Ultraschnelle Analytik von Vitamin D aus Serum - GIT

Ultraschnelle Analytik
von Vitamin D aus Serum
LC/MS/MS-Kopplung in der klinischen Chemie
Der folgende Artikel beschreibt eine schnelle und robuste Methode zur Bestimmung von 25-Hydroxy-Vitamin D2 sowie 25-Hydroxy-Vitamin D3 aus Serumproben. Die Zykluszeit beträgt nur 6 Minuten bei einem Detektionslimit (LOD) von
1 ng/ml für 25-Hydroxy-Vitamin D3 und 2 ng/ml für 25-Hydroxy-Vitamin D2.
Krankheiten wie Rachitis und Osteomalzie werden durch einen zu niedrigen Vitamin D Gehalt
im Blut über einen längeren Zeitraum hin ausgelöst. Weiterhin steht ein niedriger Vitamin D Gehalt des Blutes auch im Verdacht, eine Rolle bei
weiteren Erkrankungen zu spielen. Aus diesen
Gründen wird in vielen Ländern die Zufuhr von
Vitamin D mit der Nahrung propagiert und Lebensmitteln künstlich Vitamin D zugesetzt. Damit einhergehend hat die Anzahl der Vitamin D
Spiegelbestimmungen sehr stark zugenommen.
(1) Vitamin D wird in der Leber zu 25-HydroxyVitamin D metabolisiert. Die Halbwertszeit des
25-Hydroxy-Vitamin D in Blut beträgt ungefähr
drei Wochen. Da mit der Nahrung sowohl Vitamin D2 als auch Vitamin D3 aufgenommen wird,
ist es am Besten, beide Metaboliten zu bestimmen. Eine Herausforderung für den Analytiker ist
die Tatsache, dass 25-Hydroxy Vitamin D nicht
frei im Serum vorliegt, sondern in gebundener
Form. Die folgende Methode liefert schnell reproduzierbare und verlässliche Ergebnisse mit
einer geringen Schwankungsbreite.
Experimenteller Teil
Die Serumproben wurden durch Proteinfällung
mit Acetonitril/Methanol von störenden Mat-
Abb. 1: Chromatogramm einer Standardprobe auf einer Kinetex 2,6 µm C18 50 x 4,6 mm HPLC Säule
22 Dr. rer. nat. Dirk Hansen
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rixproteinen befreit und gebundenes Vitamin D
freigesetzt. Nach Zentrifugation wurde der
Überstand analysiert. Die Probe wurde auf einer 50 x 4,6 mm Kinetex 2,6 µm C18 Säule getrennt und auf einem API 4000 bzw. API 4000
QTRAP MS-Detektor im Multiple Reaction Monitoring (MRM) Modus detektiert. Der MRM
Modus ist wichtig, da sich das 25-Hydroxy
Vitamin D2 und 25-Hydroxy Vitamin D3 chromatographisch nicht trennen lassen, sich
allerdings in ihren MS-Fragmentierungen
(Mutter-Tochter-Ionenpaare) unterscheiden.
D6-25-Hydroxy-Vitamin D3 wurde als interner
Standard eingesetzt. Das Verhältnis der jeweiligen Peakintensitäten zum internen Standard
wurde zur Konzentrationsbestimmung genutzt.
Die Zykluszeit der LC-Methode lag bei nur 6
Minuten, was besonders interessant für Laboratorien mit hohem Probendurchsatz ist. Des
Weiteren war es möglich, mit der eingesetzten
Kinetex Säule D3-Cholesterol aus der Serummatrix außerhalb des Quantifizierungsfensters
für Vitamin D3 eluieren zu lassen (Abb. 1 und
Abb. 2). Diese Matrixverunreinigung führt bei
vielen Patientenproben zu Schwierigkeiten bei
der Quantifizierung und macht in diesen Fällen
erneute Messungen erforderlich.
Bedingungen für beide Abbildungen:
Laufmittel: A: 0,05 % Ameisensäure, B: 5 mM
Ammoniumacetat mit 0,1 % Ameisensäure in
Methanol
Gradient:
Zeit [s] 0
5
205 290 360 B %
8
8
100
100
8
Flussrate: 1 ml/min
Temperatur: 35 °C
Detektion: Massenspektrometer
Probe: 1. 25-Hydroxy-Vitamin D3 (25-OH
D3) MRM: 383,2 / 257,2
2. 25-Hydroxy-Vitamin D3-d6 (25-OH
D3-d6) MRM: 389,3 / 263,3
3. 25-Hydroxy-Vitamin D2 (25-OH D2) MRM:
395,2 / 209,3
Abb. 2: Chromatogramm einer Serumprobe auf einer Kinetex 2,6 µm C18 50 x 4,6 mm HPLC Säule
Zusammenfassung
Die vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle
und akkurate Bestimmung des Vitamin D Spiegels
in Serumproben zur präzisen Diagnose von Vitamin D Mangel. Proteinfällung hat sich als ausreichende Probenvorbereitungsmethode bewährt, die
sich auch leicht automatisieren lässt. Der Einsatz
der Kinetex Core-Shell Säule ermöglicht eine bessere Abtrennung einer Matrixverunreinigung bei
gleichzeitiger Verkürzung der Gesamtanalysenzeit.
Dies führt zu einem höheren Probendurchsatz bei
gleichzeitig höherer Zuverlässigkeit der Daten.
Literatur
[1] Dietary Supplement Fact Sheet: Vitamin D; Office of
Dietary Supplements, National Institute of Health
(http://ods.od.nih.gov/factsheets/vitamind.asp)
[2] Die komplette Applikationsmitteilung mit allen Daten:
[email protected]
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