A. Cachot Zytotoxische CD4 T-Lymphozyten: Neuer Kandidat für die

A. Cachot
Zytotoxische CD4 T-Lymphozyten: Neuer Kandidat für die menschliche
Krebsimmuntherapie
Das Projekt hat zum Ziel, unsere Kenntnisse über die Biologie der CD4 TLymphozyten zu festigen und zu erweitern, indem tumorantigenspezifische CD4 TLymphozyten umfassend charakterisiert werden. Ein besonderes Augenmerk gilt
einer bisher wenig beachteten Population: den zytotoxischen CD4 T-Lymphozyten.
Diese Zellen haben sich als wichtige Elemente von physiologischen oder
behandlungsinduzierten Tumorantworten erwiesen. Wir beabsichtigen, auf der
Ebene des Antigens von Interesse Schlüsselfaktoren, die Induktion,
Differenzierung und Plastizität von zytotoxischen CD4 T-Lymphozyten
beeinflussen, sowie spezifische Marker, die deren phänotypisches Profil definieren,
zu untersuchen.
Bei der Erkennung eines Antigens erfahren naive CD4 T-Zellen eine Differenzierung
und erwerben ein definiertes Zellschicksal, das von der Mikroumgebung beeinflusst
wird. Jede CD4 T-Zelluntergruppe zeichnet sich durch die Expression spezifischer
Transkriptionsfaktoren und Zelloberflächenmarker und durch die Ausschüttung
verschiedener Zytokine aus. Diese verschiedenen Untergruppen weisen eine
erhebliche Heterogenität und Plastizität auf. Das Vorkommen verschiedener CD4 TZellpopulationen wird mit klinischen Resultaten bei Krebspatienten assoziiert, was
eine wichtige Rolle der CD4 T-Zellen im Erhalt einer pro- oder antitumoralen
Umgebung im Tumorbett nahelegt. Allerdings zirkulieren nur wenige
tumorspezifische CD4 T-Lymphozyten, weshalb ihre Charakterisierung auf der
Antigenebene bisher nur sehr begrenzt erfolgte. Neuartige Strategien zum direkten
ex vivo Nachweis von spezifischen CD4 T-Zellen, darunter der Gebrauch von Klasse
II MHC -Peptidmultimeren, werden gegenwärtig entwickelt. Die Herstellung von
pMHC-Klasse II Multimeren ist jedoch technisch schwieriger als die Produktion von
pMHC-Klasse I Multimeren. Aus diesem Grund ist, im Vergleich zur Erforschung von
CD8 T-Lymphozyten, die Charakterisierung von tumorantigenspezifischen CD4 TLymphozyten im Rückstand.
Phänotypische und funktionale Charakterisierung zytotoxischer CD4 TLymphozyten, die für menschliche Tumorantigene spezifisch sind
Wie bereits erwähnt, kommen tumorantigenspezifische CD4 T-Zellen selten vor. Aus
diesem Grund haben wir in einem ersten Schritt verschiedene Methoden zur
Induktion und Charakterisierung von zytotoxischen CD4 T-Lymphozyten entwickelt.
Diese Methoden wenden wir an den, mit Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB)
behandelten, CD4 T-Zellpopulationen von gesunden Spendern an. Ebenso haben wir
Tumorlinien hergestellt, die mit dem CIITA-Transkriptionsfaktor transduziert wurden.
CIITA ist für die Klasse II MHC-Expression an der Zelloberfläche verantwortlich. So
konnten wir die Expressionsvariabilität des Klasse II MHCs auf Zielzellen, die für
lytische Versuche mit tumorantigenspezifischen CD4 T-Zellen benutzt werden,
ausschalten.
Mithilfe der Klasse II MHC-Peptidmultimertechnologie konnten wir
tumorantigenspezifische CD4 T-Zellen in Blutproben von Patienten identifizieren,
sowohl direkt ex vivo wie auch nach einer in vitro Expansion. Da wir nun in der Lage
sind, spezifische CD4 T-Zellen aufzuspüren, haben wir tumorspezifische CD4 TZellen isoliert und in vitro klonal vermehrt. Wir haben so ein Panel von CD4 TLymphozyten, die für tumorassoziierte Antigene (Melan-A, NY-ESO-1 und MAGE-A3)
spezifisch sind, generiert. Die vollständige Charakterisierung dieser Zellen wurde wie
folgt durchgeführt:
(i)
Wir haben Tests entwickelt, die es ermöglichen, den Phänotyp der Zellen
zu identifizieren, indem ihre Polarisierung (zytotoxisch vs. auxiliär),
Differenzierung (Tcm, Tem, Tnaiv, etc.), ihre Aktivierung (CRTAM, PD-1,
KLRG1, CX3CR1, etc.) und die Expression spezifischer
Transkriptionsfaktoren EOMES, Tbet, GATA3, etc.) definiert werden.
(ii)
Parallel dazu haben wir die funktionale Charakterisierung der
verschiedenen Klone durchgeführt, basierend entweder auf deren
zytotoxischen Fähigkeit gegenüber Zielzellen, die gepaarte HLAs besitzen,
oder auf der Ausschüttung von Zytokinen bei einer spezifischen
Stimulation mit Peptiden.
(iii)
Schliesslich wird die Sequenzierung der Alpha- und Beta-Ketten des
TCRs von Klonen, die als vielversprechende Kandidaten für eine
therapeutische Anwendung gelten, durchgeführt.
B
LAU1397
2vacc.
0.06
8vacc.
4vacc.
9.67
MAGE-A3111-125/DP4
In Vitro: Before
NY-ESO-187-99/DR7
3.34
9.94
CD4
Cancer Research
LAU1352
NY-ESO-187-99/DR7
Ex vivo: Before
0.06
LAU1350
8vacc.
4vacc.
0.12
6vacc.
0.15
0.18
MAGE-A3243-258/DP4
CD4
Melan-A25-36/DQ6
CD4
CD4
Nachweis von menschlichen, tumorantigenspezifischen CD4 T-Lymphozyten mittels Before
pMHC-Klasse II Multimeren. (A) Repräsentatives Beispiel eines NY-ESO-187-99 / DR7
Multimer-Stainings von aus HLA-DR7+ Patienten stammenden CD4 T-Lymphozyten
vor und während der Immunisierung; nach einer in vitro Stimulationsrunde (ober)
und direkt ex vivo (unten). (B) Repräsentative Beispiele spezifischer MultimerStainings für verschiedene Tumorantigene (i) Mage-A3/DP4 für die Epitope (111-125)
und (243-258), (ii) Melan-A25-36/DQ6 und (iii) NY-ESO-187-99 /DR7.
4vacc.
LAU1352
8vacc.
0.06
LAU1350
NY-ESO-187-99/DR7
0.12
CD4
6vacc.
0.15
CD4
CD4
NY-ESO-187-99/DR7
A
0.18
% positive cells
50
0
Granzyme B
Melan-A /DQ6 (25-36)
80
IFNg neg, peptide neg
IFNg pos, peptide neg
IFNg neg, peptide pos
IFNg pos, peptide pos
60
40
20
E:T ratio
10
1/
1
3/
1
10
/1
0
30
/1
1/
1
0
Percentage of specific lysis (51Cr)
20
E:T ratio
100
Granzyme A
40
3/
1
1/
1
3/
1
10
/1
0
60
10
/1
20
MageA3/DP4 (111-125)
80
30
/1
40
Percentage of specific lysis (51Cr)
60
Fold change (mRNA)
B
NY-ESO-1/DR7 (87-99)
80
30
/1
A
Percentage of specific lysis (51Cr)
Die Analyse der Ausgangsdaten von CD4 T-Zellklonen, die für die Melan-A25-36/DQ6,
MAGE-A3111-125/DP4 und NY-ESO-187-99/DP4 Peptide spezifisch sind, zeigen, dass
die für Melan-A25-36/DQ6 und NY-ESO-187-99/DR7 spezifischen Klone eine
Polarisation hin zu einem Th1 Bias aufweisen, wohingegen MAGE-A3111-125/DP4spezifische CD4 T-Zellklone eine doppelte Polarität hin zu Th1 und Th17-Th1
besitzen. Auch die zytotoxische Kapazität wurde untersucht: Erste Ergebnisse
zeigen, dass die Melan-A25-36/DQ6 Klone nicht in der Lage sind, Zielzellen zu
lysieren. Andererseits weisen die MAGE-A3111-125 / DP4 und NY-ESO-187-99/DR7Klone einen hohen Prozentsatz an spezifischer Lyse auf, wenn sie in der Gegenwart
von Tumorzellen mit gepaarten HLAs kultiviert werden. Wir charakterisieren nun die
Signalwege, die am zytotoxischen Potential dieser Klone beteiligt sind, indem wir die
Expression der zytotoxischen Moleküle untersuchen. Erste Ergebnisse zeigen eine
Zunahme der Granzyme A- und Perforin-Expression in den MAGE-A3111-125/DP4und NY-ESO-187-99/DR7-spezifischen CD4 T-Zellklonen, im Vergleich zu Melan-A2536/DQ6-spezifischen Zellen. Wir führen zurzeit Untersuchungen mittels Nanostring
Technologie und polarisierten und auxiliären, zytotoxischen CD4 T-Lymphozytklonen
durch, um zusätzliche Informationen zu den Markern und spezifischen Signalwegen,
die am zytotoxischen Potential der Cd4 T-Zellen beteiligt sind, zu erhalten. Insgesamt
werden die erstellten Tools und CD4 T-Lymphozytklone sowie zusätzliche Daten es
uns ermöglichen, die menschlichen tumorspezifischen CD4 T-Zellen gründlich zu
charakterisieren. Der TCR einer ersten Klongruppe wurde ebenfalls schon
sequenziert. Später werden die TCRs von bestimmten Klonen, die sich für eine
therapeutische Anwendung (zytotoxisch vs. auxiliär) als besonders
erfolgversprechend erwiesen haben, geklont. So können wir das Transferpotential
von TCRs im Rahmen genetischer Manipulationen von T-Zellen für den adoptiven
Zelltransfer untersuchen.
E:T ratio
Melan-A/DQ6 (26-36)
Mage-A3/DP4 (111-125)
8
6
4
2
0
Perforin
Analyse der zytotoxischen Kapazität von CD4 T-Zellklonen, die für diverse
Tumorantigene spezifisch sind. (A) Zelluläre Lyse mit Chromium 51. Für ein
bestimmtes Tumorantigen spezifische CD4 T-Zellklone wurden mit einer Tumorlinie
co-kultiviert, die vorher mit IFNγ behandelt wurde (oder nicht) und ein gepaartes HLA
aufweist, in An- oder Abwesenheit von spezifischen Peptiden und in den folgenden
Effektor:Ziel (E:T) Verhältnissen: 30:1,10:1,3:1 und 1:1 während 4h. Der Prozentsatz
der spezifischen Zelllyse wurde gemäss der folgenden Gleichung ausgerechnet:
((Wert experimentelle Lyse-spontane Zelllyse)/(maximale Zelllyse-spontane
Zelllyse))*100. (B) Faktoren, die an der zytotoxischen Kapazität der CD4 T-Zellklone,
die für das Melan-A25-36/DQ6 (schwarz) oder das Mage-A3111-125/DP4 (blau) Epitop
spezifisch sind, beteiligt sein könnten. Prozentsatz der spezifischen CD4 T-Zellklone,
die Granzyme A und Granzyme B produzieren (linke Graphik). Messung der
Veränderungen in der Expression von mRNA für Perforin in spezifischen CD4 TZellklonen (rechte Graphik).