Molekular-Pathologie
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Andras Kiss dr. med. habil, Ph.D. Semmelweis Universität, Budapest II. Institut für Pathologie den 26. Oktober, 2015 Makroskopische Pathologie Rokitansky- Wien 1840 Pathologische Anatomie Lobar and Broncho-Pneumonie Morgagni,1761 GI Krankheiten Virchow,1858 „Zellularpathologie” Watson & Creek, 1953 DNS Struktur XX. Jahrhundert Technologien • Makroskopie (Zuschnitt) • Zytologie • Histologie • Zytochemie • Immunhisto/zytoschemie • Elektronmikroskopie • • • Molekular Biologie Molekulargenetik XXI. Jahrhundert KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch AAA: Amicability Availability Affinity Freundlichkeit Verfügbarkeit Verbundenheit, Affinitat P4 Predictive Preventive Personalized Participatory prediktiv preventiv personalisiert teilnehmend, partizipativ KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch Allgemeine Probleme: - Tumorheterogenitat: biologische und diagnostische Bedeutung GEWEBSNAHME, Biopsie: Art und Menge - therapeutische Protokolle / Genehmigungsprotokolle und die Revision im Spiegel neue Ergebnisse Zieltherapien: - Einführung neuer Therpien, Anderung klinischer Protokolle (verwendbar in der ersten oder zweiten Linie ) - Einführung neuer, moderner diagnostischer Methode TRANSIT-ZEIT , QUALITATVERSICHERUNG ! EINGANGSMATERIAL • RESEKATE • Bioptaten – Zylinder/ Excision • Zelle – CYTOLOGIE • Flüssigkeit • Menschlicher Körper Die Arbeit der Pathologe • Histologische Analyse, Diagnose, Befund/Kommentar • Cytologie – zellulare Morphologie • Spezielle Untersuchungen: weitere Pünktlichkeit der Diagnose • Autopsie und Auswertung der Befunde • Unterrichtung • Konsultation ( mündlich auch !!!) Biopsien • Zytologie – Bürsten – Flüssigkeit – FNAB (Aspirationszytologie) • Bioptat für Histologie – Exzisionsbioptat (direkt, geöffnete OP, Videoassistiert) – Stanze (core) – Endoskopisch Gezielte Biopsie • visuell – Oberflachliche Lokalization, Körperhöhle, Organe mit Lumen • Bildgebende Verfahren (UH, CT, MR) – tiefe Lokalization Zytologische Materialnahme Exfoliative Zytologie (Bürste) • Oberflachliche Lasionen der schmalen, luminierten Stukturen =intraepitheliale oder invasive Tumoren (Zervix, kleine Bronchien, Gallengange) • Abstrich: viele normael/reaktive epitheliale Zelle • Fehlermöglichketi:reaktiv vs. maligne – Dysplasie vs. invasiver Tumor Feinnadelaspirationsbioptat (FNAB) • Einfache Gerate (Nadel, Spritze) • Gezielt – USCHALL (schnell, einfach, real time gezielt, ertse Wahl) – EUSCHALL (Sturkturen, Bildungen in der Nahe von luminierten Organe z.B. Pankreas, hilare LK) – CT (mit USCHALL nicht lokalizierbare Lasion, Bildungen in der Brustkorb: langeres Verfahren, Zielung nach fixierter Aufnahme KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch AAA: Amicability Availability Affinity Freundlichkeit Verfügbarkeit Verbundenheit, Affinitat P4 Predictive Preventive Personalized Participatory prediktiv preventiv personalisiert teilnehmend, partizipativ KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch Allgemeine Probleme: - Tumorheterogenitat: biologische und diagnostische Bedeutung GEWEBSNAHME, Biopsie: Art und Menge - therapeutische Protokolle / Genehmigungsprotokolle und die Revision im Spiegel neue Ergebnisse Zieltherapien: - Einführung neuer Therpien, Anderung klinischer Protokolle (verwendbar in der ersten oder zweiten Linie ) - Einführung neuer, moderner diagnostischer Methode TRANSIT-ZEIT , QUALITATVERSICHERUNG ! Routinverfahren der Histologie 1. Makroskopische Untersuchung – „Zuschnitt” 2. Fixierung der ausgeschnittene Gewebsblöcke Szövettani asszisztens 3. Schneiden 4. Farbung 5. Untersuchung Was zuschneiden? Färbungen • RUTINE: – haematoxylin-eosin (HE) – – – – PAS (perjodsaure-Schiff) Alzianblau + PAS Giemsa Papanicolau Speziale Färbungen Masson Nissl Grimelius Kristallviolet Best Gomori Schmorl Gram Ziehl-Neelsen Gallyas Romeis Van Gieson Orcein Grocott Tri-chrom Mallory Resorcin-fuchsin Kongo-rot Versilberung Kossa Endoskopie Magenbioptat 2 mm Helicobacter pylori Giemsa Warthin-Starry Färbung Amyloidose Kongo-rot Kongo-rot: in POLARIZIERTEM LICHT Metastase TUMORDIAGNOSTIK, Aufgabe der Pathologie Malignitat ausschliessen oder beweisen (so gut, wie möglich !) Was ist möglich ? - Histologie - Zytologie (Beschränkung: Nr. Der Blöcke, Serienschnitte) - Immunhistochemie - Molekular-Pathologie (FISH, PCR, usw.) GENETIK, CYTOGENETIK PATHOLOGIE MICROBIOLOGIE Pathologische Diagnose Klinisches Laboratorium Medizinische Mikrobiologie Pathologie - Anatomische Pathologie (+ klinische Pathologie) - Molekular-Pathologie Cytologie Histologie Immunohisstochemie Flow Cytometrie Molekular-Pathologie MORPHOLOGIE Schnitte: in 2 Dimension !! Biologische Strukturen: in 3 Dimension !! 1 2 3 4 1 2 3 5 4 5 6 6 Invazives Zervix Karzinom MOLEKULARE PATHOLOGIE Molekulare Biologie = Molekulare Pathologie MULTIDISZIPLINARES GEBIET Behandlung des Materials, Diagnose Stellung und Interpretation der Befunden benötigen Konsultation ! Ideale Tumormarker für Krebs HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF CANCER Ng/mL | 0.0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 100% Specificity | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 100% Sensitivity | 9.0 | 10.0 | 100.0 Realität der Untersuchungen HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF CANCER | 0.0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 20% FALSE NEG. | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 70% FALSE POS. | 8.0 | 9.0 | 10.0 | 100.0 Human Genom und Krebs • Alle Tumoren entstehen durch genetische Veränderungen • Tumorigenesis ist ein multi-step Prozess • ungefähr 5% bis 10% der Tumoren ist hereditär Tumor Diagnostik in der Pathologie Klassische Histoloige Immunhistochemie Molekular diagnostische Methoden Allgemeine Bemerkungen - SPECIFIZITAT, SENZITIVITAT - Wofür ist Pathologie (inkl. Molekulare Pathologie) ? FRAGEN ? Was sagt die Morphologie / genetische Information ? Entwicklungsanomlaie ? Vererblich ? Entzündung ? Akut oder chronisch ? Geschwulst ? Tumor like lesion, benigne, maligne ? Therapie / Prognose / Prediktion ! Allgemeine Bemerkungen malignus Tumoren: Fragen ? Primar oder sekundar (Metastase) ? When Metastase: wo ist Primartumor ? Therapie ? Parameters zu Therapie: grade und stage sind Therapie bstimmend: Resektion + Radiotherapie + Chemotherapie (preoperative oder postoperative) KOMMUNIKATION mit der Kliniker ! Sicherlisch maligne, sicherlich benigne: O.K. Pathologe weisst nicht: WARUM ? Chirurgische Resekate: R0 ? Resektionsrande ? Die Bedeutung des Genotypes Klassifizierung !! Klinikum Immunphenotyp Genetische Alterationen/Aberrationen Diagnosestellung Beurteilung der Prognose !! ansprechende Therapie ! Kontrolle ! Folgung ! Krankheit Therapie = personalisierte Therapie !! Formalin fixiertes, Paraffin Eingebettetes Material: FFP (E) ► Warum ? ► Grosses Basis von Material + Daten ► Was möchten wir erreichen ? ► Alles, aber …….. ► - DNA - RNA - PROTEIN Sequenzieren Klonieren MUTATION ANALYSE mRNA EXPRESSION (real time RT-PCR, DNA CHIP) mikroRNAs IMMUNHISTOCHEMIE WESTERN BLOT ANALYSE PROTEOMICS Optimel Grösse ? 5 mm dick alternatve Methode: RNAlater, Stickstoff z. B.: 8 cm- grosser Tumorresekat Mitte des Resekates: Nicht fixiert bis zu 3-4 Stunden: Degradierung !! + OP: relative Ischemie Was wirkt auf das Gewebe ? ? FORMALINE ( gepuffert ?) Crosslinking PROTEIN DEGRADIERUNG KONFORMATION Veranderung Brüche ALKOHOL Reihe Temperatur!!! PARAFFIN (trcokenes Warme !! ) PROTEINE und DNA, RNA Crosslinking (Methylol crosslink) DNA, RNA DEGRADIEUNG DN, RNA Brüche „ Wahre ” Schlussfolgerungen ? Frage: wozu ist dieses FFPE Material geiegnet ? Qualitative Analyse der Makromolekulen von FFPE Material • Histologie: – PRIMAR – Grosser informativer Hintergrund (KENTNISS) • PROTEIN – Immunohistochemie • Molekulare Analyse • Optimalisierung/ Erschliessung „ Kompensierung der Schadigugn „ – Isolierte Proteine • NUKLEINSAURE • DNS – Lange • RNS – Lange – Quantitat – Empfindlich Wirkung der Zeit der Fixierung an die Gewebsarchitektur 1 Tag 3 Tage 10 Tage Wirkung der Zeit der Fixierung an die Qualitat des isoliertes DNA 3Tage 1 Tag 10 Tage Wirkung der Zeit der Fixierung an die Qualitat des isoliertes RNA 3 days 1 day 10 days FFPE MATERIAL Gewebslokalisation In vitro Immunhistochemie DNA Techniken In situ Hibridisierung RNS Techniken (CISH, FISH) Protein Techniken NUKLEINSAURE ISOLATION DEPARAFFINIERUNG (Xylol + Alkoholreihe, Puffer „Verdauung „ (Proteinase-K) Nukleinsaure Isolation (Phenol/Chloroform) Prezipitation Auflösung in Puffer A. GAPDH PCR - DNA B. GAPDH RT-PCR Reaktion - cDNA C. Lebergewbe - HCV Test mit nested RT PCR RNA Integritat Kontrolle mit Gelelektrophorese 1 11 2 12 13 3 14 4 15 5 16 6 17 GAPDH RT PCR 7 18 8 19 9 20 10 21 22 Results of Real-time PCR on paraffin embedded normal human endometrium samples fixed with RNAlater™, acetone or formalin, showing 121, 225, 406 basepair (bp) products for GAPDH and 166, 310, 536 basepair products for [beta] globin. Páska és mtsai: Diagn Mol Pathol. 2004 Dec;13(4):234-40. Páska és mtsai: Diagn Mol Pathol. 2004 Dec;13(4):234-40. Different Size Amplicon GAPDHs and [beta] Globins’ Real-Time PCR CT (Threshold Cycle Number) Values (Mean ± SD) for RNAlater, Acetone, and Formalin Fixatives and Differences of Expression Between Fixatives Ratio of Downregulation of Longer Transcript Detection (225- and 406-bp GAPDH, 166and 310-bp [beta] Globin) Compared to the Smallest Amplicon (121-bp GAPDH) in the Various Fixatives, Respectively. WHAT WORKS ON THE TISSUE ? ? FORMALIN (buffered ?) Cross link between proteins PROTEIN DEGRADÁTION CONFORMATION CHANGE BREAKS ALCOHOL ROW TEMPERATURE !!! PARAFFIN (dry heat) PROTEINS and NUCLEIC ACID CROSSLINKS (methylol crosslink) DNA, RNA DEGRADES DNS, RNS BREAKES „ TRUE ” conclusions might be reached from FFPE material Question: What could be answered from FFPE material ? ? Quality analysis of isolated macromolecules from paraffin embedded material • Histology: – PRIMARY – Huge informatioin backgorund (knowledge) • PROTEINS – Immunohistochemistry • Molecular analysis • Optimalization/” retreaval „ damage correction – Isolated proteins • NUCLEIC ACIDS • DNA – length • RNA – lenght – quntity – MOST SENSITIVE FFPE material Tissue localisation In vitro Immunhistochemistry DNA based techniques In situ hibridisation RNA based techniques (CISH, FISH) Protein based techniques MILESTONE TissueSAFE High Vacuum Biospecimens Transfer System ™ 34 C° !!! Kidney, 0. day, Kidney, 3. day, HE, 400x HE, 400x VACUUM FOILED, PARRAFFIN EMBEDDED KIDNEY Kidney, 6. day, Kidney, 10. day, HE, 400x HE, 400x Kidney, 0. day, Kidney, 3. day, PAS, 400x PAS, 400x VACUUM FOILED, PARRAFFIN EMBEDDED KIDNEY Kidney, 6. day, Kidney, 10. day, PAS, 400x PAS, 400x Kidney, 0. day, Kidney, 3. day, CD10, 400x CD10, 400x VACUUM FOILED, PARRAFFIN EMBEDDED KIDNEY Kidney, 6. day, Kidney, 10. day, CD10, 400x CD10, 400x FRAGMENTATION of isolated DNA from vacuum foiled samples LIVER DAY: VACUUM, 0. KIDNEY1 3. 6. 0. 4. KIDNEY 2 7. 10. 0. 3. KIDNEY 3 6. 0. 4. 7. GASTRIC CC. 10. 0. 3. 6. then: -80Co 1000 bp 500 bp embedding 1000 bp 500 bp Nap: 0. 3. 6. LIVER 0. 4. 7. 10. KIDNEY 1 0. 3. 6. 0. 4. 7. KIDNEY 2 KIDNEY3 10. 0. 3. 6. GASTRIC CC Formalin fixation, then embedding 1000 bp 500 bp ~0,5 µg DNA/sample, 1.2% gel Nap: 0. 3. 6. KIDNEY 2 0. 4. 7. 10. KIDNEY 3 0. 3. 6. GASTRIC CC Immunhistochemie - Deparaffinálás - Antigén feltárás / mikrohullám előkezelés Szubsztrát Színreakció - Blokkoló szérum Peroxidáz - Primér antitest Biotin - Secunder antitest - Avidin - Biotin - komplex Avidin Secunder AB Anti-egér - Peroxidáz reakció / DAB / - Háttérfestés / haematoxylin / Primér antitest egér Blokkoló fehérjék Anti-nyúl Antigén: nyúl PATHOLOGIE – Lungenkrebs Kleinzellig (SCLC) ? Nicht-Kleinzellig (NSCLC) Subtyping of undifferentiated non-small cell carcinomas in bronchial biopsy specimens. Loo PS, Thomas SC, Nicolson MC, Fyfe MN, Kerr KM. J Thorac Oncol. 2010 Apr;5(4):442-7. A reevaluation of the clinical significance of histological subtyping of non--small-cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol. 2009 Jun;17(3):206-18. Review. PATHOLOGIASCHE DIAGNOSTIK PRIMER TÜDŐRÁK NE markerek + TTF-1 + p63 – HMWCKs (CK 5/6) – CD56 + Neuro-endokr. markerek EGYÉB NSCLC, n.o.s. SQC SCLC / LCCNEC ADC TTF-1 + p63 – CK7 + HMWKCKs - - rosszul diff. carcinoma átmeneti fenotípus TTF-1 P63 - TTF-1 p63 + CK7 -/+ CK 5/6 + HMWKCKs + S100A7 + A reevaluation of clinical significance of histological subtyping of non-small cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol. 2009 Jun;17(3):206-18. Review CITOLÓGIAI MINTAVÉTEL hazai gyakorlat Bronchoszkópos ( + transthroracalis) szövettani mintavétel 1 Bronchoszkópos citológiai mintavétel 4 Hátránya: - mintavételi hibák - fixálási hibák - kevesebb pontos diagnózis Rezekat Makrodissektion….. Transbronchiale Bioptat T/N<1:8 T/N <1:2 Bronchus Bürstenzytologie T/N>1/10 (10%) T/N>10/1 (90%) SQC TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + p63 TTF-1 SQC HMW CK TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + Chromogranin Bronchoskopie - Bioptat p63 p63 SQC TTF-1 TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + TTF-1 ADC TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 + CK-7 TTF-1 ADC CK-7 TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 + TTF-1 Bronchoskopie - Bioptat CK7 CK7 ADC TTF-1 TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 + TTF-1 50,297 80 jahriger Mann Anamnese: Strumektomie, Diabetes Mellitus Typ II. Parkinson Krkht., Katarakt (opus) Stroke Gehirnatrophie, Demenz Ösophagusgeschwür Hospitalization wegen Bronchitis Stazionierung: Hypoglikämie, Exsiccation Gastroskopie: Histologie: Magenkarzinom US: multiplexe Lebermetastasen – Asp. Zytologie, FNAB : Metastase von kolorektalem Karzinom ??? Primär Tumor ??? Gravis Anämie - Transfusionen - Tod unter tumoröser Kachexie CK-20 CK-7 DARM – Sigma cc. CK-20 CK-7 Magen cc. CK-20 CK-7 LEBER MET. IHC: Lebermetastase des Koloncc. Haupterkrankung / Grunderkrankung: Magenkarzinom (cardia) Komplikation 1. (zu dem Tod führend / dem Tod vorgehend): tumoröse Infiltration der Milz Lymphknotemetastase (neben truncus coeliacus) Anämie Lungenembolie Dilatation des linken Ventrikels - Herzinsuffizienz Lungenödem Hydrothorax Atelektasie (l.s.) Todesursache: Begleitskrankheiten: Nebenkrankheiten: tumoröse Kachexie Sigmakarzinom Sigmakarzinom Metastasen der Leber Gehirnatrophie Status lacunaris cerebri Meningeom Nephrosclerosis arteriolo et artriosclerotica akute Bronchitis Nierenhypoplasie (l.s.) MOLECULARE PATHOLOGIE • Tumor Diagnostik • Diagnostik der Infektionskrankheiten • Diagnostik der genetischen Krankheiten MOLEKULAR-PATHOLOGIE ZIEL • Verstärkung der Diagnose, Bestimmung des Genotyps, Untersuchung des Polymorphysmus z.B. CML ( Philadelphia Kromosom), Typisierung des Lymphoms Wilsonsche Krankheit, Diagnose der Haemochromatose • MRD: Minimal Residual Disease !! z.B. Mamma KarzinomKnochenmark, Hämatologische Krankheiten - Knochenmark • Entscheidung diagnostischer und therapeutischen Fragen HER-2 ⇒ HERCEPTIN Therapie ? • Erweisung verschiedener Infektionserreger, Typisierung: HPV, Chlamydia pn., Tuberkulose... MOLECULAR PATHOLOGY DNS • Bestimmung die Kopienummer der Genen r: FISH, competitive PCR, real time PCR: HER-2 – Brustkrebs n-myc - Neuroblastom Gezielte Therapie: Definition • Gezielt an Signaltransduktionswege, Prozesse und Physiologie die sind spezifisch unterbrochen in Tumorzellen. z.B. – – – – Rezeptoren Gene Angiogenese Tumor pH • ABER: diese Transduktionswegem usw, sind eigentlich nicht so eigenartig ! Tausch der Wache • Es gibt eine Paradigm-schaltung in der Behandlung der Tumoren • Konventionelle cytotoxische Drogen interferieren mit DNA die Zellreplikation zu verhindern. Aber: die sind nicht spezifisch für die Tumorzellen. • Therapie ist in Schaltung Richtung gezielte Therapien die attakieren Tumorzellen spezifisch kombiniert mit konventionellen cytotoxischen Drogen. Man muss den Ziel identifizieren !! • Die ansprechende Anwendung der neuen und teuren gezielten Therapien gegen Tumoren lieght an erster Hand an den Pathologen. Die Pathologen müssen in der Tumorpraparaten die Ziele identifizieren. • Es geben zwie Hauptklassen der gezielten Therapien: • kleinmolekulare Tyrosin Kinase Hemmer (inhibitors) (TKIs) und • monoclonale Antikörper (mAKs) TOPICS in MOLECULAR PATHOLOGY 1. Lung cancer target therapy sensitvity EGFR exon 19-21 mutation analysis K-RAS exon 2, codon 12/13 mutation anaalysis EML4-ALK fusion gene analysis EGFR, MET copy number analysis (FISH) 2.Colon cancer target therapy sensitivity K-RAS and B-RAF mutation analysis EGFR exon-2-7 mutation anaylsis EGFR copy number analysis (FISH) MSI status determination: MLH1 and MSH2 inactivity (IHC) EGFR, MET copy number (FISH) 3. Breast target therapy sensitivity HER-2 copy number (FISH) HER-2 ec-domain deletion test p95 4. Malignant melanoma target therapy sensitivity B-RAF mutation anaylsis N-RAS mutation anaylsis (codon 61) C-KIT mutation anaylsis (exons) EGFR, MET copy number (FISH) TOPICS in MOLECULAR PATHOLOGY 5. Neuroblastoma - n-myc copy number 6. Genetic backgroung of kidney developmental disorders - Wilms tumor dg. WT1 mutation anaylsis 8. Infectious diseases: detection and analysis HP antibiotics resistency analysis FISH HPV detectionn – typing (PCR) . CMV, EBV, TBC detection 9. Hematopathology diagnostics: e.g. Philadelphia chr. 9-22 transloc. BCL-ABL fusion gene Polycythemia vera: JAK2 point mutatios Primary myelofibrosis: JAK2 or MPL mutations anaplastic large B cell lymphoma: ALK rearrangement mantle cell lmyphoma: Cyclin D1-IgH fusion gene 10. Soft tissue tumor diagnostics: Ewing sarcoma: FL1-EWS fsion gene Liposarcoma: CHOP/TLS fusion gene Clear cell src: EWS-ATF1 fusion gene A KRAS gén mutációinak meghatározása Az EGFR gén mutációinak meghatározása A c-kit gén mutációinak meghatározása (MP03A, MP03B, MP03C) cetuximab, panitumumab, erlotinib, gefitinib NSCLC, CRC gefitinib, erlotinib NSCLC, CRC Imatinib Imatinib, sunitinib GIST GIST Imatinib, Sprycel, Tasigna Imatinib, Sprycel, Tasigna CML, ALL, AML CML, ALL, AML A t(9;22) transzlokáció kapcsán kialakuló Philadelphia kromoszóma kimutatása (MP07A, MP07B) Imatinib, nilotinib, dasatinib CML, ALL, AML A PML/RARα fúziós transzkriptum mennyiségi meghatározása ATRA kezelés AML ATRA kezelés Trastuzumab AML A PDGFRA gén mutációinak meghatározása Az abl gén mutációinak meghatározása A BCR-ABL fúziós transzkriptum mennyiségi meghatározása A t(15;17) transzlokáció kimutatása A her2/neu gén kópiaszám-növekedésének (amplifikáció) meghatározása A Epstein-Barr vírus (EBV) kópiaszámának meghatározása emlő cc. TX utáni lymphoprolif. bet. TX Th. Módosítás FLT3-ITD mutációk kimutatása Csontvelő TX indikáció AML Nucleophosmin (NPM1) mutációk kimutatása Csontvelő TX indikáció Csontvelő TX indikáció A Helicobacter pylori clarithromycin-rezisztenciájának meghatározása MLLT3/MLL és TEL/AML transzlokációk kimutatása Immunglobulin nehézlánc génátrendeződés (IgH) kimutatása T-sejt receptor génátrendeződés (TCR) kimutatása A t(8;14) transzlokáció kimutatása A 17p és 13q deléciók kimutatása A 17p és 11q deléciók és / 12-es triszómia kimutatása N-myc gén kópiaszám-növekedésének (amplifikáció) meghatározása EWSR1 gén disszociáció kimutatása SYT 1 és 2 gén disszociáció kimutatása Dg. + th. Dg. + th. B sejtes lymphoprolif. bet. T sejtes lympőhoprolif. bet. Th. Th. Burkitt ly. Myeloma mpx. Rituximab rezisztencia/ érzékenység High risk h. Dg. És th. JAK2 mutáció kimutatása Diff. Dg. Dg. EML4-ALK fúziós gén kimutatása Crizotinib CLL Neuroblastoma SRC, epitheloid sejtes tu. Synovialis src., epith. sejtes tu. Chr. Myeloprolif. bet. NSCLC Southern blot ( Northern blot , Western blot) MOLECULAR PATHOLOGY RT-PCR Basic technics in molecular pathology - overview Analysis and characterization of nucleic acids - Mapping with restriction enzymes - Hybridization techniques Southern blot (DNS) Northern blot (RNS) Western blot - Array based hybridization dot/slot blot genom array Nucleic acid amplification -target amplification Polymerase Chain Reaction (PCR) Transzkription-based Amplification Systems (TAS) - probe amplification Ligase Chain Reaction (LCR) Strand Displacement Amplification (SDA) Qβ Replicase Basic technics in molecular pathology - overview - Signal amplification Branched DNA amplification (bDNA) Hybrid Capture Assay (HCA) Cleavage-Based Amplification Chromosome structure and mutatioon analysis - Kariotyping - Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), Comparative Genome Hybridization (CGH) DNA sequencing A Southern blot ( Northern blot , Western blot) DNA microarray – expression array (1987) DNA microarray (cont.) In the reader Green laser first Expressed both Overall score Location of the three locus Stored by PC Then Red laser Stored in PC as well See result More than 80,000 spots Per slide surface (human genome consists less than 30,000 coding genes ) High-density oligonucleotide array (mutation analysis, SNP analysis, sequencing) Photolitography technique – more than 100,000 short Oligomers (10-25 base pares) in one sslide. Custom Made sequence in every spots Affymetrix technology Target amplification methods PCR: Polymerase Chain Reaction Gel elelectrophoresis Capillary electrophoresis/microfluid technology based automatic electrophoresis system Multiplex PCR Nested PCR SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) „Useful” polimorphisms for laboratory methods RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) eaffects one or more bases On restriction digestion site VNTR (variable number tandem repeat) repeat of 10-50 base units követően STR (short tandem repeat) 1-10 base unit repeat SSR (Simple Sequence Repeat) – microsatellite SNP (single nucleotide polymorphism) e.g. HLA (every 1000-1500. base In normal genome ) LINES (long interpersed nucleotide sequences) 6-8 kbp repeat – LINE-1 (L1) 15% of human genome, more than 500,000 unit SINES (short interspersed nucleotide sequences) 0,3 kbp 1,000,000 copy/genom (e.g Alu elements are restriction sites for AluI restriction enzyme) RFLP Real -Time (quantitative) PCR Real -Time (quantitative) PCR Molecular beacon Scorpion primer/probe Real -Time (quantitative) PCR primer FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) probe Signal ampléification methods (number of target sequence does NOt CHANGE !!) Hybrid Capture Assay (HPV, HBV, CMV) Branched DNA Amplification (bDNA) Fluorescens In Situ Hibridisation (FISH) Comparative Genomic Hybridisation (CGH) Sequencing – classic methods - Chemical (Maxam-Gilbert) Sequencing – classic methods Didezoxi chain termination (Sanger) Sequencing – Human Genome Project Hierarhische „ shotgun” Sequenzierung (NIH) Ganzes Genom „shotgun” Sequenzierung (Celera) Sequencing – automated (fluoreszent) sequencing MOLEKULAR-PATHOLOGIE METHODE DNS • Analyse des DNS-Sequenzes, Bestimmung des Genotyps : PCR, Hybridisationstechniken: Southern-blot, Untersuchung des Polymorphysmus: PCR • Bestimmung der Kopienummer eines Genes: FISH, kompetitive PCR, real-time PCR: HER-2, n-myc • Erweisung verschiedener Infkektionserreger: HPV, Chlamydia pn., Tuberkulose ... Neuroblastom - n-myc N-myc (2p24): Onkogen, Mitglied der myc Familie (L-myc, N-myc, S-myc, B-myc) (Meichle et al, 1992) helix-loop-helix Stuktur, Heterodimerization mit max ( kurzes Lebensalter: myc, stabiler max) Trankription Faktor Aktivation des myc Onkogen in mehreren menschlichen und experimentellen Tumoren Neuroblastom - n-myc n-myc Aktivation: charakteristisch für neuroektodermale Tumoren N-myc co-amplifizierte Genen: DDX1 ( in 400 kb ) NAG ( neuroblastoma amplified gene) Gen “ dosis “: zwei Allels im normalen Fall pathologische Umstande: bis zu mehrere hunderte Kopien. oder weniger als diese aber mehr als zwei Kopien des Gen Duplikation, Polyploidization ( segmental chromosome gain) n-myc Gen-Amplifikation - Schwab und Mitarbeiters: THE LANCET Oncology, 4:472, 2003 Neuroblastom - n-myc Gene-Amplifikation Mitotic Figures (+): Short Lasting Karyorrhectic Cells (++++): Staying Longer MYCN amplification in Neuroblastic Tumors Powerful Driving Force for: Preventing Cellular Differentiation Increasing Mitotic and Karyorrhectic Activities Neuroblastom n-myc 2ter Chromosom - alpha satellite probe die Ploidie zu bestimmen Die ErbB Familie und Liganden EGF TGF-α Amphiregulin β-cellulin HB-EGF Epiregulin No Known Ligands Heregulins HB-EGF Heregulins β-cellulin Extracellular Tyrosine Kinase Domain Intracellular ErbB-1 HER1 EGFR ErbB-2 HER2 neu ErbB-3 HER3 ErbB-4 HER4 EGFR2/HER2 Signal Transduktionsweg (physiologisch) Herceptin Disease-Free Survival Romond H et al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer NEJM 2005; 353:1673-1684 AC TH 87% 85% AC T 75% % 67% N Events AC T 1679 261 AC TH 1672 134 HR=0.48, 2P=3x10-12 Years From Randomization B31/N9831 HER2 Expression in Brustkrebs 3+ CB11 Amp HER2/CEP17 MOLEKULARE PATHOLOGIE HER-2 – mamma cc. HER2 Amplifizierung normal MOLEKULARE PATHOLOGIE FISH - Blasenkarzinom normal Urinblase Karzinom Sorlie et al., PNAS 98, 10869-10874, 2001 Hierarchical clustering of 78 primary breast cancers and 4 normal breast tissue Dendrogramma 5 different phenotypes Genetic subtypes of invasive ductal carcinoma of the breast • Normal breast-like • Luminal (A/B) ER+ • Basal type ER-/PgR-/HER2„Triple negative” BUT EGFR+ • Her2+ (amplified) breast cc. EGFR+ HER2 Expression in Brustkrebs 3+ CB11 Amp HER2/CEP17 MOLECULAR PATHOLOGY HER-2 - carcinoma of the breast HER2 amplification Healthy individual Krankheit-Frei Überleben Romond H et al. Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer NEJM 2005; 353:1673-1684 AC TH 87% 85% AC T 75% % 67% N Events AC T 1679 261 AC TH 1672 134 HR=0.48, 2P=3x10-12 Years From Randomization B31/N9831 Trastuzumab (Herceptin®) Wirkungsmechanismus HER2 receptor trastuzumab Trastuzumab: Gátolja a Her2-mediált jelátvitelt a Her2-pozitív daganatokban Megakadályozza a Her2 activációját az extracelluláris domén lehasadásának blokkolásával Aktiválja az antitest-függő sejtes citotoxicitást (ADCC) Magenkrebs Carl-McGrath et al: Gastric adenocarcinoma: epidemiology, pathology and pathogenesis (Cancer Therapy Vol 5, 877-894, 2007 ) Intestinaler Typ (Darml) Typ Magen Adenokarzinom Diffus Typ (Siegelringzellkarzinom) Her2 Auswertung Kriterien in Magenkrebs Sebészi minta – festődési mintázat Biopsziás minta – festődési mintázat Fokozott Her2 expresszió értékelés 0 Nincs specifikus festődés vagy bármilyen membránfestődés a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ában Nincs festődés illetve nincs membránfestődés egyetlen tumorsejtben sem Negatív 1+ Halvány ⁄ alig észlelhető, vagy részleges membránfestődés a tumorsejtek legalább 10%-ában Tumorsejtcsoportok halvány ⁄ alig észlelhető, vagy részleges membránfestődése, ezen sejtek százalékos arányától függetlenül Negatív Score 2+ 3+ Gyenge / közepes fokú Tumorsejtcsoportok gyenge ⁄ komplett, basolateralis v. közepes fokú, komplett, basolateralis membránfestődés a lateralis v. lateralis membrántumorsejtek legalább 10%festődése, ezen sejtek ában százalékos arányától függetlenül Tumorsejtcsoportok erős, Erős komplett, komplett, basolateralis v. basolateralis v. lateralis membránfestődés a lateralis membránfestődése, tumorsejtek legalább 10%ezen sejtek százalékos ában arányától függetlenül Kérdéses Pozitív Herceptin EU SmPC: http://www.ema.europa.eu/humandocs/PDFs/EPAR/ Herceptin/emea-combined-h278en.pdf. Images: http://www.herceptin.net/portal/eipf/pb/herceptin/trastuzumab/methodologies 4B5: 3+ H.T.: 2+ ! FISH: Ampl. SP3: 3+ Was ist die gezielte Therapie? • “kluge” Bombe versus “Teppich” Bombe. Protein Kinase: neue therpeutische Ziele • Es geben ung. 518 Protein-Kinase Hemmer in dem menschlichen Genom. • 90 Tirozin-Kinase • Hauptrolle in der intrazellularen Signaltransduktion. • Wachstum und Überleben der soliden Tumoren !! Manning G, et al. Science 2002;298:1912–34 Activated EGFR-TK A Pivotal Driver of Malignancy 1-6 R R RAS K K SOS pY pY GRB2 PI3-K RAF MEK pY PTEN STAT Akt MAPK Gene transcription Cell cycle progression PP Proliferation/ Maturation cyclin D1 myc Cyclin D1 DNA Jun Fos Myc Chemotherapy/ Radiotherapy resistance Survival (Anti-apoptosis) Angiogenesis Metastasis Adapted with permission from Baselga J. Signal. 2000;1:12-21. 1. Raymond E et al. Drugs. 2000;60(suppl 1):15-23. 2. Woodburn JR. Pharmacol Ther. 1999;82:241-250. 3. Wells A. Int J Biochem Cell Biol. 1999;31:637-643. 4. Hanahan D, Weinberg RA. Cell. 2000;100:57 5. Balaban N et al. Biochim Biophys Acta. 1996;1314:147-156. 6. Akimoto T et al. Clin Cancer Res. 1999;5:2884-2890. EGFR Expression in menschlichen Tumoren Kolon HNO Pancreas NSCLC Renal cell carcinoma Brust Ovarium Glioma Urinblase Karzinom 25-77% 95-100% 30-89% 40-80% 50-90% 14-91% (45%) 35-70% 40-63% 31-48% Cancer 103:2435, 2005 Pathologie assoziiert mit k-RAS • germline k-RAS Mutationene in – Noonan Syndrom – Cardio-facio-cutaneous Syndrom • somatische Mutationen – in Lungenkarzinom – in Brustkarzinom – in Pancreas Karzinom – in Magenkarzinom – in akute myeloblastische Leukemie Activating Ras Mutations GTP Exchange GTP Hydrolysis p21ras 12&13 59&61 ** *** ** GTP/GDP Binding Switch Region GTP GDP Structures from Sprang S.R., Annu. Rev. Biochem 1997. 66:639-78 * K-ras Mutation Analyse Exon 2 Kodon 12. PCRRFLP M + - M Molekular-genetische Selektion: Adenokarcinom (EGFRwt) EGFR-TKI rez (frequency?) 19 ex. mutants Importance ? Tímár et al. LAM,2007 MOLEKULARE PATHOLOGIE • Tumor Diagnostik • Diagnostik der Infektionskrankheiten • Diagnostik der genetischen Krankheiten Hybrid Capture Assay (HPV, HBV, CMV) DNS RNS Probe AK 2. AK MOLECULARIS PATHOLOGIA HPV Genotypisierung HPV und HNO KREBS in Ungarn Lokalization HPV (%) Zervix Penis Mundhöhle Kehlkopf Ösophagus Cardia Lunge 64.5 52.4 48.5 35.7 33.3 37.0 16.0 Szentirmay et al. Canc Met Rev 2005 HELICOBACTER PYLORI NACHWEIS Prot. K. Helico -FISH HELICOBACTER PYLORI NACHWEIS Prot. K, Chlarythromycin Rezistenz -FISH 3 years old female Heart TX : dilatative cardiomyopathy Clinical diagnosis: Pathology: Pneumonia Lung fibrosis CMV infection – sepsis Arrhytmia Respiratory insuffitiency Heart TX status post Lung fibrosis Pneumonia ARDS 49508/10 bjk. LUNG TX „Semi-sterile” samples : 1. Heart 2. Lung 3. Brain 4. Spleen 5. Liver 6. Adreanl gland 7. Kidney PK- positive control (sequenced verified CMV DNA) NK- negative control „ Non sterile” samples 8. Lung 9. Liver 10. Adrenal gland 11. Spleen 12. Kidney MOLEKULARE PATHOLOGIE • Tumor Diagnostik • Diagnostik der Infektionskrankheiten • Diagnostik der genetischen Krankheiten Danke für Ihre Aufmerksamkeit!
