Chromatographie von Penicillin-G.Natriumsalz / Antibiotikatests

Versuch 8: Chromatographie von Penicillin-G-Natriumsalz und Antiobiotika-Tests
Chromatographie von Penicillin-G.Natriumsalz /
Antibiotikatests
A. Allgemeines über Antibiotika
Bei Antibiotika handelt es sich um Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen, die
dazu dienen ihnen eine Nische ohne „Fressfeinde“ zu schaffen. Außerdem werden
Antibiotika heutzutage synthetisch bzw. halbsynthetisch hergestellt und werden
produziert, um medizinisch gegen bakterielle Infektionen zu wirken.
Die Antibiotika wirken entweder wachstumshemmend (bakteriostatisch) oder
abtötend (bakterizid) auf die entsprechenden Mikroorganismen (vgl. Meyers
Taschenlexikon).
Die Wirkung kann spezifisch auf eine Bakteriengruppe gerichtet sein oder gegen eine
Vielzahl von Bakterien eingesetzt werden (Breitband-Antibiotika). Man unterscheidet
zudem verschiedene Klassen von Antibiotika, die im Folgenden kurz aufgeführt
werden sollen.
Unter die Klasse der β-Lactame fallen unter anderem die Penicilline, die durch A.
Fleming 1928 als erstes Antibiotikum entdeckt wurden und 1940 von H. Florey
erstmals isoliert werden konnten. Lactame, zum Beispiel das Penicillin wird durch
Penicillium notatum produziert. Lactame sind zyklische Amide, wobei der griechische
Buchstabe die Ringgröße kennzeichnet (vgl. www.cdch.de).
Beta-Lactam-Antibiotika, unter die neben den Penicillinen
auch
die
Cephalosporine
fallen,
hemmen
die
Zellwandsynthese wachsender Bakterien. Cephalosporin
C, zum Beispiel, wird durch Cephalosporium acremonium
produziert. Sie beeinträchtigen jedoch hauptsächlich nur
Abb. 1: Penicillin G
das Wachstum von grampositiven Bakterien, da die
Lipopolysaccharidschicht von gramnegativen Bakterien für das Penicillin nicht
permeabel ist. Das Penicillin verhindert die Quervernetzung der Peptidoglykanketten
des Mureins. Es bindet irreversibel an die D-Alanintranspeptidase und stört somit
ihre Funktionalität und verhindert eine Neusynthese des Mureins. Es kommt somit zu
keiner Teilung.
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Manche Bakterien sind jedoch in der Lage, die Wirkungsweise von Lactamen durch
so genannte Lactamasen zu inhibieren. Die β-Lactamase spaltet den Lactamring der
beta-Lactam-Antibiotika, sodass diese ihre hohe Affinität zur Transpeptidase und
somit ihre Funktionalität verlieren.
Eine weiter Antibiotikaklasse sind
die
Tetracycline,
deren
Produzenten meist StreptomycesArten
sind,
grampositive
Bakterien.
wirken
und
Als
2:
Struktur
–negative
Beispiel
Breitbandantibiotika
Abb.
gegen
sind
dieser
das
(vgl. Tetracyclin und das Doxycyclin zu
Tetracycline
nennen. Tetracycline wirken auf die
www.wikipedia.de)
Biosynthese von Proteinen. Sie verhindern das Anlagern der Aminoacyl-t-RNA an die
Akzeptorstelle der 30S Untereinheit.
Erythromycin ist ein Vertreter einer weiteren Gruppe von Antibiotika, der Makrolide
und
wird
produziert.
durch
Die
Streptomyces-Arten
Makrolide
wirken
genauso wie die Tetracycline auf die
Biosynthese von Proteinen. Allerdings
wirken sie auf die 50S Untereinheit der
Ribosomen. Sie wirken gleichermaßen
auf
grampositive
wie
auch
auf
gramnegative Bakterien.
Als letzte Klasse von Antibiotika seien hier die Aminoglykoside genannt. Als
bekannteste Vertreter sind Streptomycin
und
Neomycin
Aminoglykoside
zu
nennen.
bestehen
Die
aus
Abb.
3:
Erythromycin
als
Beispiel
von
Makroliden
Aminozuckern und wirken auf gramnegative Bakterien, jedoch nicht auf gegen
gramnegative Anaerobier und Kokken. Sie verursachen durch die Wirkung auf die
30S Untereinheit der Ribosomen einen Ablesefehler und stören somit die Synthese
von Proteinen. Deswegen sind die meisten Aminoglykoside bakterizid. Beim Einsatz
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im menschlichen Körper müssen die Aminoglykoside intravenös verabreicht werden,
da sie nicht zellgängig sind. Außerdem werden sie schnell über die Niere
ausgeschieden.
Einige
Bakterien
können
durch
Spontanmutationen gegen Antibiotika resistent
werden.
Wie
bei
den
Lactamen
schon
angesprochen worden ist, können Bakterien
Abb. 4: Neomycin
Antibiotikum
abzubauen
zum
oder
den
Beispiel
Antibiotika
Enzyme
keine
bilden,
um
Angriffsflächen
das
bieten
(Gramnegative Bakterien). Andere wiederum sind in der Lage das Antibiotikum aktiv
aus der Zelle zu pumpen. Außerdem wird durch Änderung der Zellstruktur (z.B.
Ribosomen) die Wirkung der Antibiotika aufgehoben.
B. Durchgeführte Versuche
1. Chromatographie von Penicillin-G-Natrium-Salz
1.1. Einleitung
Die Chromatographie ist ein Analyseverfahren zur Auftrennung von Stoffgemischen.
Die Chromatographie hat sich im Laufe der Jahre soweit entwickelt, dass
verschiedene
Chromatographien
entstanden
sind.
So
gibt
es
die
Dünnschichtchromatographie (DC), Papierchromatographie (PC), sowie die in
modernen Labors meist angewandte
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
(HPLC). Das Prinzip der DC liegt bei der Adsorption und der Verteilung der zu
trennenden Stoffe. In diesem Versuch wird die Adsorption vernachlässigt. Es soll hier
auch keine Trennung eines Stoffgemisches durchgeführt werden, sondern eine
Charakterisierung von Penicillin erfolgen. Anhand der DC kann die Polarität unter
Verwendung von verschiedenen Laufmitteln, die polare oder eher apolare
Eigenschaften aufweisen, bestimmt werden. Als Laufmittel wird Wasser, Methanol,
Ethylacetat und Trichlormethan (Chloroform) eingesetzt. Als Maß für die Polarität der
zu untersuchenden Substanzen dienen die sich aus den Laufstrecken ergebenden Rf
Werte. Zur Ermittlung der Rf Werte werden die Chromatographien auf Platten mit
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Indikatorbakterien gelegt, deren Wachstum durch Penicillin gehemmt wird. Nach
einem Tag Inkubation bei 37° Celsius entstehen im Bereich des Penicillins
Hemmhöfe. Somit lassen sich die Rf-Werte anhand der Formel
R f − Wert =
( Entfernung Mittelpunkt der Hemmhöfe vom Startpunkt )
( Entfernung Laufmittelfront vom Startpunkt )
berechnen.
1.2. Material und Methode
Der Versuch wurde wie im Skript beschrieben durchgeführt.
1.3. Ergebnisse
Anhand der Ergebnisse in Abbildung 5 und der Formel zur Berechnung der Rf-Werte
konnten diese nach Ermittlung der Entfernungen berechnet werden.
Bei dem Wasserchromatogramm hat sich der Teststreifen an dem Rand festgesaugt.
Man erkennt aber trotzdem, dass das Penicillin bis zur markierten Stelle gelaufen ist.
Abb. 5: Ergebnisse der Chromatographie. Die grauen Zonen markieren den nicht-bewachsenen
Bereich der Platte. Die schwarzen Punkte symbolisieren die Mittelpunkte der Hemmhöfe.
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Tab. 1: Berechnete Rf-Werte
Mittelpunkt der
Laufmittelfront
Hemmhöfe
Berechneter
Rf-Wert
Wasser
8cm
8,5cm
0,94
Methanol
6,5cm
8,5cm
0,76
Ethylacetat
0,2cm
8,5cm
0,024
Chloroform
1,1cm
8,5cm
0,12
Beispiel der Berechnung:
R f − Wert =
( Entfernung Mittelpunkt der Hemmhöfe vom Startpunkt )
( Entfernung Laufmittelfront vom Startpunkt )
R f − Wert =
(8cm)
= 0,94
(8,5cm)
1.4. Diskussion
Die Ergebnisse zeigen auf, dass es sich bei Penicillin um eine polare Substanz
handeln muss, da die Rf-Werte bei Wasser und Methanol als Laufmittel am größten
sind. Je größer die Rf-Werte sind, desto besser ist die Fähigkeit des Laufmittels die
Substanz zu transportieren. Die Substanz wird nur transportiert, wenn sie die
gleichen polaren Eigenschaften wie die Laufmittel aufweisen. Penicillin wurde als
Penicillin-Natrium-Salz eingesetzt und dissoziert zu positiven Natriumionen und dem
negativ geladenen Penicillinion. Zusätzlich gibt die polarisierte Ketogruppe dem
Penicillin einen polaren Charakter.
Deswegen transportieren die apolaren Substanzen Ethylacetat und Chloroform das
polare Penicillin kaum (kleine Rf-Werte).
2. Antibiotika-Test – Der Lochtest
2.1. Einleitung
Der Lochtest ist ein Test, bei dem die Empfindlichkeit von Mikroorganismen (MO) auf
Antibiotika untersucht werden kann. In das zentral gestanzte Loch wird ein Tropfen
Penicillin (170E/ml) bzw. Wasser als Kontrolle gegeben. Von diesem Loch aus
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werden verschiedene Mikroorganismen strahlenförmig zum Rand der Schale
ausgestrichen. Nach einer Übernachtinkubation kann man erkennen, wie hoch die
Wirksamkeit des Antibiotikums auf die MO war. Je näher der Organismus in Richtung
des Loches gewachsen ist, desto unempfindlicher ist er gegenüber Penicillin.
2.2. Material und Methode
Die detaillierte Beschreibung des Versuchs ist im Skript zu finden.
In dem Versuch wurde anstatt Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri
eingesetzt. Außerdem wird die Ausgangslösung des Penicillins in der Konzentration
1700 E/ml eingesetzt.
2.3. Ergebnisse
Abb. 6: Ergebnisse des Lochtests (schematische Darstellung), links: Kontrolle, rechts: Testplatte
Bei der Kontrollplatte ist ein gleichförmiges Wachstum der Organismen aufgetreten.
Das Wachstum erfolgt bis an das ausgestanzte und mit Wasser gefüllte Loch. Bei
der Testplatte sind nicht alle Organismen bis an das Loch gewachsen. Nur E. coli
und Pseudomonas stutzeri zeigen ein ungehemmtes Wachstum. Der Bakterienrasen
von Micrococcus luteus und Staphylococcus carnosus ist auf den Plattenrand
beschränkt (siehe Abbildung 6 rechts).
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2.4. Diskussion
Wasser hat keinen hemmenden Einfluss auf die Bakterien und dient somit als
Kontrolle. Die Testplatte zeigt dagegen ein anderes Bild. Das Penicillin hemmt das
Wachstum der grampositiven Organismen Micrococcus luteus und Staphylococcen
carnosus. Die gramnegativen Bakterien E. coli und P. stutzeri zeigen keine
Wachstumshemmung.
Penicillin hemmt die Transpeptidase, die zur Verknüpfung der Peptidoglykanketten
des Mureins verantwortlich ist. Somit wird das Zellwachstum durch eine Inhibierung
der Zellwandsynthese gehemmt. Dies hat auf gramnegative Bakterien keinen
Einfluß, da das Penicillin nicht durch die äußere Zellwand der Bakterien diffundieren
kann. Die Bakterien zeigen ein unverändertes Wachstum.
Nimmt die Konzentration zum Plattenrand wieder ab, kommt es wieder zum
Wachstum der grampositiven Organismen.
3. Antibiotika-Test – Gradientenplatte
3.1. Einleitung
Bei diesem Test wird Agar ohne Antibiotikum in eine schräg gestellte Petrischale
gegossen und nach dem Erstarren ein antibiotikahaltiger Agar in die nun horizontal
gestellte Petrischale gegossen. Somit entsteht ein Antibiotikagradient. Der
antibiotikahaltige Agar wird in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt. Die
Ausgangslösung des Penicillins beträgt 1700E/ml. Diese Lösung wird in 10er Stufen
bis zur Verdünnungstufe 10-2 verdünnt.
Auf den Gradientenplatten wird eine Staphylcoccenkultur ausplattiert und 24 Stunden
bei 37°C inkubiert.
Anhand der sich gebildeten Kolonien kann eine Aussage über die Wirksamkeit des
Antibiotikums auf die Staphylococcen getroffen werden.
3.2. Material und Methode
siehe Skript
3.3. Ergebnisse
Die Platten des Gradiententests mit dem antibiotikahaltigen Agar in den
Verdünnungsstufen bis 10-1 zeigen auf der gesamten Platte kein Wachstum.
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Abb.
8:
Platten
antibiotikahaltigen
mit
Agar
in
dem
der
Platten
antibiotikahaltigen
mit
Agar
dem
in
der
Verdünnungsstufe 10
Verdünnungsstufe 10
10:
9:
-1
0
Abb.
Abb.
Ergebnisse
der
Gradientenplatte
der
-2
Verdünnungsstufe 10 . Der Pfeil zeigt den AntibiotikaGradienten an.
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Abb. 11: Kontroll-Platte
Die Platte in Abbildung 10 zeigt ein Wachstum nur auf der Seite, auf der die
Antibiotika-Konzentration niedriger ist. Auffällig sind die vereinzelten Kolonien, die
neben dem dichten Bakterienrasen auch noch bei höherer Antibiotika-Konzentration
wachsen. In Abbildung 11 ist die Kontrollplatte gezeigt. Die gesamte Platte ist mit
Bakterien überwachsen.
3.4. Diskussion
Bei den Gradientenplatten, bei denen Agar mit den Verdünnungsstufen 100 und 10-1
eingesetzt wurde, tritt wegen der zu hohen Konzentration des Antibiotikums kein
Wachstum auf.
Bei der 10-2 Verdünnung tritt nur bei niedriger Konzentration ein Wachstum auf, da
dort die Synthese der Zellwand durch Penicillin nicht beeinflusst wird (siehe auch
2.4.).
Wird die Konzentration jedoch mit dem Gradienten höher, tritt keine Vermehrung der
Zellen auf. Nur einzelne Kolonien entstehen bis zur Mitte der Platte. Man kann
vermuten, dass es sich bei den Kolonien um Spontanmutationen handelt, die eine
Resistenz gegen Penicillin gebildet haben. Eine weitere Möglichkeit wäre eine
Kontamination mit gramnegativen Organismen.
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4. Literatur
Madigan, M.: Brock. Mikrobiologie, Heidelberg, 2001
Meyers Grosses Taschenlexikon, Band 2, 5. überarbeitete Auflage, B. I.
Taschenbuchverlag, Mannheim, 1995
Schlegel, Hans G.: „Allgemeine Mikrobiologie“, 7. überarbeitete Auflage, Thieme
Verlag, Stuttgart, 1992
Skript „Übungen in Mikrobiologie F1-Teil2a“
Internetquellen:
www.cdch.de/organische-chemie/lactame.html
www.wikipedia.de
www.pharmazie.uni-wuerzburg.de
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