PATHOZYMEâ SYPHILIS COMPETITION Ref OD117

PATHOZYME SYPHILIS COMPETITION
Ref
OD117/OD157
Kompetitiver Enzymimmunoassay (EIA) zur Detektion von
Gesamtantikörpern gegen Treponema pallidum in humanem
Serum Bei 2°C bis 8°C lagern. NICHT EINFRIEREN.
Nur zur In-vitro-Verwendung.
EINLEITUNG
BENÖTIGTE, NICHT BEREITGESTELLTE MATERIALIEN
PATHOZYME SYPHILIS COPMETITION ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay (EIA) zur Detektion von Gesamtantikörpern gegen
Treponema pallidum in humanem Serum.
T. pallidum gehört zur Bakterienordnung der Spirochaeten und
verursacht die sexuell übertragbare Erkrankung Syphilis. Trotz der
weltweiten Bedeutung als infektiöses Agens und des chronischen,
entkräftenden durch die Erkrankung ausgelösten Leidens ist über T.
pallidum nur begrenzte Information erhältlich. Der Organismus kann
nicht kontinuierlich in-vitro kultiviert werden, es ist kein Impfstoff
erhältlich und die Mechanismen der Pathogenese werden noch nicht
gut verstanden (1, 2).
Die Infektion mit T. pallidum ist systemisch und wird durch
Latenzperioden in den späten Erkrankungsstadien verkompliziert.
Syphilis kann jedoch relativ einfach geheilt werden und in den späten
Erkrankungsstadien kann eine Behandlung jeglichen permanenten
durch dieses Bakterium ausgelösten Schaden limitieren (1).
Syphilis kann auch kongenital erworben werden. Wenn der Fetus in
der frühen Schwangerschaft infiziert wird, tritt üblicherweise ein
spontaner Abort auf (1). Dies kann durch Diagnose und Behandlung
der Syphilis verhindert werden.
Alle oben erwähnten Eigenschaften dieser Erkrankung betonen die
Bedeutung serologischer Methoden in der Syphilis-Diagnose. Der
PATHOZYME SYPHILIS COPMETITION Kit ist ein hochsensitiver
und
-spezifischer EIA zum primären Screening von Antikörpern gegen T.
pallidum als Unterstützung zur Diagnose von Syphilis.
VORGESEHENE VERWENDUNG
PATHOZYME
SYPHILIS
COMPETITION
ist
ein
in-vitro
Diagnostiktest zum Screening auf Syphilis.
Der Test detektiert primär IgG und IgM und besitzt daher für alle
Erkrankungsstadien hohe Sensitivität (3). Da dieser Test keine
Serumverdünnung oder Reagenzienvorbereitung erfordert und nur
einen Waschschritt aufweist, ist er optimal geeignet für die
Automation um große Mengen an Proben zu testen.
Nur zum professionellen Gebrauch.
TESTPRINZIP
Gereinigtes Antigen von Treponema pallidum ist an die Oberfläche
von Mikrotiternäpfchen gebunden. Unverdünnte Testsera werden
angewendet gefolgt von anti-T.pallidum Antikörpern konjugiert mit
Meerrettich Peroxidase (HRP).
Spezifische Antikörper gegen T.pallidum in den Testseren und das
Konjugat binden an das Antigen in den Näpfchen. Ungebundenes
Material wird danach weggewaschen. Nach Zugabe des Substrates,
stabilisiertes 3,3’, 5,5’ Tetramethyl Benzidin (TMB), kommt es nur in
jenen Näpfchen zu einer Farbentwicklung, in denen Enzym
vorhanden ist. Dies zeigt die Abwesenheit von humanen anti-T.
pallidum Antikörpern an und ist daher ein negatives Ergebnis. Die
Enzymreaktion wird durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure
gestoppt, danach wird die Absorption bei 450 nm gemessen. Jedes
Ergebnis mit einer optischen Dichte (OD) die niedriger als der CutOff-Wert ist, wird als positiv betrachtet. Die Intensität der gelben
Färbung nach dem Stoppen der Reaktion ist der Konzentration an
T.pallidum Antikörpern in der Probe indirekt proportional.
Dieser Test wurde mit dem WHO Referenz Serum für
Serodiagnostiktests für Treponemainfektionen kalibriert – Ref 3 –
1980
Mikropipetten: 100µl, 200µl 1000µl und 5000µl
Einwegpipettenspitzen
Inkubator: Temperatur 37°C +/- 1°C
Saugpapier
Mikroplattenreader ausgestattet mit einem 450nm Filter
Diagrammpapier
Gründlich gereinigte Laborglasware
VORSICHTSMAßNAHMEN
PATHOZYME-SYPHILIS
COMPETITION
enthält
Material
menschlichen Ursprungs, welches mittels anerkannter Methoden auf
Einzelspenderlevel getestet und als negativ bestätigt wurden für
HCV-, HIV I- und HIV II-Antikörper und HBsAg. Da kein Test
vollständige Sicherheit bieten kann, dass Produkte humanen
Ursprungs keine infektiösen Agenzien übertragen, wird empfohlen,
dass die Reagenzien dieses Kits mit gebotener Vorsicht und
Aufmerksamkeit während Verwendung und Entsorgung gehandhabt
werden. Alle Reagenzien sollten dennoch als potentielle Biogefahren
bei Verwendung und Entsorgung behandelt werden. Nicht
einnehmen.
PATHOZYME-SYPHILIS COMPETITION Reagenzien enthalten
keine gefährlichen Substanzen gemäß Definition der gültigen UKChemikalienverordnungen
(Gefahreninformation
und
Lieferverpackung). Alle Reagenzien sollen dennoch als potentielle
Biogefahren bei Verwendung und Entsorgung behandelt werden. Die
endgültige Entsorgung muss der lokalen Gesetzgebung entsprechen.
PATHOZYME-SYPHILIS COMPETITION Stopplösung (REAGENT 8)
ist 0.2M Schwefelsäure und daher korrosiv. Vorsichtig handhaben.
Bei Kontakt gründlich unter fließendem Wasser spülen.
PATHOZYME-SYPHILIS COMPETITION Reagenzien enthalten
0,05% Proclin 300* als Konservierungsmittel welches bei Einnahme
toxisch sein kann. Bei Kontakt gründlich unter fließendem Wasser
spülen.
* Proclin 300 ist eine Handelsmarke von ROHM und HAAS Limited.
LAGERUNG
Die Reagenzien müssen bei Temperaturen zwischen 2°C und 8°C
gelagert werden.
Das Ablaufdatum ist der letzte Tag des Monats der auf der Flasche
und der Kit-Etikette angegeben ist. Der Kit funktioniert gemäß
Spezifizierung bis zum angegebenen Ablaufdatum wie vom
Produktionsdatum bestimmt und am Kit und den Komponenten
angegeben. Reagenzien nach dem Ablaufdatum nicht mehr
verwenden.
Es sollte vermieden werden, die Reagenzien übermäßigen
Temperaturen auszusetzen. Nicht direktem Sonnenlicht aussetzen.
KEINES DER REAGENZIEN EINFRIEREN da dies irreversiblen
Schaden verursacht.
PROBENSAMMLUNG UND VORBEREITUNG:
Dem Patienten eine Probe venösen Blutes entnehmen,
Gerinnselbildung und Zusammenziehen ermöglichen. Geronnene
Blutprobe zentrifugieren und klares Serum entnehmen. Es werden
frische Serumproben benötigt.
INHALT
Ref
OD117
Ref
OD157
Kein hämolysiertes, kontaminiertes oder lipämischens Serum zur
Testung verwenden, da dies die Ergebnisse nachteilig beeinflusst.
Das Serum kann bei 2°C bis 8°C für bis zu 48 Stunden vor der
Testung gelagert werden. Wenn eine längere Lagerung notwendig ist,
bei -20°C bis zu 1 Jahr lagern.
Aufgetaute Proben müssen vor der Testung gemischt werden.
Microtitre Plate
12 x 8
60 x 8
Abbrechbare Näpfchen beschichtet mit
spezifischen Antigenen in wiederverschließbarer
Folie mit Trocknungsmittel.
Control
Reagent
2
0.5 ml
2.5 ml
Negativkontrolle. Klare Lösung humanen Serums
negative für Antikörper gegen Treponema pallidum
Gebrauchsfertig. (Blau)
Control
L
Reagent
3
0.5 ml
2.5 ml
Schwache Positivkontrolle. Klare Lösung humanen
Serums mit niedrigem Level an Antikörpern gegen
Treponema pallidum . Gebrauchsfertig. (Grün)
Control
H
Reagent
4
0.5 ml
2.5 ml
Starke Positivkontrolle. Klare Lösung humanen
Serums mit hohem Level an Antikörpern gegen
Treponema pallidum. Gebrauchsfertig. (Rot)
Washbuf
20X
Reagent
5
50 ml
62.5ml x 4
Waschpufferkonzentrat: Trispuffer mit
Detergentien. (Farblos)
Conj
Reagent
6
15 ml
32.5 ml x 2
Anti- Treponema pallidum HRP Konjugat:
Anti-Treponema pallidum Antikörper konjugiert
mit Meerrettich Peroxidase. Gebrauchsfertig. (Purpur)
Subs
TMB
Reagent
7
15 ml
11 ml x 5
Substratlösung: 3,3’, 5,5’ Tetramethyl Benzidin in
Zitratpuffer. Gebrauchsfertig. (Farblos)
Soln
Stop
H2SO4
0.2M
15 ml
32.5 ml x 2
Reagent
8
Stopplösung: Schwefelsäure verdünnt in
gereinigtem Wassser . Gebrauchsfertig. (Farblos)
Gebrauchsanweisung and EIA Datenerfassungsblatt
1+1
1+5
Kein Natriumazid als Konservierungsmittel verwenden, da dies das
Peroxidase-Enzymsystem inhibieren kann.
Die Proben nicht wiederholt einfrieren und auftauen, da dies falsche
Ergebnisse bedingt.
REAGENZIENVORBEREITUNG
Alle Reagenzien sollen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20°C –
25°C) gebracht und behutsam gemischt werden. Kein Schäumen
verursachen.
Waschpuffer:
Den konzentrierten Waschpuffer (REAGENT 5) verdünnen durch
Verwendung von 1 Teil Waschpufferkonzentrat und 19 Teilen
destilliertes Wasser. Für jeden abbrechbaren 8-Näpfchen Streifen
25ml verdünnten Waschpuffer herstellen durch Zufügen von 1,25ml
konzentriertem Waschpuffer zu 23,75ml destilliertem Wasser. Vor
jedem Testlauf frischen verdünnten Waschpuffer herstellen. Extra
Waschpuffer für die automatischen Waschmaschinen wird
mitgeliefert.
Der Waschvorgang ist entscheidend für das Ergebnis dieses Tests.
Ungenügendes Waschen führt zu schwacher Präzision und falsch
erhöhten Absorptionsmesswerten.
VERWENDUNGSEINSCHRÄNKUNGEN
Die Verwendung anderer Proben als Serum wurde in diesem Test
nicht validiert.
Kein serologischer Hämagglutinationstest kann unterscheiden
zwischen Antikörpern, die durch eine T. pallidum Infektion
hervorgerufen werden, und Antikörpern, die durch eine Infektion mit
anderen pathogenen Treponemas, z. B. T. pertenue und T. carateum
hervorgerufen werden.
Es gibt kein Wiederverwendungsprotokoll für dieses Produkt. Es wird
dringend angeraten bei der Interpretation des Tests alle klinischen
Daten zu berücksichtigen. Die Diagnose sollte nicht allein auf Basis
von Ergebnissen eines klinischen Tests gestellt werden.
TESTPROZEDUR
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Alle Komponenten des Kits und Testserum vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur (20°C bis 25°C)
bringen.
2. Standards sollten bei jeder Charge Testserum mitgeführt werden. Die gewünschte Anzahl an
beschichteten Näpfchen in der Halterung befestigen. Die Position des Kondrollserums und des
Testserums auf dem bereitgestellten EIA Datenerfassungsblatt eintragen.
3. Nicht verwendete Streifen sollten im Folienbeutel mit Trocknungsmittel unter Verwendung des
Zipverschlusses wiederversiegelt werden bevor sie erneut auf 2°C bis 8°C gelagert werden.
4. DAS TESTSERUM UND DIE KONTROLLEN NICHT VERDÜNNEN: 25µl Testserum oder
Kontrollserum (REAGENT 2, 3 & 4) in die entsprechenden Näpfchen verteilen. Das Kontrollserum
sollte als letztes zugefügt werden, um eine präzise Interpretation der Ergebnisse zu gewährleisten.
Unmittelbar nachdem alle Test- und Kontrollseren zugefügt wurden 100µl anti-Treponema pallidum
HRP Konjugat (REAGENT 6) in jedes Näpfchen das Test- oder Kontrollserum enthält verteilen. Das
Konjugat darf nicht mehr als 30 Minuten nach der Zugabe des ersten Serums zugefügt werden. 5
Sekunden behutsam schütteln. Die Platte mit dem mitgelieferten Deckel bedecken und für 90 Minuten
auf feuchtes Saugpapier in einen 37°C Inkubator stellen.
5. Am Ende der Inkubationszeit den Inhalt der Näpfchen verwerfen indem der Platteninhalt in einen
Abfallkontainer für infektiöses Material geschnellt wird. Danach die Näpfchen gegen Saugpapier
klopfen. Sicherstellen, dass entsprechendes Desinfektionsmittel im Abfallkontainer für infektiöses
Material enthalten ist.
6. Händischs Waschen: Die Näpfchen mit einem Minimum von 300µl Waschpuffer pro Näpfchen füllen.
Den Inhalt der Platte in einen Abfallkontainer für infektiöses Material schnellen. Danach die Näpfchen
gegen Saugpapier klopfen. Die leeren Näpfchen 5 mal waschen inklusive 30 Sekunden Absaugen
nach jedem Waschschritt.
7. Die Näpfchen gegen Saugpapier oder ein Papierhandtuch klopfen um alle restlichen Wassertröpfchen
zu entfernen.
8. Maschineles Waschen: Sicherstellen, dass 300µl Waschpuffer pro Näpfchen verteilt werden und dass
der Abfallsammelflasche geeignetes Desinfektionsmittel zugefügt ist. Die leeren Näpfchen 5 mal
waschen inklusive 30 Sekunden Absaugen nach jedem Waschschritt.
9. 100µl Substrat (REAGENT 7) in jedes Näpfchen verteilen. Den Deckel wieder auf die Platte setzten,
wieder in den Inkubator stellen und im Dunkeln bei 37°C für 15 Minuten die Entwicklung der Reaktion
ermöglichen.
10. Die Reaktion durch Zugabe von 100µl Stopplösung (REAGENT 8) zu jedem Näpfchen beenden. Dies
wird eine Farbveränderung von blau nach gelb in jenen Näpfchen verursachen, die Enzym enthalten,
was die Abwesenheit von anti-Treponema pallidum Antikörpern anzeigt. Den Blindwert des
Plattenreaders mit Luft einstellen. Die Absorption jedes Näpfchens UNVERZÜGLICH nach Stoppen
der Reaktion bei 450nm messen.
Für jedes Test- und Kontrollserum den in den Näpfchen erhaltenen Durchschnittswert der Optischen Dichte
(OD) bestimmen.
Cut Off Level = (Durchnitts-OD-Wert der doppelten schwachen Positivkontrollen (REAGENT 3)) x 1.2.
Verdächtige Zone = OD Wert innerhalb oder gleich 10% unter dem Cut Off Level.
Testvalidierung: Die Durchnitts-OD der Negativkontrolle sollte größer als 0.8 sein, die schwache
Positivkontrolle (REAGENT 3) sollte größer als 0.35 sein, die starke Positivkontrolle (REAGENT 4) sollte
kleiner als 0.6 sein damit die Testergebnisse valide sind.
Negatives Ergebnis: Ein negatives Ergebnis sollte eine OD aufweisen die größer als der Cut Off Wert ist.
Verdächtig positives Ergebnis: Bei einem schwachen oder verdächtig positiven Ergebnis sollte die OD
innerhalb der verdächtigen Zone liegen.
Positives Ergebnis: Einem positives Ergebnis sollte eine OD unter der verdächtigen Zone aufweisen.
Wenn die Levels der Kontrollen oder Proben mit bekannten Levels nicht die erwarteten Ergebnisse liefern,
muss der Test als nicht gültig angesehen werden.
1.
EVALUIERUNGSDATEN
Mit Hauptmitbewerbern und In-Haus-Standards kalibriert.
An einem Europäischen Referenzzentrum wurden 120 Proben von Patienten mit verschiedenen Formen
von Syphilis oder unbehandelten Personen getestet. Die Kontrollgruppe von 345 Proben umfasste mögliche
kreuzreaktive Proben und bekannt negative Proben.
Ergebnisse Sensitivität: PATHOZYME-SYPHILIS COMPETITION 100%
Ergebnisse Spezifität: PATHOZYME-SYPHILIS COMPETITION 100%
Der Variationskoeffizient von PATHOZYME-SYPHILIS COMPETITION ist  10%.
REFERENZLISTE
(1) Cheesbrough, M (1991). Spirochaetes, Chlamydiae, Rickettsiae, Mycoplasma and Bartonella. In:
Medical laboratory manual for tropical countries. Volume II: Microbiology. Chap 45:312-318.
Butterworth-Heinemann Ltd, Linacre House, Jordan Hill, Oxford.
(2) Norris, S J & the T. PALLIDUM POLYPEPTIDE RESEARCH GROUP. (1993). Polypeptides of
Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunologic roles.
Microbiol. Rev.57(3). 750-779.
(3) Independent Evaluation Performed By Bristol Supra
Regionaltreponemal Serology UK. April 1996.
SCHNELLREFERENZTESTPROZEDUR
1.
Testserum und Kontrollen nicht verdünnen.
2.
25l des Testserums oder Kontrollserums in Arbeitskonzentration (REAGENTS 2, 3 & 4) in jedes
Näpfchen verteilen gefolgt von 100l anti-Treponema pallidum HRP Konjugat (REAGENT 6). Das
Konjugat darf nicht mehr als 30 Minuten nach Zugabe der ersten Seren zugefügt werden. 5
Sekunden behutsam schütteln.
3.
90 Minuten bei 37oC inkubieren.
4.
Inhalt der Näpfchen verwerfen und fünf mal waschen inklusive 30 Sekunden Absaugen nach jedem
Waschschritt.
Keine beschädigten oder kontaminierten Kitkomponenten verwenden.
5.
100l Substratlösung (REAGENT 7) in jedes Näpfchen verteilen.
Für jede Probe eine eigene Einwegspitze verwenden um Kreuzkontamination zu vermeiden.
6.
Im Dunkeln 15 Minutes bei 37 C inkubieren.
Obwohl nicht erforderlich, wird eine Verdoppelung aller Standards und Proben empfohlen.
7.
100l Stopplösung (REAGENT 8) in jedes Näpfchen verteilen.
Proben und Standards sollten zur selben Zeit getestet werden, um die Testbedingungen gleich zu
bewahren.
8.
OD mittels EIA Reader unter Verwendung eines 450nm Filters ermitteln.
9.
Interpretation der Ergebnisse wie im Abschnitt Interpretation der Ergebnisse beschrieben.
ERFASSUNG DER ERGEBNISSE
Der Plattenreader sollte auf eine Wellenlänge von 450nm und einen Blindwert mit Luft eingestellt sein. Bei
der Bestimmung der Absorption jeder Probe und Kontrolle ist es wünschenswert keinen Referenzfilter zu
verwenden, da dies die erwarteten Werte der Kontrollen verändern würde.
FINDEN UND BESEITIGEN VON STÖRUNGEN ODER PROBLEMEN:
Zur Verwendung durch Personen mit zumindest einem Minimum an grundlegender Laborausbildung.
Es wird empfohlen, dass bei manuellem Pipettieren nicht mehr als 32 Näpfchen bei jedem Testlauf
verwendet werden, da das Pipettieren aller Standards und Proben innerhalb von 3 Minuten abgeschlossen
sein sollte. Eine vollständige 96-Näpfchen Platte kann verwendet werden, wenn automatisches Pipettieren
verfügbar ist.
o
8050 ISSUE 9 Revised May 2015
 Omega Diagnostics Ltd., 2015. GERMAN.
Alle Reagenzien sofort nach Verwendung wieder verschließen.
Wiederholtes Pipettieren aus Stockreagenzien vermeiden, da dies voraussichtlich Kontamination
verursacht.
Reagenzien oder antikörperbeschichtete Streifen aus verschiedenen Kits nicht mischen. Beim Verteilen
sollte darauf geachtet werden, die Oberfläche der Näpfchen nicht zu berühren.
Reagenzien nicht an den Seiten der Näpfchen herunter rinnen lassen. Vor Beginn der Analyse alle
Reagenzien auf Raumtemperatur (20°C bis 25°C) bringen. Die Reagenzien behutsam mischen durch
Umdrehen oder Aufwirbeln.
Nach Start des Tests dürfen die Näpfchen während des Tests nicht austrocknen.
Die Substratlösung nicht kontaminieren, da dies den Kit unbrauchbar macht.
Präzision und Genauigkeit der während der Prozedur verwendeten Laborausrüstung prüfen, um die
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
Nicht verwendete Streifen sollten im Folienbeutel mit Trocknungsmittel unter Verwendung des
Zipverschlusses wiederversiegelt werden bevor sie erneut auf 2°C bis 8°C gelagert werden.
OMEGA DIAGNOSTICS LTD
Omega House, Hillfoots Business Village
Alva, FK12 5DQ, Scotland, United Kingdom
[email protected]
www.omegadiagnostics.com
AN ISO 9001 & 13485 CERTIFIED COMPANY