Vortrag Lassacher H. pylori Frühstück

Molekularbiologischer Nachweis
und Resistenzbestimmung von
Helicobacter pylori aus
Magenbiopsien
Dr. rer. nat. Anita Lassacher
Institut für Krankenhaushygiene
und Mikrobiologie,
Graz
Identifizierung und Nachweis von
Antibiotika--Resistenzen
Antibiotika
mittels
GenoType® HelicoDR
(Hain lifescience)
AB--Resistenz
AB
Sequenzspezifischer Nachweis und
Identifizierung möglicher Resistenzen
gegen Clarithromycin und Fluorochinolone
(Gyrasehemmer)
Bild: medical picture
AB--Resistenz
AB
Mutationen in bestimmten Bereichen des
Helicobactergenoms führen zur
Resistenz gegen Fluorochinolone oder
Clarithromycin:
Codons 87, 91 des GyraseGyrase-Gens, sowie
im Bereich der 23 s rRNA (Pos:2146 + 2147)
Prinzip
Multiplex-Amplifikation dieser
MultiplexSequenzbereiche mit
biotin--markierten
biotin
Primern (35 Zyklen)
Prinzip
Detektion Nachweis über
Hybridisierung
Membrangebundene, spezifische
Sonden für jeweilige Sequenzvarianten
(Codon 87, Codon 91,….)
Hybridisierung
Amplifikate denaturieren (SS(SS-DNA)
SSSS-Amplifikate auf Nitrozellulose
Nitrozellulose--Streifen
Hybridisierungslösung komplementäre
Amplifikate hybridisieren an
zugehörige Sonde
Versch. Waschschritte
Enzymatische Farbreaktion
Qualitätssicherung
Zur Überprüfung der korrekten TestdurchTestdurchführung 4 Kontrollzonen/Probe:
Amplifikationskontrollzone
Locuskontrollzonen Gyrase
Locuskontrollzonen 23 s rRNA
Konjugatkontrollzone
Auswertung
1) Kontrollzonen vorhanden?
2) HPHP-spezifische Bande (Helicobacter
pylori) vorhanden?
3) Wenn ja: Locuskontrollen vorhanden?
AB-Resistenz
ABHelicobacter pylori
Sichtbarmachung der Amplifikate durch
enzymatische Farbreaktion:
Bild: Hain lifescience
Grenzen der
molekularbiologischen Methode
Für KulturKultur- und Biopsieproben validiert
Mutationen in anderen Sequenzbereichen
werden nicht detektiert
Bei DNADNA-Nachweisen kann die
Aminosäuresequenz nicht überprüft werden
Gründe für die Einführung der
molekularbiologischen Nachweismethode (PCR)
Häufige erfolglose Versuche H. pylori in
der Kultur nachzuweisen (vor allem bei
mehrmals therapierten Patienten)
hohe Resistenzraten
bei schwer therapierbaren Fällen eine
gezielte antimikrobielle Therapie zu
gewährleisten und weitere
Resistenzentwicklungen zu vermindern
der NRZ Empfehlung entsprechend
Transportmedium:
Portagerm pylori
(Fa. BioBio-Merieux)
Kultur
Pylori Agar (Fa. BioBio-Merieux)
Inkubation: mikroaerophil 36+/36+/-1°C, 72h
bis 10 Tage
Antibiogramm:
(Amoxicillin, Clarithromycin, Metronidazol,
Tetracyclin, Rifampicin, Levofloxacin)
mittels EE-Test Streifen
Müller--Hinton Agar mit 5% Schafblut
Müller
Inkubation: mikroaerophil 36+/36+/-1°C 72h
bis 10 Tage
PCR : DNADNA-Säulenextraktion (Qiagen)
PCR: Geno TypeType-HelicoDR (Fa. Hain lifescience)
automatisierte Hybridisierung: GTGT-Blot
Nachweis und Resistenzbestimmung von
H.pylori mittels Kultur und PCR
Gesamtzahl: 197 Magenbiopsien
Proben stammen von Patienten im Alter 17-86 Jahre, welche 1 (bis 3) mal gegen H. pylori
therapiert wurden, mind. 1mal mit der Standardkombination Amoxicillin+Clarithromycin und trotz der
Therapie unter typischer H. pylori-Infektionssymptomatik litten. (Daten aus Fragebögen einsendender
Ärzte)
Ergebnisse stimmen überein: 128
beide positiv 48
Resistenzbestimmungen möglich:
Kultur: 23/48  PCR: 117/117
beide negativ 80
KEINE DIFFERENZEN in den ResistenzResistenz-Ergebnissen !
Ergebnisse stimmen nicht überein
überein:: 69
Kultur negativ - PCR positiv
Diagnostik Kultur  PCR
Vor-- und Nachteile
Vor
Kultur:
+ Goldstandard – die kulturelle Untersuchung ist in der Lage lebende
Erreger nachzuweisen
+ Resistenzbestimmung für mehrere Antibiotika möglich
- H.pylori - nicht immer anzüchtbar ((- geringe Keimzahl? - Vitalität des Keimes
durch Antibiotika/PPI unterdrückt? - Kontamination des Untersuchungsmaterials)
- zeitintensiv (Kultur + Antibiogramm 7 – 10 Tage)
PCR:
+ hohe Sensitivität
+ Dauer - Nachweis + Resistenztestung ca. 6 Stunden
- Vitalität des Keimes?
- Kosten
Hinweis für Entnahme und Transport
des Untersuchungsmaterials
Magenbiopsie in
geeignetem
Transportmedium
(Portagerm pylori Fa. Bio-Merieux;
Art.Nr. 42041) umgehend ins
Labor transportieren (max.
24 Stunden)
ausgefüllter
Begleitschein (WICHTIG!!!
Patient vortherapiert? wenn
ja womit? Datum der
letzten Therapie)
Erfolglose Eradikationen belasten Patienten und finanzielle
Ressourcen und sind häufig mit weiteren Resistenzentwicklungen
und gelegentlich mit klinischen Komplikationen assoziiert.
Deshalb ist eine der Schwerpunktaufgaben eines mikrobiologischen
Labors die kontinuierliche Resistenzdatenerhebung und daraus
abgeleitete gezielte Therapieempfehlung.
Danke für Ihre Aufmerksamkeit
Hinweis für Helicobacter pylori-Diagnostik (am IKM)
Untersuchungsspektrum:
•Kultur und Antibiogramm: Kultur und
Resistenzbestimmung auf: Amoxicillin, Clarithromycin,
Metronidazol, Tetracyclin, Rifampicin und Chinolone)
(grüner Begleitschein)
Material: Magenbiopsie
•PCR: H.pylori-DNA Nachweis und Resistenzbestimmung
auf Clarithromycin und Chinolone (gelber Begleitschein)
Material: Magenbiopsie
•H.pylori-Antigen Nachweis (roter Begleitschein)
Material: Stuhl