LDL Antikörper 11.12.09
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LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne LDL Antikörper 11.12.09 Sina, Lina, Corinne Synthetisierung monoklonarer Antikörper Einleitung Die Herstellung monoklonaler Antikörper stellt ein Meilenstein in der Immunologie dar. Sie bietet die Grundlage für die künstliche und kontrollierte Herstellung von Impfstoffen. Wenn der Mensch mit einem körperfremden Stoff konfrontiert wird z. B. einem Bakterium, Virus oder Protein (werden als Antigene bezeichnet), produzieren spezialisierte Zellen des Immunsystems (Milzzellen, B-Zellen (=gesunde, weisse Blutkörperchen)) gegen diese Eindringlinge Abwehrstoffe, die Antikörper. Als Antwort auf das Eindringen eines Bakteriums werden viele unterschiedliche B-Zellen zum Wachstum angeregt, die jeweils unterschiedliche Antikörper produzieren. Diese unterschiedlichen Antikörper greifen an verschiedenen Stellen der Bakterienzelle an. Die resultierende Mischung von Antikörpern, die als Reaktion auf ein Antigen gebildet werden, nennt man polyklonal (polyklonales Antiserum). Polyklonal deshalb, weil die Antikörper von verschiedenen B-Zellen gebildet werden und unterschiedliche Strukturen aufweisen. Nun wie kann man am besten Antikörper künstlich herstellen oder anders gesagt nachproduzieren? Man hat einen Weg gefunden, ganz gezielt eine Sorte von Antikörpern zu gewinnen, die monoklonalen Antikörper. Das funktioniert nicht mehr allein in vivo, also im Körper eines Versuchstieres, sondern auch in vitro, im Reagenzglas. Damit überhaupt eine Immunisierung stattfinden kann muss zunächst das Antigen ausgewählt und produziert werden. Dies kann auf verschiedene Weisen erreicht werden. Es muss festgestellt werden, dass man identische Proteine (Antigene) verwendet. - Protein wird als Ganzes isoliert - Peptid wird in vitro (Reagenzglas) synthetisiert identische Antigene - Protein wird als Ganzes rekombinant in Bakterien hergestellt 1 LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne 1. Immunisierung Das aufgereinigte Antigen wird einem Versuchstier (z.B. Maus) intramuskulär gespritzt. Darauf bildet die Maus verschiedene Antikörper gegen die Oberflächen (Epitope; a, b, c) des Antigens. Die Produktion der spezifischen Antikörper in der Maus wird von den B-Zellen übernommen, jede B-Zelle bildet einen Satz von Antikörpern, welche alle gegen dasselbe Epitop des Antigens gerichtet sind (also monoklonal). Nach weiteren Injektionen ca. alle 2 Wochen, werden der Maus die B-Zellen entfernt oder das Blut entnommen (Gewinnung von polyklonalen Antikörpern). 2. Fusionierung Die erhaltenen B-Zellen können, auch wenn sie in Kulturen gehalten werden, maximal 7-8 Tage überleben. Daher werden sie mit Tumorzellen (Krebs-, Myelomazellen) fusioniert. Die Myelomazellen haben die Eigenschaft, dass sie sich ewig teilen, während die B-Zellen Antikörper produzieren. Die Fusionierung wird mit Hilfe eines Kulturmediums durchgeführt. Die erhaltenen fusionierten Zellen werden Hybridomazellen ("hybrid" = "gemischt") genannt. Diese Hybridomazellen besitzen beide Eigenschaften, d. h. sie produzieren Antikörper und können sich unendlich teilen. 3. Primärkultur (HAT-Medium) Nach der Fusionierung sind eine Vielzahl von Zellen entstanden. Zum Teil die Hybridomazellen, welche die gesuchten Antikörper gegen das Antigen bilden, aber auch nicht fusionierte B- oder Myelomazellen (Hybride aus zwei B-Zellen oder Myelomazellen) welche Antikörper gegen andere Antigene bilden. (produzierter Ausschuss) Mit Hilfe des HAT-Mediums (ein spezielles Medium in welchem nur die fusionierten Hybridomazellen überleben können) erfolgt die Selektion. Die Hybridomazellen sind nicht alle identisch da sie aus verschiedenen B-Zellen bestehen. 4. Klonierung (=durch ungeschl. Vermehrung genetisch identische Kopien von Lebewesen herstellen) Die von den unterschiedlichen Hybridomazellen produzierten Antikörper werden auf ihre Eigenschaften hin untersucht. Schließlich wird diejenige Hybridomazelle herausgesucht, die Antikörper mit genau der Eigenschaft produziert, die man sucht. Durch Zellteilung werden aus dieser Hybridomazelle, der Ursprungszelle, genetisch identische Zellen produziert. Man nennt diesen Vorgang auch klonen. Jeder dieser Zellklone kann den gesuchten monoklonalen Antikörper produzieren. Die Zellklone können eingefroren werden. 5. Produktion von mAk Bei Bedarf kann ein Zellklon aufgetaut und in eine Nährlösung eingebracht werden. Daraufhin wird die Produktion der monoklonalen Antikörper angeregt. Ein Zellklon kann aber auch in den Körper eines Tieres eingebracht werden, der dann die spezifischen monoklonalen Antikörper produziert (wird nur noch selten gemacht, da zum Teil verboten). Eigenschaften / Bedeutung Vorteile von monoklonalen Antikörpern: - können eingefroren & wieder aufgetaut werden & in Kultur gehalten werden - eine gleichbleibende Charge (=best. Serie von Arzneimitteln) grosse Quantität & Qualität polyklonale Antikörpern: nach Verbrauch von 1 Charge, nächste immunisierte Maus ergibt nicht identischer Satz Antikörper gegen das gleiche Antigen 2 LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne Synthetisierung monoklonarer Antikörper = Epitop Tumorzellen Auftrennung von a, b, c meist Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Pferde Nährlösung (=Flüssigkeit) 3 LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne Rekombinante Antikörper Rekombinante Antikörper sind Antikörper, die auf gentechnischem Weg gewonnen werden. Die Antikörperproduktion erfolgt durch Klonierung und Transformation in Wirtszellen. Zum Beispiel Hefe oder Pflanzen dienen als Wirtszellen für die Antikörperproduktion. Die Auswahl des richtigen (=spezifisch bindenden Antikörpers) erfolgt dabei nicht durch das Immunsystem eines Tieres/Menschen, sondern im Labor. Rekombinante Antikörper werden in vitro hergestellt, d. h. ohne Versuchstier, da keine Immunisierung notwendig ist. Sie können auf vielfältige Weise angewendet werden, da sie einfach verändert werden können, da ihre Erbsubstanz bekannt ist. Es gibt Genbibliotheken wo alle notwendigen Daten abgelegt wurden. So können rekombinante Antikörper im Labor so verändert werden, dass der Antikörper noch bessere Eigenschaften hat. Bedeutung der AK für das menschliche Immunsystem Aufgrund ihrer Fähigkeit ganz spezifisch an Antigene der Krankheitserreger zu binden, nehmen Antikörper eine sehr grosse Bedeutung im menschlichen Immunsystem ein. Ohne sie würden wir eine Infektion nicht überleben. Wo werden Antikörper überall eingesetzt? Die Verwendung von Antikörpern ist sehr vielschichtig. Doch meistens werden sie in der Medizin oder in der Biologie eingesetzt. Medizin Aus Tieren gewonnene Antikörper werden als Therapeutikum für verschiedenste Zwecke eingesetzt. Ein wichtiges Beispiel ist die Verwendung als passiver Impfstoff. Darüber habt ihr in der letzten LdL schon mehr gehört. Antikörper werden auch therapeutisch bei einigen Erkrankungen als Intravenöse Immunglobulingaben (IVIG) verabreicht. Ausserdem werden spezifische monoklonale Antikörper seit neuestem in der Medizin therapeutisch eingesetzt. Hauptanwendungsgebiet ist die Hämatologie (Blut) und Onkologie (Krebs), daneben werden sie auch in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose (neurologische Erkrankung) oder Rheumatoider Arthritis (RA) eingesetzt. Antikörper können auch dazu benutzt werden, bestimmte Stoffe im Körper ausfindig zu machen. Darüber werdet ihr aber später noch mehr hören. Früher war der konstante Teil der Antikörper noch murin (aus der Maus), was zu Abstoßungsreaktionen durch das Immunsystem führen konnte. Um dieses Problem zu umgehen, werden neuerdings sogenannte humanisierte Antikörper verwendet, bei denen mit Hilfe von molekularbiologischen Verfahren die murinen Teile der konstanten Abschnitte entfernt und durch baugleiche, menschliche Antikörper ersetzt werden. Biologie Die hohe Spezifität, mit der Antikörper ihr Antigen erkennen, macht man sich in der Biologie zu Nutze, um das Antigen, in den allermeisten Fällen ein Protein, sichtbar zu machen. Die Antikörper sind entweder direkt mit einem Enzym (setzt ein Substrat in Farbe oder Chemoluminiszenz um), mit Fluoreszenzfarbstoffen oder mit radioaktiven Isotopen gekoppelt (gelabelt) oder werden mit einem Sekundärantikörper, der an den ersten (Primärantikörper) bindet und entsprechend gelabelt ist, nachgewiesen. 4 LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne Western Blot Vor dem eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch, das vorher aus einer Zelle isoliert wurde, mit Hilfe einer Gel-Elektrophoresetechnik in einer Trägermatrix entsprechend ihrer Grösse, Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt. Hierbei handelt es sich um genau die gleiche Technik wie wir sie im Labor angewendet haben. Die zu untersuchenden Proteine werden zuerst mit einem Gel in Proteinbanden aufgetrennt. Beim Western Blot wird ein senkrecht zum Gel gerichtetes elektrisches Feld angelegt. Somit wandern die Proteine aus dem Gel auf eine Membran. An der Membranoberfläche bleiben sie haften. Dabei bleibt das Muster der Auftrennung durch das elektrische Feld. Die Proteinbanden können nun auf der Membran mit Hilfe spezifischer Antikörper identifiziert werden. Spezifische Antikörper binden an der passenden Proteinbande auf der Membran. Durch zugesetzte Stoffe wird eine Farbreaktion ermöglicht, welche dann die Bindung zwischen Antikörper und Eiweiss sichtbar macht. Wie werden Antikörper in der Diagnostik eingesetzt? Diagnose von Zöliakie (auch Sprue genannt) Falls ihr euch erinnern könnt; Sina und ich haben in unserem Science in the news Vortrag die Krankheit Zöliakie präsentiert. kurze Repetition: Die Zöliakie ist eine chronische Erkrankung der Dünndarmschleimhaut auf Grund einer Überempfindlichkeit gegen Gluten. Gluten ist das „Klebereiweiss“ im Getreide. Zöliakie ist eine Autoimmunerkrankung bei der die sog. Plasmazellen Antikörper gegen körpereigenes Gewebe produzieren. Diese Antikörper werden in diesem Fall Autoantikörper genannt. Dabei bekommt das Gehirn die Fehlinformation eigenes Gewebe zu zerstören. Um Zöliakie zu diagnostizieren, ist zunächst eine Antikörperbestimmung durch einen Bluttest erforderlich, zu dem etwa 1 ml Blutserum benötigt wird. Antikörper gegen Gliadin: Antikörper sind gegen das mit der Nahrung aufgenommene Gliadin gerichtet. In den letzten Jahren konnte nachgewiesen werden, dass sich die Gliadin-Antikörper von Zöliakiepatienten deutlich unterscheiden. Zöliakiepatienten „verdauen“ Gliadin anders als nicht Betroffene. So entstehen veränderte Eiweissstücke (Peptide), gegen welche Antikörper gebildet werden. Neuere Testverfahren ermöglichen den Nachweis dieser spezifischen Gliadin-Antikörper, die sich durch eine hohe Zuverlässigkeit auszeichnen. 5 LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne Schwangerschaftstest In diesem Test wird die Konzentration des hCG, das ist ein Hormon, welches beim Beginn der Schwangerschaft verstärkt vorhanden ist, gemessen. Der Schnelltest ist ein immunchromatographischer Test. Wird der Teststreifen mit Urin benetzt, so bindet das hCG-Antigen (grün) an einen Farbstoff-markierten hCG-Antikörper (rosa). Der AntigenAntikörper-Farbstoff-Komplex wandert zur Testzone, in der ein zweiter hCG-Antikörper (grau) fixiert ist. Der immobilisierte Antikörper bindet den wandernden Antigen-Antikörper-Farbstoff-Komplex in dieser Zone und färbt diese an. Überschüssiger Farbstoff-markierter hCG-Antikörper (rosa) wandert weiter zur Kontrollzone, in der ein anti-Fc-Antikörper (dunkelgrau) fixiert ist. Der immobilisierte antiFc-Antikörper bindet den überschüssigen Farbstoff-markierten hCG-Antikörper (rosa) in dieser Zone und färbt diese an. Influenza Influenza-Schnellteste beruhen auf dem Nachweis von Influenza-Antigenen, die sich im Probenmaterial befinden. Nachgewiesen werden die Influenza-Antigene durch konjugierte Antikörper, die sich in einem Teststreifen befinden. Zum Durchführen des Tests wird der Teststreifen mit der einen Seite in das Probenmaterial eingetaucht und durch Kapillarwirkung wird die Flüssigkeit über den Teststreifen geleitet. Bei Vorhandensein von Antigenen bilden sich Antigen-AntikörperKomplexe, die dann als farbige Markierung sichtbar werden. Als Probenmaterial werden Nasenspülflüssigkeit und Nasen/Rachenabstrich genutzt. Der Test dauert nur 15 Minuten. 6 LDL Antikörper Sina, Lina, Corinne Begriffsdefinitionen (Memory) - Antikörper sind Proteine (~ 4 Aminosäureketten) mit der Form eines Y und sind ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems. Sie werden von so genannten B-Zellen hergestellt. - Weisse, gesunde Blutkörperchen werden B-Zellen genannt. - In Wirbeltiere eindringende Bakterien, Viren, Proteine oder andere Parasiten werden als Antigene bezeichnet. Genau genommen wird die Oberfläche eines eingedrungenen Partikels als Antigen bezeichnet. - Der Begriff Antigen kommt vom Englischen Ausdruck „Antibody Generation“, was so viel heisst wie „Bildung von Antikörpern“. - Antikörper sind auch unter dem Namen Immunglobuline bekannt. - Ein Antikörper bindet sich an ein bestimmtes Antigen (spezifische Bindung), welches somit für weitere Immunreaktionen (die schlussendliche Zerstörung) „markiert“ ist. Jeder Antikörper greift eine bestimmte Stelle der z.B. Bakterienzelle an. - Die Bildung und Bindung von Antikörpern führt aufgrund des immunologischen Gedächtnisses zur Immunität. - Immunität ist die Unempfindlichkeit oder Unempfänglichkeit des Organismus gegenüber äußeren Angriffen. Auch beschreibt sie Fähigkeit des Organismus, bestimmte Krankheitserreger ohne pathologische (krankhafte) Erscheinungen zu eliminieren. - Antikörper werden von sogenannten Plasmazellen wie z.B. von Milzzellen oder B-Zellen (weisse Blutkörperchen) produziert. - Ein einzelner Antikörper erkennt meist nicht die ganze Struktur eines Antigens (Eindringlings), da dieser vorwiegend verschiedene Oberflächenstrukturen aufweist. Eine einzelne Oberflächenstruktur (einen Teil des Ganzen) wird als Epitop bezeichnet. - Ein monoklonaler Antikörper bezeichnet Antikörperzellen, welche alle auf die gleiche Mutterzelle zurück gehen und genau an das gleiche Epitop (= 1 best. Stelle auf einem Antigen) andocken. Die Tochterzelle ist identisch mit der Mutterzelle. - Im Gegensatz zu den monoklonalen Antikörpern gibt es das polyklonale Antiserum (Serum = Impfstoff). Ein polyklonales Antiserum ist eine Mischung aus verschiedenen Antikörpern, welche sich gegen diverse Epitope (= Stelle an Oberfläche des „Eindringlings“) richten. Auf einem Antigen befinden sich verschiedenste Epitope. Jeder Antikörper richtet sich gegen ein bestimmtes Epitop. - Wortbedeutung: in vivo = im Körper eines Versuchtiers - Wortbedeutung: in vitro = im Reagenzglas 7
