Qualifizierte Target-Findung mittels hochauflösender

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Qualifizierte Target-Findung mittels hochauflösender
Proteomics-Technologien
Petra Weingarten1*, Petra Lutter1,2, Helmut Jonuleit3, Edgar Schmitt4, Sonja Bailey1, Helmut, E. Meyer1,2, Christoph Hüls1
1 Protagen
4
AG, Dortmund, 2 Medizinisches Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, 3 Hautklinik der Universität Mainz,
Institut für Immunologie, Universität Mainz
Zur Auffindung von besseren Targets werden neue Technologien benötigt.
Von den heute auf dem Markt befindlichen
Medikamenten wirken 98% auf Proteine
als Target[1]. 45 % modulieren dabei Rezeptor-Ligand-Interaktionen, 28 % wirken auf
Enzyme. Die Welt der Therapeutika hat also die Proteine im Fokus. Nur 2 % der Medikamente haben direkt oder indirekt mit
der DNA zu tun. Zur Zeit gibt es keine Anzeichen dafür, dass dieses Verhältnis in der
Zukunft eine Änderung erfahren wird.
DNA- und RNA-Therapeutika konnten bisher keine breite Anwendung in der Therapie von Erkrankungen finden.
Zusätzlich hat die Genom-Ära eine Flut von
neuen potentiellen Targets gebracht, die
jetzt durch den R&D Prozess der pharmazeutischen Industrie geschleust
werden müssen.
Technologien, die
auf Functional
Genomics basieren,
müssen nun eingesetzt werden, um
die potentiellen
Targets auf ihre
Relevanz hin zu
überprüfen.
Da Proteomics die Proteine und damit die
funktionellen Äquivalente der mittels Genomics als Target-Kandidaten identifizierten Gene untersucht, wird dieses Technologiegebiet zunehmend Bedeutung in der
Medikamentenentwicklung gewinnen.
Gleichzeitig benötigt die pharmazeutische
Industrie dringend neue gut validierte Targets, die im Idealfall neue Wirkprinzipien
für die zu entwickelnden Medikamente ermöglichen. Solche „New Modes of Action“
führen zu einer besseren Abgrenzung von
der Konkurrenz und zu einem stärkeren Patentschutz. Darüber hinaus erhofft man sich
die Reduktion von Nebenwirkungen bei
diesen neuen Medikamenten.
Ziel der hier beschriebenen Untersuchungen war daher, in verschiedenen biologi-
schen Systemen die Möglichkeit zur effizienten Detektion von Target-Kandidaten zu
untersuchen. Dafür wurde die Large-GelTechnologie (LGT), die von Joachim Klose
schon 1975 entwickelt wurde, eingesetzt[2].
Das volle Potenzial dieser Technologie kann
aber erst heute genutzt werden, da die Erstellung der Genomdatenbanken, die Fortschritte der Massenspektrometrie und die
Bereitstellung geeigneter Bioinformatik
effiziente Proteomanalysen ermöglichen.
Untersuchungen zur differentiellen
Proteinexpression in T-Zell-Populationen
Chronische Krankheiten mit inflammatorischem Hintergrund wie Rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose oder Morbus
Abb. 1: A: Hochauflösende 2D-Gele der stimulierten CD4+ T-Zellen (blau umrandet) und der stimulierten CD25+CD4+ Treg-Zellen
(orange umrandet). B: Vergrößerte Ansicht der beiden exemplarischen Gelausschnitte a und b, die differentiell exprimierte
Proteine enthalten.
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Crohn sind durch eine Gemeinsamkeit charakterisiert: Alle diese Krankheiten sind sehr
wahrscheinlich Autoimmunerkrankungen,
die durch eine fehlgeleitete Reaktion einer
zentralen Zellpopulation des Immunsystems, der T-Zellen, verursacht werden. TZellen spielen außerdem eine entscheidende Rolle bei allergischen Erkrankungen, der
Abstoßung von Transplantaten und der
Bekämpfung von Tumorzellen.
In den letzten Jahren ist in diesem Zusammenhang eine T-Zellsubpopulation in
den Fokus des Interesses gerückt, die sogenannten regulatorischen T-Zellen (Treg)[3].
Diese Zellpopulation ist entscheidend an der
Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz
und damit der Verhinderung autoimmunologischer Erkrankungen beteiligt. Zusätzlich
können Treg-Zellen Transplantationsabstoßungsreaktionen limitieren. Andererseits
sind sie vermutlich aber auch für die Suppression von tumorreaktiven T-Zellen verantwortlich.
CD4+ und CD25+CD4+1) Treg-Zellen
können mittels immunomagnetischer Partikel aus Blutprodukten isoliert werden. Die
Proteome solcher konventionellen CD4+ beziehungsweise der CD25+CD4+ Treg-Zellen
nach polyklonaler Stimulation wurden miteinander verglichen. Diese Proteomanalyse
dient zur Identifizierung von Proteinen, die
an dem Mechanismus der Suppression durch
CD25+CD4+ Treg-Zellen beteiligt sind. Da
ruhende Treg-Zellen keine inhibitorische
Aktivität besitzen, mußten die Zellen vor der
Proteomanalyse zunächst in vitro stimuliert
werden.
Stimulierte CD4+ und CD25+CD4+ TregZellen von zwei unterschiedlichen Spendern
standen zur Verfügung. Von den vier Proben
wurden jeweils hochauflösende 2D-Gele angefertigt (siehe Abb. 1). Die Proteome der
beiden Zellpopulationen (CD4+ T-Zellen
und CD25+CD4+ Treg-Zellen) der Spender
wurden unabhängig voneinander Softwaregestützt miteinander verglichen. Nur diejenigen differenziell exprimierten Proteine,
die sowohl bei Spender A als auch bei
Spender B auftraten, wurden als relevant bewertet. Insgesamt wurden 12 solcher differenziellen Proteinspots lokalisiert.
Diese in Treg-Zellen differentiell exprimierten Proteine können Ausgangspunkt einer Medikamentenentwicklung mit dem
Ziel sein, diese Zellen anhand solcher Proteine in vivo zu identifizieren und spezifisch
zu aktivieren (z. B. bei Autoimmunerkrankungen). Ebenso ist es denkbar, ihre
suppressiven Eigenschaften im Verlauf einer anti-Tumorbehandlung zu unterdrücken
und damit die Effizienz von immunologi-
1
Marker“ auf der Oberfläche der Treg-Zellen
Abb. 2: Detailansichten in Fehlfarbendarstellung von LGT-Gelen nach Silberfärbung und Bearbeitung
mit dem ProteomWeaver-Auswertungsprogramm. Die Gelausschnitte zeigen die unterschiedliche
Expression der Spots a, b und c nach Inkubation von EA.hy926-Zellen für acht Stunden mit GSNO in
unterschiedlichen Konzentrationen in serumhaltigem Medium. A: Kontrolle, B 125 µM GSNO, C: 250
µM GSNO und D: 500 µM GSNO.
E: Die Diagramme zeigen die Verteilung der relativen Intensitäten der Spots a, b und c nach
Quantifizierung mit dem ProteomWeaver-Auswertungsprogramm. Es zeigte sich eine signifikante
Abhängigkeit der Expressionsrate von der Konzentration an GSNO.
schen Vakzinen bei Tumorerkrankungen zu
erhöhen.
Untersuchungen zum Einfluss von
pharmakologisch wirksamen Substanzen
auf das Proteom von Endothelzellen
Das Endothel, welches das größte endokrine
Organ darstellt, ist zwischen dem Blutkom-
partiment und den glatten Gefäßmuskelzellen lokalisiert und spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Gefäßfunktionen. Zu seinen metabolischen und regulatorischen Funktionen gehören unter anderem die Erhaltung des physiologischen Gefäßtonus, die Regulation des Blutdrucks
über die Beeinflussung der Kontraktilität der
glatten Muskelzellen, die Kontrolle des GeBIOspektrum · Sonderausgabe · 8. Jahrgang
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rinnungssystems, sowie die Interaktion von
Blutplättchen und Leukozyten mit der Gefäßwand. Das Endothel spielt aufgrund dieser vielfältigen Funktionen bei zahlreichen
Erkrankungen wie beispielsweise HerzKreislauf-Erkrankungen, Krebserkrankungen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle.
Endotheliale Zellkulturen sind somit
ein wertvolles Modell für die Erforschung
endothelialer Funktionen und der damit
im Zusammenhang stehenden Erkrankungen.
Im Gegensatz zu stabilen Zelllinien unterliegen Primärzellkulturen spenderspezifischen Variationen, die durch Alter, Geschlecht oder Polymorphismen hervorgerufen sein können. Neben humanen Nabelschnurvenenzellen (HUVEC) wurde die
Zelllinie EA.hy926, die durch Fusion von
HUVEC mit der Lungenepithelzelllinie
A549 erzeugt wurde[4], verwendet.
Die Wirkung von vasoaktiven Substanzen
mit nachgewiesener in vivo Aktivität wurde
mit Hilfe der Proteomanalyse dieser Zellmodellsysteme in vitro untersucht.
1980 wurde erstmals von Furchgott die
Bedeutung des Endothels als Quelle einer
Substanz, die die Acetylcholin-vermittelte
Vasorelaxation von isolierten Aortenringen
vermittelt, beschrieben. Diese instabile Substanz, endothelium-derived relaxing factor
(EDRF), wurde 1987 von Palmer als Stickstoffmonoxid (NO) identifiziert. NO ist ein
potenter Vasodilator, der in Endothelzellen
durch das Enzym eNOS gebildet wird. Um
den Einfluss von NO auf die Endothelzellen zu untersuchen, wurden diese mit dem
NO-Donor S-Nitrosoglutathion (GSNO) inkubiert[5]. In den EA.hy926 Zellen führte
diese Behandlung zu einer Expressionsänderung von verschiedenen Proteinen. Die
Expressionsänderung zeigte eine signifikante Abhängigkeit von der eingesetzten
GSNO-Konzentration (siehe Abb.2).
Vergleichende Untersuchungen an
HUVEC konnten diese Expressionsunterschiede teilweise bestätigen und gleichzeitig weitere Unterschiede in der Proteinexpression aufdecken.
weiteren Schritte der Medikamentenentwicklung: Target-Validierung, Lead-Findung und Optimierung der Lead-Substanzen.
Der enorme Vorteil der Target-Findung
mit Hilfe von Proteomics liegt in der besseren Qualität der Aussage: Die funktionellen Einheiten, die Proteine, werden betrachtet. Die durch Proteomics detektierten
Targets haben also einen höheren Wert als
Targets, die zum Beispiel mittels mRNAProfiling gefunden wurden. Mit Hilfe von
Proteomics gefundene Targets können als
vor-validiert bezeichnet werden, da sicher
gestellt ist, dass diese Proteine in einem relevanten biologischen System funktionell
unterschiedlich in zwei physiologischen Zuständen detektiert worden sind. In einem
mRNA-Profiling Projekt muss genau diese
Aussage als nächster Schritt erst getroffen
werden.
Literatur:
[1] Drews, J. (2000). Drug discovery: a historical perspective. Science 287:1960-1964
[2] Klose, J. (1999): Large-gel 2-D electrophoresis.
Methods Mol. Biol. 112: 147-172
[3] Jonuleit H., Schmitt E., Kakirman H., Stassen
M., Knop J., Enk A.H. (2002): Infectious Tolerance:
Petra Weingarten
geboren 1971, 1990–
1995 Studium der Chemie an der Universität
Konstanz und Diplomarbeit bei Prof. Dr. Dr.
h.c. W. Pfleiderer auf
Zusammenfassung und Ausblick
Die dargestellten Untersuchungen zeigen
eindrucksvoll das Potenzial der Proteomanalyse, mit der Unterschiede in der
Proteinexpression effizient aufgedeckt werden können. Wichtige Voraussetzung ist allerdings die Bereitstellung gut validierter
biologischer Systeme. Der Vorteil solcher in
vitro Kulturen oder in vivo Modelle liegt
nicht nur in einer validierten Qualität der
Proben, sondern auch in der Verfügbarkeit
von Test- und Validierungssystemen für die
Die Limitationen der Proteomanalyse
mittels LGT liegen zur Zeit noch im begrenzten Durchsatz und in der verglichen
zum mRNA-Profiling benötigten großen
Probenmenge. Entwicklungen zur Automatisierung von LGT und den nachfolgenden
Schritten wie Ausstechen der Protein-Spots
aus dem Gel, Verdau und Elution der Proteine und Peptide aus dem Gel, Probenpräparation, massenspektrometrische Analyse und anschließende bioinformatische
Prozessierung der Rohdaten bis zur Identifizierung des Proteins haben begonnen und
tragen deutlich zu einer Steigerung des
Durchsatzes an Proben und zur Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei.
Christoph Hüls
Jahrgang 1962, Studium
der Biologie an der Johannes-Gutenberg-Universität in Mainz, 1994
Promotion bei Prof. Dr.
Erwin Rüde am Institut
für Immunologie in
Mainz auf dem Gebiet
der T-Zell-Regulation
und –Differenzierung ,
1994–1996 Postdoktorand bei der Disease
dem Gebiet der Nukleinsäurechemie. 1996–
1999 Wissenschaftliche
Mitarbeiterin am Lehrstuhl für Chemische Mikrobiologie bei Prof. Dr.
W. Piepersberg Universität GH Wuppertal und
2000 Promotion auf
dem Gebiet der Antibiotikabiosynthese. 1999
Mitgründung der Protagen AG und seitdem
Projektleiterin Target
Discovery bei der Protagen AG.
Human CD25+ Regulatory T Cells Convey Suppressor Activity to Conventional CD4+ T Helper Cells. J. Exp. Med.
196 (2): 255-260
[4] Edgell, C-J. S. (1983): Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3734-3737
[5] Ignarro L.J., Napoli C., Loscalzo J. (2002): Nitric
oxide donors and cardiovascular agents modulating the
bioactivity of nitric oxide: an overview. Circ. Res. 90 (1):
21-28
Korrespondenzadresse:
Dr. Petra Weingarten
Protagen AG
Emil-Figge-Str. 76 A
D-44227 Dortmund
Tel.: 0231-9742-890
Fax: 0231-9742-891
[email protected]
Group Rheumatologie
der Hoechst AG in
Frankfurt (heute Aventis
SA), 1996–1999 verschiedene Positionen im
Forschungsmanagement in der Aventis Research & Technologies
GmbH & CoKG in Frankfurt (ehemalige Zentralforschung der Hoechst
Gruppe), 1999–2001
Leiter Projektmanagement und Portfoliosteuerung bei dem
deutschen Generikahersteller der NovartisGuppe in Gerlingen
(Azupharma GmbH &
CoKG), seit 2001 Geschäftsführer der Protagen AG.
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