Mimetische Peptide als molekulare Werkzeuge zur Analyse des HIV

Mimetische Peptide als molekulare
Werkzeuge zur Analyse des HIV-1
Eintrittsprozesses
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät /
dem Fachbereich Chemie und Pharmazie
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Andrea Groß
aus Wolfen
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät / vom Fachbereich Chemie und Pharmazie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 09.09.2013
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Gutachterin:
Gutachter:
Prof. Dr. Johannes Barth
Prof. Dr. Jutta Eichler
Prof. Dr. Heinrich Sticht
Meinen Eltern und Basti.
Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis........................................................................................ III
Tabellenverzeichnis .............................................................................................. V
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................... VII
1. Einleitung........................................................................................................... 1
1.1. HIV-1 und das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) ......................... 1
1.2. HIV-1: Morphologie und Replikationszyklus ................................................. 1
1.3. Details des Eintretens des Virus in die Zelle ................................................ 3
1.4. Die Strukturaufklärung von gp120 und des Spikes....................................... 5
1.5. Der CD4-Rezeptor........................................................................................ 9
1.6. Die Corezeptoren von HIV-1 ........................................................................ 9
1.7. Die V3-Schleife: Strukturen und Interaktionen............................................ 12
1.8. HIV-1: die Flucht vor dem Immunsystem und der fehlende HIV-1-Impfstoff13
1.9. Peptidische gp120-Mimetika ...................................................................... 15
1.10. Corezeptor-Mimetika ................................................................................ 17
1.11. Andere HIV-1-beeinflussende mimetische Peptide .................................. 18
1.12. Problemstellung........................................................................................ 20
2. Materialien und Methoden.............................................................................. 22
2.1. Geräte ........................................................................................................ 22
2.2. Verbrauchsmaterialien................................................................................ 24
2.3. Chemikalien................................................................................................ 24
2.4. Aminosäuren .............................................................................................. 25
2.5. Biochemikalien, Enzyme und Proteine ....................................................... 26
2.6. Methoden ................................................................................................... 27
2.6.1. Festphasenpeptidsynthese .................................................................. 27
2.6.2. Gesamtabspaltung der Peptide vom Harz ........................................... 29
2.6.3. Aufreinigung der Peptide ..................................................................... 29
2.6.4. Zyklisierung.......................................................................................... 30
2.6.5. Analyse der Peptide mittels LC-MS (ESI-MS)...................................... 31
2.6.6. Analyse der V3-Schleifen-Peptide mittels MALDI-TOF MS ................. 32
2.6.7. ELISA................................................................................................... 33
2.6.8. Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie)..... 38
2.6.9. Virologische Versuche ......................................................................... 39
2.6.10. Herstellung von anti-Peptid-Seren ..................................................... 42
2.6.11. Statistik .............................................................................................. 42
3. Ergebnisse....................................................................................................... 43
3.1. Die molekulare Basis der Wirkungsweise von CD4bs-M............................ 43
3.1.1. Synthese und Charakterisierung der CD4bs-M Varianten ................... 43
3.1.2. Die Verstärkung der HIV-1-Infektion durch CD4bs-M .......................... 45
3.1.3. Der Einfluss von CD4bs-M auf die Infektion von Zellen mit HSV-1...... 46
3.1.4. Die Bindung von CD4bs-M an gp120 und die Verstärkung der HIV-1Infektion von Primärzellen durch CD4bs-M.................................................... 47
3.1.5. Der Anteil der einzelnen Aminosäureabschnitte von CD4bs-M an der
Infektionsverstärkung und der direkten Bindung an gp120IIIB ........................ 48
3.1.6. Das β20/β21-Fragment: Bedeutung der Reihenfolge der Aminosäuren
für die Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB............................ 50
3.1.7. Der Einfluss der Aminosäureseitenketten des β20/β21-Fragmentes auf
die Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB ................................. 51
-I-
Verzeichnisse
3.1.8. Der Einfluss der Struktur des β20/β21-Fragments auf die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB ...................................... 52
3.1.9. Der Einfluss von CD4bs-M auf die HIV-1-Infektion von CD4-negativen
HeLa-Zellen ................................................................................................... 54
3.1.10. Die Abhängigkeit des durch CD4bs-M vermittelten HIV-1induzierenden Effekts vom Corezeptor .......................................................... 55
3.2. Der Einfluss der QR-Dipeptid-Insertion in der V3-Schleife auf die Erkennung
durch anti-V3-Schleifen-Antikörper.................................................................... 57
3.2.1. Synthese und Charakterisierung der V3-Schleifen-Peptide ................. 57
3.2.2. Die Interaktion der V3-Schleifen-Peptide mit anti-V3-SchleifenAntikörpern .................................................................................................... 61
3.2.3. Die Interaktion verschiedener anti-V3-Schleifen-Antikörper mit gp120 62
3.2.4. Die Bindung der anti-V3-Schleifen-Antikörper an die Peptide V3IIIB,
V3HxBc2, V3BAL und V3ADA ............................................................................... 63
3.2.5. Die Bindung verschiedener V3-Schleifen-Peptid-Varianten an anti-V3Schleifen-Antikörper....................................................................................... 64
3.2.6. Die Spezifität der Antikörper 2191, 3869 und 447-52D für V3-SchleifenEpitope........................................................................................................... 76
3.2.7. Antikörperseren gegen V3-Schleifen-Peptide mit und ohne QR-Insertion
....................................................................................................................... 80
3.3. Die Charakterisierung der CXCR4-gp120-Interaktion mittels mimetischer
Peptide .............................................................................................................. 84
3.3.1. Synthese und Charakterisierung der fluoresceinylierten V3-SchleifenPeptide........................................................................................................... 84
3.3.2. Die Interaktion der V3-Schleifen-Peptide mit CX4-M1 ......................... 87
3.3.3. Die Rolle der Interaktion von gp120 sowie V3-Schleifen-Peptiden mit
sCD4 für die Bindung an CX4-M1.................................................................. 91
3.3.4. Die Spezifität der Interaktion von CX4-M1 mit gp120 und V3-SchleifenPeptiden......................................................................................................... 92
3.3.5. Die Charakterisierung der CX4-M1-Bindungsstelle auf dem V3Schleifen-PeptidHxBc2 ...................................................................................... 93
3.3.6. Die Charakterisierung der V3-Schleifen-Bindungsstelle in der ECL2 von
CX4-M1.......................................................................................................... 95
3.3.7. Der Einfluss des Peptids V3HxBc2 auf die HIV-1-Infektionsinhibition durch
CX4-M1 97
4. Diskussion....................................................................................................... 99
4.1. Die molekulare Basis der Wirkungsweise von CD4bs-M............................ 99
4.1.1. Ausblick ............................................................................................. 103
4.2. Der Einfluss der QR-Dipeptid-Insertion in der V3-Schleife auf die Erkennung
durch anti-V3-Schleifen-Antikörper.................................................................. 107
4.2.1. Ausblick ............................................................................................. 112
4.3 Die Charakterisierung der CXCR4-gp120-Interaktion mittels mimetischer
Peptide ............................................................................................................ 114
4.3.1. Ausblick ............................................................................................. 119
5. Zusammenfassung ....................................................................................... 122
6. Summary........................................................................................................ 125
7. Literaturverzeichnis ...................................................................................... 128
8. Anhang........................................................................................................... 142
9. Danksagung .................................................................................................. 148
10. Eigene Publikationen und Vorträge........................................................... 149
- II -
Verzeichnisse
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematischer Aufbau des HI-Virus 1............................................................ 2
Abb. 2: HIV-1-Replikationszyklus. .............................................................................. 3
Abb. 3: Fusion von HIV-1 mit der Zielzelle (kanonischer Weg)................................... 4
Abb. 4: Vergleich von Fusion und Endozytose von HIV-1. ......................................... 4
Abb. 5: Röntgenkristallstruktur des CD4-gp120HxBc2-mAb17b-Komplexes (pdb 1GC1).
............................................................................................................................ 5
Abb. 6: Röntgenkristallstruktur vom SIV gp120Mac32H (pdb 2BF1). ............................. 7
Abb. 7: „Geschlossene“ und „geöffnete“ Struktur von gp120...................................... 8
Abb. 8: Struktur des Spikes im Komplex mit seinem Corezeptor CXCR4. ............... 11
Abb. 9: Modell des HIV-1 Spikes mit ausgewählten breit neutralisierenden
Antikörpern. ....................................................................................................... 14
Abb. 10: Röntgenkristallstruktur von gp120 und schematische Darstellung von
CD4bs-M. .......................................................................................................... 16
Abb. 11: Röntgenkristallstruktur von CXCR4 und schematische Darstellung von CX4M1. .................................................................................................................... 18
Abb. 12: HPLC-Chromatogramm und ESI-MS-Spektrum von CD4bs-M. ................. 43
Abb. 13: Verstärkung der HIV-1NL4.3-Infektion durch CD4bs-M................................. 45
Abb. 14: CD4bs-M beeinflusst nicht die Infektion von Zellen mit HSV-1. ................. 46
Abb. 15: CD4bs-M bindet an gp120 verschiedener HIV-1-Stämme. ........................ 47
Abb. 16: CD4bs-M verstärkt die HIV-1-Subtyp-Infektion von Primärzellen. .............. 48
Abb. 17: CD4bs-M: Korrelation von Infektionsverstärkung und direkter Bindung an
gp120. ............................................................................................................... 49
Abb. 18: Bedeutung der Reihenfolge der Aminosäuren im β20/β21-Fragment von
CD4bs-M. .......................................................................................................... 50
Abb. 19: Einfluss der Aminosäureseitenketten des β20/β21-Fragmentes auf die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB. ......................................... 51
Abb. 20: Einfluss von Prolinresten im β20/β21-Fragment auf die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB. ......................................... 53
Abb. 21: Einfluss von alternierenden L- und D-Aminosäuren im β20/β21-Fragment auf
die Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB. ................................... 53
Abb. 22: CD4bs-M induziert die HIV-1-Infektion von CD4-negativen HeLa-Zellen. .. 55
Abb. 23: Vergleich der Infektion von CEMx174 SEAP-Zellen mit X4- und R5-tropem
HIV-1NL4.3........................................................................................................... 56
Abb. 24: Röntgenkristallstruktur von gp120 und schematische Darstellung des V3Schleifen-Peptids. ............................................................................................. 57
Abb. 25: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten
Peptids V3IIIB. .................................................................................................... 58
Abb. 26: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten
Peptids V3HxBc2. ................................................................................................. 58
Abb. 27: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten
Peptids V3BAL. ................................................................................................... 59
Abb. 28: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten
Peptids V3ADA. ................................................................................................... 59
Abb. 29: Bindung der Peptide V3BAL und V3ADA an die anti-V3-Schleifen-Antikörper
3869 und 2191 sowie an gp130-Fc und b12. .................................................... 61
Abb. 30: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an gp120 mit
(gp120IIIB, gp120HxBc2) und ohne (gp120BAL, gp120ADA) QR-Insertion................ 63
- III -
Verzeichnisse
Abb. 31: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an V3-SchleifenPeptide mit (V3IIIB, V3HxBc2) und ohne (V3BAL, V3ADA) QR-Insertion. .................. 64
Abb. 32: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an die Peptide
V3IIIB (a) und V3HxBc2 (b) mit verschiedenen Mutationen im Aminosäurebereich
310-311. ............................................................................................................ 65
Abb. 33: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an die Peptide
V3BAL (a) und V3ADA (b) mit verschiedenen Mutationen im Aminosäurebereich
310-311. ............................................................................................................ 66
Abb. 34: Kompetition der Peptide V3HxBc2, V3HxBc2 ΔQR, V3BAL, V3BAL + QR, V3ADA und
V3ADA +QR mit gp120BAL und gp120ADA um Bindung an mAb 2191 und 3869. .... 77
Abb. 35: Kompetition der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA sowie deren
Varianten mit gp120IIIB, gp120HxBc2, gp120BAL und gp120ADA um Bindung an mAb
447-52D............................................................................................................. 78
Abb. 36: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des Immunogens
V3 Ova-HxBc2......................................................................................................... 80
Abb. 37: Bindung der Peptide V3HxBc2 und V3HxBc2 ΔQR an die Seren anti-V3Ova-HxBc2
und anti V3Ova-HxBc2 ΔQR. ..................................................................................... 82
Abb. 38: Bindung von gp120HxBc2 und gp120ADA an die Seren anti-V3Ova-HxBc2 und anti
V3Ova-HxBc2 ΔQR. ................................................................................................... 83
Abb. 39: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des
fluoresceinylierten Peptids V3HxBc2. ................................................................... 85
Abb. 40: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des
fluoresceinylierten Peptids V3MN........................................................................ 85
Abb. 41: Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA an CX4-M1. ............ 88
Abb. 42: Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3MN, V3BAL und V3ADA sowie gp120 der
passenden Stämme an CX4-M1. ...................................................................... 88
Abb. 43: Einfluss von sCD4 auf die Bindung von gp120HxBc2 und V3HxBc2 an CX4-M1.
.......................................................................................................................... 91
Abb. 44: Kompetition von 447-52D und 3869 mit CX4-M1 um Bindung an gp120HxBc2
und Peptid V3HxBc2............................................................................................. 93
Abb. 45: Bindung der verkürzten, von V3HxBc2 abgeleiteten Peptide an CX4-M1...... 94
Abb. 46: Bindung vom Peptid V3HxBc2, sowie dessen alaninsubstituierte Varianten, an
CX4-M1. ............................................................................................................ 95
Abb. 47: Bindung von gp120HxBc2 sowie vom Peptid V3HxBc2 an CX4-M1 und Alaninsubstituierte Varianten....................................................................................... 96
Abb. 48: Neutralisation von CEMx174 SEAP-Reporterzellen durch CX4-M1 und
Wiedererlangung der Infektiosität durch Kompetition mit V3-Schleifen-Peptiden.
.......................................................................................................................... 98
Abb. 49: Modell der möglichen Interaktion von CD4bs-M mit gp120. ..................... 100
Abb. 50: NMR-Struktur der V3-SchleifeIIIB (447-52D-Komplexstruktur) mit markiertem
R311................................................................................................................ 109
Abb. 51: NMR-Struktur der V3-SchleifeIIIB (447-52D-Komplexstruktur) (pdb 1U6U):
Einfluss der Alanin-Substitutionen. .................................................................. 115
Abb. 52: Ladungsabhängigkeit der CXCR4 – SDF-1-Interaktion (pdb 3OE0 und
2K05)............................................................................................................... 116
Abb. S 1: Überinfektion der Zellkulturüberstände CD4-positiver HeLa-Zellen nach 3-4
Tagen auf SEAP-Zellen................................................................................... 145
Abb. S 2: Bindung von mAb 2191 an verschiedene V3-Schleifen-Peptide im
Streptavidin-basierten ELISA. ......................................................................... 146
Abb. S 3: Bindung von mAb 2191 an verschiedene V3-Schleifen-Peptide im ELISA
ohne Streptavidin. ........................................................................................... 147
- IV -
Verzeichnisse
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Gegenüberstellung der HIV-1 Corezeptoren CCR5 und CXCR4. ................ 10
Tab. 2: Übersicht HIV-1-Infektions-beeinflussender Peptide. ................................... 19
Tab. 3: Reinigungsgradienten der präparativen HPLC. ............................................ 30
Tab. 4: Gradienten der LC-MS-Analyse. .................................................................. 32
Tab. 5: Sequenzen der verwendeten Peptide zur Untersuchung von CD4bs-M....... 44
Tab. 6: Sequenzen der verwendeten Peptide zur Untersuchung der Bedeutung der
QR-Insertion in V3-Schleifen-Peptiden auf die Bindung an anti-V3-SchleifenAntikörper. ......................................................................................................... 60
Tab. 7: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch und
ΔQR), sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 447-52D. ............... 67
Tab. 8: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2
(zyklisch und ΔQR), sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 44752D, gefittet nach dem 2-state-reaction-Modell................................................. 67
Tab. 9: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch und
ΔQR), sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 2191...................... 69
Tab. 10: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2
(zyklisch und ΔQR), sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 2191,
gefittet nach dem 2-state-reaction-Modell. ........................................................ 69
Tab. 11: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (R311E,
R311I, R311K), sowie V3BAL und V3ADA (+QE, +QI, +QK) an mAb 447-52D..... 70
Tab. 12: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2
(R311E, R311I, R311K), sowie V3BAL und V3ADA (+QE, +QI, +QK) an mAb 44752D, gefittet nach dem 2-state-reaction-Modell................................................. 70
Tab. 13: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (R311I,
Q310q R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+QI, +qr) an mAb 2191....................... 72
Tab. 14: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2
(R311I, Q310q R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+QI, +qr) an mAb 2191, gefittet
nach dem 2-state-reaction-Modell. .................................................................... 72
Tab. 15: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (Q310A
R311A, Q310q R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+AA, +qr) an mAb 447-52D. .. 74
Tab. 16: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2
(Q310A R311A, Q310q R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+AA, +qr) an mAb 44752D, gefittet nach dem 2-state-reaction-Modell................................................. 74
Tab. 17: Sequenzen der verwendeten Peptide zur Mausimmunisierung mit V3Schleifen-Peptiden. ........................................................................................... 81
Tab. 18: Sequenzen der V3-Schleifen-Peptide zur Untersuchung der Interaktion mit
CX4-M1. ............................................................................................................ 86
Tab. 19: Sequenzen der CX4-M1-Varianten zur Untersuchung der Interaktion mit V3Schleifen-Peptiden. ........................................................................................... 87
Tab. 20: SPR-Sensogramme der Bindung von Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3MN, V3BAL
und V3ADA (links) sowie der entsprechenden gp120 (rechts) an CX4-M1.......... 90
Tab. 21: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2,
V3MN, V3BAL und V3ADA (links) sowie gp120 der entsprechenden Stämme an
CX4-M1, gefittet nach dem 2-state-reaction-Modell. ......................................... 91
Tab. 22: Übersicht der verwendeten anti-V3-Schleifen-Antikörper, sowie deren
Herkunft und Bindungsepitope. ....................................................................... 108
-V-
Verzeichnisse
Tab. S 1: Berechnete und mittels ESI-MS ermittelte Massen der CD4bs-M-Varianten.
........................................................................................................................ 142
Tab. S 2: Berechnete und mittels MALDI-TOF MS ermittelte Massen der
biotinylierten V3-Schleifen-Peptide.................................................................. 143
Tab. S 3: Berechnete und mittels MALDI-TOF MS ermittelte Massen der
fluoresceinylierten V3-Schleifen-Peptide. ........................................................ 144
Tab. S 4: Berechnete und mittels ESI-MS ermittelte Massen der verkürzten
fluoreceinylierten V3-Schleifen-Peptide........................................................... 144
Tab. S 5: Berechnete und mittels ESI-MS ermittelte Massen der CX4-M1-Varianten.
........................................................................................................................ 145
- VI -
Verzeichnisse
Abkürzungsverzeichnis
AIDS
Erworbenes Immundefizienzsyndrom
(engl.: acquired immunodeficiency
syndrom)
A492
Absorbtion bei 492 nm
Ar
Relative Absorption
a.u.
Willkürliche Einheit (engl.: Arbitrary unit)
amu
Atommasseneinheit (engl.: Atomic mass
unit)
Bio
Biotin
Boc
tert-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe
BSA
Bovines Serumalbumin
cps
Impulse pro Minute (engl.: counts per
second)
CCR5 (R5)
CC-Motiv-Chemokinrezeptor 5
CD4
Differenzierungscluster 4 (engl.: Cluster of
differentiation 4)
CD4i Antikörper
Antikörper besitzt CD4-induziertes
Bindungsepitop
CDR H3
Komplementaritätsbestimmende Region
der schweren Kette des Antikörpers
(engl.: Complementary determining region
heavy 3)
CXCR4 (X4)
CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4
DIC
N,N’-Diisopropylcarbodiimid
DIPEA
N,N’-Diisopropylethylamin
DMF
Dimethylformamid
DMSO
Dimethylsulfoxid
DTNB
5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)
ECL
Extrazelluläre Schleife
EDTA
Ethanoldiamintetraacetat
ELISA
Enzymgekoppelter Immuntest (engl.:
- VII -
Verzeichnisse
Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
ESI
Elektronenspray-Ionisation
et al.
und andere (lat.: et alteri)
FACS
Durchflusszytometrie (engl.: Fluorescence
activated cell sorting)
Fc
Kristallisierbares Fragment (engl.:
crystallizable fragment) eines Antikörpers
FCS
Fötales Kalbsserum
Fluo
Fluorescein
Fmoc
Fluorenylmethoxycarbonyl
GFP
Grün-fluoreszierendes Protein
GPCR
G-Protein gekoppelter Rezeptor
gp41
Glykoprotein 41
gp120
Glykoprotein 120
HeLa-Zellen
Immortalisierte Zervix-Karzinom-Zelllinie
HIV-1
Humanes Immundefizienzvirus 1
HOBT
1-Hydroxybenzotriazol
HPLC
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(engl.: High performance liquid
chromatigraphy)
HRP
Meerrettich-Peroxidase
HSV-1
Herpes simplex Virus 1
IC50
Mittlere inhibitorische Konzentration
IL
Interleukin
ivDde
[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1ylidene)-3-methylbutyl]-Schutzgruppe
LC
Flüssigkeitschromatographie (engl.:
Liquid chromatography)
m/z
Masse / Ladung
mAb
Monoklonaler Antikörper
MALDI-TOF
Matrix-unterstützte LaserDesorption/Ionisation-Flugzeit (engl.:
Matrix-assisted-Laser
desorption/ionisation time-of-flight)
- VIII -
Verzeichnisse
mAu
Molare Absorptionseinheiten
MHC II
Haupthistokompatibilitätskomplex II
(engl.: Major histocompatibility complex II)
MIF
Makrophagen-Migrationsinhibitionsfaktor
(engl.: Macrophage migration inhibitory
factor)
min
Minute
MIP-1 α/β
Makrophagen-Entzündungsprotein α/β
(engl.: Macrophage inflammatory protein
α/β)
MOI
Multiplizität der Infektion
MS
Massenspektrometrie
NMR
Kernresonanzspektroskopie
OMPC
Neisseria meningitidis äußerer
Membranproteinkomplex (engl.: outer
membrane protein complex)
oMpe
ortho-Methylpent-3-ylester-Schutzgruppe
OPD
o-Phenylendiamin
PAP
Prostataspezifische saure Protease
Pbf
Pentamethylbenzofuran-Schutzgruppe
PBMC
Mononukleare periphäre Blutzelle (engl.:
Peripheral blood mononuclear cell)
RANTES
Engl.: Regulated on activation, normal T
cell expressed and secreted
rlu
Relative Lichteinheiten (engl.: relative
light units)
sCD4
Lösliches CD4
SDF-1
Stromazellen-entstammender Faktor 1
(engl.: Stromal cell-derived factor 1)
SEAP
Sezernierten alkalische Phosphatase
SEVI
Samen-Verstärker der Virusinfektion
(engl.: Semen-Enhancer of Virus
Infection)
SIV
Simianes Immundefizienzvirus
- IX -
Verzeichnisse
Spike
Hüllproteinkomplex aus gp120 und gp41
SPR
Oberflächenplasmonresonanz (engl.:
surface plasmon resonance)
t
Zeit
t-Bu
tert-Butyl-Schutzgruppe
TH-Zell-Epitop
T-Helferzell-Epitop
TFA
Trifluoressigsäure
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Trt
Trityl-Schutzgruppe
TZM-bl-Zellen
HeLa-Zelllinie, die CD4, CXCR4 und
CCR5 exprimiert
U
Einheiten (engl.: units)
V-Schleife
Variable Schleife
VIRIP
Virus-inhibierendes Peptid (engl.: Virus
Inhibitory Peptide)
-X-
Einleitung
1. Einleitung
1.1. HIV-1 und das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS)
1981 wurde in den USA ein gehäuftes Auftreten von Karposi’s Sarkom und
Pneumocystis Carinii verursachter Lungenentzündung, begleitet von weiteren
opportunistischen Infektionen, beschrieben, die bevorzugt bei homosexuellen
Männern auftraten und deren Ursache unbekannt war1. Die Epidemie konnte auf eine
erworbene Immunsuppression (verminderte T-Helfer-Zellzahl) zurückgeführt werden2
und wurde erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS) genannt. 1983 wurde HIV-1
als das zugrunde liegende Pathogen beschrieben3 und 1984 bestätigt4. Seit dieser
Zeit hat sich AIDS zu einer weltweiten Epidemie entwickelt. Im Jahr 2011 waren 34
Millionen Menschen mit HIV-1 infiziert5. 35 Millionen Menschen sind seit der
Entdeckung von AIDS an dieser unheilbaren Krankheit verstorben5. Ein gegen HIV-1
wirksamer Impfstoff konnte bis heute nicht entwickelt werden. Jedoch konnte die
Lebenserwartung und -qualität von HIV-1-infizierten Patienten durch die hochaktive
antivirale Therapie (HAART) deutlich gesteigert werden5,6.
1.2. HIV-1: Morphologie und Replikationszyklus
HIV-1 gehört zur Familie der Retroviren und zur Gattung der Lentiviren 7. Der
Virusdurchmesser beträgt etwa 126,5 nm8. HIV besitz zwei Kopien eines
einzelsträngigen RNA-Genoms9. Das virale Genom codiert für die Polyproteine Gag,
Pol und Env 9. Diese Polyproteine werden proteolytisch in individuelle Proteine
gespalten. Gag wird in die Proteine p17 (Matrix), p24 (Kapsid), Nukleokapsid und p6
gespalten, welche für die Virusmorphologie verantwortlich sind9. Env codiert für das
Glykoprotein 160 (gp160), welches in die Glykoproteine 120 und 41 (gp120 und
gp41) gespalten wird, die den viralen Spike bilden9. HIV-1 besitzt lediglich acht bis
zehn Spikes auf der Virusmembran8. Pol wird in die enzymatisch aktiven Proteine
reverse Transkriptase, Integrase und Protease gespalten, welche sich im Kapsid des
Virus befinden9. Zusätzlich codiert das virale Genom für sechs Proteine, die bei der
Virusreplikation und der Knospung, sowie dem zelleigenen Restriktionsmechanismus
eine Rolle spielen9 (Abb. 1).
-1-
Einleitung
Abb. 1: Schematischer Aufbau des HI-Virus 1.
Der HIV-1-Replikationszyklus (Übersichtsartikel10, Abb. 2) beginnt mit dem
Viruseintritt in die Zielzelle (detailliert beschrieben in Abschnitt 1.3). Als Zielzellen
dienen Zellen des Immunsystems, welche das Differenzierungscluster 4 (CD4)
exprimieren, wie z.B. Makrophagen und T-Helfer-Zellen. Während des Eintritts wird
das virale Kapsid in das Zytoplasma der Wirtszelle freigesetzt. Dieses beinhaltet die
doppelsträngige virale RNA, sowie zahlreiche Enzyme und Proteine. Dazu zählen die
reverse Transkriptase und die Integrase. Die virale RNA wird mittels reverser
Transkriptase in eine virale DNA umgeschrieben. Danach erfolgt der Import der DNA
in den Nukleus der Zielzelle, gefolgt von der Integration der viralen DNA in das
Wirtszellgenom mittels Integrase (Provirus). Durch Transkription wird das Provirus in
mRNA umgeschrieben. Davon wird die virale RNA und nach Translation die viralen
Proteine abgelesen. Das Vorläuferprotein gp160 wird, nach Prozessierung im
Endoplasmatischen Retikulum, im Golgi-Apparat in die Proteine gp120 und gp41
geschnitten, zum Spike zusammengesetzt und in die Wirtszellmembran eingefügt.
Die Vorläuferproteine Gag und Gag-Pol assoziieren zusammen mit der viralen RNA
an der Wirtszellmembran. Die finalen Schritte finden simultan statt. Die virale
Protease schneidet die Polyproteine in einzelne funktionale HIV-Proteine und
Enzyme, das Viruspartikel wird zusammengebaut und durch Knospung von der
Wirtszelle freigesetzt.
-2-
Einleitung
Abb. 2: HIV-1-Replikationszyklus.
1) Virusanlagerung. 2) Fusion. 3)
Freisetzung des viralen Kapsids. 4)
reverse Transkription. 5) Kernimport.
6) Integration der viralen DNA ins
Wirtszellgenom. 7) Transkription. 8)
Kernexport. 9) Viruszusammenbau.
10) Knospung. Grafik modifiziert aus11.
1.3. Details des Eintretens des Virus in die Zelle
Der HIV-1 Fusionsprozess besteht aus einer komplexen Abfolge von Interaktionen
und Konformationsänderungen und wurde 1999 wie folgt beschrieben12,13 (Abb. 3):
Die von HIV-1 auf der Oberfläche präsentierten Spikes bestehen aus zwei nichtkovalent assoziierten Untereinheiten: gp120 und gp41. Diese lagern sich zu Trimeren
zusammen und fungieren als Fusionsmaschinerie. Die Fusion ist pH-unabhängig14,15
und wird vermittelt zwischen dem in die Virusmembran eingebetteten Spike und CD4
sowie einem Corezeptor (CCR5 oder CXCR4) auf der Wirtszellmembran. Nach
relativ unspezifischer Bindung von gp120 mit negativ geladenen ZelloberflächenHeparansulfat-Proteoglykanen16, dem Integrin α4β717 oder DC-SIGN18 wird HIV-1 in
räumliche Nähe zu seinem Rezeptor CD4 gebracht13. Die darauffolgende Interaktion
erfolgt zwischen gp120 und CD4. Dies führt zur Freisetzung einer hohen
Bindungsenergie19 und Konformationsänderungen im Spike (insbesondere in gp120),
die eine Interaktion von gp120 mit dem Corezeptor ermöglichen. Man spricht hierbei
vom „Öffnen“ des gp120, wodurch das sogenannte Bridging sheet gebildet und die
V3-Schleife freigelegt wird. Durch Interaktion von gp120 mit dem Corezeptor werden
weitere Konformationsänderungen im Spike verursacht (insbesondere in gp41). Das
im
gp41
enthaltene
Fusionspeptid
wird
hierbei
freigelegt,
und
in
die
Wirtszellmembran eingefügt. Durch Ausbildung eines sechs-Helix-Bündels wird das
-3-
Einleitung
Virus nah an die Wirtszellmembran herangezogen und kann nun mit der Wirtszelle
fusionieren.
Abb. 3: Fusion von HIV-1 mit der Zielzelle (kanonischer Weg).
Dargestellt sind die CD4-Rezeptor-Bindung durch gp120, die Corezeptorbindung durch gp120 und die
gp41-vermittelte Zellfusion. Grafik modifiziert aus 13.
Als alternativer Mechanismus zum Eintritt von HIV-1 in die Wirtszelle wurde die
Endozytose beschrieben20 (Abb. 4), worauf unter anderem die Dynamin-Abhängikeit
der HIV-1-Infektion von TZM-bl-Zellen21 hinweist. Eine produktive Infektion durch
Endozytose wurde bis jetzt jedoch nur in immortalisierten Zelllinien beobachtet21,
während in primären CD4-positiven T-Zellen keine Endozytose nachgewiesen
werden konnte22. Vermutlich ist der gewählte Eintrittsweg (Fusion oder Endozytose)
Zelltyp-abhängig23. Zudem konnte gezeigt werden, dass HIV-1 die Internalisierung in
Makrophagen24 und dendritische Zellen als Transportweg zu CD4-positiven T-Zellen
nutzen kann (Trans-Infektion)18 und somit vor neutralisierenden Antikörpern
geschützt ist25, da bei der Trans-Infektion eine virologische Synapse gebildet werden
kann22,26-29. Ob HIV-1 durch Fusion mit der Wirtszellmembran oder durch Endozytose
mit anschließender Fusion mit der Endosomenmembran die Zielzellen infiziert, wird
kontrovers diskutiert.
Abb. 4: Vergleich von Fusion
und Endozytose von HIV-1.
Elektronenmikroskopische
Aufnahmen des HIV-1 Eintrittsprozesses. a) Fusion. b) Endozytose. Grafiken übernommen aus
20
.
-4-
Einleitung
1.4. Die Strukturaufklärung von gp120 und des Spikes
Die Kristallisation von gp120 gestaltet sich als schwierig. Trotz intensiver Forschung
ist es bis heute nicht gelungen, Volllängen-gp120 zu kristallisieren. Zahlreiche
Deletionen sowie Deglykosylierungen führten zwar zu Röntgenkristallstrukturen,
jedoch ist nicht auszuschließen, dass diese nicht-native Strukturen von gp120
darstellen. Die Aufklärung von NMR-Strukturen großer Proteine ist bis heute
problematisch, und für gp120 ist eine solche Struktur nicht publiziert worden. Eine
Alternative stellt die Cryoelektronentomographie dar, die auf der Basis einer Vielzahl
elektronenmikroskopischer Aufnahmen den viralen Spike gut darstellen kann. Bei
dieser Methode reicht jedoch die Auflösung nicht bis zum atomaren Level, sodass in
diese Strukturen Röntgenkristallstrukturen eingepasst werden, um ein möglichst
genaues Bild des Spike-Aufbaus zu erhalten. Im Folgenden soll auf bereits
aufgeklärte Strukturen eingegangen werden
1.4.1. Der gp120-CD4 Komplex
Einen Durchbruch im Verständnis des HIV-Eintrittsprozesses stellte die Kristallisation
und Aufklärung der Röntgenkristallstruktur des gp120-CD4-mAb 17b-Komplexes im
Jahr 1998 dar30 (Abb. 5). In dieser Struktur konnte die Interaktion von gp120 mit CD4
und dem Antikörper mAb 17b mit einer Auflösung von 2,5 Å aufgeklärt werden. Das
eingesetzte gp120 enthielt hierbei lediglich 10% der Glycosylierungen und besaß
Deletionen in den variablen Bereichen (V1/V2-Schleife und V3-Schleife) sowie am Nund C-Terminus.
Abb. 5: Röntgenkristallstruktur des CD4-gp120HxBc2mAb17b-Komplexes (pdb 1GC1).
Dargestellt ist gp120. CD4 und der mAb 17b wurden aus der
Struktur entfernt. Markierte Bereiche: violett: β2/β3-Fragment;
rot: β20/β21-Fragment; türkis: α1-Helix. Grafik erstellt mittels
RCSB Protein-Workshop.
-5-
Einleitung
Gp120 besteht aus 25 β-Strängen, 5 α-Helices und 10 definierten SchleifenSegmenten. Es besitzt fünf variable Schleifen und fünf konservierte Regionen31. Die
Hauptinteraktionen von CD4 werden vermittelt durch die Aminosäuren F43 und R59,
die intensive Kontakte mit den Aminosäureresten D368, E370, I371, N425, M426,
W427 und V430 des gp120 eingehen30. F43 des CD4 bindet hierbei in einer
Vertiefung im gp120. Das β20/β21-Fragment (Aminosäuren 422-434) sowie das
β2/β3-Fragment (Aminosäuren 119-201, hierbei V1/V2-Schleife deletiert) bilden eine
Struktur, die als Bridging sheet bekannt ist. Hier bindet der CD4i-Antikörper 17b. Das
i in CD4i steht für induziert und beschreibt, dass die Bindungsstelle dieses
Antikörpers erst nach CD4-Bindung freigelegt wird32. MAb 17b interferiert mit der
Corezeptorbindung von gp12033. Somit konnte gezeigt werden, dass das Bridging
sheet neben der V3-Schleife Teil der Corezeptorbindungsstelle ist.
Die Struktur eines V3-Schleife-beinhaltenden gp120 wurde 2005 veröffentlicht34.
Hierbei handelte es sich um einen Komplex aus gp120JRFL, CD4 und dem CD4iAntikörper X5 (Auflösung 3,5 Å). Auch in dieser Struktur ist das Bridging sheet
ausgebildet und bindet an den CD4i-Antikörper X5. Die V3-Schleife besitzt eine
Disulfidbrücke am Stamm, ist 50 Å lang, 15 Å breit und 5 Å tief. Sie zeigt konservierte
Bereiche (integrale Bestandteile des Kerns von gp120), eine Turn/Faltblatt-Struktur
an der Spitze und einen flexiblen Stamm.
1.4.2. Gp120 ohne Interaktionspartner
Im Jahr 2005 wurde eine Struktur von vollständig glykosyliertem gp120 eines
simianen Immundefizienzvirus (SIV) beschrieben (Auflösung 4Å), in der jedoch die
variablen Bereiche (V1/V2-Schleife und V3-Schleife) sowie Teile des N- und CTerminus deletiert wurden35. In dieser Struktur konnte gezeigt werden, dass die unter
1.4.1. beschriebene Corezeptorbindungsstelle, insbesondere das Bridging sheet,
nicht ausgebildet vorliegen (Abb. 6). Der Abstand zwischen den beiden Fragmenten
β20/β21 und β2/β3 beträgt 20-25 Å. Zwischen beiden Fragmenten liegt die
amphipatische α1-Helix mit exponiertem polaren Bereich. Ein Vergleich mit dem HIV1 gp120-CD4-Komplex aus 1.4.1. zeigt, dass diese α1-Helix nach CD4-Bindung nach
hinten
gedrängt
wird
und
sich
beide
zusammenlagern.
-6-
Fragmente
zum
Bridging
sheet
Einleitung
Abb. 6: Röntgenkristallstruktur vom SIV gp120Mac32H
(pdb 2BF1).
Markierte Bereiche: violett: β2/β3-Fragment; rot:
β20/β21-Fragment; türkis: α1-Helix. Grafik erstellt
mittels RCSB Protein-Workshop.
Weitere Röntgenkristallstrukturen von HIV-1 gp120 verschiedener Stämme ohne
Interaktionspartner wurden im Jahr 2012 veröffentlicht36. Auch hier hatten die
verwendeten gp120-Proteine Deletionen der V1/V2- und V3-Schleife, sowie im Nund C-terminalen Bereich. Unerwarteterweise zeigten diese gp120 die „geöffnete“
Konformation (vergleichbar mit der CD4-gp120-Komplexstruktur aus 1.4.1.). Für die
in dieser Publikation verwendeten gp120 konnte eine geringere Entropieänderung
nach CD4-Bindung festgestellt werden als für Volllängen-gp120, was darauf hinweist,
dass die Deletion der variablen Schleifen das konformationelle Äquilibrium des
gp120 ohne Liganden zur „geöffneten“ Konformation verschiebt. Somit kann den
deletierten variablen Schleifen sowie dem N- und C-Terminus eine entscheidende
Rolle bei der Erhaltung der „geschlossenen“ Konformation von gp120 zugeschrieben
werden.
1.4.3. Spike-Strukturaufklärung mittels Cryoelektronentomographie
Da HIV-1 einen Spike aus Trimeren von gp120 und gp41 auf der Virusoberfläche
exponiert, sind die unter 1.4.1. und 1.4.2. beschriebenen Röntgenkristallstrukturen
von monomerem gp120 nur bedingt aussagekräftig. Strukturelle Änderungen durch
die Ausbildung des Multiproteinkomplexes sind wahrscheinlich. Als Überbrückung
dieser Strukturlücke eignet sich die Anwendung der Cryoelektronentomographie,
einer
Abwandlung
der
Elektronenmikroskopie.
Solche
cryoelektronen-
tomographischen Strukturen des Spike-CD4-Komplexes sowie des Spikes ohne
Interaktionspartner wurden für HIV-1 und SIV in den Jahren 2003, 2008, 2010 und
2011 veröffentlicht37-41. Die Auflösung dieser Strukturen betrug etwa 20-30 Å. Die am
besten
aufgelöste
cryoelektronentomographische
Spike-Struktur
ohne
Interaktionspartner (11 Å) wurde 2012 veröffentlicht42. Die Ausmaße des Spikes
wurden
wie
folgt
ermittelt:
Höhe:
~120
-7-
Å,
maximale
Breite:
~150
Å,
Einleitung
Membranverknüpfung: 35 Å. Durch Fitting der Röntgenkristallstruktur von gp120 in
diese Spikestruktur können Rückschlüsse auf die Lage einzelner gp120-Bereiche
gezogen werden. Die V1/V2- und V3-Schleifen befinden sich an der Spitze des
Trimers und sind lösungsmittelexponiert38,40. Die cryoelektronentomographischen
Strukturen bestätigen, dass eine Konformationsänderung nach CD4-Bindung im
Spike stattfindet und widerlegen damit, dass die Struktur von gp120 ohne
Interaktionspartner der von CD4-gebundenem gp120 gleicht (siehe 1.4.1. und 1.4.2.).
Es wurde postuliert, dass die V1/V2- und V3-Schleifen an der Trimerschnittfläche
interagieren. Diese Interaktion wird wahrscheinlich durch CD4-Bindung gestört und
führt zur „Öffnung“ des Trimers42. Das CD4-gebundene Trimer zeigt dramatische
Konformationsänderungen im Vergleich zum Trimer ohne Ligand. Jedes gp120Monomer rotiert nach CD4-Bindung um 45° um eine Achse parallel zur zentralen 3Faltungsachse, um 15° aus der Ebene und bewegt sich um ~15 Å von der
Virusmembran weg38. Es kommt somit zu einer Hebelarm-ähnlichen „Öffnung“ des
Trimers (Abb. 7) mit Umorganisationen in den V1/V2- und V3-Schleifen und der
Umorientierung der CD4-Bindungsstelle. Die V3-Schleife wird nach „Öffnung“ des
Trimers der Zielzelle direkt präsentiert38. Die Herausbewegung des gp120 führt zu
starken Veränderungen der Orientierung der zwei äußeren Domänen (D1-D2) des
CD4, die Gelenkregion des CD4 knickt ein43. Dadurch kommt das Virus
wahrscheinlich näher an die Zielzellmembran, was die Infektion erleichtert38.
Abb. 7: „Geschlossene“ und „geöffnete“ Struktur von gp120.
(a,b) Ansicht aus Sicht der Zielzelle auf die Virusmembran. Dargestellt sind die „geschlossene“ (a) und
die „geöffnete“ (b) Struktur von gp120HxBc2 (pdb 1GC1)30, wie sie sich aus dem Fitting mit der
Dichtemappe aus Liu et al.38 ergeben. V1/V2-Schleifen-Basis: rot. V3-Schleifen-Basis: grün. CD4Bindungsstelle: gelb. Abbildung aus Harris et al., 2011 39.
-8-
Einleitung
1.5. Der CD4-Rezeptor
CD4 (früher auch als Leu-3a, T4 bezeichnet) ist ein 55 kDa schweres Protein und ist
ein Mitglied der Immunglubulin-Superfamilie44. Es besitzt vier extrazelluläre
Domänen, eine Transmembranregion und einen 38 Aminosäure beinhaltenden Cterminalen intrazellulären Bereich44. CD4 wird auf T-Helfer-Zellen, Macrophagen und
dendritischen Zellen sowie Monozyten exprimiert45 und ist neben dem T-ZellRezeptor an der Bindung an MHC II Proteine auf Antigen-präsentierenden Zellen
beteiligt
44,46
, was durch Aktivierung der T-Helferzelle und Cytokinausschüttung44 die
Produktion von Antikörpern durch B-Lymphozyten sowie die Aktivität von Phagozyten
stimuliert. Zusätzlich ist es als Corezeptor für die Aktivierung der T-Helfer-Zelle
verantwortlich44.
Beim Eintritt von HIV-1 in die Zelle dient CD4 als Rezeptor
45
. Die Struktur der vier
extrazellulären Domänen von CD4 konnte 1997 gelöst werden43. Darin ist eine
Gelenkregion zwischen der zweiten und dritten extrazellulären Domäne beschrieben,
die während des HIV-1-Eintritts in die Zelle das Virus in räumliche Nähe zur
Wirtszellmembran bringen könnte
43
. Die Interaktion von CD4 mit dem gp120 des
Spikes findet an der ersten extrazellulären Domäne statt30.
1.6. Die Corezeptoren von HIV-1
Die bekannten Corezeptoren für die HIV-1-Fusion heißen CCR5 und CXCR412 (Tab.
1). Beide sind Chemokinrezeptoren und gehören zur Familie der 7-TransmembranG-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)47, welche sieben membrandurchspannende Helices besitzen, mit ihrem extrazellulären Bereich (extrazelluläre
Schleifen (ECL) 1, 2 und 3 sowie N-Terminus) an das entsprechende Chemokin
binden und mit dem intrazellulären Bereich die Signaltransduktion vermitteln. Diese
Chemokinrezeptoren interagieren ebenfalls mit ihrem extrazellulären Bereich mit
dem Spike des Virus48.
Die Primärinfektion findet in der Regel mit CCR5-verwendendem HIV-1 statt. Im
Verlauf der HIV-Infektion kommt es bei 50% der Patienten zum Wechsel des
Corezeptors von CCR5 zu CXCR449. Dieser Wechsel ist mit dem Beginn der AIDSErkrankung verbunden und stellt demzufolge eine schlechte Prognose dar12.
-9-
Einleitung
Die Struktur von CCR5 konnte bis jetzt noch nicht mittels Röntgenkristallographie
aufgeklärt werden. Lediglich ein Modell auf der Grundlage der Struktur von
Rhodopsin50 wurde beschrieben51.
Eine Struktur von CXCR4 im Komplex mit synthetischen Antagonisten wurde 2010
beschrieben52. CXCR4 lag hierbei als Dimer vor. Aus der Struktur wird ersichtlich,
dass wahrscheinlich eine Ladungsinteraktion zwischen CXCR4 (negativ geladen im
extrazellulären Bereich) und dem Chemokin SDF-1 (Stromazellen–entstammender
Faktor 1, positiv geladen) stattfindet. Ein ähnliches Verhalten wurde auch für die
Bindung der V3-Schleife von gp120 an CXCR4 postuliert.
SDF-1 bindet an CXCR4 nach dem zwei-Seiten-Modell53. Nach diesem Modell bindet
SDF-1 zuerst selektiv und mit hoher Affinität an die N-terminale Domäne von CXCR4
(Seite 1). Anschließend wird die Interaktion mit den ECLs der extrazellulären
Domäne und den membrandurchspannenden Domänen begünstigt (Seite 2), was
dann zur produktiven Aktivierung des Rezeptors führt.
Tab. 1: Gegenüberstellung der HIV-1 Corezeptoren CCR5 und CXCR4.
CCR5
CXCR4
Natürliche Liganden
RANTES, MIP-1α, MIP-1ß47
SDF-154,55, (MIF56)
Biologische Aufgaben /
Exakte Rolle in normaler
Freistzung von Ca2+ in das
Wirkung
Immunfunktion noch nicht
Cytosol nach SDF-1-Bindung54,55,
aufgeklärt, wahrscheinlich
Chemotaxis von CXCR4-positiven
beteiligt an
Immunzellen entlang des SDF-1-
Entzündungsreaktionen
57
Gradienten55
Krankheitsbild bei
CCR5 Δ32 (homozygot):
Knockout-Mäuse mit deletiertem
fehlendem Rezeptor /
Resistenz für R5-trope HIV-1-
CXCR4 oder SDF-1 sind nicht
Chemokin
Infektion (Corezeptor wird nicht
lebensfähig58-60 (embryonale
zur Membran transportiert), keine
Letalität, Defekte der
gesundheitliche Beeinträchtigung
Lymphozyten- und Herzbildung
durch fehlendes CCR5
12
sowie des Nervensystems)
Bedeutung in HIV-1
Ermöglicht Infektion von CD4-
Ermöglicht Infektion von CD4-
Infektion
positiven Monozyten und
positiven T-Lymphozyten
Makrophagen
(T-tropes / X4-tropes HIV-1)47
(M-tropes / R5-tropes HIV-1)47
Interaktionen mit gp120
Hauptsächlich N-Terminus, auch
ECL248,61
- 10 -
ECL2 und N-Terminus48,62
Einleitung
1.6.1. Die Gp120-Interaktion mit dem Corezeptor CXCR4
Auf der Grundlage der Röntgenkristallstruktur des Komplexes aus gp120JRFL, CD4
und mAb X534 (siehe 1.4.1.) konnte die Corezeptorbindungsstelle wie folgt definiert
werden: die V3-Schleifen-Spitze interagiert mit ECL2 des Corezeptors, während das
Bridging sheet und die V3-Schleifen-Basis und deren benachbarte Reste mit dem NTerminus des Corezeptors interagieren63. Die Interaktion der V3-Schleife mit CXCR4
konnte
durch
die
Röntgenkristallstruktur
von
CXCR4
und
anschließende
Modellierung dieser Struktur zu einer elektronentomographischen Struktur des
viralen Spikes mit eingefügter gp120-Röntgenkristallstruktur weiter bestätigt werden
(Abb. 8). Eine Röntgenkristallstruktur des Komplexes von gp120 mit CXCR4 wurde
bis jetzt nicht veröffentlicht.
Abb. 8: Struktur des Spikes im Komplex mit seinem Corezeptor CXCR4.
Dargestellt ist die elektronentomographische Struktur des viralen Spikes (pdb 3DNO)38 mit internem
Fit der gp120- und CD4-Struktur (pdb 2QAD, 1WIP, 2KLU)43,64,65 und einer Modellierung der CXCR4Röntgenkristallstruktur52. Eine vergrößerte Darstellung des Interaktionsbereiches von gp120 mit
CXCR4 zeigt die potentiellen Kontaktstellen beider Proteine. Übernommen aus Wu et al.52.
Bei der Interaktion von CXCR4 mit dem Spike spielen geladene Reste eine
Schlüsselrolle. Obwohl große Unterschiede zwischen der Wichtigkeit verschiedener
Aminosäuren in CXCR4 für die Infektion durch verschiedene HIV-1-Stämme berichtet
wurden48, sind negativ geladene Reste (Aspartat und Glutamat) sowie Tyrosine
(sulfatiert im N-Terminus) essentiell für die Bindung von CXCR4 an gp12048. Im Jahr
2000 beschrieben Kajumo et al., das die HIV-1-Infektion der Zelle von YDE-reichen
Clustern im N-Terminus sowie im ECL-2 abhängig ist66.
- 11 -
Einleitung
1.7. Die V3-Schleife: Strukturen und Interaktionen
Die variable Schleife 3 (V3-Schleife) besitzt eine typische Länge von 34 bis 36
Aminosäuren67 und ist weniger variabel, als anfangs angenommen68. Der molekulare
Mechanismus der Interaktion der V3-Schleife mit dem Corezeptor konnte bis jetzt
nicht im Detail geklärt werden. Jedoch führt die Deletion der V3-Schleife zum
kompletten Verlust der HIV-1-Infektivität69. Eine Interaktion der V3-Schleife mit dem
Corezeptor CXCR4 konnte indirekt durch Kompetition mit einem gegen CXCR4
gerichteten
Antikörper
um
Bindung
an
CXCR4-positive
Zellen
sowie
der
Verminderung der Calciumfreisetzung durch Kompetition mit SDF-1 um Bindung an
CXCR4-positive Zellen nachgewiesen werden70. Die V3-Schleife besitzt eine starke
Immunogenität71, aber die meisten anti-V3-Schleifen-Antikörper sind nicht breit
neutralisierend72, und erkennen demzufolge nur eine limitierte Anzahl von HIV-1Stämmen.
Die 2005 und 2007 beschriebenen Röntgenkristallstrukturen von gp120 im Komplex
mit CD4 und dem CD4i Antikörper X5 sowie dem Antikörper 412d sind die einzigen
derzeit veröffentlichten Röntgenkristallstrukturen von gp120 mit intakter V3Schleife34,64. Diese V3-Schleife ist, außer an ihrer Basis, unstrukturiert. Als weitere
Methode zur Strukturaufklärung wurden V3-Schleifen-Peptide im Komplex mit antiV3-Schleifen-Antikörpern mittels Röntgenstrukturanalyse und NMR beschrieben73-86.
Aus diesen Strukturen ist ersichtlich, dass die V3-Schleife, welche in ungebundener
Form keine β-Faltblattstruktur aufweist34,64,85,87, die Tendenz hat, eine β-Faltblattartige
Struktur
auszubilden68
und
diese
tatsächlich
nach
Bindung
an
Interaktionspartner (anti-V3-Schleifen-Antikörper) ausbildet73,75,77,78,80-84,86. Zusätzlich
konnte durch kompetitive ELISA gezeigt werden, dass die native Disulfidbrücke der
V3-Schleifen-Basis zur Strukturstabilisierung dieser Schleife beiträgt und eine
effektivere Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper ermöglicht87.
Die V3-Schleife ist die Hauptdeterminante des Corezeptortropismus88 und reguliert
den Tropismus nach der 11/24/25-Regel89. Ist einer der Aminosäurereste 11, 24 oder
25 basisch (positiv geladen), dann bindet das zugehörige gp120 den Corezeptor
CXCR4. Sind die Aminosäureseitenketten neutral oder sauer (negativ geladen), dann
wird der Corezeptor CCR5 bevorzugt.
HIV-1LAI besitzt in der Spitze der V3-Schleife eine QR-Insertion zwischen den Resten
I309 und G31267 (HxBc2-Nomenklatur). Diese Insertion ist sehr selten86. Sie beeinflusst
- 12 -
Einleitung
nicht die Länge der β-Faltblatt-artigen Struktur in der V3-SchleifeIIIB, aber der Turn,
der diese Struktur verbindet, wird aus 6 Resten statt 3 Resten gebildet86. Dadurch
kommt es zu einer Verschiebung um eine Aminosäure sowie zu einer Drehung des
zweiten β-Stranges um 180°86. Die Insertion hat keine Bedeutung für den Tropismus,
jedoch beeinflusst sie die Neutralisation durch anti-V3-Schleifen-Antikörper68,90-92.
1.8. HIV-1: die Flucht vor dem Immunsystem und der fehlende HIV-1-Impfstoff
Die Generierung breit neutralisierender Antikörper gegen HIV-1, welche eine Vielzahl
verschiedenener HIV-1-Isolate erkennen, gestaltet sich trotz intensiver Forschung als
schwierig. Alle derzeit bekannten breit neutralisierenden Antikörper wurden aus
Patienten isoliert32,93-103 und nicht durch Immunisierung erhalten. Der Hauptgrund
des Fehlens eines effektiven Vakzins zur Generierung breit-neutralisierender
Antikörper ist die hohe Mutationsrate von HIV-1, da HIV-1 als Retrovirus eine
viruscodierte fehleranfällige reverse Transkriptase zum Umschreiben des Genoms in
DNA einsetzt, was zu einer Mutationsrate von 10-4 bis 10-6 Mutationen pro Nukleotid
und
genomischer
Replikation
führt104.
Dieses
führt
zu
hochvariablen
Proteinbereichen, welche konservierte Proteinbereiche verdecken. Ein weiterer
Grund für das Fehlen einer effektiven Impfung ist die komplexe Glykosylierung von
gp120, welche die zugängliche Oberfläche von gp120 für neutralisierende Antikörper
verdeckt105.
Ein weiterer Mechanismus von HIV-1, dem Immunsystem zu entkommen, ist, dass
ein zwei-Rezeptor-System zur Fusion mit der Wirtszellmembran genutzt wird. Es wird
angenommen, dass der evolutionäre Vorgänger des heutigen HI-Virus lediglich den
Corezeptor zur Fusion mit der Wirtszelle benötigte12. Die Verwendung von CD4 als
primären Rezeptor führte demnach zu größerer Zielzellspezifität sowie zum Schutz
vor der humoralen Immunantwort, da die Bindungsstelle für den Chemokinrezeptor
erst nach Interaktion des Spikes mit CD4 freigelegt wird und somit vor der „Öffnung“
des Spikes nicht von neutralisierenden Antikörpern gegen dieses Epitop erkannt
wird106. Zusätzlich spielt die halbsphärische Oberfläche des CD4-gebundenen gp120
für die Flucht vor dem Immunsystem eine Rolle. Dadurch wird die für Antikörper
zugängliche Oberfläche minimiert105. Die für die Entwicklung breit neutralisierender
Antikörper benötigten konservierten Epitope sind demzufolge auf dem Spike nur
schwer zugänglich und stellen nur einen Bruchteil der Oberfläche des Spikes dar,
- 13 -
Einleitung
welche durch bekannte breit neutralisierende Antikörper erkannt wird107 (Abb. 9).
Durch
Röntgenkristallstrukturanalyse
und
Mutationsstudien
der
breit
neutralisierenden Antikörper konnten die Epitope dieser Antikörper wie folgt ermittelt
werden: die CD4-Bindungsstelle auf gp120 (VRC01108,109, b12110,111, HJ1694), die
Corezeptorbindungstelle auf gp120 (CD4i-Antikörper 17b30, X534) und die V3-Schleife
(447-52D80), das Glykosylierungsmuster auf gp120 (2G12111, PGT-128112), Trimerspezifische Epitope auf gp120 (PG995,113, PG1695,114) und Epitope auf gp41
(2F5115,116, 4E10116,117, Z13e1116,118). Trotz dieses Wissens konnte in bereits
durchgeführten
Vakzinstudien
kein
hinreichender
Impfschutz
in
Patienten
hervorgerufen werden119-123. Die starke somatische Hypermutation und lange CDR
H3-Schleifen der schweren Kette der Antikörper107 spielen hierbei eine große Rolle.
Ein genaueres Verständnis der molekularen Basis des HIV-1-Eintrittsprozesses in
die Zelle wäre für die Immunogenentwicklung von großem Vorteil.
Ein auf Peptiden basierender Impfstoff wäre ein Durchbruch für die HIV-Forschung.
Mit Peptiden ist es möglich, sowohl lineare (ein Sequenzabschnitt) als auch
diskontinuierliche (mehrere Sequenzabschnitte, die im gefalteten Protein in
räumlicher Nähe zueinander stehen) Epitope des Spikes darzustellen und zu
modifizieren, und somit die Antikörperantwort gezielt gegen ein Epitop zu lenken,
welches das Virus nur bedingt durch verstärkte Mutation oder Glykosylierung
maskieren kann
124
. Somit besteht die Möglichkeit, breit neutralisierende Antikörper
zu erzeugen.
Abb. 9: Modell des HIV-1 Spikes mit
ausgewählten breit neutralisierenden
Antikörpern.
Cryoelektronentomographische
SpikeStruktur38 mit Bindungsstellen der breit
neutralisierenden Antikörper PG9 (gelb),
PGT128 (ocker), VRC01 (grün), 2F5
(pink)
und
4E10
(lachs).
Die
Zuckerketten
wurden
auf
einen
gp120YU2-Struktur modeliert36. Abbildung
aus Burton et al., 2012107.
- 14 -
Einleitung
Während die Immunisierung von Versuchstieren mit Proteinen durch deren Größe
ohne Hilfsproteine von statten geht, sind Peptide zu klein, um eine effiziente
Immunantwort auszulösen. Zusätzlich ist bei der Immunisierung nicht nur die
Präsentation des B-Zell-Epitops, sondern auch die Präsentation eines TH-ZellEpitops erforderlich, da T-Helfer-Zellen die naiven B-Zellen zur Proliferation in
Antikörper-produzierende Plasmazellen stimulieren44. Standardmäßig wird deshalb
ein Trägerprotein (KLH, Ovalbumin, humanes und bovines Albumin) an das Peptid
(Hapten) gekuppelt125. Diese Strategie wurde bereits 1994 für die Immunisierungen
mit
V3-Schleifen-Peptiden
beschrieben71.
V3-Schleifen-Peptid-OMPC-Konjugate
lösten virus-neutralisierende Immunantworten aus, die vergleichbar mit intaktem HIV1-Glykoprotein-Immunogenen waren. Es konnte jedoch keine breite Neutralisation
erzeugt werden71.
Eine Alternative zur Kupplung an ein Trägerprotein ist die Vollsynthese eines B- und
TH-Zell-Epitops mittels Festphasenpeptidsynthese. Dziadek et al. beschrieben 2005
die Synthese eines solchen Konstrukts als Antitumor-Impfstoff126. Das hier
verwendete TH-Zell-Epitop aus Ovalbumin (Ova323-339) war in der Lage, die T-HelferZellen spezieller Mäuse (DO11.10, erkennen spezifisch das TH-Zell-Epitop von
Ovalbumin127) zu stimulieren und dadurch eine starke und hochspezifische humorale
Immunantwort hervorzurufen.
1.9. Peptidische gp120-Mimetika
Die Peptidsynthese wurde mit die Entwicklung der Festphasenpeptidsynthese am
polymeren Träger durch R. B. Merrifield 1963 revolutioniert128. Dank dieser
Technologie ist es möglich, Peptide schnell und effizient in hoher Ausbeute zu
synthetisieren. Seitdem hat sich die Anzahl an peptidischen Mimetika und
Arzneistoffen drastisch erhöht129. Auch für die HIV-1 Forschung trifft dies zu130.
Durch den mehrstufigen Fusionsprozess von HIV-1 kommen mehrere potentielle
inhibitorische Peptide der HIV-1-Infektion auf der Grundlage der gp120-Sequenz in
Frage. Im Folgenden sollen einige Mimetika auf der Basis der jeweiligen
Bindungstelle aufgeführt werden.
- 15 -
Einleitung
1.9.1. CD4-Bindungsstellenmimetika
2007 wurde von Franke et al. ein diskontinuierliches CD4-Bindungsstellenmimetikum
auf der Basis der gp120-CD4-Komplexstruktur30 beschrieben, welches aus den
gp120-Fragmenten
365SGGDPEIVT373,
424INMWQEVGKA433
und
454LTRDGGN460 besteht und über ein verzweigtes Gerüst verknüpft wurde131.
Diese Fragmente beinhalten die für die Bindung von gp120 an CD4 essentiellen
Reste D368, E370, W427 und D45730. Das Mimetikum, genannt CD4bs-M (Abb. 10),
war in der Lage, mit gp120 um die Bindung an CD4 und den breit neutralisierenden
mAb b12 zu kompetieren, sowie in Immunisierungsstudien Antikörper hervorzurufen,
welche spezifisch gp120 erkannten und mit mAb b12 um Bindung an gp120
konkurrierten.
Ein weiteres CD4-Bindungsstellenmimetikum wurde 2009 veröffentlicht132. Es
handelt sich hierbei wie bei CD4bs-M um ein diskontinuierliches Bindungsstellenmimetikum aus 3 Fragmenten: 364SSGGDPEIV372, 424INMWQKVG431 und
454LTRDGGN460.
Alle
drei
Fragmente
wurden
zyklisiert
und
über
ein
Triazacyclophan-Gerüst präsentiert. Dieses Peptid konnte jedoch die Infektion von
CEM-Zellen mit HIV-1IIIB und HIV-2ROD nicht verhindern.
a)
b)
Abb. 10: Röntgenkristallstruktur von gp120 und schematische Darstellung von CD4bs-M.
a) Röntgenkristallstruktur von gp12030 im CD4-gebundenen Zustand (pdb 1GC1) mit markierten
Fragmenten, welche in CD4bs-M präsentiert werden. b) CD4bs-M mit den drei Fragmenten β20/β21,
β23 und der CD4-Bindungsschleife. Die Fragmente wurden an ein verzweigtes Gerüst gekoppelt131.
Die Grafik (a) wurde mittels RCSB Protein-Workshop erstellt.
- 16 -
Einleitung
1.9.2. Corezeptorbindungsstellen-Mimetika
Die Bindung von gp120 an den Corezeptor erfolgt mit Hilfe des Bridging sheets und
der V3-Schleife. Zahlreiche Untersuchungen wurden mit V3-Schleifen-mimetischen
Peptiden durchgeführt. Neben Peptiden für die Strukturaufklärung (siehe Abschnitt
1.7) wurden auch zahlreiche Peptidimmunogene synthetisiert68,71,92,133-135. Die V3Schleife ist sehr immunogen. Die primäre Antikörperantwort nach Infektion ist
hauptsächlich gegen die V3-Schleife gerichtet136,137. Bis jetzt wurden jedoch noch
keine breit neutralisierenden Antikörper durch Immunisierung erzeugt.
Das Bridging sheet als weiteres Bindungselement für den Corezeptor stellt eine
diskontinuierliche Bindungsstelle dar, welches aus dem β2/β3-Fragment und dem
β20/β21-Fragment des gp120 gebildet wird30. Das Bridging sheet ist ein
viersträngiges β-Faltblatt. Die Mimikry solcher Strukturen stellt eine Herausforderung
dar. Chakraborty et al. beschrieben 2005 ein viersträngiges Bridging sheetMimetikum, bestehend aus 26 Aminosäuren, und klärten dessen Struktur mittels
NMR auf138. Dieses Peptid war nicht in der Lage, an den CD4i-Antikörper 17b zu
binden. Weitere Mimetika des Bridging sheets wurde 2012 beschrieben139. In diesen
Peptiden wurden das β2/β3-Fragment und das β20/β21-Fragment linear präsentiert.
Durch
Immunisierung
in
Kaninchen
konnte
eine
moderat-neutralisierende
Antikörperantwort hervorgerufen werden. In beiden Veröffentlichungen wurde eine
schlechte Löslichkeit der Peptide in wässrigen Puffern beschrieben.
1.10. Corezeptor-Mimetika
Im Jahr 2001 wurde ein 16-Aminosäure-langes Peptid beschrieben, welches den NTerminus von CCR5 darstellt (Aminosäuren 2-18)140. Dieses Peptid wurde zur
Aufklärung der Bindungsstellen von gp120 und CCR5 füreinander verwendet. Es
konnte geschlussfolgert werden, dass die Aminosäuren 10 bis 18 des Peptids die
minimale Interaktionsfläche für gp120 bilden, dass die Interaktion dieses Peptids
durch hochkonservierte Bereiche auf gp120 vermittelt wird (Bridging sheet und der
Stamm der V3-Schleife), und dass für die CCR5-Bindung weitere Bereiche des
gp120 essentiell sind, unter anderem die Spitze der V3-Schleife. Durch diese Peptide
wurde das Verständnis der Corezeptorbindung durch gp120 stark verbessert.
- 17 -
Einleitung
Mimetika der Transmembranregionen von CCR5 und CXCR4 waren in der Lage, die
Replikation von HIV-1 in vitro zu inhibieren141. Dabei spielten negative Ladungen an
den extrazellulären Termini dieser Peptide eine Schlüsselrolle für die spontane
Insertion in die Zellmembran und deren antagonistische Aktivität.
2012
wurde
ein
diskontinuierliches
Mimetikum
des
Corezeptors
CXCR4
veröffentlicht, welches die drei ECLs dieses Corezeptors präsentiert. Dieses
Mimetikum, genannt CX4-M1142 (Abb. 11), wurde auf der Grundlage eines von
Rhodopsin50 abgeleiteten CXCR4-Strukturmodells entworfen. CX4-M1 war in der
Lage, in Bindungsstudien selektiv an X4-trope gp120 zu binden, während R5-trope
gp120 nicht erkannt wurden. Zusätzlich konnte die Bindung von CX4-M1 an gp120
durch
lösliches
CD4
verstärkt
werden,
was
durch
die
Freilegung
der
Corezeptorbindungsstelle auf gp120 zu erklären ist. Wie bei CXCR4 konnte auch für
CX4-M1 eine ladungsabhängige Interaktion festgestellt werden. Zudem konnte die
Infektion CD4-positiver Zellen mit HIV-1 wirksam durch CX4-M1 inhibiert werden
(IC50 ~ 10 µM). In einer weiteren Veröffentlichung konnte die Anwendbarkeit von
CX4-M1 als Werkzeug zur Analyse der molekularen Mechanismen der breit
neutralisierenden Antikörper b12 und VRC01 bestätigt werden143.
Abb. 11: Röntgenkristallstruktur von CXCR4 und schematische Darstellung von CX4-M1.
Röntgenkristallstruktur von CXCR4 (pdb 3ODU)52 sowie schematische Darstellung von CX4-M1142.
Die extrazellulären Schleifen, wie sie in CX4-M1 präsentiert werden, sind farbig markiert (violett:
ECL1, blau: ECL2, grün: ECL3). Die Grafik wurde mittels RCSB Protein-Workshop erstellt.
1.11. Andere HIV-1-beeinflussende mimetische Peptide
Neben den beschriebenen gp120-Mimetika sind auch andere HIV-1-Infektionsbeeinflussende Peptide beschrieben worden (Tab. 2). Das bekannteste ist T20
- 18 -
Einleitung
(Enfuvirtide), welches als gp41-Mimetikum die HIV-1-Infektion inhibiert144. Ebenfalls
durch Inhibition der gp41-vermittelten Fusion von HIV-1 mit der Zelle funktioniert das
Peptid VIRIP145.
Peptide, die aus den 16 aminoterminalen Resten von SDF-1α bestehen, inhibieren
ebenfalls die HIV-1-Infektion146, in diesem Fall durch Blockieren des CXCR4Corezeptors. Ebenfalls auf diesem Inhibitionsmechanismus beruht die Wirkung des
Peptids T22147. Ein weiteres Peptid (Ac-(10Ala-RANTES 6-10)-NH2) inhibiert durch
Blockierung des Corezeptors CCR5148.
Tab. 2: Übersicht HIV-1-Infektions-beeinflussender Peptide.
Name
Aminosäurebereich
Sequenz
Effekt
Referenz
Enfuvirtide
638-673 (gp41)
(T20,
AcYTSLIHSLIEESQNQQEKNE-
Infektionsinhibition
QELLELDKWASLWNWF-NH2
(gp41, Fusion)
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF
Infektionsinhibition
144
Fuzeon)
VIRIP
353-372 SerinProtease-Inhibitor α1-
145
(gp41, Fusionspeptid)
Antitrypsin
SDF-1α N-
5-14
LSYRCPCREF
Terminus
T22
146
(Corezeptorbindung)
[Tyr
5,12
7
, Lys ]-
RRWCYRKCYKGYCYRKCR-NH2
Polyphemusin II
Ac-(10Ala-
Infektionsinhibition
6-10 (RANTES)
Infektionsinhibition
147,149
(Corezeptorbindung)
Ac-DTTPA-NH2
RANTES 6-
Infektionsinhibition
148
(Corezeptorbindung)
10)-NH2
EF-C
417-428 (β19/β20,
QCKIKQIINMWQ
Infektionsverstärkung
150
QIINMWQEVG
Kein Effekt
150
IRKRYRKFLNESYKHEQVYIRST
Infektionsverstärkung
151
Infektionsverstärkung
151
gp120)
EF-H
422-431 (β20/β21,
gp120)
SEVI
85-120 (PAP)
DVDRTLMSAMTNL
SEVI
248-286 (PAP)
GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILN
HMKRATQIPSYKKLIMY
Unter den gp120-imitierenden Peptiden wurden auch solche beschrieben, die in der
Lage sind, die Infektion mit HIV-1 zu verstärken (Tab. 2). Eines dieser Peptide, EF-C,
wurde als effizienter Verstärker der Infektion von CD4-positiven Zellen mit HIV-1
- 19 -
Einleitung
beschrieben150. Seine verstärkende Wirkung konnte auf die Ausbildung von
Nanofibrillen zurückgeführt werden, die eine Annäherung des Virus an die Zielzelle
ermöglichen. Ein ebenfalls in diesem Artikel beschriebenes Peptid, EF-H, welches
mit der Sequenz von EF-C überlappt, konnte die Infektion nicht verstärken150. Die
adhäsive Wirkung von Nanofibrillen und die damit verbundene Verstärkung der HIV1-Infektion konnte auch schon am Beispiel des SEVI (in Sperma vorkommender
Verstärker
der
Virusinfektion)151,
gezeigt
werden.
Die
aus
der
PAP
(Prostataspezifische saure Protease) generierten Peptide PAP85-120 und PAP248286 verstärken die HIV-1-Infektion CD4-positiver Zielzellen durch die Ausbildung von
Nanofibrillen und besitzen wie EF-C eine positive Nettoladung.
1.12. Problemstellung
Trotz intensiver Forschung konnte bis heute kein Impfstoff gegen HIV-1 entwickelt
werden. Voraussetzung für die Bekämpfung der HIV-1-Infektion ist das genaue
molekulare Verständnis des HIV-1-Eintritts in die Zelle. Ziel dieser Arbeit war es, die
molekulare Grundlage des Fusionsprozesses mittels Peptiden näher zu untersuchen
und dadurch das grundlegende Verständnis der molekularen Abläufe zu vertiefen.
Die Arbeit wurde in die folgenden drei Themengebiete aufgeteilt.
1.12.1. Die molekulare Basis der Wirkungsweise von CD4bs-M
Das CD4-Bindungsstellenmimetikum CD4bs-M ist in der Lage, mit gp120 um die
Bindung an CD4 zu kompetieren131. In diesem Teilprojekt sollte untersucht werden,
welchen Einfluss CD4bs-M auf die HIV-1-Infektion von Zellen besitzt und ob eine
Inhibition der Infektion durch dieses Mimetikum stattfindet. Zusätzlich sollte eine
Aminosäure-genaue Analyse der Bindungseigenschaften von CD4bs-M erfolgen.
- 20 -
Einleitung
1.12.2. Der Einfluss der QR-Dipeptid-Insertion in der V3-Schleife auf die Erkennung
durch anti-V3-Schleifen-Antikörper
Die seltene QR-Insertion kommt in der Spitze der V3-Schleife der HIV-1LAI-Gruppe
vor (Stämme
HxBc2, IIIB
und
NL4.3).
Diese sind vielverwendete Laborstämme. In diesem
Teilprojekt sollte untersucht werden, welchen Einfluss die QR-Insertion auf die
Bindung von V3-Schleifen-Peptiden und gp120 an anti-V3-Schleifen-Antikörper
besitzt. Zusätzlich sollte untersucht werden, welche Folgen für die Bindung an antiV3-Antikörper entstehen, wenn man die QR-Insertion in nicht-QR-enthaltende V3Schleifen-Peptidsequenzen einbaut, die QR-Insertion aus QR-enthaltenden V3Schleifen-Peptidsequenzen
deletiert
oder
die
QR-Insertion
durch
andere
Aminosäuren substituiert. Durch Mausimmunisierungen sollte zusätzlich ermittelt
werden, ob man eine Selektivität der anti-V3-Schleifen-Antikörper für V3-SchleifenPeptide mit und ohne QR-Insertion erzeugen kann.
1.12.3. Die Charakterisierung der CXCR4-gp120-Interaktion mittels mimetischer
Peptide
Das CXCR4-Mimetikum CX4-M1 ist in der Lage, selektiv an X4-trope gp120 zu
binden142.
Als
Hauptdeterminante
des
Tropismus
wurde
die
V3-Schleife
beschrieben88. In diesem Teilprojekt sollte versucht werden, die CXCR4-gp120Interaktion (Protein-Protein-Interaktion) mittels einer CX4-M1-V3-Schleifen-PeptidInteraktion (Peptid-Peptid-Interaktion) zu imitieren. Zusätzlich sollten diese Mimetika
auf
deren
Bindungsselektivität
und
die
Aminosäure-genaue
Bindungsstellen beider Peptide füreinander untersucht werden.
- 21 -
Analyse
der
Materialien und Methoden
2. Materialien und Methoden
2.1. Geräte
Gerät
Name
Hersteller
Analysenwaage
CPA225D
Sartorius
Biacore / SPR-Spektroskopie
Biacore
X100
GE Healthcare
Software
Biacore X100 Control
Biacore
Software, vers. 2.0
Auswertungssoftware
Biacore X100 Evaluation
Biacore
software, vers. 2.0
Gefrierschrank (-80°C)
Innova ULT laboratory
New Brunswick
freezer
HPLC CLARITY / KINETEX
Pumpe
L 6200 Intelligent Pump
Merck Hitachi
UV-Detektor (214 nm)
L4250
Merck Hitachi
Trennsäule Clarity
Reprosil 100 C18, 5 µm,
Dr. Maisch GmbH
250*25 mm
Trennsäule Kinetex
Kinetex C18, 5 µm 100Å,
Phenomenex
100*21,2 mm
Fraktionssammler
Fraction Collector Super-
GE Healthcare
FracTM
Software
Clarity version 3.0.6.589
DataApex Ltd.
Pumpe
L 6200 Intelligent Pump
Merck Hitachi
UV-Detektor (214 nm
Variable Wavelength
KNAUER
und 280 nm)
monitor
Trennsäule
Reprosil 100 C18, 5 µm,
HPLC MERCK
Dr. Maisch GmbH
250*25 mm
Fraktionssammler
Fraction Collector SuperFrac
Flachbettschreiber
GE Healthcare
TM
K3624, 2 Kanal
- 22 -
Techlab
Materialien und Methoden
HPLC SHIMADZU
Pumpe
LC-10AD VP
Shimadzu
UV-Detektor (214 nm)
SPD-10A VP
Shimadzu
Trennsäule
Reprosil-Pur C18-AQ, 5
Dr. Maisch GmbH
µm, 250*10 mm
Fraktionssammler
Fraction Collector Super-
GE Healthcare
FracTM
Software
LCsolution 1.02 SP2
Shimadzu
HPLC
HP 1100
Agilent
Trennsäule
Kinetex, 2.6u, C18, 100 Å
Phenomenex
Autosampler
Series 200 Autosampler
Perkin Elmer
Massenspektrometer
API 2000, LC/MS/MS
AB SCIEX
LC-MS
System
Software
Analyst Software Vers.
AB SCIEX
1.4.2
Gefriertrockner
ALPHA 1-4
CHRIST
Peptid-Synthesizer
SYRO I
MultiSyn Tech
pH-Meter
Seven Easy
Mettler Toledo
Photometer
NanoPhotometerTM
IMPLEN
Plattenleser
Infinite 200
Tecan
Schüttler
Titramax 101
Heidolph
Ultraschallbad
ULTRASONIC CLEANER
VWR
Vortex
Mixer UZUSIO, YTX-
HARMONY
3000L
Waage
BP210S
Sartorius
Wasserfiltrationsanlage
Synergy 185
Milipore
Zentrifuge
Galaxy 7D
VWR
Zentrifuge
Galaxy Mini Star
VWR
Zentrifuge
Megafuge 1.0R
Thermo Scientific
- 23 -
Materialien und Methoden
2.2. Verbrauchsmaterialien
Name
Hersteller
Biacore Sensorchip CAP
GE Healthcare
UV-Küvette mikro
BRAND GmbH
96-Vertiefung-Mikrotiterplatten
Immulon 2HB
Thermo Scientific
Microtest Plate 96-well flat bottom
Sarstedt
2.3. Chemikalien
Name
Hersteller
1,2-Ethandithiol
Aldrich
1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)
Aldrich
Acetanhydrid
Merck
Acetonitril
VWR/Prolabo
Ammoniumacetat
Fluka
Biotin
Sigma Aldrich
Cyclohexan
Roth
Dichlormethan (DCM)
VWR/Prolabo
Dimethylformamid (DMF)
Aldrich
Guanidinium Hydrochlorid 8M
GE Healthcare
HBS-EP-Puffer 10x
GE Healthcare
HBS-N 10x
GE Healthcare
K2HPO4
Sigma Aldrich
KH2PO4
Merck
Magnesiumchlorid
Fluka
Methyl-t-butyl-ether
Merck
Na2CO3
Roth
NaHCO3
Roth
NaOH 1M
GE Healthcare
N,N’-Diisopropylcarbodiimid (DIC)
Iris Biotech
o-Phenylendiamin (OPD)
Sigma Aldrich
- 24 -
Materialien und Methoden
Phenol
Merck
Piperidin
Sigma Aldrich
Pyridin
Roth
Schwefelsäure
Roth
TentaGel S RAM, 0,24 mmol/g
Rapp Polymere
Thioanisol
Fluka
Trifluoressigsäure (TFA)
Roth
Triisopropylsilan (TIPS)
Aldrich
Tween 20
Roth
2.4. Aminosäuren
Chemikalie
Name
1-Buch-
Hersteller
staben-Code
Fmoc-6-Ahx-OH
Aminohexansäure
X
Iris Biotech
Fmoc-β-Ala-OH
β-Alanin
B
ORPEGEN Pharma
Fmoc-D-Ala-OH
D-Alanin
a
MultiSyn Tech
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH
D-Arginin
r
MultiSyn Tech
Fmoc-D-Asn(Trt)-OH
D-Asparagin
n
Iris Biotech
Fmoc-D-Gln(Trt)-OH
D-Glutamin
q
MultiSyn Tech
Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH
D-Glutamat
e
MultiSyn Tech
Fmoc-D-Ile-OH
D-Isoleucin
i
Bachem
Fmoc-D-Lys(Boc)-OH
D-Lysin
k
Senn Chemicals
Fmoc-D-Met-OH
D-Methionin
m
MultiSyn Tech
Fmoc-D-Trp(Boc)-OH
D-Tryptophan
w
Senn Chemicals
Fmoc-D-Val-OH
D-Valin
v
MultiSyn Tech
Fmoc-Glycin-OH
Glycin
G
Iris Biotech
Fmoc-L-Ala-OH
L-Alanin
A
Iris Biotech
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH
L-Arginin
R
Iris Biotech
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH
L-Asparagin
N
Iris Biotech
Fmoc-L-Asp(oMpe)-OH
L-Aspartat
D
Merck
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH
L-Aspartat
D
ORPEGEN Pharma
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH
L-Cystein
C
ORPEGEN Pharma
- 25 -
Materialien und Methoden
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH
L-Glutamin
Q
Iris Biotech
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH
L-Glutamat
E
Iris Biotech
Fmoc-L-His(Trt)-OH
L-Histidin
H
Iris Biotech
Fmoc-L-Ile-OH
L-Isoleucin
I
Iris Biotech
Fmoc-L-Leu-OH
L-Leucin
L
Iris Biotech
Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH
L-Lysin
K
MultiSyn Tech
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH
L-Lysin
K
Iris Biotech
Fmoc-L-Met-OH
L-Methionin
M
ORPEGEN Pharma
Fmoc-L-Phe-OH
L-Phenylalanin
F
ORPEGEN Pharma
Fmoc-L-Pro-OH
L-Prolin
P
Senn Chemicals
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH
L-Serin
S
MultiSyn Tech
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH
L-Threonin
T
ORPEGEN Pharma
Fmoc-L-Trp(Boc)-OH
L-Tryptophan
W
ORPEGEN Pharma
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH
L-Tyrosin
Y
Iris Biotech
Fmoc-L-Val-OH
L-Valin
V
ORPEGEN Pharma
2.5. Biochemikalien, Enzyme und Proteine
Proteine
Expression
Hersteller
BSA
---
Sigma Aldrich
Gp120 ADA
293 Zellen
Immune Technology
Gp120 BAL
293 Zellen
NIH AIDS Reagent Program
Gp120 IIIB
Baculovirus
Immuno Diagnostics Inc.
Gp120 HxBc2
293 Zellen
Immune Technology
Gp120 MN
293 Zellen
Immune Technology
Gp130-Fc
Maus Myelomzellen
R&D Systems
sCD4 (4 Domänen)
Humane Zellen
Sino Biologicals Inc.
Streptavidin
---
Thermo Scientific
Wirt
Hersteller
Anti Biotin-HRP
Maus
Calbiochem
Anti Fluorescein-HRP
Maus
Antibodies online
Anti gp120
Schaf
Aalto
Antikörper
- 26 -
Materialien und Methoden
Anti human-HRP
Ziege
Sigma Aldrich
Anti Maus-HRP
Ziege
Calbiochem
Anti Schaf
Kaninchen
Dianova
4G10
Maus
NIH AIDS Reagent Program
5F7
Maus
NIH AIDS Reagent Program
257-DIV
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
268-DIV
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
447-52D
Mensch
Polymun Scientific GmbH
2191
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
2219
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
2442
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
3074
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
3869
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
F425 B4a1
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
F425 B4e8
Mensch
NIH AIDS Reagent Program
Mensch
Polymun Scientific GmbH
Anti V3 Antikörper:
mAb b12
2.6. Methoden
2.6.1. Festphasenpeptidsynthese
Alle
Peptide
wurden
als
C-terminale
Amide
durch
Fmoc/t-Bu
basierte
Festphasenpeptidsynthese auf 100 mg des TentaGel S RAM Harzes (0,23 mmol/g)
synthetisiert. Zur Synthese wurde ein automatisierter Peptid-Synthesizer (SYRO von
MultiSynTech) verwendet. Ein Standard-Kupplungszyklus war wie folgt aufgebaut:
Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 20 % Piperidin in DMF in einer
Reaktionszeit von 20 min entfernt. Die Kupplung erfolgte durch Zugabe von 5
Äquivalenten Fmoc-geschützter Aminosäure, gelöst in 0,5 M HOBT, und 20 % DIC in
DMF, im Verhältnis 3,3 zu 1. Es wurden zwei Kupplungen mit einer Reaktionszeit
von je 60 min durchgeführt. Anschließend erfolgte eine 30-minütige Acetylierung
mittels Acetanhydrid, Pyridin und DMF im Verhältnis 1:2:3. Nach jedem
Reaktionsschritt wurde fünfmal mit DMF gewaschen. Die Qualität der Synthese
- 27 -
Materialien und Methoden
wurde nach bestimmten Syntheseabschnitten überprüft, indem eine kleine Menge
Harz aus dem Reaktor genommen und mit Abspaltmix (TFA / DCM / Wasser / TIPS
im Verhältnis 14:4:1:1) für eine Stunde inkubiert wurde. Anschließend wurde die
Probe im Stickstoffstrom getrocknet, in Wasser / Acetonitril (1:1) mit 0,1% TFA
aufgenommen und im 10 min Gradient (Tab. 4) mittels LC/MS gemessen. Nach
Kupplung der letzten Aminosäure erfolgte eine finale Fmoc-Abspaltung und eine
Acetylierung bzw. Kupplung eines für die spätere Detektion essentiellen Markers.
2.6.1.1. Synthese der CD4bs-M Analoga
Um Aspartimidbildung im β23-Fragment zu verhindern, wurde der Aspartat-Rest mit
einer OMpe-Schutzgruppe (3-Methylpentyl-Ester) eingebaut. Die Kupplung erfolgte
manuell über Nacht unter Verwendung von 3 Äquivalenten Fmoc-geschützer
Aminosäure, gelöst in 0,5 M HOBT, und 20 % DIC in DMF, im Verhältnis 3,3 zu 1.
Das zentrale Lysin des Gerüstes dient als Verzweigungspunkt der drei Fragmente
von CD4bs-M. Demzufolge musste die Aminogruppe der Seitenkette des Lysins
orthogonal geschützt werden, um eine selektive Seitenkettenschutzgruppenabspaltung zu ermöglichen. Hierzu wurde ein ivDde-geschütztes Lysin gewählt und
manuell über Nacht unter Verwendung von 3 Äquivalenten Fmoc-geschützer
Aminosäure, gelöst in 0,5 M HOBT, und 20 % DIC in DMF, im Verhältnis 3,3 zu 1
gekuppelt. Die Abspaltung der ivDde-Schutzgruppe erfolgte nach fertiger Synthese
des CD4bl-Fragments und dessen N-terminaler Biotinylierung beziehungsweise
Acetylierung mittels 5 % Hydrazin in DMF in fünf 30-minütigen Zyklen.
Die Biotinylierung erfolgte durch manuelle Kupplung über Nacht unter Verwendung
von 3 Äquivalenten Biotin, gelöst in 0,5 M HOBT, und 20 % DIC in DMF, im
Verhältnis 3,3 zu 1.
2.6.1.2. Synthese der biotinylierten V3-Schleifen-Peptide
Die Biotinylierung erfolgte durch manuelle Kupplung an den N-Terminus des Peptids
über Nacht unter Verwendung von 3 Äquivalenten Biotin, gelöst in 0,5 M HOBT, und
20 % DIC in DMF, im Verhältnis 3,3 zu 1.
- 28 -
Materialien und Methoden
2.6.1.3. Synthese der fluoresceinylierten V3-Schleifen-Peptide
Die Fluoresceinylierung erfolgte mittels manueller Kupplung von 2 Äquivalenten
Fluorescein-N-Hydroxysuccinimid,
gelöst
in
5
%
DIPEA
in
DMF,
unter
Lichtausschluss über Nacht.
2.6.2. Gesamtabspaltung der Peptide vom Harz
Nach vollständiger Synthese wurden die Peptide vom Harz abgespalten. Hierzu
wurde das Harz mit DCM gewaschen. Als Abspaltreagenz diente Reagenz K (TFA /
Wasser / Phenol / Thioanisol / Ethandithiol im Verhältnis 82,5:5:5:5:2,5). Das PeptidHarz wurde für zwei Stunden mit Reagenz K auf den Reaktoren inkubiert, danach in
Szintilationsgläschen ausgedrückt, neues Reagenz K aufgezogen, für eine weitere
Stunde inkubiert und in Szintilationsgläschen ausgedrückt. In diesen erfolgte eine
weitere Inkubation für eine Stunde. Anschließend wurden die Peptide in einer kalten
Mischung aus Cyclohexan und tert-Butylether (1:1) präzipitiert, mit Wasser extrahiert
und lyophilisiert.
2.6.3. Aufreinigung der Peptide
Die synthetisierten Rohpeptide wurden mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Dazu
wurde die HPLC (MERCK oder CLARITY) verwendet. Die Peptide wurden in TFA
gelöst
und
injiziert.
Zur
Aufreinigung
der
Peptide
wurden
verschiedene
Lösungsmittelgradienten verwendet (Tab. 3). Die verwendeten Lösungsmittel
beinhalteten 0,1 % TFA. Die Detektion erfolgte photometrisch über Absorption bei
214
nM
und
die
Fraktionen
wurden
nach
Probennahme
via
Flüssigkeitschromatographie mit nachfolgender Massenspektrometrie (LC-MS, 5 min
Gradient, Tab. 4) analysiert. Saubere Peptidfraktionen wurden erneut über LC-MS
(15 min Gradient, Tab. 4) analysiert, vereinigt und lyophilisiert.
- 29 -
Materialien und Methoden
Tab. 3: Reinigungsgradienten der präparativen HPLC.
t (min)
Wasser (%)
Acetonitril (%)
CD4bs-M und V3-Schleifen-Immunogene
0
80
20
5
80
20
65
50
50
70
5
95
80
5
95
85
80
20
95
80
20
0
85
15
5
85
15
65
55
45
70
5
95
80
5
95
85
85
15
95
85
15
0
70
30
5
70
30
65
40
60
70
5
95
80
5
95
85
70
30
95
70
30
V3-Schleifen-Peptide
Corezeptormimetika
Eine Nachreinigung mittels HPLC (SHIMADZU oder KINETEX) erfolgte zum Teil
nach
Begutachtung
des
HPLC-Chromatogramms
und
ESI-MS-Spektrums
beziehungsweise MALDI-TOF-MS-Spektrums nach Oxidation der V3-SchleifenPeptide sowie der Corezeptormimetika.
2.6.4. Zyklisierung
Die Zyklisierung der gereinigten V3-Schleifen – und CX4-M1-Peptide erfolgte über
Oxidation zweier Cysteinreste zum Disulfid. Als Oxidationspuffer diente eine
Mischung aus 50 % Acetonitril und 50 % eines 0,1 M Ammoniumacetatpuffers pH 8.
- 30 -
Materialien und Methoden
Die Peptide wurden im Oxidationspuffer mit einer Konzentration von 0,3 mg/mL
gelöst und für drei Tage bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Bei den
fluoreszinylierten Peptiden erfolgte die Inkubation unter Lichtausschluss. Am Anfang
und am Ende des Oxidationsprozesses wurde ein Ellman’s Test152 durchgeführt, um
den Fortschritt und die Vollständigkeit der Oxidation zu überprüfen. Hierfür wurde
folgender Ansatz gewählt: 1 M TRIS-Puffer (pH 8) / Wasser / DTNB / Probe
(2:11:1:6). Als Negativkontrolle diente für die biotinylierten Peptide ein Ansatz, in
dem die Probe durch Oxidationspuffer ersetzt wurde. Da das DTNB während des
Ellman’s Test unter alkalischen Bedingungen zum gelben 2-Nitro-5-thiobenzoat
umgesetzt
wird
und
auch
die
fluoresceinylierten
Peptide
in
diesem
Wellenlängenbereich absorbieren, wurde für diese Peptide als Negativkontrolle eine
Peptidlösung ohne DTNB verwendet. Nach erfolgter Oxidation wurden die Peptide
mittels LC-MS (15 min Gradient, Tab. 4) analysiert und lyophilisiert. Nach
Auswertung des HPLC-Chromatogramms und ESI-MS-Spektrums wurde bei nicht
sauberen Peptiden eine weitere Reinigung durchgeführt.
2.6.5. Analyse der Peptide mittels LC-MS (ESI-MS)
Zur Charakterisierung von Zwischenstufen der Synthese und des Rohpeptides sowie
zur Beurteilung der Sauberkeit der Peptide nach Aufreinigung wurde eine LC-MSAnalyse durchgeführt. Die verwendeten Analysegradienten waren wie folgt: 5 min
Gradient für Reinigungsfraktionen der präparativen HPLC, 10 min Gradient für die
Charakterisierung von Zwischenstufen der Synthese und des Rohpeptids und 15 min
Gradient für die Endanalytik des gereinigten Peptids (Tab. 4). Alle Lösungsmittel
beinhalteten 0,1% TFA. Die Auswertung der aufgenommenen Spektren erfolgte über
die Analyst-Software von AB SCIEX.
- 31 -
Materialien und Methoden
Tab. 4: Gradienten der LC-MS-Analyse.
t (min)
Wasser (%)
Acetonitril (%)
0
95
5
5
5
95
6
5
95
7
95
5
10
95
5
0
95
5
10
5
95
11
5
95
12
95
5
15
95
5
0
95
5
15
5
95
16
5
95
17
95
5
20
95
5
5 min Gradient
10 min Gradient
15 min Gradient
2.6.6. Analyse der V3-Schleifen-Peptide mittels MALDI-TOF MS
Durch die hohe positive Ladung der V3-Schleifen-Peptide, insbesondere V3IIIB und
V3HxBc2, und die damit verbundene starke Ionisierung bei der LC-MS, war eine
Analyse der gereinigten und oxidierten V3-Schleifen-Peptide mittels MALDI-TOF MS
erforderlich. Diese wurde von Petra Wenzeler (Lehrstuhl für Biochemie, FriedrichAlexander-Universität Erlangen Nürnberg) durchgeführt.
Die gereinigten Peptide wurden in einer Konzentration von 2,5 mM (biotinylierte V3Schleifen-Peptide)
bzw.
1
mM
(fluoresceinylierte
V3-Schleifen-Peptide)
in
Acetonitril/Wasser 1:1 + 0,1 % TFA gelöst. Diese Peptide wurden 20 – 200fach in
Wasser + 0,1 % TFA verdünnt. 1 µL dieser Peptidlösung wurde mit 1 µL Wasser + 2
%
TFA
gemischt,
anschließend
mit
1
µL
Matrix
(15
mg/mL
2’-5’-
Dihydroxyacetophenon, 5 mg/mL Diammoniumcitrat, 75 % Ethanol und 25 %
Wasser) gemischt, auf das Target (MTP 384 massive) pipettiert und mittels Autoflex
- 32 -
Materialien und Methoden
1 (Bruker Daltonics) gemessen. Als externer Calibrant diente Peptid standard mix II
(Massebereich 700-4000 Da, Bruker Daltonics). Die Datenanalyse erfolgte mittels
FlexAnalysis Software (Bruker Daltonics).
2.6.7. ELISA
2.6.7.1. Direkter Streptavidin-basierter ELISA mit CD4bs-M
Hochbindungs-Mikrotiterplatten (Immulon 2HB) wurden bei 4°C über Nacht mit
Streptavidin (4 µg/mL, gelöst in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,5) beschichtet. Zur
Verminderung der unspezifischen Bindung (Blockierung) wurden die Platten mit einer
1 %igen BSA-Lösung (gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2, 200 µL pro Vertiefung)
für eine Stunde inkubiert. Alle weiteren Arbeitsschritte und Verdünnungen wurden in
0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 0,1 % BSA und 0,01 % Tween durchgeführt. Die
Platten wurden mit 100 µL biotinylierten CD4bs-M-Varianten (10 µM) für zwei
Stunden inkubiert, gefolgt von einer dreistündigen Inkubation mit 100 µL des
entsprechenden Proteins (gp120
IIIB,
gp120BAL, gp120ADA, gp120MN, gp130-Fc oder
anti-gp120 aus dem Schaf, jeweils 8,3 nM). Als Detektionsantikörper wurden
verschiedene Antikörpersysteme verwendet. Für gp120 wurde das Zwei-AntikörperSystem anti gp120 aus dem Schaf (0,2 µg/mL, gerichtet gegen den C-terminalen
Bereich von gp120) und ein anti-Schaf-HRP-Konjugat aus dem Kaninchen (3 µg/mL)
verwendet. Für gp130-Fc wurde ein anti-human-HRP-Konjugat aus der Ziege (1
µg/mL) verwendet. Alle Antikörper wurden in einem Volumen von 100 µL pro
Vertiefung und für je eine Stunde inkubiert. Zwischen jedem Inkubationsschritt
wurden die Platten viermal mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 und 0,01 % Tween 20
gewaschen. Das eingesetzte Volumen pro Vertiefung betrug hierbei 300 µL. Die
Entwicklung der Platten erfolgte mit einer OPD-Lösung (1 mg/mL, 100 µL pro
Vertiefung) nach Zugabe von 0,03 % Wasserstoffperoxid für etwa 10 min unter
Lichtausschluss. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 M
Schwefelsäure (50 µL pro Vertiefung) abgestoppt und die Absorption bei 492 nM
gemessen. Alle Datenpunkte sind Mittelwerte aus um Negativkontrollen (Probe ohne
Peptid) korrigierten Messwerten.
- 33 -
Materialien und Methoden
2.6.7.2. Direkter Streptavidin-basierter ELISA mit V3 Schleifen-Peptiden und anti-V3Schleifen-Antikörpern
Die ELISA wurde wie unter 2.6.7.1. beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied,
dass nach Beschichtung der Platte und Blockierung mit 100 µL V3-SchleifenPeptidlösung (100 nM, für die Ausverdünnungen entsprechend abweichend) für zwei
Stunden inkubiert wurden, gefolgt von einer dreistündigen Inkubation mit 100 µL des
entsprechenden Antikörpers (257-DIV (0,5 nM), 268-DIV, F425 B4a1, F425 B4e8,
2191, 2219, 2442, 3869, 3074 und 447-52D (jeweils 2 nM) sowie 5F7 und 4G10
(1:100)). Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung wurden die Antikörper 2191
und 3869 sowie der CD4-Bindungsstellenantikörper mAb b12 und das nicht mit HIV1 korrelierte Protein gp130-Fc (jeweils 1 µg/ml) verwendet. Als Detektionsantikörper
wurden verschiedene Antikörpersysteme verwendet. Für 5F7 und 4G10 wurde ein
anti-Maus-HRP-Konjugat aus der Ziege (1 µg/mL) verwendet. Für die anderen
Antikörper sowie mAb b12 und gp130-Fc wurde ein anti-human-HRP-Konjugat aus
der Ziege (1 µg/mL) verwendet. Die Waschschritte, die Entwicklung der Platte und
die Detektion erfolgten wie unter 2.6.7.1. beschrieben. Die Entwicklungszeit betrug
1,5 min. Alle Datenpunkte sind Mittelwerte aus um Negativkontrollen (Vertiefungen
ohne anti-V3-Schleifen-Antikörper) korrigierten Messwerten.
2.6.7.3. Direkter ELISA mit gp120 und anti-V3-Schleifen-Antikörpern
Microtest Plate 96-well flat bottom (Sarstedt) wurden bei 4°C über Nacht mit
gp120IIIB,
gp120HxBc2,
gp120BAL
und
gp120ADA
(8
nM,
gelöst
in
0,1
M
Natriumcarbonatpuffer pH 9,5) beschichtet. Die Blockierung wurde wie in Abschnitt
2.6.7.1. durchgeführt. Alle Arbeitsschritte und Verdünnungen wurden in 0,1 M
Phosphatpuffer pH 7,2 mit 0,1 % BSA durchgeführt. Die Inkubation mit anti-V3Schleifen-Antikörpern
sowie
Detektionsantikörpern
wurde
wie
unter
2.6.7.2.
beschrieben durchgeführt. Zwischen jedem Inkubationsschritt wurden die Platten
viermal mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 und 0,1 % Tween 20 gewaschen. Das
eingesetzte Volumen pro Vertiefung betrug hierbei 300 µL. Die Entwicklung der
Platte
und
die
Detektion
erfolgten
wie
unter
2.6.7.1.
beschrieben.
Die
Entwicklungszeit betrug 1,5 min. Alle Datenpunkte sind Mittelwerte aus um
- 34 -
Materialien und Methoden
Negativkontrollen
(Vertiefungen
ohne
anti-V3-Schleifen-Antikörper)
korrigierten
Messwerten.
2.6.7.4. Direkter ELISA mit V3 Schleifen-Peptiden und anti-V3-Schleifen-Antikörpern
(ohne Streptavidin)
Microtest Plate 96-well flat bottom (Sarstedt) wurden bei 4°C über Nacht mit mAb
2191 (2 nM) beschichtet. Die Blockierung wurde wie in Abschnitt 2.6.7.1.
durchgeführt. Die Pufferbedingungen wurden wie unter 2.6.7.3. beschrieben gewählt.
Die Platten wurden mit 100 µL V3-Schleifen-Peptidlösung (500 nM bis 16 nM) für
zwei Stunden inkubiert. Als Detektionsantikörper wurde ein anti-Biotin-HRP-Konjugat
aus der Maus (0,1 µg/mL) verwendet. Die Entwicklung der Platte und die Detektion
erfolgten wie unter 2.6.7.1. beschrieben. Die Entwicklungszeit betrug 3 min. Alle
Datenpunkte sind Mittelwerte aus um Negativkontrollen (Vertiefungen ohne anti-V3Schleifen-Antikörper) korrigierten Messwerten.
2.6.7.5.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA zur Überprüfung der Bindung der
Antikörper aus DO11.10-Mäusen an V3-Schleifen-Peptide
Die ELISA wurde wie unter 2.6.7.1. beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied,
dass nach Beschichtung der Platte und Blockierung mit 100 µL V3-SchleifenPeptidlösung (50 nM) für zwei Stunden inkubiert wurden, gefolgt von einer
dreistündigen Inkubation mit 100 µL des entsprechenden DO11.10-Mausserums
(1:200 und Verdünnungsstufen). Als Detektionsantikörper wurde ein anti-Maus-HRPKonjugat aus der Ziege (1 µg/mL) verwendet. Die Entwicklung der Platte und die
Detektion erfolgten wie unter 2.6.7.1. beschrieben. Die Entwicklungszeit betrug 2
min. Alle Datenpunkte sind Mittelwerte aus um Negativkontrollen (Vertiefungen ohne
Serum) korrigierten Messwerten.
- 35 -
Materialien und Methoden
2.6.7.6. Direkter ELISA zur Überprüfung der Bindung der Antikörper aus DO11.10Mäusen an gp120
Hochbindungs-Mikrotiterplatten (Immulon 2HB) wurden bei 4°C über Nacht mit
gp120IIIB und gp120ADA (8 nM, gelöst in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,5)
beschichtet. Die Inkubation mit den Mausseren, dem Detektionsantikörper sowie die
Entwicklung der Platte und Detektion wurde wie unter 2.6.7.5. beschrieben
durchgeführt.
2.6.7.7. Direkter Streptavidin-basierter ELISA mit CX4-M1
Die ELISA wurde wie unter 2.6.7.1. beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied,
dass nach Beschichtung der Platte und Blockierung alle weiteren Arbeitsschritte und
Verdünnungen in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 1 % BSA (V3-schleifen-Peptide)
oder 0,1 % BSA (gp120) und 0,01 % Tween durchgeführt wurden. Die Platten
wurden mit 100 µL biotinyliertem CX4-M1 und dessen Varianten (2,5 µM für die
Bindung an gp120, 500 nM für die Bindung an V3 Schleifen-Peptide) für zwei
Stunden inkubiert, gefolgt von einer dreistündigen Inkubation mit 100 µL einer gp120Lösung (8,3 nM) in An- und Abwesenheit von CD4 (8,3 nM) oder einer V3-SchleifenPeptidlösung mit Fluoresceinmarkierung (250 nM, abweichend für Ausverdünnungen
und 100 nM für die Bindung an CX4-M1 Alanin-substituierte Peptide). Als
Detektionsantikörper wurden verschiedene Antikörpersysteme verwendet. Für gp120
wurde das Zwei-Antikörper-System anti gp120 aus dem Schaf (0,2 µg/mL) und ein
anti-Schaf-HRP-Konjugat aus dem Kaninchen (3 µg/mL), verwendet. Für die V3Schleifen-Peptide diente ein anti-Fluorescein-HRP-Konjugat aus der Maus (3 µg/mL)
als Detektionsantikörper. Die Waschschritte, die Entwicklung der Platte und die
Detektion erfolgten wie unter 2.6.7.1. beschrieben. Die Entwicklungszeit betrug 1,5
min. Alle Datenpunkte sind Mittelwerte aus um Negativkontrollen (Vertiefungen ohne
CX4-M1-Varianten und mit Biotin) korrigierten Messwerten, die mindestens im
Duplikat durchgeführt wurden.
- 36 -
Materialien und Methoden
2.6.7.8.
Kompetitiver ELISA mit V3 Schleifen-Peptiden und anti-V3-SchleifenAntikörpern
Hochbindungs-Mikrotiterplatten (Immulon 2HB) wurden bei 4°C über Nacht mit den
anti-V3-Schleifen-Antikörpern mAb 447-52D, mAb 2191 oder mAb 3869 (0,2 µg/mL,
gelöst in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer pH 9,5) beschichtet. Zur Verminderung der
unspezifischen Bindung wurden die Platten mit einer 1 %igen BSA-Lösung (gelöst in
0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2, 200 µL pro Vertiefung) für eine Stunde blockiert. Alle
weiteren Arbeitsschritte und Verdünnungen wurden in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2
mit 0,1 % BSA durchgeführt. Als Kompetitor wurden verschiedene V3-SchleifenPeptide eingesetzt, beginnend bei einer Konzentration von 5 µM. Hierzu wurden 62,5
µL des Kompetitors (10 µM) vorgelegt und 5-fach verdünnt, gefolgt von einer Zugabe
von 50 µL einer gp120
IIIB,
gp120HxBc2, gp120BAL oder gp120ADA -Lösung
(Endkonzentration 4 nM). Zum Nachweis der gp120-Bindung diente das ZweiAntikörper-System anti gp120 aus dem Schaf (0,2 µg/mL, gerichtet gegen den Cterminalen Bereich von gp120) und ein anti-Schaf-HRP-Konjugat aus dem
Kaninchen (3 µg/mL). Die Detektionsantikörper wurden jeweils in einem Volumen
von 100 µL pro Vertiefung und für eine Stunde inkubiert. Zwischen jedem
Inkubationsschritt wurden die Platten viermal mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 und
0,1 % Tween 20 gewaschen. Das eingesetzte Volumen pro Vertiefung betrug hierbei
300 µL. Die Entwicklung der Platte und die Detektion erfolgten wie unter 2.6.7.1.
beschrieben. Die Entwicklungszeit betrug 1,5 min bis 3 min. Die IC50-Werte wurden
mittels des Regression Wizards des Programms Sigma Plot 9.0 aus den
Inhibitionsdaten
bei
verschiedenen
Antikörperkonzentrationen
bestimmt.
Die
Messungen wurden mindestens im Duplikat durchgeführt. Die Inhibition wurde wie
folgt bestimmt:
⎡ (ODPr obe − ODBlank ) ⎤
Inhibition(%) = ⎢1 −
⎥ * 100
⎣ (OD100% − ODBlank ) ⎦
wobei 100 % den Absorptionswert ohne Kompetitor darstellt und Blank der
Absorptionswert ohne Anti-V3-Schleifen-Antikörper ist.
- 37 -
Materialien und Methoden
2.6.7.9. Kompetitiver Streptavidin-basierter ELISA mit CX4-M1
Die Bindung des Streptavidins und die Blockierung wurden wie unter 2.6.7.1.
beschrieben durchgeführt. Alle Arbeitsschritte und Verdünnungen wurden in 0,1 M
Phosphatpuffer pH 7,2 mit 1% BSA (V3-Schleifen-Peptide) oder 0,1% BSA (gp120)
und 0,01 % Tween durchgeführt. Die Platten wurden mit 100 µL biotinyliertem CX4M1 oder Biotin (2,5 µM für die Bindung an gp120, 500 nM für die Bindung an V3
Schleifen-Peptide) für zwei Stunden inkubiert. Als Kompetitor wurden die Anti-V3Schleifen-Antikörper
447-52D
und
3869
eingesetzt,
beginnend
bei
einer
Konzentration von 150 nM. Hierzu wurden 100 µL des Kompetitors (300 nM)
vorgelegt und 1:1 verdünnt, gefolgt von einer Zugabe von 50 µL einer gp120HxBc2Lösung (Endkonzentration 12,5 nM) in Anwesenheit von CD4 (Endkonzentration 12,5
nM)
oder
einer
V3-Schleifen-Peptidlösung
mit
Fluoresceinmarkierung
(Endkonzentration 50 nM). Die Inkubationszeit betrug drei Stunden. Die Detektion
von gp120 erfolgte wie unter 2.6.7.1. beschrieben. Die Detektion der V3-SchleifenPeptide erfolgte wie unter 2.6.7.7. beschrieben. Die Waschschritte, die Entwicklung
der Platte und die Detektion erfolgten wie unter 2.6.7.1. beschrieben. Die
Entwicklungszeit betrug etwa 4,5 min (V3-Schleifen-Peptide) oder 2 min (gp120
HxBc2).
Die IC50-Werte wurden wie unter 2.6.7.8. beschrieben durchgeführt. Der 100
%-Wert ist der Absorptionswert ohne Kompetitor und Blank der Bindungswert vom
Liganden an Biotin. Die Messungen wurden mindestens im Duplikat durchgeführt.
2.6.8. Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie)
2.6.8.1. Bindung der V3-Schleifen-Peptide an anti-V3-Schleifen-Antikörper
Alle Messungen wurden am Biacore X100 (GE Healthcare) durchgeführt. Zur
Immobilisierung der Peptide wurde ein Streptavidin-vermittelter Ansatz (Biotin
CAPture Kit, GE Healthcare) gewählt. Hierzu wurde ein mit einzelsträngiger DNA
beschichteter Sensorchip CAP verwendet. Dieser wurde mit 0,83 nM CAPtureReagenz, bestehend aus mit komplementärer DNA funktionalisiertem Streptavidin,
hybridisiert. Anschließend wurden biotinylierte V3-Schleifen-Peptide (100 nM) an das
Streptavidin gebunden und die Bindung von anti-V3-Schleifen-Antikörpern (6,7 nM,
- 38 -
Materialien und Methoden
1:1
verdünnt)
an
die
jeweiligen
V3-Schleifen-Peptide
gemessen.
Als
Regenerationslösung zur Dehybridisierung des DNA-Doppelstranges diente eine 6 M
Guanidiniumchloridlösung mit 250 mM Natriumhydroxid. Als Laufpuffer und
Verdünnungspuffer wurde HBS-EP-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM
EDTA und 0,05 % Surfactant 20, pH 7,4) eingesetzt. Die Datenaufzeichnung und
Auswertung erfolgte über die Biacore X100 Control Software, Version 2.0 und
Biacore X100 Evaluation Software, Version 2.0.
2.6.8.2. Bindung von CX4-M1 an gp120 und V3-Schleifen-Peptide
Die SPR-Spektroskopie wurde wie unter 2.6.8.1. beschrieben durchgeführt, mit dem
Unterschied, dass das CAPture-Reagenz in einer Konzentration von 83 nM
eingesetzt wurde. Anschließend wurde CX4-M1 (2 µM) an das Streptavidin
gebunden und die Bindung von V3-Schleifen-Peptiden (5 µM, 1:1 verdünnt) sowie
gp120 (8,3 nM, 1:1 verdünnt) an CX4-M1 gemessen. Als Laufpuffer und
Verdünnungspuffer wurde HBS-N-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4),
versetzt mit 0,05 % Tween 20 und 100 mM Magnesiumchlorid (für V3-SchleifenPeptid-Messungen) bzw. 2,5 mM Magnesiumchlorid (für gp120-Messungen)
eingesetzt.
2.6.9. Virologische Versuche
Alle virologischen Versuche wurden von Katja Rödel (im Rahmen ihrer Bachelor- und
Masterarbeit), Nobert Donhauser, Christina Haußner und Prof. Dr. Barbara Schmidt
(Virologisches Institut, klinische und molekulare Virologie, Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen Nürnberg, sowie Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Hygiene, Universität Regensburg) durchgeführt. Für die virologischen Versuche
wurden acetylierte CD4bs-M-Varianten verwendet.
- 39 -
Materialien und Methoden
2.6.9.1. Infektion von CEMx174-SEAP Reporterzellen
Die Indikatorzelllinie CEMx174, entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von R.E. Means und R. C. Desrosiers, exprimiert das Gen der sezernierten
alkalischen Phosphatase (SEAP) unter der Kontrolle der LTR-Sequenz (long terminal
repeat)153. Die Anwendbarkeit dieser Zelllinie für die Untersuchung der HIV-1
Resistenz gegen Medikamente wurde mit einem großen Probensatz evaluiert154. Drei
Tage nach Infektion der Zellkultur mit HIV-1NL4.3 (X4-trop) oder
NL4.3 005pf135
(R5-trop,
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ulrich
Schubert) wurden die Zellüberstände entnommen und deren SEAP-Aktivität mittels
Phospha-Light Kit (Life Technologies, Darmstadt) überprüft. Die präsentierten Daten
für HIV-1NL4.3 stellen Mittelwerte und Standardirrtum von mindestens drei
unabhängigen Messungen im Triplikat dar.
2.6.9.2. Infektion von Primärzellen
Mononukleäre periphere Blutzellen (PBMC) wurden aus EDTA-anticoaguliertem Blut
HIV-uninfizierter Spender (genehmigt durch die Ethikkommission der Medizinischen
Fakultät, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen/Nürnberg (Ref. Nr. 3375)) isoliert.
Nach standardisierter Ficoll Dichtegradientenzentrifugation (Biochrom AG, Berlin)
wurden die Zellen in RPMI 1640 (Gibco, Eggstein) resuspendiert, das mit 10 %
Hitze-inaktiviertem FCS (fötalem Kalbsserum, Lonza, Basel), 50 mg/mL Glutamin,
200 U/mL Penicillin und 90 U/mL Streptomycin versetzt war. Die PBMCs wurden für
drei Tage mit 1 µg/mL PHA (Phytohemagglutinin, Oxoid GmbH, Wesel) und 20 U/mL
IL-2 (Interleukin 2, Roche Pharma, Reinach) stimuliert. Diese Zellen wurden in Anund Abwesenheit von CD4bs-M für sechs Stunden mit HIV-1-Isolaten der Subtypen
B (92TH026), D(92UG035), F(93BR029) (alle drei vom AIDS Research and
Reference Reagent Program, NIAID, NIH), H (VI557) und O (HIV-1 Ca-9) (beide vom
Nationalinstitut für biologische Standards und Kontrollen, NIBSC, Hertfordshire)
infiziert. Die Zellen wurden einmal gewaschen und in einer Dichte von 200.000
Zellen/250 µL in 96-Vertiefungs-Platten plattiert. Nach drei Tagen wurden die
Zellkulturüberstände geerntet und der Gehalt von p24 Antigen (Innotest HIV Antigen
mAb, Innogenetics GmbH, Hannover) ermittelt.
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Materialien und Methoden
2.6.9.3. Herstellen der Virusstocklösungen und HSV-1-Versuche
Die Plasmide HIV-1pBRNL4.3 und HIV-1pBR43IeG-nef+ (F. Kirchhoff, Ulm und NIH AIDS
Research and Reference Reagent Program) wurden in XL-1 Blue kompetenten
Zellen (Stratagene, Waldbronn) transformiert, aufgereinigt und mittels FuGENE HD
(Roche, Mannheim) in 293T-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die
Überstände mittels 0,22 µm Millex-GS-Filter (Millipore, Schwalbach) filtriert und in
Aliquots bei -80°C gelagert. Das Herpes simplex Virus 1 (HSV-1) Isolat 166v (G.
Elliott, Lehrstuhl für Virologie, Medizinische Fakultät, Imperial College London und P.
O’Hare, Maire Curie Research Institute, The Chart, Oxted, Surrey) exprimiert ein
GFP-fusioniertes VP22-Protein. Nach wiederholtem Einfrieren und Auftauen der
infizierten Vero-Zellen wurden die Überstände geerntet und durch eine SaccharoseDichtegradientenzentrifugation gereinigt155. CEMx174-SEAP-Zellen und Vero-Zellen
wurden mit drei verschiedenen infektiösen Dosen von HSV-1 166v (MOI: 0,05, 0,005
und 0,0005) für eine Stunde infiziert. Nach zwei Waschschritten wurden die Zellen
resuspendiert, für drei Tage kultiviert und mittels Durchflusszytometrie (LSR II (BD
Biosciences) und Auswerteprogramm FCS Express V3) vermessen.
2.6.9.4. Infektion von HeLa-Zellen
CD4-positive und CD4-negative HeLa-Zellen (AIDS Research and Reference
Reagent Program) wurden in DMEM (Gibco, Eggstein) mit 10% Hitze-inaktiviertem
FCS (Lonza, Basel), 50 mg/mL Glutamin, 200 U/mL Penicillin und 90 U/mL
Streptomycin kultiviert. Die Expression von CD4 und CXCR4 auf den Zellen wurde
mittels FITC-conjugiertem anti-CD4 Antikörper (BD Biosciences, Heidelberg) und
APC-konjugiertem anti CD184 (BioLegend, London) analysiert. Die Daten wurden
mittels Durchflusszytometrie (LSR II (BD Biosciences) und FCS Express V3)
aufgenommen und ausgewertet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 25.000
Zellen/200 µL in 96-Vertiefungs-Platten plattiert und mit HIV-1pBR43IeG-nef+ in An- und
Abwesenheit von CD4bs-M und dem Peptid Δβ20/β21 infiziert. Nach drei bis vier
Tagen wurde die Expression von GFP mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (DMI
600 B, Leica Microsystems, Wetzlar) und Durchflusszytometrie (LSR II (BD
Biosciences) und FCS Express V3) analysiert. Als Kontrolle wurden UV-inaktivierte
Virusstämme (Applikation von 1 Joule/cm2, Stratalinker UV Crosslinker 1800,
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Materialien und Methoden
Stratagene, Amsterdam) und die Peptide in Abwesenheit von Virus verwendet. Die
Infektivität der Überstände CD4-positiver und CD4-negativer HeLa-Zellkulturen
wurde durch Transfer der Überstände (100 µL) auf CEMx174 SEAP Reporterzellen
ermittelt.
2.6.10. Herstellung von anti-Peptid-Seren
Die DO11.10-Mäuse (Versuchstiernummer 234-5596 und 234-5597) wurden
freundlicherweise von Prof. Dr. David Vöhringer zur Verfügung gestellt. Die
Immunisierungen wurden von Prof. Dr. Thomas Winkler (Institut für Genetik,
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg) durchgeführt.
Da die Immunogene Konjugate aus dem V3-Schleifen-Peptid und dem T-Zell-Epitop
aus Ovalbumin (Ova323-339) darstellten, wurden zur Immunisierung spezielle Mäuse
(DO11.10-Mäuse) verwendet. Die Methode wurde 2005 von Dziadek et al.
beschrieben126. Diese transgenen Mäuse besitzen einen Rezeptor spezifisch für
Ova323-339, und induzieren dadurch eine starke humorale Immunantwort gegen das
gewünschte Immunogen. 50 µg der V3-Schleifen-Konjugate wurden mit komplettem
Freud’schen Adjuvanz156 intraperitoneal injiziert. Die Seren wurden nach 6 Wochen
abgenommen und die Immunantwort im direkten ELISA getestet.
2.6.11. Statistik
Für den Vergleich voneinander abhängiger Infektionsdaten wurde der Student’s tTest verwendet. Zweiseitige p-Werte < 0,05 wurden als signifikant definiert.
- 42 -
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1. Die molekulare Basis der Wirkungsweise von CD4bs-M
Das CD4-Bindungsstellenmimetikum CD4bs-M stellt ein Werkzeug zur Analyse des
HIV-1-Eintrittsmechanismus dar. Aufgrund der Mimikry der CD4-Bindungsstelle auf
gp120 und der Kompetition mit gp120 um Bindung an CD4 wurde untersucht,
welchen Einfluss CD4bs-M auf die HIV-1-Infektion besitzt.
3.1.1. Synthese und Charakterisierung der CD4bs-M Varianten
CD4bs-M wurde wie unter 2.6.1. und 2.6.1.1. beschrieben synthetisiert und
anschließend mittels HPLC aufgereinigt. Das HPLC-Chromatogramm und ESI-MSSpektrum des gereinigten CD4bs-M ist in Abb. 12 dargestellt.
Abb. 12: HPLC-Chromatogramm und ESI-MS-Spektrum von CD4bs-M.
Analog zu CD4bs-M wurden verschiedene Deletions- und Substitutionsvarianten
synthetisiert. Die Sequenzen der verschiedenen Varianten von CD4bs-M sind in Tab.
5 aufgeführt, die dazugehörigen berechneten und mittels ESI-MS bestimmten
Massen sind in Tabelle S1 dargestellt.
- 43 -
Ergebnisse
Tab. 5: Sequenzen der verwendeten Peptide zur Untersuchung von CD4bs-M.
Ursprungssequenz von CD4bs-M:
INMWQEVGKA433365SGGDPEIVT373-K-454LTRDGGN460
424
(CD4bl—β23)
Peptid
CD4bs-M
Sequenz
Ac-INMWQEVGKA-XbYa-SGGDPEIVT-X-K-X-X-LTRDGGN-NH2
Verkürzte Varianten und Einzelfragmente von CD4bs-M
Ac-INMWQEVGKA-XΔCD4bl
Y-X-K-X-X-LTRDGGN-NH2
Ac-X
Δβ20/β21
Y-SGGDPEIVT-X-K-X-X-LTRDGGN-NH2
Ac-INMWQEVGKA-XΔβ23
Y-SGGDPEIVT-X-K-NH2
Y-SGGDPEIVT-NH2
CD4bl
Y-INMWQEVGKA-NH2
β20/β21
Y-LTRDGGN-NH2
β23
Alanin-Substitutionen des β20/β21-Fragments von CD4bs-M
I424A
Ac-ANMWQEVGKA-(CD4bl—β23)
N425A
Ac-IAMWQEVGKA-(CD4bl—β23)
M426A
Ac-INAWQEVGKA-(CD4bl—β23)
W427A
Ac-INMAQEVGKA-(CD4bl—β23)
Q428A
Ac-INMWAEVGKA-(CD4bl—β23)
E429A
Ac-INMWQAVGKA-(CD4bl—β23)
V430A
Ac-INMWQEAGKA-(CD4bl—β23)
G431A
Ac-INMWQEVAKA-(CD4bl—β23)
K432A
Ac-INMWQEVGAA-(CD4bl—β23)
D-Aminosäure-Substitutionen im β20/β21-Fragment von CD4bs-M
D-1*
Ac-iNmWqEvGkA-(CD4bl—β23)
D-2*
Ac-InMwQeVGKa-(CD4bl—β23)
Prolin-Substitutionen im β20/β21-Fragment von CD4bs-M
W427P
Ac-INMPQEVGKA-(CD4bl—β23)
Q428P
Ac-INMWPEVGKA-(CD4bl—β23)
E429P
Ac-INMWQPVGKA-(CD4bl—β23)
V430P
Ac-INMWQEPGKA-(CD4bl—β23)
CD4bs-M mit gemischter Sequenz im β20/β21-Fragment
β20/β21scr.
Ac-AEGIKMNQW-(CD4bl—β23)
HIV-1 unabhängiges Peptid
SSHPIFHRGEFSVSDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVXC-NH2
AH5-01**
a
Y, Acetyl- (Ac-) oder Biotin-Ahx-Gly-Ahx- ; bX, ε−Aminohexansäure (Abstandshalter). Kleine
Buchstaben beschreiben D-Aminosäuren; fett markierte Aminosäuren beschreiben eingeführte
Mutationen. *Synthese durch Barbara Kneidl während ihrer Masterarbeit, ** Synthese durch Anna
Heimerl.
- 44 -
Ergebnisse
3.1.2. Die Verstärkung der HIV-1-Infektion durch CD4bs-M
Um den Einfluss von CD4bs-M auf die HIV-1-Infektion zu testen, wurde in
Kooperation mit Prof. Dr. Barbara Schmidt und Katja Rödel ein SEAP-ReporterzellVersuch durchgeführt. Hierzu wurden Infektions-kompetente CEMx174-SEAP
Reporterzellen mit HIV-1NL4.3 in An- und Abwesenheit von CD4bs-M infiziert. Aus den
bereits publizierten kompetitiven ELISA-Daten, bei denen CD4bs-M in der Lage war,
die Bindung von gp120 an sCD4 konzentrationsabhängig zu kompetieren, wurde
eine Infektionsinhibition erwartet. Unerwarteterweise wurde durch CD4bs-M die
Infektion von SEAP-Reporterzellen mit HIV-1 signifikant verstärkt (Abb. 13a). Für die
Lösungsmittelkontrolle sowie für ein Peptid (AH5-01), welches nicht mit HIV-1 in
Verbindung steht, konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden.
Abb. 13: Verstärkung der HIV-1NL4.3-Infektion durch CD4bs-M.
a) Die CEMx174 SEAP Reporterzellen wurden in Anwesenheit von löslichem CD4 (sCD4, 15µg/mL),
abnehmenden Konzentrationen von CD4bs-M und AH5-01 sowie einer Lösungsmittelkontrolle (selbes
Acetonitril/Puffer-Verhältnis wie in Peptidlösungen) HIV-1NL4.3 ausgesetzt. Die Aktivität der alkalischen
Phosphatase (SEAP) wurde 3 Tage nach Infektion gemessen. b) Infektion von CEMx174 SEAP
Reporterzellen bei sinkender Menge von HIV-1NL4.3 in Ab- bzw. Anwesenheit (- bzw. +) von CD4bs-M
(10 µM). c) Infektion von CEMx174 SEAP Reporterzellen bei Vorinkubation von HIV-1NL4.3 ohne (-)
und mit (+) 10 µM CD4bs-M bei unterschiedlicher Vorinkubationszeit. SEAP-Aktivität normalisiert im
Bezug auf – (HIV-1-Infektion ohne Peptid, = 100 %). Die Daten sind als Mittelwerte und
Standardirrtum von drei separaten Experimenten gezeigt. Die Versuche wurden von Katja Rödel (a)
und Prof. Dr. Barbara Schmidt (b, c), Virologisches Institut, Universität Erlangen/Nürnberg
durchgeführt. *p<0,05.
- 45 -
Ergebnisse
Im Gegensatz zu CD4bs-M war sCD4 in der Lage, die Infektion mit HIV-1 komplett
zu inhibieren. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Reporterzelllinie sowohl für
Infektionsverstärkung als auch –inhibition von HIV-1NL4.3 angewendet werden kann.
Um den infektionsverstärkenden Effekt von CD4bs-M näher zu untersuchen, wurden
verschiedene infektiöse Dosen von HIV-1NL4.3 verwendet. So konnte eine bis zu achtfache Infektionsverstärkung detektiert werden (Abb. 13b). Zusätzlich wurde die
Kinetik des Effekts durch Präinkubation von HIV-1NL4.3 mit und ohne CD4bs-M für
verschiedene Zeitperioden vor Zugabe zu den Reporterzellen getestet. Eine
verstärkende
Wirkung
von
CD4bs-M
konnte
bereits
ohne
Präinkubation
nachgewiesen werden, was für eine schnelle Wirkung von CD4bs-M spricht (Abb.
13c).
3.1.3. Der Einfluss von CD4bs-M auf die Infektion von Zellen mit HSV-1
Um die Spezifität der Infektionsverstärkung durch CD4bs-M zu adressieren, wurde
die Wirkung von CD4bs-M auf die Infektion durch andere Viren (z.B. das Herpessimplex-Virus 1, HSV-1) getestet. In diesem Versuch wurde das HSV-1-Isolat166v
verwendet, welches ein mit GFP fusioniertes VP22-Protein exprimiert157.
Abb. 14: CD4bs-M beeinflusst nicht die Infektion von Zellen mit HSV-1.
Die CEMx174 SEAP-Reporterzelllinie (a) sowie Vero-Zellen (b) wurden mit dem HSV-1-Isolat 166v
infiziert. Die graue Kurve zeigt uninfizierte Zellen, die schwarze Kurve HSV-1 Infektion (MOI 0,05) in
Abwesenheit und die grüne Kurve in Anwesenheit von CD4bs-M (10 µM). Heparin (rote Kurve) ist ein
bekannter Inhibitor der HSV-1-Infektion. Die Versuche wurden von Norbert Donhauser, Virologisches
Institut, Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt.
- 46 -
Ergebnisse
Im Gegensatz zur Infektion mit HIV-1 beeinflusste CD4bs-M die Infektion der
gleichen SEAP-Reporterzellen mit HSV-1 nicht (Abb. 14a). Auch für Vero-Zellen,
welche häufig bei HSV-1-Infektionsversuchen Anwendung finden158, konnte keine
Infektionsverstärkung durch CD4bs-M auf HSV-1 gezeigt werden (Abb. 14b). Dies
weist auf einen spezifischen Effekt von CD4bs-M auf die HIV-1-Infektion von Zellen
hin.
3.1.4. Die Bindung von CD4bs-M an gp120 und die Verstärkung der HIV-1-Infektion
von Primärzellen durch CD4bs-M
Um den molekularen Mechanismus der unerwarteten Verstärkung der HIV-1NL4.3Infektion zu verstehen, wurde untersucht, ob CD4bs-M in der Lage ist, nicht nur an
CD4, sondern auch an gp120 zu binden, auf dessen Basis es entwickelt wurde.
Dabei konnte gezeigt werden, dass CD4bs-M in der Lage ist, an gp120
verschiedener Stämme zu binden, wohingegen die Bindung an ein unverwandtes
Protein (gp130-Fc) und den Primärantikörper der Detektion deutlich geringer war
(Abb. 15). Die Bindung von CD4bs-M an gp120 gibt einen Hinweis darauf, dass
CD4bs-M die Verstärkung der Infektion durch Interaktion mit gp120 vermitteln
könnte.
Abb. 15: CD4bs-M bindet an gp120 verschiedener HIV-1-Stämme.
Bindung von CD4bs-M (10 µM) an gp120 verschiedener HIV-1-Stämme: MN (X4-trop), ADA und BAL
(beide R5-trop), sowie an Negativkontrollen (gp130 und mAb Schaf anti gp120) im direkten
Streptavidin-basierten ELISA. Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
- 47 -
Ergebnisse
Um zu testen, ob die Verstärkung der Infektion lediglich ein Stamm-spezifischer
Effekt ist oder auch auf andere HIV-1-Isolate übertragbar ist, wurden periphere
mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von freiwilligen Spendern mit fünf klinisch
relevanten HIV-1-Subtyp-Isolaten in An- und Abwesenheit von CD4bs-M infiziert. Die
Menge von p24-Antigen wurde drei Tage nach Infektion bestimmt. CD4bs-M war in
der Lage, die HIV-1-Infektion der PBMCs für alle fünf Subtyp-Isolate bis zu acht-fach
zu verstärken (Abb. 16). Somit verstärkt CD4bs-M die Infektion nicht nur von
Reporterzellen, sondern auch von Primärzellen.
Abb. 16: CD4bs-M verstärkt die HIV-1-Subtyp-Infektion von Primärzellen.
PBMCs wurden mit fünf verschiedenen HIV-1-Subtyp-Isolaten (B, D, F, H, O) in Ab- (- CD4bs-M) und
Anwesenheit (+ CD4bs-M) von CD4bs-M (10 µM) infiziert. Die Menge an p24-Antigen im
Zellkulturüberstand wurde drei Tage nach Infektion bestimmt.
3.1.5. Der Anteil der einzelnen Aminosäureabschnitte von CD4bs-M an der
Infektionsverstärkung und der direkten Bindung an gp120IIIB
CD4bs-M präsentiert drei separate gp120-Fragmente. Dazu zählen die CD4Bindungsschleife (CD4bl, Reste 365-373), das β20/β21-Fragment (Reste 424-433)
und das β23-Fragment (Reste 454-460). Um herauszufinden, welchen Anteil diese
drei Aminosäureabschnitte von CD4bs-M auf die Infektionsverstärkung von HIV1NL4.3 sowie die direkte Bindung an gp120IIIB haben, wurden verkürzte Varianten von
CD4bs-M synthetisiert, in denen einer oder zwei dieser Aminosäureabschnitte
- 48 -
Ergebnisse
deletiert wurden (Tab. 5). Diese Peptide wurden im HIV-1-Infektionsversuch
untersucht sowie auf Bindung an gp120 getestet (Abb. 17). Da die StämmeIIIB und
NL4.3
vom gemeinsamen
als die Stämme
LAI-Stamm
BAL, ADA
und
MN,
abstammen und sich demzufolge ähnlicher sind
wurden alle folgenden Bindungsversuche mit
gp120IIIB durchgeführt.
Abb. 17: CD4bs-M: Korrelation von Infektionsverstärkung und direkter Bindung an gp120.
a) Verstärkung der HIV-1NL4.3-Infektion in Ab- (-) und Anwesenheit von CD4bs-M und verkürzten
Varianten (10 µM). SEAP-Aktivität normalisiert im Bezug auf – (HIV-1-Infektion ohne Peptid, = 100%).
Die Daten sind als Mittelwerte und Standardirrtum von fünf (Δβ23, ΔCD4bl, β23, CD4bl und β20/β21)
bzw. sechs (CD4bs-M; Δβ20/β21) separaten Experimenten gezeigt. Die Versuche wurden von Katja
Rödel und Norbert Donhauser, Virologisches Institut, Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt.
*p<0,05. b) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von CD4bs-M und verkürzten Varianten
(10 µM) an gp120 IIIB (8 nM). Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt. Ar beschreibt die um
den Hintergrund korrigierten relative Absorption bei 492 nm, normiert auf die Absorption der Bindung
von CD4bs-M an gp120 (= 100%).
Von den drei verkürzten Varianten, bei denen ein Aminosäureabschnitt deletiert
wurde, war lediglich das Peptid, bei dem das β20/β21-Fragment deletiert wurde
(Δβ20/β21), nicht mehr in der Lage, die Infektion durch HIV-1NL4.3 zu verstärken. Von
den Einzelfragmenten war nur das β20/β21-Fragment in der Lage, die Infektion zu
verstärken.
Dies
weist
auf
die
Wichtigkeit
- 49 -
dieses
Fragments
für
den
Ergebnisse
infektionsverstärkenden Effekt von CD4bs-M hin. Zusätzlich war gp120IIIB in der
Lage, an CD4bs-M zu binden. Für die verkürzten Varianten Δβ23 konnte eine
Bindung vergleichbar mit CD4bs-M detektiert werden, wohingegen die Peptide
Δβ20/β21 und ΔCD4bl nicht mehr in der Lage waren, an gp120IIIB zu binden. Keines
der Einzelfragmente war in der Lage, an gp120IIIB zu binden. Dies weist darauf hin,
dass (wie für die Infektionsverstärkung) das β20/β21-Fragment für die Bindung an
gp120IIIB essentiell ist, jedoch auch die CD4-Bindungsschleife eine wichtige Rolle
spielt.
3.1.6. Das β20/β21-Fragment: Bedeutung der Reihenfolge der Aminosäuren für die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB
Um die Wichtigkeit des β20/β21-Fragments von CD4bs-M sowohl für die Bindung als
auch die Infektionsverstärkung weiter zu untersuchen, wurde eine CD4bs-M-Variante
synthetisiert, in der die Aminosäuren des β20/β21-Fragments in willkürlich
veränderter Reihenfolge („scrambled“) angeordnet wurden (β20/β21scr, Tab. 5) und
im HIV-1-Infektionsversuch untersucht sowie auf Bindung an gp120 getestet.
Abb. 18: Bedeutung der Reihenfolge der Aminosäuren im β20/β21-Fragment von CD4bs-M.
a) Verstärkung der HIV-1NL4.3 Infektion in Abwesenheit von Peptiden (-) und in Anwesenheit von
CD4bs-M und β20/β21scr. Die Daten sind als Mittelwerte und Standardirrtum von sechs separaten
Experimenten gezeigt. Die Versuche wurden von Norbert Donhauser, Virologisches Institut,
Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt. SEAP-Aktivität normalisiert im Bezug auf – (HIV-1Infektion ohne Peptid, = 100%). *p<0,05. b) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von
CD4bs-M und β20/β21scr (10 µM) an gp120 IIIB (8 nM). Die Messungen wurden im Duplikat
durchgeführt. Ar beschreibt die um den Hintergrund korrigierte relative Absorption bei 492 nm,
normiert auf die Absorption der Bindung von CD4bs-M an gp120 (= 100%).
- 50 -
Ergebnisse
Es konnte eine signifikante Abschwächung der Infektionsverstärkung sowie der
Bindung an gp120IIIB beobachtet werden (Abb. 18), was auf die Wichtigkeit der
Aminosäure-Reihenfolge des β20/β21-Fragmentes hinweist.
3.1.7. Der Einfluss der Aminosäureseitenketten des β20/β21-Fragmentes auf die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB
Um den Einfluss einzelner Aminosäuren des β20/β21-Fragmentes auf die Infektionsverstärkung und Bindung an gp120IIIB zu untersuchen, wurden Alanin-SubstitutionsVarianten dieses Fragments synthetisiert (Tab. 5) und im HIV-1-Infektionsversuch
untersucht sowie auf Bindung an gp120 getestet. Mit Ausnahme der Variante K432A
und W427A konnte sowohl für die Infektionsverstärkung als auch für die direkte
Bindung an gp120 ein vergleichbares Muster von abwechselnd wichtigen (I424,
M426, Q428, V430) und weniger wichtigen (N425, E429, G431) Aminosäuren
beobachtet werden (Abb. 19). Der Austausch der wichtigen Aminosäuren durch
Alanin führte zum Verlust der Infektionsverstärkung und der Bindung an gp120,
wohingegen der Austausch der weniger wichtigen Aminosäuren durch Alanin zu
keinem oder nur einem geringen Abfall der Infektionsverstärkung und der Bindung an
gp120 führte.
Abb. 19: Einfluss der Aminosäureseitenketten des β20/β21-Fragmentes auf die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB.
a) Verstärkung der HIV-1NL4.3 Infektion in Abwesenheit von Peptiden (-) und in Anwesenheit von
CD4bs-M und dessen Alanin-substituierten Varianten (10 µM). Die Daten sind als Mittelwerte und
Standardirrtum von drei separaten Experimenten gezeigt. Die Versuche wurden von Katja Rödel,
Virologisches Institut, Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt. SEAP-Aktivität normalisiert im
Bezug auf – (HIV-1-Infektion ohne Peptid, = 100%). b) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der
Bindung von CD4bs-M und dessen Alanin-substituierten Varianten (10 µM) an gp120IIIB (8 nM). Die
Messungen wurden im Duplikat durchgeführt. Ar beschreibt die um den Hintergrund korrigierten
relative Absorption bei 492 nm, normiert auf die Absorption der Bindung von CD4bs-M an gp120 (=
100%).
- 51 -
Ergebnisse
Während der Austausch von Lysin 432 durch Alanin zum Verlust der Infektionsverstärkung führte, wurde die Bindung an gp120 nicht beeinträchtigt. Im Gegensatz
dazu führte der Austausch von Tryptophan 427 zu einer starken Abschwächung der
Bindung an gp120, wohingegen die Infektionsverstärkung nicht beeinträchtigt wurde.
Somit konnte eine gute, jedoch keine vollkommene Übereinstimmung zwischen
Infektionsverstärkung und Bindung an gp120 beobachtet werden.
3.1.8. Der Einfluss der Struktur des β20/β21-Fragments auf die Infektionsverstärkung
und die Bindung an gp120IIIB
Die alternierende Wichtigkeit der Aminosäuren des β20/β21-Fragments weist darauf
hin, dass das β20/β21-Fragment bei der Infektionsverstärkung und der Bindung an
gp120 eine ausgestreckte Struktur ausbilden und eventuell in ein β-Faltblatt involviert
sein könnte. Aus der Kristallstruktur des gp120-CD4-Komplexes30 ist bekannt, dass
das β20/β21-Fragment neben dem β2/β3-Fragment Teil des Bridging sheets ist.
Sollte eine ausgestreckte Struktur des β20/β21-Fragments von CD4bs-M für die
Interaktion erforderlich sein, so würde die Einführung eines Knicks (zum Beispiel
durch den Einbau von Prolin159) die Interaktion von CD4bs-M mit dessen
Interaktionspartner verhindern. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Reste
W427, Q428, E429, V430 im β20/β21-Fragment durch Prolin substituiert (Tab. 5) und
im HIV-1-Infektionsversuch untersucht sowie auf Bindung an gp120 getestet. Keine
der Prolin-Varianten war in der Lage, die Infektion mit HIV-1NL4.3 zu verstärken oder
an gp120 zu binden (Abb. 20). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die
ausgestreckte Struktur des β20/β21-Fragments von CD4bs-M essentiell für die
Interaktion sowohl mit gp120 als auch mit dem intakten Virus ist.
Eine weitere Möglichkeit, die postulierte ausgestreckte Struktur zu stören, ist der
alternierende Einbau von
L-
und
D-Aminosäuren.
Durch die Ausrichtung der
Aminosäureseitenketten in die gleiche Richtung in diesen Peptiden werden
gebogene Strukturen mehr bevorzugt als ausgestreckte160. Um die Wichtigkeit der
ausgestreckten Struktur zu testen, wurden CD4bs-M-Varianten synthetisiert (Tab. 5),
bei denen alternierend
L-
und
D-Aminosäuren
im β20/β21-Fragment eingebaut
wurden (D1 und D2). Keine der beiden CD4bs-M-Varianten mit alternierenden L- und
D-Aminosäuren
im β20/β21-Fragment war in der Lage, die Infektion mit HIV-1NL4.3 zu
- 52 -
Ergebnisse
verstärken oder an gp120IIIB zu binden (Abb. 21). Dadurch wird die These, dass eine
ausgestreckte Struktur des β20/β21-Fragments vorliegen muss, weiter erhärtet.
Abb. 20: Einfluss von Prolinresten im β20/β21-Fragment auf die Infektionsverstärkung und die
Bindung an gp120IIIB.
a) Verstärkung der HIV-1NL4.3 Infektion in Abwesenheit von Peptiden (-) und in Anwesenheit von
CD4bs-M und dessen Prolin-substituierten Varianten (10 µM). Die Daten sind als Mittelwerte und
Standardirrtum von fünf separaten Experimenten gezeigt. Die Versuche wurden von Katja Rödel und
Norbert Donhauser, Virologisches Institut, Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt. SEAP-Aktivität
normalisiert im Bezug auf – (HIV-1-Infektion ohne Peptid, = 100%). *p<0,05, **p<0,01. b) Direkter
Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von CD4bs-M und dessen Prolin-substituierten Varianten
(10 µM) an gp120IIIB (8 nM). Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
Abb. 21: Einfluss von alternierenden L- und D-Aminosäuren im β20/β21-Fragment auf die
Infektionsverstärkung und die Bindung an gp120IIIB.
a) Verstärkung der HIV-1NL4.3 Infektion in Abwesenheit von Peptiden (-) und in Anwesenheit von
CD4bs-M und dessen Varianten D1 und D2 mit alternierenden L und D -Aminosäuren (10 µM). Die
Daten sind als Mittelwerte und Standardirrtum von drei separaten Experimenten gezeigt. Die
Versuche wurden von Norbert Donhauser, Virologisches Institut, Universität Erlangen/Nürnberg
durchgeführt. SEAP-Aktivität normalisiert im Bezug auf – (HIV-1-Infektion ohne Peptid, = 100%).
*p<0,05, **p<0,01. b) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von CD4bs-M und dessen
Varianten (10 µM) an gp120IIIB (8 nM). Die Messungen wurden von Barbara Kneidl, während ihrer
Masterarbeit im Institut für pharmazeutische Chemie, im Duplikat durchgeführt.
- 53 -
Ergebnisse
3.1.9. Der Einfluss von CD4bs-M auf die HIV-1-Infektion von CD4-negativen HeLaZellen
Um herauszufinden, ob die Infektionsverstärkung durch einen einfachen Klebeeffekt
(zum Beispiel durch Aggregation) von CD4bs-M an die Zielzelle oder durch eine
spezifische Interaktion von CD4bs-M im Bindungsprozess vom Spike des Virus mit
den zellulären Rezeptoren ausgelöst wird, wurden CD4-positive und –negative HeLaZellen, welche beide CXCR4 exprimierten (Abb. 22 a), mit dem Viruskonstrukt HIV1BR43IeG-nef+ infiziert. Werden Zielzellen mit diesem Viruskonstrukt infiziert, so wird
GFP exprimiert, welches durch Immunfluoreszenz im Mikroskop oder im FACS
nachgewiesen werden kann. Die Infektion CD4-positiver HeLa-Zellen wurde durch
CD4bs-M deutlich verstärkt, während das Peptid Δβ20/β21 keinen Einfluss auf die
Infektion dieser Zellen hatte (Abb. 22 b und c). CD4-negative Zellen konnten
hingegen nicht mit HIV-1BR43IeG-nef+ infiziert werden. Interessanterweise war CD4bs-M
in der Lage, die Infektion dieser Zellen schwach zu induzieren. Um auszuschließen,
dass es sich bei dieser Beobachtung um ein Artefakt handelte, wurde überprüft, ob in
Anwesenheit von CD4bs-M neue infektiöse Viren gebildet werden konnten. HI-Viren
besitzen eine Halbwertszeit von 30 bis 35 Stunden bei Raumtemperatur und sind
nach Inaktivierung nicht mehr in der Lage, eine produktive Infektion auszulösen161.
Da die Infektion der HeLa-Zellen erst nach drei bis vier Tagen via Fluoreszenz
detektiert wurde, enthielten nur diejenigen Zellkulturüberstände infektiöse HI-Viren,
die durch Infektion neu hervorgegangen waren. Deshalb wurden die Zellüberstände
der Infektionsversuche CD4-positiver und -negativer HeLa-Zellen gesammelt und auf
deren Infektions-verstärkende Wirkung auf CEMx174-SEAP Zellen untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass bei den Zellüberständen der HIV-1-infizierten CD4positiven HeLa-Zellen die SEAP-Akitivät deutlich detektierbar war und durch CD4bsM verstärkt werden konnte (Abb. S1). Für die Zellüberstände der CD4-negativen
HeLa-Zellen konnte lediglich eine SEAP-Aktivität detektiert werden, wenn der
Infektionsversuch in Anwesenheit von CD4bs-M durchgeführt wurde (Abb. 22 d).
Auch die Peptide allein sowie das UV-inaktivierte HIV-1BR43IeG-nef+ konnten keine
produktive Infektion auslösen. Dies weist darauf hin, dass CD4bs-M das Fehlen des
CD4-Rezeptors auf der Zielzelle kompensiert, wenn auch relativ ineffizient.
- 54 -
Ergebnisse
Abb. 22: CD4bs-M induziert die HIV-1-Infektion von CD4-negativen HeLa-Zellen.
a) Expression von CD4 und CXCR4 in CD4-positiven und CD4-negativen HeLa-Zellen, gemessen
mittels FACS, repräsentativ für zwei separate Experimente. b) Immunfluoreszenz und c) FACS von
CD4-positiven und CD4-negativen HeLa-Zellen infiziert mit HIV-1BR43IeG-nef+ in Ab- (-) und Anwesenheit
von CD4bs-M (10 µM) und dem Peptid Δβ20/β21 (10 µM). Die Daten stellen vier (für b) und drei (für c)
unabhängige Experimente dar. d) Aktivität der sekretierten alkalischen Phosphatase im CEMx174
SEAP Reporterzell-Versuch. Dargestellt sind relative Lichteinheiten (rlu), gemessen vier Tage nach
der Passage der Zellüberstände der CD4-negativen HeLa-Zellen. Die CEMx174 Zellen wurden den
Zellkulturüberständen ausgesetzt, welche infektiöses oder UV-inaktiviertes HIV-1BR43IeG-nef+ in Ab- (-)
und Anwesenheit von CD4bs-M (10 µM) und dem Peptid Δβ20/β21 (10 µM) enthielten. Die Daten
repräsentieren zwei separate Experimente. Die Versuche wurden von Norbert Donhauser und Prof.
Dr. Barbara Schmidt, Virologisches Institut, Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt.
3.1.10. Die Abhängigkeit des durch CD4bs-M vermittelten HIV-1-induzierenden
Effekts vom Corezeptor
Um zu testen, ob die in Abschnitt 3.1.9. gezeigte Induktion der Infektion durch
CD4bs-M Corezeptor-abhängig ist, wurden die CCR5-negativen CEMx174 SEAPZellen mit R5-tropem HIV-1NL4.3 005pf135 inkubiert und im Infektionsversuch vermessen.
Da der richtige Corezeptor für dieses Virus fehlte, kam es zu keiner messbaren
produktiven Infektion, die Infektion von CCR5-exprimierenden TZM-bl-Zellen war
jedoch positiv (Daten nicht gezeigt). Aus den Daten wird ersichtlich, dass CD4bs-M
in diesem Fall nicht in der Lage ist, die Infektion von Zellen mit diesem HIV-1-Stamm
- 55 -
Ergebnisse
zu induzieren (Abb. 23). Somit kann geschlussfolgert werden, dass der
infektionsverstärkende / induzierende Effekt Corezeptor-abhängig ist.
Abb. 23: Vergleich der Infektion von CEMx174 SEAP-Zellen mit X4- und R5-tropem HIV-1NL4.3.
Die CEMx174-SEAP Reporterzellen wurden in An- und Abwesenheit (-) von Peptid X4-tropem HIV1NL4.3 (CD4bs-M) sowie R5-tropem HIV-1NL4.3 005pf135 (CD4bs-M und Δβ20/β21) ausgesetzt. Die
Aktivität der alkalischen Phosphatase (SEAP) wurde 3 Tage nach Infektion gemessen. Die Versuche
wurden von Christina Haußner im Virologischen Institut, Universität Erlangen/Nürnberg durchgeführt
(Einfachbestimmung im Triplikat mit Standardabweichung).
- 56 -
Ergebnisse
3.2. Der Einfluss der QR-Dipeptid-Insertion in der V3-Schleife auf die Erkennung
durch anti-V3-Schleifen-Antikörper
Die erste Immunantwort gegen HIV-1 wird durch die V3-Schleife des gp120
ausgelöst. Die V3-Schleifen einiger weniger HIV-1-Isolate besitzen eine DipeptidInsertion (QR-Insertion) in der V3-Schleifen-Spitze. Der Einfluss dieser Insertion auf
die Erkennung durch anti-V3-Schleifen-Antikörper wurde mittels Peptiden untersucht.
Dazu wurden Volllängen-V3-Schleifen-Peptide mit nativer Disulfidbrücke synthetisiert
und deren Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper getestet. Eine schematische
Darstellung des Konstruktionsprinzips ist in Abbildung 24 dargestellt.
Abb. 24: Röntgenkristallstruktur von gp120 und schematische Darstellung des V3-SchleifenPeptids.
a) Röntgenkristallstruktur von gp12034 im CD4-gebundenen Zustand (pdb 2B4C) mit markiertem
Bridging sheet (schwarz) und markierter V3-Schleife (rot). b) schematische Darstellung des V3Schleifen-Peptids mit Disulfidbrücke (schwarz). Die Grafik wurde mittels RCSB Protein-Workshop
erstellt.
3.2.1. Synthese und Charakterisierung der V3-Schleifen-Peptide
Die V3-Schleifen-Peptide wurden wie unter 2.6.1. und 2.6.1.2. beschrieben
synthetisiert, oxidiert und mittels HPLC aufgereinigt. Die HPLC-Chromatogramme
und MALDI-TOF-MS-Spektren der gereinigten Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und
V3ADA sind in Abb. 25 bis 28 exemplarisch dargestellt.
Analog zu diesen V3-Schleifen-Peptiden wurden verschiedene Deletions-, Insertionsund
Substitutionsvarianten
synthetisiert.
- 57 -
Die
Sequenzen
der
verschiedenen
Ergebnisse
Varianten sind in Tab. 6 aufgeführt, die dazugehörigen berechneten und mittels
MALDI-TOF MS bestimmten Massen sind in Tabelle S2 dargestellt.
Abb. 25: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten Peptids V3IIIB.
Abb. 26: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten Peptids
V3HxBc2.
- 58 -
Ergebnisse
Abb. 27: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten Peptids
V3BAL.
Abb. 28: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des biotinylierten Peptids
V3ADA.
- 59 -
Ergebnisse
Tab. 6: Sequenzen der verwendeten Peptide zur Untersuchung der Bedeutung der QR-Insertion
in V3-Schleifen-Peptiden auf die Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper.
Ursprungssequenz eines V3-Schleifen-Peptids am Beispiel des Stammes HxBc2
CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC331
296
Peptid
Sequenz
V3IIIB
zyklisch
Bioa-Xb-G-X-CTRPNNNTRKKIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
ΔQR
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKKIRI--GPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
R311E
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKKIRIQEGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
R311I
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKKIRIQIGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
R311K
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKKIRIQKGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
Q310A R311A
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKKIRIAAGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
Q310q R311r
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKKIRIqrGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
V3HxBc2
zyklisch
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
ΔQR
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRI--GPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
R311E
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQEGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
R311I
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQIGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
R311K
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQKGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
Q310A R311A
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIAAGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
Q310q R311r
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIqrGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
V3BAL
zyklisch
Bioa-Xb-G-X-CTRPNNNTRKSIHI--GPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QR
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQRGPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QE
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQEGPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QI
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQIGPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QK
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQKGPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+AA
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIAAGPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+qr
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIqrGPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
V3ADA
zyklisch
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHI--GPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QR
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQRGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QE
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQEGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QI
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+QK
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIQKGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+AA
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIAAGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
+qr
Bio-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHIqrGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
a
Bio, Biotin (Markierung); bX, ε−Aminohexansäure (Abstandshalter). Die kleinen Buchstaben q und r
beschreiben D-Aminosäuren; fett markierte Aminosäuren zeigen die QR-Insertion und deren Mutation
an.
- 60 -
Ergebnisse
3.2.2. Die Interaktion der V3-Schleifen-Peptide mit anti-V3-Schleifen-Antikörpern
Um die Konzentrationen an V3-Schleifen-Peptiden herauszufinden, die für die
Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper erforderlich ist, wurde exemplarisch die
Bindung der Peptide V3BAL und V3ADA an die anti-V3-Schleifen-Antikörper 3869 und
2191 untersucht. Beide Antikörper wurden ursprünglich aus Patienten isoliert162,163.
3869 und 2191 binden im nanomolaren Bereich an beide V3-Schleifen-Peptide (Abb.
29a), was auf eine sehr starke Interaktion hinweist. Der gegen die CD4Bindungsstelle gerichtete Antikörper b12 sowie das unverwandte Protein gp130-Fc
waren nicht in der Lage, an diese Peptide zu binden. Auf Grundlage dieser
Ergebnisse wurde die Konzentration der V3-Schleifen-Peptide in allen weiteren
Bindungsversuchen (ELISA) auf 100 nM festgelegt.
a)
3
250 nM
125 nM
63 nM
31 nM
16 nM
8 nM
A492
2
1
0
BAL
A 492
BAL
3869
2
b)
ADA
ADA
2191
10 µM
5 µM
2,5 µM
1
0
3869
2191
gp130-Fc
b12
Abb. 29: Bindung der Peptide V3BAL und V3ADA an die anti-V3-Schleifen-Antikörper 3869 und
2191 sowie an gp130-Fc und b12.
a) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung der Antikörper 3869 und 2191 (jeweils 2 nM) an
die Peptide V3BAL und V3ADA (250 nM bis 8 nM ausverdünnt). b) Direkter Streptavidin-basierter ELISA
der Bindung der Antikörper 3869, 2191 und b12 sowie gp130-Fc (jeweils 1 µg/ml) an das Peptid V3BAL
(10 µM bis 2,5 µM ausverdünnt). Dargestellt ist die Absorption bei 492 nM. Die Messungen wurden
mindestens im Duplikat durchgeführt.
- 61 -
Ergebnisse
3.2.3. Die Interaktion verschiedener anti-V3-Schleifen-Antikörper mit gp120
Die Interaktion verschiedener anti-V3-Schleifen-Antikörper mit gp120 verschiedener
Stämme wurde in direkten Bindungsstudien untersucht. Da die vielen Daten im
Balkendiagramm relativ unübersichtlich sind (Abb. 30a) wurden sie zusätzlich
tabellarisch mit Farbcodierung dargestellt (Abb. 30b). Es konnte gezeigt werden,
dass die Antikörper 257-DIV, 268-DIV, F425 B4a1, F425 B4e8, 2191, 2219, 2442,
3869 und 3074 lediglich gp120BAL und gp120ADA erkannten, wohingegen gp120IIIB
und gp120HxBc2 nicht erkannt wurden. Im Gegensatz dazu erkannten die Antikörper
5F7 und 4G10 lediglich gp120IIIB und gp120HxBc2, jedoch nicht gp120BAL und
gp120ADA. Der einzige Antikörper, der in der Lage war, alle vier gp120 zu erkennen,
war 447-52D.
Die Antikörper 257-DIV, 268-DIV, F425 B4a1, F425 B4e8, 2191, 2219, 2442, 3869,
3074 und 447-52D wurden aus Patienten isoliert103,162-167. Die Antikörper 5F7 und
4G10 hingegen sind aus Immunisierungen von Mäusen mit hybriden Hepatitis C
Kern Antigen (HBcAg) / V3BH10 -Partikeln hervorgegangen168. Gp120BH10 besitzt in
der V3-Schleifen-Sequenz eine QR-Dipeptid-Insertion und ist den V3-Schleifen in
gp120IIIB und gp120HxBc2 sehr ähnlich, da diese alle von HIV-1LAI abstammen. Da die
QR-Isertion nur in HIVLAI vorkommt, ist es wahrscheinlich, dass die anderen hier
verwendeten anti-V3-Schleifen-Antikörper von Patienten stammen, die mit einem
HIV-Stamm ohne QR-Insertion in der V3-Schleife infiziert wurden. Es fällt also, mit
Ausnahme von 447-52D, eine klare Stammselektivität der Antikörper auf, die
eventuell auf die QR-Insertion zurückzuführen sein könnte.
- 62 -
Ergebnisse
a)
A 492
2
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
1
447-52D
4G10
5F7
3074
3869
2442
2219
2191
F425 B4e8
F425 B4a1
268-DIV
257-DIV
0
b)
gp120IIIB
gp120HxBc2
gp120BAL
gp120ADA
257-DIV
268-DIV
F425 B4a1
F425 B4e8
2191
2219
2442
3869
3074
5F7
4G10
447-52D
Abb. 30: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an gp120 mit (gp120IIIB,
gp120HxBc2) und ohne (gp120BAL, gp120ADA) QR-Insertion.
a) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung der Antikörper 257-DIV (0,5 nM), 268-DIV, F425
B4a1, F425 B4e8, 2191, 2219, 2442, 3869, 3074 und 447-52D (jeweils 2 nM) sowie 5F7 und 4G10
(1:100) an gp120IIIB (schwarz), gp120HxBc2 (dunkelgrau), gp120BAL (hellgrau) und gp120ADA (weiß)
(jeweils 8 nM). Dargestellt ist die Absorption bei 492 nM. Die Messungen wurden mindestens im
Duplikat durchgeführt. b) Schematische Darstellung der Daten aus a). Die Bindungsstärke jedes antiV3-Schleifen-Antikörpers an verschiedene gp120 wurde wie folgt definiert: grau: A492 < 0,1; gelb: 0,1<
A492 < 0,4; hellgrün: 0,4< A492 < 0,8; dunkelgrün: A492 > 0,8.
3.2.4. Die Bindung der anti-V3-Schleifen-Antikörper an die Peptide V3IIIB, V3HxBc2,
V3BAL und V3ADA
Die Selektivität der gp120-Bindung von anti-V3-Schleifen-Antikörpern ist ein
bemerkenswerter Effekt, der die Frage aufkommen lässt, ob diese Selektivität auch
für
die
Bindung
von
V3-Schleifen-Peptiden
an
anti-V3-Schleifen-Antikörper
nachweisbar ist. Um die Bindungseigenschaften der anti-V3-Schleifen-Antikörper für
die Bindung an V3-Schleifen-Peptide zu bestimmen, wurden die Peptide V3IIIB,
- 63 -
Ergebnisse
V3HxBc2, V3BAL und V3ADA über Streptavidin präsentiert und die Bindung der anti-V3Schleifen-Antikörper an diese Peptide getestet. Mit Ausnahme der Antikörper F425
B4e8, 2191, 2219 und 447-52D konnte erneut eine Stamm-Selektivität der Antikörper
festgestellt werden (Abb. 31), was die Ergebnisse der gp120-Bindung an anti-V3Schleifen-Antikörper bestätigt.
V3IIIB
V3HxBc2
V3BAL
V3ADA
257-DIV
268-DIV
F425 B4a1
F425 B4e8
2191
2219
2442
3869
3074
5F7
4G10
447-52D
Abb. 31: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an V3-Schleifen-Peptide
mit (V3IIIB, V3HxBc2) und ohne (V3BAL, V3ADA) QR-Insertion.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung der Antikörper 257-DIV (0,5 nM), 268-DIV, F425
B4a1, F425 B4e8, 2191, 2219, 2442, 3869, 3074 und 447-52D (jeweils 2 nM) sowie 5F7 und 4G10
(1:100) an die Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA (jeweils 100 nM). Schematisch dargestellt ist
die Absorption bei 492 nM. Die Bindungsstärke jedes anti-gp120 V3 Antikörpers an verschiedene V3Schleifen-Peptide wurde wie folgt definiert: grau: A492 < 0,1; gelb: 0,1< A492 < 0,4; hellgrün: 0,4< A492 <
0,8; dunkelgrün: A492 > 0,8. Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
3.2.5. Die Bindung verschiedener V3-Schleifen-Peptid-Varianten an anti-V3Schleifen-Antikörper
Da die V3-Schleifen von HIV-1 der Stämme
IIIB, HxBc2, BAL
und
ADA
N- und C-terminal
der QR-Insertion nicht Sequenz-identisch sind, sollte im Folgenden der Einfluss der
QR-Insertion innerhalb der V3-Schleifen durch Deletions- bzw. Insertions- sowie
Substitutionsvarianten genauer bestimmt werden (Tab. 6). Dies erfolgte mittels
direktem Streptavidin-basiertem ELISA (Abb. 32 und 33) sowie für die Antikörper
447-52D und 2191 mittels Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPRSpektroskopie) (Tab. 7-16).
Für die Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA konnte für die Interaktion mit 44752D eine starke Bindung nachgewiesen werden (Abb. 32 und 33, Tab. 7 und 8).
- 64 -
Ergebnisse
Auch für den Antikörper 2191 konnte eine starke Bindung an die Peptide V3BAL und
V3ADA detektiert werden (Abb. 32 und 33, Tab. 9 und 10). Interessanterweise konnte
jedoch mittels SPR-Spektroskopie keine Bindung an die Peptide V3IIIB und V3HxBc2
gemessen werden (Tab. 9-10), obwohl in der direkten ELISA eindeutig eine Bindung
nachweisbar war (Abb. 31). Dies stellt eine Diskrepanz zu den direkten
Bindungsdaten aus Abb. 32 dar. Demzufolge ist unklar, ob der Antikörper 2191 eine
Selektivität für V3-Schleifen ohne QR-Insertion besitzt oder nicht.
a)
IIIB
V3IIIB
Q310A Q310q
gp120 zyklisch ΔQR R311E R311I R311K R311A R311r
257-DIV
268-DIV
F425 B4a1
F425 B4e8
2191
2219
2442
3869
3074
5F7
4G10
447-52D
b)
HxBc2
V3HxBc2
Q310A Q310q
gp120 zyklisch ΔQR R311E R311I R311K R311A R311r
257-DIV
268-DIV
F425 B4a1
F425 B4e8
2191
2219
2442
3869
3074
5F7
4G10
447-52D
Abb. 32: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an die Peptide V3IIIB (a) und
V3HxBc2 (b) mit verschiedenen Mutationen im Aminosäurebereich 310-311.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung der Antikörper 257-DIV (0,5 nM), 268-DIV, F425
B4a1, F425 B4e8, 2191, 2219, 2442, 3869, 3074 und 447-52D (jeweils 2 nM) sowie 5F7 und 4G10
(1:100) an die Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (jeweils 100 nM). Schematisch dargestellt ist die Absorption
bei 492 nM. Die Bindungsstärke jedes anti-V3-Schleifen-Antikörpers an verschiedene V3-SchleifenPeptide wurde wie folgt definiert: grau: A492 < 0,1; gelb: 0,1< A492 < 0,4; hellgrün: 0,4< A492 < 0,8;
dunkelgrün: A492 > 0,8. Die Messungen wurden mindestens im Duplikat durchgeführt.
- 65 -
Ergebnisse
a)
V3BAL
gp120 zyklisch +QR
+QE
+QI
+QK
+AA
+qr
V3ADA
gp120 zyklisch +QR
+QE
+QI
+QK
+AA
+qr
BAL
257-DIV
268-DIV
F425 B4a1
F425 B4e8
2191
2219
2442
3869
3074
5F7
4G10
447-52D
b)
ADA
257-DIV
268-DIV
F425 B4a1
F425 B4e8
2191
2219
2442
3869
3074
5F7
4G10
447-52D
Abb. 33: Bindung von verschiedenen anti-V3-Schleifen-Antikörpern an die Peptide V3BAL (a)
und V3ADA (b) mit verschiedenen Mutationen im Aminosäurebereich 310-311.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung der Antikörper 257-DIV (0,5 nM), 268-DIV, F425
B4a1, F425 B4e8, 2191, 2219, 2442, 3869, 3074 und 447-52D (jeweils 2 nM) sowie 5F7 und 4G10
(1:100) an die Peptide V3BAL und V3ADA (jeweils 100 nM). Schematisch dargestellt ist die Absorption
bei 492 nM. Die Bindungsstärke jedes anti-V3-Schleifen-Antikörpers an verschiedene V3-SchleifenPeptide wurde wie folgt definiert: grau: A492 < 0,1; gelb: 0,1< A492 < 0,4; hellgrün: 0,4< A492 < 0,8;
dunkelgrün: A492 > 0,8. Die Messungen wurden mindestens im Duplikat durchgeführt.
Um herauszufinden, ob die Selektivität der Antikörper auf die QR-Insertion und nicht
auf andere Sequenzunterschiede zurückzuführen ist, wurde die QR-Insertion in den
Peptiden V3IIIB und V3HxBc2 deletiert und in den Peptiden V3BAL und V3ADA eingefügt
(Tab. 6) und die Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper getestet.
- 66 -
Ergebnisse
Tab. 7: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch und ΔQR),
sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 447-52D.
Dargestellt ist das Signal (RU) in Abhängigkeit von der Zeit (s), wobei die Assoziation von 0 s bis 120
s und die Dissoziation von 121 s bis 700s dargestellt ist. Gemessen wurde bei einer
Antikörperkonzentration von 6,7 nM – 0,4 nM. Die Messungen bei einer Konzentration von 3,3 nM
wurden im Duplikat durchgeführt.
Stamm
zyklisch
ΔQR
zyklisch
+QR
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
Tab. 8: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch und
ΔQR), sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 447-52D, gefittet nach dem 2-statereaction-Modell.
# KD konnte nicht eindeutig bestimmt werden, da kd außerhalb der Messgrenze des Biacore X100 lag
(Dissoziation zu schwach).
Stamm
zyklisch
ΔQR
IIIB
6,116*10-10
8,630*10-13#
HxBc2
5,153*10-14#
3,259*10-12#
zyklisch
+QR
BAL
2,215*10-13#
3,576*10-9
ADA
7,932*10-11#
3,926*10-9
- 67 -
Ergebnisse
Interessanterweise waren mit Ausnahme von 268-DIV alle getesteten anti-V3Schleifen-Antikörper in der Lage, an die Peptide V3IIIB ΔQR und V3HxBc2 ΔQR zu binden
(Abb. 32), wohingegen die Bindung an die Peptide V3BAL +QR und V3ADA +QR deutlich
schlechter war als für die Wildtyp-Varianten (Abb. 33). Die SPR-Spektroskopie-Daten
zeigten, dass der Antikörper 2191, der nicht in der Lage ist, die Peptide V3IIIB und
V3HxBc2 zu erkennen, sehr stark an die Peptide V3IIIB ΔQR und V3HxBc2 ΔQR bindet (Tab.
9 und 10). Dies weist weiterhin auf eine QR-Abhängigkeit von 2191 hin. Der
Antikörper 447-52D konnte im ELISA alle vier Varianten ähnlich gut wie die WildtypVarianten erkennen (Abb. 32 und 33) und ist demzufolge nicht von der QR-Insertion
abhängig. Jedoch konnte mittels SPR-Spektroskopie für 447-52D gezeigt werden,
dass die Bindung an die Peptide V3BAL
+QR
und V3ADA
+QR
waren, wohingegen die Bindung an die Peptide V3IIIB
deutlich abgeschwächt
ΔQR
und V3HxBc2
ΔQR
unbeeinträchtigt blieb oder sich sogar etwas verstärkte (Tab. 7 und 8). Die Antikörper
5F7 und 4G10 waren in der Lage, die Peptide V3IIIB ΔQR und V3HxBc2 ΔQR zu erkennen,
jedoch nicht die Peptide V3BAL
sind
demzufolge
nicht
+QR
und V3ADA
QR-selektiv,
+QR
jedoch
(Abb. 32 und 33). 5F7 und 4G10
selektiv
für
einen
anderen
Sequenzabschnitt innerhalb von V3IIIB und V3HxBc2, der unabhängig von dieser
Insertion präsentiert wird. Die Selektivität der anderen anti-V3-Schleifen-Antikörper
für V3-Schleifen ohne QR-Insertion weist darauf hin, dass sich die QR-Insertion
scheinbar in einem Sequenzabschnitt der V3-Schleife befindet, welcher als Epitop
zahlreicher Antikörper dient.
Die QR-Insertion beinhaltet eine positive Ladung, welche die Bindung der anti-V3Schleifen-Antikörper beeinträchtigen könnte. Um die Abhängigkeit der Bindung der
anti-V3-Schleifen-Antikörper von der Ladung innerhalb der QR-Insertion zu
überprüfen, wurde innerhalb der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 das Arginin gegen ein
Glutamat (negativ geladen), ein Isoleucin (neutral) oder ein Lysin (positiv geladen)
substituiert (Varianten R311E, R311I und R311K) (Tab. 6). Diese Peptide wurden
wiederum auf Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper untersucht. Für die Stämme
IIIB
und
HxBc2
konnte im direkten ELISA gezeigt werden, dass sich die Varianten
R311E und R311K ähnlich den Wildtyp-Peptiden verhielten. Lediglich für die
Antikörper F425 B4e8, 2191 und 2219, sowie 5F7, 4E10 und 447-52D konnte eine
Bindung an diese Varianten gemessen werden (Abb. 32).
- 68 -
Ergebnisse
Tab. 9: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch und ΔQR),
sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 2191.
Dargestellt ist das Signal (RU) in Abhängigkeit von der Zeit (s), wobei die Assoziation von 0 s bis 120
s und die Dissoziation von 121 s bis 700s dargestellt ist. Gemessen wurde bei einer
Antikörperkonzentration von 6,7 nM – 0,4 nM. Die Messungen bei einer Konzentration von 3,3 nM
wurden im Duplikat durchgeführt.
Stamm
zyklisch
ΔQR
zyklisch
+QR
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
Tab. 10: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch
und ΔQR), sowie V3BAL und V3ADA (zyklisch und +QR) an mAb 2191, gefittet nach dem 2-statereaction-Modell.
# KD konnte nicht eindeutig bestimmt werden, da kd außerhalb der Messgrenze des Biacore X100 lag
(Dissoziation zu schwach).
Stamm
zyklisch
ΔQR
IIIB
nicht berechnet
2,737*10-16#
HxBc2
nicht berechnet
1,404*10-14#
zyklisch
+QR
BAL
2,677*10
-17#
nicht berechnet
ADA
8,254*10-15#
nicht berechnet
- 69 -
Ergebnisse
Tab. 11: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (R311E, R311I, R311K),
sowie V3BAL und V3ADA (+QE, +QI, +QK) an mAb 447-52D.
Dargestellt ist das Signal (RU) in Abhängigkeit von der Zeit (s), wobei die Assoziation von 0 s bis 120
s und die Dissoziation von 121 s bis 700s dargestellt ist. Gemessen wurde bei einer
Antikörperkonzentration von 6,7 nM – 0,4 nM. Die Messungen bei einer Konzentration von 3,3 nM
wurden im Duplikat durchgeführt.
Stamm
R311E
R311I
R311K
+QE
+QI
+QK
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
Tab. 12: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (R311E,
R311I, R311K), sowie V3BAL und V3ADA (+QE, +QI, +QK) an mAb 447-52D, gefittet nach dem 2state-reaction-Modell.
# KD konnte nicht eindeutig bestimmt werden, da kd außerhalb der Messgrenze des Biacore X100 lag
(Dissoziation zu schwach).
Stamm
R311E
R311I
R311K
IIIB
3,288*10-7
9,031*10-16#
1,070*10-8
HxBc2
3,292*10-9
1,035*10-13#
1,770*10-9
+QE
+QI
+QK
BAL
nicht berechnet
8,150*10-11#
nicht berechnet
ADA
nicht berechnet
1,313*10-10#
nicht berechnet
- 70 -
Ergebnisse
Aus den SPR-Spektroskopie-Daten der Bindung dieser V3-Schleifen-Peptide an den
Antikörper 447-52D ergab sich jedoch eine deutliche Bindungsverschlechterung
(Tab. 11), was sich auch in niedrigeren Gleichgewichtskonstanten (KD) widerspiegelt
(Tab. 12). Unerwarteterweise waren die Peptide V3IIIB
R311I
und V3HxBc2
R311I
in der
Lage, an alle Antikörper, mit Ausnahme von 257-DIV, 268-DIV und 3074, stark zu
binden (Abb. 32). Zusätzlich konnte mittels SPR-Spektroskopie eine starke
Interaktion mit dem Antikörper 447-52D nachgewiesen werden (Tab. 11 und 12). Der
Antikörper 2191 war ebenfalls in der Lage, eine starke Interaktion mit diesen
Peptidvarianten auszubilden (Tab. 13 und 14). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine
neutrale Insertion deutlich besser toleriert wird, als eine geladene.
Um herauszufinden, ob dieser Effekt auch auf die Peptide V3BAL und V3ADA
übertragbar ist, wurden in diese V3-Schleifen-Peptide die Dipeptide QE, QI oder QK
eingefügt (Tab. 6) und die Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper untersucht. Auch
hier konnte gezeigt werden, dass die QE- und QK-Insertion nachteilige Effekte auf
die Erkennung durch die anti-V3-Schleifen-Antikörper, ähnlich der QR-Insertion,
hatten (Abb. 33). Der Antikörper 447-52D bindet nicht oder deutlich schwächer an
diese Varianten. Dies konnte zusätzlich mittels SPR-Spektroskopie bestätigt werden
(Tab. 11 und 12), da keine Bindung dieser Varianten an 447-52D nachgewiesen
werden konnte. Interessanterweise konnte, mit Ausnahme der QR-unabhängigen
Antikörper 5F7 und 4G10, sowie 257-DIV und 268-DIV, eine starke Bindung der antiV3-Schleifen-Antikörper
an
die
QI-Varianten
beider
V3-Schleifen-Peptide
nachgewiesen werden, welche vergleichbar mit der Bindung an die Wildtyp-Peptide
war (Abb. 33). Diese Ergebnisse konnten auch mittels SPR-Spektroskopie für den
Antikörper 447-52D bestätigt werden (Tab. 11 und 12). Für den Antikörper 2191
konnte lediglich eine Bindung für das Peptid V3ADA
+QI
nachgewiesen werden (Tab.
13 und 14). Auch für diese Peptide lässt sich schlussfolgern, dass eine QI-Insertion
von den meisten anti-V3-Schleifen-Antikörpern besser toleriert wird als eine
geladene Insertion.
Um diese Hypothese weiter zu untersuchen, wurden V3-Schleifen-Peptide mit einer
Q310A R311A-Substitution (für V3IIIB und V3HxBc2) beziehungsweise einer AAInsertion (für V3BAL und V3ADA) synthetisiert (Tab. 6) und die Bindung an die anti-V3Schleifen-Antikörper getestet.
- 71 -
Ergebnisse
Tab. 13: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (R311I, Q310q R311r),
sowie V3BAL und V3ADA (+QI, +qr) an mAb 2191.
Dargestellt ist das Signal (RU) in Abhängigkeit von der Zeit (s), wobei die Assoziation von 0 s bis 120
s und die Dissoziation von 121 s bis 700s dargestellt ist. Gemessen wurde bei einer
Antikörperkonzentration von 6,7 nM – 0,4 nM. Die Messungen bei einer Konzentration von 3,3 nM
wurden im Duplikat durchgeführt.
Stamm
R311I
Q310q R311r
+ QI
+qr
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
Tab. 14: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (R311I,
Q310q R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+QI, +qr) an mAb 2191, gefittet nach dem 2-statereaction-Modell.
# KD konnte nicht eindeutig bestimmt werden, da kd außerhalb der Messgrenze des Biacore X100 lag
(Dissoziation zu schwach).
Stamm
R311I
Q310q R311r
IIIB
2,331*10-13#
nicht berechnet
HxBc2
4,001*10-11#
nicht berechnet
+ QI
+qr
BAL
nicht berechnet
nicht berechnet
ADA
1,299*10-15#
nicht berechnet
- 72 -
Ergebnisse
Für die Peptide V3IIIB
Q310A R311A
und V3HxBc2
Bindungsverhalten wie für die Peptide V3IIIB
Q310A R311A
R311I
konnte ein ähnliches
und V3HxBc2
nachgewiesen
R311I
werden (Abb. 32). Mittels SPR-Spektroskopie konnte auch die Bindung dieser
Varianten an 447-52D nachgewiesen werden. Jedoch ist die Bindung deutlich
schwächer als für die V3-Schleifen-Peptide V3IIIB
R311I
und V3HxBc2
R311I
(Tab. 15).
Dies spiegelt sich auch in schlechteren Gleichgewichtskonstanten wider (Tab. 16).
Die Bindung der Peptide V3BAL +AA und V3ADA + AA an die anti-V3-Schleifen-Antikörper
ist besser als für die Peptide V3BAL
+QR
und V3ADA
+QR,
reicht jedoch nicht für alle
Antikörper an die Bindungsstärke der Peptide V3BAL +QI und V3ADA +QI heran (Abb. 33).
Für den Antikörper 447-52D bedeutet die AA-Insertion in den Peptiden V3BAL und
V3ADA sogar den kompletten Bindungsverlust (Abb. 33, Tab. 15 und 16). Daraus kann
geschlussfolgert werden, dass eine neutrale Insertion in die V3-Schleife von einigen
anti-V3-Schleifen-Antiköpern toleriert wird, jedoch wird eine AA-Insertion nicht so
effizient toleriert wie eine QI-Insertion.
Die Toleranz der Dipeptid-Insertion in der V3-Schleifen-Spitze von einigen anti-V3Schleifen-Antikörpern wirft die Frage auf, ob die Aminosäure-Seitenketten dieser
Insertion in einer bestimmten Konformation vorhanden sein müssen, um erkannt zu
werden, oder ob eine generelle Toleranz dieser Insertion, unabhängig von der
Seitenkettenausrichtung, möglich ist. Um dieser Frage nachzugehen, wurden V3Schleifen-Peptide mit der
D-Aminosäure-Insertion
Glutamin und Arginin (qr)
synthetisiert (Tab. 6) und die Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper getestet.
Nur die anti-V3-Schleifen-Antikörper 2219 (V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA), F425
B4e8 (V3ADA) sowie schwach 2191 (V3ADA) und F425 B4a1 (V3BAL und V3ADA) zeigten
Bindung an eines dieser Peptide. Die anderen Antikörper hingegen zeigten keine
Bindung an die Peptide mit dieser Dipeptid-Insertion. Dies trifft auch auf die SPRSpektroskopie-Daten des Antikörpers 447-52D sowie des Antikörpers 2191 zu. Die
geringfügige Bindung des Antikörpers 2191 an das Peptid V3ADA
+qr
konnte mittels
SPR-Spektroskopie nicht nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass
die Seitenkettenkonformation der QR-Insertion eine wichtige Rolle für die Erkennung
durch die meisten anti-V3-Schleifen-Antikörper spielt.
- 73 -
Ergebnisse
Tab. 15: SPR-Sensogramme der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (Q310A R311A, Q310q
R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+AA, +qr) an mAb 447-52D.
Dargestellt ist das Signal (RU) in Abhängigkeit von der Zeit (s), wobei die Assoziation von 0 s bis 120
s und die Dissoziation von 121 s bis 700s dargestellt ist. Gemessen wurde bei einer
Antikörperkonzentration von 6,7 nM – 0,4 nM. Die Messungen bei einer Konzentration von 3,3 nM
wurden im Duplikat durchgeführt.
Stamm
Q310A R311A
Q310q R311r
+AA
+qr
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
Tab. 16: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (Q310A
R311A, Q310q R311r), sowie V3BAL und V3ADA (+AA, +qr) an mAb 447-52D, gefittet nach dem 2state-reaction-Modell.
Stamm
Q310A R311A
Q310q R311r
IIIB
4,516*10-9
nicht berechnet
HxBc2
9,130*10-10
nicht berechnet
+AA
+qr
BAL
nicht berechnet
nicht berechnet
ADA
nicht berechnet
nicht berechnet
- 74 -
Ergebnisse
Um zu evaluieren, warum eine Diskrepanz zwischen den direkten ELISAs und der
SPR-Spektroskopie beim anti-V3-Schleifen-Antikörper 2191 auftrat, wurden in
direkten Streptavidin-basierten ELISAs die Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA
sowie die Peptide V3IIIB ΔQR, V3HxBc2 ΔQR, V3BAL +QR und V3ADA +QR nicht bei der fixen
Konzentration (100 nM) getestet, sondern beginnend bei einer Konzentration von
500 nM bis 16 nM ausverdünnt (Abb. S2). Es stellte sich heraus, dass eine starke
Bindung von 2191 an die Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA nachgewiesen
werden konnte (Abb. S2a). Ein ähnliches Bild ergab sich für die Peptide V3IIIB
ΔQR,
V3HxBc2 ΔQR, V3BAL +QR und V3ADA +QR (Abb. S2b). Es konnte gezeigt werden, dass das
Peptid V3BAL
+QR
nicht in der Lage war, an den Antikörper 2191 zu binden,
wohingegen die Peptide V3IIIB
ΔQR,
V3HxBc2
ΔQR
und V3ADA
+QR
ein gutes
Bindungsverhalten zeigten.
Um diesen Effekt in einem anderen Versuchsformat zu testen, wurden direkte ELISA
(ohne Streptavidin) mit den V3-Schleifen-Peptiden V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA
sowie V3IIIB
ΔQR,
V3HxBc2
ΔQR,
V3BAL
+QR
und V3ADA
+QR
durchgeführt, wobei der
Nachweis nicht über den Antikörper 2191 sondern über die Biotinmarkierung der V3Schleifen-Peptide erfolgte (Abb. S3). Hier konnte gezeigt werden, dass die Bindung
an die Peptide V3IIIB, V3HxBc2 (Abb. S3a) sowie das Peptid V3ADA +QR (Abb. S3b) im
Vergleich zu den Peptiden V3BAL und V3ADA (Abb. S3a) sowie den Peptiden V3IIIB ΔQR,
V3HxBc2 ΔQR (Abb. S3b) deutlich schlechter war. Für das Peptid V3BAL +QR konnte keine
Bindung nachgewiesen werden. Es ist demzufolge wahrscheinlich, dass es sich beim
Antikörper 2191 um einen Antikörper handelt, der eine Selektivität für V3-Schleifen
ohne QR-Insertion besitzt.
Für die Antikörper 5F7 und 4G10 wurde in den direkten ELISAs eine Bindung an die
Peptidvarianten V3IIIB und V3HxBc2, unabhängig von der QR-Insertion, nachgewiesen.
Lediglich die Insertion der D-Aminosäuren qr führte zum Signalverlust. Es lässt sich
demzufolge schlussfolgern, dass es sich bei den Antikörpern 5F7 und 4G10 um antiV3-Schleifen-Antikörper handelt, die ein Epitop außerhalb der V3-Schleifen-Spitze
erkennen. Da der Einbau von
D-Aminosäuren
die Konformation von Peptiden
beeinflussen kann, könnte dieses Epitop beeinträchtigt werden, auch wenn es nicht
in der V3-Schleifen-Spitze lokalisiert ist.
- 75 -
Ergebnisse
3.2.6. Die Spezifität der Antikörper 2191, 3869 und 447-52D für V3-Schleifen-Epitope
Die Spezifität eines Proteins für eine bestimmte Bindungsstelle, welche durch ein
Mimetikum imitiert wird, kann mittels kompetitiver ELISA bestimmt werden. Im Fall
der anti-V3-Schleifen-Antikörper wurden zu diesem Zweck kompetitive ELISAs am
Beispiel der anti-V3-Schleifen-Antikörper 2191, 3869 und 447-52D durchgeführt. Die
Kompetition macht sich hierbei in einer konzentrationsabhängigen Inhibition der
Bindung von gp120 an anti-V3-Schleifen-Antikörper durch die Peptide bemerkbar.
Um den Effekt der Selektivität der anti-V3-Schleifen-Antikörper für V3-Schleifen ohne
QR-Insertion näher zu untersuchen, wurden kompetitive ELISAs mit den Peptiden
V3HxBc2, V3BAL und V3ADA mit gp120BAL und gp120ADA um Bindung an 2191 sowie
3869 durchgeführt (Abb. 34). Da beide Antikörper nicht in der Lage waren,
gp120HxBc2 im direkten Bindungstest zu erkennen (Abb.30), wurde für die Kompetition
der Peptide V3HxBc2 und V3HxBc2 ΔQR als Kompetitionspartner gp120ADA definiert. Für
die Kompetition dieser Peptide konnte eine eindeutige Selektivität für V3-Schleifen
ohne QR-Insertion gemessen werden, da das Peptid V3HxBc2
ΔQR
eine gute
Kompetition mit gp120ADA für die Bindung sowohl an 2191 (IC50: 0,7 nM) (Abb. 34a)
als auch an 3869 (IC50: 0,9 nM) (Abb. 34b) zeigte, wohingegen für das Peptid V3HxBc2
weder für die Bindung an 2191 (Abb. 34a) noch 3869 (Abb. 34b) eine Kompetition
nachweisbar war. Die gleiche Korrelation ergab sich für die Kompetition der Peptide
V3BAL, V3BAL
+QR,
V3ADA und V3ADA
+QR
mit gp120 des passenden Stammes um
Bindung an 2191 und 3869. Es wurde ersichtlich, dass die Peptide V3BAL (Abb. 34 e,
f) und V3ADA (Abb. 34 c, d) sehr gut mit gp120 um Bindung an 2191 (IC50
BAL:
19 nM,
IC50 ADA: 0,2 nM) und 3869 (IC50 BAL: 0,9 nM, IC50 ADA: 3,7 nM) kompetierten, während
die QR-Insertions-Varianten keine Kompetition mit gp120 um Bindung an 2191 und
3869 zeigten. Aus diesen kompetitiven Daten wird ersichtlich, dass sowohl 2191 als
auch 3869 eine klare Selektivität für V3-Schleifen ohne QR-Insertion besitzen. Dies
weist wiederum auf ein falsch-positives Signal im direkten Streptavidin-basierten
ELISA für 2191 und die V3-Schleifen-Peptide V3IIIB und V3HxBc2 hin (Abb. 32).
- 76 -
Ergebnisse
120
100
80
80
3869 + gp120 ADA + V3 HxBc2
3869 + gp120 ADA + V3 HxBc2 (ΔQR)
2191 + gp120 ADA + V3 HxBc2
2191 + gp120 ADA + V3 HxBc2 (ΔQR)
120
d)
120
100
80
Inhibition (%)
60
40
20
0
80
60
40
20
0
80
80
[Peptid] (nM)
10000
1000
10000
1000
0,0001
10000
1000
100
-20
10
0
-20
1
0
0,1
100
20
100
20
40
10
40
60
1
60
0,1
Inhibition (%)
100
0,01
10
120
100
0,001
1
3869 + gp120 ADA + V3 ADA
3869 + gp120 ADA + V3 ADA (+QR)
0,01
f)
120
0,0001
0,1
[Peptid] (nM)
2191 + gp120 ADA + V3 ADA
2191 + gp120 ADA + V3 ADA (+QR)
Inhibition (%)
0,01
0,0001
[Peptid] (nM)
0,001
-20
10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
-20
0,001
Inhibition (%)
100
e)
10000
[Peptid] (nM)
[Peptid] (nM)
c)
1000
0,0001
10000
1000
100
10
1
-20
0,1
-20
0,01
0
0,001
0
100
20
10
20
40
1
40
60
0,1
60
0,01
Inhibition (%)
100
0,001
b)
120
0,0001
Inhibition (%)
a)
[Peptid] (nM)
3869 + gp120 BAL + V3 BAL
3869 + gp120 BAL + V3 BAL (+QR)
2191 + gp120 BAL + V3 BAL
2191 + gp120 BAL + V3 BAL (+QR)
Abb. 34: Kompetition der Peptide V3HxBc2, V3HxBc2 ΔQR, V3BAL, V3BAL + QR, V3ADA und V3ADA +QR mit
gp120BAL und gp120ADA um Bindung an mAb 2191 und 3869.
Kompetitiver ELISA der Bindung von gp120ADA (4nM) (a bis d) und gp120BAL (4 nM) (e, f) an mAb
2191 (a, c, e) und 3869 (b, d, f). Als Kompetitoren wurden die Peptide V3HxBc2 und V3HxBc2 ΔQR (a und
b), V3ADA und V3ADA +QR (c und d) und V3BAL und V3BAL +QR (e und f) eingesetzt. Dargestellt ist die
Inhibition der Bindung von gp120 an mAb 2191 beziehungsweise mAb 3869 durch das entsprechende
V3-Schleifen-Peptid. Die Messungen wurden mindestens im Duplikat durchgeführt.
- 77 -
Ergebnisse
b)
100
100
80
80
Inhibition (%)
120
[Peptid] (nM)
10000
1000
Peptid [nM]
447-52D + gp120 IIIB + V3 IIIB
447-52D + gp120 IIIB + V3 IIIB (ΔQR)
447-52D + gp120 IIIB + V3 IIIB (R311I)
447-52D + gp120 HxBc2 + V3 HxBc2
447-52D + gp120 HxBc2 +V3 HxBc2 (ΔQR)
447-52D + gp120 HxBc2 + V3 HxBc2 (R311I)
d)
120
100
100
80
80
10000
1000
100
10000
1000
100
10
1
0,1
-20
0,01
-20
0,001
0
0,0001
0
10
20
1
20
40
0,1
40
60
0,01
60
0,001
Inhibition (%)
120
0,0001
c)
Inhibition (%)
100
10000
1000
100
10
1
0,1
-20
0,01
-20
0,001
0
0,0001
0
10
20
1
20
40
0,1
40
60
0,01
60
0,0001
Inhibition (%)
120
0,001
a)
[Peptid] (nM)
[Peptid] (nM)
447-52D + gp120 BAL + V3 BAL
447-52D + gp120 BAL + V3 BAL (+QR)
447-52D + gp120 BAL + V3 BAL (+QI)
447-52D + gp120 ADA + V3 ADA
447-52D + gp120 ADA + V3 ADA (+QR)
447-52D + gp120 ADA + V3 ADA (+QI)
Abb. 35: Kompetition der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA sowie deren Varianten mit
gp120IIIB, gp120HxBc2, gp120BAL und gp120ADA um Bindung an mAb 447-52D.
Kompetitiver ELISA der Bindung von gp120IIIB (4 nM) (a), gp120HxBc2 (b), gp120BAL (4 nM) (c) und
gp120ADA (d) an mAb 447-52D. Als Kompetitoren wurden die Peptide V3IIIB und V3HxBc2 (zyklisch, ΔQR
und R311I) (a und b) sowie die Peptide V3BAL und V3ADA (zyklisch, +QR und +QI) (c und d) eingesetzt.
Dargestellt ist die Inhibition der Bindung von gp120 an mAb 447-52D durch das entsprechende V3Schleifen-Peptid. Die Messungen wurden mindestens im Duplikat durchgeführt.
Der Antikörper 447-52D zeigte in der direkten Bindungsanalyse keine QRSelektivität. Um herauszufinden, ob dieser Antikörper eine Präferenz für V3Schleifen-Peptide mit oder ohne QR-Insertion besitzt, wurde die Kompetition der
- 78 -
Ergebnisse
Peptide V3IIIB, V3IIIB ΔQR, V3HxBc2, V3HxBc2 ΔQR, V3BAL, V3BAL +QR, V3ADA und V3ADA +QR
mit dem jeweiligen gp120 des passenden Stammes um Bindung an 447-52D
getestet (Abb. 35). Es konnte gezeigt werden, dass 447-52D eine klare Präferenz für
die Bindung an V3-Schleifen-Peptide ohne QR-Insertion besitzt. Im Fall des
Stammes
führte die Deletion der QR-Insertion zu einer etwa 260–fachen
IIIB
Verbesserung des IC50-Wertes (IC50
IIIB:
6,5 nM, IC50
IIIB ΔQR
: 25,1 pM). Die
Verbesserung des IC50-Wertes durch Deletion der QR-Insertion für den Stamm
konnte zu etwa 23–fach bestimmt werden (IC50
pM). Für die Stämme
BAL
und
ADA
HxBc2:
2,4 nM, IC50
HxBc2 ΔQR
HxBc2
: 106,1
führte die QR-Insertion sogar dazu, dass kein IC50-
Wert der entsprechenden Peptide für die Kompetition mit dem passenden gp120 um
Bindung an 447-52D bestimmt werden konnte (IC50 > 5 µM). Dies bestätigt die SPRSpektroskopie-Daten aus 3.2.5.
Die Peptidvarianten V3IIIB R311I, V3HxBc2 R311I, V3BAL +QI und V3ADA +QI waren in der Lage,
direkt an 447-52D zu binden. Auch diese Peptide wurden auf ihre Fähigkeit
untersucht, mit gp120 des passenden Stammes um die Bindung an 447-52D zu
kompetieren (Abb. 35). Für den Stamm
IIIB
zeigten die berechneten IC50-Werte
deutlich, dass durch die R311I-Substitution eine etwa 75–fache Verbesserung der
Kompetition stattfand (IC50
Stamm
HxBc2
IIIB:
6,5 nM, IC50
IIIB R311I:
87,2 pM) (Abb. 35a). Für den
war die Verbesserung der Kompetition so dramatisch, dass bei einer
Konzantration von 1 pM Peptid noch 60% Inhibition durch das Peptid V3HxBc2
R311A
nachweisbar waren (Abb. 35b). Somit konnte kein IC50-Wert berechnet werden. Aus
dem Kurvenverlauf wird jedoch ersichtlich, dass dieses Peptid deutlich stärker mit
gp120HxBc2 um Bindung an 447-52D kompetierte als die Wildtyp-Variante. Bei den
Stämmen
BAL
und
ADA
konnte gezeigt werden, dass die QI-Insertion in diesen
Peptiden zu einer drastischen Verschlechterung der Kompetition mit gp120 des
passenden Stammes um Bindung an 447-52D führte (Abb. 35 c, d). Für den Stamm
BAL
ergab sich eine etwa 12500–fache Verschlechterung (IC50 BAL: 51 pM, IC50 BAL + QI:
646 nM), für den Stamm
ADA
eine 100.000–fache Verschlechterung des IC50-Wertes
der Peptide mit QI-Insertion verglichen mit den Wildtyp-Varianten (IC50 ADA: 9,7 pM,
IC50 ADA + QI: 984 nM). Obwohl mittels SPR-Spektroskopie eine vergleichbare Bindung
der Wildtyp- und der QI-Insertionsvariante nachweisbar war (3.2.5.), schließt dies
nicht aus, dass die Kompetition mit gp120, welches die Wildtyp-V3-Schleife trägt,
dramatisch schlechter sein kann.
- 79 -
Ergebnisse
3.2.7. Antikörperseren gegen V3-Schleifen-Peptide mit und ohne QR-Insertion
Der Effekt der Selektivität oder Präferenz der anti-V3-Schleifen-Antikörper für V3Schleifen ohne QR-Insertion stellt ein bemerkenswertes Phänomen dar. Um
herauszufinden, ob das Immunsystem gegen V3-Schleifen-Peptide eine QRselektive Antikörperantwort generiert, wurden die Peptide V3Ova-HxBc2 und V3Ova-HxBc2
ΔQR
synthetisiert. Zur Auslösung einer effektiven humoralen Immunantwort wurde
eine Strategie angewendet, die 2005 beschrieben wurde126. Hierbei wurde das zu
immunisierende Peptid synthetisch während der Festphasenpeptidsynthese an das
TH-Zell-Epitop aus Ovalbumin (Ova
Erhaltung
der
nativen
323-339)
Disulfidbrücke
gekoppelt. Diese Strategie ermöglicht die
an
der
Basis
der
V3-Schleife.
Die
Immunogensequenzen sowie das HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MSSpektrum des Peptids V3Ova-HxBc2 sind in Tab. 17 und Abb. 36 dargestellt, die mittels
MALDI-TOF MS bestimmten Massen sind in Tabelle S2 aufgelistet. Die gereinigten
und oxidierten Peptide wurden zur Immunisierung von speziellen Mäusen
(DO11.10)127 eingesetzt, die abhängig vom TH-Zell-Epitop Ova
323-339
eine starke
Immunantwort auslösen.
Abb. 36: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des Immunogens V3 Ova-HxBc2.
- 80 -
Ergebnisse
Tab. 17: Sequenzen der verwendeten Peptide zur Mausimmunisierung mit V3-SchleifenPeptiden.
Beispielsequenz des Immunogens V3Ova-HxBc2:
323ISQAVHAAHAEINEAGR339
296CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC331
gp120 V3-Schleife
Ovalbumin T-Zell-Epitop (Ova)
Peptid
Sequenz
V3-Schleifen-Peptid
Ova-HxBc2
Ac-Ova-Xa -G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
Ova-HxBc2
Ac-Ova-X -G-X-CTRPNNNTRKRIRI--GPGRAFVTIGKIGNMRQAHC-NH2
ΔQR
a
X, ε−Aminohexansäure (Abstandshalter).
Nach sechs Wochen wurden Seren genommen und die Bindung an die Peptide
V3HxBc2 und V3HxBc2 ΔQR untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass die entstandenen Seren ausschließlich anti-V3Schleifen-Antikörper enthielten, die eine Selektivität für V3-Schleifen mit oder ohne
QR-Insertion aufwiesen (Abb. 37). Das Serum, welches mittels Peptid V3Ova-HxBc2
erzeugt wurde (Serum anti-V3Ova-HxBc2) erkannte das Peptid V3HxBc2 sehr gut, war
aber nicht in der Lage, das Peptid V3HxBc2 ΔQR zu erkennen (Abb. 37a). Im Gegensatz
dazu erkannte das Serum, welches mittels Peptid V3Ova-HxBc2
(Serum anti-V3Ova-HxBc2
ΔQR),
lediglich das Peptid V3HxBc2
V3HxBc2 (Abb. 37b).
- 81 -
ΔQR,
ΔQR
erzeugt wurde
und nicht das Peptid
Ergebnisse
1,6
V3 HxBc2
1,2
A 492
V3 HxBc2 ΔQR
0,8
0,4
0,0
200
400
800
1600
3200
12800
Serumverdünnung (-fach)
1,6
V3 HxBc2
1,2
A 492
6400
V3 HxBc2 ΔQR
0,8
0,4
0
200
400
800
1600
3200
6400
12800
Serumverdünnung (-fach)
Abb. 37: Bindung der Peptide V3HxBc2 und V3HxBc2 ΔQR an die Seren anti-V3Ova-HxBc2 und anti V3Ova-
HxBc2 ΔQR.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung der aus der DO11.10-Mausimmunisierung
hervorgegangenen Seren anti-V3Ova-HxBc2 (a) und anti-V3Ova-HxBc2 ΔQR (b) an die Peptide V3HxBc2 und
V3HxBc2 ΔQR (jeweils 50 nM). Die Seren wurden ausverdünnt, beginnend bei 200-fach. Dargestellt ist die
Absorption bei 492 nM. Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
Um herauszufinden, ob die erzeugten Seren in der Lage waren, an gp120 zu binden,
wurde die Bindung der anti-Peptid-Seren anti-V3Ova-HxBc2 und anti-V3Ova-HxBc2
gp120HxBc2 und gp120ADA getestet.
- 82 -
ΔQR
an
Ergebnisse
1,1
gp120 HxBc2 / anti-V3 Ova-HxBc2
gp120 HxBc2 / anti-V3 Ova-HxBc2 ΔQR
gp120 ADA / anti-V3 Ova-HxBc2
gp120 ADA / anti-V3 Ova-HxBc2 ΔQR
A 492
0,7
0,3
-0,1
200
400
800
1600
3200
6400 12800
Abb. 38: Bindung von gp120HxBc2 und gp120ADA an die Seren anti-V3Ova-HxBc2 und anti V3Ova-HxBc2
ΔQR.
Direkter ELISA der Bindung der aus der DO11.10-Mausimmunisierung hervorgegangenen Seren antiV3Ova-HxBc2 und anti-V3Ova-HxBc2 ΔQR an gp120HxBc2 und gp120ADA (jeweils 8 nM). Die Seren wurden
ausverdünnt, beginnend bei 200-fach. Dargestellt ist die Absorption bei 492 nM. Die Messungen
wurden im Duplikat durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass lediglich das Serum anti-V3Ova-HxBc2 in der Lage war,
gp120HxBc2 zu erkennen, wohingegen das Serum anti-V3Ova-HxBc2
ΔQR
keine Bindung
an dieses gp120 zeigte (Abb. 38). Beide Seren waren nicht in der Lage, an gp120ADA
zu binden. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass nicht nur eine QR-Selektivität
der Seren vorliegt, sondern auch eine Abhängigkeit von der Sequenz der V3-Schleife
HxBc2.
Jedoch stellt dieses Immunisierungs- und Testsystem eine gute Grundlage für
die Erforschung weiterer Immunogene dar.
- 83 -
Ergebnisse
3.3. Die Charakterisierung der CXCR4-gp120-Interaktion mittels mimetischer Peptide
Die Interaktion von gp120 mit dem Corezeptor ist bis heute nicht auf molekularer
Basis geklärt. Dies liegt zum Teil daran, dass der Corezeptor als membranständiges
Molekül nur schwer aufgereinigt und in Bindungsanalysen untersucht werden kann.
Zum anderen besteht der virale Spike aus einem großen Multiproteinkomplex,
bestehend aus Trimeren, welche aus gp120 und gp41 aufgebaut werden. Zusammen
mit CXCR4, welches auf der Zelloberfläche Multimere bilden kann, ist diese
Interaktion hochkomplex (Abb. 8). Das 2012 beschriebene Corezeptormimetikum
CX4-M1142 (Abb. 11) wurde auf der Grundlage der Struktur von CXCR4 entwickelt
und stellt eine Möglichkeit dar, dieses komplexe System grundlegend zu
vereinfachen. CX4-M1 ist in der Lage, zwischen X4- und R5-tropen gp120 zu
unterscheiden und die HIV-1-Infektion X4-troper Viren zu inhibieren.
Die Hauptdeterminante des HIV-1-Tropismus liegt in der V3-Schleife88. Deshalb
wurde mit Hilfe von V3-Schleifen-Peptiden untersucht, ob die Interaktion zwischen
CXCR4 und gp120 nicht nur auf Peptid-Protein-Ebene, sondern auch auf PeptidPeptid-Ebene möglich ist, und somit eine deutliche Vereinfachung des komplexen
Systems bereitgestellt werden kann, die es ermöglicht, die molekularen Details
dieser Interaktion in einfachen Bindungstests zu untersuchen.
3.3.1. Synthese und Charakterisierung der fluoresceinylierten V3-Schleifen-Peptide
Die V3-Schleifen-Peptide wurden wie unter 2.6.1. und 2.6.1.3. beschrieben
synthetisiert, oxidiert und mittels HPLC aufgereinigt. Die HPLC-Chromatogramme
und MALDI-TOF-MS-Spektren der gereinigten fluoresceinylierten Peptide V3HxBc2
und V3MN sind in Abb. 39 und 40 exemplarisch dargestellt. Analog zu diesen V3Schleifen-Peptiden wurden verschiedene Deletions- und Substitutions-varianten
synthetisiert. Die Sequenzen der verschiedenen Varianten sind in Tab. 18 aufgeführt,
die dazugehörigen berechneten und mittels MALDI-TOF MS oder ESI-MS
(Deletionsvarianten) bestimmten Massen sind in Tabelle S3 und S4 aufgelistet.
Zusätzlich wurden Varianten des Corezeptormimetikums CX4-M1 synthetisiert,
oxidiert, mittels HPLC aufgereinigt und mittels LC-MS analysiert (Synthese durch
Gerlinde Mühlhuber, Monika Junge und Kalle Möbius). Die Sequenzen der
- 84 -
Ergebnisse
verschiedenen Varianten sind in Tab. 19 aufgeführt, die dazugehörigen berechneten
und mittels ESI-MS bestimmten Massen sind in Tabelle S5 aufgelistet
Abb. 39: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des fluoresceinylierten Peptids
V3HxBc2.
Abb. 40: HPLC-Chromatogramm und MALDI-TOF-MS-Spektrum des fluoresceinylierten Peptids
V3MN.
- 85 -
Ergebnisse
Tab. 18: Sequenzen der V3-Schleifen-Peptide zur Untersuchung der Interaktion mit CX4-M1.
Ursprungssequenz eines V3-Schleifen-Peptids am Beispiel des Stammes HxBc2:
CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHC331
296
Turn
beta
Peptid
Sequenz
X4-trope V3-Schleifen-Peptide
IIIB
Fluoa-Xb-G-X-CTRPNNNTRKKIRIQRGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
HxBc2
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
MN
Fluo-X-G-X-CTRPNYNKRKRIHI--GPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC-NH2
R5-trope V3-Schleifen-Peptide
BAL
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHI--GPGRALYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
ADA
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKSIHI--GPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC-NH2
Verkürzte Varianten des Peptids V3HxBc2
HxBc2 Turn
Fluo-X-G-X-C-------------QRGPGRA---------------C-NH2
HxBc2 Turn /
Fluo-X-G-X-C---------RIRIQRGPGRAFVTI-----------C-NH2
beta
HxBc2 Δbeta
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRK----QRGPGRA----GKI-GNMRQAHC-NH2
Alanin-Substitution innerhalb des Peptids V3HxBc2
R306A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKAIRIQRGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
I307A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRARIQRGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
R308A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIAIQRGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
I309A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRAQRGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
Q310A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIARGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
R311A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQAGPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
G312A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRAPGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
P313A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGAGRAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
G314A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPARAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
R315A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGAAFVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
F317A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAAVTIGKI-GNMRQAHC-NH2
V318A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFATIGKI-GNMRQAHC-NH2
T319A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVAIGKI-GNMRQAHC-NH2
I320A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTAGKI-GNMRQAHC-NH2
G321A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIAKI-GNMRQAHC-NH2
K322A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGAI-GNMRQAHC-NH2
I323A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKA-GNMRQAHC-NH2
G324A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKI-ANMRQAHC-NH2
N325A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKI-GAMRQAHC-NH2
M326A
Fluo-X-G-X-CTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKI-GNARQAHC-NH2
a
Fluo, Fluorescein (Markierung); bX, ε−Aminohexansäure (Abstandshalter); fett markierte Aminosäuren beschreiben eingeführte Mutationen.
- 86 -
Ergebnisse
Tab. 19: Sequenzen der CX4-M1-Varianten zur Untersuchung der Interaktion mit V3-SchleifenPeptiden.
Ursprungssequenz des Corezetormimetikums CX4-M1:
97
DAVANWYFGNFLCK110
ECL1
182
DRYICDRFYPNDLWV196
262
DSFILLEIIKQGSEFENTVHK282
ECL2
ECL3
Peptid
Sequenz
Corezeptormimetikum
CX4-M1*
Aca-ECL1-Xb-Bc-X-ECL2-X-B-X-ECL3-X-K(Biod)-NH2
Alanin-Substitution im ECL2 von CX4-M1
D182A**
Ac-ECL1-X-B-X-ARYICDRFYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
R183A**
Ac-ECL1-X-B-X-DAYICDRFYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
Y184A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRAICDRFYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
I185A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYACDRFYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
D187A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICARFYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
R188A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDAFYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
F189A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRAYPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
Y190A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFAPNDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
P191A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFYANDLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
N192A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFYPADLWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
D193A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFYPNALWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
L194A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFYPNDAWV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
W195A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFYPNDLAV-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
V196A**
Ac-ECL1-X-B-X-DRYICDRFYPNDLWA-X-B-X-ECL3-X-K(Bio)-NH2
a
b
Ac, Acetyl; X ε−Aminohexansäure (Abstandshalter) ; cB, β-Alanin (Abstandshalter); dBio, Biotin
(Markierung); fett markierte Amino-säuren beschreiben eingeführte Mutationen. * Synthese durch
Gerlinde Mühlhuber und Dr. Kalle Möbius. ** Synthese durch Monika Junge.
3.3.2. Die Interaktion der V3-Schleifen-Peptide mit CX4-M1
Um herauszufinden, ob CX4-M1 in der Lage ist, an V3-Schleifen-Peptide zu binden,
wurde die Bindung beider Peptide aneinander untersucht. Es stellte sich heraus,
dass CX4-M1 nicht nur in der Lage war, an die Peptide V3IIIB und V3HxBc2 zu binden,
sondern auch zwischen X4- (V3IIIB, V3HxBc2) und R5-tropen (V3BAL, V3ADA) V3Schleifen-Peptiden zu unterscheiden (Abb. 41). Für die folgenden Bindungstests
wurde eine V3-Schleifen-Peptid-Konzentration von 250 nM gewählt, da bei dieser
Konzentration eine deutliche Bindung der X4-tropen V3-Schleifen-Peptide gemessen
werden konnte. Für die Analyse der Alanin-substituierten V3-Schleifen-Varianten
wurde eine Konzentration von 100 nM gewählt, um sowohl Bindungsverbesserungen
als auch –verschlechterungen nachweisen zu können.
- 87 -
Ergebnisse
2
500 nM
250 nM
A492
125 nM
1
63 nM
31 nM
16 nM
8 nM
0
IIIB
HxBc2
BAL
ADA
Abb. 41: Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA an CX4-M1.
a) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von CX4-M1 (0,5 µM) an die Peptide V3IIIB,
V3HxBc2, V3BAL und V3ADA (500 nM bis 8 nM ausverdünnt). Dargestellt ist die Absorption bei 492 nM.
Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
a)
b)
V3-Schleifen-Peptid
2
gp120
3
A 492
A 492
2
1
1
0
0
IIIB
HxBc2
MN
BAL
ADA
IIIB
HxBc2
MN
BAL
ADA
Abb. 42: Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3MN, V3BAL und V3ADA sowie gp120 der passenden
Stämme an CX4-M1.
a) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von CX4-M1 (0,5 µM) an die Peptide V3IIIB,
V3HxBc2, V3MN, V3BAL und V3ADA (250 nM)(a) sowie der passenden gp120-Stämme, welche durch sCD4
„geöffnet“ wurden (8nM) (modifiziert aus142) (b). Dargestellt ist die Absorption bei 492 nM. Gezeigt sind
Messungen eines Duplikats.
- 88 -
Ergebnisse
Dass CX4-M1 in der Lage ist, zwischen gp120 verschiedenen Tropismus zu
unterscheiden, war bereits bekannt142. Um die Vergleichbarkeit der Bindung von
CX4-M1 an gp120 und V3-Schleifen-Peptide genauer zu evaluieren, wurde die
direkte Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3MN, V3BAL und V3ADA an CX4-M1
bestimmt und mit der direkten Bindung der passenden gp120 verglichen.
Lediglich für die X4-tropen Peptide V3IIIB, V3HxBc2 und V3MN konnte eine direkte
Bindung an CX4-M1 nachgewiesen werden (Abb. 42a). Die R5-tropen Peptide V3BAL
und V3ADA binden deutlich schlechter an CX4-M1. Verglichen mit der direkten
Bindung an gp120 der gleichen Stämme (Abb. 42b) war ein ähnliches
Bindungsmuster erkennbar. Somit ist die Tropismusselektivität von CX4-M1 für X4trope HIV-1-Stämme sowohl auf gp120- als auch auf V3-Schleifen-Peptid-Ebene
nachweisbar.
Die Tropismusselektiviät konnte zusätzlich mittels SPR-Spektroskopie der Bindung
von CX4-M1 an gp120IIIB, gp120HxBc2, gp120MN, gp120BAL und gp120ADA sowie die
entsprechenden V3-Schleifen-Peptide nachgewiesen werden (Tab. 20). Die Stämme
BAL
und
ADA,
sowohl auf gp120- als auch auf V3-Schleifen-Peptid-Ebene, zeigten
keine Bindung an CX4-M1. Im Gegensatz dazu war eine deutliche Bindung von CX4M1 sowohl an gp120 als auch V3-Schleifen-Peptide der Stämme
IIIB, HxBc2
und
MN
messbar. Die für diese Interaktion bestimmten Gleichgewichtskonstanten (Tab. 21)
der Interaktion von CX4-M1 mit X4-tropen gp120 waren nicht nur untereinander,
sondern auch mit den Gleichgewichtskonstanten der Bindung von CX4-M1 an V3Schleifen-Peptide vergleichbar und lagen im niedrigen bis sub-micromolaren Bereich.
Da die SPR-Spektroskopie für die verschiedenen gp120 ohne CD4 durchgeführt
wurden,
diese
Interaktion
jedoch
zur
kompletten
Freisetzung
der
Corezeptorbindungsstelle führt, könnte die Affinität für gp120 durch Zugabe von
CD4, analog den Ergebnissen im direkten ELISA (Abb. 43), noch weiter gesteigert
werden, was jedoch aus technischen Gründen im gewählten Versuchsaufbau nicht
gezeigt werden konnte. Demzufolge wurde nicht nur die Tropismusselektivität von
CX4-M1 bestätigt, sondern zusätzlich gezeigt, dass V3-Schleifen-Peptide gute
Mimetika der Corezeptor-Bindungsstelle von gp120 darstellen.
- 89 -
Ergebnisse
Tab. 20: SPR-Sensogramme der Bindung von Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3MN, V3BAL und V3ADA
(links) sowie der entsprechenden gp120 (rechts) an CX4-M1.
Die Messergebnisse sind nach dem jeweiligen Rezeptor-Tropismus geordnet. Dargestellt ist das
Signal (RU) in Abhängigkeit von der Zeit (s), wobei die Assoziation von 0 s bis 120 s und die
Dissoziation von 121 s bis 700s dargestellt ist. Gemessen wurde bei einer Konzentration von 5000 nM
– 312 nM (V3-Schleifen-Peptide) oder 8 nM – 0,5 nM (gp120). Die Messungen bei einer Konzentration
von 2500 nM (V3-Schleifen-Peptide) oder 4 nM (gp120) wurden im Duplikat durchgeführt.
Stamm
V3-Schleifen-Peptid
gp120
X4-trop
IIIB
HxBc2
MN
R5-trop
BAL
ADA
- 90 -
Ergebnisse
Tab. 21: Gleichgewichtskonstanten (KD) der Bindung der Peptide V3IIIB, V3HxBc2, V3MN, V3BAL und
V3ADA (links) sowie gp120 der entsprechenden Stämme an CX4-M1, gefittet nach dem 2-statereaction-Modell.
Stamm
V3-Schleifen-Peptid
Gp120
IIIB
1,050*10-6 M
1,060*10-7 M
HxBc2
3,397*10-7 M
2,301*10-7 M
MN
1,559*10-6 M
6,897*10-7 M
BAL
nicht berechnet
nicht berechnet
ADA
nicht berechnet
nicht berechnet
3.3.3. Die Rolle der Interaktion von gp120 sowie V3-Schleifen-Peptiden mit sCD4 für
die Bindung an CX4-M1
Während des HIV-1-Eintrittsprozesses in die Zelle ist die Interaktion des Corezeptors
mit gp120 des Virus abhängig von einer vorhergehenden Interaktion des gp120 mit
dem Rezeptor CD4, welcher gp120 „öffnet“ und dadurch dazu befähigt, die
Corezeptorbindungsstelle zu exponieren. Zu dieser gehört auch die V3-Schleife13.
a)
b)
1,2
0,5
0,4
A 492
A 492
0,8
0,4
0,3
0,2
0,1
0
V3HxBc2
- sCD4
0
V3HxBc2
+ sCD4
gp120HxBc2
- sCD4
gp120HxBc2
+ sCD4
Abb. 43: Einfluss von sCD4 auf die Bindung von gp120HxBc2 und V3HxBc2 an CX4-M1.
a,b) Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung des Peptids V3HxBc2 (100 nM) (a) und
gp120HxBc2 (8 nM) (b) an CX4-M1 in Abhängigkeit der Zugabe von löslichem CD4. Dargestellt ist die
Absorption bei 492 nM. Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
- 91 -
Ergebnisse
Dieser Effekt führt dazu, dass durch sCD4 „geöffnetes“ gp120 wesentlich besser an
CX4-M1 bindet als gp120 allein142. Die V3-Schleifen-Peptide hingegen besitzen
keine versteckte Bindungsstelle, welche durch sCD4 exponiert werden könnte.
Demzufolge sollte sCD4 keinen Einfluss auf die Bindung dieser Peptide an CX4-M1
besitzen. Um dies zu überprüfen, wurde die Bindung des Peptids V3HxBc2 sowie des
entsprechenden gp120 an CX4-M1 in Ab- und Anwesenheit von sCD4 untersucht. Es
konnte gezeigt werden, dass keine Verstärkung der CX4-M1-V3-Schleifen-PeptidInteraktion durch sCD4 induziert werden konnte, wohingegen die gp120-Bindung wie
erwartet deutlich gesteigert wurde (Abb. 43). Demzufolge stellen die V3-SchleifenPeptide gute Mimetika der „geöffneten“ Corezeptorbindungsstelle dar.
3.3.4. Die Spezifität der Interaktion von CX4-M1 mit gp120 und V3-SchleifenPeptiden
Um die Anwendbarkeit der V3-Schleifen-Peptide als Corezeptormimetika weiter zu
evaluieren, wurde die Kompetition von CX4-M1 mit anti-V3-Schleifen-Antikörpern um
Bindung an gp120 oder V3-Schleifen-Peptide untersucht. Die Kompetition macht sich
hierbei in einer Inhibition der Bindung des gp120 oder V3-Schleifen-Peptids an CX4M1 bemerkbar. Der in diesem Versuch verwendete Stamm
HxBc2
besitzt in seiner V3-
Schleifen-Sequenz die seltene QR-Insertion und wird deshalb von einer Vielzahl von
anti-V3-Schleifen-Antikörpern nicht erkannt (siehe 3.2). Zu diesen Antikörpern zählt
mAb 3869. Jedoch ist der Antikörper 447-52D in der Lage, trotz Präferenz für V3Schleifen-Peptide ohne QR-Insertion, das Peptid V3HxBc2 zu erkennen. Es wurde
ersichtlich, dass 447-52D in der Lage war, mit ähnlichen IC50-Werten mit CX4-M1 um
Bindung sowohl an gp120HxBc2 (IC50: 4,2 nM) als auch an Peptid V3HxBc2 (IC50: 3,2
nM) zu kompetieren, wohingegen 3869 keine Kompetition sowohl um Bindung an
gp120HxBc2 als auch an Peptid V3HxBc2 zeigte (Abb. 44). Dieses Ergebnis bestätigt die
Spezifität der Bindung von CX4-M1 sowohl an gp120 als auch an V3-SchleifenPeptide und demzufolge die Funktionalität beider Mimetika. Deshalb sollte im
Folgenden eine Charakterisierung der Bindungsstelle, sowohl auf der V3-Schleife für
CX4-M1 als auch auf CX4-M1 für die V3-Schleife und gp120, erfolgen.
- 92 -
Ergebnisse
a)
b)
100
80
80
60
Inhibition (%)
100
Inhibition (%)
120
60
40
20
40
20
0
0
-20
-20
-40
-40
0,1
1
10
100
0,1
1000
1
10
100
1000
[Antikörper] (nM)
[Antikörper] (nM)
gp120 HxBc2 + sCD4 + 447-52D
gp120 HxBc2 + sCD4 + 3869
V3 HxBc2 + 447-52D
V3 HxBc2 + 3869
Abb. 44: Kompetition von 447-52D und 3869 mit CX4-M1 um Bindung an gp120HxBc2 und Peptid
V3HxBc2.
Kompetitiver Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von Peptid V3HxBc2 (50 nM) (a) oder gp120HxBc2
+ sCD4 (jeweils 12,5 nM) (b) an CX4-M1. Als Kompetitoren wurden die anti-V3-Schleifen-Antikörper
447-52D und 3869 eingesetzt. Dargestellt ist die Inhibition der Bindung von gp120 beziehungsweise
V3-Schleifen-Peptide an CX4-M1 durch den entsprechenden Antikörper. Die Messungen wurden im
Duplikat durchgeführt.
3.3.5. Die Charakterisierung der CX4-M1-Bindungsstelle auf dem V3-SchleifenPeptidHxBc2
V3-Schleifen-Peptide besitzen in Abwesenheit eines Bindungspartners keine
Sekundärstruktur34,64,87.
strukturanalyse
Jedoch
nachgewiesen,
(Aminosäuren 306 bis 320,
Bindung
an
wurde
dass
durch
der
HxBc2-Nomenklatur)
anti-V3-Schleifen-Antikörper
NMR
zentrale
und
Bereich
Röntgenkristallder
V3-Schleife
eine definierte Sekundärstruktur nach
ausbildet73,75,77,78,80-84,86.
In
diesen
Strukturen wurde ein kleines zweisträngiges β-Faltblatt, gebildet durch die
Aminosäurereste 306 bis 309 sowie 317 bis 320, nachgewiesen, wobei beide
Stränge über die V3-Schleifen-Spitze (Aminosäuren 310 bis 316) verbunden sind.
Um die Beteiligung der einzelnen V3-Schleifen-Bereiche an der Bindung an CX4-M1
zu untersuchen, wurden verkürzte Varianten des Peptids V3HxBc2 synthetisiert,
welche den Turn (V3HxBc2 Turn) sowie den Turn und den Faltblattbereich (V3HxBc2 Turn /
beta)
präsentierten, oder eine Deletion im Faltblattbereich besaßen (V3HxBc2 Δbeta) (Tab.
18). Analog zum Volllängenpeptid wurden die Peptide V3HxBc2 Turn und V3HxBc2 Turn / beta
an ihren N- und C-Termini über eine Disulfidbrücke stabilisiert.
- 93 -
Ergebnisse
0,8
0,6
A 492
0,4
0,2
0
-0,2
HxBc2
HxBc2 Turn
HxBc2 Turn /
beta
HxBc2 Δbeta
Abb. 45: Bindung der verkürzten, von V3HxBc2 abgeleiteten Peptide an CX4-M1.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von V3HxBc2 und seinen verkürzten Varianten (je
100 nM) an CX4-M1 (0,5 µM). Dargestellt ist die gemessene Absorption bei 492 nm. Die Messung
wurde in Sechsfachbestimmung durchgeführt.
Es konnte nachgewiesen werden, dass nur das verkürzte Peptid V3HxBc2
Turn / beta
einen Teil der Affinität des Peptids V3HxBc2 beibehielt, während die Peptide V3HxBc2
Turn
und V3HxBc2 Δbeta nicht mehr in der Lage waren, an CX4-M1 zu binden (Abb. 45).
Dies weist auf eine starke Beteiligung des beta-Bereichs an der Bindung der V3Schleife an CX4-M1 hin.
Die Wichtigkeit des beta-Bereichs konnte zusätzlich durch Bindungsanalysen von
Alanin-Substitutions-Varianten des Peptids V3HxBc2 im Aminosäurebereich 306 bis
326 bestätigt werden. Die in X4- und R5-tropen HIV-1-Isolaten konservierten
Aminosäuren des N- und C-Terminus68 (Aminosäurebereich 296 bis 305 und 327 bis
331) wurden nicht durch Alanin ersetzt (Tab. 18). Auch für die AlaninSubstitutionsvarianten konnte gezeigt werden, dass der beta-Bereich stark an der
Bindung des Peptids V3HxBc2 an CX4-M1 beteiligt ist, da der Austausch der
Aminosäuren I307, R308, I309, F317, V318 und I320 durch Alanin eine deutliche
Abschwächung der Interaktion mit CX4-M1 zeigte (Abb. 46). Dieses Ergbenis weist
darauf hin, dass das β-Faltblatt, welches in V3-Schleifen-Peptid / anti-V3-SchleifenAntikörper-Komplexen nachweisbar ist, auch bei der Interaktion mit CX4-M1
ausgebildet werden könnte.
- 94 -
Ergebnisse
3
Ar
2
1
HxBc2
M326A
N325A
G324A
I323A
K322A
G321A
I320A
T319A
V318A
F317A
R315A
G314A
P313A
G312A
R311A
Q310A
I309A
R308A
I307A
R306A
0
Abb. 46: Bindung vom Peptid V3HxBc2, sowie dessen alaninsubstituierte Varianten, an CX4-M1.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung des Peptids V3HxBc2 und dessen alaninsubstituierter
Varianten (100 nM) an CX4-M1 (0,5 µM). Dargestellt ist die relative Absorption (Ar) bei 492 nm,
bezogen auf das Peptid V3HxBc2 (= 1). Die Messung wurde im Duplikat durchgeführt.
Für den Austausch der Aminosäuren R315 und I323 durch Alanin konnte ebenfalls
ein bindungsabschwächender Effekt nachgewiesen werden. Da I323 nicht im Peptid
V3HxBc2 Spitze / beta enthalten war, könnte dies ein möglicher Grund sein, warum dieses
Peptid eine schwächere Bindung an CX4-M1 zeigte. Des Weiteren führten zwei
Alanin-Substitutionen (R311A, K322A) zu einer Verbesserung der Bindung an CX4M1. Da die substituierten Aminosäuren relativ große Seitenketten besitzen und somit
sterische Hinderungen verursachen könnten, wäre eine Substitution durch Alanin in
diesem Fall bindungsfördernd.
3.3.6. Die Charakterisierung der V3-Schleifen-Bindungsstelle in der ECL2 von CX4M1
Die ECL2 von CXCR4 spielt eine wichtige Rolle für die Interaktion von gp120 mit
diesem Corezeptor62. Deshalb wurden Alanin-substituierte Varianten der ECL2 in
CX4-M1 synthetisiert (Tab. 19) und der Beitrag der einzelnen Aminosäuren auf die
Bindung an das Peptid V3HxBc2 getestet.
- 95 -
Ergebnisse
a)
3
Ar
2
1
D193A
L194A
W195A
V196A
CX4-M1
D193A
L194A
W195A
V196A
CX4-M1
F189A
F189A
N192A
R188A
R188A
N192A
D187A
D187A
P191A
I185A
I185A
P191A
Y184A
Y184A
Y190A
R183A
R183A
Y190A
D182A
b)
D182A
0
Ar
2
1
0
Abb. 47: Bindung von gp120HxBc2 sowie vom Peptid V3HxBc2 an CX4-M1 und Alanin-substituierte
Varianten.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung von gp120HxBc2 in Anwesenheit von sCD4 (jeweils 8
nM) (a) sowie vom Peptid V3HxBc2 ( 100 nM) (b) an CX4-M1 und dessen Alanin-substituierte Varianten
(2,5 µM für gp120, 0,5 µM für V3-Schleifen-Peptide). Dargestellt ist die relative Absorption (Ar) bei 492
nm, bezogen auf CX4-M1 (= 1). Die Messungen wurden im Triplikat durchgeführt.
- 96 -
Ergebnisse
Es konnte gezeigt werden, dass die Alanin-Substitution der positiv geladenen
Aminosäuren R183 und R188, sowie der Aminosäuren I185, F189, P191 und N192
in CX4-M1 zu einer Verstärkung der Bindung an gp120HxBc2 führten (Abb. 47a). Im
Gegensatz
dazu
führte
die
Alanin-Substitutionen
der
negativ
geladenen
Aminosäuren D182, D187 und D193, sowie der Aminosäuren L194 und W195, zu
einer Bindungsabschwächung, was auf deren Wichtigkeit für die Bindung von CX4M1 an gp120 hinweist (Abb. 47a). Bei der Bindung an das Peptid V3HxBc2 führte die
Substitution der negativ geladenen Aminosäuren D182, D187 und D193 zu einer
deutlichen Bindungsabschwächung (Abb. 47b). Daraus kann geschlussfolgert
werden, dass die Abnahme der negativen Nettoladung in der ECL2 von CX4-M1
einen Verlust der Affinität für diese X4-trope V3-Schleife, sowohl auf Peptid- als auch
auf gp120-Ebene, verursacht. Andererseits führte die Substitution sowohl der Reste
R183, I185, R188, F189, P191 und N192, als auch Y184, Y190, L194 und V196 zu
einer Verstärkung der Bindung an das Peptid V3HxBc2. Die Alanin-Substitution der
Aminosäuren Y184, Y190 und L194 hatte sogar einen gegenteiligen Effekt auf die
Bindung dieser Varianten an gp120HxBc2 (Bindungsabschwächung), verglichen mit der
Bindung an das Peptid V3HxBc2 (Verstärkung der Bindung). Demzufolge konnte ein
ähnliches Bindungsmuster für die Interaktion der Alanin-substituierten CX4-M1Varianten mit dem Peptid V3HxBc2 und gp120HxBc2 beobachtet werden. Zusätzlich
konnte sowohl mittels Peptid-Protein- als auch Peptid-Peptid-Interaktion gezeigt
werden, dass negativ geladene Aminosäuren in der ECL2 des CXCR4-Corezeptors
wichtig für die Interaktion mit V3-Schleifen aus X4-tropen HIV-1 sind.
3.3.7. Der Einfluss des Peptids V3HxBc2 auf die HIV-1-Infektionsinhibition durch CX4M1
Aus vorhergehenden Untersuchungen ist bekannt, dass CX4-M1 nicht nur selektiv an
gp120 aus X4-tropen HIV-1 binden kann, sondern auch selektiv die Infektion mit X4tropen HIV-1-Stämmen inhibiert142. Es wurde postuliert, dass diese Inhibition durch
Interaktion von CX4-M1 mit dem viralen gp120 zustande kommt, wodurch die
Interaktion dieses viralen gp120 mit CXCR4 auf der Wirtszelle verhindert und in
Konsequenz die HIV-1 Infektion inhibiert wird. Um diese These zu bestätigen, wurde
- 97 -
Ergebnisse
getestet, ob das Peptid V3HxBc2 in der Lage ist, mit der durch CX4-M1 verursachten
Infektionsinhibition zu interferieren (Abb. 48).
CX4-M1 (10 µM)
120
Infektion (%)
100
80
60
40
20
0
nur
HIV-1
90,0
30,0
10,0
3,0
1,0
0,3
0,1
0,0
[V3HxBc2] (µM)
Abb. 48: Neutralisation von CEMx174 SEAP-Reporterzellen durch CX4-M1 und
Wiedererlangung der Infektiosität durch Kompetition mit V3-Schleifen-Peptiden.
Infektion von CEMx174 SEAP-Reporterzellen in An- und Abwesenheit von CX4-M1 und dem Peptid
V3HxBc2. Für die Infektionsinhibition wurde CX4-M1 (10 µM) verwendet. Als Kompetitor wurde das
Peptid V3HxBc2 verwendet. Schwarz: ohne Peptide, Grau: mit CX4-M1 und V3HxBc2, Weiß: mit CX4-M1.
Die SEAP-Aktivität wurde normalisiert im Bezug auf nur HIV-1 (= 100%). Dargestellt ist eine
Dreifachbestimmung im Triplikat mit Standardirrtum. Der Versuch wurde von Norbert Donhauser,
Virologisches Institut, FAU Erlangen/Nürnberg, durchgeführt.
CX4-M1 war bei einer Konzentration von 10 µM in der Lage, die Infektion von
CEMx174 SEAP-Reporterzellen mit dem X4-tropen HIV-1NL4.3 fast vollständig zu
inhibieren (Abb. 48, weißer Balken). Dieser Inhibition konnte konzentrationsabhängig
durch das Peptid V3HxBc2 entgegengewirkt werden. Dies kommt wahrscheinlich durch
die Bindung des V3-Schleifen-Peptids an CX4-M1 zustande, welches dann nicht
mehr in der Lage ist, mit gp120 auf HIV-1 zu interagieren, was zur Widererlangung
der Infektivität führt. Somit konnte die funktionelle Imitation der gp120-CXCR4Interaktion
nicht
nur
in
Bindungsexperimenten,
Infektionsexperimenten bestätigt werden.
- 98 -
sondern
auch
in
Diskussion
4. Diskussion
4.1. Die molekulare Basis der Wirkungsweise von CD4bs-M
CD4bs-M ist in der Lage, die Infektion von Zellen mit HIV-1 zu verstärken. Dieser
Effekt war unerwartet. Eigentlich war eine Inhibition der Infektion erwartet worden, da
aus kompetitiven ELISAs eindeutig eine Konkurrenz zwischen CD4bs-M und gp120
für die Bindung an CD4 zu beobachten war. Die direkte Bindung von CD4bs-M an
gp120 brachte zum Vorschein, dass im kompetitiven ELISA nicht nur CD4bs-M und
gp120 um die Bindung an CD4, sondern auch CD4bs-M und CD4 um die Bindung an
gp120 kompetierten. Der Infektions-verstärkende Effekt von CD4bs-M lässt mehrere
Interpretationsmöglichkeiten zu.
Die erste Interpretationsmöglichkeit wäre eine Infektionsverstärkung, vermittelt durch
Aggregation, welche das Virus und die Zielzelle in räumliche Nähe bringen könnte.
Dieser Effekt wurde 2013 für das gp120-mimetische Peptid EF-C beschrieben150
(Tab. 2), welches eine überlappende Sequenz mit CD4bs-M aufweist. Während das
Peptid EF-C die Infektion CD4-positiver Zellen mit HIV-1 verstärkte, konnte dieser
Effekt für EF-H (Tab. 2) nicht beobachtet werden. Die Sequenz von EF-H ist der des
in der vorliegenden Arbeit beschriebenen β20/β21-Fragments ähnlicher. Da der
Effekt von EF-C durch die Autoren auf die durch Aggregation (positiver Thioflavin-TTest169) verursachte Ausbildung von Nanofibrillen zurückgeführt wird, die eine
Adhäsion der Viren an die Zielzellen verursachen, kann dieser Effekt für das
β20/β21-Fragment nicht ausgeschlossen werden. Jedoch erklärt die Ausbildung von
Nanofibrillen nicht die Infektion CD4-negativer HeLa-Zellen und die fehlende
Infektionsverstärkung durch HSV-1. Zusätzlich besitzt das beschriebene HIV-1infektionsverstärkende Peptid EF-C eine positive Nettoladung150,151, wohingegen das
hier beschriebene β20/β21-Fragment ungeladen ist.
Eine
andere
Interpretationsmöglichkeit
des
Infektionsverstärkungseffektes,
verursacht durch das β20/β21-Fragment, könnte eine spezifische Interaktion dieses
Fragmentes mit dem β2/β3-Fragment sein, woraufhin sich das Bridging sheet
ausbilden könnte und somit eine Interaktion des Virus mit dem Corezeptor auf der
Zielzelle ermöglicht werden würde (Abb. 49). CD4bs-M ohne Interaktionspartner
besitzt keine definierte Struktur (gemessen über Zirkulardikroismus durch Stefan
- 99 -
Diskussion
Klingel,
Lehrstuhl
für
Biotechnologie,
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen/Nürnberg, Daten nicht gezeigt). Zur Interaktion nach diesem Modell wäre
jedoch die Ausbildung einer ausgestreckten Struktur erforderlich. Dass Peptide erst
nach Bindung an den Interaktionspartner eine definierte Struktur ausbilden, konnte
2011 gezeigt werden170. Die helikale Struktur des beschriebenen S-Peptids konnte
erst nach Bindung an die Ribonuklease A nachgewiesen werden.
Abb. 49: Modell der möglichen Interaktion von CD4bs-M mit gp120.
Nach Bindung des β20/β21-Fragments kommt es zur Ausbildung des Bridging sheets. Die Grafik
wurde mittel RCSB Protein-Workshop erstellt. Grün: β20/β21-Fragment. Pdb: 1GC1 und 2BF1.
Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass das
β20/β21-Fragment eine ausgestreckte Konformation annehmen muss, um mit gp120
oder
dem
viralen
Spike
interagieren
zu
können.
Diese
ausgestreckten
Konformationen kommen hauptsächlich in β-Faltblattstrukturen vor. Durch seine
Aminosäuresequenz
besitzt
Faltblattstrukturen einzugehen
das
171
β20/β21-Fragment
die
Tendenz,
β-
. Faltblattstrukturen spielen aber auch bei der
Aggregation eine entscheidende Rolle172. Amyloide Fibrillen bilden zum Beispiel
solche Faltblattstrukturen und stellen somit geordnete Aggregate dar, während
Einschlusskörper bei der Überexpression von Proteinen meist ungeordnete
Aggregate bilden173. Auch das Bridging sheet von gp120 stellt ein viersträngiges
Faltblatt dar30, wobei das β20/β21-Fragment von CD4bs-M die Sequenz von zwei der
vier
Stränge
dieses
Faltblattes
besitzt
und
somit
zusätzlich
zum
CD4-
Bindungsstellenmimetikum auch ein Bridging-sheet-Mimetikum darstellt. Andere
Mimetika des Bridging sheets, wie zum Beispiel BS1PEP und BS2PEP sowie BS3
und BS4, besitzen wahrscheinlich ein hohes Aggregationspotential, da für diese
Mimetika eine schlechte Löslichkeit in wässrigen Puffern beschrieben wurde138,139.
Dies weist auf ein generelles Aggregationspotential von Bridging-sheet-Mimetika hin.
Somit könnten sowohl die Aggregation als auch die spezifische Interaktion von
- 100 -
Diskussion
CD4bs-M mit gp120 eine Schlüsselrolle sowohl bei der direkten Bindung als auch bei
der Infektionsverstärkung spielen.
Dass CD4bs-M sowohl mit CD4 als auch mit gp120 interagiert, könnte ebenfalls
verschiedene Gründe haben. Zum einen ist CD4bs-M ein Mimetikum der CD4Bindungsstelle auf gp120 und mit dem Ziel synthetisiert worden, an CD4 zu binden.
Die interagierenden Aminosäuren, die essentiell für die Bindung von CD4 an gp120
sind, werden in CD4bs-M präsentiert30,131. Zusätzlich wäre auch hier eine Interaktion
auf der Grundlage der Aggregation möglich. CD4 besteht aus 4 Domänen, die
hauptsächlich aus Faltblattstrukturen bestehen43,174. Durch Interaktion des β20/β21Fragmentes von CD4bs-M mit diesen Faltblattstrukturen könnte im ELISA ein
positives Signal erzeugt werden.
Allein die Aggregation reicht jedoch nicht aus, um die Interaktion von CD4bs-M mit
gp120 zu erklären. Für diese Interaktion ist zusätzlich die Präsenz der CD4Bindungsschleife erforderlich. Für die Infektionsverstärkung reicht jedoch das
β20/β21-Fragment
aus.
Präsentation
gp120
des
Dieses
im
Verhalten
könnte
auf
die
monomeren
Protein
und
im
unterschiedliche
trimeren
Spike
zurückzuführen sein. Dass gp120 im Spike eine andere Konformation annimmt als in
löslichem gp120 konnte am Beispiel des breit neutralisierenden Antikörpers VRC01
gezeigt
werden93.
Dieser
CD4-Bindungsstellenantikörper
zeigte
ein
entgegengesetztes Verhalten bei Bindung an monomeres gp120 und den trimeren
Spike. Während die Bindung von VRC01 an monomeres gp120 zu einer Verstärkung
der Bindung an den CD4i-Antikörper 17b führte und somit suggeriert, dass die
Corezeptorbindungstelle durch VRC01 freigelegt wird, führte die Zugabe von VRC01
zu infektiösen HIV-1 nicht zu einer Verstärkung der Neutralisation durch 17b93. Die
Freilegung der Corezeptorbindungsstelle auf monomerem gp120 konnte auch durch
eine Verstärkung der Bindung an das Corezeptomimetikum CX4-M1 nachgewiesen
werden143. VRC01 agiert auf Bindungsebene demnach ähnlich wie CD4, welches
ebenfalls die Corezeptor-Bindungsstelle freilegt. Jedoch löst CD4 noch weitere
Konformationsänderungen
aus,
unter
anderem
die
Zugänglichkeit
des
Bindungsepitops des Antikörpers 2F5 auf gp41 sowie Induktion des Zerfalls des
Spikes, wenn keine effektive Corezeptorbindung erfolgt109. Diese Effekte konnten für
VRC01 nicht beobachtet werden109, was wiederum konformationelle Unterschiede
zwischen monomerem gp120 und dem trimeren Spike verdeutlicht. Somit ist ein
- 101 -
Diskussion
unterschiedliches Bindungs- und Infektionsverhalten von CD4bs-M durchaus
vorstellbar.
Ein ebenfalls entgegengesetztes Bindungs- und Infektions-inhibitorisches Verhalten
zeigen die breit neutralisierenden Antikörper PG9 und PG16, welche gegen die
V1/V2- und V3-Schleife sowie gegen Glykane gerichtet sind95. Trotz hoher
Neutralisationspotenz konnte keine Bindung an monomeres gp120 nachgewiesen
werden, was auf ein Trimer-spezifisches Epitop hinweist95.
Die Induktion der Infektion CD4-negativer HeLa-Zellen weist auf eine spezifische
Interaktion zwischen CD4bs-M und dem viralen Spike als hin, da ein einfacher
Klebeeffekt zwischen Virus und Zielzelle, der durch Aggregation vermittelt werden
würde, nicht zur produktiven Infektion Rezeptor-negativer Zellen führen würde. Die
Infektionsinduktion spricht eher für eine konformationelle Umlagerung oder
Anlagerung von CD4bs-M an das β2/β3-Fragment von gp120, gefolgt von der
Ausbildung des Bridging sheets (Abb. 49). Somit könnte CD4bs-M einen ähnlichen
Effekt auf die Infektion haben wie die Bindung von CD4 an gp120, die zur „Öffnung“
des Spikes und zur Präsentation der Corezeptor-Bindungsstelle führt. Für die
Beeinflussung
der
Infektion
von
CEMx174
SEAP-Zellen
konnte
ein
entgegengesetzter Effekt von sCD4 und CD4bs-M beobachtet werden (Abb. 13).
Während CD4bs-M die Infektion verstärkte, konnte die Infektion mittels sCD4
komplett inhibiert werden. Dies könnte dadurch zu erklären sein, dass die
Konformationsänderungen, die durch CD4bs-M ausgelöst werden, sich lediglich auf
gp120 auswirken, während die durch sCD4 verursachten Konformationsänderungen
sowohl
Auswirkungen
auf
gp120
als
auch
auf
gp41
besitzen175.
Die
Konformationsänderungen in gp41 führen zu einem kurzlebigen aktivierten Zustand
des Spikes, gefolgt von Inaktivierung und Inhibition der Fusion der viralen mit der
Zielzellmembran175. Dabei spielt die Konzentration von sCD4 eine Schlüsselrolle und
kann zu gegensätzlichen Effekten führen. Wird sCD4 in hoher Konzentration
eingesetzt, so neutralisiert es die meisten HIV-1-Stämme176, wobei wahrscheinlich
die Dissoziation des gp120 aus dem Spike eine Schlüsselrolle spielt177,178. Niedrigere
sCD4-Konzentrationen führen hingegen zu moderater Infektionsverstärkung179. Die
gegensätzlichen Effekte von sCD4 und CD4bs-M könnten somit auch in einer zu
hohen Konzentration an sCD4 (15 µg/mL) begründet sein. Zusätzlich konnte ein
Infektions-induzierender Effekt durch sCD4 in CD4-negativen Zellen beobachtet
werden180-182.
- 102 -
Diskussion
Ein weiteres Indiz für eine Freilegung der Corezeptorbindungsstelle auf gp120 durch
CD4bs-M ist, dass die Infektion von CEMx174 SEAP-Zellen durch ein R5-tropes HIV1NL4.3
005pf135
nicht induziert wird. Dieses künstllich erzeugte Virus wurde durch
Substitution der X4-tropen V3-Schleife gegen eine R5-trope V3-Schleife erhalten183.
CCR5 wird auf CEMx174 SEAP-Zellen nicht exprimiert, sodass eine Freilegung der
Corezeptorbindungsstelle durch CD4bs-M auf dem Spike dieses Virus keinen
Einfluss auf die Infektion besitzt. Dies weist darauf hin, dass CD4bs-M spezifisch auf
die Fusion von HIV-1 mit der Zielzelle wirkt.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse belegen, dass durch ein
synthetisches Peptid, welches Teile von gp120 präsentiert, eine Induktion und
Verstärkung der HIV-1-Infektion stattfindet. Der zugrunde liegende Mechanismus
dieses Effekts sollte weiter untersucht werden, weil sich daraus Medikamente für die
antiretrovirale Therapie oder ein potentieller Impfstoff ergeben könnten.
4.1.1. Ausblick
Um das Modell (Abb. 49) weiter zu bestätigen und zu evaluieren, dass es sich bei
der Infektionsverstärkung durch CD4bs-M um einen HIV-spezifischen Effekt handelt,
wäre die Infektion von CEMx174 SEAP-Zellen mit HIV-1NL4.3
(ΔEnv)G
interessant.
Dieses Virus infiziert nicht über Interaktionen des Spikes, sondern über Interaktionen
des G-Proteins des Vesikularen Stromatitis Virus mit Phospholipiden der
Membran184. Sollte der Effekt von CD4bs-M spezifisch für die Fusion von HIV-1 mit
seinen Zielzellen, insbesondere für die Freilegung der Corezeptorbindungsstelle,
sein, so sollte die Infektion dieses Virus durch CD4bs-M nicht verstärkt werden. Ein
ähnliches
Verhalten wäre für die Infektion Corezeptor-negativer Zellen in
Anwesenheit von CD4bs-M zu erwarten, wenn es die Corezeptorbindungsstelle auf
dem viralen Spike freilegt. Im Infektionsversuch mit CEMx174-SEAP Reporterzellen,
welche CCR5-negativ sind, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass
die Infektion dieser Zellen mit dem R5-tropen HIV-1NL4.3 005pf135 durch CD4bs-M nicht
mehr induziert werden konnte.
Um den Infektions-induzierenden Effekt von CD4bs-M weiter zu bestätigen wäre es
zudem sinnvoll, CD4bs-M-Varianten, wie zum Beispiel das β20/β21-Fragment oder
die Peptide des Alanin-Scans, auf diesen Effekt in CD4-negativen HeLa-Zellen zu
- 103 -
Diskussion
untersuchen. In diesem Versuchsformat fehlt jedoch die zellseitige Negativkontrolle,
also HeLa-Zellen ohne CXCR4. Eine Möglichkeit, CXCR4-negative Zellen zu
erhalten, wäre die Blockierung der Bindung des Spikes an den CXCR4-Corezeptor
durch einen Liganden (zum Beispiel SDF-1 oder einen Antikörper gegen CXCR4),
was zur Inhibition der HIV-1-Infektion führt54,55,185. Die Bindung von SDF-1 hat jedoch
einen Einfluss auf die Signalleitung in der Zelle und führt zu Calciumfreisetzung und
Chemotaxis54,55. Alternativ könnten derivatisierte Chemokinvarianten und Chemokinbasierte synthetische Peptide mit reduzierter Agonistfunktion eingesetzt werden12,148.
Laut dem Modell (Abb. 49) sollte keine Induktion der Infektion solcher Zellen durch
CD4bs-M mehr stattfinden.
Da CD4bs-M einen Teil des Bridging sheets präsentiert, könnte ebenfalls eine
Bindung dieses Peptids an den Corezeptor CXCR4 stattfinden. Dies konnte in
direkten Bindungsversuchen bis jetzt nicht nachgewiesen werden, da CXCR4
(membranständiges Protein) nicht als aufgereinigtes Protein zur Verfügung steht.
Das Corezeptormimetikum CX4-M1142 in Bindungsstudien einzusetzen wäre eine
Alternative zu CXCR4. Jedoch fehlt diesem Mimetikum der N-Terminus des
Corezeptors. Ein Bindungstest auf Virusebene wäre eine lohnenswerte Alternative.
Eine weitere Möglichkeit, die Freilegung der Corezeptorbindungsstelle durch CD4bsM zu bestätigen, wäre die Infektion von CEMx174 SEAP-Zellen mit CD4unabhängigen Viren. Diese zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Corezeptorbindungsstelle auch ohne die vorherige Bindung an CD4 exponieren186-189.
CD4bs-M sollte für diese Viren nicht mehr in der Lage sein, die Infektion zu
verstärken, wenn es spezifisch die Corezeptorbindungsstelle freilegt. Ein geeignetes
CD4-unabhängiges Virus für diesen Versuch könnte HIV-1IIIBx186,187 darstellen, da
dieses wie HIV-1NL4.3 von HIV-1LAI abstammt und deshalb nicht so stark von dessen
Sequenz abweicht wie ein unverwandtes Virus.
Interessant wäre es auch, replikationsfähige HIV-1-Varianten mit Mutationen im
Bereich des β20/β21-Fragments (Bridging sheet) zu generieren und auf deren
Infektionsverhalten zu untersuchen. Damit könnte eventuell auch auf Virusebene die
alternierende Wichtigkeit der Aminosäuren im β20/β21-Bereich des intakten Spikes
nachgewiesen werden. Zusätzlich würden diese HIV-1-Varianten Informationen
darüber zulassen, inwieweit Peptide als Mimetika des Bridging sheets Anwendung
finden und zusätzlich neue Details des Viruseintritts in die Zelle preisgeben.
- 104 -
Diskussion
Zudem könnte der Einfluss von CD4bs-M auf die Entwicklung von Mutationen
innerhalb von gp120 im Verlauf einer Infektion weitere Details über die
Wirkungsweise dieses Peptids aufdecken. Hierzu müssten im Infektionsversuch
Zellen in An- und Abwesenheit von CD4bs-M und der Negativkontrolle Δβ20/β21 mit
HIV-1 infiziert werden und nach mehreren Passagen die entstandenen Viren auf
Mutationen innerhalb von gp120 mittels Sequenzierung untersucht werden. Dies
würde zeigen, ob Mutationen im Virus spezifisch in Anwesenheit der Peptide
auftreten.
Zur Evalulation des Modells (Abb. 49) wäre zudem die Aufklärung der strukturellen
Details der Interaktion von CD4bs-M mit gp120 sowie mit dem trimeren Spike
notwendig. Diese Strukturaufklärung ist nicht trivial. Eine Röntgenkristallstruktur des
gp120-CD4bs-M-Komplexes ist aufgrund der schlechten Kristallisierbarkeit von
Volllängen-gp120 derzeit nicht möglich. Lediglich die Kristallisation mit dem gp120Kern mit Deletionen in der V1/V2- und V3-Schleife, der Zuckerketten sowie des Nund C-terminalen Bereichs wäre denkbar. Dieses Kern-gp120 unterscheidet sich
jedoch strukturell nicht vor36 und nach30 CD4-Bindung, und stellt somit keine gute
Grundlage für die Interaktion von gp120 mit CD4bs-M dar. Als Alternative könnte die
Komplexstruktur mittels Elektronentomographie ermittelt werden. Eine atomare
Auflösung konnte bis jetzt mit dieser Methode noch nicht erreicht werden, jedoch
bietet
die
Elektronentomographie
die
Möglichkeit,
die
Bindung
eines
Interaktionspartners auf dem intakten viralen Spike zu beobachten. Da CD4bs-M zu
klein ist, um in einer solchen Struktur gesehen zu werden, müsste es markiert
vorliegen, zum Beispiel mittels Undecagold-Nanopartikeln190, welche mit einem
Durchmesser von 0,8 nm klein genug wären, um den viralen Spike nicht zu
verdecken. Durch die große Elektronendichte dieser Partikel würde das Peptid als
dunkler Punkt im Bild sichtbar.
Das β20/β21-Fragment von CD4bs-M ist dem kürzlich publizierten Peptid EF-C
ähnlich. Dieses Peptid zeigte eine Infektionsverstärkung, die von den Autoren auf
das Aggregationsverhalten von EF-C zurückgeführt wurde150. Demzufolge sollte in
weiterführenden Arbeiten untersucht werden, ob und gegebenenfalls welche Rolle
das
Aggregationsverhalten
von
CD4bs-M
und
dessen
Varianten
auf
die
Infektionsverstärkung spielt. Jedoch kann die Aggregation von CD4bs-M nicht der
einzige Grund für die Beeinflussung der Infektion sein, da im Falle der
Infektionsinduktion das Fehlen des CD4-Rezeptors auf der Zelloberfläche nicht von
- 105 -
Diskussion
der Aggregation ausgeglichen werden kann und demnach nicht zur produktiven
Infektion führt. Der Infektions-induzierende Effekt durch CD4bs-M ist relativ schwach
(Vergleich Abb. 21 und Abb. S1), demzufolge könnte er bei der Infektionsverstärkung
für CD4-positive Zellen vom Aggregationseffekt überlagert werden. Trotz eines
möglichen Aggregationsverhaltens handelt es sich bei CD4bs-M jedoch um ein
interessantes Mimetikum zur Aufklärung des HIV-1-Eintritts in die Zelle.
- 106 -
Diskussion
4.2. Der Einfluss der QR-Dipeptid-Insertion in der V3-Schleife auf die Erkennung
durch anti-V3-Schleifen-Antikörper
Mit Hilfe der V3-Schleifen-Peptide war es möglich, die Bedeutung der QR-Insertion in
der V3-Schleife durch direkte und kompetitive Bindungsanalysen herauszuarbeiten.
Hierbei fiel auf, dass die meisten anti-V3-Schleifen-Antikörper selektiv an V3Schleifen ohne QR-Insertion binden, und somit V3-Schleifen-Peptide mit QRInsertion nicht erkennen. Somit kann mittels dieser V3-Schleifen-Peptide nicht nur
eine Aussage über die Selektivität dieser Antikörper, sondern auch über deren
Bindungsepitope getroffen werden. Ist ein anti-V3-Schleifen-Antikörper QR-abhängig,
dann
erkennt
er
höchstwahrscheinlich
die
V3-Schleifen-Spitze
oder
deren
Konformation. Für einen Teil der hier verwendeten anti-V3-Schleifen-Antikörper
wurden bereits die Epitope untersucht, sowie publiziert, aus welchen HIV-1-Isolaten
diese isoliert wurden (Übersicht in Tab. 22).
Die Tatsache, dass die meisten aus Patienten isolierten anti-V3-Schleifen-Antikörper
die Spitze der V3-Schleife erkennen, wurde bereits 1993 publiziert191. Zwölf der
vierzehn in dieser Publikation getesteten Antikörper erkannten ein Epitop innnerhalb
der Sequenz KRIHIGPGRAF. Auch die in der vorliegenden Arbeit getesteten
Antikörper erkennen die V3-Schleifen-Spitze (Tab. 22), da die meisten Antikörper
selektiv für V3-Schleifen ohne QR-Insertion sind. Im Gegensatz zu den meisten
anderen getesteten Antikörpern ist 447-52D in der Lage, sowohl HIV-1IIIB als auch
HIV-1MN zu neutralisieren, und ist demnach nicht QR-abhängig
191
. Weil dieser
Antikörper viele Interaktionen mit der Hauptkette und wenige Interaktionen mit den
Aminosäureseitenketten der V3-Schleife eingeht, ist er nicht so stark von der
Sequenz der V3-Schleife abhängig77. Dies spiegelte sich auch in den direkten
Bindungsstudien der vorliegenden Arbeit wider. Obwohl die Bindung von 447-52D
sowohl an die Peptide V3BAL und V3ADA als auch V3HxBc2 und V3IIIB nachgewiesen
werden konnte, zeigten kompetitive ELISAs eindeutig eine Präferenz für V3Schleifen-Peptide ohne QR-Insertion. Somit stellt auch dieser Antikörper keine
Ausnahme der Selektivität für V3-Schleifen ohne QR-Insertion dar. Die einzigen
Antikörper, die nicht QR-abhängig V3-Schleifen-Peptide erkannten, waren die durch
Immunisierung von Mäusen erzeugten Antikörper 5F7 und 4G10. Da durch
Immunisierung meist stammspezifische Antikörper gegen lineare Epitope auf V3-
- 107 -
Diskussion
Schleifen erzeugt werden92,162,192, sind die Bindungseigenschaften von 5F7 und
4G10 wahrscheinlich ebenfalls stammspezifisch und können nicht zur Evaluation der
QR-Selektivität herangezogen werden.
Tab. 22: Übersicht der verwendeten anti-V3-Schleifen-Antikörper, sowie deren Herkunft und
Bindungsepitope.
Antikörper NeutralisationsLand
Verursachen Epitop
Referenz
stärke
der
HIV-1Subtyp
165,191,193,19
257-DIV
begrenzt
nicht
B
KRIHI
4
bekannt
73,165,191,193
268-DIV
begrenzt
nicht
B
HIGPGR
,194
bekannt
166,167
F425 B4a1
breit
nicht
nicht bekannt
V3
bekannt
78,195
F425 B4e8
breit
nicht
nicht bekannt
IHIGPGRAFYTT
bekannt
162,196
2191
breit
USA
B
V3
2219
breit
USA
B
TRKSIHIGP-R-FY 75,162,196
162,194
2442
breit
nicht
B
V3
bekannt
163,196
3869
breit
Kamerun
nicht bekannt
V3
164,196
3074
breit
Kamerun
CRF02_AG
V3
5F7
stammspezifisch
--BH10
RIQRGPGRAFVTGK 193,194
4G10
stammspezifisch
--BH10
RIQRGPGRAFVTGK 193,194
77,103,196
447-52D
breit
USA
B
KRIHIGPGR/
GPGR
Die QR-Insertion spielt eine entscheidende Rolle für die Konformation der V3Schleife. Dies wurde 2003 vergleichend für die Strukturen des Peptids V3MN an 44752D sowie des Peptids V3IIIB an den stammspezifischen Antikörper 0.5β
beschrieben86. Das Peptid V3MN in der 447-52D-Komplexstruktur bildet eine
Turn/Falktblatt-Struktur aus, mit einem antiparallelen zweisträngigen β-Faltblatt der
Reste 306 bis 309 und 317 bis 320 (HxBc2-Nomenklatur), welches durch einen
reversen Turn verbrückt wird. Diese Turn/Faltblatt-Struktur wird durch ein Netzwerk
von Wasserstoffbrücken zwischen den Strängen des β-Faltblatts stabilisiert. Ebenso
stabilisierend wirken sich großflächige hydrophobe Interaktionen aus. Die GPGSequenz (Reste 312 bis 314) im Peptid V3MN bildet einen inversen γ-Turn, der durch
R315 weiter stabilisiert wird. Im Gegensatz dazu bildet das Peptid V3IIIB im Komplex
mit 0.5β neben dem β-Faltblatt eine völlig andere Turn-Struktur aus. Die QR-Insertion
in dieser V3-Schleife beeinflusst nicht die Länge der β-Stränge, bildet jedoch einen
sechs-Aminosäuren beinhaltenden reversen Turn aus (Reste 310 bis 315). Dieser
Turn ist um einen Rest verschoben und beinhaltet die RGPG-Sequenz (Reste 311
bis 314), um die zentrale Lage des Turns an der Spitze der V3-Schleife zu
- 108 -
Diskussion
gewährleisten. Dies führt zu einer 180°-Drehung des zweiten β-Stranges.
Demzufolge führt die QR-Insertion nicht zu dramatischen Änderungen der V3Schleifen-Konformation, jedoch zu einer Verlängerung des Turns. Dies kann
Auswirkungen auf die Bindung von anti-V3-Schleifen-Antikörpern haben. Zusätzlich
besitzt das Arginin aus der QR-Insertion eine relativ große und zudem positiv
geladene Seitenkette, welche nach außen exponiert wird (Abb. 50). Eventuell wird
eine große Seitenkette im Turn aufgrund sterischer Hinderungen von den meisten
anti-V3-Schleifen-Antikörpern nicht toleriert. Andererseits könnte die positive Ladung
zu Abstoßungen mit hydrophoben oder positiv geladenen Resten innerhalb der
Antikörperbindungsstellen führen.
Abb. 50: NMR-Struktur der V3-SchleifeIIIB (447-52DKomplexstruktur) mit markiertem R311.
Pdb: 1U6U. R311 wurde rot markiert. Die Grafik wurde mittels
RCSB Protein-Workshop erstellt.
Zur Aufklärung des Einflusses der QR-Insertion auf die anti-V3-SchleifenAntikörperbindung wurden in dieser Arbeit verschiedene Deletions-, Insertions- und
Substitutionsvarianten synthetisiert. Die R311I-Substitution (für V3IIIB und V3HxBc2)
beziehungsweise QI-Insertion (für V3BAL und V3ADA) führte sogar dazu, dass diese
Varianten von den anti-V3-Schleifen-Antikörpern F425 B4a1, F425 B4e8, 2191,
2219, 2442, 3869 (im Fall der Substitution) und zusätzlich 3074 (im Fall der Insertion)
vergleichbar gut erkannt wurden wie die Peptidvarianten ohne QR-Insertion. Da die
Seitenkette des Isoleucins nicht geladen ist und auch weniger Platz einnimmt als die
des Arginins, könnte sowohl die fehlende sterische Hinderung als auch die fehlende
ladungsabhängige
Abstoßung
der
Grund
hierfür
sein.
Eine
weitere
Interpretationsmöglichkeit ist, dass sich die Faltblattstruktur über die QI-Insertion
ausweitet. Isoleucin gehört zu den Aminosäuren, die eine starke Tendenz zur
Ausbildung eines β-Faltblatts besitzen171. Somit wäre die Turn-Region strukturell
genauso angeordnet wie bei V3-Schleifen-Peptiden ohne Insertion, und die
Antikörperbindung demnach in dieser Region möglich.
Die R311E und R311K-Substitution (für V3IIIB und V3HxBc2) beziehungsweise QE und
QK-Insertion (für V3BAL und V3ADA) hatte bei fast allen Antikörpern einen ähnlichen
Bindungsverlust wie die QR-Insertion zur Folge. Im Fall von 447-52D führte die QE
- 109 -
Diskussion
oder
QK-Insertion
in
den
Peptiden
V3BAL
und
V3ADA
sogar
zu
einer
Bindungsverschlechterung im Vergleich zu Peptiden mit QR-Insertion. Das Glutamat
in der QE-Insertion besitzt eine negative Ladung. Dies könnte wiederum zu
ladungsbedingten Abstoßungen bei der Bindung der Antikörper an diese V3Schleifen-Peptide führen. Da die V3-Schleifen-Peptide eine positive Nettoladung
besitzen, könnte zusätzlich eine Konformationsänderung innerhalb der V3-Schleife
zum Bindungsverlust führen. Wie in Abbildung 50 gezeigt, ist die V3-Schleifen-Spitze
ausgestreckt und präsentiert ihre Aminosäureseitenketten nach außen. Das
Glutamat in der QE-Insertion könnte Interaktionen mit anderen positiv geladenen
Aminosäureseitenketten innerhalb eines V3-Schleifen-Peptids oder mit einem
benachbarten V3-Schleifen-Peptid ausbilden, was entweder die Konformation der
V3-Schleife drastisch verändert oder durch Verdeckung des Antikörper-Epitops durch
ein zweites V3-Schleifen-Peptid einhergeht. Dies würde zum Bindungsverlust führen.
Dass die Konformation der V3-Schleifen-Spitze eine entscheidende Rolle für die
Bindung an anti-V3-Schleifen-Antikörper spielt, belegt auch die fehlende Bindung an
V3-Schleifen-Varianten mit qr-Insertion. Da die Seitenketten der D-Aminosäuren (q, r)
in eine andere Richtung weisen und die lokale Peptid-Rückgradkonformation durch
den Einbau von
D-Aminosäuren
stark beeinträchtigt werden kann, wird auch hier
voraussichtlich die Konformation des Turn/Faltblatt-Bereichs stark verändert, was
zum Bindungsverlust an die anti-V3-Schleifen-Antikörper führen könnte.
Die Herstellung eines effektiven Vakzins ist eines der wichtigsten Ziele in der HIVForschung. Die Generierung einer effektiven Immunantwort gestaltet sich jedoch als
schwierig, da für eine hochaffine neutralisierende Antikörperantwort sowohl eine
Affinitätsreifung durch somatische Hypermutation als auch eine Unterstützung durch
T-Helfer-Zellen erforderlich ist197,198. Deshalb führten Immunisierungen mit V3Schleifen-Peptiden
Antworten92,192.
bis
Zusätzlich
68
Sequenzvariation .
jetzt
lediglich
beinhaltet
Deshalb
wurde
die
zu
stammspezifischen
V3-Schleife
geschlussfolgert,
Bereiche
dass
Antikörpermit
starker
anti-V3-Schleifen-
Antikörper nicht breit neutralisierend sein können. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt
werden, dass anti-V3-Schleifen-Antikörper von HIV-1 infizierten Menschen, die über
eine größere Zeitperiode (Monate bis Jahre) der humoralen Immunantwort
ausgesetzt
und
deren
Antikörper
demnach
affinitätsgereift
waren,
breite
Neutralisations-eigenschaften aufwiesen199. Die in dieser Arbeit beschriebenen antiV3-Schleifen-Antikörper aus DO11.10-Mäusen wurden sechs Wochen nach der
- 110 -
Diskussion
Immunisierung
untersucht.
Demzufolge
konnte
noch
keine
Affinitätsreifung
stattfinden, was die fehlende Kreuzreaktivität der Seren mit gp120 anderer Stämme
als dem des Immunogens erklärt. Beachtlich ist jedoch, dass das anti-PeptidSerumOva-HxBc2 in der Lage war, hervorragend an gp120 dieses Stammes zu binden.
Dies belegt eindrucksvoll die Anwendbarkeit der V3-Schleifen-Peptide als Mimetika
der gp120-V3-Schleife. Beeindruckend war ebenfalls, dass durch Peptide mit und
ohne QR-Insertion QR-selektive Antikörper, sowohl für V3-Schleifen mit als auch
ohne QR-Insertion, erzeugt wurden. Dieser Effekt war mit den Seren anti-V3Ova-HxBc2
und anti-V3Ova-HxBc2
ΔQR
messbar, ohne dass eine Aufreinigung der Antikörper
notwendig war. Ein ähnlicher Effekt wurde bereits 1994 bei einer Kaninchen- und
Affen-Immunisierungsstudie mit verkürzten V3-Schleifen-Peptid der Stämme
MN
IIIB
und
beobachtet, konnte jedoch damals nicht auf die QR-Insertion zurückgeführt
werden71. Die V3-Schleifen-Spitze ist demnach der immunogenste Bereich der V3Schleife, da die meisten Antikörper gegen diesen Bereich gerichtet waren. Die
konservierte V3-Schleifen-Basis hingegen löste keine starke Immunantwort aus.
Dass im Serum HIV-infizierter Menschen keine Antikörper gegen die V3-SchleifenBasis gefunden wurden, wurde meist damit begründet, dass dieser Bereich durch
Abschirmung durch Zucker oder die V1/V2-Schleife unzugänglich für das
Immunsystem war
30,105,200,201
. Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Seren
beinhalten hauptsächlich Antikörper gegen die V3-Schleifen-Spitze. In den
beschriebenen Peptiden fand weder eine Abschirmung durch die V1/V2-Schleife
noch eine Glykosylierung statt, woraus geschlussfolgert werden kann, dass die
Spitze der V3-Schleife deutlich immunogener ist als die Basis.
Die Insertion eines Dipeptids in die V3-Schleife ist für das Virus nicht so einfach wie
eine Substitution einer Aminosäure. Während für eine Substitution nur der Austausch
einer Nukleobase erforderlich ist, so müssen für eine Dipeptid-Insertion sechs
Nukleotide in das bestehende Genom eingefügt werden202. Dies erklärt, warum eine
solche Insertion im HIV-1-Genom relativ selten vorkommt. Wenn sie jedoch
vorkommt, bietet sie dem Virus einen entscheidenden Vorteil. Die QR-Insertion in der
V3-Schleife könnte eine Möglichkeit für HIV-1 sein, dem Immunsystem zu
entkommen, da diese Insertion dazu führt, dass die meisten anti-V3-SchleifenAntikörper nicht mehr an die V3-Schleife binden können und somit die Infektion nicht
verhindert wird. Der Einbau einer QI-Insertion hingegen ist für das Virus eher
ungünstig, da die meisten Antikörper diese Insertion tolerieren. Der Einbau einer QE- 111 -
Diskussion
Insertion in die V3-Schleife könnte weitreichende Folgen auf die Infektiösität des
Virus besitzen, da zwar die V3-Schleife durch anti-V3-Schleifen-Antikörper nicht
mehr effizient erkannt wird, jedoch auch die Corezeptorbindung durch Abstoßung der
negativen Ladung und durch eine eventuelle Strukturänderung innerhalb der V3Schleife beeinträchtigt werden könnte. Somit ist diese Mutation ungünstig für das
Virus und ist bis jetzt nicht beobachtet worden.
Die Tatsache, dass die V3-Schleifen der HIVLAI-Gruppe (Stämme
NL4.3)
BH10, IIIB, HxBc2
und
gerade in der Anfangszeit der HIV-Forschung als Referenzstämme verwendet
wurden und immer noch werden, könnte ein Grund dafür sein, dass nur wenige breit
neutralisierende anti-V3-Schleifen-Antikörper beschrieben wurden. Eventuell wurden
breit neutralisierende Antikörper aufgrund ihrer Selektivität für V3-Schleifen ohne
QR-Insertion mittels Neutralisationsversuchen und Bindungsstudien nicht erkannt, da
in diesen Versuchen die Neutralisationskapazität mit Viren, die eine V3-Schleife mit
QR-Insertion enthielten, bestimmt wurden. Die in dieser Arbeit beschriebene
Bedeutung der QR-Insertion auf die Antikörperbindung zeigt einen möglichen Grund
dafür.
Die hier präsentierten Daten zeigen eindrucksvoll die Anwendbarkeit von V3Schleifen-Peptiden für die Evaluation von anti-V3-Schleifen-Antikörpern und deren
Bindungspräferenzen und –selektivitäten. Somit können diese Peptide dazu dienen,
unser
Verständnis
über
die
Generierung
einer
effektiven
Immunantwort
voranzutreiben und in Zukunft eventuell einen Impfstoff auf der Basis dieser Peptide
zu entwickeln.
4.2.1. Ausblick
Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen die Selektivität von anti-V3-SchleifenAntikörpern für V3-Schleifen mit und ohne QR-Insertion. Es traten jedoch
Diskrepanzen zwischen direkter Streptavidin-basierter ELISA und der SPRSpektroskopie auf, die auf falsch positive Signale zurückzuführen waren. Ziel sollte
es sein, dieses Phänomen in weiteren vertiefenden Studien und Bindungstests zu
evaluieren und die Versuchsbedingungen (Puffer, Inkubationszeiten, Peptid- und
Antikörperkonzentrationen) weiter zu verbessern, sodass das Screening von anti-V3Schleifen-Antikörpern in Zukunft mit Hilfe der V3-Schleifen-Peptide eine einfache und
- 112 -
Diskussion
schnelle Methode darstellt, um Antikörper zu charakterisieren. Interessant wäre es,
die Epitope von anti-V3-Schleifen-Antikörpern mit Hilfe weiterer Aminosäuresubstitutionen zu charakterisieren. Mit den V3-Schleifen-Peptiden könnte ein
Microarray aufgebaut werden, der es ermöglicht, Seren aus Patienten innerhalb von
24 Stunden auf deren anti-V3-Schleifen-Antikörper zu testen.
Zusätzlich bieten die V3-Schleifen-Peptide eine hervorragende Basis zur Herstellung
eines potenten HIV-1-Impfstoffs. Mit Hilfe der Peptide V3Ova-HxBc2 und V3Ova-HxBc2 ΔQR
konnte gezeigt werden, dass eine starke Antikörperanwort gegen diese Peptide
erzeugt wurde. Diese Antikörper waren eindeutig QR-selektiv, abhängig vom
Immunogen für V3-Schleifen mit- und ohne QR-Insertion. Dieser Effekt sollte durch
Immunisierung weiterer V3-Schleifen-Peptide anderer Stämme, die in ihrer nativen
V3-Schleifen-Sequenz keine QR-Insertion besitzen, bestätigt werden. Zusätzlich
wäre es interessant, die Antikörperantwort weiter zu betrachten und durch
zusätzliche Injektionen desselben oder unterschiedlicher V3-Schleifen-Peptide in die
Mäuse, zu versuchen, somatische Hypermutationen auszulösen, welche für die
Erzeugung von breit-neutralisierenden Antikörpern erforderlich sind199. Zusätzlich
könnte versucht werden, andere Tiere als die DO11.10-Mäuse zu immunisieren, da
diese nur eine begrenzte Lebenserwartung besitzen. Dies könnte weitere Hinweise
über die Neutralisationsstärke der erzeugten Antikörper bereitstellen. Ein weiterer
Ansatzpunkt wäre, andere V3-Schleifen-Peptid-Varianten als Immunogene zu
verwenden. Eine geeignete Variante mit dem Potential, anti-V3-Schleifen-Antikörper
ohne QR-Selektivität hervorzurufen, wäre ein V3-Schleifen-Peptid mit QI-Insertion.
Die Insertion anderer Aminosäuren als QR wäre ebenfalls ein Anreiz für weitere
Forschung.
Mit Hilfe dieser Peptidvarianten könnten in Zukunft eventuell breit neutralisierende
Antikörper erzeugt werden.
- 113 -
Diskussion
4.3 Die Charakterisierung der CXCR4-gp120-Interaktion mittels mimetischer Peptide
Das CXCR4-mimetische Peptid CX4-M1 ist in der Lage, selektiv an gp120 von X4tropen HIV-1 zu binden142. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses
Verhalten auch auf die Bindung an V3-Schleifen-Peptide zutrifft. Da sowohl die
Bindungsselektivitäten, als auch die Affinitäten vergleichbar waren, handelt es sich
bei
CX4-M1
und
den
V3-Schleifen-Peptiden
um
ein
vielversprechendes
Modellsystem zur Analyse der Interaktion des Corezeptors und gp120 des viralen
Spikes.
Mit Hilfe dieses Modellsystems war es möglich, die Interaktion beider Proteine auf
der Ebene einzelner Aminosäuren aufzuklären. Als Vertreter der V3-SchleifenPeptide wurde hierfür die V3-SchleifeHxBc2 gewählt, da bekannt ist, dass die HIV-1LAIGruppe, zu der HIV-1HxBc2 gehört, unabhängig vom N-Terminus des Corezeptors, der
in CX4-M1 nicht enthalten ist, Zielzellen infizieren kann62. CX4-M1 bindet an die βFaltblatt-Region der V3-Schleife. Dies konnte mittels verkürzten V3-SchleifenVarianten sowie mit Hilfe von Alanin-Substitutionsvarianten nachgewiesen werden.
Dies erklärt auch die starke Bindung der V3-Schleifen-Peptide an CX4-M1. Eine
treibende Kraft für eine Peptid-Peptid-Interaktion kann thermodynamischer Natur
sein, sodass mit Hilfe der Ausbildung einer Sekundärstruktur innerhalb des Peptids
die nötige Energie für die Bindung an das Protein bereitgestellt wird. Dies konnte
bereits 2011 am Beispiel der Bindung des S-Peptids an die Ribonuklease A gezeigt
werden170. Für die V3-Schleife ist beschrieben, dass sie ohne Interaktionspartner
keine definierte Sekundärstruktur aufweist34,64,85,87, jedoch nach Bindung an anti-V3Schleifen-Antikörper ein β-Faltblatt an der V3-Schleifen-Spitze ausbildet73,75,77,78,8084,86
.
Dies
weist
stark
auf
eine
thermodynamische
Begünstigung
des
Bindungsprozesses beider Peptide aneinander hin.
Die Auswirkung der Alanin-Substitutionen sind in Abbildung 51 am Beispiel der NMRStruktur eines V3IIIB-Peptids in Komplex mit mAb 447-52D gezeigt, da dieses Peptid,
wie das Peptid V3HxBc2, eine QR-Insertion beinhaltet. Die Alanin-Substitution der
Faltblattregion führte zu einer Bindungsverschlechterung für die Reste I307, R308,
I309, F317, V318, T319, I320. Dies könnte durch Beeinflussung der Ausbildung der
Faltblattstruktur zu begründen sein. Ebenfalls einen bindungsabschwächenden Effekt
hatte die Substitution der Reste P313A und R315A im Turn der V3-Schleife. Der
Austausch des Prolins führt sicher zur Zerstörung der Turnstruktur86. Die Seitenkette
- 114 -
Diskussion
des Arginins interagiert mit G312 und P313 des Turns86. Der Austausch von Arginin
durch Alanin in dieser Position hat demnach ebenfalls einen Einfluss auf die TurnStruktur.
Abb. 51: NMR-Struktur der V3-SchleifeIIIB (447-52DKomplexstruktur) (pdb 1U6U): Einfluss der AlaninSubstitutionen.
Einfluss der Alanin-Substitution der Aminosäuren in der V3Schleifen-Spitze auf die Bindung an CX4-M1. rot: Bindungsverschlechterung, grün: Bindungsverbesserung (R311). Die
Grafik wurde mittels RCSB Protein-Workshop erstellt.
Die
Substitution
des
Restes
I323
durch
Alanin
führte
ebenfalls
zur
Bindungsverschlechterung. Der Grund hierfür ist nicht bekannt, könnte aber auf den
Verlust einer Seitenketteninteraktion zurückzuführen sein. Der Austausch der Reste
R311 und K322 zu Alanin hingegen führte jeweils zu einer Bindungsverstärkung. Da
die Seitenkette des Arginins aus der V3-Schleife herausragt und demnach eine
große Fläche einnimmt (Abb. 51), sind sterische Hinderungen bei der Interaktion mit
CX4-M1 denkbar, die durch die Seitenkette des Alanins nicht verursacht werden
würden. Dasselbe gilt für Lysin. Hier fällt zusätzlich ins Gewicht, dass der Austausch
von Lysin an dieser Position dazu führen könnte, dass sich ein längeres β-Faltblatt
ausbildet, da Lysin als Brecher dieser Struktur beschrieben wurde171. Ein längeres
Faltblatt könnte eine Bindung beider Peptide aneinander thermodynamisch
begünstigen,
da
stärkere
Interaktionen
in
Form
von
zum
Beispiel
Wasserstoffbrückenbindungen gebildet werden könnten170.
Die Tatsache, dass der Austausch von positiv geladenen Aminosäuren zu Alanin in
der V3-Schleife sowohl zu Bindungsverstärkung (R311, K322) als auch zur
Bindungsabschwächung
(R308,
R315)
führt,
weist
darauf
hin,
dass
die
Beeinträchtigung der Nettoladung der V3-Schleife nicht der alleinige Grund für die
Interaktion mit CX4-M1 ist. Der Corezeptor-Tropismus wird ebenfalls nicht durch die
Nettoladung bestimmt, da sowohl V3-Schleifen für R5-trope als auch X4-trope HIV-1
mit der Netoladung +4, +5 und +6 beschrieben wurden89. Für den Tropismus sind die
Reste 11, 24 und 25 (Reste 306, 321 und 322 HxBc2-Nomenklatur) von Bedeutung89.
Die ECL2 des Corezeptors CXCR4 stellt einen wichtigen Teil der gp120Bindungsstelle auf dem Corezeptor dar62. Deshalb wurde die ECL2 in CX4-M1 mit
Hilfe eines Alanin-Scans auf die Beteiligung einzelner Aminosäuren an der Bindung
- 115 -
Diskussion
an
gp120
und
V3-Schleifen-Peptide
untersucht.
Die
Bindung
der
Alanin-
Substitutionsvarianten der ECL2 von CX4-M1 an gp120HxBc2 sowie das Peptid
V3HxBc2
zeigte,
dass
der
Austausch
negativ
geladener
Reste
zu
einem
Bindungsverlust, sowohl an gp120 als auch an das V3-Schleifen-Peptid, führt.
Ein ähnlicher Effekt wurde für CXCR4 bereits 2003 beschrieben. Es konnte im
Western Blot gezeigt werden, dass die direkte Bindung der Varianten D187A und
D193A eine Bindungsverschlechterung an gp120VCP und gp120ROD/B aus HIV-2 zur
Folge hatten203. In Infektionsversuchen konnte durch Einzelmutationen dieser Reste
jedoch nicht eindeutig eine Infektionsabschwächung festgestellt werden66,203. Auf
eine ladungsabhängige Interaktion der V3-Schleife mit dem Corezeptor CXCR4 weist
auch die Abhängigkeit der Infektivität X4-troper HIV-1 von einer positiven Ladung an
Position 306, 321 oder 322 der V3-Schleife (HxBc2-Nomenklatur) hin89. In der
Darstellung des elektrostatischen Potentials am Beispiel der CXCR4 – SDF-1Interaktion durch Wu et al. ist eindeutig eine Ladungsabhängigkeit der Interaktion
dieser beiden Proteine nachvollziehbar (Abb. 52)52. Da die V3-Schleife wie SDF-1
eine hohe positive Nettoladung aufweist, kommt ein ähnliches Bindungsverhalten der
V3-Schleife in Betracht52.
Abb. 52: Ladungsabhängigkeit der CXCR4 – SDF-1Interaktion (pdb 3OE0 und 2K05).
Dargestellt ist das elektrostatische Potentiel von CXCR4 und
SDF-1 von rot (negativ) bis blau (positiv) im Bindungsmodell
der Einzelstrukturen. Gelb: N-terminale Domäne des CXCR4
mit P27 und den sulfatierten Tyrosinen in der raumfüllenden
Darstellung. grün: Peptidligand CVX15. Grafik übernommen
aus 52.
Der verstärkende Effekt des Austauschs von positiv geladenen Resten durch Alanin,
wie R183 und R188, innerhalb von CX4-M1 auf die Bindung an gp120HxBc2 und das
Peptid V3HxBc2 konnte in vorhergehenden Publikationen in Zellfusions- und
Infektionsversuchen mit X4-tropem HIV-1 nicht bestätigt werden204,205. Hier führte der
Austausch von R188 sogar zur Reduktion der Fusion. Im Gegensatz dazu wurde von
- 116 -
Diskussion
Lin et al. 2003 eine stammabhängige Interaktion von gp120 an CXCR4 mit R188AMutation beschrieben203. Während gp120VCP in der Lage war, stark an CXCR4 mit
dieser
Alaninvariante
zu
binden,
konnte
keine
Interaktion
für
gp120ROD/B
nachgewiesen werden. Zellen, die diese gp120 auf ihrer Oberfläche präsentierten,
waren jedoch in der Lage, eine Fusion mit Zellen, die CXCR4 R188A präsentierten,
durchzuführen, welche jedoch im Gegensatz zur Fusion mit CXCR4-präsentierenden
Zellen deutlich abgeschwächt war. Diese Diskrepanz zwischen Bindung und Fusion
könnte, den Autoren zufolge, auf eine Funktion von CXCR4 nach gp120-Bindung
oder auf die unterschiedliche Präsentation im trimeren Spike im Gegensatz zum
monomeren gp120 zurückzuführen sein.
Die unterschiedliche Bindung von gp120HxBc2 und Peptid V3HxBc2 an die AlaninSubstitutionsvarianten von CX4-M1 weist darauf hin, dass neben der V3-Schleife
zusätzlich andere Bindungsstellen auf gp120 eine Rolle für die Bindung an CX4-M1
(also die ECLs des Corezeptors) spielen. Da die meisten Primärisolate eine gute
Zugänglichkeit der V3-Schleifen-Spitze auf der Oberfläche des intakten Virus
besitzen206,207, jedoch erst mit dem CD4-Rezeptor interagieren müssen, um die Zelle
zu infizieren, weist dies darauf hin, dass eine Bindung der V3-Schleife an den
Corezeptor notwendig, aber nicht hinreichend für eine Infektion ist. Lösliches gp120
bindet schwach an Corezeptor-exprimierende Zellen, durch CD4-Bindung wird die
Affinität der Bindung stark verbessert33,208-210. Durch die Bindung von gp120 an CD4
wird scheinbar ein weiterer Bestandteil der Corezeptor-Bindungsstelle freigelegt,
welcher dann die Bindung an den Corezeptor verstärkt. Dieser könnte aus dem
Bridging sheet30 aufgebaut sein. 2001 wurde beschrieben, dass die V1/V2-Schleife
ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Bindung an den Corezeptor spielt und dass
diese Interaktion unabhängig vom N-Terminus des Corezeptor ist211.
Desweiteren besteht die Möglichkeit, dass die gp120-Bindung an den Corezeptor
eine konformationelle Änderung des Corezeptors verursacht, der daraufhin
Konformationsänderungen im Spike auslöst und diesen dazu befähigt, die Fusion
durchzuführen12. Das würde erklären, warum eine einfache Bindung der V3-Schleife
an CXCR4 nicht ausreicht, um die Fusion zu vermitteln.
Ein weiterer Grund für die unterschiedliche Bindung von gp120HxBc2 und dem Peptid
V3HxBc2 an die Alanin-Varianten von CX4-M1 könnte die unterschiedliche Flexibilität
der V3-Schleife sein. Während das V3-Schleifen-Peptid sich flexibel bewegen kann
und ohne Proteinkontext ungefaltet vorliegt, ist die V3-Schleife im gp120 in seinem
- 117 -
Diskussion
Proteinkontext und ist somit wahrscheinlich durch andere Proteinbereiche des gp120
in seiner Bewegung eingeschränkt. Somit könnte zum Beispiel durch AlaninSubstitution der Aminosäuren Y184 und Y190 eine hydrophobe Interaktion zur V3Schleife in gp120 zerstört werden, da die Länge der Seitenkette des Alanins nicht
ausreicht, um diese Interaktion einzugehen. Im Gegensatz dazu ist das V3-SchleifenPeptid flexibler und somit eventuell in der Lage, sogar stärkere Interaktionen mit
diesen Corezeptorkonstrukten einzugehen, was durch eine Bindungsverbesserung
sichtbar wird.
Zusätzlich
zu
den
oben
aufgeführten
Gründen
könnten
posttranslationale
Modifikationen innerhalb von gp120, wie zum Beispiel Glykosylierungen von
Asparaginen, eine entscheidende Rolle für die Zugänglichkeit und Flexibilität der V3Schleife spielen. Bereits 2001 veröffentlichten Polzer et al., dass das Fehlen der
Glykosylierung in oder in unmittelbarer Nähe der V3-Schleife einen starken Einfluss
auf die Bindung an CXCR4 sowie die Infektion von Zielzellen besitzt212.
CX4-M1 ist in der Lage, die Infektion von CEMx174 SEAP-Reporterzellen zu
inhibieren142. Diese Infektionsinhibition konnte in dieser Arbeit bestätigt werden.
Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass V3-Schleifen-Peptide in der Lage sind,
dieser Infektionsinhibition entgegenzuwirken. Dies bestätigt deren Funktionalität als
Corezeptorbindungsstellenmimetika. Ein ähnlicher Effekt wurde für anti-V3-SchleifenAntikörper beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass die Neutralisation von HIV-1
durch anti-V3-Schleifen-Antikörper vermittelt wird136. Desweiteren waren V3Schleifen-Peptide in der Lage, dieser Neutralisation durch anti-V3-SchleifenAntikörper entgegenzuwirken213-215. In dieser Arbeit konnte dieses Verhalten in
ELISAs bestätigt werden, da eine Kompetition der anti-V3-Schleifen-Antikörper mit
CX4-M1 um Bindung an gp120HxBc2 oder das Peptid V3HxBc2 nachgewiesen werden
konnte und vergleichbare IC50-Werte hervorbrachte.
Das Modellsystem, welches mittels CX4-M1 und V3-Schleifen-Peptiden erstellt
wurde, belegt die Anwendbarkeit von Peptid-Peptid-Interaktionen für die Aufklärung
von Protein-Protein-Interaktionen, und stellt somit eine vielversprechende Alternative
zur Aufklärung der Interaktion von CXCR4 und gp120 bereit.
- 118 -
Diskussion
4.3.1. Ausblick
Um die Interaktion von V3-Schleifen-Peptiden mit CX4-M1 auch auf struktureller
Ebene zu bestätigen, ist die Strukturaufklärung dieses Komplexes ein lohnendes
Ziel. Dies würde nicht nur eine Aussage darüber zulassen, wie beide Peptide
miteinander interagieren, es bietet auch eine erste Möglichkeit, die Interaktion von
CXCR4 und gp120 strukturell abzuleiten, da eine Komplexstruktur von gp120 und
CXCR4 bis heute nicht aufgeklärt werden konnte.
Die Strukturaufklärung membranständiger Proteine, wie CXCR4 als G-Protein
gekoppelter Rezeptor, stellte lange eine Herausforderung dar. Deshalb wurde CX4M1 aus Ermangelung einer CXCR4-Struktur auf der Grundlage eines Modells,
basierend auf der Röntgenkristallstruktur von Rhodopsin50, entwickelt142. Als 2010
die CXCR4-Röntgenkristallstruktur52 publiziert wurde, wurde ersichtlich, dass ein Teil
der ECL2 nicht in CX4-M1 präsentiert wird, da dieser Teil laut Modell zu einer
Membran-durchspannenden Helix gehörte. Die ECL3 in CX4-M1 hingegen beinhaltet
laut Röntgenkristallstruktur Sequenzen, die in membrandurchspannende Helices
involviert sind. In weiterführenden Arbeiten könnte die Längen der ECLs denen in der
Röntgenkristallstruktur
angeglichen
werden.
Das
daraus
resultierende
Peptidkonstrukt könnte dann auf dessen Bindungseigenschaften untersucht werden.
CX4-M1 präsentiert die drei ECLs des Corezeptors CXCR4. Da der Corezeptor
zusätzlich extrazellulär seinen N-Terminus präsentiert, welcher ebenfalls an der
Bindung an gp120 beteiligt ist48,62, wäre eine interessante Fortsetzung dieses
Projekts die Erweiterung von CX4-M1 um den N-Terminus. Die Erhaltung nativer
Sulfotyrosine
im
N-Terminus
stellt
hierbei
eine
besondere
synthetische
Herausforderung dar, die durch Etablierung einer geeigneten Synthesestrategie
überwunden werden könnte.
Die Annahme, dass die ECL2 von CX4-M1 wichtig für die Interaktion mit gp120 und
V3-Schleifen-Peptiden ist, konnte mittels Alanin-Substitutionen belegt werden. Um
die Beteiligung der anderen ECLs von CX4-M1 an der Bindung an gp120 oder V3Schleifen-Peptide herauszufinden, wäre die Synthese von verkürzten Varianten (die
jeweils nur eine oder zwei ECLs besitzen) sowie Alanin-Substitutionen der ECLs eins
und drei wichtig.
Die primäre biologische Funktion von CXCR4 ist nicht, als Corezeptor für HIV-1 zu
dienen, sondern Signaltransduktionsprozesse durch Bindung an Chemokine
- 119 -
Diskussion
einzuleiten. Dazu zählen SDF-1 und MIF. Die Bindung dieser Chemokine an CX4-M1
wäre eine weitere Möglichkeit, CX4-M1 als Mimetikum von CXCR4 zu bestätigen.
Erste Ergebnisse der Bindung von CX4-M1 an SDF-1 waren widersprüchlich. Ein
geeignetes Versuchssystem müsste etabliert werden. Zusätzlich ist bekannt, dass
Chemokine stark mit dem N-Terminus des Corezeptors interagieren53. Auch hier
wäre die Synthese eines um den N-Terminus erweiterten CX4-M1 von Vorteil.
Das Verständnis der Interaktion der V3-Schleife mit CX4-M1 könnte zusätzlich durch
gezielte Mutationen in der V3-Schleife weiter verbessert werden. Aus der
vorliegenden Arbeit geht hervor, dass der Faltblatt-Bereich, welcher sich während
der Interaktion der V3-Schleife mit CX4-M1 potentiell ausbildet, eine wichtige Rolle
spielt. Um diese These weiter zu stützen und um herauszufinden, ob die Ausbildung
einer Faltblattstruktur in der V3-Schleife wichtig für die Interaktion mit CX4-M1 ist,
wäre der Einbau konformationsbeeinträchtigender Aminosäuren eine hervorragende
Möglichkeit.
Desweiteren könnten die Alanin-Varianten sowohl des CX4-M1 als auch des V3Schleifen-PeptidsHxBc2, sowie doe verkürzten Peptide, in Infektionsversuchen getestet
werden, um deren Kompetitionspotential und damit Bindungseigenschaften auch auf
der Ebene intakter Viren genauer zu analysieren. Dies würde weiterhin dazu
beitragen, Unterschiede zwischen gp120 und intakten trimeren Spikes zu
entschlüsseln.
Trotz der Evaluation von CX4-M1 als exzellentes Corezeptormimetikum war es bis
jetzt leider nicht möglich, CX4-M1 mit CXCR4 im direkten ELISA zu vergleichen. Dies
liegt darin begründet, dass CXCR4 (als membranständiges Protein) nicht als
pufferlösliche Variante erhältlich ist, da dessen Expression nicht zur Freisetzung des
Proteins führt. Die direkte Bindung an V3-Schleifen-Peptide wäre somit nur auf
Zellebene möglich. CXCR4 wird jedoch universell auf fast allen Zelllinien exprimiert,
wodurch eine Negativkontrolle für solche Bindungsversuche fehlen würde. Durch
Blockierung von CXCR4 durch Chemokin-imitierende Peptide mit reduzierter
Agonist-Funktion12,148 könnten CXCR4-negative Zellen bereitgestellt werden, an
denen Bindungsanalysen an Zellen (zum Beispiel FACS) durchgeführt werden
könnten. In diesem System wäre jedoch ein weiteres Problem, dass die V3-Schleife
nicht nur an den Corezeptor, sondern auch an Heparansulfat-Proteoglykane16 binden
kann, und somit das Signal-zu-Rausch-Verhältnis in einer solchen Studie sehr
schlecht sein könnte. Ein lohnendes Ziel wäre es, lediglich die ECLs und den N- 120 -
Diskussion
Terminus von CXCR4 – verbrückt mittels Platzhalteraminosäuren – zu exprimieren
und dieses verkürzte Corezeptor-Konstrukt auf seine Bindungseigenschaften zu
testen und damit CX4-M1 als funktionelles Mimetikum von CXCR4 zu bestätigen.
Zusätzlich sollten die im V3-Schleifen-Peptid eingeführten Mutationen in der V3Schleife des intakten gp120 mutiert und auf deren Interaktion mit CX4-M1 untersucht
werden, um die Bindungsergebnisse dieser Peptide auch auf Ebene des gesamten
Proteins (gp120) zu bestätigen. Außerdem könnte man auch die Infektion von Zellen
durch ein X4-tropes HIV-1 in An- und Abwesenheit von CX4-M1 über einen längeren
Zeitraum betrachten, und nach mehreren Zellpassagen die entstandenen HIV-1Varianten auf Mutationen innerhalb von gp120 untersuchen, sowie diese Viren auf
Wechsel des Corezeptors von CXCR4 auf CCR5 testen. Dies würde wichtige
Hinweise auf die Wirkweise von CX4-M1 geben und dazu beitragen, die Interaktion
zwischen dem Spike und dem Corezeptor besser zu verstehen.
- 121 -
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Das humane Immundefizienzvirus (HIV-1) löst das erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS) aus. Es tritt mittels seines Hüll-Multiproteinkomplexes, dem Spike, in
die Zelle ein. Der Spike besteht aus einem Trimer, welches durch gp120 und gp41
aufgebaut wird. Für die Fusion von HIV-1 mit der Wirtszellmembran muss der Spike
mit dem Rezeptor (CD4) und einem Corezeptor (CCR5 oder CXCR4) interagieren.
Diese
Interaktionen
werden
durch
gp120
vermittelt
und
führen
zu
Konformationsänderungen, welche gp41 zur Vermittlung der Fusion von Virus- und
Wirtszellmembran befähigen. Trotz intensiver Forschung kann AIDS nicht geheilt
werden und verursacht jährlich 1,5 Millionen Todesfälle. Bis heute wurde noch kein
wirksamer Impfstoff gegen HIV-1 entwickelt. Dies ist hauptsächlich damit zu
begründen, dass HIV-1 durch hohe Mutationsraten sowie Verdeckung von potentiell
neutralisierenden Epitopen dem Immunsystem entkommt, was die Entwicklung von
Impfstoffen auf der Basis ganzer Proteine oder Proteinkomplexe (zum Beispiel dem
Spike) zusätzlich erschwert. Eine mögliche Lösung dieses Problems könnte der
Einsatz von Immunogenen auf der Basis peptidischer Bindungsstellenmimetika
darstellen. Die Präsentation einzelner Bindungsstellen auf gp120 durch Peptide, wie
zum Beispiel die CD4-Bindungsstelle oder die Corezeptorbindungsstelle, könnte
nicht nur das Verständnis der molekularen Details der Virus-Wirtszellinteraktion
verbessern, sondern auch potentielle Impfstoffe im Kampf gegen HIV-1 bereitstellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Details der Interaktion eines CD4Bindungsstellenmimetikums
(CD4bs-M)
sowie
von
Corezeptorbindungsstellen-
mimetika (V3-Schleifen-Peptide) näher untersucht.
Bereits
2007
konnte
gezeigt
werden,
dass
das
diskontinuierliche
Bindungsstellenmimetikum CD4bs-M mit gp120 um die Bindung an CD4 kompetierte.
Interessanterweise konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass CD4bs-M
in der Lage ist, an gp120 im direkten ELISA zu binden. Desweiteren konnte CD4bsM die HIV-1-Infektion von CD4-positiven Zielzellen deutlich verstärken und zusätzlich
die Infektion CD4-negativer HeLa-Zellen mit HIV-1 vermitteln. Dieser Effekt konnte
mit dem β20/β21-Fragment dieses Mimetikums in Verbindung gebracht werden,
welches Teil des Bridging sheets von gp120 ist. Durch den Einsatz verschiedener
Substitutionsvarianten konnte gezeigt werden, dass eine definierte Seitenketten- und
Peptidrückgratorientierung, sowie eine definierte räumliche Anordnung dieses
- 122 -
Zusammenfassung
Fragments für die beobachteten Effekte erforderlich sind. Es konnte gezeigt werden,
dass die Infektions-vermittelnde Wirkung von CD4bs-M Corezeptor-abhängig ist, und
somit einen Einfluss auf die Fusion von HIV-1 mit der Wirtszellmembran besitzen
könnte.
Während der Infektion mit HIV-1 ist die primäre Immunantwort gegen die V3-Schleife
von gp120 gerichtet. Unglücklicherweise sind die gebildeten Antikörper in den
meisten Fällen nicht breit neutralisierend und können demzufolge von HIV-1 durch
verschiedene Fluchtmechanismen vor dem Immunsystem umgangen werden, wie
zum
Beispiel
durch
Einzelnukleotid-Polymorphismen,
die
eine
Aminosäure-
Substitution zur Folge haben, oder Verdeckung des entsprechenden Epitops.
Trotzdem wurden von einigen HIV-1 positiven Langzeitüberlebenden breitneutralisierende
anti-V3-Schleifen-Antikörper
gebildet.
Neben
Aminosäure-
Substitutionen in der V3-Schleifen-Sequenz kommen auch HIV-1-Stämme mit
Aminosäure-Insertionen in der V3-Schleife vor. Ein Beispiel hierfür ist HIV-1LAI, aus
dem zum Beispiel HIV-1IIIB, HIV-1HxBc2 und HIV-1NL4.3 hervorgegangen sind. Diese
Stämme haben eine Dipeptid-Insertion (QR-Insertion) in der V3-Schleifen-Spitze. In
der vorliegenden Arbeit konnte mittels V3-Schleifen-Peptiden mit beziehungsweise
ohne QR-Insertion gezeigt werden, dass die meisten breit neutralisierenden anti-V3Schleifen-Antikörper eine klare Selektivität für V3-Schleifen-Peptide ohne QRInsertion besitzen. Die Immunisierung von Mäusen mit zwei V3-Schleifen-Peptiden
des Stammes
HxBc2
(mit und ohne QR-Insertion) führte zu strikt QR-abhängigen anti-
V3-Schleifen-Antikörpern. Mittels Substitutionsvarianten innerhalb der QR-Insertion
der V3-Schleifen-Peptide konnte gezeigt werden, dass der Austausch von Arginin
durch Isoleucin das V3-Schleifen-Peptid dazu befähigt, an Antikörper mit einer
Selektivität für V3-Schleifen ohne QR-Insertion zu binden. Diese QI-Insertionenthaltenden Peptide könnten möglicherweise als potentielle Impfstoffe zur
Erzeugung von Antikörpern eingesetzt werden, welche sowohl Peptide mit als auch
ohne QR-Insertion erkennen könnten, und somit die Flucht von HIV-1 vor dem
Immunsystem durch Aminosäure-Insertionen in der V3-Schleifen-Spitze vorbeugen.
Als Hauptdeterminante des Tropismus wurde die V3-Schleife aus gp120 intensiv
untersucht. Trotzdem ist die Interaktion der V3-Schleife auf gp120 mit dem
Corezeptor (CCR5 oder CXCR4) sowohl aufgrund der großen Komplexität des
Spikes, als auch der Limitation der Studie membranständiger Proteine, wie zum
Beispiel dem Corezeptor, in in vitro Bindungsversuchen bis heute nicht gut
- 123 -
Zusammenfassung
verstanden.
Um
diesen
Problemen
entgegenzuwirken,
wurde
ein
CXCR4-
Corezeptormimetikum, genannt CX4-M1, in unserer Arbeitsgruppe entwickelt,
welches die drei extrazellulären Schleifen des Corezeptors präsentiert. Dieses Peptid
ist in der Lage, selektiv gp120 von CXCR4-verwendendem HIV-1 zu binden,
wohingegen
gp120
von
CCR5-verwendendem
HIV-1
nicht
erkannt
wurde.
Desweiteren konnte die Infektion von Zellen mit CXCR4-verwendendem HIV-1 durch
CX4-M1 inhibiert werden. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass
CX4-M1 nicht nur in der Lage ist, zwischen dem Tropismus des HIV-1 Hüllproteins
gp120 zu unterscheiden, sondern auch selektiv V3-Schleifen-Peptide von CXCR4verwendendem HIV-1 zu erkennen. Zusätzlich konnte in Infektionsversuchen gezeigt
werden, dass ein V3-Schleifen-Peptid eines CXCR4-verwendenden HIV-1 in der
Lage
ist,
der
Infektionsinhibition
durch
CX4-M1
entgegenzuwirken.
Mittels
Substitutionsvarianten sowohl dieses V3-Schleifen-Peptids als auch der zweiten
extrazellulären Schleife von CX4-M1 konnten die Bindungsstellen beider Peptide
füreinander auf der Basis individueller Aminosäuren charakterisiert werden, die
wichtig für deren Interaktion sind. Über die Erforschung der molekularen Details
dieser Interaktion hinaus zeigen die Ergebnisse eindeutig, dass Protein-ProteinInteraktionen durch Peptid-Peptid-Interaktionen imitiert werden können und damit als
Werkzeuge für zukünftige Analysen zur Verfügung stehen.
Peptide können demzufolge zur Aufklärung der molekularen Details des HIV-1Eintritts in die Zelle verwendet werden und haben das Potential, als neue
Medikamente und Impfstoffe zu dienen.
- 124 -
Summary
6. Summary
The human immunodeficiency virus (HIV-1), which is the causative agent of the
acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), enters its cells by utilizing its envelope
(spike) multiprotein complex. The spike is trimer composed of gp120 and gp41. For
fusion of HIV-1 with the host cell membrane, it interacts with its receptor (CD4) and a
coreceptor (CCR5 or CXCR4). These interactions are initiated by gp120 and result in
conformational changes inside of the spike that enable gp41 to mediate fusion of the
viral and host cell membranes. Despite intensive research, AIDS can not be cured
and causes more than 1.5 million deaths annually. Until today, a potent HIV-1
vaccine is still elusive. This is mainly due to intensive immune escape mechanisms
and shielding of potently neutralizing epitopes on the virus, which is challenging for
developing vaccines based on whole proteins or protein complexes (like the spike).
To overcome this problem, peptides as binding site mimetics are suitable tools.
Displaying only the CD4- or coreceptor-binding site of gp120 through peptides could
therefore not only improve our understanding of the molecular details on virus - host
cell interaction, but also display potent vaccines in the battle against HIV-1.
In this study, the molecular details of the interaction of one CD4-binding site mimetic
(CD4bs-M) as well as coreceptor-binding site mimetics (V3-loop peptides) were
analysed.
The previously published discontinuous binding site mimetic CD4bs-M had been
shown to compete with gp120 for binding to CD4. Interestingly, it could be shown in
the current study that CD4bs-M is able to bind to gp120 in direct ELISA. Furthermore,
it strongly enhanced HIV-1 infection of susceptible target cells. This effect could be
linked to the β20/β21-fragment of CD4bs-M, which is part of the bridging sheet of
gp120. Using different substitution variants, it could be shown that a defined sidechain orientation, peptide backbone and spatial orientation of this fragment is
necessary for the interaction with gp120 as well as the infection enhancement.
Moreover, CD4bs-M was able to trigger infection of CD4-negative HeLa cells with
HIV-1, leading to the hypothesis that the β20/β21-fragment of CD4bs-M adopts a
defined conformation while interacting with gp120, which in turn facilitates interaction
of gp120 with its coreceptors.
In HIV-1 infection, the primary humoral immune response is preferentially directed
against the V3-loop of gp120. Unfortunately, the generated antibodies have, in most
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Summary
cases, only a limited neutralizing capacity and can, therefore, be easily bypassed by
HIV-1 through immune escape mechanisms like single nucleotide polymorphisms
that cause an amino acid substitution or shielding of the corresponding epitopes.
Nevertheless, some broadly neutralizing anti-V3-loop antibodies have been isolated
from HIV-1 longterm non-progressors. Besides HIV-1 strains with amino acid
substitutions in their V3-loop sequence, HIV-1 strains with amino acid insertions in
the V3 loop are known. For example the HIV-1LAI strain, which HIV-1IIIB, HIV-1HxBc2
and HIV-1NL4.3 originate from, has a dipeptide insertion (QR insert) in the V3-loop tip.
In this study, it could be shown, using V3-loop peptides containing insertions and
deletions of this particular dipeptide, that most of the broadly neutralizing anti-V3-loop
antibodies are strictly dependent on V3-loops that do not contain this insert.
Immunisation of mice with two V3-loop peptides of strainHxBc2 (one with and one
without QR-insert) resulted in antibody responses that were strictly dependend on the
QR-insert. Using substitution analogs of the QR-insert in V3-loop peptides, it could
be demonstrated that substitution of arginine to isoleucine renders the V3-loop
capable at binding to the QR-dependent anti-V3-loop antibodies. V3-loop peptides
with QI-Insertion could possibly serve as potent vaccines to induce antibodies that
could recognize V3-loops with as well as without QR-insert and could thus be used to
avoid immune escape of HIV-1 through amino acid insertions in the V3-loop tip.
As the main determinant of coreceptor tropism, the V3-loop of gp120 had been
intensively studied. However, due to the high complexity of the spike, as well as the
barrier to study the membrane-bound coreceptors in in vitro assay systems like
ELISA, the interaction of the V3-loop with the corresponding coreceptor (CCR5 or
CXCR4) is not well understood. To overcome this problem, a CXCR4 coreceptor
mimetic peptide, called CX4-M1, was recently developed in our group that mimics the
three extracellular loops of the coreceptor. This mimetic is able to selectively bind
gp120 of CXCR4-using HIV-1, whereas gp120 of CCR5-using HIV-1 is not
recognized. Furthermore, CX4-M1 is able to inhibit HIV-1 infection of CXCR4-using
HIV-1. In this study, it could be shown that CX4-M1 not only discriminates between
gp120 of different tropism, but also selectively recognizes V3-loop peptides of
CXCR4-using HIV-1. In addition, it could be shown in infection assays that a V3-loop
peptide of CXCR4-using HIV-1 is able to counteract infection inhibition through CX4M1. Using substitution analogs of the V3-loop peptides as well as of the second
extracellular loop of CX4-M1, the binding sites of both peptides for each other could
- 126 -
Summary
be dissected on the level of individual amino acids. Beyond the exploration of the
molecular details of this interaction, these results clearly demonstrate the feasibility of
mimicking protein-protein interactions through peptide-peptide interactions.
Peptides are therefore valuable tools to dissect the molecular mechanism of HIV-1
entry into cells and have the potential to serve as new drugs and vaccines.
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- 141 -
Anhang
8. Anhang
Tab. S 1: Berechnete und mittels ESI-MS ermittelte Massen der CD4bs-M-Varianten.
a
Aminosäuren X-G-X als Platzhalter zwischen Biotin / Acetyl und S365 des CD4bl. b Aminosäure X als
Platzhalter zwischen Biotin und S365 des CD4bl. c kein Platzhalter zwischen Acetyl und S365 des
CD4bl.
[M+H]+
[M+2H]2+
[M+3H]3+
[M+4H]4+
[M+5H]5+
Peptid
Mberechnet
(g/mol)
Biotinylierte Peptide
CD4bs-Ma
3876.59
1292.9
670.1
776.3
ΔCD4bla
3020.89
1510.5
1007.5
756.1
605.0
Δβ20/β21a
2719.43
1360.2
907.3
680.8
545.3
Δβ23a
3163.04
1581.2
1055.0
791.4
633.7
CD4blb
1210.4
1212.8
β20/β21b
1511.6
1514.6
β23b
1068.4
1071.0
I424Aa
3834.51
1279.5
959.7
767.7
N425Aa
3833.56
1278.6
959.6
767.8
M426Aa
3816.47
1273.2
955.2
764.5
W427Aa
3761.45
1254.5
941.3
753.1
Q428Aa
3819.53
1274.7
955.8
764.8
E429Aa
3818.55
1274.1
955.7
764.6
V430Aa
3848.53
1283.6
963.5
770.7
G431Aa
3890.61
1297.9
973.8
779.2
K432Aa
3820.50
1274.2
955.8
764.7
D1a
3876.59
1292.9
970.3
776.4
D2a
3876.59
1292.8
970.2
776.5
W427Pa
3787.49
1263.3
947.8
758.9
Q428Pa
3845.57
1282.9
962.7
770.1
E429Pa
3844.58
1282.3
962.1
770.0
V430Pa
3874.57
1292.3
969.5
775.6
β20/β21scra 3876.59
1292.8
970.5
776.2
Acetylierte Peptide
CD4bs-M a
3692.33
1231.3
924.1
739.5
ΔCD4blc
2439.88
1220.3
813.9
611.0
Δβ20/β21c
2025.26
1013.4
676.0
Δβ23c
2468.90
1226.5
CD4blc
914.5
915.8
β20/β21c
1215.7
1216.4
609.0
β23c
772.4
773.5
I424Ac
3366.87
1684.3
1123.3
N425Ac
3365.93
1683.4
1122.7
842.5
M426Ac
3348.83
1675.1
1116.8
W427Ac
3293.82
1647.1
1098.7
824.2
Q428Ac
3351.90
1676.8
1117.9
839.0
E429Ac
3350.91
1676.1
1117.3
V430Ac
3380.90
1690.7
1127.5
846.2
G431Ac
3422.98
1711.8
1141.8
856.7
K432Ac
3351.86
1676.1
1117.9
838.6
D1a
3692.33
1231.4
924.2
739.5
D2a
3692.33
1231.5
924.1
739.5
W427Pa
3603.23
1202.2
901.9
721.9
Q428Pa
3661.31
1221.4
916.1
732.9
E429Pa
3660.32
1221.0
916.1
732.9
V430Pa
3690.31
1230.8
923.6
739.0
β20/β21scra 3692.33
1231.8
924.1
739.5
Freier N-Terminus
AH5-01
4019.54
1340.1
1005.6
805.0
- 142 -
Anhang
Tab. S 2: Berechnete und mittels MALDI-TOF MS ermittelte Massen der biotinylierten V3Schleifen-Peptide.
Peptid
V3IIIB
zyklisch
ΔQR
R311E
R311I
R311K
Q310A R311A
Q310q R311r
V3HxBc2
zyklisch
ΔQR
R311E
R311I
R311K
Q310A R311A
Q310q R311r
V3BAL
zyklisch
+QR
+QE
+QI
+QK
+AA
+qr
V3ADA
zyklisch
+QR
+QE
+QI
+QK
+AA
+qr
Immunogene
Ova-HxBc2
Ova-HxBc2 ΔQR
Mberechnet (g/mol)
[M + H]+
[M + 2H]2+
4600,5
4316,2
4573,5
4557,5
4572,5
4458,4
4600,6
4602,5
4316,8
4573,4
4559,5
4573,7
4459,6
4601,2
2301,5
2159,3
2287,7
2280,7
2287,7
2230,2
2301,0
4628,5
4344,2
4601,5
4585,5
4600,5
4486,4
4628,5
4628,7
4345,3
4602,2
4586,2
4601,5
4488,1
4629,2
2315,2
2173,3
2302,0
2294,1
2301,6
2244,5
2315,1
4371,0
4655,4
4628,3
4612,4
4627,4
4513,3
4655,4
4371,8
4654,8
4628,0
4611,8
4628,7
4513,9
4655,7
2185,8
2328,3
2315,0
2306,3
2314,8
2257,3
2328,4
4405,1
4689,4
4662,4
4646,4
4661,4
4547,3
4689,4
4405,3
4689,0
4661,7
4645,9
4662,5
4548,1
4690,2
2202,9
2345,3
2331,8
2323,3
2331,8
2274,5
2345,5
6200,2
5916,2
6202,8
5918,5
3101,0
2958,8
- 143 -
Anhang
Tab. S 3: Berechnete und mittels MALDI-TOF MS ermittelte Massen der fluoresceinylierten V3Schleifen-Peptide.
Peptid
Mberechnet (g/mol)
X4-trope V3-Schleifen-Peptide
IIIB
4732,6
HxBc2
4760,6
MN
4724,4
R5-trope V3-Schleifen-Peptide
BAL
4503,1
ADA
4537,1
Alanin-Substitution innerhalb von V3HxBc2
R306A
4675,4
I307A
4718,4
R308A
4675,4
I309A
4718,4
Q310A
4703,4
R311A
4675,4
G312A
4774,5
P313A
4734,5
G314A
4774,5
R315A
4675,4
F317A
4684,4
V318A
4732,4
T319A
4730,5
I320A
4718,4
G321A
4774,5
K322A
4703,4
I323A
4718,4
G324A
4774,5
N325A
4717,5
M326A
4700,4
[M + H]+
[M + 2H]2+
4733,5
4762,3
4724,0
2366,7
2381,0
2362,0
4504,1
4538,1
2252,5
2269,4
4676,1
4719,2
4676,3
4719,4
4707,6
4676,0
4775,1
4734,8
4774,9
4675,8
4684,8
4732,6
4730,7
4718,3
4774,4
4707,0
4722,2
4777,6
4721,2
4703,7
2338,5
2360,0
2338,8
2360,5
2352,9
2338,7
2388,4
2367,9
2387,5
2338,4
2342,9
2366,2
2365,8
2359,6
2388,0
2353,3
2360,8
2387,6
2360,3
2351,5
Tab. S 4: Berechnete und mittels ESI-MS ermittelte Massen der verkürzten fluoreceinylierten
V3-Schleifen-Peptide.
Peptid
Mberechnet
[M +
(g/mol)
H]+
Verkürzte Varianten von V3HxBc2
HxBc2 Turn
1585,7
1588,0
HxBc2 Turn/
2585,0
beta
HxBc2 Δbeta
3761,2
[M +
2H]2+
[M +
3H]3+
[M +
4H]4+
[M +
5H]5+
794,6
1292,7
530,4
862,5
397,7
647,4
517,8
1255,0
941,7
754,0
- 144 -
[M +
6H]6+
[M +
7H]7+
[M +
8H]8+
628,4
539,0
471,3
Anhang
Tab. S 5: Berechnete und mittels ESI-MS ermittelte Massen der CX4-M1-Varianten.
Peptid
Mberechnet
[M +
[M +
[M +
(g/mol)
H]+
2H]2+ 3H]3+
Corezeptormimetikum
CX4-M1 7136,3
Alanin-Substitution im ECL2 von CX4-M1
D182A
7092,4
R183A
7050,1
Y184A
7044,5
I185A
7094,2
D187A
7092,4
R188A
7050,1
F189A
7060,3
Y190A
7044,5
P191A
7110,3
N192A
7093,3
D193A
7092,4
L194A
7094,3
W195A
7021,2
V196A
7108,3
[M +
4H]4+
[M +
5H]5+
[M +
6H]6+
[M +
7H]7+
[M +
8H]8+
[M +
9H]9+
1785,7
1428,5
1190,7
1020,8
893,1
794,2
1773,6
1763,9
1762,5
1773,9
1419,8
1410,5
1410,0
1419,8
1418,8
1410,6
1413,1
1410,0
1422,9
1419,3
1418,9
1419,8
1405,0
1422,5
1183,2
1175,7
1174,9
1183,3
1182,2
1175,7
1177,6
1174,9
1186,1
1183,2
1182,7
1183,3
1171,2
1185,5
1014,1
887,5
1007,1
1014,4
1013,6
1007,8
1009,9
1007,4
1016,9
1014,2
1014,0
1014,5
1004,1
1016,2
881,7
887,8
1765,9
1762,1
1778,8
1774,5
1774,8
1756,3
1778,1
883,8
881,6
890,1
887,7
887,8
878,6
889,7
70
60
rlu x 10
3
50
infektiöses Virus
ohne Virus
UV-inaktiviertes Virus
40
30
20
10
0
mock
-
Δβ20/β21 CD4bs-M
Abb. S 1: Überinfektion der Zellkulturüberstände CD4-positiver HeLa-Zellen nach 3-4 Tagen auf
SEAP-Zellen.
CD4-positive HeLa-Zellen wurden für drei bis vier Tage mit HIV-1BR43IeG-nef+ in Ab- (-) und Anwesenheit
von CD4bs-M (10 µM) und dem Peptid Δβ20/β21 (10 µM) inkubiert und die Zellkulturüberstände
abgenommen. Anschließend wurden CEMx174 SEAP-Reporterzellen diesen Zellkulturüberstände
ausgesetzt, welche infektiöses oder UV-inaktiviertes HIV-1BR43IeG-nef+ enthielten. Dargestellt ist die
Aktivität der sezernierten alkalischen Phosphatase im CEMx174 SEAP-Reporterzell-Versuch,
gemessen in relativen Lichteinheiten (rlu) vier Tage nach der Passage der Zellkulturüberstände der
CD4-positiven HeLa-Zellen. Die Daten repräsentieren zwei separate Experimente.
- 145 -
Anhang
a)
1,5
500 nM
1,0
250 nM
A 492
125 nM
63 nM
31 nM
0,5
16 nM
0,0
IIIB
b)
HxBc2
BAL
ADA
1,5
500 nM
1,0
250 nM
A 492
125 nM
63 nM
31 nM
0,5
16 nM
0,0
IIIB ΔQR
HxBc2 ΔQR
BAL +QR
ADA +QR
Abb. S 2: Bindung von mAb 2191 an verschiedene V3-Schleifen-Peptide im Streptavidinbasierten ELISA.
Direkter Streptavidin-basierter ELISA der Bindung des mAb 2191 (2 nM) an V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und
V3ADA (a) und V3IIIB ΔQR, V3HxBc2 ΔQR, V3BAL +QR und V3ADA +QR (b) (500 nM bis 16 nM). Dargestellt ist die
Absorption bei 492 nM. Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
- 146 -
Anhang
a)
1,5
500 nM
1,0
250 nM
A 492
125 nM
63 nM
31 nM
0,5
16 nM
0,0
IIIB
b)
HxBc2
BAL
ADA
1,5
500 nM
1
250 nM
A 492
125 nM
63 nM
31 nM
0,5
16 nM
0
IIIB ΔQR
HxBc2 ΔQR
BAL +QR
ADA +QR
Abb. S 3: Bindung von mAb 2191 an verschiedene V3-Schleifen-Peptide im ELISA ohne
Streptavidin.
Direkter ELISA der Bindung des mAb 2191 (6,7 nM) an V3IIIB, V3HxBc2, V3BAL und V3ADA (a) und V3IIIB
ΔQR, V3HxBc2 ΔQR, V3BAL +QR und V3ADA +QR (b) (500nm bis 16 nM). Dargestellt ist die Absorption bei 492
nM. Die Messungen wurden im Duplikat durchgeführt.
- 147 -
Danksagung
9. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Jutta Eichler für die Möglichkeit, meine
Doktorarbeit in ihrer Arbeitsgruppe zu verfassen, für die freundliche Betreuung,
fachliche Diskussionen und hilfreiche Kritik und die Freiräume, die sie mir während
dieser Promotionsarbeit gewährte.
Desweiteren danke ich meiner Mentorin Frau Prof. Dr. Barbara Schmidt für
zahlreiche produktive Diskussionen und Hinweise, sowie im Besonderen für die
Kooperation und die Bereitstellung zahlreicher Daten aus Infektionsversuchen.
Meiner Mentorin Frau Dr. Dr. Heide Reil gilt mein Dank für anregende fachliche und
fachübergreifende Diskussionen.
Besonders danken möchte ich Katja Rödel, Norbert Donhauser und Christina
Haußner für die Durchführung zahlreicher Infektionsversuche.
Petra Wenzeler möchte ich für die vielen MALDI-TOF MS Messungen danken,
welche die Charakterisierung der V3-Schleifen-Peptide erst ermöglichten.
Meinen ehemaligen Kollegen Gerlinde Mühlhuber, Kalle Möbius und Monika Junge
danke ich für die Synthese von CX4-M1 und dessen Varianten sowie Barbara Kneidl
für die Synthese und Bindungsanalyse einiger CD4bs-M Varianten.
Zusätzlich danke ich allen ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern dieser
Arbeitsgruppe für produktive Diskussionen und nützliche fachliche Tipps.
Mein Dank gilt außerdem den Mitgliedern des GRK 1071 „Viren des Immunsystems“
für eine konstruktive Zusammenarbeit sowie dem GRK 1071 für die Finanzierung
und die Möglichkeit zur Teilnahme an Konferenzen und Workshops.
Ein extra Dankeschön geht an meinen Freund Sebastian, meine Eltern und meinen
Bruder, sowie Lena, Gerli und Marina, die immer für mich da waren und mich
während dieser Promotion immer unterstützt haben.
- 148 -
Eigene Publikationen und Vorträge
10. Eigene Publikationen und Vorträge
10.1. Eigene Publikationen
Erstautorschaft (eingereicht)
Groß, A., Möbius, K., Haußner, C., Donhauser, N., Schmidt, B.,
Eichler, J. “Mimicking protein-protein interactions through
peptide-peptide interactions: HIV-1 gp120 and CXCR4.“
eingereicht in Frontiers in Immunology (B cell biology)
Co-Autorschaft:
Webel, R., Solbak, SM., Held, C., Milbradt, J., Groß, A., Eichler, J.,
Wittenberg, T., Jardin, C., Sticht, H., Fossen, T.,
Marschall, M. "Nuclear import of isoforms of the
cytomegalovirus kinase pUL97 is mediated by differential
activity of NLS1 and NLS2 both acting through classical
importin-α binding." J Gen Virol. 93, no. 8 (2012).
Eissmann, K., Mueller, S., Sticht, H., Jung, S., Zou, P., Jiang, S., Groß,
A., Eichler, J., Fleckenstein, B., Reil, H. HIV-1 Fusion Is
Blocked through Binding of GB Virus C E2D Peptides to
the HIV-1 gp41 Disulfide Loop. PLOSone 8 (1), e54452,
2013.
DOI: 10.1371/journal.pone.0054452
10.2. Konferenzbeiträge
Vorträge
20.03.2013 11th German Peptide Symposium (München/Garching)
Exploring Binding Specificities of HIV-1 gp120 and CXCR4
through Peptide-Peptide Interactions
Posterpräsentationen
03.10.2012 6th Peptide Engineering Meeting (Atlanta, USA)
Exploring binding specificities of HIV-1 gp120 and CXCR4
through peptide-peptide interactions
- 149 -
Eigene Publikationen und Vorträge
14.06.2012 Symposium "Forty Years of Virology at the University of
Erlangen-Nuremberg" (Erlangen)
Assembled Peptides Mimicking the CD4 Binding Site of
gp120 Modulate HIV-1 Entry
07.03.2011 10th German Peptide Symposium (Berlin)
Dissecting the binding specificities of anti-HIV CD4 binding
site antibodies
16.10.2010 3rd international symposium: Regulators of Adaptive
Immunity (Erlangen)
Dissecting the binding specificities of CD4 binding site
antibodies
10.3. weitere wissenschaftliche Vorträge
11.03.2013 12th GRK1071 Retreat (Schlaifhausen)
Exploring Binding Specificities of HIV-1 gp120 and CXCR4
through Peptide-Peptide Interactions
02.03.2012 11th GRK1071 Retreat (Schlaifhausen)
Influence of gp120 Derived Peptides on HIV-1 Infection
23.05.2011 10th GRK1071 Retreat (Schlaifhausen)
Peptide-based epitope analysis of broadly neutralizing anti
HIV-1 Env antibodies
13.09.2010 9th GRK 1071 Retreat (Southborough, USA)
The Secret of Broadly Neutralizing CD4 Binding Site
(CD4bs) Antibodies
23.04.2010 8th GRK 1071 Retreat (Schlaifhausen)
Dissecting the HIV-1 gp120 binding specificities of CD4
and CD4bs antibodies
- 150 -