Prof. Dr. med.

1
Aus der Hautklinik Universitätsklinikum Erlangen
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. G. Schuler
Ex vivo Isolation und Charakterisierung von CD4+ CD25+
regulatorischen T-Zellen unter spezifischer Immuntherapie
mit Pollinex Quattro® versus ALK SQ Depot®
bei Typ I-Allergie auf Birkenpollenallergie
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Carolin Christine Hack
aus
Forchheim
2
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. V. Mahler
Korreferent:
Prof. Dr. med. M. W. Beckmann
Tag der mündlichen Prüfung: 12.09.2012
3
“Quidquid agis prudenter agas et respice finem.”
(Aesop ca. 600 v. Chr.)
4
Widmung
Diese Arbeit widme ich meinen Eltern und meiner Schwester.
5
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung.....................................................1
1.1. Hintergrund und Ziele ....................................................................... 7
1.2. Methoden (Patienten, Material, Untersuchungsmethoden)............... 7
1.3. Ergebnisse und Beobachtungen....................................................... 8
1.4. Praktische Schlussfolgerungen......................................................... 8
1. Summary ...................................................................10
1.1. Background and Aims..................................................................... 10
1.2. Methods (patients, material, techniques) ........................................ 10
1.3. Results and Observations............................................................... 10
1.4. General Conclusion ........................................................................ 11
2. Einleitung ..................................................................12
2.1. Epidemiologie von allergischen Erkrankungen ............................... 12
2.2. Definition des Begriffs „Allergie“...................................................... 13
2.3. Allergische Reaktionen vom Typ I-Soforttyp ................................... 15
2.4. Rolle der regulatorischen T-Zellen .................................................. 17
2.4.1. Thymus-generierte, natürliche regulatorische CD4+ CD25+ TZellen................................................................................... 20
2.4.2. Induzierte Tr1-Zellen und Th3-Lymphozyten ........................ 22
2.5. Allergenspezifische Immuntherapie als Behandlungsmöglichkeit... 22
2.6. Allergenpräparate und Therapie-Schemata der SIT ....................... 27
2.7. Hintergründe und Ziele der Dissertation ......................................... 28
3. Material und Methoden ............................................30
3.1. Charakterisierung der Patienten ..................................................... 30
3.2. Charakterisierung der Impfstoffe..................................................... 33
3.3. Puffer und Medien........................................................................... 34
3.4. Antikörper und Proteine .................................................................. 36
6
3.5. Lymphoprep-Gradient aus Heparin-Vollblut.................................... 37
3.6. CD4-Negativ-Selektions-MACS ...................................................... 39
3.7. CD25-Positiv-Selektions-MACS...................................................... 40
3.8. FACS mit PBMCs, CD4+ CD25- und CD4+ CD25+ T-Zellen ......... 41
3.9. Züchtung und Reifung dendritischer Zellen .................................... 43
3.10. Proliferationsassay mit anti-CD3 und anti-CD28........................... 45
3.11. Proliferationsassay mit reifen dendritischen Zellen ....................... 47
3.12. Auswertung der Proliferationsassays mit ³H-Thymidin.................. 48
3.13. Foxp3-Bestimmung....................................................................... 49
3.14. Statistische Auswertung................................................................ 51
3.15. Untersuchungen zur subjektiven Bewertung der SIT .................... 52
4. Ergebnisse ................................................................59
4.1. Charakterisierung der Patientenkollektive....................................... 59
4.2. Ergebnisse der PBMC-FACS-Auswertung...................................... 61
4.3. Foxp3-Bestimmung......................................................................... 64
4.4. Ergebnisse des Proliferationsassays mit unspezifischer Stimulation
(Anti-CD3-/Anti-CD28-Antikörper) ................................................... 66
4.5. Ergebnisse des Proliferationsassays mit spezifischer Stimulation
(dendritische Zellen mit und ohne rBet v 1)..................................... 69
4.6. Auswertung der Patientenfragebögen............................................. 73
5. Diskussion ................................................................87
6. Literaturverzeichnis ...............................................104
7. Abkürzungsverzeichnis .........................................127
8. Danksagung............................................................130
9. Lebenslauf ...............Fehler! Textmarke nicht definiert.
7
1. Zusammenfassung
1.1. Hintergrund und Ziele
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der CD4+ CD25+
regulatorischen T-Zellen bei der Induktion allergenspezifischer Toleranz
durch spezifische Immuntherapie (SIT) mit einem adjuvans-verstärkten
präsaisonalen Kurzzeitschema (Pollinex Quattro®) versus einem perennialen
Behandlungsschema (ALK SQ Depot®) bei Typ I-Birkenpollenallergie zu
untersuchen. Des Weiteren sollten folgende Fragestellungen geklärt werden:
Inwiefern unterscheiden sich die Behandlungseffekte der perennialen im
Vergleich zur präsaisonalen SIT? Kann durch die Zugabe des Adjuvans
Monophosphoryl Lipid A (MPL-A) eine Verkürzung der Behandlungsdauer
bei gleichem Therapieerfolg erreicht werden?
1.2. Methoden (Patienten, Material, Untersuchungsmethoden)
Für die Studie wurden insgesamt 24 geeignete Patienten mit Typ I-Allergie
auf Birkenpollen ausgewählt, wobei die eine Hälfte eine perenniale
Langzeittherapie mit ALK SQ Depot® und die andere Hälfte eine
präsaisonale Kurzzeittherapie mit Pollinex Quattro® erhielt. Zu definierten
Zeitpunkten wurden aus dem Heparin-Vollblut der Patienten PBMCs
gewonnen und anschließend mittels CD4-Negativ- und CD25-PositivSelektions-MACS weiter aufgetrennt. Neben der allergenunspezifischen
Stimulation der T-Zellen mittels anti-CD3 und anti-CD28 wurde auch ein
allergenspezifischer Proliferationsassay mit reifen rBet v 1-beladenen und unbeladenen dendritischen Zellen durchgeführt, um das proliferative
Verhalten der CD4+ T-Zellsubklassen und das inhibitorische Potential der
regulatorischen T-Zellen zu analysieren. Zur Qualitätskontrolle wurde der
Anteil der CD4+ CD25+ T-Zellen an den PBMCs mittels FACS-Analyse
bestimmt und eine Foxp3-Messung durchgeführt.
8
1.3. Ergebnisse und Beobachtungen
Anhand der FACS-Analyse konnte ermittelt werden, dass der Anteil der
CD4+ CD25+ T-Zellen an den Gesamt-PBMCs bei perennialer Behandlung
(ALK SQ Depot®) im Laufe der SIT kontinuierlich anstieg, wohingegen bei
dem verabreichten Kurzzeitschema (Pollinex Quattro®) nach initialer
Zunahme
im
rückläufiger
behandlungsfreien
Befund
(jedoch
Intervall nach
auf
ein
sechs
Niveau
Monaten
oberhalb
ein
des
Ausgangsbefundes) zu verzeichnen war. Sowohl bei der spezifischen als
auch bei der unspezifischen Stimulation wiesen die CD4+ CD25- T-Zellen
stets deutlich höhere Proliferationsraten auf als die CD4+ bulk und CD4+
CD25+/CD4+ CD25- T-Zellen. Die regulatorischen CD4+ CD25+ T-Zellen
selbst verhielten sich hypoproliferativ und blieben auf konstant niedrigem
Niveau. Während der SIT nahm die supprimierende Wirkung der
regulatorischen T-Zellen auf periphere CD4+ T-Zellen in beiden Gruppen
signifikant zu, was zu einem deutlichen Abfall der Proliferationsraten führte.
Bei ALK SQ Depot® war dieser Behandlungseffekt stärker ausgeprägt als bei
Pollinex Quattro®. Grundsätzlich zeigten die T-Zellsubpopulationen bei der
spezifischen Stimulation insgesamt höhere Proliferationsraten als bei der
unspezifischen Induktion, wobei die mit rBet v 1-beladenen rDCs am besten
in der Lage waren, CD4+ T-Zellen zu aktivieren. In beiden Gruppen war ein
Rückgang der Symptomstärke und des Medikamentenverbrauchs zu
verzeichnen.
1.4. Praktische Schlussfolgerungen
Die oben beschriebenen Ergebnisse lassen folgende Schlussfolgerungen
zu: Die SIT induziert sowohl eine Zunahme der Anzahl als auch des
supprimierenden Potentials der regulatorischen CD4+ CD25+ T-Zellen,
wodurch die Fähigkeit zur Proliferationsinhibition im Organismus zunimmt.
Dieser positive Effekt wirkt der allergiebedingten Th2-Polarisierung entgegen
und führt letztendlich durch den so genannten Th2-Th1-Switch zur
Wiederherstellung des natürlichen immunologischen Gleichgewichts. Beide
Gruppen zeigten im Verlauf der SIT hochsignifikante Behandlungseffekte.
Insgesamt hielt die Wirkung bei der ganzjährigen Behandlung mit ALK SQ
9
Depot® im Untersuchungszeitraum länger an als bei der präsaisonalen
Behandlung mit Pollinex Quattro®, bei der im behandlungsfreien Intervall ein
Rückgang des Behandlungseffekts zu verzeichnen war. Daraus resultiert,
dass die Behandlungsdauer bei der präsaisonalen SIT durch die Zugabe von
MPL-A auf ein Jahr gesehen zwar verkürzt werden kann, jedoch vor der
Pollensaison erneut wiederholt werden muss, um einen entsprechenden
Behandlungseffekt zu boosten.
10
1. Summary
1.1. Background and Aims
Aim of this study was to investigate the role of CD4+ CD25+ regulatory Tcells
at
the
induction
of
allergen-specific
tolerance
with
specific
immunotherapy with a pre-seasonal adjuvant-enhanced scheme (Pollinex
Quattro™) versus a perennial treatment scheme (ALK SQ Depot™) in Type I
birch pollen allergy. Further, the following questions should be addressed:
Do the therapeutic effects of a perennial specific immunotherapy differ from
pre-seasonal specific immunotherapy?
Does a co-application of the adjuvant Monophosphoryl Lipid A allow a
reduction of the treatment interval at comparable efficacy?
1.2. Methods (patients, material, techniques)
For this study a total of 24 suitable patients with Type I allergy to birch pollen
was randomised. Whereas one half got a perennial long-term therapy (ALK
SQ Depot™) and the other half received a pre-seasonal short-term therapy
(Pollinex Quattro™). At defined times, PBMCs were isolated from the
patients' peripheral blood and were separated afterwards by CD4-negativand CD25-positiv selection MACS. Besides allergen non-specific stimulation
of T-cells with anti-CD3 and anti-CD28 also an allergen specific proliferation
assay with mature rBet v 1-loaded and -unloaded dendritic cells was
performed to analyse the proliferation of CD4+ T-cell sub-classes and the
inhibitory potential of regulatory T-cells. For the quality assurance the portion
of CD4+ CD25+ T-cells from the PBMCs was determined by FACS analysis
and a Foxp3-measurement was performed.
1.3. Results and Observations
On the basis of FACS analysis it could be determined, that the portion of
CD4+ CD25+ T-cells from the overall PBMCs increased continuously during
the course of the SIT with ALK SQ Depot™, whereas there was a decrease
11
during the treatment-free interval after six month with Pollinex Quattro™.
After specific as well as after non-specific stimulation CD4+ CD25- T-cells
showed considerably higher proliferation rates compared to CD4+ bulk and
CD4+
CD25+/CD25-
T-cells.
The
regulatory
CD4+
CD25+
T-cells
themselves displayed a hypoproliferative behavior and remained constantly
on a low level. During the SIT the inhibitory effect of the regulatory T-cells on
peripheral CD4+ T-cells increased significantly in both groups, which lead to
a noticeable decrease of the proliferation rates. With perennial ALK SQ
Depot™ treatment this therapeutic effect was distinctly stronger than with the
pre-seasonal treatment scheme with Pollinex Quattro™. In principal, the Tcell sub-populations exhibited all in all higher proliferation rates after specific
stimulation than after non-specific induction, whereas the mDCs loaded with
rBet v 1 were suited best to activate CD4+ T-cells. In both groups, a
reduction of symptom intensity and of medication use was noticed.
1.4. General Conclusion
The above described outcome leads to the following conclusions: The SIT
increases the number of regulatory CD4+ CD25+ T-cells as well as their
suppressive potential, exhibiting an increasing inhibition of proliferation of
effector cells. This positive impact counteracts the allergenic Th2 polarization
and leads finally to the recovery of the natural immunological balance by the
so-called Th2-Th1-Switch. Both groups exhibited highly significant treatment
effects during the period of SIT. All in all, the treatment effect of ALK SQ
Depot™ lasted longer than Pollinex Quattro™ in the investigated observation
period. It can be concluded, that a pre-seasonal SIT with MPL-A as
adjuvant-enhancer induces a treatment effect after a very short treatment
duration, however the treatment has to be repeated before the pollen
season, to boost the treatment effect.
12
2. Einleitung
2.1. Epidemiologie von allergischen Erkrankungen
Erkrankungen des allergischen Formenkreises, wie atopische Dermatitis,
allergische Rhinokonjunktivitis oder intrinsisches Asthma haben innerhalb
der letzten Jahrzehnte vor allem in den westlichen Industrieländern deutlich
zugenommen und sind weiter auf dem Vormarsch [94]. Allergien haben sich
regelrecht zu einer Volkskrankheit entwickelt und werden sogar als „Seuche
der Neuzeit“ bezeichnet.
Epidemiologische Studien zeigen, dass aktuell 20 bis 30 Prozent der
westlichen Zivilisation gegen eine oder mehrere Substanzen allergisch
reagieren und bei jedem zweiten irgendwann im Laufe seines Lebens eine
Sensibilisierung nachweisbar ist [148].
Gerade in jüngster Zeit fällt auf, dass sich vor allem bei Kindern und
Jugendlichen immer schwerere Verlaufsformen zeigen und dass die Anzahl
der Polysensibilisierung und Kreuzreaktionen stetig ansteigt [167].
Die Ursachen für diesen Trend sind noch nicht vollständig geklärt, werden
aber derzeit in zahlreichen Studien untersucht. Diskutiert werden neben
einer genetischen Disposition vor allem der westliche Lebensstandard und
die
„Hygiene-Hypothese“,
Infektionsquellen
für
die
wonach
der
Rückgang
Hypersensibilisierung
des
natürlicher
Immunsystems
verantwortlich ist [88], [142]. Wahrscheinlich wird durch den Wegfall von
Infektionen aufgrund des hohen Hygienestandards das Immunsystem im
Laufe seiner Entwicklung zu wenig bezüglich einer Th1-Reaktionslage
stimuliert, wodurch eine Dysbalance zwischen Th1- und Th2-Immunantwort
entsteht mit einer überschießenden Th2-basierten Abwehr auf an sich
harmlose
Umweltallergene.
Lebensgewohnheiten
und
entscheidende Rolle [87].
Zusätzlich
die
spielen
zunehmende
vermutlich
veränderte
Umweltbelastung
eine
13
Nach heutigem Verständnis basieren Allergien auf einer Störung des
immunologischen
Gleichgewichts
und
einer
Dysregulation
der
Immunmodulation, was bei Erkrankten zu einer Überreaktion des Körpers
führt. An sich harmlose und ungefährliche Proteine, die normalerweise keine
Bedrohung für den Organismus darstellen und vom Gesunden ohne
weiteres toleriert werden, lösen bei Betroffenen eine überschießende Th2Immunantwort mit allergischer Entzündungsreaktion aus [24], [68].
Insgesamt ist das Geschehen sehr komplex und die Einzelheiten zum
Verständnis
der
involvierten
Faktoren
und
der
zellulären
Immunkomponenten noch nicht vollständig entschlüsselt.
Daher ist
es
weiterhin
Gegenstand
der aktuellen
Forschung,
die
Mechanismen der Allergieentstehung zu identifizieren und innovative
Strategien zur Allergie-Prävention und -Therapie zu entwickeln.
2.2. Definition des Begriffs „Allergie“
Im Jahr 1906 prägte Freiherr Clemens von Pirquet, Ordinarius der
Kinderklinik in Wien, erstmals den Begriff „Allergie“
und
definierte
ihn
damals
weit
gefasst
als
„veränderte Fähigkeit des Körpers, auf fremde
Substanz zu reagieren“. Er erkannte als erster, dass
Antikörper nicht nur schützende Immunantworten
vermitteln, sondern auch Überempfindlichkeitsreaktionen auslösen können [111].
Abbildung 1: Clemens von Pirquet (1874-1929)
(Quelle:
http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Pirquet.jpg&filetimestamp=20060812143529,
Stand 08.08.2011)
14
Heute versteht man unter Allergie eine überschießende Abwehrreaktion des
Immunsystems gegen bestimmte Antigene, die zwar primär apathogen sind,
aber bei Erkrankten typische Symptome hervorrufen und zu ernsthaften
Erkrankungen und Gewebeschäden führen können [58].
Bei den Allergenen handelt es sich vor allem um Umweltantigene, wie z.B.
Pflanzenpollen, Insektengifte oder Nahrungsmittel, die natürlichen Ursprungs
sind und ubiquitär vorkommen, wodurch der Kontakt kaum vermeidbar ist.
Generell lassen sich Allergien nach der Klassifikation von Coombs und Gell
(1963) in vier verschiedene Gruppen einteilen [28]:
Typ I
Typ II
Typ III
Typ IV
Auftreten der
Symptome
nach
Allergenkontakt
2 - 30 min
5-8h
2-8h
> 24 h
Antigen
löslich
zell- oder
matrixassoziiert
löslich
löslich oder
zellassoziiert
Auslösende
Immunkomponente
IgE-Antikörper
IgG-Antikörper
IgG-Antikörper
T-Zellen
Effektormechanismen
Mastzellaktivierung
Aktivierung des
Komplementsystems,
Zytotoxizität
Immunkomplexe,
Komplement,
Phagozyten
Aktivierung von
allergenspezifischen CD4+
und CD8+ TZellen und
unspezifischen
Entzündungszellen (z.B.
Makrophagen)
Krankheitsbilder
(Bsp.)
Rhinitis,
Konjunktivitis,
allerg. Asthma,
Anaphylaxie,
Nahrungsmittelallergien
Bluttransfusionsreaktion,
Erytroblastosis
fetalis
Serumkrankheit
Farmerlunge,
ArthusReaktion
Kontaktdermatitis,
Tuberkulinreaktion
Tabelle 1: Einteilung der Hypersensibilitätsreaktionen nach Coombs und Gell
Coombs und Gell klassifizierten 1968 vier verschiedene Typen allergischer Reaktionen
anhand von Merkmalen wie dem zeitlichen Ablauf, der Art des Antigens, der an der
Reaktion beteiligten Immunkomponenten und Effektormechanismen sowie den
Krankheitsbildern.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich ausschließlich mit der Typ I-Allergie
vom Soforttyp und mit der Birkenpollenallergie im Speziellen.
15
2.3. Allergische Reaktionen vom Typ I-Soforttyp
Die allergische Reaktion vom Typ I-Soforttyp wird definitionsgemäß durch
IgE-Antikörper vermittelt und läuft charakteristischerweise in zwei Phasen
ab, wobei die Sensibilisierungsphase der Effektorphase vorausgeht (vgl.
Abbildung 2).
Während der Sensibilisierung, dem ersten Kontakt mit dem Allergen,
manifestiert
sich
eine
starke
Th2-Polarisierung
und
eine
daraus
resultierende massenhafte IgE-Produktion. Diese Phase steht am Anfang
jeder Allergie und verläuft klinisch stumm [117].
Die Disposition zur Ausbildung einer Sensibilisierung ist häufig genetisch
festgelegt. Atopiker weisen im Serum einen bis zu 10-mal höheren IgESpiegel auf als die Normalbevölkerung, was das Allergierisiko um ein
Vielfaches erhöht [60]. Allergene dringen durch die Haut oder Schleimhaut in
den menschlichen Körper ein und treffen dort auf antigenpräsentierende
Immunzellen, wie Makrophagen und dendritische Zellen, welche die
Antigene als körperfremd einstufen und enzymatisch prozessieren [42], [89].
Nach Bindung an MHC-II-Komplexe werden sie den T-Helferzellen des Typs
0 (Vorläuferzellen) präsentiert. Diese wiederum differenzieren sich unter
dem Einfluss von Interleukin 4 zu allergenspezifischen T-Helferzellen des
Typs 2, die daraufhin IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13 produzieren. Als unmittelbare
Folge schütten immunologische B-Zellen massenhaft IgE-Antikörper aus, die
an hochaffine FcεRI-Rezeptoren auf Gewebemastzellen und basophilen
Granulozyten binden [58].
In der Effektorphase, das heißt bei dem Folgekontakt mit dem selben
Allergen, binden die spezifischen Antigene an das membranständige IgE der
Mastzellen
und
Ausschüttung
Leukotrienen
Basophilen
von
und
und
lösen
inflammatorischen
Prostaglandinen
aus.
durch
Kreuzvernetzung
Mediatoren,
Diese
wie
die
Histamin,
Degranulation
von
intrazellulären Botenstoffen hat eine sofortige Überempfindlichkeitsreaktion
des Körpers zur Folge und führt innerhalb von Minuten zu allergischen
Symptomen mit erhöhter Gefäßpermeabilität, vermehrter Schleimsekretion,
16
Konstriktion der glatten Muskulatur und Chemotaxis von eosinophilen und
neutralen Granulozyten [97], [136].
In der allergischen Spätphase sezernieren Th2-Zellen IL-4, IL-5, IL-10 und
IL-13
und
aktivieren
dadurch
zusätzlich
Eosinophile,
Basophile,
Alveolarmakrophagen und weitere T-Lymphozyten, die nun massenhaft in
die Kontaktregion des Gewebes einströmen und die inflammatorische
Reaktion aufrecht erhalten [116], [153].
Abbildung 2: Die spezifische Immuntherapie mit Therapie-Allergenen verschiebt das
Verhältnis von Th1- zu Th2-Zellen zugunsten der Th1-Zellen. Die Immunantwort des
Allergikers wird so moduliert, dass sie weitgehend der eines Nichtallergikers entspricht
(modifiziert nach ALK-SCHERAX Arzneimittel GmbH 2009).
Während in der Sensibilisierungsphase die IgE-Produktion die größte Rolle
spielt, stehen bei der manifesten Typ I-Allergie die Rekrutierung von
17
eosinophilen Granulozyten und das lokale Entzündungsgeschehen im
Vordergrund.
Klinisch können sich verschiedene Ausprägungen der Soforttyp-Allergie
entwickeln, die von allergischer Rhinokonjunktivitis über Asthma und
Nahrungsmittelallergien
bis
hin
zum
anaphylaktischen
Schock
und
Verschlechterung einer atopischen Dermatitis reichen [12], [81].
Bei Nichtallergikern aktivieren die antigenpräsentierenden Zellen (APCs) vor
allem Th1-Zellen, die hautsächlich IL-2 und IFN-γ produzieren. Es kommt
dadurch lediglich zur Stimulation von Makrophagen und B-Zellen, die IgG
und IgM-Antikörper bilden. Bei einer gesunden Immunantwort überwiegen
Th1-Zellen und die Produktion von IgG und IgM, wodurch eine allergische
Reaktion ausbleibt.
2.4. Rolle der regulatorischen T-Zellen
Das humane lmmunsystem verfügt über eine ganze Reihe verschiedener
hochspezialisierter Zelltypen, die das Gleichgewicht zwischen Abwehr und
Toleranz im menschlichen Körper aufrechterhalten.
Auf der einen Seite schützt es den Organismus vor dem Angriff
krankheitserregender Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren und Pilze, auf
der
anderen
Seite
Immunreaktionen
verhindert
gegen
es
aber
körpereigenes
auch
Gewebe
überschießende
und
harmlose
Umweltantigene. Allerdings kann das Immunsystem auch außer Kontrolle
geraten und dann selbst Ursache von lebensbedrohlichen Krankheiten sein.
Das Versagen der Abwehrbereitschaft gegenüber pathogenen Keimen, die
den Körper permanent und ubiquitär attackieren, kann zu gefährlichen
Infektionen führen. Verliert das Immunsystem die Toleranz gegenüber
Strukturen des eigenen Körpers und harmlosen Umweltstoffen, können
schwerwiegende Autoimmunkrankheiten und Allergien auftreten. Ursache
beider Krankheitsformen ist immer der Verlust der Balance, wodurch das
Immunsystem
nicht
mehr
unterscheiden kann [61].
richtig
zwischen
„Selbst“
und
„Fremd“
18
Damit dies im Regelfall nicht geschieht, haben sich in der Evolution des
Immunsystems
neben
zellulär
stark
stimulierend
und
expandierend
wirkenden Reaktionen auch supprimierende Strukturen herausgebildet, um
die Immunantwort zu kontrollieren.
Die Analyse der regulatorischen Komponenten gestaltete sich bedingt durch
die methodische Unzulänglichkeit über lange Zeit hinweg als sehr schwierig.
Erst 1995 gelang Sakaguchi und Kollegen der entscheidende Durchbruch,
indem sie eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen charakterisierten, die auf
ihrer Oberfläche konstitutiv CD25 (Alpha-Kette des Interleukin 2-Rezeptors)
exprimieren [61].
CD4+ CD25+ T-Zellen, die ein starkes regulatorisch-suppressives Potential
besitzen,
haben
eine
essentielle
Funktion
bei
der
Kontrolle
von
Immunantworten. Sie sind sozusagen die Schlüsselzellen für die Induktion
der
Immuntoleranz,
was
sie
zu
einem
attraktiven
Ziel
für
immuntherapeutische Interventionsstrategien macht [100], [108].
Intensiv erforscht wird hierbei vor allem die Rolle der regulatorischen TZellen in der Entstehung und dem Verlauf von Allergien [155].
Allerdings sind bisher noch nicht alle Einzelheiten auf diesem Gebiet
ausreichend geklärt und manche Zusammenhänge nur unzureichend
verstanden, so dass im Moment noch viele Fragen offen sind. Außerdem
gibt
es
in
den
verschiedenen
Studien
abhängig
vom
jeweiligen
Studiendesign Diskrepanzen, was die endgültige Einordnung der Funktion
und Bedeutung der regulatorischen T-Zellen in den Gesamtmechanismus
zusätzlich erschwert.
Unumstritten ist jedoch, dass die regulatorischen T-Zellen eine zentrale
Position
in
der Kontrolle
des
Immunsystems
einnehmen und
ein
inhibitorisches Potential besitzen [125], [137], [146], [149].
In verschieden Studien konnte gezeigt werden, dass Allergiker deutlich
geringere Mengen allergenspezifischer Tregs im peripheren Blut aufweisen
als Gesunde und das insbesondere während symptomatischer Perioden [8].
19
Zusätzlich ist bei isolierten CD4+ CD25+ T-Zellen von Atopikern die
Fähigkeit, die Proliferation und Zytokinproduktion autologer Responder-TZellen zu unterdrücken, weniger stark ausgeprägt [79].
Auch Hyposensibilisierungsstudien belegen diese Befunde. So wurden nach
zweijähriger SIT bei Pollenallergikern signifikant höhere Mengen an CD4+
CD25+ T-Zellen in der Nasenmukosa gefunden, was mit einer deutlichen
Besserung der klinischen Symptomatik einherging [113], [151].
Die
gezielte
Induktion
versprechender
Ansatz
von
zur
regulatorischen
Therapie
von
T-Zellen
Allergien
ist
ein
und
viel
anderer
Immundysfunktionen. Die immunologische Forschung beschäftigte sich in
den letzten Jahren intensiv mit der Identifizierung und Charakterisierung
regulatorischer T-Zellen („Tregs“) und mittlerweile sind viele verschiedene
Zellpopulationen mit immunregulatorischen Kapazitäten bekannt [138].
Man unterscheidet im Prinzip zwei große Hauptgruppen: natürliche und
adaptive (induzierte, „induced“) Tregs. Natürliche Tregs entstehen im
Thymus und sind das ganze Leben in beinahe konstanten Mengen
vorhanden [21]. Adaptive Tregs unterschiedlicher Eigenschaften entwickeln
sich
erst
unter
bestimmten
Voraussetzungen/Stimulation
(z.B.
Antigenkontakt, IL-10, TGF-β, dendritische Zellen (DCs)) aus CD4+ T-Zellen.
Auch unter den Korezeptor CD8 tragenden T-Zellen konnte eine bestimmte
Subpopulation mit möglicherweise regulatorischem Potential ausgemacht
werden, wobei sie in der Aufrechterhaltung der Homöostase eher eine
untergeordnete Rolle spielen [70].
Abbildung 3 zeigt schematisch die bisher charakterisierten Suppressor TZelltypen im Vergleich zueinander.
20
Abbildung 3: Regulatorische T-Zellen. Das Diagramm zeigt schematisch die bisher
bekannten Hauptpopulationen von CD4+ oder CD8+ regulatorischen T-Zellen sowie ihren
Ursprung und ihre Wirkungsweise. Treg = CD25+ CD4+ natürliche regulatorische T-Zelle,
Th3 = T Helfer 3 Zelle, Tr1 = regulatorische Typ 1-Zelle, CD8+ Tr = CD8+ regulatorische TZelle. In der rechten Spalte sind der Phänotyp und die Wirkungsweise angezeigt. Neuere
Arbeiten zeigen teilweise auch Überlappungen zwischen den genannten Subpopulationen.
Unterstrichen ist die jeweils vorherrschende Art der Suppression (modifiziert nach [83]).
2.4.1. Thymus-generierte, natürliche regulatorische CD4+
CD25+ T-Zellen
Die wohl bekanntesten und am intensivsten erforschten regulatorischen TZellen sind die von Sakaguchi erstmals 1995 beschriebenen natürlich
vorkommenden CD4+ CD25+ T-Zellen (nTregs) [127]. Sie reifen im Thymus
heran, wenngleich die Einzelheiten ihrer Reifung noch nicht geklärt sind [18],
und machen 5-10 Prozent der peripheren CD4+ Zellen aus [31]. Sie stellen
eine früh spezialisierte CD4+ Zelllinie dar mit der Fähigkeit zur eigenen
Selbsterneuerung, was sie von den induzierten Tregs unterscheidet [64].
Als konstitutiv CD25 exprimierende CD25+ Zellen sind sie ab dem dritten
Tag nach der Geburt im Blut nachweisbar [17].
21
Der
momentan
spezifischste
Marker
ist
der
Nachweis
des
Transskriptionsfaktors Forkhead BoxP3 (Foxp3) [44].
CTLA-4
(cytotoxic
T-lymphocyte
antigen-4)
[123],
[132],
die
Oberflächenmoleküle GITR (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor
receptor) [139] und LAG-4 (lymphocyte activation antigen-3) sowie CD62L,
CD45RO und HLA-DR können zu ihrer weiteren Charakterisierung genutzt
werden [80]. nTregs sind in der Lage CD4+ und CD8+ T-Zellen in ihrer
Aktivierung, Proliferation und Effektorfunktion zu supprimieren sowie die
Induktion und Immunglobulinproduktion von B-Zellen zu hemmen, indem sie
die IL-2-Bildung in den Zielzellen inhibieren. Zusätzlich unterdrücken nTregs
die zytotoxische Funktion von Nk- bzw. NkT-Zellen und die Reifung und
Differenzierung von DCs. Durch diese Fähigkeit sind sie maßgeblich an der
Erhaltung der Selbsttoleranz beteiligt [56], [137], [149].
Die Aktivierung der nTregs über den T-Zellrezeptor erfolgt antigenspezifisch,
die Suppression jedoch antigenunspezifisch und zell-zell-kontaktabhängig.
Für ihre optimale inhibitorische Wirkung benötigen sie eine vorausgehende
Stimulation durch professionelle DCs über CD28- und CD154- Korezeptoren
[62], [150].
Vom Phänotyp her zeigen sich aktivierte CD4+ CD25+ T-Zellen (nTregs)
hypoproliferativ. Sie wurden als eine Subpopulation von regulatorischen TZellen identifiziert, die eine Suppression von CD4+ CD25- T-Zellen durch
Zell-Zell-Interaktion und nicht durch Sekretion von Zytokinen (z.B. IL-10 und
TGF-β) bewirken [125]. Nakamura et al. beobachteten jedoch, dass diese
Suppression durch anti-TGF-β aufgehoben werden kann, und zeigten
entgegen den bisherigen Studienergebnissen, dass CD4+ CD25+ T-Zellen
nach adäquater Stimulation die Zytokine IL-10 und TGF-β exprimieren, TGFβ allerdings in größeren Mengen nur zellständig auf der Oberfläche [97].
22
2.4.2. Induzierte Tr1-Zellen und Th3-Lymphozyten
Neben den natürlichen CD25+ Tregs, die bereits bei Verlassen des Thymus
voll ausdifferenziert sind, konnten auch induzierte regulatorische T-Zellen
(iTreg)
identifiziert
werden,
die
sich
erst
in
der
Peripherie
aus
konventionellen CD4+ CD25+ T-Zellen entwickeln [70]. Zu diesen kürzlich
entdeckten
thymusunabhängigen
T-Zellpopulationen
zählen
die
sogenannten Tr1- (T regulatorisch 1) Zellen und die Th3- (T Helfer 3) Zellen
[49], [64]. Im Gegensatz zu den nTregs führen diese iTregs ihre suppressive
Funktion nicht zell-zell-kontaktabhängig aus, sondern durch die Sekretion
der inhibitorischen Zytokine IL-10 und TGF-β [10], [133], [169].
Beide Zelltypen exprimieren weder CD25 noch den Transkriptionsfaktor
Foxp3, sind aber in der Lage sowohl die Th1- als auch die Th2-Antwort zu
unterdrücken. Dies geschieht bei Tr1-Zellen hauptsächlich durch die
Sekretion von IL-10 [51] und bei Th3-Zellen in erster Linie durch TGF-βProduktion [54], [161].
Zu den Voraussetzungen für die Generierung dieser Zellen gehören die
Stimulation
durch
spezifische
Antigene,
die
Anwesenheit
von
immunsuppressiven Zytokinen, wie IL-10 und TGF-β, und die Aktivierung
durch DCs [77], [118], [162].
Zusammen mit den natürlichen Tregs sind sie maßgeblich an der Kontrolle
und der Aufrechterhaltung des immunologischen Gleichgewichts beteiligt.
2.5. Allergenspezifische Immuntherapie als
Behandlungsmöglichkeit
Die spezifische lmmuntherapie (SIT), auch Hyposensibilisierung oder
Allergievakzinierung genannt, stellt neben der Allergenkarenz in der
heutigen Zeit die einzige kausale Behandlungsform von Typ I-Allergien dar
[74]. Insbesondere bei Pollenallergien gilt sie als ein sehr effizientes und gut
etabliertes Verfahren zur Prävention und Therapie [72], weil sie einen
positiven Einfluss auf die Progredienz der allergischen Erkrankung hat und
23
bei Patienten mit allergischer Rhinokonjunktivitis einen Etagenwechsel zum
Asthma hin verhindern kann [23].
Die spezifische Immuntherapie in Form einer subkutanen Injektion mit
ansteigenden Allergendosen geht auf Freeman und Noon aus dem Jahr
1911 zurück [46]. Seitdem wurde die SIT als Therapieoption immer weiter
entwickelt und untersucht, so dass nach derzeitigem Forschungsstand viele
verschiedene Applikationsformen und Therapieschemata möglich sind.
Die klinische Wirksamkeit der spezifischen Immuntherapie konnte in vielen
Forschungsprojekten eindeutig belegt werden [1], [23], [45], [115], so dass
internationale Gremien (WHO) sowie europäische Verbände (EAACI:
European Academy of Allergology and Clinical Immunology) die SIT als
kausale Behandlungsmöglichkeit von IgE-vermittelten Allergien befürworten
[23].
Allerdings sind die Erkenntnisse bezüglich der genauen immunologischen
Wirkungsweise und der Langzeiteffekte noch unvollständig, weshalb weitere
klinische und molekulare Untersuchungen angestrebt werden müssen, um
die ablaufenden Prozesse richtig verstehen zu können.
In immunologischen Studien konnte bisher gezeigt werden, dass die SIT die
allergenspezifische Immunantwort stark beeinflusst [5] (vgl. Abbildung 4).
Die
Hyposensibilisierung
greift
in
die
grundlegenden
Mechanismen
allergischer Krankheitsbilder ein und besitzt daher einen besonderen
Stellwert in der Therapie [72].
Einerseits wurde erkannt, dass während der Hyposensibilisierungstherapie
die vermehrte Produktion von TGF-β und IL-10 in regulatorischen T-Zellen
induziert wird [19]. Beide Zytokine haben einen inhibitorischen Effekt auf die
Th2-Zellen, denen bei der allergischen Pathogenese eine zentrale
Schlüsselfunktion zukommt [16], [73]. Durch die erhöhte Konzentration von
TGF-β und IL-10 wird außerdem die IgE-Produktion in den B-Zellen
gehemmt und ein Klassenwechsel zu IgG und IgA induziert, was die
allergische Reaktion wiederum abschwächt [7], [97].
Ferner supprimieren diese Zytokine direkt die an der Typ I-Reaktion
beteiligten Entzündungszellen, wie Mastzellen, basophile und eosinophile
24
Granulozyten
und
unterdrücken
dadurch
die
Freisetzung
der
Entzündungsmediatoren Histamin und Leukotrien [165]. Besonders IL-10
beeinflusst die Proliferationsinduktion von eosinophilen Granulozyten
günstig, indem es die Freisetzung von IL-5 aus CD4+ T-Zellen verhindert [5],
[7], [110].
Abbildung 4: Allergische Immunantwort und Wirkungsweise der subkutanen spezifischen
Immuntherapie (SCIT). Th2-Zellen induzieren durch eine IL-5-Produktion die von
eosinophilen Granulozyten geprägte allergische Entzündung und mit Hilfe von IL-4 und IL13 die IgE-Synthese von B-Lymphozyten. Die SCIT hemmt die Funktion der Th-Zellen durch
vermehrte Ausschüttung der Zytokine TGF-β (Wachstumsfaktor „transforming growth factor
beta“) und IL-10 aus regulatorischen Tr1-artigen Zellen (Immunmodulation). Daneben wird
eine gegenregulatorische Th1-Immunantwort induziert (Immundeviation): IL-12 aus
antigenpräsentierenden Zellen stimuliert die IFN-γ-Produktion der Th1-Zellen und hemmt
dadurch
die
IgE-Bildung
und
die
Differenzierung
von
Th2-Zellen.
Abbildungsmerkmale: Kreis mit +: induziert; Kreis mit –: inhibiert; rote Kodierung:
verstärkt allergische Immunantwort (Soforttypallergie); gelbe Kodierung:
reduziert
allergische Immunantwort (modifiziert nach [74]).
Andererseits
besteht
gegenregulatorische
die
Annahme,
Th1-Immunantwort
dass
durch
die
eingeleitet
SIT
wird.
eine
Die
antigenpräsentierenden Zellen (APC) produzieren dabei vermehrt IL-12,
welches die IFN-γ-Ausschüttung der Th1-Zellen stimuliert [67].
25
Hierdurch wird die IgE-Freisetzung aus B-Zellen gehemmt und die
Differenzierung von Th2-Lymphozyten reduziert. Langfristig resultieren aus
der Veränderung des Zytokinmusters eine Verminderung der IL-4 und IL-5
abhängigen IgE-Produktion [39], [40], [135] sowie ein Anstieg der IL-10 und
TGF-β-vermittelten IgG-Bildung [97], [114].
Neben
einer
Verringerung
der
Eosinophilen-Zahl
während
der
Pollenflugsaison wurde eine reduzierte Mastzellen- und EosinophilenMigration beobachtet [37], [47], [102].
Die folgende Tabelle fasst die Änderungen der immunologischen Parameter
vereinfacht zusammen [15].
Vor SIT
Nach SIT
Proliferation der T-Zellen
+
-
Th1 (IFN-γ)
-
+
Th2 (IL-4, IL-5)
+
-
Treg (IL-10, TGF-β)
-
+
IgG/IgG4
-
+
IgE
+
-
Mastzellen/Eosinophile
+
-
Histamin-/Leukotrienausschüttung
+
-
Tabelle 2: Änderung der immunologischen Parameter durch die SIT
All
diese
Effekte
Ungleichgewichts
in
bewirken
eine
Verschiebung
Richtung
Th1-Immunantwort
des
und
Th2-Th1stellen
die
ursprüngliche Toleranz des Immunsystems wieder her - man spricht auch
von Th2-Th1-Switch.
Die Anwendungen der spezifischen Immuntherapie erfolgt in Kombination
mit anderen Therapiestrategien wie Allergenkarenz, Pharmakotherapie und
Patientenschulung, um bei den Betroffenen eine Symptomlinderung zu
erreichen. Sie ist indiziert bei Patienten mit diagnostisch gesicherte IgEvermittelte
Typ
I-Allergie
(Pricktest,
In-vitro-Diagnostik)
und
klinisch
26
relevanten Beschwerden, die damit in Zusammenhang stehen (zum Beispiel
Rhinokonjunktivitis,
Asthma
bronchiale).
Eine
weitere
wesentliche
Voraussetzung für die Durchführung einer SIT stellt die Verfügbarkeit von
standardisierten, qualitativ hochwertigen Allergenextrakten dar, deren
Wirksamkeit für die jeweilige Indikation nachgewiesen sein muss [73], [74].
Im Hinblick auf die Anwendung müssen Allergenextrakte durch einen
Facharzt mit allergologischen Kenntnissen in Dosis und Applikationsart auf
die klinischen Beschwerden des Patienten abgestimmt werden. Beim
therapeutischen Einsatz der spezifischen Immuntherapie ist es außerdem
notwendig wesentliche Kontraindikationen zu berücksichtigen, um die
Entwicklung von unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden.
Als absolute Kontraindikation gelten maligne Tumorleiden mit aktuellem
Krankheitswert,
schwerwiegende
Immundefekte
einschließlich
Immunsuppression sowie eine unzureichende Compliance des Patienten
[75].
Relative Kontraindikationen ergeben sich im Zusammenhang mit folgenden
Erkrankungen:
•
Funktionell
relevante
Veränderungen
am
Respirationssystem
(besonders persistierendes Asthma und Atemwegsobstruktion mit
FEV1 < 70%)
•
Kardiovaskuläre Erkrankungen und Hyperthyreose mit erhöhtem
Risiko von Nebenwirkungen nach Adrenalingabe
•
Lokale und systemische Anwendung von Beta-Blockern und ACEHemmern
•
Chronische Infektionskrankheiten (z.B. Tuberkulose), chronische
Entzündungsprozesse
im
Rahmen
von
rheumatischen
oder
Autoimmun-Erkrankungen
•
Schwerwiegende Allgemeinerkrankungen (z.B. Niereninsuffizienz,
Lebererkrankungen)
•
Schwangerschaft
27
2.6. Allergenpräparate und Therapie-Schemata der SIT
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existieren eine Vielzahl verschiedener
Behandlungsformen und Allergenpräparate, um bei Allergikern mit der
spezifischen Immuntherapie eine symptomatische Verbesserung und
präventive Effekte zu erzielen. Die größte Rolle spielt nach wie vor die
subkutane SIT, bei der ein Allergenextrakt repetitiv in ansteigenden Dosen
subkutan injiziert wird. Die Allergene werden nativ oder chemisch modifiziert
als Allergoide in Form von wässrigen Extrakten oder physikalisch gekoppelt
als Semi-Depot-Präparate gegeben [75].
Prinzipiell wird zwischen gereinigten „nativen“ Extrakten mit unveränderter
Allergen-Konformation und chemisch modifizierten Präparaten, den so
genannten
Allergoiden,
unterschieden.
Letztere
sollen
durch
ihre
Modifizierung mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd eine Reduktion der IgEspezifischen Epitope erfahren bei unveränderter Toleranzinduktion durch die
spezifischen T-Zell-Epitope der Allergene [75].
Neben wässrigen Extrakten kommen in Europa vorwiegend SemidepotPräparate zum Einsatz, bei denen native oder modifizierte Allergene
physikalisch an eine Trägersubstanz wie Aluminiumhydroxid, Tyrosin,
Alginat oder Calciumphosphat gekoppelt werden. Hierdurch wird eine
verzögerte, damit sicherere und besser verträglichere Allergenfreisetzung
erreicht, weil hohe systemische Allergenkonzentrationen im direkten
Anschluss an die Applikation vermieden werden und die Gefahr von
schwerwiegenden Nebenwirkungen (z.B. anaphylaktischer Schock) sinkt
[75].
Ein wichtiger Fortschritt in der Entwicklung von Allergen-Präparaten war die
Addition
von
Adjuvantien
(z.B.
Monophosphoryl
Lipid
A)
zu
den
Allergenextrakten, wodurch die immunmodulatorische Wirkung der Allergene
unterstützt und verstärkt wird [59]. MPL-A ist chemisch ein detoxifiziertes
Endotoxin aus Salmonella minnesota, welches eine Th1-Antwort induzieren
kann, und unterstützt damit die Wiederherstellung der Immuntoleranz [13],
[72], [143], [163].
28
Die SIT erzielt bei Birkenpollenallergikern in Abhängigkeit von der klinischen
Symptomatik, der Eignung des Patienten und vom verwendeten Präparat
sehr gute Erfolge, wobei sich nasale Symptome häufig besser reduzieren
lassen als konjunktivale Beschwerden oder ein orales Allergiesyndrom bei
pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie [59], [74]. Bei allergischem Asthma
bronchiale hat die SIT sowohl einen positiven Einfluss auf die klinische
Symptomatik als auch auf den Bedarf an antiasthmatischer Medikation und
die bronchiale Hyperreagibilität. Zudem kann die Hyposensibilisierung einen
Etagenwechsel
vermeiden,
wenn
noch
keine
irreversiblen
Sekundärveränderungen an den Atemwegen vorliegen [1].
2.7. Hintergründe und Ziele der Dissertation
Die spezifische Immuntherapie ist die einzig kausal wirksame Therapie bei
Typ I-allergischen Erkrankungen. Durch repetitive Applikation eines
Allergens wird eine allergenspezifische Toleranz mit Reduktion der
allergischen Symptome wie Rhinokonjunktivitis oder Asthma erreicht. Trotz
Jahrzehnte
langer
Anwendung
sind
die
zugrunde
liegenden
immunologischen Wirkmechanismen nicht vollständig aufgeklärt.
Definierte Subtypen von CD4+ T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in der
Aufrechterhaltung der Immunhomöostase. Die so genannten regulatorischen
T-Zellen sind dazu in der Lage, die Aktivierung und Effektorfunktion von
anderen T-Zellen aktiv und dominant zu unterdrücken. Am besten
charakterisiert sind die CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorischen T-Zellen, die
im menschlichen Immunsystem bei der spezifischen Immuntherapie eine
wichtige Schlüsselposition einnehmen [31], [62], [138], [146].
Über die Rolle der humanen CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen bei
Birkenpollenallergie liegen bislang wenige Ergebnisse vor, insbesondere
bezüglich der Effekte einer präsaisonalen Kurzzeittherapie mit MLP-A als
Wirkverstärker (Pollinex Quattro®) im Vergleich zu einem traditionellen
perennialen Behandlungsschema (ALK SQ Depot®) [48]. Der Nutzen beider
Impfstoffe ist zwar in Einzelstudien gegenüber Placebo belegt [1], [27], [33],
[34], [35], [36], [39], [75], [82], [121], aber es liegen noch keine Daten vor, ob
29
die klassische perenniale SIT mit vielen monatlichen Injektionen durch eine
präsaisonale Kurzzeittherapie mit nur vier Injektionen vor der Saison
gleichwertig ersetzt werden kann.
Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Rolle der regulatorischen TZellen bei der Induktion allergenspezifischer Toleranz durch unterschiedliche
Therapieschemata der SIT (Kurzzeitschema eines Thyrosin-adsorbierten
Allergoids
mit
Monophosphoryl
Lipid
A
(Pollinex
Quattro®)
versus
perenniales Langzeitschema mit naiven Allergenen mit AIOH3 (ALK SQ
Depot®)) zu untersuchen. Insbesondere sollten die Induktion regulatorischer
T-Zellen
und
deren
suppressive
Wirkung
auf
allergenspezifische
Effektorzellen unter Anwendung der zwei verschiedenen SIT-Schemata bei
definierter Typ I-Allergie auf Birkenpollenallergie genauer charakterisiert
werden.
Eine weitere zentrale Fragestellung war zudem, ob die Kurzzeittherapie mit
Pollinex Quattro® die gleichen Therapieeffekte erzielt wie die perenniale SIT
mit ALK SQ Depot® oder ob es wesentliche Unterschiede in Bezug auf das
Ansprechen der Behandlung gibt. Ziel war es herauszufinden, ob durch die
Zugabe des Adjuvans Monophosphoryl Lipid A die Behandlungsdauer bei
gleichem Therapieeffekt verkürzt werden kann.
30
3. Material und Methoden
3.1. Charakterisierung der Patienten
Für die ex vivo Isolation und die Charakterisierung von CD4+ CD25+
regulatorischen T-Zellen unter spezifischer Immuntherapie mit ALK SQ
Depot® versus Pollinex Quattro® wurden zunächst geeignete Patienten mit
Typ I-Allergie auf Birkenpollen in der Allergieambulanz der Hautklinik
Universitätsklinikum Erlangen und sechs Patienten in der Facharztpraxis für
Innere Medizin und Allergologie von Dr. Laumen, Dr. Wiederhold und Dr.
Schratz rekrutiert.
Inklusionskriterien waren neben einer positiven Anamnese, Nachweis einer
Soforttyp-Allergie auf frühblühende Bäume im Pricktest und in den CAPFEIA Befunden sowie die Teilnahmebereitschaft der Patienten. Einholen der
Einwilligungen erfolgte mündlich und schriftlich. Ein positives Ethikvotum der
lokalen Ethikkommission (Bearbeitungs-Nr. 2375) liegt vor.
Die Indikation zur Hyposensibilisierung wurde nach den Empfehlungen der
Weltgesundheitsorganisation
und
nach
positiver
nasaler
Provokation
gestellt. Gemäß den Leitlinien bildete der Zusammenhang zwischen IgEvermittelter
Sensibilisierung
auf
Pollenallergene
und
der
klinischen
Symptomatik die Grundlage für die spezifische Immuntherapie. Chronische
Infekte, Sekundärveränderungen am Reaktionsorgan (z.B. Emphysem,
Bronchiektasen),
Autoimmunkrankheiten,
tuberkulo-allergische
Augenerkrankungen, Immundefekte, Behandlung mit Immunsuppressiva, ßBlockern
oder
ACE-Hemmern,
Störungen
des
Tyrosinstoffwechsels,
Schwangerschaft und Lebensalter unter 18 Jahren führten zum Ausschluss
der Patienten. Außerdem durfte bei akuter Infektion, fieberhaften Zuständen
und schweren Asthmaanfällen die nächste Hyposensibilisierungsinjektion
erst 24 bis 48 Stunden nach Normalisierung des Gesundheitszustandes
erfolgen.
Als Einschlusskriterien für die Studie galten also neben der Indikation der
spezifischen Immuntherapie entsprechend der Weltgesundheitsorganisation
und dem Fehlen von Kontraindikationen eine gesicherte Sensibilisierung auf
31
das
Hauptallergen
der
Birke
rBet
v
1
(CAP-Fluoreszenz-Enzym-
Immunoassay = CAP-FEIA).
Insgesamt wurden im Rahmen der Hyposensibilisierungsstudie 24 den
Einschlusskriterien entsprechende Patienten, die nach schriftlicher und
mündlicher Aufklärung freiwillig an der Studie teilnahmen, bezüglich der
Rolle der regulatorischen CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen untersucht.
Während die eine Hälfte der Allergiker eine ganzjährige Langzeittherapie mit
dem Impfstoff ALK SQ Depot® Birke (ALK-SCHERAX Arzneimittel GmbH,
Hamburg, Deutschland) erhielt, wurde die andere Hälfte der Patienten nach
einem präsaisonalen Kurzzeitschema mit dem Impfstoff Pollinex Quattro®
Birke (Bencard Allergy GmbH, München, Deutschland) behandelt, wobei
hierbei nur vier Hyposensibilisierungsinjektionen vor der Pollenflugzeit
verabreicht werden. Genauere Informationen über die Zusammensetzung
und Applikation beider Injektionsformen werden in Kapitel 3.2. erläutert.
Im Verlauf der jeweiligen spezifischen Immuntherapie erfolgten zu vier
definierten Zeitpunkten die Gewinnung und Analyse der CD4+ CD25+
Foxp3+ regulatorischen T-Zellen, wobei das klinische Ansprechen zusätzlich
mittels nasaler Provokation vor Einleitung der Therapie und nach Erreichen
der Erhaltungsdosis bestimmt wurde. Die Blutentnahmen fanden nach
folgendem Schema statt:
ALK SQ Depot® (s. Abb. 5):
Zeitpunkt 1: vor SIT 1
Zeitpunkt 2: 2 Wochen nach 2. Erhaltungsdosis (= bei SIT 14)
Zeitpunkt 3: 6 Monate nach Behandlungsbeginn (nach dem Pollenflug)
Zeitpunkt 4: 12 Monate nach Behandlungsbeginn (vor nächstem Pollenflug)
Pollinex Quattro® (s. Abb. 6):
Zeitpunkt 1: vor SIT 1
Zeitpunkt 2: 2 Wochen nach 2. Erhaltungsdosis (= SIT 4 = Abschluss der
Behandlung)
Zeitpunkt 3: 6 Monate nach Behandlungsbeginn (nach dem Pollenflug)
Zeitpunkt 4: 12 Monate nach Behandlungsbeginn (vor nächstem Pollenflug)
32
®
Abbildung 5: Schema der ganzjährigen Therapie (ALK SQ Depot )
®
Abbildung 6: Schema der präsaisonalen Kurzzeittherapie (Pollinex Quattro )
33
Den Patienten wurde bei den vier Untersuchungszeitpunkten jedes Mal 160
ml Heparin-Vollblut durch Punktion einer Vene der Ellenbogeninnenseite
entnommen und anschließend im Labor für die weitere Analyse aufbereitet
(siehe Kapitel 3.5.).
3.2. Charakterisierung der Impfstoffe
Basierend auf vorausgegangenen in domo durchgeführten Untersuchungen
[85] beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Vergleich von Induktion und
Wirkung der CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen im Verlauf der
spezifischen Immuntherapie bei zwei unterschiedlichen Impfschemata. Die
präsaisonale Kurzzeittherapie mit einem Tyrosin-gekoppelten Allergoid und
MPL-A als Wirkverstärker (Pollinex Quattro®) wurde der perennialen
Langzeittherapie mit einem Impfstoff mit nativen Allergenen gebunden an
Aluminiumhydroxid (ALK SQ Depot®) gegenübergestellt. Beide Impfvakzine
werden
für die
Hyposensibilisierungstherapie
bei Typ
I-allergischen
Erkrankungen als kausal wirksame Behandlung eingesetzt, unterscheiden
sich aber hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und dem Verabreichungsplan.
Bei Pollinex Quattro® handelt es sich um einen innovativen, 1999
eingeführten
Impfstoff,
der
tyrosin-adsorbierte,
chemisch
modifizierte
Allergenextrate zur subkutanen Injektion enthält. Insgesamt werden nur vier
Injektionen vor der Pollensaison verabreicht, wobei sich die Allergendosis
von 300 SU/ml bei der 1. Impfung über 800 SU/ml bei der 2. Impfung auf
2000 SU/ml bei der 3. und 4. Impfung steigert. Als Adjuvans kommt in
diesem Impfstoff MPL (= Monophosphoryl Lipid A), die gereinigte und
detoxifizierte
Lipid
A-Komponente
aus
dem
Lipopolysaccharid
von
Salmonella minnesota R 595, in einer Konzentration von 50 µg/ml zum
Einsatz.
Das Semidepotpräparat ALK SQ Depot® setzt sich dagegen aus selektiv
gereinigten,
nicht
modifizierten
Allergenen
und
dem
Adjuvans
Aluminiumhydroxid zusammen und wird ebenfalls subkutan injiziert. Der
Impfstoff wird über einen Zeitraum von circa 13 Wochen auf die
Erhaltungsdosis von 100.000 SQ-Einheiten aufdosiert und anschließend
34
perennial als Langzeittherapie in gleich bleibender Konzentration alle vier bis
acht Wochen verabreicht. Um bestmögliche Therapieerfolge zu erzielen,
wird die spezifische Immuntherapie bei beiden Impfstoffen insgesamt für
einen Zeitraum über drei bis fünf Jahre empfohlen.
3.3. Puffer und Medien
• A-Medium (500 ml RPMI 1640 without Glutamine (BioWhittaker Europe,
Verviers,
Belgien),
(Separation
aus
5
ml
hitzeinaktiviertes
Blutproben
Universitätsklinikum
Erlangen,
der
vgl.
unverdünntes
Studienteilnehmer,
Kapitel
3.5.),
5
ml
Plasma
Hautklinik
Glutamin
(BioWhittaker), 5 ml Pen-Strep (= Penicillin/Streptomycin, 10.000 U
Penicillin/ml,
10
mg Streptomycin/ml,
Cat.No.:
P06-07100,Lot.No.:
530403, PAN, Biotech GmbH, Aidenbach, Deutschland))
• DMSO (= Dimethyl Sulfoxide, Lot.-Nr.: 101K00291, EC No.: 200-664-3,
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland)
• DPBS (= phosphate buffered saline; BioWhittaker Europe, Verviers,
Belgien)
• DPBS/EDTA-Lösung (500 ml DPBS (BioWhittaker Europe, Verviers,
Belgien), 1 ml 0,5-molare EDTA-Lösung (AccuGENE, BioWhittaker,
Walkersville, Maryland, USA))
• EDTA-Lösung (= disodium ethylenediamine tetraacetic acid; AccuGENE,
BioWhittaker, Walkersville, Maryland, USA)
• Einfriermedium (10% DMSO (= Dimethyl Sulfoxide, Lot.-Nr.: 101K00291,
EC
No.:
200-664-3,
Sigma-Aldrich
Chemie
GmbH,
Steinheim,
Deutschland), 90% FCS (= Foetales Calf Serum Gold; Cat.No.: A15-649,
Lot.No.: A01120-437, PAA Laboratorie GmbH, Pasching Österreich))
• FACS-Puffer (500 ml DPBS, 5 ml FCS (= Foetales Calf Serum Gold,
Cat.No.: A15-649, Lot.No.: A01120-437, PAA Laboratorie GmbH,
Pasching Österreich), 1 ml 10%-Natriumazid-Lösung, pH = 7,3)
• FCS (= Foetales Calf Serum Gold; Cat.No.: A15-649, Lot.No.: A01120437, PAA Laboratorie GmbH, Pasching Österreich)
35
• 2% Formaldehydlösung = FACS-Fix (2,7 ml 37%-Formaldehydlösung
(Art.-Nr.: 4979.1, Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland), 47,3
ml DPBS)
• Glutamin
(=
L-Glutamine,
Cat.No.:
BE17-605E,
Lot.No.:
3MB0031,BioWhittaker, Verviers, Belgien)
• Heparin Natrium (= Liquemin N 5000; Hersteller: Roche, Basel, Schweiz)
• HSA (= Human Serum Albumin, Kabi 20%, salzarm, Octapharm GmbH,
Langenfeld, Deutschland)
• ³H-Thymidin-Lösung ( 0,5 ml Methyl-³H-Thymidin (185 MBq = 5 mCi)
aequeous solution containing 19% Ethanol sterilized 25 Ci/mmol
(Amersham pharmacia biotech, Little Chalfont, UK), 9,5 ml x vivo 20
complete + 5% Serum)
• Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen)
• Lysispuffer
• MACS-Puffer (500 ml DPBS, 12,5 ml HSA) (HSA= Human Serum
Albumin, Kabi 20%, salzarm, octapharm, Langenfeld, Deutschland)
• Mercapto-Ethanol
• 10% Natriumazid-Lösung (10 g NaN³, 100 ml Aqua dest.)
• Pen-Strep (= Penicillin/Streptomycin, 10.000 U Penicillin/ml, 10 mg
Streptomycin/ml, Cat.No.: P06-07100,Lot.No.: 530403, PAN, Biotech
GmbH, Aidenbach, Deutschland)
• Plasma (Separation aus Blutproben der Studienteilnehmer, Hautklinik
Universitätsklinikum Erlangen, vgl. Kapitel 3.5.)
• Pool-Serum (= Human-Serum, Cat.No.: 14-402E, Lot.No.: 017642,
BioWhittaker, Walkersville, Maryland, USA)
• RPMI 1640 without Glutamine (BioWhittaker Europe, Verviers, Belgien)
• 0,4%-Trypanblau-Lösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)
• Türk’sche Lösung (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz, No. 93770)
• X-vivo-20 (BioWhittaker, Verviers, Belgien)
• X-vivo-20 complete + 5% Serum (250 ml X-vivo-20 (BioWhittaker), 5 ml
Glutamin (= L-Glutamine, Cat.No.: BE17-605E, Lot.No.: 3MB0031,
BioWhittaker, Verviers, Belgien), 5 ml Pen-Strep, 12,5 ml Pool-Serum
(BioWhittaker))
36
3.4. Antikörper und Proteine
• Anti-Biotin MicroBeads (CD4+ T-Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Deutschland)
• Anti-CD3-Antikörperlösung (CD3, purified mouse anti-human monoclonal
antibody, Katalog-Nummer 555329, BD PharMingen, San Diego, USA)
• Anti-CD28-Antikörperlösung
(CD28,
purified
mouse
anti-human
monoclonal antibody, Katalog-Nummer: 555725, BD PharMingen, San
Diego, USA)
• Bet v 1a Lot#21 (BIOMAY Produktions- und Handelsgesellschaft m. b. H.,
Wien, Österreich)
• Biotin-Antikörper Cocktail (CD4+ T-Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Deutschland)
• CD25 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland)
• Cy-Chrome anti-human CD3 (Nr.: 555334, PharMingen, Becton Dickinson
Company)
• Cy-Chrome Mouse IgG1 (Nr.: 555750, PharMingen, Becton Dickinson
Company)
• FITC anti-human CD4 (Nr.: 555346, PharMingen, Becton Dickinson
Company)
• FITC Mouse IgG1 (Nr.: 555748, PharMingen, Becton Dickinson Company)
• GM-CSF (Leukine, Berlex Laboratories Inc., Richmond, CA 94804, USA)
• IL-1β (Art.-Nr. 1011, Cell Genix, Technologie Transfer GmbH, Freiburg,
Deutschland)
• IL-4 (Art.-Nr. 1003, Cell Genix, Technologie Transfer GmbH, Freiburg,
Deutschland)
• IL-6 (Art.-Nr. 1004, Cell Genix, Technologie Transfer GmbH, Freiburg,
Deutschland)
• PE anti-human CD25 (Nr.: 555432, PharMingen, Becton Dickinson
Company)
• PE Mouse IgG1 (Nr.: 555749, PharMingen, Becton Dickinson Company)
• PGE2 (= Minoprostin E2 5000 µg, Wirkstoff: Dinoproston, Pharmacia
N.V./S.A., Puurs, Belgien)
37
• TNFα−1a
(Beromun,
Wirkstoff:
Tasonermin,
Boehringer-Ingelheim
International GmbH, Ingelheim am Rhein, Deutschland)
3.5. Lymphoprep-Gradient aus Heparin-Vollblut
Zu jedem der definierten Untersuchungszeitpunkte (s. Abb. 7) wurde den
Patienten in der Allergieambulanz 160 ml Vollblut mit Hilfe von acht
heparinisierten 20 ml-Spritzen entnommen und anschließend zu gleichen
Teilen à 20 ml auf acht 50 ml-Röhrchen (Falcon, Becton Dickinson Labware,
New Jersey, USA) verteilt, in die vorher jeweils 10 ml ungekühltes DPBS
vorgelegt war. Um die Gerinnung des Blutes bei der Aufbereitung zu
verhindern, wurden die Monovetten vorher mit 800 µl Liquemin N 5000
(Wirkstoff:
Heparin-Natrium,
Hersteller:
Roche,
Basel,
Schweiz)
als
Antikoagulans präpariert.
Behandlungsschema SIT und BE
ALK SQ Depot
monatl.
Injektion
®
®
monatl.
Injektion
Pollinex Quattro
monatl.
Injektion
Injektion # 1
monatl.
Injektion
Inj. #4 / #14
vor
SITBeginn
Erhaltungs
-dosis
BE 1
2 Wo. nach 2.
Erhaltungsdosis
BE 2
6 Mo.
nach
SIT-
12 Mo.
nach
SIT-
BE 3
BE 4
Abbildung 7: Behandlungsschema der SIT und Blutentnahmen bei ALK SQ Depot
und Pollinex Quattro
®
®
38
Das so gewonnene Heparin-Vollblut wurde jeweils mit 13 ml Lymphoprep
(Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen) unterschichtet und anschließend in
der Megafuge 2,0 RS von Heraeus zentrifugiert (1.500 rpm / 30 min / 22 °C).
10 ml der Serumschicht, die oberhalb des Lymphozytengradienten und der
Lymphoprepschicht entstanden war, wurden mit Hilfe einer 5 ml-Pipette in
ein 15 ml-Falcon überführt und als Plasma bei -20°C bis zur weiteren
Verwendung tiefgefroren.
Der Lymphozytengradient, der sich nach Zentrifugation zwischen Serumund Lymphoprepschicht gebildet hatte, wurde mit Hilfe einer 5 ml-Pipette
abgezogen und auf drei neue 50 ml-Röhrchen verteilt, die vorher mit 5 ml
DPBS/EDTA befüllt worden waren.
Nach der Isolation der PBMCs, bei der teilweise auch Serum und
Lymphoprep überführt worden waren, wurden die Röhrchen mit DPBS/EDTA
auf einen Gesamtinhalt von 50 ml aufgefüllt und wieder zentrifugiert (Rotanta
460 R Zentrifuge von Hettich, 1.150 rpm / 15 min / 4 °C). Die dabei
entstandenen Überstände wurden mit einer Glaspipette abgesaugt und
verworfen. Die drei vorhandenen Zellpellets wurden in insgesamt 50 ml
DPBS resuspendiert und in ein Falcon gepoolt.
Anschließend wurde die Zahl der PBMCs bestimmt, indem 40 µl
Zellsuspension mit 40 µl Türk’scher Lösung (Fluka Chemie GmbH, Buchs,
Schweiz, No. 93770) gemischt wurden. Dieses Gemisch wurde in eine mit
Deckglas (Deckgläser geschliffen 20 x 26 mm, Carl Roth GmbH & Co.,
Karlsruhe, Deutschland) bestückte Neubauer-Zählkammer (Zählkammer
Neubauer-improved, Tiefe 0,1 mm, Fläche 0,0025 mm², Art.-Nr. 3408100104, Hirschmann Laborgeräte, Deutschland) gegeben, die unter dem
Mikroskop (Axiostar, Zeiss, Jena, Deutschland) ausgezählt wurde.
Nach dem Zählen der T-Zellen wurde die Zellsuspension zum wiederholten
Mal zentrifugiert (Rotanta 460 R Zentrifuge von Hettich, 1000 rpm / 10 min /
4 °C) und der Überstand mit einer Glaspipette abges augt. Dem Pellet wurde
so viel MACS-Puffer hinzugefügt, dass eine Million Zellen in 4 µl MACSPuffer gelöst waren. Daraufhin wurden für die FACS-Messung 500.000
PBMCs, was einer Menge von 2µl Zellflüssigkeit entsprach, in einem
39
Eppendorfcup mit 500 µl FACS-Puffer vermischt und bis zum weiteren
Gebrauch auf Eis gestellt.
3.6. CD4-Negativ-Selektions-MACS
Nachdem 500.000 Zellen für die FACS-Färbung bei Seite genommen
worden waren, wurde den übrigen in MACS-Puffer gelösten PBMCs pro eine
Million Zellen 1 µl Biotin-Antikörper-Cocktail (CD4+ T-Cell Isolation Kit,
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) hinzugegeben und 10 min
lang bei 4 °C im Kühlschrank inkubiert. Nachdem pro 1 Million Zellen weitere
3 µl MACS-Puffer dazukamen, wurde die Zellsuspension mit Anti-Biotin
MicroBeads (CD4+ T-Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Deutschland) vermischt, wobei für eine Million Zellen 2 µl MicroBeads
verwendet wurden. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei 4 °C wurde
das Falcon mit mindestens der 10 bis 20-fache Menge MACS-Puffer befüllt
und anschließend zentrifugiert (Rotanta 460 R Zentrifuge von Hettich, 1000
rpm / 5 min / 4 °C). Während der Überstand verworfe n wurde, kamen beim
Pellet pro eine Million Zellen 5 µl MACS-Puffer hinzu.
Im nächsten Schritt wurden die markierten CD4- Zellen mit Hilfe einer MACS
LS Separation Column (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) von
den unmarkierten CD4+ Zellen getrennt. Für diesen Isolationsvorgang wurde
die Säule zunächst in den Magneten des Systems gesteckt und mit 3 ml
MACS-Puffer gespült. Nachdem daraufhin die Zellsuspension auf die Säule
gegeben worden war, wurde zweimal mit 3 ml Puffer nachgespült und der
Durchfluss in einem neuen mit CD4+ beschrifteten 15 ml-Falcon gesammelt
(= Ansatz 1; Erklärung: zuerst passiert die CD4+ Fraktion die Säule, da es
sich in diesem Falle um eine Negativ-Selektion handelt). Nach Entfernung
der Säule aus dem Magneten erfolgte die Separation der CD4- T-Zellen in
ein zweites 15 ml-Röhrchen mit der Beschriftung CD4- (= Ansatz 2), indem 5
ml MACS-Puffer mit dem Stempel durch die LS Column gedrückt wurden.
Als Nächstes wurde die Zahl der CD4+ und CD4- T-Zellen mit Hilfe der
Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop bestimmt, indem 40 µl
Zellsuspension mit 10 µl Trypanblau vermischt wurden. Der Zählvorgang
40
selbst lief nach dem gleichen Prinzip ab, wie oben bereits beschrieben
(siehe Kapitel 3.5). Um das Zählen der CD4- Zellen zu erleichtern, wurden
diese vorher mit MACS-Puffer verdünnt, indem das Falcon 2 auf einen
Gesamtinhalt von 12 ml aufgefüllt wurde.
Im Anschluss wurden von den CD4+ T-Zellen 3 Millionen Zellen entnommen
und in ein weiteres 15 ml-Falcon mit der Aufschrift „bulk“ (= Ansatz 3)
überführt. Nachdem die drei Röhrchen zentrifugiert (Rotanta 460 R
Zentrifuge von Hettich, 1.000 rpm / 5 min / 4 °C) u nd die Überstand
verworfen worden waren, wurden zuerst die CD4+ „bulk“ T-Zellen (= Ansatz
3) in 3 ml X-vivo-20 complete + 5% Serum resuspendiert und bei 4 °C bis zu
ihrer weiteren Verwendung aufbewahrt (vgl. Kapitel 3.10.). Die Beschreibung
der Weiterbearbeitung von Pellet 1 und 2 erfolgt an späterer Stelle im Text
(siehe Kapitel 3.7. bzw. Kapitel 3.9.).
3.7. CD25-Positiv-Selektions-MACS
Nach
dem
Arbeitschritt
CD4-Negativ-Seperationsvorgang
die
CD25-
T-Zellen
durch
wurden
ein
im
nächsten
positives
MACS-
Selektionsverfahren von den CD25+ T-Zellen getrennt. Hierfür wurden je
eine Million CD4+ T-Zellen von Ansatz 1 in 8 µl MACS-Puffer aufgenommen
und dann mit 2 µl CD25 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Deutschland)
pro
1
Million
Zellen
versetzt.
Daraufhin
wurde
die
Zellsuspension bei 4 °C für 15 min inkubiert und an schließend mit der 10bis 20-fachen Menge MACS-Puffer vermischt, was in etwa einem
Gesamtinhalt von 2 ml entsprach. Nach erneuter Zentrifugation (Rotanta 460
R Zentrifuge von Hettich, 1.000 rpm / 5 min / 4 °C) und Verwerfen des
Überstandes, wurde dem Pellet pro 1 Million Zellen zum wiederholten Mal 5
µl MACS-Puffer hinzugefügt. Die Auftrennung der CD4+ T-Zellen in CD25+
und CD25- wurde mit Hilfe einer MS Separation Column (Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Germany) durchgeführt und erfolgte nach ähnlichem
Prinzip wie das oben genannte Negativ-Selektions-MACS (siehe Kapitel
3.6.).
41
Nachdem die MS-Säule in den Magneten des Systems gesteckt und mit 3 ml
MACS-Puffer gespült worden war, wurde die Zellsuspension auf die Säule
gegeben und in einem neuen 15 ml-Falcon, beschriftet mit CD25- (= Ansatz
4), aufgefangen. Daraufhin wurde zweimal mit 1 ml MACS-Puffer
nachgespült und das Falcon 4 auf insgesamt 11 ml Gesamtinhalt aufgefüllt,
um die Zellzählung durch den Verdünnungsvorgang zu vereinfachen. Dann
wurde die Säule aus dem Magneten entnommen und auf ein weiteres 15 mlRöhrchen (beschriftet mit CD25+ (= Ansatz 5)) gesetzt. Anschließen wurden
2 ml MACS-Puffer auf die Säule gegeben und mit dem Stempel
durchgedrückt, so dass sich im Falcon 5 nun die isolierten CD25+ T-Zellen
befanden. Als Nächstes wurde die Zahl der CD4+ CD25- und der CD4+
CD25+ T-Zellen unter Verwendung von Trypanblau in gewohnter Weise
bestimmt (siehe oben).
Nach Zentrifugation von Ansatz 4 und 5 (Rotanta 460 R Zentrifuge von
Hettich, 1000 rpm / 5 min / 4 °C) und Verwerfen der Überstände wurden die
Zellpellets in X-vivo-20 complete + 5% Serum resuspendiert, so dass 1
Million Zellen in 1 ml Medium gelöst waren, und bei 4 °C bis zur weiteren
Bearbeitung aufbewahrt.
3.8. FACS mit PBMCs, CD4+ CD25- und CD4+ CD25+ T-Zellen
Um sicher zu stellen, dass im MACS-Selektionsverfahren jeweils die
richtigen T-Zellen in den Falcons 3, 4 und 5 isoliert worden waren, fand im
Anschluss an die Durchflusszytometrie als Qualitätskontrolle eine FACSMessung der PBMCs und der CD4+ CD25- bzw. CD4+ CD25+ T-Zellen
statt. Zunächst wurden sieben FACS-Röhrchen (Greiner Labortechnik
GMbH, Frickenhausen, Deutschland) mit den Nummern 1 bis 7 beschriftet
und nach folgendem Schema befüllt: In FACS-Röhrchen 1, 2 und 3 wurden
je 100.000 PBMCs pipettiert, was einem Volumen von 100 µl entsprach. (Zur
Erinnerung: nach der ersten Zellzählung (s. Kapitel 3.5.) wurden die 500.000
PBMCs gesondert in einem Eppendorfcup mit 500 µl FACS-Puffer isoliert
und bis zur FACS-Färbung bei 4 °C aufgehoben (vgl. Kapitel 3.5.)). In
FACS-Röhrchen 4 und 5 wurden je 100.000 CD4+ CD25-T-Zellen gegeben,
42
auf die FACS-Röhrchen 6 und 7 wurden je 100.000 CD4+ CD25+ T-Zellen
verteilt.
Nach Zentrifugation in der Tischzentrifuge Hettich Megafuge 2,0 R (1200
rpm / 5 min / 4 °C), wurden die Überstände mit eine r feinen Nadel abgesaugt
und die sieben Pellets in je 100 µl FACS-Puffer resuspendiert. Danach
wurden nach folgendem Pipettierschema Farbstoff-markierte Antikörper
(PharMingen, Becton Dickinson Company, Katalog-Nr. jeweils in Klammern)
in die Röhrchen gegeben:
Röhrchen
FITC
PE
Cy-Chrome
1
2µl FITC Mouse IgG1
2µl PE Mouse IgG1
2µl Cy-Chrome Mouse IgG1
(555748)
(555749)
(555750)
2µl FITC anti-human CD 4
2µl PE anti-human CD 25
2µl Cy-Chrome anti-human
(555346)
(555432)
CD 3 (555334)
2
3
4
5
6
7
2µl FITC anti-human CD 4
2µl Cy-Chrome anti-human
(555346)
CD 3 (555334)
2µl FITC Mouse IgG1
2µl PE Mouse IgG1
2µl Cy-Chrome Mouse IgG1
(555748)
(555749)
(555750)
2µl FITC anti-human CD 4
2µl PE anti-human CD 25
2µl Cy-Chrome anti-human
(555346)
(555432)
CD 3 (555334)
2µl FITC Mouse IgG1
2µl PE Mouse IgG1
2µl Cy-Chrome Mouse IgG1
(555748)
(555749)
(555750)
2µl FITC anti-human CD 4
2µl PE anti-human CD 25
2µl Cy-Chrome anti-human
(555346)
(555432)
CD 3 (555334)
Nachdem die Röhrchen vorgetextet (Heidolph) und für 30 min bei 4 °C
inkubiert worden waren, wurden sie mit je 250 µl FACS-Puffer befüllt und in
der Tischzentrifuge von Hettich Megafuge 2,0 R wieder zentrifugiert (1200
rpm / 5 min / 4 °C). Während der Überstand abgesaug t und verworfen
wurde, kamen zu den Zellpellets jeweils 50 µl FACS-Puffer pro Röhrchen
hinzu. Um die Zellen für die später stattfindende FACS-Messung zu fixieren,
wurden die Röhrchen zusätzlich mit 50 µl 2%-Formaldehydlösung versetzt
und nach erneutem Vortexten mit Parafilm verschlossen. Bis zur
Einmessung im flow cytometer BD FACScan mit CellQuest Software wurden
die Zellen für maximal sieben Tage bei 4 °C im Kühl schrank aufbewahrt.
43
3.9. Züchtung und Reifung dendritischer Zellen
Um die allergenspezifische Stimulierung der CD4 Lymphozyten untersuchen
zu können, war es notwendig, körpereigene dendritische Zellen aus CD4- TZellen (= Ansatz 2) zu generieren. Wie oben in Kapitel 3.6. bereits
beschrieben, wurden die CD4- T-Zellen mit Hilfe des Negativ-SelektionsMACSs im Ansatz 2 isoliert. Nach Zentrifugation (Rotanta 460 R Zentrifuge
von Hettich, 1000 rpm / 5 min / 4 °C) wurde der Übe rstand verworfen und
das Pellet in 10 ml A-Medium gelöst. Anschließend wurde die Suspension
auf eine Primaria-Kulturplatte (Falcon 3803, Becton Dickinson Labware, New
Jersey, USA) gegeben und für eine Stunde bei 37 °C im Brutschrank (5%
CO2-Anteil) inkubiert. In dieser Zeit kam es zur Adhäsion derjenigen Zellen
an die Platte, aus denen sich im weiteren Verlauf die reifen dendritischen
Zellen entwickeln. Anschließend wurde die nicht-adhärente Fraktion mit
einer Glaspipette abgesaugt und die Kulturschale mehrfach mit je 10 ml
„RPMI 1640 without Glutamine“ gewaschen. Das RPMI wurde wieder
abgesaugt und 10 ml A-Medium wurden erneut auf die Platte gegeben. Um
die Generierung der dendritischen Zellen zu fördern, wurden zusätzlich 200
µl GM-CSF (Leukine, Berlex Laboratories Inc., Richmond, CA 94804, USA)
und 2,5 µl IL-4 (Art.-Nr. 1003, Cell Genix, Technologie Transfer GmbH,
Freiburg, Deutschland) hinzugefügt und durch Schwenken der Platte
gründlich verteilt. Dann wurde die Zellkultur für die weitere Inkubation
insgesamt sechs Tage lang bei 37 °C und 5% CO 2-Anteil in den Brutschrank
gestellt (Tag 0). Am Tag 2 wurden zusätzlich 5 ml A-Medium, 300 µl GMCSF und 3,75 µl Il-4 auf die Schale pipettiert, am Tag 5 kamen weitere 200
µl GM-CSF und 2,5 µl IL-4 dazu, um die Entwicklung der dendritischen
Zellen zu beschleunigen.
Nachdem sich die Zellen im Verlauf der Inkubationszeit wieder von der
Platte gelöst hatten, fand am Tag 6 die Reifung der dendritischen Zellen
statt. Hierfür wurde die Suspension mit den nun frei schwimmenden DCs in
ein 15 ml-Röhrchen überführt und zentrifugiert (Rotanta 460 R Zentrifuge
von Hettich, 1000 rpm / 9 min / 4 °C). Anschließend wurde der Überstand
verworfen und das Pellet im vorbereiteten Reifungsmedium resuspendiert,
welches sich aus folgenden Komponenten zusammensetzte: 6 ml A-
44
Medium, 12 µl IL-1β (Art.-Nr. 1011, Cell Genix, Technologie Transfer GmbH,
Freiburg, Deutschland), 6 µl IL-6 (Art.-Nr. 1004, Cell Genix, Technologie
Transfer GmbH, Freiburg, Deutschland), 6 µl TNFα−1a (Beromun, Wirkstoff:
Tasonermin, Boehringer-Ingelheim International GmbH, Ingelheim am
Rhein, Deutschland), 6 µl PGE2 (= Minoprostin E2 5000 µg, Wirkstoff:
Dinoproston, Pharmacia N.V./S.A., Puurs, Belgien), 6 µl GM-CSF und 1,3 µl
IL-4 . Nachdem die 6 ml Reifungscocktail zu gleichen Teilen à 3 ml auf zwei
wells einer 6-well-Platte (35-3046 Multiwell 6 well, Becton Dickinson
Labware, New Jersey, USA) verteilt worden waren, wurde einem der beiden
wells zusätzlich noch 150 µl rBet v 1 (BIOMAY Produktions- und
Handelsgesellschaft m. b. H., Wien, Österreich) hinzugefügt. Nach
entsprechender Beschriftung der wells mit rDCs + rBet v 1 bzw. rDCs ohne
rBet v 1, wurde die Platte wieder bei 37 °C und 5% CO2-Anteil im
Brutschrank inkubiert.
An Tag 7 wurde der Inhalt der beiden wells jeweils in ein 15 ml-Röhrchen
umgefüllt und anschließend die Zellzahl der rDCs + rBet v 1 und der rDCs
ohne rBet v 1 mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop
bestimmt. Hierfür wurden den beiden Suspensionen je 40 µl entnommen, um
mit 10 µl 0,4%-Trypanblau-Lösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)
gefärbt zu werden. Nach Zentrifugation in der Rotanta 460 R Zentrifuge von
Hettich (900 rpm / 8 min / 4 °C) wurden die Zellen entsprechend der
errechneten Zellzahl in so vielen Cryotubes eingefroren, das eine Portion
mindestens 500.000 Zellen enthielt. Die weitere Beschreibung schildert den
Vorgang, bei dem die Zellen in jeweils nur einer Portion eingefroren wurden:
In zwei entsprechend beschrifteten Einfrierröhrchen (Cellstar Cryo.s, Greiner
Labortechnik GmbH, Frickenhausen, Deutschland) wurden jeweils 500 µl
Einfriermedium vorgelegt. Während der Überstand der beiden 15 mlRöhrchen verworfen wurde, kamen zu den Pellets je 500 µl HSA dazu, worin
die reifen dendritischen Zellen suspendiert wurden. Die Suspension wurde
nun jeweils in ein Einfrierröhrchen überführt, das geschwenkt wurde und
anschließend in einem Cryo-Container (Nalgene Cryo) 1 °C Freezing
Container, Cat. No. 5100-0001, Nalge Nunc International, Hereford, U.K.)
auf -80 °C tief gefroren wurde. Auf diese Weise wur den die autologen Zellen
45
bis zu ihrer Verwendung bei einer späteren Untersuchung desselben
Patienten aufbewahrt.
Um die T-Zellen im Proliferationsassay allergenspezifisch stimulieren zu
können, mussten die dendritischen Zellen für die Befüllung der 96-wellRundbodenplatte wieder aufgetaut werden. Nachdem pro Einfrieröhrchen je
5 ml 4 °C kaltes DPBS in je einem 15 ml-Röhrchen vo rgelegt worden waren,
wurden die Cryotubes im Wasserbad bei 36 °C angewär mt. Sobald sich die
gefrorene Suspension von der Wand des Einfrierröhrchens gelöst hatte,
wurde der teilweise noch gefrorene Inhalt in das 15 ml-Röhrchen gegeben
und das Cryotube mit DPBS nachgespült. Als die Zellflüssigkeit nun gänzlich
aufgetaut war, wurden 40 µl der geschwenkten Suspension entnommen, um
mit 10 µl 0,4% Trypanblau-Lösung gefärbt zu werden. Mit der NeubauerZählkammer wurde unter dem Mikroskop die Zellzahl der rDCs + rBet v 1
und der rDCs ohne rBet v 1 bestimmt. Anschließend wurden die beiden 15
ml-Falcons zentrifugiert (Rotanta 460 R Zentrifuge von Hettich, 900 rpm / 8
min / 4 °C), die Überstände verworfen und die Zelle n in so viel „X-vivo-20
complete + 5% Serum“ aufgenommen, dass 100.000 Zellen in 100 µl
Medium gelöst waren.
3.10. Proliferationsassay mit anti-CD3 und anti-CD28
Für die allergenunspezifische Stimulation der T-Zellen wurden zunächst 24
wells einer 96-well-Flachbodenplatte (Microtest 96, 35-3072, Falcon, Becton
Dickinson Labware,New Jersey, USA) mit jeweils 49,5 µl DPBS und 0,5 µl
Anti-CD3-Antikörperlösung (CD3, purified mouse anti-human monoclonal
antibody, Katalog-Nummer 555329, BD PharMingen, San Diego, USA) nach
folgendem Schema gecoatet:
46
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
anti-CD3
Die Flachbodenplatte wurde mit einem Parafilm abgedichtet und bei 4 °C für
mindestens vier Stunden im Kühlschrank inkubiert.
Daraufhin wurde der Inhalt der wells abgesaugt und jedes well dreimal mit
DPBS gewaschen. Anschließend wurden die ersten sechs wells mit je
100.000 CD4+ „bulk“ (= Ansatz 3) befüllt, also den T-Zellen, die nicht weiter
in CD4+ CD25+ und CD4+ CD25- T-Zellen aufgetrennt worden waren
(Anmerkung: hier lag also noch die natürliche Mischung zwischen CD4+
CD25+ und CD4+ CD25- Zellen vor), und weitere sechs wells mit je 100.000
CD4+ CD25+ T-Zellen (= Ansatz 5). Nachdem in die nächste Reihe
sechsmal
jeweils 100.000 CD4+ CD25- T-Zellen (= Ansatz 4) gegeben
worden waren, wurden in die letzen sechs wells zum Schluss noch je
100.000 CD4+ CD25+ und zusätzlich je 100.000 CD4+ CD25- T-Zellen
pipettiert, so dass sich letztendlich folgende Verteilung ergab:
CD4+
CD4+
CD4+
CD4+
CD4+
CD4+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25+
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
CD4+CD25-
47
Alle wells wurden mit „X-vivo-20 complete + 5% Serum“ auf 200 µl
Gesamtinhalt aufgefüllt. Anschließend wurden pro well 2 µl Anti-CD28Antikörperlösung (CD28, purified mouse anti-human monoclonal antibody,
Katalog-Nummer: 555725, BD PharMingen, San Diego, USA) zugegeben.
Die Platte wurde nun bei 37 °C im Brutschrank (5% C O2-Anteil) inkubiert.
Nach 48 Stunden (= Tag 2) wurden aus drei wells jeder 6er-Reihe jeweils
100 µl Überstand entnommen (in der Tabelle grau unterlegt), also insgesamt
300 µl pro Zellsorte, und bis zur ELISA-Auswertung bei -20 °C in 12
Eppendorfcups à 100 µl eingefroren. Danach wurde die Flachbodenplatte
bei 37 °C im Brutschrank bis zur Auswertung des Pr oliferationsassays mit
³H-Thymidin (= Tag 6) weiter inkubiert (vergleiche Kapitel 3.12.)
3.11. Proliferationsassay mit reifen dendritischen Zellen
Neben der allergenunspezifischen Stimulation der T-Zellen mittels anti-CD3
und
anti-CD28
wurde
im
Rahmen
dieser
Studie
auch
ein
allergenspezifischer Proliferationsassay mit reifen dendritischen Zellen
durchgeführt. Hierfür war es zunächst von Bedeutung, rBet v 1-beladene
und -unbeladene reife DCs aus CD4- T-Zellen zu generieren, was in Kapitel
3.9. bereits im Detail geschildert wurde. Da bei der ersten Blutentnahme
eines jeden Patienten noch keine gezüchteten reifen autologen DCs zur
Verfügung standen, entfiel der folgende Arbeitsschritt an diesem Termin und
wurde erst beim Untersuchungszeitpunkt 2, 3 und 4 durchgeführt.
Auf einer 96-well-Rundbodenplatte (Microtest U-Bottom, 35-3077, Falcon,
Becton Dickinson Labware, New Jersey, USA) wurden die ersten 9 wells mit
je 100.000 CD4+ „bulk“ T-Zellen befüllt und 9 weitere mit je 100.000 CD4+
CD25+ T-Zellen. In die nächste Reihe wurden 9x je 100.000 CD4+ CD25- TZellen gegeben und die letzten 9 wells erhielten jeweils 100.000 CD4+
CD25+ gemischt mit je 100.000 CD4+ CD25- T-Zellen. In drei wells wurden
je 5.000 reife dendritische Zellen ohne rBet v 1 gegeben und in 3 weitere
5.000 reife dendritische Zellen mit rBet v 1. Diese wurden im Rahmen einer
vorhergegangenen Blutentnahme desselben Patienten ohne bzw. mit Zusatz
48
des Birkenallergens gezüchtet, anschließend eingefroren und für dieses
Experiment wieder aufgetaut (siehe Kapitel 3.9.).
Um die allergenspezifische Stimulierung der T-Zellen durch rDCs und rDCs
+ rBet v 1 vergleichen zu können, wurden jeweils in 3 wells jeder 9-er Reihe
5.000 reife dendritische Zellen ohne rBet v 1 gegeben und in 3 andere wells
jeder Zellsorte 5.000 reife dendritische Zellen mit rBet v 1, so dass sich
folgendes Pipettierschema ergab:
bulk
bulk
bulk
bulk
+ rDC
bulk
+ rDC
bulk
+ rDC
bulk
+ rDC
+rBet v 1
bulk
+ rDC
+rBet v 1
bulk
+ rDC
+rBet v 1
-
-
-
CD25+
CD25+
CD25+
CD25+
+ rDC
CD25+
+ rDC
CD25+
+ rDC
CD25+
+ rDC
+rBet v 1
CD25+
+ rDC
+rBet v 1
CD25+
+ rDC
+rBet v 1
-
-
-
-
-
-
CD25+ rDC
CD25+ rDC
CD25+ rDC
CD25+ rDC
+rBet v 1
CD25+ rDC
+rBet v 1
CD25+ rDC
+rBet v 1
-
-
-
CD25+
CD25+ rDC
CD25+
CD25+ rDC
CD25+
CD25+ rDC
CD25+
CD25+ rDC
+rBet v 1
CD25+
CD25+ rDC
+rBet v 1
CD25+
CD25+ rDC
+rBet v 1
-
-
-
CD25
CD25+
CD25-
CD25
CD25+
CD25-
CD25
CD25+
CD25-
rDC
rDC
rDC
-
-
-
-
-
-
-
-
-
rDC
+rBet v 1
rDC
+rBet v 1
rDC
+rBet v 1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Alle 52 wells wurden nun mit „X-vivo-20 complete + 5% Serum“ auf 200 µl
Gesamtinhalt aufgefüllt und bei 37 °C und 5% CO 2-Anteil im Brutschrank
inkubiert.
3.12. Auswertung der Proliferationsassays mit ³H-Thymidin
Fünf Tage nach Ansetzen der 96-well Flachbodenplatte und der 96-well
Rundbodenplatte wurden beide Proliferationsassays im Radioaktivlabor mit
³H-Thymidin-Lösung gepulst, indem jedes well mit 20 µl der radioaktiven
Substanz versehen wurde. Anschließend wurden beide Platten für weitere
16 Stunden im Brutschrank bei 37 °C (5% CO 2-Anteil) inkubiert.
Am Tag 6 wurde der Inhalt jeder Platte mit Hilfe des Cell Harvesters
(Inotech) durch einen Glasfaserfilter (Printed Filtermat A, 90*120mm,
49
Nr. 1450-421, Wallac Oy) gesaugt, so dass nur die Zellen auf dem Filter
hängen blieben. Die wells wurden fünfmal mit Aqua dest. gespült, um auch
die in den wells verbliebenen Zellen auf den Filter zu überführen und das
radioaktive Medium aus diesem herauszuwaschen. Der Filter wurde nun auf
der Heizplatte Präzitherm (Stork-Tronic) bei 80 °C getrocknet. Anschließend
wurde ein Melt-on Scintillator Sheet (Melti-Lex A, 73*109mm, average
weight 4g, Nr. 1450-441, Wallac Oy) auf den Filter gelegt und gewartet, bis
das Wachs geschmolzen war. Sobald sich der Wachsfilm überall
gleichmäßig verteilt hatte, wurde der Filter wieder von der Heizplatte
genommen, so dass das Wachs erkalten und aushärten konnte. Nachdem
der so präparierte Filter in eine Zählplatte eingeklemmt worden war, wurde
er am 1450 MicroBeta PLUS Liquid Scintillation Counter (Wallac Oy) mit
Hilfe der MicroBeta Workstation Software Version 3.20 (Perkin Elmer Life
Sciences, Wallac Oy) eingemessen.
3.13. Foxp3-Bestimmung
Für die Foxp3-Bestimmung der im MACS-Selektionsverfahren isolierten
CD4+
CD25+
regulatorischen
T-Zellen
wurden
nach
dem
Positiv-
Separationsverfahren 50.000 CD4+ CD25+ T-Zellen aus Ansatz 5
entnommen und in der Biofuge 22 R von Heraeus zentrifugiert (900 rpm / 8
min / 4 °C). Anschließend wurde der Überstand verwo rfen und das Pellet in
350 µl Lysispuffer aufgenommen, der mit 3,5 µl Mercapto-Ethanol versetzt
war. Nachdem die Suspension für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert worden war, wurden die T-Zellen bei -20 °C eingefroren.
Für die Foxp3-Messung selbst wurden die Proben an das Pharmakologische
Institut des Universitätsklinikums Erlangen übergeben, wo unter der Leitung
von Herrn Prof. Dr. Pahl die Foxp3-Bestimmung der regulatorischen T-Zellen
wie folgt stattfand:
RNA wurde aus den gefrorenen Blutzellen mittels Rneasy® (QIAGEN,
Hilden, Germany) gewonnen. Anschließend wurde eine real-time RT-PCR
unter Verwendung des Quantitect® RT-PCR Probe-KITs von QIAGEN
50
(Hilden, Germany) durchgeführt. Anhand dieser RT-PCR wurde die
Expression von Foxp3 in Relation zu 18S bestimmt, wobei TaqMan®-Assays
auf einem ABI-Prism 7900 verwendet wurden.
Primer und Sonden für humanes 18S und Foxp3 wurden bei Applied
Biosystems (Darmstadt, Germany) hergestellt.
Die Quantität der mRNA wurde mit Hilfe der ∆∆CT-Methode (PE Applied
Biosystems User Bulletin #2; ABI PRISM 7700 Sequence Detection System,
1997) ermittelt. Für jede RT-PCR wurde der Zyklus-Schwellenwert (CT)
bestimmt, definiert als der Zyklus, bei dem die Fluoreszenz das 10-fache der
Standardabweichung der durchschnittlichen Basisemission von Zyklus 3 - 10
überschreitet. Die Foxp3 mRNA-Levels wurden dann anhand folgender
Formel mit dem 18S-Gen „housekeeping“ normiert:
∆CT = CT18S - CTFoxp3
Anschließend wurden die Foxp3 mRNA-Levels mit der sogenannten ∆∆CTMethode nach folgender Formel berechnet:
∆∆CT = ∆CT (vor Behandlung) - ∆CT (Behandlung)
Das heißt, diejenigen ∆CT - Werte, die die mRNA von Proben während der
Behandlung repräsentieren, wurden mit ∆CT - Werten von Proben vor der
Behandlung in Relation gesetzt.
Der relative mRNA-Level der betreffenden Probe wurde als 2-∆∆CT berechnet,
basierend auf den Ergebnissen von Kontrollexperimenten mit einer Effizienz
der PCR-Reaktion von nahezu 100 Prozent.
51
3.14. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse übernahm Herr Prof. Dr. rer. nat.
Oliver Kuss vom Institut für Medizinische Epidemiologie, Biometrie und
Informatik am Universitätsklinikum Halle-Wittenberg.
Der Behandlungseffekt wird in einem linearen gemischten Modell mit den
Proliferationswerten als Zielgröße und den festen Effekten Behandlung,
Zeitpunkt und deren Interaktion berechnet. Der eigentliche interessierende
Effekt wird dabei durch diese Interaktion, das heißt den Verlauf der
Behandlungen über die Zeitpunkte beschrieben.
Zur Adjustierung für potentielle Baseline-Unterschiede zwischen den
Behandlungsgruppen wurden zusätzlich noch die a priori definierten
Merkmale Geschlecht, Asthma, orales Allergiesyndrom mit Kreuzreaktion
auf
Früchte,
Alter,
subjektive
Symptome
vor
Therapie
und
Medikamentenverbrauch vor spezifischer Immuntherapie als feste Effekte
aufgenommen.
Die Aufnahme des zufälligen Patienteneffekts trägt der Tatsache Rechnung,
dass die Patienten mehrmals im Zeitverlauf gemessen wurden und die
Werte innerhalb eines Patienten daher als abhängig angenommen werden
müssen. Eine Sensitivitätsanalyse per Propensity-Score-Matching und
IPTW-Schätzung (= Inverse Probability of Treatment Weighting-Schätzung)
ergab qualitativ dieselben Ergebnisse.
52
3.15. Untersuchungen zur subjektiven Bewertung der SIT
Neben den immunologischen Behandlungseffekten im Vergleich von
Pollinex Quattro® versus ALK SQ Depot®, die mittels der oben genannten
Methoden untersucht wurden, sollte auch die subjektive Bewertung der
spezifischen Immuntherapie aus Sicht der Patienten berücksichtigt werden.
Um herauszufinden, wie die Studienteilnehmer selbst ihre allergische
Symptomatik
im
Behandlungsverlauf
einschätzen
und
die
Hyposensibilisierung beurteilen, wurden zwei Fragebögen (vgl. S. 47 ff.)
entworfen, die den Verlauf der Therapie dokumentieren.
Nach einer standardisierten Anamneseerhebung wurden gezielt klinische
Beschwerden,
Symptomverbesserung,
Medikamentenverbrauch,
Nebenwirkungen und Verträglichkeit der SIT abgefragt. Außerdem waren
Fragen über Therapieerfolg, Compliance und Zufriedenheit enthalten.
Insgesamt fand die Befragung der Patienten während des ersten
Behandlungszyklus
an
vier
Terminen
jeweils
zeitgleich
mit
den
Blutentnahmen statt, das heißt vor der ersten Impfung, 2 Wochen nach der
2. Erhaltungsdosis bei ALK SQ Depot® beziehungsweise nach der letzten
Injektion von Pollinex Quattro®, nach 6 Monaten und nach 12 Monaten.
Zudem wurde im zweiten Therapiejahr nach der zweiten Pollensaison (= 18
Monate nach Beginn der SIT) nochmals eine telefonische Befragung der
Patienten durchgeführt.
53
Fragebogen 1
Ex vivo Isolation und Charakterisierung von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen
unter spezifischer Immuntherapie mit Pollinex Quattro®/ALK SQ Depot®
Hautklinik Universitätsklinikum Erlangen
Prof. Dr. med. Vera Mahler
Untersuchender Arzt:
…………………………………………………………………………………………………
Patientendaten:
Name, Vorname
…………………………………………………………………………………………………
Geburtsdatum ………………………………….
….. männl.
….. weibl.
Referenz-Nr. der Therapielösung: 200../030/……
Rezeptur:
Birke ….
Eingangsuntersuchung (vor Therapiebeginn):
Diagnose/Indikation:
….Allerg. Rhinitis
….Allerg. Konjunktivitis
….Allerg. Asthma:
….leicht
.…mittel
….schwer
Weitere klinisch relevante Allergien:
…Gräser …Roggen …Beifuß …Wegerich
Birke/Erle/Hasel ….
Datum: ……………………..
….Haut-Symptome:
….Atop. Ekzem
….Urtikaria
…Hausstaubmilben
…Katze
Andere Allergene:……………………………………………………………………………
Weitere Diagnosen (nicht allergischer Ursache) und Medikamente:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Basisuntersuchungen:
….Anamnese
….Pricktest
….CAP-FEIA
….Nasale Provokation
Weitere:……………………………………………………………………………………….
54
Symptomatische Medikamente während der letzten Pollenflugsaison:
Lokal (Nase, Augen, Haut): ………………………………………………………………..
Oral: …………………………………………………………………………………………..
Leukotrien-R-Antagonist? ………………………………………………………………….
(Asthma)Sprays:……………………………………………………………………………..
Einschätzung des Medikamentenverbrauchs während des letzten Pollenfluges
durch den Patienten:
…nie gebraucht
…sehr selten, nur bei besonderer Exposition
…ca. 1 x pro Woche
…mehrfach pro Woche
…täglich
…mehrfach täglich
Einschätzung der Beschwerden während des letzten Pollenfluges durch den
Patienten:
1…….2…….3…….4…….5…….6…….7…….8…….9…….10
sehr
extrem
gering
stark
Wurde früher bereits eine Hyposensibilisierung durchgeführt?
…..ja
…..nein
Wenn ja:
Dauer der letzten Hyposensibilisierung in Jahren
………
Abschluss der letzten Hyposensibilisierung im Jahr: ………bzw. andauernd:………..
Route: …..sublingual …..s.c. ganzjährig …..s.c. präsaisonal
Präparat: ………...........................................................................................................
Allergenzusammensetzung der letzten Hyposensibilisierungs-Lösung:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Bemerkungen:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
55
1. Nachuntersuchung (nach der letzten Injektion)
Datum: ……………..
Gesundheitszustand des Patienten / therapierelevante Veränderungen
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Beurteilung der Akzeptanz durch den Patienten (Compliance, Verträglichkeit):
…..sehr gut
…..gut
…..weniger gut
…..schlecht
Bemerkungen:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
2. Nachuntersuchung (6 Monate nach Therapiebeginn)
Datum: ……………..
Gesundheitszustand des Patienten / therapierelevante Veränderungen
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Beurteilung der Akzeptanz durch den Patienten (Compliance, Verträglichkeit):
…..sehr gut
…..gut
…..weniger gut
…..schlecht
Fliegen zum Untersuchungszeitpunkt für den Patienten relevante Pollen?
…..ja
…..nein
Wenn ja:
Welche?...................................................................................................
Einschätzung der aktuellen Beschwerden durch den Patienten:
1…….2…….3…….4…….5…….6…….7…….8…….9…….10
sehr
extrem
gering
stark
Bemerkungen:
…………………………………………………………………………………………………
..……….……………………………………………………………………………………....
56
3. Nachuntersuchung (12 Monate nach Therapiebeginn)
Datum:…………….
Gesundheitszustand des Patienten / therapierelevante Veränderungen
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Beurteilung der Akzeptanz durch den Patienten (Compliance, Verträglichkeit):
…..sehr gut
…..gut
…..weniger gut
…..schlecht
Beurteilung des Therapieerfolges (bezogen auf die Pollenflugzeit nach Therapie)
durch den Patienten:
….stark gebessert
….mäßig gebessert
….gering gebessert
….unverändert, Beschwerden wie in der Pollenflugzeit davor
….verschlechtert
….nicht beurteilbar
Einschätzung des Medikamentenverbrauchs während des Pollenfluges nach
Therapie durch den Patienten:
…nie gebraucht
…sehr selten, nur bei besonderer Exposition
…ca. 1 x pro Woche
…mehrfach pro Woche
…täglich
…mehrfach täglich
Untersuchungen:
….Prick
….CAP-FEIA
….Nasale Provokation
Weitere:……………………………………………………………………………………….
Ist die Behandlung im vorgesehenen Schema zu Ende geführt worden?
….ja ….nein
falls nein: Variationen im Schema:
…………………………………………………………………………………………………
Abgebrochen? ….
Gründe? …………………………………………………..
Soll die Therapie im nächsten Jahr fortgeführt werden?
….ja
….nein
falls nein: Gründe?………………………………… ……………………………………….
Bemerkungen:
…………………………………………………………………………………………………
.....................................................................................................................................
57
Fragebogen 2
Fragebogen für Treg-Verlaufsbeobachtung
Name: ______________________Alter: _____Impfstoff: □ ALK SQ Depot®
®
□ Pollinex Quattro
1.)
Wie beurteilen Sie die Besserung Ihrer allergischen Beschwerden nach
der Therapie im Vergleich zu vorher?
a) Rhinitis?
□
□
□
□
□
b) Conjunctivitis?
□
□
□
□
□
stark verbessert
mäßig verbessert
wenig verbessert
unverändert
verschlechtert
c) Asthma/Atembeschwerden?
□
□
□
□
□
stark verbessert
mäßig verbessert
wenig verbessert
unverändert
verschlechtert
d) Orales Allergiesyndrom?
□
□
□
□
□
stark verbessert
mäßig verbessert
wenig verbessert
unverändert
verschlechtert
stark verbessert
mäßig verbessert
wenig verbessert
unverändert
verschlechtert
2.) Wie schätzen Sie Ihre allergischen Beschwerden während der
Pollenflugzeit (Birke, Hasel, Erle) auf einer Skala 1 - 10 ein?
a)
Vor Therapiebeginn?
sehr wenig
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
extrem stark
7
8
9
10
extrem stark
7
8
9
10
extrem stark
b) 1. Pollensaison nach Therapiebeginn ?
sehr wenig
1
2
3
4
5
6
c) 2. Pollensaison nach Therapiebeginn ?
sehr wenig
1
2
3
4
5
6
3.) Wie hat sich der Medikamentenverbrauch nach der Therapie im
Vergleich zu vorher verändert?
□
□
□
□
□
stark reduziert
mäßig reduziert
wenig reduziert
unverändert
gestiegen
58
4.) Wie zufrieden sind Sie mit Ihrer Hyposensibilisierungstherapie?
□
□
□
□
sehr zufrieden
zufrieden
weniger zufrieden
unzufrieden
5.) Welche Nebenwirkungen traten nach den Injektionen auf?
□
□
□
□
keine
Lokalreaktionen an der Injektionsstelle (Rötung, Schwellung, Schmerzen)
leichte allergische Symptome (Augentränen/-jucken, Fließschnupfen, Niesen)
starke systemische Beschwerden (Atemprobleme, Asthma, Schock, Angst)
59
4. Ergebnisse
4.1. Charakterisierung der Patientenkollektive
Von den 24 (2x12) initial eingeschlossenen Patienten, beendeten 12
Patienten aus der Pollinex Quattro®-Gruppe und 10 Patienten aus der ALK
SQ Depot®-Gruppe den ersten Zyklus der Immuntherapie. Zwei Personen
aus der ALK SQ Depot®-Gruppe brachen die spezifische Immuntherapie
wegen unerwünschter Nebenwirkungen (n=1 nach 15. SIT aufgrund starker
Lokalreaktion an der Injektionsstelle sowie Zunahme der asthmatischen
Symptome) oder aus persönlichen Gründen (n=1 nach 18. SIT wegen
Studiumsortwechsel) vorzeitig ab. Zwei Patienten aus der Pollinex Quattro®Gruppe führten zwar den ersten Zyklus der präsaisonalen Immuntherapie zu
Ende und erhielten 4 Injektionen, brachen aber die Studie aus persönlichen
Gründen nach der 2. Blutentnahme vorzeitig ab (n=1 nach 4. SIT aus
Zeitmangel; n=1 nach der 4. SIT wegen familiären Problemen), so dass am
Studienende trotz des Schwunds von vier Patienten die Gruppengrößen mit
jeweils zehn Patienten gleich waren.
Da sich nach Charakterisierung der Patienten in beiden Gruppen ein
annähernd gleiches Patientenprofil befand (vgl. Tabelle 3), war insgesamt
eine gute Ausgangssituation für den Vergleich der beiden spezifischen
Immuntherapien geschaffen.
ALK-Depot Birke
Pollinex Birke
männlich
50%
50%
RC
100%
100%
A
50%
60%
OAS
70%
90%
≥ 40. Lj.
50%
60%
Tabelle 3: Charakterisierung der behandelten und ausgewerteten Patientenkollektive
(perenniales Behandlungsschema (ALK-Depot Birke, n=10) versus präsaisonales
Kurzzeitschema (Pollinex Birke, n=10))
(RC = Rhinoconjunctivitis, A = Asthma bronchiale, OAS = Orales Allergiesyndrom)
60
Das Alter des behandelten und auswertbaren Patientenkollektivs (n=10 in
jeder Behandlungsgruppe), welches alle sozialen Bevölkerungsschichten
durchzog, lag in beiden Impfgruppen zwischen 21 und 65 Jahren, wobei in
der Pollinex Quattro®-Gruppe das Durchschnittsalter mit 43 Jahren etwas
höher war als in der ALK SQ Depot®-Gruppe mit durchschnittlich 41 Jahren.
Bei allen Patienten konnte aufgrund einer positiven Anamnese, eines
Pricktests, einer nasalen Provokation und der CAP-FEIA Befunde eine
Birkenpollenallergie eindeutig nachgewiesen werden. Alle 20 Patienten des
ausgewerteten Kollektivs litten zu Beginn der Hyposensibilisierung unter
allergischer Rhinitis und Konjunktivitis. 50% der Patienten aus der
perennialen („ALK SQ Depot®“)-Behandlungsgruppe und 60% der Patienten
aus der präsaisonalen Kurzzeit-(„Pollinex Quattro®“)-Behandlungsgruppe
wiesen asthmatische Beschwerden auf. Jeweils zwei Patienten litten an
Hauterscheinungen
(atopisches
Ekzem,
Urtikaria).
Von
oralem
®
Allergiesyndrom war die Pollinex Quattro -Gruppe mit 90% etwas häufiger
betroffen als die ALK SQ Depot®-Gruppe mit 70%.
Anhand ihrer IgE-Werte auf Birkengesamtextrakt konnten sie den CAPKlassen 1-6 zugeordnet werden, wobei die zusätzlichen allergischen
Symptome,
welche
von
der
Rhinokonjunktivitis
über
Asthma
und
Hautreaktionen bis hin zum oralen Allergiesyndrom reichten, nicht mit den
IgE-Werten korrelierten. Bei 95% der Patienten konnte eine Sensibilisierung
auf rBet v 1 aus Birkenpollen anhand der spezifischen IgE-Werte
nachgewiesen werden. Die Werte schwankten zwischen 0,16 kU/l und >100
kU/l. Das spezifische IgG für rBet v 1 aus Birkenpollen lag bei 90% der
Patienten unter 2,00 kU/l und war somit negativ. Die Mehrheit der Patienten
(3 von 4 Patienten), bei denen zu Beginn der Behandlung spezifisches IgG
nachweisbar war, hatte auf dezidierte Nachfrage in der Vergangenheit
bereits eine spezifische Immuntherapie erhalten.
Bei den meisten Patienten (90% in jeder Behandlungsgruppe) bestanden
zusätzlich
zur
Birkenpollenallergie
Kosensibilisierungen
auf
Gräser,
®
Katzenhaare oder Milben. In der Pollinex Quattro -Gruppe waren diese
Kosensibilisierungen bei allen betroffenen Patienten symptomatisch (90%
61
der Patienten mit präsaisonaler SIT) und in der ALK SQ Depot®-Gruppe bei
80% der Patienten.
Die Patienten aus der Pollinex Quattro®-Gruppe waren zusammenfassend
etwas älter und „kränker“ als diejenigen aus der ALK SQ Depot®-Gruppe.
4.2. Ergebnisse der PBMC-FACS-Auswertung
Um
herauszufinden,
wie
sich
die
beiden
unterschiedlichen
Hyposensibilisierungstherapien auf zellulärer Ebene auswirken, wurden die
Blutzellen der Patienten im Labor isoliert und untersucht. Das Ziel bestand
darin, aus der Gesamtlymphozytenzahl die regulatorischen CD4+ CD25+ TZellen zu isolieren, deren prozentualen Anteil an den PBMCs mittels FACS
zu
bestimmen
und
ihr
regulatorisches
Potential
in
beiden
Behandlungsschemata zu untersuchen.
Anhand der FACS-Auswertung konnte analysiert werden, zu welchen
quantitativen Veränderungen es in der CD4+ CD25+ T-Zellpopulation jedes
Patienten während der jeweiligen SIT gekommen ist.
Zu diesem Zweck wurde die durch Dichtezentrifugation aufgereinigte PBMCPopulation mittels FACS auf qualitative Änderungen der CD4+ CD25+ TZellpopulation hin untersucht. Im forward-sidewardscatter wurde auf vitale
Lymphozyten gegatet, welche im Folgenden analysiert wurden. Die PBMCs
wurden mit Antikörpern gegen die Oberflächenantigene CD3, CD4 und
CD25 bzw. mit FITC-, PE- und Cy-Chrome-konjugierten Maus-IsotypAntikörpern gefärbt. Alle Isotypen waren negativ. Im dargestellten,
repräsentativen Beispiel waren 44,99% aller CD3+ T-Zellen CD4+, während
nur 7,81% aller CD3+ T-Zellen CD25+ waren. 7,02% der T-Zellen waren
doppelt positiv für CD4 und CD25 und konnten somit als regulatorische TZellen identifiziert werden (siehe Abb. 8a).
62
Abbildung 8a: PBMC-FACS-Analyse (Becton Dickinson FACScan Flow Cytometer) am
repräsentativen Beispiel von Patient Nr. 3 Blutentnahme 2. Alle Isotypen waren
negativ (a, b, c). 44,99% aller CD3+ T-Zellen waren CD4+ (d), während nur 7,81% aller
CD3+ T-Zellen CD25+ waren (e). 7,02% der T-Zellen waren doppelt positiv für CD4 und
CD25 und konnten somit als regulatorische T-Zellen identifiziert werden (f).
Der prozentuale Anteil der CD4+ CD25+ T-Zellen an den gesamten PBMCs
vor der Hyposensibilisierungsbehandlung variierte bei den einzelnen
Patienten zwischen 3,88% und 8,02%, was mit den vorbeschriebenen
natürlichen Schwankungen um den Durchschnittswert von etwa 6% in
Einklang steht [31]. Dieser prozentuale Anteil wurde bei jedem Patienten bei
jeder Blutentnahme bestimmt. Aus den Einzelwerten der Studienteilnehmer
wurden für jede Impfgruppe die Durchschnittswerte zu den verschiedenen
Blutentnahmen errechnet und im Diagramm 8b (siehe Abb. 8b) dargestellt.
63
Anteil CD4+ CD25+
Abbildung 8b: Anstieg der CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen im Verlauf der
®
®
spezifischen Immuntherapie mit ALK SQ Depot (=A) versus Pollinex Quattro (=P);
Mittelwerte der Patienten (n=10 in jeder Behandlungsgruppe)
Beim Vergleich der beiden Hyposensibilisierungstherapien fällt auf, dass das
Ausgangsniveau in beiden Gruppen fast identisch ist. Bei beiden
Behandlungsformen zeigt sich im weiteren Verlauf der SIT ein Anstieg des
prozentualen Anteils der regulatorischen T-Zellen an den Gesamt-PBMCs.
Bei
Verabreichung
des
MPL-verstärkten
Kurzzeitschemas
(Pollinex
®
Quattro ) fallen die regulatorischen T-Zellen nach Beendigung der Therapie
und vor Beginn des nächsten Therapiezyklus zum Untersuchungszeitpunkt
BE 4 (= 12 Monate nach SIT-Beginn) wieder ab, wobei der Anteil der CD4+
CD25+ T-Zellen über dem Ausgangsniveau liegt (vgl. Abb. 8b).
Bei dem ganzjährigen Behandlungsschema mit ALK SQ Depot® steigen die
regulatorischen T-Zellen über 12 Monate kontinuierlich an, wobei die
Zunahme initial größer ist als in der Endphase. Während die Werte vor
Beginn der Therapie bei ca. 5,51% lagen, erreichten sie nach einem Jahr
64
einen Durchschnittswert von 10,65%, was nahezu einer Verdopplung
entspricht.
Im Vergleich hierzu nimmt der Anteil der CD4+ CD25+ T-Zellen beim oben
genannten Kurzzeitschema mit Pollinex Quattro® während der ersten sechs
Monate von 5,05% auf 8,89% zu und fällt nach Beendigung des 1.
Therapiezyklus bei Untersuchungszeitpunkt BE 4 (= 12 Monate nach SITBeginn) auf einen Wert von 6,97% ab. Das Niveau der regulatorischen TZellen, das durch die ganzjährige Stimulation des Immunsystems erreicht
wird, kann also im Vergleich mit dem ganzjährigen Behandlungsschema
(ALK SQ Depot®) beim oben genannten Kurzzeitschema nicht über das
ganze Jahr gehalten werden, sondern verringert sich nach Ende der SIT und
Pollensaison wieder. Dieser Rückgang erreicht aber nicht den Ausgangswert
zu Beginn der SIT. Während der Behandlungsphase mit Pollinex Quattro®
steigt der Anteil der regulatorischen T-Zellen schneller an als bei ALK SQ
Depot®. Nach Abschluss des Therapiezyklus wird bei der 2. Blutentnahme
mit 8,75% ein höherer Wert erzielt als bei der ganzjährigen Vakzine mit
7,57%.
Insgesamt ergibt sich folgendes Ergebnis:
Über ein Jahr gesehen, zeigt das ganzjährige Behandlungsschema mit ALK
SQ Depot® ein größeres Potential, regulatorische T-Zellen zu induzieren, als
das präsaisonale Kurzzeitschema mit Pollinex Quattro®. Der Maximalwert
des Anteils an CD4+ CD25+ T-Zellen liegt bei der perennialen Behandlung
höher als bei der Kurzzeittherapie. Im Verlauf der ganzjährigen Therapie fällt
dieser
im
Gegensatz
zum
Verlauf
nach
Therapieende
bei
der
Kurzzeittherapie mit Pollinex Quattro® nach 12 Monaten nicht wieder ab.
4.3. Foxp3-Bestimmung
Zum sicheren Nachweis, dass im MACS-Selektionsverfahren CD4+ CD25+
regulatorische T-Zellen isoliert worden waren, wurde zur Qualitätskontrolle
eine Foxp3-Bestimmung dieser Zellen durchgeführt (Prof. Dr. rer. nat. Pahl,
Pharmakologisches Institut des Universitätsklinikums Erlangen).
65
Die
Expression
des
Foxp3-Transkriptionsfaktors
vor
Beginn
der
Hyposensibilisierung (1. BE) wurde in beiden Impfgruppen dem Wert 1
gleichgesetzt, um einen Bezugspunkt für die Auswertung zu schaffen. Die
bei den späteren Blutentnahmen gemessenen Zahlen wurden nun in
Relation dazu auf diesen Wert 1 bezogen. In der graphischen Darstellung
(vgl. Abb. 9) ist zu erkennen, dass die isolierten CD4+ CD25+
regulatorischen T-Zellen den Marker Foxp3 enthalten.
Im Verlauf der SIT zeigen sich keine nennenswerten Trends nach oben oder
unten.
FOXP3 mRNA-Expression
[Zunahmefaktor]
Abbildung 9: Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 in regulatorischen
®
CD4+CD25+ T-Zellen im Therapieverlauf bei ALK SQ Depot bzw. Pollinex Quattro
®
®
®
A = ALK SQ Depot , P = Pollinex Quattro , Mittelwerte der Patienten (n=10 in jeder
Behandlungsgruppe)
66
4.4. Ergebnisse des Proliferationsassays mit unspezifischer
Stimulation (Anti-CD3-/Anti-CD28-Antikörper)
Bei allen Blutentnahmen wurde ein Proliferationsassay mit unspezifischer
Stimulation durchgeführt. Zusätzlich wurde mit Ausnahme der ersten
Blutentnahme, bei der patienteneigene autologe dendritische Zellen
gewonnen wurden, auch ein Proliferationsassay mit allergenspezifischer
Stimulation durchgeführt.
In diesem Kapitel wird zunächst die unspezifische Stimulation mit Anti-CD3-/
Anti-CD28-Antikörper dargestellt. (Die allergenspezifische Stimulation mit
reifen dendritischen Zellen und dem Majorallergen der Birke rBet v 1 wird in
Kapitel 4.5. besprochen).
Wie oben beschrieben, wurde nach der radioaktiven Markierung der T-Zellen
mit
3
H-Thymidin die Proliferation der CD4+ Subklassen anhand der
eingebauten Radioaktivität gemessen. Die Werte wurden in Tripletts
bestimmt, aus denen dann Durchschnittswerte gebildet wurden.
Es zeigen sich folgende Ergebnisse (siehe Abb. 10):
Die regulatorischen T-Zellen bleiben in beiden Behandlungsgruppen
erwartungsgemäß auf konstant niedrigem Niveau und verhalten sich
hypoproliferativ.
unspezifische
Die
CD4+
Stimulation
CD25die
Zellen
höchsten
alleine
im
weisen
auf
die
Behandlungsverlauf
uneingeschränkten Proliferationsraten auf.
Bei den CD4+ bulk Zellen und den CD4+ CD25-/CD4+ CD25+ T-Zellen
(100.000 CD4+ CD25- : 100.000 CD4+ CD25+) zeigt sich im Laufe der SIT
ein kontinuierlicher Abfall der Proliferation. Die Inhibition der CD4+ T-Zellen
durch die regulatorischen T-Zellen ist in beiden Behandlungsgruppen im
Vergleich zum Ausgangsbefund signifikant.
Die
Proliferationsraten
bei
der
SIT
mit
Pollinex
Quattro®
liegen
durchschnittlich auch zu Beginn der Behandlung höher als bei der SIT mit
ALK SQ Depot®.
67
Proliferation
(anti-CD3/anti-CD28 Stimulation)
Abbildung 10: Proliferationsraten der CD4+ CD25-, CD4+ bulk, CD4+ CD25+/CD4+
®
CD25- und CD4+ CD25+ T-Zellen im Verlauf der SIT mit ALK SQ Depot (=A) versus
Pollinex Quattro
®
(=P) während der unspezifischen Stimulation mit Anti-CD3- und
Anti-CD28-Antikörpern; Mittelwerte der Patienten (n=10 in jeder Behandlungsgruppe)
Basierend auf den Durchschnittswerten der Proliferationsraten wurde wie
folgt die Proliferationsinhibitionsfähigkeit berechnet: Vom Proliferationswert
des gemischten Kulturansatzes m (100.000 CD4+ CD25+ und 100.000
CD4+ CD25- Zellen in jedem well) wurde der Proliferationswert der CD4+
CD25+ Zellen p (100.000 CD4+ CD25+ Zellen in jedem well) abgezogen:
m - p.
Dies geschah aus dem Grunde, dass der (geringe) Proliferationsanteil der
CD4+ CD25+ Zellen alleine aus dem gemischten Anteil eliminiert werden
sollte. Diese Differenz wurde nun ins Verhältnis zum Proliferationswert der
68
CD4+ CD25- Zellen n (100.000 CD4+ CD25- Zellen in jedem well) gesetzt
(m - p): n (= relative Proliferation).
Dieser Wert - zwischen 0 und 1 gelegen - gibt an, auf welchen relativen
Anteil die Proliferation der CD4+ CD25- Zellen durch die Zugabe von CD4+
CD25+ Zellen im Kulturansatz reduziert werden konnte.
Um nun diesen Wert als „Fähigkeit zur Proliferationsinhibitionsfähigkeit“
(PIF) durch die CD4+ CD25+ Zellen auszudrücken, wird der Kehrwert
gebildet: 1: ((m - p): n).
Je stärker also diese Inhibition ist, desto größer stellt sich dieser PIF-Wert
dar. Die Formel für die Proliferationsinhibitionsfähigkeit (PIF) vermittelt durch
die CD4+ CD25+ Zellen lautet mathematisch vereinfacht:
PIF = n: (m - p).
Im Rahmen der Behandlung ließ sich ein Anstieg der Fähigkeit der CD4+
CD25+ regulatorischen T-Zellen beobachten, die Proliferation der CD4+
CD25- T-Zellen zu inhibieren. Sie waren zu Beginn der Hyposensibilisierung
in beiden Impfgruppen durchweg in der Lage, die Proliferationsrate der
CD4+ CD25- Zellen etwa um den PIF-Wert 2, also auf circa 50% zu
reduzieren.
Bei der perennialen SIT stieg der PIF von 2,05 (1. BE) auf 2,49 (2. BE) und
3,06 (3. BE) und erreichte nach 12 Monaten einen Wert von 3,58. Bei der
Kurzzeittherapie mit Pollinex Quattro® lagen die Werte dagegen mit 2,04 (1.
BE), 2,36 (2. BE), 2,60 (3.BE) und 2,95 (4. BE) niedriger (vgl. Abb. 11).
Während durch ALK SQ Depot® nach einjähriger Therapie die Proliferation
der CD4+ CD25- T-Zellen um 72% reduziert wurde, erreichte Pollinex
Quattro® zur gleichen Zeit eine Verminderung der Proliferation um 61%.
69
Abbildung 11: Inhibition der CD4+ CD25- T-Zellen durch regulatorische CD4+ CD25+
®
®
T-Zellen im Verlauf der SIT mit ALK SQ Depot und Pollinex Quattro im Vergleich;
®
®
Mittelwerte aller ALK SQ Depot -Patienten bzw. Pollinex Quattro -Patienten (n=10 in
jeder Behandlungsgruppe)
Die Suppression der Proliferation war in beiden Gruppen im Vergleich zum
Ausgangsbefund signifikant (vgl. Abb. 10). Die PIF-Werte lagen in der ALK
SQ Depot®-Gruppe höher als in der Pollinex Quattro®-Gruppe (siehe
Abb.10).
4.5. Ergebnisse des Proliferationsassays mit spezifischer
Stimulation (dendritische Zellen mit und ohne rBet v 1)
Neben dem Proliferationsassay mit unspezifischer Stimulation (Anti-CD3und Anti-CD28-Antikörper) wurde bei den Blutentnahmen 2, 3 und 4
zusätzlich ex vivo ein Proliferationsassay mit spezifischer Stimulation
(autologe patienteneigene dendritische Zellen mit und ohne rBet v 1)
70
durchgeführt, um die in vivo-Situation bei Typ I-Allergie möglichst
naturgetreu nachvollziehen zu können (vgl. Abb. 12).
Allergenspezifische Proliferation
(Stimulation mit autologen rBet 1 v-gepulsten DC)
Abbildung 12: Proliferationsraten der CD4+ CD25-, CD4+ bulk, CD4+ CD25+/CD4+
®
CD25- und CD4+ CD25+ T-Zellen im Verlauf der SIT mit ALK SQ Depot (=A) versus
Pollinex Quattro
®
(=P) während der spezifischen Stimulation mit rBet v 1-gepulsten
reifen DCs; Mittelwerte der Patienten (n=10 in jeder Behandlungsgruppe)
Vergleicht man die Proliferationsraten der verschiedenen Zellkulturansätze,
so fällt auf, dass erwartungsgemäß die CD4+ CD25+ Zellen eine geringe
Proliferation zeigen, unabhängig davon, ob sie durch unbeladene oder mit
rBet v 1-beladene dendritische Zellen stimuliert wurden, was bestätigt, dass
es sich um regulatorische T-Zellen handelt. Die Kulturen der CD4+ CD25Zellen, aber auch der nicht aufgetrennten CD4+ Zellen (CD4+ bulk) und des
71
gemischten Ansatzes (CD25+/CD25-) zeigen durchgehend deutlich höhere
Proliferationsraten. Die CD4+ CD25- T-Zellen wiesen hierbei die größten
Proliferationsraten auf, da in der Zellkultur keine regulatorischen T-Zellen
enthalten sind, die eine Inhibition bewirken könnten.
Dieses Ergebnis tritt sowohl bei der SIT mit ALK SQ Depot® als auch mit
Pollinex Quattro® ein und gilt sowohl für die Stimulation mit dendritischen
Zellen ohne rBet v 1 als auch für die Stimulation mit dendritischen Zellen
plus rBet v 1.
Vergleicht man nun die einzelnen Zellpopulationen - also die CD4+ bulk, die
CD4+ CD25+, die CD4+ CD25- und die CD4+ CD25-/CD4+ CD25- Zellen darin, wie stark sie in Abhängigkeit davon proliferieren, ob sie von
unbeladenen oder von rBet v 1-präsentierenden reifen dendritischen Zellen
stimuliert wurden, so zeigt sich, dass die mit rBet v 1-beladenen reifen
dendritischen Zellen eine stärkere Proliferation hervorzurufen vermögen als
die unbeladenen Zellen.
Betrachtet man die Proliferationsraten im Verlauf der SIT, zeichnen sich
einige Veränderungen ab. Während die Proliferation der CD4+ CD25+ und
der
CD4+
CD25-
T-Zellen
über
den
gesamten
Verlauf
der
Hyposensibilisierung auf einem relativ konstanten Level bleibt, fallen die
Proliferationsraten der CD4+ bulk und der CD4+ CD25+/CD4+ CD25- Zellen
im Laufe der Zeit deutlich ab.
In Korrelation dazu steigt der PIF bei den CD4+ bulk Zellen und den CD4+
CD25+/CD4+ CD25- Zellen in beiden Impfgruppen während der SIT deutlich
an, wobei die Zunahme bei der Stimulation mit rDCs mit rBet v 1 erheblich
höher liegt als bei der Stimulation mit rDCs ohne rBet v 1 (vgl. Abb. 13).
In der perennialen Behandlungsgruppe zeigt sich bei der Stimulation der
CD4+ CD25+/CD4+ CD25- Zellen mit rDCs ein Anstieg des PIF um 35,4%
und bei der Stimulation mit rDCs mit rBet v 1 ein Anstieg um 50%. In der
präsaisonalen Behandlungsgruppe liegt der Anstieg des PIF bei der
Stimulation mit rDCs bei 35,9% und bei der Stimulation mit rDCs mit rBet v 1
bei 45%.
72
Abbildung 13: Suppression der peripheren CD4+ CD25- T-Zellen durch regulatorische
T-Zellen im Verlauf der SIT mit ALK SQ Depot
®
versus Pollinex Quattro
®
nach
spezifischer Stimulation mit rDCs bzw. rDCs + rBet v 1; Mittelwerte aller ALK SQ
®
Depot -Patienten
bzw.
Pollinex
®
Quattro -Patienten
(n=10
in
jeder
Behandlungsgruppe)
Zusammengefasst bedeutet das folgendes:
Die CD4+ CD25+ T-Zellen, die sich selbst hypoproliferativ verhalten, sind in
der Lage, allergenspezifisch mit reifen dendritischen Zellen stimulierte CD4+
bulk Zellen und CD4+ CD25+/CD4+ CD25- Zellen zu supprimieren. Das
Potential ihrer inhibitorischen Wirkung wird bei der Stimulation mit rDCs +
rBet v 1 deutlich stärker ersichtlich als bei der Stimulation mit rDCs ohne
rBet v 1 und nimmt im zeitlichen Verlauf der Hyposensibilisierung zu. Die
Proliferation der CD4+ CD25- T-Zellen (ohne Anteil regulatorischer T-Zellen)
73
war erwartungsgemäß durchgehend auf konstant hohem Niveau vorhanden
(vgl. Abb. 12).
Diese Ergebnisse treffen für beide Behandlungsgruppen (ALK SQ Depot®
und Pollinex Quattro®) zu.
In der direkten Gegenüberstellung der beiden Impfstoffe bestehen aber auch
Unterschiede:
Die Proliferationsraten der CD4+ bulk Zellen, CD4+ CD25+ regulatorischen
T-Zellen, CD4+ CD25- T-Zellen und CD4+ CD25+/CD4+ CD25- Zellen
liegen bei der SIT mit Pollinex Quattro® durchschnittlich höher als bei der
SIT mit ALK SQ Depot®.
Im Laufe der SIT fällt die Proliferation der CD4+ bulk Zellen und der CD4+
CD25+/CD4+ CD25- Zellen in beiden Behandlungsgruppen ab.
Nach einjähriger SIT mit ALK SQ Depot® war die Proliferationsinhibition der
CD4+ bulk Zellen und der CD4+ CD25+/CD4+ CD25- Zellen größer als bei
der SIT mit Pollinex Quattro®. Die Proliferationsinhibition steigt während der
SIT bei beiden Impfstoffen an: Bei der Stimulation mit rBet v 1 bei der SIT
mit ALK SQ Depot® um 50%, bei der SIT mit Pollinex Quattro® um 45%.
4.6. Auswertung der Patientenfragebögen
Da für die Gesamtbeurteilung des Therapieerfolges vor allem die
Symptomverbesserung und die Zufriedenheit des Patienten eine wichtige
Rolle spielt, wurde in dieser Arbeit neben oben genannten immunologischen
Parametern ein besonderes Augenmerk auf das Beschwerdebild und die
subjektive Einschätzung des Patienten selbst gelegt.
Zu diesem Zweck wurden zusätzlich zur ausführlichen Anamnese zwei
Fragebögen (vgl. Kapitel 3.15.) entworfen, die den Verlauf der jeweiligen
Immuntherapie
dokumentieren
und
das
Nebenwirkungs-/Nutzenprofil
erfassen.
Nach Auswertung der einzelnen Interviews zeigte sich folgendes Bild (vgl.
Auswertung der Fragebögen auf Seite 68 und 69):
74
Auswertung der Fragebögen (= nach 2 Therapiezyklen)
Erhebungszeitpunkte: 1. BE, 2.BE, 3. BE, 4. BE und 18 Monate nach Beginn SIT
SIT mit ganzjährigem Therapieschema (native Allergene, Aluminiumhydroxidadsorbiert: ALK SQ Depot® Birke)
Beruf
Nr.
1
Redakteur
2
Student
3 Industriemeister
4
Hausfrau
5
Hebamme
6
Studentin
7
Bürokauffrau
8
Rentnerin
9
Zimmerer
10 Unternehmer
11
Lehrerin
12
Rentnerin
Nr. ∆ d
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4
5
6
6
6
4
6
3
3
5
2
6
Alter
IgE
rBet v 1
(kU/l)
IgG
rBet v 1
(mgA/l)
Symptome
vor SIT
Subjektive
Symptombesserung
Score
v. SIT
Score
n. 1 J.
SIT
Score
n. 2 J.
SIT
40
28
41
37
46
27
31
62
29
31
43
64
27,0 (Kl. 4)
12,2 (Kl. 3)
0,67 (Kl. 1)
22,7 (Kl. 4)
36,3 (Kl. 4)
54,9 (Kl. 5)
2,36 (Kl. 2)
5,40 (Kl. 3)
26,8 (Kl. 4)
3,44 (Kl. 2)
59,4 (Kl. 5)
36,9 (Kl. 4)
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
2,24
<2,00
<2,00
2,42
<2,00
R, C, O
R,C,A
R, C, A, O
R, C, O
R, C, A, O
R, C, A, O
R, C, H, O
R, C, A
R, C, H, O
R, C
R, C, O
R, C, A, O
R, C, O
R, C, A
R, C, A, O
R, C, (O)
R, C, A, (O)
R, C, A
R, C, (H)
R, C, A
R, C, (H)
R, C
R, C
R, C, (O)
5
7
9
8
8
8
10
7
8
6
8
8
2
4
6
6
3
6
6
6
6
3
6
2
1
2
3
2
2
4
4
4
5
1
6
2
Medikamentenverbrauch
(n. 1 J. SIT)
stark reduziert
reduziert
stark reduziert
stark reduziert
stark reduziert
stark reduziert
stark reduziert
unverändert niedrig
stark reduziert
stark reduziert
unverändert hoch
stark reduziert
Verträglichkeit d. Hypo
UWs
The- Zufrie- Compliance
rapie- denerfolg
heit
sehr gut
keine
sehr gut
keine
sehr gut
keine
sehr gut
keine
sehr gut
keine
gut
(lokal)
gut
(lokal)
systemisch
weniger gut
sehr gut
keine
sehr gut
keine
weniger gut lokal/systemisch
sehr gut
(lokal)
↑↑
↑↑
↑↑
↑↑
↑↑
↑
↑
↑
↑
↑↑
(↑)
↑↑
↑↑
↑
↑
↑↑
↑↑
↑
↑
↓
↑↑
↑↑
↓
↑↑
Sonstige
Anmerkung
sehr gut
sehr gut
gut
gut
sehr gut
gut
Abbruch SIT
gut
weniger gut
sehr gut
sehr gut
schlecht
Abbruch SIT
sehr gut
Tabelle 2: Charakterisierung der ALK SQ Depot® – Patienten (R = Rhinitis, C = Conjunctivitis, A =
Asthma, O = Orales Allergiesyndrom, H = Hauterscheinungen, SIT = Spezifische Immuntherapie, UW =
Unerwünschte Wirkung); ↑↑ stark gebessert, sehr zufrieden; ↑ mäßig gebessert, zufrieden; (↑) wenig
verbessert, wenig zufrieden; ↔ unverändert; ↓ verschlechtert, unzufrieden
Legende:
Subjektive Symptombesserung:
fett gedruckt = stark gebessert
normal gedruckt = mäßig gebessert
(in Klammern gedruckt) = wenig gebessert
UWs:
fett gedruckt = starke UWs
normal gedruckt = mäßige UWs
(in Klammern gedruckt) = leichte UWs
75
Auswertung der Fragebögen (= nach 2 Therapiezyklen)
Erhebungszeitpunkte: 1. BE, 2.BE, 3. BE, 4. BE und 18 Monate nach Beginn SIT
SIT mit Kurzzeitschema (Allergoid, Tyrosin-adsorbiert, MPL als Adjuvans:
Pollinex Quattro® Birke)
Beruf
Nr.
Alter
IgE
rBet v 1
(kU/l)
IgG
rBet v 1
(mgA/l)
Symptome
vor SIT
Subjektive
Symptombesserung
65
51
44
21
18,1 (Kl. 4)
23,0 (Kl. 4)
10,6 (Kl. 4)
0,16 (Kl. 0)
89,6 (Kl. 5)
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
3,39
R, C, O
R, C, O
R, C, A, H, O
R, C, A
R, C
R, (C)
keine
(R), C
8
8
8
8
6
7
8
7
6
5
8
5
59,1 (Kl. 5)
11,1 (Kl. 3)
34,3 (Kl. 4)
31,1 (Kl. 4)
1,79 (Kl. 2)
>100 (Kl. 6)
2,10 (Kl. 2)
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
<2,00
2,08
<2,00
R, C, A, O
R, C, H, O
R, C, O
R, C, A, O
R, C, A, O
R, C, A, O
R, C, A, O
R, C, A, O
R, C, A, (O)
R, C, H, O
R, C
( R)
R, C, A
R, C, A, O
R, C, A
R, C, (A)
7
7
7
8
8
10
9
10
4
5
5
7
6
5
6
7
1
4
4
7
4
3
5
5
13
Rentnerin
14 Callcenteragentin
15
Hausfrau
16
Schülerin
Techn.
Angestellter
17
18
Hausfrau
19
Monteur
20
Student
21
Handwerker
22
Beamter
23
Bauingeneur
24 Fabrikarbeiterin
51
35
30
26
55
56
50
40
Nr. ∆ d
Medikamenten- Verträglich- UWs
verbrauch
keit d.
(n. 1 J. SIT)
Hypo
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
keiner
reduziert
unverändert
wenig reduziert
stark reduziert
reduziert
reduziert
unverändert
reduziert
stark reduziert
unverändert
unverändert
2
3
0
3
6
3
3
1
4
7
4
5
gut
gut
gut
sehr gut
gut
gut
gut
sehr gut
sehr gut
gut
gut
sehr gut
lokal
(lokal)
keine
keine
(lokal)
(lokal)
(lokal)
keine
keine
lokal
(lokal)
keine
Therapie- Zufrieden- Compliance
erfolg
heit
↑
↑
↔
↑
↑↑
↑↑
↑
↔
↑↑
↑↑
↑
↑
↑
↑
↓
↑
↑↑
↑↑
↑
↓
↑
↑↑
↑
↑
gut
gut
weniger gut
gut
sehr gut
sehr gut
gut
weniger gut
gut
sehr gut
gut
gut
Score Score
v.
n. 1 J.
SIT
SIT
Score
n. 2 J.
SIT
Sonstige
Anmerkung
Studienabbruch
Studienabbruch
Tabelle 3: Charakterisierung der Pollinex Quattro® – Patienten (R = Rhinitis, C = Conjunctivitis, A =
Asthma, O = Orales Allergiesyndrom, H = Hauterscheinungen, SIT = Spezifische Immuntherapie, UW =
Unerwünschte Wirkung); ↑↑ stark gebessert, sehr zufrieden; ↑ mäßig gebessert, zufrieden; (↑) wenig
verbessert, wenig zufrieden; ↔ unverändert; ↓ verschlechtert, unzufrieden
Legende:
Subjektive Symptombesserung:
fett gedruckt = stark gebessert
normal gedruckt = mäßig gebessert
(in Klammern gedruckt) = wenig gebessert
UWs:
fett gedruckt = starke UWs
normal gedruckt = mäßige UWs
(in Klammern gedruckt) = leichte UWs
76
Die klinische Wirksamkeit und der Therapieerfolg beider Impfstoffe, welche
schon vorher in einer Vielzahl von Studien dokumentiert wurden, bestätigten
sich
auch
im
vorliegenden
Projekt.
Sowohl
beim
perennialen
®
Behandlungsschema (ALK SQ Depot ) als auch beim präsaisonalen
Kurzzeitschema (Pollinex Quattro®) kam es zu einer deutlichen Besserung
der Symptome.
Im größten Ausmaß beeinflusste dabei die SIT den Fließschnupfen (Abb.
14) und die Augenbindehautentzündung (Abb. 15) positiv, wirkte sich aber
auch günstig auf das Asthma bronchiale (Abb. 16) aus, solange die
inflammatorischen Prozesse und die Schädigung der Bronchien nicht zu weit
fortgeschritten waren.
Beim oralen Allergiesyndrom blieb der Status in den meisten Fällen
unverändert oder zeigte nur eine geringgradige Verbesserung (Abb. 17).
Hautreaktionen (atopisches Ekzem, Urtikaria) waren selten mit der Typ IAllergie assoziiert (n=2 in jeder Behandlungsgruppe), waren aber bei diesen
Patienten unter der spezifischen Immuntherapie leicht gebessert. Insgesamt
reduzierte sich die klinische Symptomatik in beiden Gruppen erheblich. Bei
keinem Studienteilnehmer fand im Beobachtungszeitraum ein Fortschreiten
der atopischen Erkrankung oder ein „Etagenwechsel“ vom Heuschnupfen
zum Asthma bronchiale statt, was für die präventive Wirkung der
Hyposensibilisierung spricht.
77
Subjektive Symptombesserung der Rhinitis
Anzahl der Patienten (n=20)
.
8
7
6
5
Alk SQ Depot ®
4
Pollinex Quattro ®
3
2
1
0
stark
verbessert
Abbildung
14:
mäßig
verbessert
Subjektive
wenig
verbessert
unverändert
Symptombesserung
der
®
Rhinitis
durch
die
®
Hyposensibilisierung mit ALK SQ Depot bzw. Pollinex Quattro (n=20)
Subjektive Symptombesserung der Konjunktivitis
.
8
Anzahl der Patienten (n=20)
7
6
5
Alk SQ Depot ®
4
Pollinex Quattro ®
3
2
1
0
stark
verbessert
Abbildung
15:
mäßig
verbessert
Subjektive
wenig
verbessert
Symptombesserung
®
unverändert
der
Konjunktivitis
®
Hyposensibilisierung mit ALK SQ Depot bzw. Pollinex Quattro (n=20)
durch
die
78
.
Subjektive Symptombesserung des Asthmas
Anzahl der Patienetn (n=20)
6
5
4
Alk SQ Depot ®
3
Pollinex Quattro ®
2
1
Subjektive
un
ve
rä
nd
er
t
ve
rb
es
se
rt
w
en
ig
st
ar
k
16:
m
äß
ig
ve
rb
es
se
rt
As
th
m
a
ke
in
Abbildung
ve
rb
es
se
rt
0
Symptombesserung
des
®
Asthmas
durch
die
®
Hyposensibilisierung mit ALK SQ Depot bzw. Pollinex Quattro (n=20)
.
7
Anzahl der Patienetn (n=20)
Subjektive Symptombesserung des oralen Allergiesyndroms
6
5
4
Alk SQ Depot ®
3
Pollinex Quattro ®
2
1
un
ve
rä
nd
er
t
ve
rb
es
se
rt
w
en
ig
ve
rb
es
se
rt
m
äß
ig
ve
rb
es
se
rt
st
ar
k
ke
in
O
AS
0
Abbildung 17: Subjektive Symptombesserung des Oralen Allergiesyndroms durch die
®
®
Hyposensibilisierung mit ALK SQ Depot bzw. Pollinex Quattro (n=20)
79
Im direkten Vergleich der perennialen und der präsaisonalen Therapie
zeigten sich im untersuchten Kollektiv folgende diskrete Unterschiede:
Bezüglich der subjektiven Verbesserung der Gesamtsymptomatik erzielte
das perenniale Behandlungsschema bessere Patientenbewertungen als das
Kurzzeitschema.
Während
nach
zwei
Behandlungszyklen
bei
der
perennialen Langzeittherapie die Beschwerden durchschnittlich um 66%
reduziert werden konnten, lag der Wert bei der Kurzzeittherapie bei 40%.
Diese Aussage basiert auf subjektiven Einschätzungen der Patienten selbst,
die anhand von Punktescores jeweils vor Therapiebeginn, nach einjähriger
und zweijähriger Therapie ermittelt wurden (Abb. 18, 19, 20). Hierbei sollten
die Patienten (n=10 je Gruppe) ihre klinischen Beschwerden auf einer Skala
von 0 bis 10 bewerten, wobei 0 überhaupt keine und 10 die schlimmsten
vorstellbaren Symptome bedeuteten.
Vor Beginn der SIT lag die Symptomstärke während der Pollenflugzeit in
beiden Gruppen auf vergleichbar hohem Niveau. Bereits nach einem
Therapiejahr ließ sich eine Reduktion der allergischen Beschwerden
verzeichnen und nach zwei Therapiejahren fiel die Symptomstärke weiter
ab. Die Reduktion der Symptomatik war im untersuchten Kollektiv nach der
Kurzzeittherapie geringfügig geringer ausgeprägt als nach der ganzjährigen
Therapie (vgl. Abb. 18).
80
Abbildung 18: Reduktion der Symptomstärke in der Pollenflugzeit unter der
®
®
Spezifischen Immuntherapie mit ALK SQ Depot (=A) versus Pollinex Quattro (=P);
Mittelwerte der Patienten (n=10 in jeder Behandlungsgruppe)
Während sich der durchschnittliche Score (von 0-10) in der perennialen ALK
SQ Depot®-Gruppe vom Ausgangswert 7,6 nach einem Therapiejahr fast
halbiert hatte und nach zwei Jahren einen Wert von 2,6 erreichte, sank der
Symptomenscore in der präsaisonalen Pollinex Quattro®-Gruppe von dem
Anfangswert 8,0 zunächst auf 6,0 und anschließend auf 4,8. Die Differenz
zwischen den Scores vor der Therapie und nach zweijähriger SIT (∆d) liegt
im untersuchten Kollektiv demnach in der ganzjährigen Behandlungsgruppe
bei 5,0 und in der präsaisonalen Behandlungsgruppe bei 3,2 Punkten (vgl.
Abb. 19 und 20).
Aus diesen Befunden geht hervor, dass sich beide Immuntherapien positiv
auf das Beschwerdebild auswirken, wobei sich die Symptome unter der
ganzjährigen Therapie (ALK SQ Depot®) etwas stärker besserten als bei der
Kurzzeittherapie (Pollinex Quattro®).
81
Subjektive Symptombesserung bei ganzjähriger SIT
(ALK depot SQ - Gruppe)
.
12
Punktescore auf Skala 1 - 10
10
8
6
4
2
0
vor SIT
nach 1 Jahr SIT
nach 2 Jahren SIT
Abbildung 19: Beurteilung der subjektiven Symptombesserung im Verlauf der
®
Hyposensibilisierungstherapie mit ALK SQ Depot anhand eines Punktescores von 1
bis 10 (n=10)
Subjektive Symptombesserung bei der Kurzzeit-SIT
(Pollinex Quattro - Gruppe)
.
12
Punktescore auf Skala 1 - 10
10
8
6
4
2
0
vor SIT
nach 1 Jahr SIT
nach 2 Jahren SIT
Abbildung 20: Beurteilung der subjektiven Symptombesserung im Verlauf der
®
Hyposensibilisierungstherapie mit Pollinex Quattro anhand eines Punktescores von
1 bis 10 (n=10)
82
In
Einklang
mit
der
Symptomreduktion
verbesserte
sich
der
.
Medikamentenverbrauch bereits nach einem Behandlungsjahr (Abb. 21a/b).
Reduktion des Medikamentenverbrauchs
10
9
8
Anzahl der Patienten (n=20)
7
6
Alk depot SQ ®
5
Pollinex Quattro ®
4
3
2
1
0
stark
reduziert
mäßig
reduziert
wenig
reduziert
unverändert
Abbildung 21a: Reduktion des Medikamentenverbrauchs durch die SIT mit ALK SQ
®
®
Depot bzw. Pollinex Quattro (n=20) nach einem Behandlungsjahr
83
Abbildung 21b: Reduktion des Medikamentenverbrauchs unter der spezifischen
Immuntherapie mit ALK SQ Depot
®
(=A) versus Pollinex Quattro
®
(=P) nach einem
Behandlungsjahr; Mittelwerte der Patienten (n=10 in jeder Behandlungsgruppe)
Beide Hyposensibilisierungstherapien sind gut verträglich (Abb.23), wobei
die Häufigkeit und Stärke von lokalen Nebenwirkungen, wie Schmerzen oder
Schwellungen im Bereich der Injektionsstelle, bei Pollinex Quattro®
durchschnittlich höher lag als bei ALK SQ Depot®. Leichte allergische
Reaktionen
(z.B.
Rhinitis
oder
Konjunktivitis)
wurden
in
unserem
Patientenkollektiv nicht beobachtet. Systemische Nebenwirkungen (z.B.
Asthma, Dyspnoe oder allergischer Schock) zeigten sich bei zwei Patienten
der ALK SQ Depot®-Gruppe (n=2 mit Asthma und Dyspnoe, vgl. Abb. 22).
84
Anzahl der Patienten (n=20)
.
Unerwünschte Nebenwirkungen der SIT
8
7
6
5
Alk depot SQ ®
4
Pollinex Quattro ®
3
2
1
0
keine
lokal
leicht
allergisch
stark
systemisch
Abbildung 22: Unerwünschte Nebenwirkungen der SIT mit ALK SQ Depot
Pollinex Quattro
®
®
und
im Vergleich (n=20). Lokal: z.B. Schwellung, Rötung, Schmerzen an
der Injektionsstelle; leicht allergisch: z.B. Niesen, Rhinitis, Konjunktivitis; stark systemisch:
z.B. Asthma, Dyspnoe, Kreislaufprobleme, allergischer Schock.
.
Verträglichkeit der Hyposensibilisierung
Anzahl der Patienten (n=20)
9
8
7
6
5
Alk depot SQ ®
4
Pollinex Quattro ®
3
2
1
0
sehr gut
gut
weniger gut
schlecht
Abbildung 23: Subjektive Akzeptanz und Verträglichkeit der SIT mit ALK SQ Depot
®
®
und Pollinex Quattro im Vergleich (n=20)
Trotz des deutlich größeren Zeitaufwandes erreichte das ganzjährige
Therapieschema mit ALK SQ Depot® im Hinblick auf die Compliance (=
85
konsequentes Befolgen der Therapierichtlinien und des ärztlichen Rates) ein
ähnlich gutes Ergebnis wie Pollinex Quattro® (Abb. 24).
.
Compliance der Patienten
Anzahl der Patienten (n=20)
7
6
5
4
Alk depot SQ ®
3
Pollinex Quattro ®
2
1
0
sehr gut
gut
weniger gut
schlecht
Abbildung 24: Compliance (= konsequentes Befolgen der Therapierichtlinien und des
®
®
ärztlichen Rats) der SIT mit ALK SQ Depot und Pollinex Quattro im Vergleich (n=20)
86
Die
meisten
Patienten
(83%)
zeigten
sich
mit
beiden
Hyposensibilisierungstherapien insgesamt sehr zufrieden und bewerteten
den Therapieeffekt als positiv (Abb.25).
Abbildung 25: Behandlungserfolg und subjektive Patientenzufriedenheit unter der
Spezifischen Immuntherapie mit ALK SQ Depot
®
versus Pollinex Quattro
®
(n=10 in
jeder Behandlungsgruppe)
Zusammenfassend wurde mit beiden Therapieformen aus Sicht der
Patienten ein guter Therapieerfolg erreicht, wobei ALK SQ Depot® in der
direkten Gegenüberstellung subjektiv etwas besser beurteilt wurde als
Pollinex Quattro®.
87
5. Diskussion
Die spezifische Immuntherapie, erstmals von Noon im Jahre 1911
beschrieben [99], ist nach heutigem Wissensstand neben der Allergenkarenz
die bisher einzige kausale Behandlungsoption von IgE-vermittelten Allergien.
Die Einführung des Begriffs „Allergie-Impfung“ durch die WHO 1993 wertete
den Stellenwert der spezifischen Immuntherapie auf und weist darauf hin,
dass nach heutigem immunologischen Verständnis die Hyposensibilisierung
bei Typ I-Allergie frühzeitig eingesetzt werden soll, um den natürlichen
Verlauf der allergischen Erkrankung und den „Etagenwechsel“ zum Asthma
bronchiale zu verhindern [38].
Trotz verbesserter Standardisierung und zunehmender Erkenntnislage zu
den Wirkmechanismen
spezifischen
hat
sich
das Grundprinzip
Immuntherapie
seit
der
der subkutanen
Erstbeschreibung
1911
nicht
grundlegend verändert. Den Patienten werden entweder Allergenextrakte
der natürlichen Allergenquellen oder im Rahmen von Studien rekombinante
Allergene repetitiv in hohen Dosen verabreicht, um das natürliche
Gleichgewicht
des
Immunsystems
wiederherzustellen.
Die
genauen
Wirkmechanismen sind weiterhin nicht abschließend bekannt und daher
weiterhin Gegenstand der aktuellen Forschung. Unumstritten ist inzwischen,
dass sogenannte regulatorische T-Zellen eine entscheidende Rolle in der
Aufrechterhaltung und in der Kontrolle der immunologischen Homöostase
spielen [4], [11], [22], [26], [126], [129], [130], [166].
In den letzten Jahrzehnten hat es eine ganze Reihe von Neuentwicklungen
auf dem Gebiet der Allergievakzine gegeben. Zum Beispiel wurden neue
Verabreichungsrouten (u.a. sublinguale [9], [20], [92], [140] oder intranodale
[2], [78], [168] Immuntherapie) und innovative Kurzzeitschemata [105], [107],
[119]
entwickelt.
Oder
den
Impfstoffen
wurden
modifizierte
Allergenbestandteile (z.B. Allergoide, modifizierte rekombinante Allergene)
[30], [76], [84], [156], [159], Adjuvantien (z.B. MPL-A) [105], [106], [119]
sowie Trägermoleküle (z.B. Tyrosin) [105], [119] hinzugefügt, um die
88
Wirkung der Vakzine zu verstärken, die Nebenwirkungen zu reduzieren und
die Behandlungsdauer zu verkürzen.
Aufgrund von wirtschaftlichen Rahmenbedingungen geht der Trend bei der
Patientenakzeptanz hin zu kürzeren Verabreichungsschemata, was für die
Patienten einen erwünschten Zeitvorteil bietet. Inwieweit diese neuen
Strategien eine gleichwertige Alternative zur klassischen perennialen
subkutanen Hyposensibilisierung darstellen, ist aufgrund von fehlenden
(Double Dummy) Vergleichsstudien weitgehend ungeklärt. Zahlreiche
placebokontrollierte
Studien
beschäftigen
sich
derzeit
-insbesondere
aufgrund der in Kraft getretenen neuen Therapieallergene-Verordnung
(TAV)- damit, die spezifische Immuntherapie bezüglich ihrer Wirksamkeit zu
überprüfen
und
zu
optimieren.
Hierbei
ist
vorrangiges
Ziel,
den
Wirksamkeitsnachweis eines Präparates in großen Studien mit hoher
Probandenzahl (>100) im Vergleich zu Placebo zu führen. Ein direkter
Vergleich von zwei unterschiedlichen Präparaten/Schemata erfolgt hierbei in
der Regel nicht. Ziel der Forschung ist es aber auch, dem Patienten
wirksame
und
nebenwirkungsärmere
Applikationsformen
mit
wenig
Zeitaufwand zu ermöglichen.
Da die Zahl allergischer Erkrankungen in den Industriestaaten in den letzten
Jahrzehnten zunahm und noch weiter zunimmt [94], [148], ist es im Hinblick
auf eine Prävention allergischer Erkrankungen ein wichtiges Anliegen, die
Mechanismen der Entstehung von Allergien zu verstehen und innovative
Strategien der primären und sekundären Allergie-Prävention sowie der
effektiven Tertiärprävention (= Therapie) zu entwickeln und zu evaluieren.
Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit die Effizienz zweier
verschiedener
Therapieschemata
bei
der
Typ
I-Allergie
auf
Birkenpollenallergene geprüft. Die ex vivo Isolation von regulatorischen TZellen und die Charakterisierung der Rolle von CD4+ CD25+ T-Zellen bei
der Kontrolle von Typ I-Allergien waren dabei als Read-out-Marker von
besonderem Interesse.
Im Verlauf der spezifischen Immuntherapie mit einem klassischen
perennialen Behandlungsschema und einem MPL-A-wirkungsverstärkten
Kurzzeitschema wurde ein aufwendiges immunologisches Monitoring
89
durchgeführt. Zu definierten Zeitpunkten wurden mononukleäre Zellen
(PBMCs) aus dem peripheren Blut der Patienten gewonnen, der prozentuale
Anteil der regulatorischen T-Zellen an den Gesamt-PBMCs mittels FACSAnalyse bestimmt und Proliferationsassays mit allergenspezifischer und
antigenunspezifischer Stimulation durchgeführt, um die Proliferation und die
Inhibition der T-Zellen beurteilen zu können.
Die klinische Wirksamkeit der subkutanen Immuntherapie konnte in der
Vergangenheit
durch
zahlreiche
placebokontrollierte
Studien
wissenschaftlich nachgewiesen werden [32], [41], [52], [69].
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der CD4+ CD25+ regulatorischen TZellen im Rahmen der spezifischen Immuntherapie bei Typ I-Allergien zu
untersuchen, wobei die perenniale Langzeittherapie unter ALK SQ Depot®
mit der präsaisonalen Kurzzeittherapie unter Pollinex Quattro® im Hinblick
auf ihre Behandlungseffekte verglichen wurde.
In beiden unterschiedlichen Behandlungsgruppen zeigte sich ein sehr
homogenes Patientenprofil, wodurch gute Voraussetzungen für eine
objektive Vergleichbarkeit gegeben waren. Es befanden sich in beiden
Gruppen jeweils 50 Prozent Männer sowie 50 Prozent Frauen. Alle
Patienten litten unter allergischer Rhinokonjunktivitis. Der Anteil der
Patienten mit Asthma bronchiale allergicum und oralem Allergiesyndrom war
in der Pollinex Quattro®-Gruppe um 10% bzw. 20% höher als in der ALK SQ
Depot®-Gruppe. Der Anteil der Studienteilnehmer über dem 40. Lebensjahr
lag bei der präsaisonalen Therapie 10% höher.
Keiner
der
Patienten
hatte
in
der
Vergangenheit
eine
Hyposensibilisierungstherapie erhalten. Alle Patienten wiesen seit mehreren
Jahren
allergische
Spontanremission
Symptome
zeigten.
auf,
die
Aufgrund
keinerlei
dessen
Anzeichen
ergibt
sich
einer
die
Schlussfolgerung, dass die Verbesserung der klinischen Symptomatik, die
Reduktion des Medikamentenverbrauchs und der Therapieerfolg auf die
spezifische Immuntherapie zurückzuführen sind.
90
Akdis und Blaser formulierten 1999 die wichtigsten Wirkungsmechanismen
der SIT: Die Induktion von antigenspezifischer Toleranz durch regulatorische
T-Zellen und die Inhibition der antigenspezifischen Zytokinproduktion sowie
der IgE-Produktion.
Die
Aktivierung
von
IL-10-produzierenden
Zellen
scheint
ein
Hauptmechanismus für eine erfolgreiche SIT zu sein. Der Therapieerfolg
manifestiert sich nach Akdis und Blaser (1999) zunächst in der IL-10Produktion durch unspezifische regulatorische T-Zellen. Im späteren Verlauf
produzieren auch B-Zellen sowie Monozyten IL-10 und halten dadurch die
Anergie und die Allergentoleranz der antigenspezifischen T-Zellen aufrecht
[6]. Bestimmte Zytokine können die Anergie wieder brechen: IL-2 und IL-15
induzieren eine Th1-Zytokinproduktion und die Bildung von IgG4, während
IL-4 die Produktion von Th2-Zytokinen und IgE reaktiviert [6], [66].
Bellinghausen et al. (1997) und Piconi et al. (2007) zeigen, dass eine
erfolgreiche SIT direkt mit der Induktion von IL-10 einhergeht [16], [109].
IL-10 supprimiert die saisonale IgE-Produktion und steigert die IgG4-Bildung.
Deshalb findet man nach einer SIT bei den Patienten eine verminderte
IgE:IgG4-Ratio [6], [66].
Verschiedene Subsets regulatorischer Zellen sind an der peripheren
Toleranzentwicklung beteiligt [56], [125], [127], [129], [130], [149].
Regulatorische CD4+ CD25+ T-Zellen verhalten sich hypoproliferativ,
supprimieren zellkontaktabhängig CD4+ CD25- T-Zellen in der Peripherie
und steuern somit die Zytokinsekretion der Effektorzellen. Dadurch sind sie
in der Lage, das Immunsystem zu kontrollieren und sowohl ein
Überschießen der Th1-Antwort als auch der Th2-Antwort zu unterdrücken
[6], [66].
Auch in unserer Arbeit konnten wir eine zentrale Rolle der CD4+ CD25+
regulatorischen T-Zellen im Rahmen der spezifischen Immuntherapie
nachweisen. Im Laufe der Hyposensibilisierung steigt der prozentuale Anteil
der CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen an den Gesamt-PBMCs deutlich
an und auch ihre Fähigkeit, die Proliferation von peripheren T-Zellen zu
inhibieren, nimmt mit der Zeit zu. Sowohl beim antigenunspezifischen
91
Proliferationsassay
mit
anti-CD3
und
anti-CD28
als
auch
beim
antigenspezifischen Proliferationsassay mit rDCs ohne rBet v 1 bzw. rDCs
mit rBet v 1 waren die regulatorischen T-Zellen nach einem Behandlungsjahr
in der Lage, die Proliferationsraten der CD4+ CD25-/CD4+ CD25+ T-Zellen
um mindestens 50% zu senken. Die Proliferationsinhibition der CD4+ TZellen durch regulatorische T-Zellen war in beiden Behandlungsgruppen
deutlich nachweisbar.
Die CD4+ CD25+ T-Zellen selbst proliferierten nach Stimulation, wie es für
sie typisch ist, auf nur sehr niedrigem Niveau und verhielten sich insgesamt
hypoproliferativ.
Immunologische Analysen zeigten, dass es unter einer subkutanen
Immuntherapie zur Modulation des Th1/Th2-Verhältnisses zugunsten der
Th1-Antwort kommt [154]. Dies hat langfristig eine Verminderung der
allergenspezifischen IgE-Produktion und einen Klassenwechsel zur Bildung
von
IgG4-Antikörpern
zur
Folge,
wodurch
die
allergische
Entzündungsreaktion abgeschwächt wird [16].
Ebenso erfolgt eine Beeinflussung der involvierten inflammatorischen Zellen
wie Mastzellen, eosinophilen und basophilen Granulozyten [75]. Diese
Immunmodulation ist letztendlich dafür verantwortlich, dass sich das
Beschwerdebild der Patienten verbessert und das Fortschreiten der Typ IAllergie
verhindert
wird.
Der
positive
Einfluss
der
spezifischen
Immuntherapie auf allergische Erkrankungen konnte in verschieden
klinischen Studien nachgewiesen werden [4], [73], [117].
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle regulatorischer T-Zellen bei der
Induktion allergenspezifischer Toleranz durch spezifische Immuntherapie
untersucht, wobei neben einer klassischen perennialen subkutanen Therapie
(mit Alk SQ Depot®) eine präsaisonale Kurzzeittherapie mit MPL-A als
Adjuvans (Pollinex Quattro®) zum Einsatz kam. Das besondere an diesem
präsaisonalen Impfstoff ist, dass er sowohl Tyrosin-adsorbierte Allergoide als
auch das Adjuvans Monophosphoryl Lipid A enthält, das an sich bereits
einen Th1-induzierenden Effekt hat und die Vakzinwirkung dadurch
verstärken kann [105]. Während bei der perennialen Therapie repetitiv jeden
92
Monat eine Impfdosis verabreicht wird, umfasst die Kurzzeittherapie lediglich
vier Injektionen vor der Pollensaison, wobei die Höchstdosis bereits bei der
dritten Applikation erreicht ist. MPL-A ist kontinuierlich in einer Dosierung
von 50 µg/ml enthalten [14], [105]. Die Konzentration der Allergoide in der
Kurzzeitvakzine und die der nativen Allergene in der perennialen Vakzine
sind in beiden Impflösungen wie allgemein bei Allergievakzinen üblich nach
dem Hauptallergen standardisiert.
Die Zugabe von Monophosphoryl Lipid A verstärkt die antiallergische
Wirkung der spezifischen Immuntherapie über die Aktivierung der Toll-likeRezeptoren 2 und 4 (TLR2 und TLR4), die u.a. auf der Zellmembran von
Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, dendritischen und epithelialen Zellen
vorkommen [86], [95], [96]. TLR haben die Fähigkeit, strukturelle Muster zu
erkennen, die nur von mikrobiellen Pathogenen exprimiert werden, sog.
pathogen-associated
microbial
patterns
(PAMPs),
darunter
auch
Lipopolysaccharide aus der Zellwand von Bakterien (z.B. MPL).
Die Stimulation von TLR durch PAMPs initiiert eine Botenstoffkaskade, die
zur Sekretion von Th1-typischen Zytokinen führt. Diese regulieren die
Reifung
von
Lymphozyten
zu
antigenspezifischen
Effektor-
oder
Gedächtniszellen. TLR-Agonisten wie MPL sind in der Lage, sowohl die
unspezifische,
angeborene
Immunabwehr
als
auch
die
erworbene
Langzeitimmunität positiv zu beeinflussen und somit zum Schutz vor
Krankheitserregern
bzw.
Antigenen/Allergenen
beizutragen
[86].
In
verschiedenen Studien wurde herausgefunden, dass es durch MPL zu einer
signifikant erhöhten Produktion von IL-10 und IL-12 kommt [55], [86], [131].
IL-10 inhibiert die Aktivierung von Mastzellen in der Lunge, unterstützt die
Bildung von IgG4 und supprimiert IgE. IL-12 unterstützt die Th1-Zelle.
Hieraus kann man schlussfolgern, dass MPL über Toll-like-Rezeptoren die
Produktion
von
Th1-aktivierenden
Zytokinen
induziert
[86]. Weitere
Untersuchungen belegen, dass durch MPL die IL-5-Produktion vermindert
bzw. die IFN-γ-Produktion erhöht wird. Es wird also ein Zytokinmuster
induziert, das eine Th1-gerichtete Immunantwort bei Allergikern verstärkt.
[112], [143], [163].
93
MPL kann den Anstieg von IgE-Antikörper (Booster-Effekt) verhindern und
die Bildung von Th1-typischen IgG-Subtypen induzieren [163]. Durch diese
immunogenen Effekte unterstützt MPL den Switch von einer Th2-gerichteten
zu einer Th1-gerichteten Immunantwort und verstärkt damit die Wirksamkeit
der SIT [163].
Die
Wirksamkeit
von
Quattro®
Pollinex
konnte
in
zahlreichen
placebokontrollierten Studien bereits nachgewiesen werden [14], [33], [34],
[35], [48], [105], [120], [134].
In einer im Jahre 2004 durchgeführten multizentrischen placebokontrollierten
Doppelblindstudie wurden 14 Birkenpollenallergiker präsaisonal mit Pollinex
Quattro® (Birke/Erle/Hasel, n=9) oder Placebo (n=5) therapiert. Nach
Blutentnahme
zu
verschiedenen
Zeitpunkten
wurden
T-Zellkulturen
angelegt. Es erfolgte die Stimulation mit Birkenpollenextrakt und die
Messung von Zytokinen mittels ELISA [143]. Als Ergebnis kam es bei der
ersten im Vergleich zur zweiten Gruppe zu einer signifikant erhöhten
Produktion von IFN-γ, welches die Bildung von IgG unterstützt und die Th2Zelle hemmt. Weiterhin konnte kein Anstieg von IL-4 und IL-5 während des
Pollenfluges festgestellt werden. IL-4 hemmt die Th1-Zelle und induziert die
IgE-Produktion.
IL-5
verstärkt
die
allergische
Reaktion
über
eine
Entzündungsreaktion mittels Attraktion von Eosinophilen. Pollinex Quattro®
induziert also ein Zytokinmuster, das die Th1-gerichtete Immunantwort bei
Allergikern verstärkt [143].
Eine weitere multizentrische placebokontrollierte Doppelblindstudie mit 20
Gräserpollenallergikern ergab, dass Pollinex Quattro® allergenspezifische
IgG-Antikörper induziert, die eine Histaminfreisetzung aus basophilen
Granulozyten nach Allergenkontakt signifikant [93] reduzieren.
Arbeiten, die das neue verkürzte MPL-haltige Therapiekonzept mit der
klassischen perennialen Langzeithyposensibilisierung verglichen haben, gab
es bislang nicht.
Beide
untersuchte
Behandlungszyklus
Allergievakzine
eine
zeigten
signifikante
im
Verlauf
des
Suppression
Effektorzellproliferation im Vergleich zum Ausgangsbefund.
ersten
der
94
Der Effekt der Induktion CD4+ CD25+ regulatorischer T-Zellen durch die
MPL-haltige Kurzzeittherapie mit Pollinex Quattro® hält nach unseren
Ergebnissen etwa sechs Monate an. Das heißt, es sind bei der
präsaisonalen Kurzzeittherapie mit den oben genannten vier MPL-haltigen
Injektionen ein nachweisbarer Anstieg der regulatorischen T-Zellen und
Suppression der Effektorzellproliferation für die Pollensaison gegeben, die
jedoch nach Beendigung des Behandlungszyklus nachlässt und vor dem
Pollenflug im nächsten Jahr wiederholt werden muss. Der prozentuale Anteil
der CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen lag aber auch bei oben
genanntem
Kurzzeitschema
Ausgangsniveau.
Insgesamt
nach
zeigte
12
Monaten
die
noch
MPL-haltige
über
dem
präsaisonale
Kurzzeittherapie mit nur vier Injektionen jedoch ein fast gleichwertiges
Ansprechen und eine ähnlich gute immunologische Wirkung während der
Pollenflugzeit wie die perenniale SIT, bei der die Impfungen jeden Monat
repetitiv wiederholt wurden.
Mittlerweile wurden eine Reihe unterschiedlicher Subsets an humanen
regulatorischen T-Zellen entdeckt, die zur peripheren Immuntoleranz
beitragen. An der Suppression von Allergiereaktionen sind die natürlichen
regulatorischen T-Zellen, die CD4 auf ihrer Oberfläche tragen und durch die
Expression der α-Kette des IL-2-Rezeptors (CD25+) charakterisiert sind,
beteiligt. Diese natürlichen CD4+ CD25+ T-Zellen exprimieren konstitutiv
CD45RO, GITR, das Histokompatibilitäts-Leukozyten Antigen (HLA-DR) und
das intrazelluläre zytotoxische T Lymphozyten-assoziierte Antigen 4 (CTLA4) [63], [123], [124], [132], [139]. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch
eine niedrige Expression der α-Kette des IL-7-Rezeptors (CD127) aus, was
sie von aktivierten CD4+ CD25+ Effektor-T-Zellen unterscheidet [11], [166].
Sie expandieren nicht nach Stimulation und unterdrücken die antigenspezifische Proliferation von konventionellen T-Zellen [50], [127]. Natürliche
regulatorische T-Zellen produzieren im Vergleich zu Tr1-und Th3-Zellen
keine Zytokine und sind gegenüber Apoptose resistenter als andere T-Zellen
[11], [64].
2003 konnten Hori und Mitarbeiter zeigen, dass der Transkriptionsfaktor
Foxp3 essentiell für die Differenzierung und Funktion dieser regulatorischen
95
T-Zellen ist [53]. Der Grund hierfür ist, dass Foxp3 genetische Programme
kontrolliert,
die
zur
spezifischen
Entwicklung
von
CD4+
CD25+
regulatorischen T-Zellen führen. Da CD25 auch bei CD25- T-Zellen nach
Aktivierung hochreguliert wird, gilt Foxp3 als einziger zuverlässiger Marker
CD4+ CD25+ regulatorischer T-Zellen [43], [53], [71].
Mutationen im Foxp3-Gen beim Menschen führen zu einem Syndrom mit
dem Namen IPEX. Dieses Akronym steht für „Immundysregulation,
Polyendokrinopathie, Enteropathie, X-linked Syndrom“, das durch eine
Autoimmun-Endokrinopathie, Typ I-Diabetes, inflammatorische MagenDarmerkrankung und schwere Atopie charakterisiert ist [11], [25], [43], [71].
Der Vergleich der Proteinexpression in verschiedenen CD4+ T-Zellen zeigte,
dass neben den CD4+ CD25high regulatorischen T-Zellen auch andere CD4+
CD25- bzw. CD4+ CD25low T-Zellen existieren, die Foxp3 auf sehr viel
niedrigerem Niveau exprimieren [44], [53], [91].
Da der Transkriptionsfaktor Foxp3 nur von den natürlichen regulatorischen
CD4+
CD25+
T-Zellen,
Oberflächenmoleküls
die
CD25
durch
(CD4+
eine
starke
CD25high)
Expression
gekennzeichnet
des
sind,
konstitutiv in anhaltend hoher (sustained high) Menge exprimiert wird, gilt er
weiterhin
als
das
wichtigste
Molekül
zur
Identifikation
natürlicher
regulatorischer T-Zellen des Menschen.
Die Expression dieses intrazellulären Proteins wurde in der vorliegenden
Arbeit mittels real-time-PCR in isolierten CD4+ CD25+ T-Zellen untersucht,
um die Identität der regulatorischen T-Zellen zu sichern. Wir konnten
nachweisen, dass die regulatorischen T-Zellen sowohl in der ALK SQ
Depot®-Gruppe als auch in der Pollinex Quattro®-Gruppe zu allen
Zeitpunkten der Blutentnahmen Foxp3 exprimierten.
Die
Funktion
regulatorischer
T-Zellen
besteht
nach
dem
heutigen
Verständnis darin, dass sie eine wesentliche Kontrollfunktion im Rahmen
chronisch inflammatorischer Prozesse spielen. Dabei kommt ihnen nicht nur
eine Rolle in der Suppression von sogenannten Th1-Krankheiten zu,
sondern auch bei der Kontrolle von inflammatorischen Veränderungen und
der Zytokinproduktion im Rahmen des Asthmas bronchiale [117], [122].
Bellinghausen und Mitarbeiter konnten zeigen, dass sowohl Atopiker (n=7)
96
als auch Nicht-Atopiker (n=6) CD4+ CD25+ T-Zellen haben, die in quantitativ
wie auch qualitativ vergleichbarer Weise die Th1- wie auch die Th2Immunantwort inhibieren können [3], [15], [29].
In unserer Studie konnten wir die charakteristischen Eigenschaften der
regulatorischen T-Zellen bestätigen. Wir haben zunächst CD4+ CD25+ TZellen
mittels
CD4-Negativ-
und
CD25-Positiv-Selektions-MACS
aus
Heparin-Vollblut isoliert und anschließend ihren prozentualen Anteil an den
Gesamt-PBMCs
mit
Hilfe
einer
FACS-Analyse
bestimmt.
Die
durchflusszytometrische Charakterisierung der Oberflächenmarker CD4 und
CD25 grenzen die natürlichen CD4+ CD25+ T-Zellen phänotypisch von
anderen regulatorischen T-Zellpopulationen, wie Tr1- und Th3- Zellen, ab
[27], [50], [127].
Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil der CD4+ CD25+ T-Zellen an den
Gesamt-PBMCs
zu
Beginn
der
Hyposensibilisierung
in
beiden
Behandlungsgruppen durchschnittlich bei 5,28% lag. Das entspricht dem
Ergebnis von anderen Forschungsarbeiten, die Werte um die 6% ermittelten
[31]. Im weiteren Verlauf der SIT ist in beiden Behandlungsgruppen ein
Anstieg des prozentualen Anteils der regulatorischen T-Zellen an den
Gesamt-PBMCs zu verzeichnen. Sowohl die Kurzzeithyposensibilisierung
mit
dem
Adjuvans
MPL-A
als
auch
die
klassische
perenniale
Langzeithyposensibilisierung zeigten bezüglich der Proliferationshemmung
der Effektorzellen nach spezifischer und unspezifischer Stimulation einen
deutlichen immunologischen Effekt.
In den Proliferationsassays mit unspezifischer und allergenspezifischer
Stimulation wiesen die selektierten CD4+ CD25- T-Zellen eine unverändert
starke Proliferation von der ersten bis zur vierten Blutentnahme auf, da die
Inhibition
durch
die
regulatorischen
T-Zellen
fehlte.
Eine
im
Behandlungsverlauf abnehmende Effektorzellproliferation wiesen sowohl die
CD4+ bulk Zellen mit dem natürlichen Anteil an CD4+ CD25+ T-Zellen auf
wie auch die gemischte Fraktion mit gleich vielen CD4+ CD25- und CD4+
CD25+ T-Zellen (je 100.000 CD25- und CD25+ T-Zellen). Im Verlauf der SIT
nahm die Proliferationsinhibitionsfähigkeit der regulatorischen T-Zellen in
97
beiden Behandlungsgruppen zu. Bei der spezifischen Stimulation mit rDCs +
rBet v 1 zeigte sich eine stärkere Suppression der Effektorzellproliferation
als bei der spezifischen Stimulation mit rDCs ohne rBet v 1.
Die regulatorischen T-Zellen selbst proliferierten nicht wesentlich, was
bestätigt,
dass
es
sich
um
regulatorische
T-Zellen
handelt.
Die
immunologische Wirkung der SIT beruht folglich nicht nur auf einer
Steigerung der Zellzahl der regulatorischen T-Zellen sondern auf einer
Induktion der Zellaktivität.
Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit publizierten Untersuchungen, die
zeigten, dass auch die Inhibition und Kontrolle von autoreaktiven T-Zellen
durch CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen antigenunspezifisch und zellzell-kontaktabhängig verlaufen [127], [128].
Im Mittel konnten die Proliferationsraten im Ansatz der CD4+ CD25-/CD4+
CD25+ T-Zellen auf etwa die Hälfte herunter reguliert werden, was auch
Arbeiten anderer Arbeitsgruppen bestätigen [31], [62], [64], [65], [125], [138],
[141], [144], [147].
Im Laufe des ersten Behandlungszyklus der SIT fällt die Proliferation der
CD4+ bulk Zellen und der CD4+ CD25+/CD4+ CD25- Zellen in beiden
Behandlungsgruppen ab. Die Fähigkeit zur Proliferationsinhibition steigt
während der SIT bei beiden Impfstoffen an, ist aber unter der Therapie mit
ALK SQ Depot® sowohl bei der spezifischen als auch bei der unspezifischen
Stimulation stärker ausgeprägt als bei der SIT mit Pollinex Quattro®. Bei der
MPL-verstärkten Kurzzeittherapie mit Pollinex Quattro® , bei der nur vier
Injektionen vor der Pollensaison appliziert werden, wird nach einem
Therapiejahr ein fast gleichwertiges immunologisches Ansprechen erreicht
wie bei der perennialen SIT mit ALK SQ Depot®.
Die untersuchten CD4+ CD25+ T-Zellen zeichneten sich durch zwei
Charakteristika aus, die sie klar als regulatorische T-Zellen identifizierten:
Zum einen proliferierten sie im Vergleich zum Subset der CD4+ CD25- TZellen bzw. der CD4+ bulk-Zellen nicht wesentlich, was sich sowohl bei der
unspezifischen Stimulation mittels anti-CD3 und anti-CD28 als auch bei der
98
spezifischen Stimulation mittels rBet v 1-beladenen und rBet v 1unbeladenen dendritischen Zellen zeigte. Zum anderen besaßen die CD4+
CD25+ T-Zellen in den allergenspezifischen und -unspezifischen Ansätzen
eindeutig ein inhibitorisches Potential. Durch die Zugabe der CD4+ CD25+ TZellen wurde eine deutliche Hemmung der Proliferation der entsprechenden
T-Zell-Population erreicht, die in Kokultur zu den regulatorischen T-Zellen
gegeben wurde.
Aufgrund unserer Ergebnisse ist davon auszugehen, dass sowohl die
Zellzahlerhöhung der regulatorischen T-Zellen als auch die Steigerung ihrer
Inhibitionsfähigkeit
für
die
therapeutischen
Effekte
der
spezifischen
Immuntherapie verantwortlich sind.
Die Wirksamkeit und Sicherheit der subkutanen spezifischen Immuntherapie
bei Erkrankungen der Typ I-Allergie insbesondere bei Pollenallergie, z.B. auf
Birke, Erle oder Hasel, sind in randomisierten, placebokontrollierten,
doppelblind durchgeführten Studien sehr gut belegt [74]. Die Wirkung setzt
bereits beim ersten Therapiezyklus ein und wird durch die Wiederholung der
SIT in den darauf folgenden drei bis fünf Jahren verstärkt [90], [101], [103],
[145]. Das Maximum wird erst nach etwa dreijähriger Therapie erzielt [164].
In unserer Arbeit nahm die subjektive Symptomstärke der Patienten während
der Pollenflugzeit, die anhand einer visuellen Analogskala erfasst wurde,
bereits im ersten Jahr ab. Das allergische Beschwerdebild reduzierte sich in
beiden Impfgruppen bereits nach einem Therapiejahr deutlich und fiel nach
zwei Behandlungsjahren nochmals weiter ab. Die Besserung der klinischen
Symptomatik war im untersuchten Kollektiv bei der perennialen Therapie mit
ALK SQ Depot® geringfügig stärker ausgeprägt als bei der präsaisonalen
Kurzzeittherapie mit Pollinex Quattro®. Dieses Ergebnis basiert auf der
subjektiven Bewertung der Patienten selbst, die anhand von Punktescores
jeweils vor Therapiebeginn, nach einjähriger und zweijähriger Therapie
ermittelt wurde.
Frühere Studien belegen, dass die Wirkung der spezifischen Immuntherapie
mit ALK SQ Depot® auch nach dem Ende der dreijährigen Therapie erhalten
99
bleibt [36], [57], wohingegen bei Pollinex Quattro® noch keine Daten
bezüglich des Langzeiteffekts existieren.
In den letzten Jahren wurde noch eine weitere Eigenschaft der spezifischen
Immuntherapie dokumentiert: Eine frühzeitige Behandlung verhindert die
Sensibilisierung auf weitere Allergene und greift damit präventiv in das
Krankheitsgeschehen ein [104]. Weiterhin gibt es eindeutige Hinweise
darauf, dass die Hyposensibilisierung einen Etagenwechsel der atopischen
Erkrankung von der Rhinitis zum allergischen Asthma aufhalten kann [157].
Insgesamt belegen die Studien, dass die Allergievakzinierung für die
Patienten trotz der damit verbundenen Mühen eine in höchstem Maße
lohnenswerte
Therapie
ist,
welche
die
Lebensqualität
entscheidend
verbessert [74], [158], [160]. Auch im einjährigen Verlauf unserer Studie kam
es
während
der
Hyposensibilisierungstherapie
des
immunologisch
untersuchten Patientenkollektivs zu keinem Fortschreiten der atopischen
Erkrankung.
Zu Beginn der Hyposensibilisierungstherapie litten alle Patienten unter
allergischer Rhinokonjunktivitis. Asthmatische Beschwerden wiesen 50% der
Patienten in der ALK SQ Depot®-Gruppe und 60% der Patienten in der
Pollinex Quattro®-Gruppe auf. Vom oralen Allergiesyndrom waren 70% der
Patienten in der ALK SQ Depot®-Gruppe und 90% der Patienten in der
Pollinex
Quattro®-Gruppe
Beschwerdesymptomatik
betroffen.
beim
Durch
Großteil
der
die
SIT
Patienten
konnte
in
die
beiden
Behandlungsgruppen bereits nach einem Jahr reduziert werden (n=10 bei
ALK SQ Depot®; n=9 bei Pollinex Quattro®).
Im größten Ausmaß beeinflusste dabei die SIT den Fließschnupfen und die
Augenbindehautentzündung positiv, wirkte sich aber auch günstig auf das
Asthma bronchiale aus, solange die inflammatorischen Prozesse und die
Schädigung der Bronchien nicht zu weit fortgeschritten waren. Dadurch
konnte der Medikamentenverbrauch deutlich eingeschränkt werden. Beim
oralen Allergiesyndrom blieb der Status in den meisten Fällen im
Behandlungszeitraum unverändert oder zeigte nur eine geringgradige
Verbesserung.
100
Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit anderen Forschungsarbeiten. Das
Positionspaper von Kleine-Tebbe et al. belegt, dass sich nasale Symptome
durch eine Allergievakzinierung häufig besser reduzieren lassen als
konjunktivale
Symptome
oder
ein
orales
Allergiesyndrom
bei
pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie [74].
Bousquet
et
al.
und
Abramson
et
al.
zeigten
auf,
dass
die
Hyposensibilisierung bei allergischem Asthma bronchiale einen positiven
Einfluss auf bronchiale Symptome und den Bedarf an antiasthmatischer
Medikation [23], sowie auf die unspezifische bronchiale Hyperreagibilität hat
[1].
Dies
gilt
jedoch
nur,
wenn
nicht
bereits
irreversible
Sekundärveränderungen an den Atemwegen vorliegen.
Ebenfalls
dokumentiert
ist
ein
deutlicher
Rückgang
des
Gesamtmedikamentenverbrauchs [158], [160]. In der Royal-Brompton-Studie
benötigten die Patienten bereits im ersten Jahr 80% weniger Medikamente.
Im zweiten und dritten Jahr lag der Rückgang sogar bei 95-100%. Die
Medikamenteneinsparung
war
hochsignifikant
Cromoglicinsäure-Augentropfen
bzw.
für
Antiallergika
-Nasenspray)
(z.B.
und
für
Bedarfsmedikamente, wie orales Prednisolon und inhalatives Salbutamol.
Die klinischen Ergebnisse waren begleitet von einer dauerhaften positiven
Veränderung der immunologischen Reaktionsfähigkeit.
Wir
konnten
in
unserer
Arbeit
ähnliche
Ergebnisse
zeigen.
Der
Medikamentenverbrauch konnte beim Großteil (70%) der Patienten bereits
nach einem Therapiejahr deutlich (von täglich bis mehrmals wöchentlich auf
selten bis nie) reduziert werden.
Beide Hyposensibilisierungstherapien sind gut verträglich, wobei die
Häufigkeit und Stärke von lokalen Nebenwirkungen, wie Schmerzen oder
Schwellungen im Bereich der Injektionsstelle, bei dem Tyrosin- und MPLhaltigen Vakzin mit 70% (Pollinex Quattro®; n=7) durchschnittlich um 50%
höher lag als bei ALK SQ Depot® mit 20% (n=2). Bei der Beurteilung der
Compliance erreichte ALK SQ Depot® trotz des deutlich größeren
Zeitaufwandes ein ähnlich gutes Ergebnis wie Pollinex Quattro®. In puncto
Gesamtzufriedenheit
und
Therapieerfolg
schnitt
das
perenniale
Langzeitschema aus subjektiver Sicht der Patienten geringfügig besser ab
als das präsaisonale Kurzzeitschema.
101
Die SIT ist die einzige Therapie, die den natürlichen Krankheitsverlauf
allergischer Erkrankungen beeinflusst und die Entwicklung von Asthma bei
Patienten mit allergischer Rhinitis verhindern kann [38]. Sie ist deshalb
kausale Therapie und Prävention der Typ I-Allergien zugleich.
Zusammenfassend haben wir in unserer Studie zeigen können, dass
prinzipiell beide Verabreichungsschemata bei der Typ I-Allergie auf
Pollenallergene frühblühender Bäume wirksam sind. Beim direkten Vergleich
der beiden untersuchten perennialen und präsaisonalen spezifischen
Immuntherapien zeigten sich geringe Unterschiede im Bezug auf die
immunologischen Effekte. Eine Aussage über die Langzeitwirkung kann bei
dem Behandlungszeitraum von einem Jahr nicht getroffen werden.
Bei der Gegenüberstellung der beiden Verabreichungsschemata konnten wir
im Einzelnen folgende Ergebnisse ermitteln, die für einen geringfügig
besseren Behandlungseffekt der ganzjährigen Hyposensibilisierung mit dem
Impfstoff ALK SQ Depot® sprechen:
• In der FACS-Analyse nimmt der Anteil der CD4+ CD25+ regulatorischen
T-Zellen an den Gesamt-PBMC im Verlauf der SIT bei beiden
Therapieformen zu. Allerdings fielen die regulatorischen T-Zellen bei der
Kurzzeittherapie
mit
Pollinex
Quattro®
nach
sechsmonatiger
Behandlungsdauer wieder ab, jedoch nicht bis auf den Ausgangswert vor
Beginn der Hyposensibilisierung. Bei der perennialen SIT dagegen blieb
der Anteil der CD4+ CD25+ T-Zellen auch nach 12-monatiger Therapie
auf konstant hohem Niveau.
• Des Weiteren kam es im allergenunspezifischen Assay mit anti-CD3 und
anti-CD28 zu einer Zunahme der Proliferationsinhibitionsfähigkeit der
CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen gegenüber den peripheren CD4+
CD25- T-Zellen und zwar bei der perennialen SIT mit ALK SQ Depot® mit
75% in stärkerem Maße ( um 30% mehr) als bei der präsaisonalen SIT mit
Pollinex Quattro® mit 45%. Die CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen, die
sich selbst hypoproliferativ verhielten, waren in der Lage, die CD4+ bulk T-
102
Zellen und die CD4+ CD25- T-Zellen um circa 50% zu inhibieren. Die
Suppression war in beiden Gruppen signifikant, wobei ALK SQ Depot®
geringfügig bessere Werte erreichte als Pollinex Quattro®.
• Im Proliferationsassay mit allergenspezifischer Stimulation (rDCs ohne
und mit rBet v 1) zeigte sich im Wesentlichen ein ähnliches Bild wie bei
der allergenunspezifischen Stimulation. Diese Ergebnisse des ex vivo
Proliferationsassays mit rBet v 1-beladenen autologen dendritischen
Zellen
spiegeln
die
natürlichen
Gegebenheiten
im
menschlichen
Organismus wider. Auch hier nahm die Proliferationsinhibitionsfähigkeit
der regulatorischen T-Zellen im Laufe der spezifischen Immuntherapie zu,
bei Pollinex Quattro® weniger stark als bei ALK SQ Depot®.
• Die Identität der regulatorischen T-Zellen wurde mittels Bestimmung der
Foxp3 mRNA-Expression mittels quantitativer real-time PCR untersucht.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass zu allen Zeiten der spezifischen
Immuntherapie in beiden Impfgruppen Foxp3 exprimiert wurde.
• Wir konnten zudem anhand einer subjektiven Analogskala nachweisen,
dass es in beiden Therapiegruppen zu einer deutlichen Verbesserung der
allergischen
Symptome
Allergievakzinierung
in
im
erster
Laufe
Linie
der
SIT
die
kam,
allergische
wobei
Rhinitis
die
und
Konjunktivitis positiv beeinflusste. Schon nach einem Therapiejahr fiel die
Symptomstärke deutlich ab und nach zwei Jahren war nochmals ein
deutlicher Rückgang zu verzeichnen. Die Reduktion der allergischen
Beschwerden bei Pollinex Quattro® war nur geringfügig schwächer
ausgeprägt als bei ALK SQ Depot®.
• Durch
die
Hyposensibilisierung
konnte
außerdem
der
Medikamentenverbrauch in beiden Gruppen eingeschränkt werden. Bei
ALK SQ Depot® war die Reduktion stärker ausgeprägt als bei Pollinex
Quattro®.
• Im Laufe unserer Studie rief der Impfstoff Pollinex Quattro® im Vergleich
zu ALK SQ Depot® häufiger lokale Nebenwirkungen (z.B. Rötung,
Schwellung oder Schmerzen an der Injektionsstelle) hervor.
• Die Compliance war trotz des Mehraufwands bei ALK SQ Depot® ähnlich
gut wie bei Pollinex Quattro®.
103
• Bei der Beurteilung der beiden Impfstoffe durch die Patienten schnitt ALK
SQ Depot® auch in puncto Therapieerfolg und Gesamtzufriedenheit
geringfügig besser ab als Pollinex Quattro®.
Insgesamt konnten wir anhand unserer Forschungsergebnisse nachweisen,
dass beide Verabreichungsschemata, also sowohl die perenniale Therapie
mit ALK SQ Depot® als auch die Kurzeittherapie mit Pollinex Quattro®,
hochsignifikante Behandlungseffekte aufweisen.
Wir konnten in unserer Arbeit zudem zeigen, dass beide Immuntherapien auf
ähnliche Art und Weise wirken und die Induktion von regulatorischen TZellen auslösen. Es ist mittlerweile unumstritten, dass diese CD4+ CD25+
regulatorischen T-Zellen eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und
Behandlung von allergischen Typ I-Erkrankungen spielen. Doch noch sind
nicht alle Einzelheiten der immunologischen Abläufe im Rahmen der
Hyposensibilisierung endgültig geklärt. Deshalb ist es gerade vor dem
Hintergrund der Allergieprävention und -therapie von Bedeutung, die
Kontrollfunktion der regulatorischen T-Zellen weiter zu charakterisieren. Dies
könnte dazu beitragen, die Mechanismen der allergischen Sensibilisierung im
frühen Kindesalter in den nächsten Jahren im Ganzen zu verstehen und
gezielte Strategien zu entwickeln, um damit langfristig der Zunahme
allergischer
Sensibilisierungen
und
atopischer
Erkrankungen
westlichen Industrienationen entgegenwirken zu können.
in
den
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°C
Grad Celcius
∆d
Delta d (Differenz)
Abb.
Abbildung
ACE
Angiotensin Converting Enzyme
(ein für die Blutdruck-Regulation wichtiges Enzym)
APC/APZ
Antigenpräsentierende Zelle(n)
Art.-Nr.
Artikel-Nummer
rBet v 1
Hauptallergen der Birke (Betula verrucoum)
B-Zelle(n)
Bone Cell(s)
BE
Blutentnahme
Bsp.
Beispiel
bzw.
beziehungsweise
CD(s)
cluster(s) of determination
CD4+ CD25+
gleichbedeutend zu CD4+CD25+
CTLA-4
Intrazelluräres Antigen (cytotoxic T-lymphocyte antigen-4)
DC(s)
dendritic cell(s)
DMSO
Dimethyl Sulfoxide
DPBS
phosphate buffered saline
EDTA
Ethylendiamintetra-Essigsäure
ethylenediamine tetraacetic acid
EAACI
European Academy of Allergology and Clinical
Immunology
ELISA
enzyme linked immuno sorbent assay
Eos
Eosinophile Granulozyten
FCS
Foetales Calf Serum
FACS
fluorescence-activated cell sorting
FcεRI
FcεRI-Rezeptor
FEIA
Fluoreszenz-Enzym-Immunoassay
FEV1
forcierte exspiratorische Vitalkapazität
Einsekundenkapazität (Lungenfunktion)
ff.
folgende
FITC
Fluorescein isothiocyanate
128
Foxp3/FOXP3
Transskriptionsfaktor Forkhead box protein 3
GITR
Oberflächenmolekül
(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor)
GmbH
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GM-CSF
granulocytes and macrophages colony stimulating factor
h
Stunde(n)
HSA
Human Serum Albumin
Hypo
Hyposensibilisierung
IFN
Interferon
IgA
Immunglobulin A
IgE
Immunglobulin E
IgG
Immunglobulin G
IgM
Immunglobulin M
IL
Interleukin
IPTW
Inverse Probability of Treatment Weighting
iTreg
induzierte regulatorische T-Zelle
iTregs
induzierte regulatorische T-Zellen
J.
Jahr/Jahre
LAG-4
Oberflächenmolekül (lymphocyte activation antigen-3)
MACS
Magnetic Cell Separation
mg
Milligramm
min
Minute(n)
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mm2
Quadratmillimeter
No./Nr.
Nummer
MHC
Major Histocompatibility Complex
MPL
Monophosphoryl Lipid
MPL-A
Monophosphoryl Lipid A
n
Anzahl
n.
nach
Nk
Natural Killer cell(s)
NkT
Natural Killer T-cell(s)
nTreg
natürliche regulatorische CD4+ CD25+ T-Zelle
129
nTregs
natürliche regulatorische CD4+ CD25+ T-Zellen
Pen-Strep
Penicillin/Streptomycin
PBMC(s)
peripheral blood mononuclear cell(s)
PE
Phycoerythrin
PIF
Proliferationsinhibitionsfähigkeit
RAST
Radio-Allergo-Sorbens-Test
rDC(s)
ripe dendritic cell(s)
rmp
rounds per minute / Umdrehungen pro Minute
RPMI 1640
Roswell Park Memorial Institute 1640, cell medium
s.
siehe
SCIT
Subkutane Spezifische Immuntherapie
SIT
Spezifische lmmuntherapie
SU
Standardised Unit(s)
SU/ml
Standardised Unit(s) pro Milliliter
T-Zelle(n)
Thymus Cell(s)
TAV
Therapieallergene-Verordnung
TGF-β
Wachstumsfaktor: transforming growth factor- β
Th1:
T-Helferzellen des Typs 1
Th2:
T-Helferzellen des Typs 2
Th3:
T-Helferzellen des Typs 3
Tr
regulatorische T-Zellen
Tr1
eine Untergruppe regulatorischer T-Zellen
Treg(s)
regulatorische T-Zelle(n)
U
Unit(s)
UWs
unerwünschte Wirkungen (hier Nebenwirkungen)
µg
Mikrogramm
µg/ml
Mikrogramm pro Milliliter
µl
Mikroliter
UK
Unit Kingdom
USA
United States of America
v.
vor
vgl.
vergleiche
WHO
Word Health Organisation / Weltgesundheitsorganisation
z.B.
zum Beispiel
130
8. Danksagung
Dem ärztlichen Direktor der Klinik Herrn Prof. Dr. med. Gerold Schuler
danke ich vielmals für die Bereitstellung der Forschungseinrichtungen, die
eine derartige Arbeit ermöglicht haben.
Herzlichst bedanke ich mich bei Frau Prof. Dr. med. Vera Mahler für die
Bereitstellung des Themas und für die hervorragende Betreuung und
Anleitung bei der Durchführung und Gestaltung der Arbeit. Sie hat mich
jederzeit fachlich unterstützt und stand mir bei Fragen und Problemen immer
mit Rat und Tat zur Seite. Mit ihrem Engagement und ihrer Motivation hat sie
die Realisierung der Arbeit ganz erheblich erleichtert.
Dem Direktor der Frauenklinik Erlangen Herrn Prof. Dr. med. Matthias W.
Beckmann danke ich ganz herzlich für die Übernahme des Korreferates.
Großer Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pahl (Institut für
Experimentelle
und
Klinische
Pharmakologie
und
Toxikologie
Universitätsklinikum Erlangen), der die Foxp3-Analyse für uns übernommen
hat und Herrn Prof. Dr. rer. nat. Oliver Kuss (Institut für Medizinische
Epidemiologie,
Biometrie
und
Informatik
Universitätsklinikum
Halle-
Wittenberg), der die Arbeit mit seiner statistischen Auswertung bereichert
hat. Bei Herrn Wolfgang Schmidt möchte ich mich sehr für die graphische
Gestaltung der Abbildungen bedanken.
Ganz herzlicher Dank gilt auch den medizinisch-technischen Assistentinnen
Andrea Wüst und Antje Golka, die mich im Labor bei meiner Arbeit
unterstützt haben.
Herrn Dr. med. Reiner Laumen und seinem Praxisteam aus Fulda danke
ich für die gute Zusammenarbeit.
Besonders bedanken möchte ich mich auch bei den Assistenzärztinnen bzw.
-ärzten
und
den
Schwestern
der
Allergieabteilung
der
Hautklinik
Universitätsklinikum Erlangen, die mich bei der Rekrutierung und der
Aufklärung der Patienten sowie bei den Blutentnahmen tatkräftig unterstützt
haben