annehmen, wenn die Probe IgG Antikörper-CMV aufweist. Die blaue Farbe wird gelb, nachdem die Reaktion mit
Schwefelsäure gestoppt worden ist. Die Intensität der Farbe ist proportional zu der in der Probe vorhandenen Menge
von IgG CMV-Antikörpern. Die in der Probe vorhandene Konzentration der Antikörper kann auf der Grundlage einer
Kalibrationskurve bestimmt werden.
Bestandteile
1. MCPL MIKROTITERPLATTE:
12 x 8 Vertiefungen, beschichtet mit inaktiviertem CMV-Antigen. Einzeln trennbare Vertiefungen.
2.
CONJ 51x KONZENTRIERTES KONJUGAT:
1 x 0,35 ml Peroxydase konjugiertes anti-humanes IgG von Kaninchenantikörper. Enthält roten Farbstoff,
Proteinstabilisatoren,
0,02%
Thimerosal
und
0,001%
Gentamicinsulfat.
Vor
Gebrauch
mit
Probenverdünnungsmittel 1/51 verdünnen.
3.
DIL CONJ KONJUGATVERDÜNNUNGSMITTEL:
1 x 15 ml Tris-Puffer. Enthält gelben Farbstoff, Zusatzmittel, 0,02% Thimerosal und 0,001% Gentamicinsulfat.
4.
DIL SAMP PROBENVERDÜNNUNGSMITTEL:
2 x 50 ml Phosphatpuffer, mit Reinigungsmittel. Enthält Proteinstabilisatoren, grünen Farbstoff und
Natriumazid < 0,1%. Gebrauchsfertig.
5.
WASH SOLN 10x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG:
2 x 50 ml konzentrierter Phosphatpuffer (10x), der 1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal enthält. Vor Gebrauch
mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/10 verdünnen.
6.
SUBS BUF SUBSTRATPUFFER:
1 x 14 ml Zitrat/Azetat-Puffer mit Wasserstoffperoxid und 0,002% Gentamicinsulfat.
7.
SOLN TMB CHROMOGEN:
1 x 1,5 ml 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO).
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
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8.
CAL + H STARK POSITIVE KALIBRIERSUBSTANZ:
1 x 0,6 ml verdünnten, humanen Serums, das 2,5 IE/ml von CMV-IgG-Antikörpern enthält. Standardisiert am
von der WHO vorgeschlagenen Anti-CMV-Standard, der von dem Zentrallabor für Bluttransfusionen (CLB) in
Amsterdam, Holland, geliefert wird. Enthält Proteinstabilisatoren, grünen Farbstoff und Natriumazid < 0,1%.
9.
CAL + L SCHWACH POSITIVE KALIBRIERSUBSTANZ:
1 x 0,6 ml verdünntes, humanes Gammaglobulin, das 0,25 IE/ml von CMV-IgG-Antikörpern enthält. Standardisiert
am von der WHO vorgeschlagenen Anti-CMV-Standard, der von dem Zentrallabor für Bluttransfusionen (CLB) in
Amsterdam, Holland, geliefert wird. Enthält Proteinstabilisatoren, grünen Farbstoff und Natriumazid < 0,1%.
10. CONTROL – NEGATIVE KONTROLLE:
1 x 0,6 ml verdünntes, humanes Gammaglobulin, CMV-IgG-Antikörper negativ. Enthält Proteinstabilisatoren,
gelben Farbstoff und Natriumazid < 0,1%.
11. H2SO4 1N STOPPLÖSUNG:
1 x 12 ml 1N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig.
12. SEALS HAFTFOLIE:
Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationsphasen.
13. BAG FOLIENBEUTEL:
Zur Aufbewahrung der nicht verwendeten Streifen.
14. GRAPH BLATT EINFACH-LOGARITHMISCHES PAPIER:
Um die quantitative Technik durchzuführen.
Vorsichtsmassnahmen
bioelisa CMV IgG ist ausschliesslich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt.
Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal.
ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL.
Das gesamte zur Herstellung dieses Produkts verwendete Humanmaterial ist unter Verwendung eines
zugelassenen kommerziellen Verfahrens auf die Anwesenheit von HBsAg, HIV-1/HIV-2 und HCV Antikörpern
getestet und für negativ befunden worden. Da kein Nachweisverfahren die Abwesenheit von infektiösen Agenzien
garantieren kann, ist dieses Produkt mit entsprechenden Vorsichtsmassnahmen zu handhaben:
-
-
Eine Berührung der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden; bei Berührung mit reichlich Wasser auswaschen.
Handschuhe verwenden.
Die Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren.
Nicht rauchen.
Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Die Reste von
Proben, Kontrollen, aspirierte Reagenzien und Pipettenspitzen müssen in einem dafür vorgesehenen Behälter
gesammelt werden und eine Stunde bei 121°C autoklaviert werden oder mit Natriumhypochlorit in einer
Endkonzentration von 10% 30 Minuten lang behandelt werden. (Die Reste, die Säure enthalten können,
müssen vor Zugabe des Natriumhypochlorit neutralisiert werden).
Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf
Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und –Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim
Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden.
Hinweise für die Handhabung:
-
Für sachgemäßes Auswaschen den Wascher auf den Mikrotiterplattentyp einstellen (flacher Grund).
Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen nicht mischen.
Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.
Verwenden Sie das Reagenz nicht, wenn Sie an irgendeinem zu dem Kit gehörenden Bestandteil irgendeine
Änderung des Erscheinungsbilds beobachten.
Es ist besondere Sorgfalt aufzuwenden, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Kreuzkontamination
zwischen den Reagenzien zu vermeiden.
Zur Pipettierung jeder Probe und jedes Reagenz ist eine neue Einweg-Pipettenspitze zu verwenden.
Reste von Seifen und/oder Oxidationsmitteln, die in den zur Herstellung der TMB-Substratlösung verwendeten
Gefässe zurückgeblieben sind, können die Reaktion beeinflussen. Bei Verwendung von Glasgefäßen sollten diese
darum mit 1N Schwefelsäure oder Salzsäure ausgewaschen, mit reichlich destilliertem Wasser ausgespült und vor
Gebrauch getrocknet werden. Vorzugsweise sind Einweggefäße aus Kunststoff zu verwenden.
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Lagerung und Stabilität
Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8°C bleiben die Bestandteile bis zum auf dem Etikett angegebenen
Verfallsdatum haltbar. Der Beutel mit der Mikrotiterplatte muss vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht
werden, um eine Kondensationsbildung in den Vertiefungen zu vermeiden. Nach dem Öffnen des Beutels ist die
Mikrotiterplatte bei Lagerung zwischen 2 und 8°C im gut verschlossenen Kunststoffbeutel mit dem Silicagelbeutel
3 Monate haltbar. Die Waschlösung bleibt nach Verdünnung zwei Wochen haltbar , wenn sie bei 2-8°C gelagert
wird. Das Konjugat ist nach Verdünnung 15 Tage haltbar bei einer Lagerung zwischen 2 und 8°C. Das Chromogen
vor direktem Licht schützen. Die TMB-Substratlösung ist nach Zubereitung nicht stabil, deshalb sind die
Gebrauchsanweisungen sorgfältig zu befolgen.
Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material
Destilliertes oder deionisiertes Wasser.
Mehrkanalpipetten und Mikropipetten (10 µl, 100 µl, 1000 µl) und Einwegspitzen.
Inkubator bei 37°C  1°C.
Röhren/Mikroröhrchen für die Verdünnungen.
Stoppuhr.
Mikrotiterplattenmessgerät mit Filter 450 nm. Empfohlen wird ein Referenzfilter 620 oder 630 nm.
Manuelles oder automatisiertes Waschsystem.
Probenmaterial
Frisches Serum oder Plasma (EDTA) benutzen. Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden. Die
Proben können 3 Tage lang bei 2-8°C gelagert werden. Bei längerer Lagerung müssen die Proben eingefroren
werden (-20°C). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Sichtbare suspendierte
Partikel sind durch Zentrifugieren zu entfernen. Die Seren oder Plasmen dürfen nicht hitzinaktiviert werden, da es
sonst zu falschen Ergebnissen kommen kann.
Automatische Verarbeitung
Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen In strumenten
eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die
erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte
das Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und
Einstellung der automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler
in Verbindung.
DURCHFÜHRUNG (Siehe schematischer Ablauf)
Vorbereitung
Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur gebracht worden sein (20-25°C).
Flüssige Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt werden.
Die konzentrierte Waschlösung ist mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1/10 zu verdünnen. Für eine
Platte 50 ml konzentrierte Waschlösung mit 450 ml Wasser mischen. Wird nicht die ganze Platte gebraucht, dann
eine proportional entsprechende Menge der Lösung herstellen.
1/101 Verdünnungen der negativen Kontrolle, Kalibriersubstanzen und zu analysierenden Proben vorbereiten,
wobei zum Beispiel 10 µl Serum 1 ml Probenverdünner hinzugefügt werden. Gut mischen.
ACHTUNG: Wenn manueller Versuch durchgeführt wird, ist es ratsam, alle Verdünnungen in Mikropipetten
durchzuführen und mit einer Mehrkanalpipette auf der Mikroplatte zu dosieren.
Das konzentrierte Konjugat mit dem Konjugatverdünnungsmittel gemäß Tabelle 1 1/51 verdünnen. Bei
Verwendung der gesamten Platte 300 µl des konzentrierten Konjugats direkt in eine Reagenzflasche mit 15 ml des
Konjugatverdünnungsmittel geben. Vorsichtig mischen.
TABELLE 1
Erforderliche Streifen
Verdünnungsmittel Konjugat ml
Konzentriertes Konjugat µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
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10
10,0
200
12
12,0
240
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Versuchsprotokoll
1. Nur die für den Test benötigte Anzahl Streifen verwenden. 7 Vertiefungen für Leerwert, Kalibriersubstanzen
und Kontrollen reservieren. Die Kalibriersubstanzen und die negative Kontrolle doppelt prüfen. 100 µl von
jeder verdünnten Probe, Kontrolle und verdünnten Kalibriersubstanzen auf die entsprechenden Vertiefungen
überführen. Eine Vertiefung für den Substratleerwert freilassen.
2.
Die Platte mit einer Haftfolie abdecken und 1 Stunde lang bei 37°C inkubieren.
3.
Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Den Inhalt aus den Vertief ungen herauspipettieren und diese
vollständig (ca. 350 µl) mit verdünnter Waschlösung befüllen. Den Vorgang aus Aspirierung und
Auswaschen weitere 3 Mal wiederholen. Stellen sie sicher, dass jede Vertiefungsreihe mindestens
15 Sekunden einweicht, bevor ein neuer Aspirationszyklus einsetzt. Nach dem letzten Waschen die Platte
umgekehrt über saugfähigem Papier ausklopfen, um alle Flüssigkeitsüberschüsse in den Vertiefungen zu
beseitigen.
4.
100 µl Konjugat auf jede Vertiefung übertragen, mit Ausnahme der für die Kontrolle des Substratleerwertes
bestimmten Vertiefungen. Blasenbildung vermeiden.
5.
Die Platte mit einer Haftfolie abdecken und 30 Minuten lang bei 37°C inkubieren.
6.
Während der letzten 5-10 Minuten dieser Inkubation die Substrat-Chromogen-Lösung zubereiten.
Verwendung der ganzen Platte 280 µl der TMB-Chromogen-Lösung in die Reagenzflasche
Substratpuffer (14 ml) einfüllen und gut mischen. Wird nicht die ganze Platte benötigt, dann
erforderliche Menge gemäß Tabelle 2 zubereiten. Die endgültige Lösung muss farblos sein;
Blaufärbung nicht mehr verwenden.
Bei
mit
die
bei
TABELLE 2
Erforderliche Streifen
Substratpuffer ml
Chromogen (TMB) µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
10
10,0
200
12
12,0
240
HINWEIS: Das TMB ist in DMSO gelöst. Da die Schmelzpunkt von DMSO bei 18°C liegt muss das Chromogen vor
Gebrauch auf eine Temperatur von 20-25°C gebracht und gut gemischt werden. Eine Gelbfärbung der
Chromogenlösung ist normal.
7.
Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Die Platte wie unter Punkt 3 beschrieben aspirieren und waschen.
8.
100 µl des TMB-Substrats auf alle Vertiefungen sogar des Leerwertes hinzugeben.
9.
30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren.
10. 100 µl Stopplösung in jede Vertiefung einfüllen, dabei die gleiche Reihenfolge und die gleichen Zeitabstände
einhalten wie bei der Zugabe des TMB-Substrats.
11. Das Messgerät anhand der Vertiefung mit der Leerwertsprobe bei 450 nm auf Null stellen und die Extinktion
jeder einzelnen Vertiefung innerhalb einer Zeitspanne von maximal 30 Minuten ablesen. Empfohlen wird eine
biochromatische Messung mit einem Referenzfilter von 620 - 630 nm.
Qualitätskontrolle
Die Ergebnisse einer Serie sind gültig, wenn folgende Kriterien erfüllt sind:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Substratleerwert: der Extinktionsgrad muss unterhalb oder gleich 0,100 sein.
Negative Kontrolle: Extinktion nach Abzug des Leerwertes kleiner als 0,100.
Stark positive Kalibriersubstanz: Extinktion nach Abzug des Leerwertes größer oder gleich 0,600.
Schwach positive Kalibriersubstanz: Extinktion muss nach Abzug des Leerwertes größer oder gleich
0,150 sein.
Verhältnis stark positive Kalibriersubstanz/schwach positive Kalibriersubstanz: gleich oder größer als 2,0.
Verhältnis negative Kontrolle/schwach positive Kontrolle: gleich oder unter 0,5.
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Qualitative Ergebnisse
1. Den Mittelwert der Extinktion der schwach positiven Kalibriersubstanz berechnen. Das Ergebnis ist der
Schwellenwert.
Schwellenwert = SCPKx
2.
Die Extinktion der Probe durch den Schwellenwert teilen.
Positiv:
Negativ:
Zweifelhaft:
Verhältnis Extinktion/Schwellenwert  1,0
Verhältnis Extinktion/Schwellenwert  0,9
Verhältnis Extinktion/Schwellenwert  0,9  1,0
Quantitative Ergebnisse
1. Durchschnittsextinktion der schwach positiven Kalibriersubstanz berechnen. Die Konzentration der
CMV-IgG-Antikörper der schwach positiven Kalibriersubstanz beträgt 0,25 IE/ml.
2.
Durchschnittsextinktion der stark positiven Kalibriersubstanz berechnen.
CMV-IgG-Antikörper der positiven Kalibriersubstanz beträgt 2,5 IE/ml.
Die
Konzentration
der
3.
Die Mittelwerte der Extinktionen der Kalibriersubstanzen auf der Ordinate (y-Achse, linear) gegenüber den
entsprechenden Konzentrationen in IE/ml auf der Abszisse (x-Achse, log) auf dem im Kit enthaltenen Bogen
Millimeterpapier als Koordinaten darstellen oder die einfach-logarithmische Regression benutzen.
4.
Wenn Millimeterpapier benutzt wird, eine durch die 2 Punkte führende Linie ziehen. Eine andere Option ist es,
eine einfach-logarithmische Regression auszuführen.
5.
Die Konzentration der Proben zwischen 0,25 und 2,5 IE/ml lässt sich auf der Grundlage der entsprechenden
Extinktionen unter Verwendung der graphischen Darstellung oder einfach-logarithmischen Regression
ableiten.
ACHTUNG: Dieser Versuch ist zur Bestimmung der Konzentrationen von IgG-Antikörpern gegen das CMV
zwischen 0,25 und 2,5 IE/ml bestimmt. Die Quantifizierung außerhalb dieses Bereichs führt zu
mangelnder Präzision. Proben, die Extinktionswerte oberhalb der stark positiven Kalibriersubstanz
ergeben, müssen erneut getestet werden, nachdem sie entsprechend mit dem Verdünnungspuffer
verdünnt worden sind. Das so erhaltene Resultat muss mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert
werden: (z.B. wenn eine Probe 1/500 verdünnt wird, muss das Resultat mit 5 multipliziert werden, da
die Normalverdünnung des Tests 1/101 ist).
Ergebnis in IE/ml
 0,25
 0,25
Auswertung
Positiv (immun)
Negativ (nicht immun)
Auswertung der Ergebnisse
Eine positive Reaktion muss als Vorhandensein von IgG-Antikörpern und CMV-Infektion, kurz zurückliegend oder
nicht, interpretiert werden. Ein 4facher oder höherer Anstieg des Antikörper-Titers gegen CMV in paarweisen
Proben, die in einem Zeitintervall von 3-4 Wochen genommen wurden und die gleichzeitig in anklebenden
Vertiefungen getestet werden müssen, kann auf eine kurz zurückliegende Infektion hindeuten. Zur Diagnose wird
allerdings empfohlen, dieses Verfahren mit dem Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern gegen CMV und dem
Nachweis der Virus-DNA in den weißen Blutkörperchen oder dem Gesamtblut mit Verstärkungstechniken zu
ergänzen.
Begrenzung der Methode
Wie auch bei anderen serologischen Untersuchungen dienen die mit bioelisa CMV IgG ermittelten Resultate als
Hilfe bei der Diagnose und müssen unter Berücksichtigung des klinischen Befunds des Patienten interpretiert
werden.
Für eine optimale Leistung des Kits sind die beschriebenen Anweisungen genauestens zu befolgen. Irgendeine
Abweichung kann zu abwegigen Ergebnissen führen.
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Bei zweifelhaften Ergebnissen wird empfohlen, den Test mit einer neuen Probe des Patienten zu wiederholen und
mit einer anderen Methode zu testen, wenn das Ergebnis noch zweifelhaft ist.
Die Ablesewerte der Extinktion sind zum Logarithmus der Konzentration der Antikörper (oder IE/ml) proportional.
Geringe Abweichungen bei den Extinktionen können zu größeren Abweichungen bei den Antikörpertitern führen.
Erwartete Ergebnisse
Die Prävalenz mit Primär- und rekurrenter CMV-Infektion unter Erwachsenen schwankt in verschiedenen
Weltgegenden und selbst zwischen verschiedenen Altersgruppen und gesellschaftlichen Schichten innerhalb der
gleichen geografischen Region stark. In einer internen Studie wurde bei 642 nicht ausgewählten Blutspendern in
Barcelona, Spanien, eine Seroprävalenz von etwa 70% festgestellt. In Mitteleuropa sind rund 50% der jungen
10
Erwachsenen mit CMV infiziert. In der ältesten Altersgruppe liegt die Durchseuchung bei 70-80%.
Charakteristika des Tests
Auswertungen
Die Leistungsfähigkeit des Tests bioelisa CMV IgG wurde unter Verwendung von kommerziellen Panels sowie in
Vergleichsstudien mit anderen kommerziellen Tests untersucht.
-
Es wurde ein kommerzielles BBI-Panel „anti-CMV mixed titre panel PTC202“ bestehend aus 25 charakterisierten
Proben getestet. Der Kit wies korrekt alle Proben nach. Für 23 Proben wurden positive Ergebnisse ermittelt.
-
Bei einer internen Bewertung wurden 642 Proben mit bioelisa und mit einem anderen handelsüblichen Test
getestet. Von diesen Proben waren 447 mit beiden Tests positiv und 189 negativ. Die Gesamtkonkordanz
zwischen den Tests war 99,1% (635/642). Von den 6 abweichenden Proben, wiesen 4 zweifelhafte
Ergebnisse mit bioelisa oder dem zweiten Test auf. Bei Ausschluss der zweifelhaften Ergebnisse aus der
Berechnung lag die relative Sensitivität von bioelisa bei 99,8% (447/448) und die relative Spezifität bei 99,5%
(189/190).
-
In einer externen Studie zur Sensitivität und Spezifität mit anderen handelsüblichen Tests wurden 79 bei
Organspendern entnommene Sera mit 6 Tests getestet. Zwei Latex-Agglutinationstests, ein PartikelAgglutinationstest und drei ELISA für CMV-Antikörper. Insgesamt 67/79 Proben wiesen bei allen Tests
übereinstimmende Ergebnisse auf. (34 positive und 33 negative Proben). Der bioelisa CMV IgG wies 40 als
positive und 39 als negative nach. In Bezug auf das Übereinstimmungsergebnis ergab sich eine Sensitivität
von 100% (38/38) und eine Spezifität bei 97,6% (40/41).
Präzision
Intra-Assay Reproduzierbarkeit:
Die erhaltenen Variationskoeffizienten für die Extinktionswerte einer positiven Probe, die 32 Mal repliziert wurde,
lagen bei 3,0%, 5,0% und 4,7% bei drei untersuchten Chargen.
Inter-Assay Reproduzierbarkeit:
Drei positive Proben unterschiedlichen Niveaus wurden in 3 verschiedenen Tests getestet. Die erhaltenen
Variationskoeffizienten für das Verhältnis Extinktion/Schwellenwert der 3 Proben lagen bei 6,8%, 4,7% und 2,6%.
Interferenzen
Mit dem Ziel mögliche Interferenzen zu studieren, wurden Proben mit potenziellen Risiko zur Entstehung von
Kreuzreaktionen analysiert. Unter solchen Proben befanden sich positive Sera mit Rheumafaktor (RF),
antinuklearen Antikörpern (ANA) und von schwangeren Frauen. Es wurden keine Hinweise auf Interferenzen
beobachtet.
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bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung
Problem
Mögliche Ursachen
Lösung
1. Kontrollen außerhalb der
Validierung.
1a. Temperatur, Inkubation
oder Pipettieren falsch.
1b. Unsachgemäße
Vorbereitung der
Reagenzien, falsche
Verdünnung. Reagenzien
nicht richtig
durchgemischt.
1c. Kreuzkontamination
zwischen Kontrollen.
Methode überprüfen. Den
Test wiederholen.
Methode überprüfen. Den
Test wiederholen.
1d. Falscher Lesefilter.
1e. Interferenz in der Optik.
1f. Es wurden Komponenten
aus unterschiedlichen
Chargen verwendet.
1g. Reagenzien abgelaufen.
2. Keine oder nur schwache 2a. Ein Reagenz oder
Färbung am Ende des
mehrere nicht oder in der
Tests.
falschen Reihenfolge
hinzugefügt.
2b. Konjugat inaktiv:
unsachgemäße
Konservierung.
2c. Mikrotiterplatte inaktiv:
unsachgemäße
Konservierung.
2d. Substrat inaktiv:
unsachgemäße
Konservierung oder
Verdünnung, der
verwendete Behälter
beeinträchtigt die
Stabilität des Substrats,
Kreuzkontamination mit
der Stopplösung.
Sorgfältig pipettieren. Die
Reagenzflascheverschlüsse
nicht vertauschen. Den Test
wiederholen.
Überprüfen, ob ein Lesefilter
der Wellenlänge 450 nm
eingesetzt ist. Wird kein
Referenzfilter mit 620-630 nm
eingesetzt, dann erhöht sich
die Extinktion um ca. 0,050.
Das Messgerät überprüfen.
Den Grund der Vertiefungen
reinigen oder trocknen.
Prüfen, ob Luftblasen
eingeschlossen sind. Die
Ablesung wiederholen.
Keine Komponenten aus
unterschiedlichen Chargen
mischen, da diese spezifisch
für jeden Chargen
zusammengestellt sind.
Verfallsdatum des Kits prüfen.
Ein abgelaufenes Kit nicht
mehr verwenden.
Methode überprüfen. Den
Test wiederholen.
Prüfen, ob es zu einer
Kontamination gekommen ist.
Methode überprüfen. Den
Test wiederholen.
Die nicht verwendeten
Streifen sind immer im
verschließbaren Folienbeutel
zusammen mit dem
Trockenmittel aufzubewahren.
Den Test wiederholen.
Immer eine neu zubereitete
TMB-Lösung im
Substratpuffer verwenden.
Einwegbehälter verwenden
oder die Behälter mit Säure
oder Ethanol auswaschen und
mit desionisiertem Wasser
ausspülen. Methode
überprüfen. Den Test
wiederholen.
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bioelisa
bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung
Problem
Mögliche Ursachen
Lösung
3. Zu starke Färbung in
allen Vertiefungen der
Mikrotiterplatte.
3a. Substrat kontaminiert,
oxidiert oder
unsachgemäß
vorbereitet.
Prüfen, ob das vorbereitete
Substrat farblos ist; bei
Blaufärbung nicht mehr
verwenden. Vor Verwendung
das TMB prüfen und
sicherstellen, dass es
vollkommen flüssig ist. Für
eine vollständige
Durchmischung des TMB im
Substratpuffer sorgen.
Einweg-Reagenzgläser
oder –Behälter verwenden
oder diese mit Säure oder
Ethanol auswaschen. Den
Test wiederholen.
Auf Kontamination prüfen
(Trübung). Verdünnungen
prüfen. Den Test wiederholen.
Die Qualität des
destillierten/deionisierten
Wassers zur Herstellung der
Verdünnung prüfen. Den Test
wiederholen.
Wascher prüfen. Die
Vertiefungen bis zum Rand
befüllen und vollständig
aspirieren. Die Anzahl der
Waschzyklen und die
Einweichzeit erhöhen. Die
umgekehrte Platte auf
saugfähigem Papier
ausklopfen. Den Test
wiederholen.
Nur die Waschlösung von
biokit verwenden.
3b. Reagenzien kontaminiert
oder unsachgemäß
zubereitet.
3c. Waschlösung (1x)
kontaminiert.
3d. Waschen ungenügend
oder nicht konsistent:
Füllmenge und/oder
Aspirieren ungenügend
oder nicht einheitlich,
Anzahl der Waschzyklen
ungenügend. Wascher
kontaminiert.
4. Schlechte
Reproduzierbarkeit oder
erhöhte Anzahl reaktiver
Proben, die sich nicht
wiederholen.
3e. Es wurde Waschlösung
von einem anderen
Hersteller verwendet.
4a. Probleme beim Waschen.
4b. Pipetten schlecht
kalibriert oder
Pipettenspitzen nicht
richtig eingesetzt.
Unsachgemäße
Pipettiertechnik.
4c. Reagenzien und Seren
nicht auf Raumtemperatur
oder vor Gebrauch nicht
richtig gemischt.
4d. Mikrotiterplatten während
der Inkubationen der
Zugluft ausgesetzt.
4e. Zuviel Zeit bei der
Zugabe von Proben
und/oder Reagenzien.
Inkonsistente
Zeitintervalle. Luftblasen.
4f. Interferenzen in der Optik.
Siehe Abschnitte 3c, 3d, 3e.
Nur kalibrierte Pipetten mit
richtig eingesetzten
Pipettenspitzen verwenden.
Sorgfältig und ohne Blasen
und Spritzer pipettieren. Den
Test wiederholen.
Reagenzien und Seren auf
Raumtemperatur bringen und
vor Gebrauch gut mischen.
Die Mikrotiterplatte vor Zugluft
geschützt lagern.
Eine einheitliche und
konsistente Technik
entwickeln.
Siehe 1e.
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0843