Experimentelle Untersuchungen zum Einfluss einer G

Tierärztliche Hochschule Hannover
Experimentelle Untersuchungen zum Einfluss einer G-CSFTherapie auf die Arrhythmogenese bei Herzinsuffizienz an
Langendorff- perfundierten isolierten Kaninchenherzen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Kati Dieks, geb. Hagemeister
aus Leipzig
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung:
1. Prof. Dr. Michael Fehr, Klinik für Kleintiere,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Prof. Dr. Lars Eckardt, Medizinische Klinik
und Poliklinik C (Kardiologie und
Angiologie), Universitätsklinikum Münster
1. Gutachter:
Prof. Dr. Michael Fehr
2. Gutachter:
Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
Tag der mündlichen Prüfung:
20.05.2009
Meinem Mann, Holger Dieks
Meinem Sohn, Jonatan Robert Dieks
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung .............................................................................................................. 9
2. Literaturübersicht ............................................................................................... 11
2.1 Anatomie und Physiologie des Kaninchenherzens ......................................... 11
2.1.1 Anatomie des Kaninchenherzens ............................................................. 11
2.1.2 Elektrophysiologische Grundlagen des Aktionspotentials der
Herzmuskelzelle ................................................................................................ 12
2.2 Pathophysiologie der Repolarisation............................................................... 15
2.2.1 Elektrische Heterogenität des Kammermyokards..................................... 15
2.2.2 Frühe Nachdepolarisationen, induzierte getriggerte Aktivität und Re-entry
.......................................................................................................................... 18
2.2.3 Torsade de Pointes .................................................................................. 21
2.2.4 Angeborenes und erworbenes langes QT-Syndrom (LQTS).................... 23
2.3 Die chronische Herzinsuffizienz ...................................................................... 26
2.3.1 Arrhythmogenese bei Herzinsuffizienz ..................................................... 28
2.3.2 Der plötzliche Herztod .............................................................................. 30
2.4 Einfluss von Erythromycin auf die Repolarisation ........................................... 33
2.5 G-CSF und der Einfluss von Stammzellen am Herzen ................................... 36
2.5.1 Struktur des G-CSF .................................................................................. 37
2.5.2 Stammzelltherapie bei der Herzinsuffizienz.............................................. 37
2.5.3 Kardiale Connexine .................................................................................. 45
2.6 Der Langendorff- Versuch............................................................................... 46
2.6.1 Ein geschichtlicher Überblick.................................................................... 47
2.6.2 Die historische Langendorff-Anlage.......................................................... 48
2.6.3 Die Perfusionslösung................................................................................ 49
3. Material und Methode........................................................................................ 50
3.1 Versuchstiergut ............................................................................................... 50
3.2 Schrittmacherimplantation............................................................................... 51
3.2.1 Operationsvorbereitung ............................................................................ 51
3.2.2 Operation.................................................................................................. 52
3.3 Stimulation ...................................................................................................... 56
3.3.1 Anschließen des externen Schrittmachers ............................................... 56
3.3.2 Intensivierung der Stimulation .................................................................. 57
3.4 Klinische Untersuchung der Tiere ................................................................... 58
3.5 G-CSF Applikation .......................................................................................... 58
3.6 Echokardiographie .......................................................................................... 59
3.7 Der Langendorff-Versuch................................................................................ 62
3.7.1 Präparation des isolierten Kaninchenherzens .......................................... 62
3.7.2 Versuchsaufbau........................................................................................ 64
3.7.3 Versuchsprotokoll bzw. Versuchsdurchführung........................................ 70
3.7.4 Auswertung .............................................................................................. 75
3.8 Statistik ........................................................................................................... 77
4. Ergebnisse .......................................................................................................... 78
4.1 Erzeugung einer signifikanten Herzinsuffizienz............................................... 78
4.2 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die myokardiale Repolarisation ................... 80
4.2.1 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die QT-Zeit............................................ 84
4.2.2 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die Dispersion der Repolarisation ......... 85
4.3 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die myokardiale Refraktärzeit...................... 89
4.4 Einfluss der Herzinsuffizienz und des Zytokins G-CSF auf das Entstehen von
Kammerflimmern................................................................................................... 90
4.5 Einfluss des Zytokins G-CSF bei Herzinsuffizienz auf die myokardiale
Repolarisation ....................................................................................................... 92
4.5.1 Einfluss des Zytokins G-CSF bei Herzinsuffizienz auf die QT-Zeit ........... 97
4.6 Einfluss des Zytokins G-CSF auf die myokardiale Refraktärzeit ..................... 99
4.7 Einfluss des Zytokins „G-CSF“ auf die Entstehung von Torsade de Pointes bei
Herzinsuffizienz................................................................................................... 100
5. Diskussion ........................................................................................................ 103
5.1 Arrhythmogenese bei chronischer Herzinsuffizienz und dem langen-QTSyndrom.............................................................................................................. 104
5.1.1 Repolarisationsreserve........................................................................... 106
5.1.2 Spatiale und temporale Dispersion......................................................... 108
5.2 Einfluss von G-CSF auf die Arrhythmogenese bei chronischer Herzinsuffizienz
............................................................................................................................ 109
5.3 Grenzen der Methode ................................................................................... 112
5.4 Ein Ausblick .................................................................................................. 113
6. Zusammenfassung ........................................................................................... 116
7. Summary ........................................................................................................... 118
8. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 120
9. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 139
10. Danksagung .................................................................................................... 140
9
1. Einleitung
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1. Einleitung
Deutschlandweit steigt die Zahl der Kleintierhalter seit 2001 kontinuierlich an [1].
Besonders die vermeintlich leichter zu haltenden Heimtiere nehmen in den letzten
Jahren zu. Bestätigt wird das durch einen nicht zu vernachlässigenden Anteil an
Heimtieren
am
Patientengut
einer
Tierarztpraxis.
Damit
steigt
auch
die
Wahrscheinlichkeit für den Tierarzt, neben den häufig vorkommenden Erkrankungen
der Zähne, des Verdauungs-, Harn- und des Geschlechtsapparats beim Kaninchen,
auf Erkrankungen zu stoßen, deren Ursachen im Bereich des Herzkreislaufsystems
zu suchen sind. Aufgrund des hohen Informationsgehaltes aus den Medien und dem
Internet steigt das Bedürfnis der Patientenbesitzer nach qualifizierter tierärztlicher
Betreuung.
In der humanmedizinischen Forschung werden Kaninchen schon seit Jahrzehnten
erfolgreich als Tiermodell bei der Erforschung verschiedener Herzerkrankungen
eingesetzt
[2].
Neben
Untersuchungen
zur
Myokardischämie
[3],
zum
Herzinfarktmodell [4] und zu Klappenfehlern [5], sind vor allem Untersuchungen zur
induzierten
Herzinsuffizienz
am
Kaninchenherzen
Bestandteil
intensiver
Forschungsbemühungen [6]. Hier hat sich am Universitätsklinikum Münster das
Herzinsuffizienzmodell durch schnelle Schrittmacherstimulation etabliert. Dabei wird
die Entwicklung der Herzinsuffizienz durch klinische Untersuchung und serielle Mmode-Echokardiographie beurteilt. Anschließend werden die Herzen explantiert und
an einer Langendorff- Anlage elektrophysiologisch untersucht.
Vor dem Hintergrund steigender Fälle von chronischer Herzinsuffizienz beim
Menschen besteht hier ein großer Forschungsbedarf. Der plötzliche Herztod ist dabei
ein häufiges Ereignis, das jedes Jahr etwa 100000 Todesopfer in Deutschland fordert
[7]. In vielen dieser Todesfälle sind ventrikuläre Tachyarrhythmien bei bestehender
chronischer Herzinsuffizienz dafür verantwortlich. Unabhängig vom plötzlichen
Herztod führt die chronische Herzinsuffizienz neben einem gehäuften Auftreten von
10
1. Einleitung
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Vorhofflimmern auch zu einer deutlichen Einschränkung der Lebensqualität und laut
Framingham-Studie [8] zu einer 5-Jahres Überlebensrate von unter 40 %. Außerdem
sei bei einem Patientenkollektiv mit Herzinsuffizienz die Sterblichkeitsrate sechs bis
sieben Mal höher als in der Normalbevölkerung [8].
Im Gegensatz zu den Mechanismen der Pathogenese von Herzrhythmusstörungen
bei bestehender koronarer Herzkrankheit mit durchgemachtem Herzinfarkt sind die
pathophysiologischen
Grundlagen
der
Entstehung
von
Arrhythmien
bei
Herzinsuffizienz und deren adäquate Behandlung weit weniger bekannt. Da die
Untersuchung der elektrophysiologischen und hämodynamischen Vorgänge im
Rahmen einer chronischen Herzinsuffizienz, sowie der ihr zugrunde liegenden
Arrhythmiemechanismen
sowohl
Veterinärmedizin
grundlegender
von
für
die
Humanmedizin,
Bedeutung
sind,
als
auch
für
entstand
die
diese
Promotionsarbeit als Kooperation zwischen der Kleintierklinik der Tierärztlichen
Hochschule
Hannover
und
der
Medizinischen
Klinik
C
(Kardiologie)
des
Universitätsklinikum Münster. Da wesentliche elektrophysiologische Charakteristika
des Herzmuskelgewebes beim Kaninchen auch auf das Myokard des Menschen
zutreffen [9, 10], sind die Ergebnisse dieser Arbeit sowohl für die Veterinär- als auch
für die Humanmedizin zu interpretieren.
Ziel dieser Arbeit ist es, neue Erkenntnisse hinsichtlich der pathophysiologischen
Mechanismen
der
elektrophysiologischen
Veränderungen
und
der
daraus
entstehenden Arrhythmien bei der chronischen Herzinsuffizienz zu gewinnen. Dies
soll als Grundlage für die Weiter- und Neuentwicklung von Behandlungsstrategien
dienen und eventuell neue therapeutische Ansätze bei der Behandlung der
Herzinsuffizienz aufzeigen.
Da erste Ergebnisse einer Studie aus Münster beim Herzinfarktmodell mit dem
Stammzellpräparat G-CSF positive Effekte auf die Herzfunktion zeigten [11], soll in
dieser Arbeit festgestellt werden, ob sich auch beim Modell der chronischen
Herzinsuffizienz die positiven Auswirkungen auf die Herzfunktionen durch eine
Behandlung mit G-CSF bestätigen lassen.
11
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2. Literaturübersicht
2.1 Anatomie und Physiologie des Kaninchenherzens
2.1.1 Anatomie des Kaninchenherzens
Das Herz des Kaninchens ist wie beim Menschen kegelförmig und sitzt umgeben von
einem dünnen Herzbeutel der ventralen Brustwand breitflächig auf. Die Herzspitze ist
links des Sternums im Bereich des dritten Intercostalraums gelegen. Das
Kaninchenherz liegt vergleichsweise weit kranial, der rechte Ventrikel reicht dabei
weit nach dorsal. Im blutleeren Zustand liegt das Herzgewicht ca. bei 0,4 % des
Körpergewichtes
[12].
Auch
die
vier
Herzklappen
des
Kaninchens
sind
Endokardduplikaturen und dem Herzskelett angeheftet. Durch die Segelklappen
werden die Vorhöfe von den Herzkammern getrennt. Die linke Atrioventrikularklappe
ist zweizipflig (Valva mitralis), die rechte dreizipflig (Valva trikuspidalis) [13]. Durch
die sehnigen Chordae tendineae sind die freien Ränder der Klappensegel mit den
Papillarmuskeln verbunden [14]. Im Vergleich zu den Ventrikeln sind die Vorhöfe
dünnwandig. Die Taschenklappen, aus je drei Semilunarklappen bestehend, sitzen
am Ursprung der Aorta und des Truncus pulmonalis. Die Wand der Pulmonalarterie
ist dicker als bei anderen Tierarten, die kollaterale Blutgefäßversorgung des
Myokards hingegen ist vergleichsweise geringer [15]. Daraus resultiert nach Huston
[15] eine Prädisposition zur Ischämie mit Tod durch Anaphylaxie, verursacht durch
pulmonale Hypertension, Konstriktion der Pulmonalarterie und folgender Dilatation
des rechten Herzens.
Nach Donally [16] liegt die physiologische Herzfrequenz beim Kaninchen zwischen
180- 200 Schlägen pro Minute, die Atemfrequenz zwischen 30-60 Atemzügen pro
Minute und die Körpertemperatur liegt bei 38,5-40 °C.
12
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.1.2 Elektrophysiologische Grundlagen des Aktionspotentials der
Herzmuskelzelle
Das Herz ist ein Organ mit autonomer Reizbildung im Reizbildungs- und
Erregungsleitungssystem des Myokards. Die Herzmuskelzellen dieses Systems
(bestehend aus Sinusknoten, AV-Knoten, His-Bündel, den Tawara-Schenkeln und
den Purkinjefasern) besitzen die Fähigkeit zu spontaner Reizbildung, weshalb das
Herz auch außerhalb des Körpers bei entsprechender Versorgung weiter schlägt
[17].
Durch
Doppelmembranen,
den
so
genannten
Glanzstreifen,
einer
Diphospholipidschicht, die mit unzähligen elektrisch leitenden Ionenkanälen bestückt
ist, sind die einzelnen Herzmuskelzellen voneinander abgegrenzt, aber elektrisch
leitend miteinander verbunden (funktionelles Syncytium) [17]. Jeder Herzschlag wird
durch ein Aktionspotential ausgelöst. Das Aktionspotential ist das Ergebnis
verschiedener ein- und auswärts fließender Ionenströme an aufeinanderfolgenden
Zeitpunkten durch transmembranäre porenbildende Kanalproteine [18].
Abb. 1: Ionenkanäle und die auf molekularer Basis verantwortlichen Gene; Schematische
Darstellung des zeitlichen Verlaufs des kardialen Aktionspotentials; mod. nach [24].
13
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Die verschiedenen Ionenkanäle besitzen dabei eine unterschiedliche Selektivität für
die beteiligten einzelnen Ionen.
Das Aktionspotential (AP) des Herzens unterscheidet sich wesentlich durch seine
Länge von ca. 300 ms,
von dem der Skelettmuskelzelle, welches nur wenige
Millisekunden (ms) dauert [19]. Das lange AP des Herzens ist notwendig, um die
Kontraktion zu kontrollieren und das Herz vor frühzeitiger Kontraktion und daraus
resultierender
Tetanie
zu
schützen.
Keating
und
Sanguinetti
teilen
das
Aktionspotential des Herzens in fünf Phasen ein (0-4) [20]. Phase 0 repräsentiert die
Depolarisation der Myozyten. Diese Phase wird durch die rasche Öffnung bzw.
Aktivierung der spannungs- und zeitgesteuerten Na+-Kanäle initialisiert und führt zu
einem massiven Na-Ionen- Einstrom [21].
Fast zeitgleich werden die ebenfalls spannungs- und zeitgesteuerten Ca-Kanäle
aktiviert. Dabei werden vor allem die L-Typ (long-lasting) und die T-Typ (high
threshold oder tiny [22]) Ca-Kanäle unterschieden. Die L-Kalziumkanäle haben zum
einen die Aufgabe, die Depolarisation zu verstärken und so das lange
Aktionspotential des Herzens zu erhalten, und zum anderen direkt zu einer CaFreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum zu führen [18, 21]. Sie tragen
auf diese Weise zum Plateau des Aktionspotentials bei.
Phase 1 des Aktionspotentials ereignet sich direkt nach dem Peak der Depolarisation
und kann als kurze Repolarisation an der Zellmembran wahrgenommen werden
(„notch“). Diese initiale Repolarisation entsteht durch das Schließen der NatriumKanäle und durch den spannungsabhängig inaktivierbaren Kaliumkanal im Herzen It0
[23]. Dieser Kanal ist für die frühe Repolarisation des AP und die Überleitung in die
Plateauphase verantwortlich [23]. Dieser transiente auswärtsgerichtete Strom ist
nicht gleichmäßig über den Herzmuskel verteilt. Er ist endokardial deutlich geringer,
was das Ausbleiben einer prominenten Einkerbung im endokardial abgeleiteten
Aktionspotential erklärt [24].
Phase 2 des Aktionspotentials ist die so genannte Plateauphase, bei der die
Nettoladungsverschiebung fast gleich null ist. Sie wird durch einen Na+/Ca2+Austauscher (Nettokationeneinstrom in Form von Na+) und einen kompensatorischen
Kaliumausstrom gebildet [25]. In dieser Phase ist das Herz refraktär, das heißt also,
14
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
nicht durch einen Reiz erregbar. Bereits geringe Veränderungen des Ionenstroms in
dieser
Phase
können
zu
deutlichen
Auswirkungen
auf
den
Verlauf
des
Aktionspotentials führen [20].
In
der
Phase
3
der
Repolarisation
bestimmen
auswärtsgerichtete
spannungsabhängige Kaliumströme das Aktionspotential maßgeblich [26]. Boyett et
al. beschreiben 17 verschiedene Kaliumströme [21]. Dabei spielt für die
Repolarisation der verzögerte Gleichrichterstrom IK mit seiner schnell (rapid=r)
aktivierenden IKr und seiner langsam (slow=s) aktivierenden Komponente IKs eine
entscheidende Rolle [27]. Beide Ströme sind im Myokard mit einer unterschiedlichen
Dichte (Heterogenität von IKs:IKr ) verteilt, was das Aktionspotential stark beeinflussen
kann [28, 29]. Sowohl beim Menschen, wie auch beim Kaninchen wird IKs deutlich
geringer exprimiert als IKr [30]. Aufgrund dieser Tatsache hängt die Repolarisation
mehr von IKr ab und reagiert daher sensitiver auf eine Blockade dieses Kanals [31].
Die Kanaleinheit des IKr Kanals wird durch das HERG- Gen kodiert [32], genetische
Defekte dieser Kanaleinheit sind verbunden mit dem kongenitalen (LQT2 und LQT6)
und dem erworbenen langen QT-Syndrom (LQTS) [33, 34]. Die Leitfähigkeit von IKr
nimmt mit der Membrandepolarisation ab, die Aktivierung steigt jedoch mit
zunehmender Repolarisation, so dass vor allem die terminale Phase 3 wesentlich
von IKr bestimmt wird [33]. Die unterschiedliche Verteilung der repolarisierenden
Ionenkanäle im Myokard [35] führt auch zu deutlichen Aktionspotentialunterschieden
bei den verschiedenen Spezies. So hat die Maus ein kurzes Aktionspotential,
während das von Kaninchen und Mensch aufgrund einer deutlich ausgeprägteren
Plateauphase sehr ähnlich ist. Das Kaninchen ist aus diesem Grunde besonders für
unser Modell geeignet.
Die Repolarisationsphase wird also wesentlich von Kaliumionenströmen bestimmt
und ist Ansatzpunkt vieler Antiarrhythmika, aber auch von nicht kardiovaskulären
Medikamenten [36].
15
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Abb. 2: Die an der Repolarisation beteiligten Kaliumkanäle [23]
Die Phase 4 des Aktionspotentials wird auch als Ruhepotential bezeichnet, wobei
das Membranpotential wieder zu seiner Ausgangslage um -85 mV zurückkehrt [20].
Der
einwärtsgerichtete
Kaliumgleichrichterstrom
IK1
bestimmt
dabei
das
Membranruhepotential wesentlich [37]. Der Kanal wird erst gegen Ende der
Repolarisationsphase permeabel und ist während des Aktionspotentials inaktiviert.
Diese Ruhephase repräsentiert die Diastole der Ventrikel.
2.2 Pathophysiologie der Repolarisation
2.2.1 Elektrische Heterogenität des Kammermyokards
Da im Gegensatz zu den depolarisierenden Ionenkanälen, die homogen im Myokard
verteilt sind, die an der Repolarisation beteiligten Kanäle, wie bereits erwähnt,
heterogen im Herzen verteilt sind, kann das zu erheblichen Differenzen in der
Erregungsrückbildung führen. Ursache kann aber auch eine unterschiedliche
Verteilung von Gap-Junctions zwischen aneinander grenzenden Myozyten oder das
übermäßige Vorhandensein von Fibroblasten sein [38]. Ein erniedrigter pH-Wert,
Ca2+-Überladung der Myokardzelle, Zunahme von Na+, Verlust von ATP oder
Hypoxie können die Leitfähigkeit von Ionenkanälen in den Gap-Junctions reduzieren
16
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
und
eine
Entkopplung
bewirken.
Dies
hat
eine
Abnahme
der
Erregungsleitungsgeschwindigkeit, sowie einen Anstieg der Dispersion, also der
lokalen Inhomogenität der AP-Dauer, zur Folge [39]. Antzelevitch [40] beschreibt,
dass das Myokard aus drei elektrophysiologisch und funktionell unterschiedlichen
Zelltypen zusammengesetzt ist. Es gibt sowohl eigene Repolarisationsprofile von
epikardialen, endokardialen und midmyokardialen Zellen (M-Zellen), wie auch von
links und rechtsventrikulären Ableitungen [38], was wesentlich zur elektrischen
Heterogenität des Kammermyokards beiträgt. Sicouri und Antzelevitch konnten
experimentell zeigen, dass unter Bradykardie die Aktionspotentialdauer (APD) bei MZellen deutlich länger als in epi- oder endokardialen Zellen ist [41]. Das liegt auch
daran, dass die beiden Kaliumkanäle, die bedeutend für die Repolarisation des
Aktionspotentials sind (IKs und IKr), in den M-Zellen gegenüber anderen Myozyten
deutlich reduziert sind (vor allem IKs fast halbiert), während die Zahl der für die
Depolarisation vor allem verantwortlichen Na+-Kanäle (late-INa) und Na+-Ca2+Austauscher (INa-Ca) doppelt so hoch wie im Epikard sind [40, 42]. Weiterhin
unterscheiden sich die Zelltypen dadurch, dass epi- und midmyokardiale Zellen, nicht
aber die endokardialen Zellen eine prominente Phase 1 mit deutlichem „notch“
infolge der sensitiven auswärtsgerichteten Ionenströme It0 aufweisen [43, 44].
Während M-Zellen histologisch den epi- und endokardialen Zellen ähneln, sind sie
elektrophysiologisch und pharmakologisch Hybride zwischen Purkinjefasern und
Ventrikelzellen. Wie auch die Purkinjefasern zeigen M-Zellen eine deutliche APDVerlängerung und die Entstehung von frühen Nachdepolarisationen (EADs) als
Antwort auf IKr-Blocker, während epi- und endokardiale Zellen dies nicht zeigen. Im
Gegensatz zu den Purkinjefasern weisen M-Zellen ebenso wie epi- und endokardiale
Zellen eine APD-Verlängerung infolge von IKs-Blockade auf [40]. Yan und Shimizu
konnten zeigen, dass die M-Zellen mit dem längsten Aktionspotential im tiefen
Subendokard der linken Kammervorderwand beim Kaninchen gelegen sind [45].
Messbare Abweichungen bei der Repolarisation (die Differenz zwischen kürzestem
und längstem Aktionspotential = Synchronisation der zellulären Repolarisation in den
verschiedenen Regionen des Herzens), die durch verschiedene Einflüsse in der
Repolarisationsphase entstehen können (z.B. Blockierung von IKr), nennt man auch
17
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
die Dispersion der Repolarisation in der untersuchten Region. Diese lässt sich auf
der Herzoberfläche, also epikardial messen (Unterschiede rechtes/ linkes Herz, bzw.
basal/apikal), wie auch von außen nach innen durch das Myokard hindurch, also
transmural.
Transmurale und apiko-basale Heterogenität der Repolarisation im Ventrikelmyokard
wird für die im EKG messbare T-Welle verantwortlich gemacht [24]. Die komplette
Repolarisation des APs des Epikards stimmt mit dem Peak der T-Welle und die
Repolarisation der M-Zellen stimmt mit dem Ende der T-Welle überein. Das Intervall
zwischen Peak und Ende der T-Welle (TPeak- TEnde) scheint ein Index für die
transmurale Dispersion der Repolarisation zu sein und prognostischen Wert für
proarrhythmisches Risiko zu haben [24, 43, 46, 47].
Einen weiteren und wertvollen prognostischen Marker stellt die „beat-to-beat“
Variabilität der Repolarisation (BVR) dar. Die BVR ist ein Maß für die zeitliche
Dispersion
[48],
wobei
die
Variation
der
Repolarisation
mehrerer
aufeinanderfolgender Schläge verglichen wird [49]. In einem Modell mit Hunden mit
chronischem AV-Block konnte gezeigt werden, dass das Auftreten medikamenteninduzierter TdPs mit dem Anstieg der BVR der linken endokardialen MAP-Dauer
korreliert. Auch wurde bei Hunden, die später dem plötzlichen Herztod (PHT)
erlagen, gegenüber Kontrollhunden eine deutlich erhöhte BVR gemessen. Die QTZeiten und MAP-Dauern zeigten hingegen keinen Unterschied zwischen den beiden
Gruppen [50]. Neben der Identifikation von Risikopatienten kann mittels der BVR
auch das proarrhythmische Potential von Medikamenten bewertet werden [51].
In einer klinischen Studie an Patienten mit vorberichtlichen medikamenteninduzierten Torsade de Pointes (TdPs) konnte die BVR des QT-Intervalls als nichtinvasiver wertvoller Marker identifiziert werden [52].
Folglich kann die BVR sowohl benutzt werden, um Patienten mit einem Risiko für
ventrikuläre Tachykardien zu identifizieren, als auch das proarrhythmische Potential
von Medikamenten einzuschätzen.
18
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.2.2 Frühe Nachdepolarisationen, induzierte getriggerte Aktivität
und Re-entry
Frühe Nachdepolarisationen (early afterdepolarisations=EAD) sind pathologische
Depolarisationen, die auftreten, bevor die Repolarisation der Herzmuskelzelle
vollständig abgeschlossen ist. Eine solche Nachdepolarisation ist begründet in
Schwankungen des transmembranären Potentials. Ein neues Aktionspotential (AP)
wird dann ausgelöst, wenn ein kritisches Schwellenpotential für die Aktivierung eines
depolarisierenden Ionenflusses erreicht ist [53]. Es haben sich zwei Typen von
Nachdepolarisationen hervorgetan. Die verspäteten (delayed afterdepolarisations
(DADs)) und die eigentlichen frühen Nachdepolarisationen (EADs). Während DADs
definiert wurden als Schwankung des Membranpotentials, welche nach der
Repolarisation des Aktionspotentials auftritt, also während der Phase 4, sind EADs
definiert als Schwankungen während der Plateauphase
des Membranpotentials
(Phase 2, -30 mV) oder etwas später während der Repolarisation des
Aktionspotentials (Phase 3, -60 mV) [53]. Mittlerweile weiß man, dass EADs und
DADs nicht demselben Mechanismus folgen, wie noch von Priori und Corr [54]
angenommen.
Hypokaliämie, Hypomagnesämie, langsame Herzfrequenz sowie Katecholamine
begünstigen das Auftreten von EADs.
EADs entstehen durch Veränderungen der normalen Repolarisation, also einem
Ungleichgewicht zwischen extra- und intrazellulären Ionenströmen. Für das
Manifestieren von EAD- induzierter getriggerter Aktivität [56], die nicht direkt durch
externe Stimulation entsteht, sind jedoch mehrere Faktoren verantwortlich. Zunächst
eine kritische Verlängerung der Repolarisationsphase, welche entsteht, wenn
einwärtsgerichtete
depolarisierende
Ströme
die
auswärtsgerichteten
repolarisierenden Ströme übersteigen. Diese so genannte Konditionierungsphase
bewegt sich in einem Spannungsbereich um -35 mV, die zu einer Reaktivierung der
L-Typ Ca2+-Ströme führt, welche eine wesentliche Rolle bei der nun folgenden
Depolarisation spielen [55, 57].
19
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
I
II
III
aVR
aVL
aVF
MAP LV post.
MAP RV post.
MAP RV ant.
MAP RV ant.
MAP LV ant.
MAP LV lat.
MAP LV post.
MAP LV endo.
Abb. 3: Typisches Beispiel für EADs in einem Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen
während Hypokaliämie und 150 M Erythromycin.
Durch
die
Reaktivierung
sarkoplasmatischen
von
Retikulum
ICa-L,
einer
Ca2+
und
einer
Aktivierung
Freisetzung
der
aus
dem
transienten
einwärtsgerichteten Ionenströme kommt es zu einer Zunahme positiver Ionen im
Zellinneren [55]. Ein Netto-Depolarisationsstrom [56,57] wird aber auch durch eine
Blockade der auswärtsgerichteten repolarisierenden K- Ströme (IK , It0) begünstigt
[58]. In dieser labilen Phase kann bei Vorliegen des geeigneten Substrats, zum
Beispiel erhöhter Dispersion der Repolarisation mit heterogenen Refraktärzeiten, ein
passender Trigger wie zum Beispiel eine vorzeitige ektope Erregung, eine frühe
Nachdepolarisation auslösen. Diese kann nach dem Auftreten beendet sein, oder
aber der erste Schlag einer Torsade de Pointes sein.
Eine von EADs gestartete Tachykardie kann durch Ausbildung eines Re-entryKreises aufrechterhalten werden. Re-entry-Kreise stellen die häufigste Ursache für
das
Auftreten
von
supraventrikulären
und
ventrikulären
Tachykardien
dar.
Physiologisch ist das Myokard durch die Refraktärzeit der Zellen vor einer
Wiedererregung geschützt. Ein Re-entry tritt dann auf, wenn der sich ausbreitende
Impuls nicht stoppt, weil die aktivierende Front immer wieder auf erregbares
20
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Herzgewebe trifft [59]. Bedingung für solches Re-entry ist ein initialer Trigger, dessen
Erregungsfront auf eine unidirektionale Blockade trifft, die Aktivierungsfront aber
fähig ist, diese Blockade zu umgehen. Ursachen für den unidirektionalen Block
können Änderungen der passiven Membraneigenschaften sowie eine Abnahme der
Erregbarkeit sein. Von besonderer Bedeutung sind in diesem Zusammenhang die
Gap-junctions zwischen den Herzmuskelzellen. Eine Azidose, eine Ca
2+
-Überladung
der Myokardzelle, eine Zunahme von Na+ sowie der Verlust von Adenosintriphosphat
(ATP) oder Hypoxie können die Leitfähigkeit von Ionenkanälen in den Gap-junctions
reduzieren und eine Entkopplung bewirken. Dies hat eine Abnahme der
Erregungsleitungsgeschwindigkeit sowie einen Anstieg der Dispersion, also der
lokalen Inhomogenität der AP-Dauer, zur Folge [59].
Die Erregungswelle kann jedoch nur zirkulieren, wenn die Wellenlänge (das Produkt
aus Fortleitungsgeschwindigkeit und der effektiven Refraktärzeit des am Re-entry
beteiligten Gewebes) kürzer ist, als die Strecke, die die Welle zurücklegen soll oder
aber die Fortleitungsgeschwindigkeit so verlangsamt ist, dass die Erregungswelle
immer wieder auf bereits erregbares Gewebe trifft [59, 60].
Eine Verlängerung der Aktionspotentialdauer und damit der Repolarisation wird in
Bezug auf Re-entry als antiarrhythmisch bewertet. Diese Verlängerung des
Aktionspotentials ist auch das Wirkprinzip von Klasse III- Antiarrhythmika [61].
Abb. 4: Schematische Darstellung des Re-entry.
21
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.2.3 Torsade de Pointes
Torsade de Pointes (TdPs) sind lebensbedrohliche polymorphe Arrhythmien, die zum
plötzlichen Herztod führen können. Der exakte elektrophysiologische Mechanismus
der Entstehung von TdPs im Zusammenhang mit dem Long QT-Syndrom ist noch
immer
nicht
vollständig
geklärt.
So
wird
die
QT-Verlängerung
als
Grundvoraussetzung, das Auftreten von EADs als Trigger oder Auslöser und Reentry infolge Verlängerung der Dispersion der Repolarisation als Substrat für die
Induktion und Aufrechterhaltung von polymorphen Arrhythmien angesehen [62,63].
Einige Studien haben gezeigt, dass die Messung der QT-Dispersion bessere
Informationen für das Risiko von TdPs gibt als die Messung der QT-Länge allein [64].
Abb. 5: Zur Veranschaulichung dargestelltes Haarband und EKG mit Torsade de Pointes.
Symptome für TdPs reichen von heftigem Herzklopfen über Synkopen bis hin zum
Herzstillstand und sind abhängig von der Dauer der TdPs. Normalerweise
terminieren TdPs spontan, sie können aber bei längerer Dauer auch in
22
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Kammerflimmern degenerieren [64]. Sie sind dabei mindestens 6 Schläge lang und
weisen im Oberflächen EKG eine charakteristische Umkehr der QRS-Komplexe
(Spitzenumkehrtachykardie) auf [65]. Unter bestimmten Voraussetzungen wirkt eine
Verlängerung der Repolarisation, wie unter 2.2.2 beschrieben, proarrhythmisch. Die
häufigsten proarrhythmischen Effekte wurden von primär nicht kardiovaskulär
wirksamen Medikamenten wie z.B. einigen Makrolidantibiotika [127], Antihistaminika
[89] sowie einigen antiarrhythmisch wirksamen Medikamenten beschrieben, vor
allem dann, wenn sie IKr blockieren [34, 66]. Die Gesamtinzidenz von TdPs bei
Patienten, die einen IKr Blocker nehmen, liegt jedoch unter 3 % [34]. Zum einen, weil
sie nicht alle das gleiche proarrhythmische Potential besitzen, zum anderen, gibt es
eine Reihe weiterer Faktoren, die beim Auftreten von Torsade de Pointes eine Rolle
spielen [34]. So sah Zwillinger bereits 1935 einen Zusammenhang zwischen
niedrigem Serum-Magnesium und polymorphen ventrikulären Arrhythmien [67], und
auch heute werden TdPs unter anderem mit Magnesiuminfusionen therapiert [68].
Weiterhin
konnte
gezeigt
werden,
dass
eine
niedrige
extrazelluläre
Kaliumkonzentration zu einer zusätzlichen Blockade von IKr führt und damit zu einer
potentiellen Verlängerung der Repolarisation [69]. Ebenso zeigte Turgeon [70, 71],
dass Diuretika zu einer Verlängerung des Aktionspotentials führen können, entweder
durch Erniedrigung des totalen Körper-Kalium-Wertes (Serum-Kaliumwert war
normal) oder aber durch direkte Wirkung des Diuretikums auf repolarisierende
Ionenkanäle (z.B. IKs).
Besonders
unter
Bradykardie
können
einige
repolarisationsverlängernde
Medikamente zu Torsade de Pointes führen. Patienten mit einem kompletten AVBlock
zeigten
eine
Repolarisationsverlängerung
selbst
nach
Schrittmacherimplantation, wenn dieser auf <60 Schläge/min eingestellt war [72].
Verschiedene Studien konnten zeigen, dass auch das weibliche Geschlecht ein
signifikanter unabhängiger Risiko-Faktor für das Auftreten von TdPs darstellt. Es ist
bekannt, dass Frauen ein längeres Zykluslängen- abhängiges QT-Intervall (QTcIntervall) haben als Männer [73, 74]. Besonders bei Kaninchen wird auch IKr bei
weiblichen Tieren deutlich weniger exprimiert als bei männlichen Tieren, was dazu
führt, dass sich weibliche Kaninchen besonders gut für tierexperimentelle Versuche
23
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
zu repolarisationsverlängernden Medikamenten eignen [75, 76]. Ein zusätzliches
Risiko für das Auftreten von Rhythmusstörungen besteht bei Patienten, die an
Lebererkrankungen leiden oder Patienten, die zusäztlich zu IKr-Blockern Substanzen
einnehmen, die deren Abbau in der Leber inhibieren. Der Hauptabbauweg vieler
Medikamente ist die Verstoffwechslung über das Enzymsystem Cytochrom P450.
Konkurrieren mehrere Arzneimittel um gleiche Isoenzyme in diesem System, können
sich die Plasmaspiegel erheblich verändern [34]. Schließlich gehören Patienten mit
einem angeborenen Long-QT-Syndrom natürlich zu einem Kollektiv mit erhöhtem
Risiko für das Auftreten von TdPs [34].
12 Kanal-EKG
MAP LV post.
MAP RV post.
MAP RV ant.
MAP RV ant.
MAP LV ant.
MAP LV lat.
MAP LV post.
MAP LV endo.
Abb. 6: Torsade de Pointes- Aufzeichnung eines Kaninchenherzens bei hypokalämischer
Krebs-Henseleit-Lösung (KHB) und 200 M Erythromycin
2.2.4 Angeborenes und erworbenes langes QT-Syndrom (LQTS)
Die im EKG gemessene Strecke zwischen dem Beginn des QRS-Komplexes und
dem Ende der T-Welle korreliert mit der Dauer des kardialen Aktionspotentials (AP).
Die
QT-Dauer
umfasst
somit
sowohl
die
Depolarisations-,
als
auch
die
Repolarisationsphase. Die Unterschiede der QT-Dauern im Oberflächen-EKG
24
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
reflektieren eine inhomogene Repolarisation in der Ventrikelwand. Die QTDispersion, also die Differenz zwischen längstem und kürzestem QT-Intervall im 12
Kanal-EKG liegt physiologisch zwischen 40-50 ms. Eine frequenzkorrigierte QTVerlängerung (QTc) von über 0,50 s gilt als pathologisch [39], dabei besteht nach
Haverkamp [77] eine recht gute Korrelation zwischen dem Ausmaß des QTcIntervalls eines Patienten und der Häufigkeit klinischer Ereignisse.
Eine Verlängerung des Intervalls wird durch einen Anstieg der Aktionspotentialdauer
der Myozyten verursacht. Diese Verlängerung kann durch Medikamente induziert
oder kongenital bedingt sein.
Das kongenitale, also angeborene LQTS ist eine genetisch bedingte, primär
elektrische Herzerkrankung, im Rahmen dessen die Verlängerung des QT-Intervalls
mit sich wiederholenden Synkopen und einem vermehrten Auftreten des plötzlichen
Herztodes assoziiert ist [43]. Beides resultiert aus dem spontanen Auftreten von
lebensbedrohlichen ventrikulären Arrhythmien vom Torsade de Pointes Typ [77]. Es
lassen sich zehn Subtypen differenzieren. Mindestens sieben verschiedene Gene,
die Ionenkanäle kodieren, sind beteiligt.
Zwei Formen der vererbten Form konnten identifiziert werden. Die nach den
Erstbeschreibern benannte, autosomal-dominant vererbte Form des LQTS wird als
Romano-Ward-Syndrom bezeichnet und tritt mit einer Häufigkeit von 1:100.000 auf
[78]. Bei der zweiten, autosomal- rezessiven Form liegt zusätzlich eine angeborene
Innenohr-Schwerhörigkeit vor. Sie ist wesentlich seltener und wird als Jervell-LangeNielsen-Syndrom bezeichnet [79]. Die Diagnose LQTS basiert auf dem verlängerten
QTc-Intervall (während der Nacht, also in Ruhe größer als während täglicher
Aktivität)
sowie einer abnormen T-Wellen-Morphologie [80]. Die klinische
Manifestation des LQTS erfolgt meist in der Jugend und Kindheit. Auch ein Teil der
Fälle des plötzlichen Kindstodes werden dem Syndrom zugeschrieben [81]. Wie
bereits erwähnt, handelt es sich beim kongenitalen LQT-Syndrome um eine
genetisch heterogene Erkrankung, der Mutationen von Genen zugrunde liegen, die
für Ionenkanäle kodieren, wobei sich am häufigsten Mutationen von KCNQ1 und
HERG finden [82,83].
25
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Neben dem angeborenen ist aber in den letzten Jahren auch zunehmend das
erworbene
LQT-Syndrom
von
großem
wissenschaftlichem
und
praktischem
Interesse [34].
Von einem erworbenen QT-Sydrom spricht man, wenn es z.B. im Rahmen einer
medikamentös antiarrhythmischen Therapie oder aber auch einer primär nicht
rhythmuskorrigierenden Therapie zu einer QT-Zeit Verlängerung kommt. Eine der
ersten Beschreibungen über medikamenteninduzierte Synkopen, dem klinischen
Korrelat von TDP, stammt von Frey aus dem Jahre 1918, der das Antiarrhythmikum
Chinidin
untersuchte
[86].
Das
QT-Intervall
der
Patienten
ist
dabei
vor
Therapiebeginn normal lang, erst nach der Gabe eines repolarisationsverlängernden
Medikaments kommt es zu einer QT-Verlängerung [87]. Da es inzwischen eine große
Zahl bekannter kardial und primär nicht kardial wirksamer Medikamente gibt, kommt
dem erworbenen LQT-Syndrom eine größere klinische Bedeutung zu als dem
angeborenen
LQT-Syndrom
[34].
Vor
allem
die
Einnahme
von
repolarisationsverlängernden Antiarrhythmika der Klasse Ia und III (z.B. Chinidin,
Sotalol, Dofetilid, Clofilium und Disopyramid) kann zum unerwünschten Auftreten von
Torsade de Pointes durch eine IKr- Blockade führen [34, 88]. Jedoch kommt es auch
bei einer immer größer werdenden Zahl nicht kardiovaskulärer Medikamente zu einer
QT-Zeit Verlängerung und dem damit verbundenen Auftreten von Torsade de
Pointes, (wie z.B. bei Antihistaminika; Terfenadin [89], Darmmotalitätsanregern;
Cisaprid [90], Neuroleptika; Haloperidol [91] sowie einigen Makrolidantibiotika [92,
93]). Bei den primär nicht kardiovaskulären Therapeutika ist im Vergleich zu den
Antiarrhythmika eine repolarisationsverlängernde Wirkung in der Regel nur bei hohen
Plasmakonzentrationen nachweisbar. Eine Inzidenzschätzung für das Auftreten von
Torsade de Pointes während einer Behandlung ist schwierig, da für einige dieser
Medikamente nur wenige Fallberichte zur Verfügung stehen [34]. Es finden sich
dabei häufig zusätzliche Faktoren wie Elektrolytimbalancen (z.B. Hypokaliämie,
Hypomagnesiämie), Bradykardie (AV-Block) oder Kardiomyopathien, die die Neigung
zum Auftreten von TdPs erhöhen [34].
26
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.3 Die chronische Herzinsuffizienz
Es gibt zwar zahlreiche Definitionen für die chronische Herzinsuffizienz, doch werden
dort meist nur einige spezifische Aspekte hervorgehoben. Eine simple, objektive und
umfassende Definition ist kaum möglich, da es keinen Parameter am Herzen gibt,
der alleinig eine Aussage über den Zustand der Herzfunktion zulässt [94].
Pathophysiologisch betrachtet, handelt es sich um eine unzureichende Funktion des
Herzens, so dass es nicht mehr imstande ist, eine der Anforderung entsprechende
Förderleistung
zu
bringen.
Daraus
resultieren
eine
unzureichende
Sauerstoffversorgung der Peripherie, Stauungserscheinungen im großen und kleinen
Kreislauf, Herzhypertrophie, Rhythmusstörungen (Tachykardien, Bradykardien) und
Zyanose [95]. Zur Einschätzung des Stadiums der Herzinsuffizienz eines Patienten
dient die NYHA-Klassifikation (New York Heart Association) [96]:
> Klasse I: Herzerkrankung ohne körperliche Einschränkung. Alltägliche
Belastung verursacht keine inadäquate Erschöpfung, Rhythmusstörungen,
Luftnot oder Angina pectoris.
> Klasse II: Herzerkrankung mit leichter Einschränkung der körperlichen
Leistungsfähigkeit. Keine Beschwerden in Ruhe. Alltägliche körperliche
Belastung verursacht Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina
pectoris
>
Klasse
III:
Herzerkrankung
mit
höhergradiger
Einschränkung
der
körperlichen Leistungsfähigkeit bei gewohnter Tätigkeit. Keine Beschwerden
in
Ruhe.
Geringe
körperliche
Belastung
verursacht
Erschöpfung,
Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris.
> Klasse IV: Herzerkrankung mit Beschwerden bei allen körperlichen
Aktivitäten und in Ruhe. Bettlägerigkeit.
Mit zunehmendem Alter des Patienten steigt die Prävalenz deutlich an. Hinzu kommt,
dass bei der derzeitigen demographischen Entwicklung in Deutschland die
Herzinsuffizienz weiter an Bedeutung gewinnen wird. Insbesondere wenn die
Ursache nicht frühzeitig erkannt wird, ist die Prognose bei Herzinsuffizienz schlecht.
27
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Die Hälfte der Patienten verstirbt innerhalb von 4 Jahren, Patienten im Stadium III
und IV haben sogar meist nur eine Lebenserwartung von maximal einem Jahr [97].
Trotz bemerkenswerter Therapiefortschritte bleibt die Mortalität bei Herzinsuffizienz
sehr hoch. Die Inzidenz für den plötzlichen Herztod liegt abhängig vom Ausmaß der
Erkrankung zwischen 10 % und 50 %, wobei mit zunehmendem Schweregrad mehr
Patienten
durch
Pumpversagen
als
durch
plötzlichen
Tod
mit
Herzrhythmusstörungen versterben [98]. Aufgrund der multifaktoriellen Genese der
Herzinsuffizienz kann eine Reihe von arrhythmogenen Faktoren zu Arrhythmien
führen, die die Herzinsuffizienz damit verkomplizieren. Bei den Grunderkrankungen,
die einer Insuffizienz zu Grunde liegen, unterscheidet man zwischen koronaren
Herzerkrankungen
(KHK),
Ventrikeldilatationen
und
dilatativen
Aneurysmen
Kardiomyopathien,
[99].
Ventrikuläre
Hypertrophien,
Arrhythmien
bei
Herzinsuffizienz zeigen eine große Variabilität. Weder die Art, noch die Frequenz der
Rhythmusstörung gibt einen Hinweis auf die der Herzinsuffizienz zugrunde liegende
Erkrankung. Frequenz und Komplexität der Rhythmusstörungen korrelieren im
Allgemeinen aber sehr gut mit dem Ausmaß der ventrikulären Dysfunktion [99].
Bei der Behandlung von Herzrhythmusstörungen herzinsuffizienter Patienten steht
zunächst eine optimale Herzinsuffizienztherapie im Vordergrund. Revaskularisation,
soweit
erforderlich,
Beta-Blocker
und
ACE-Hemmer
sollte,
falls
keine
Kontraindikationen bestehen, Bestandteil jeder Herzinsuffizienztherapie sein [99]. Die
beiden Hauptgründe für eine medikamentöse Antiarrhythmika-Therapie sind eine
Minderung der Symptome und die Verbesserung der Prognose, wenn trotz oben
genannter Therapie Arrhythmien persistieren [100]. Der Einsatz von Antiarrhythmika
bei Herzinsuffizienz muss jedoch penibel überwacht werden und wird vielfach durch
die negativ-inotropen Eigenschaften limitiert. Die mittlerweile unumstritten beste
verfügbare Therapie zur Vermeidung des plötzlichen Herztods durch ventrikuläre
Tachykardien
oder
Kammerflimmern
stellt
der
implantierbare
Kardioverter
Defibrillator (ICD) dar. Er führt zu einer deutlich besseren Prognose und einer
Verringerung der Gesamtmortalität bei betroffenen Patienten [101].
28
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.3.1 Arrhythmogenese bei Herzinsuffizienz
Für die Entstehung von Herzrhythmusstörungen bei chronischer Herzinsuffizienz
sind eine Vielzahl von Mechanismen verantwortlich, zu denen strukturelle
myokardiale Prozesse ebenso wie Veränderungen des elektrophysiologischen
Substrats zählen. Die Komplexität von Herzrhythmusstörungen wird daran
erkennbar, dass in den verschiedenen Abschnitten des Herzens unterschiedliche
Ionenströme mit zum Teil unterschiedlicher Intensität an der Ausbildung des Ruheund Aktionspotentials beteiligt sind. Abhängig von der Ursache der Herzinsuffizienz
sind unterschiedliche Faktoren, die zu Rhythmusstörungen führen von Bedeutung
[100].
Bei koronaren Herzerkrankungen und Myokardinfarkt spielen vor allem durch Fibrose
bedingte strukurelle Veränderungen eine entscheidende Rolle, die das Auftreten von
Arrhythmien durch Re-entry- Mechanismen (siehe 2.2.2) fördern [99].
Die arrhythmogenen Mechanismen bei nicht- infarktbedingten Insuffizienzen sind
meist vielfältiger [102]. Dabei kommt gesteigerter Automatie, die auch durch
hämodynamische Größen direkt beeinflusst wird [103], und der getriggerten Aktivität
im Subendokardium eine besondere Bedeutung zu [104]. Die Entstehung
getriggerter Aktivität und der ihr meist vorausgehenden frühen Nachdepolarisationen,
gehen in der Regel mit einer auf zellulärer Ebene stattfindenden Verlängerung des
QT-Intervalls einher. Akar und Rosenbaum [105] konnten zeigen, dass dem
Mechanismus für die Entstehung von polymorphen ventrikulären Tachykardien
(PVTs) bei Herzinsuffizienz, die heterogene und selektive Verlängerung der
Repolarisation der verschiedenen Zelltypen der Ventrikelwand das zugrunde
liegende Substrat ist. Den verschiedenen Veränderungen bei Herzinsuffizienz,
einschließlich
QT-Intervall-Verlängerung,
transmuraler
Heterogenität
der
Repolarisation und die Anfälligkeit für Leitungsblockaden sowie PVTs, liegt vor allem
die selektive Verlängerung des Aktionspotentials der M-Zellen zugrunde [105].
Die QT-Verlängerung bei Herzinsuffizienz wird durch mehrere Veränderungen der
Ionenkanaldichte der Myozytenmembranen hervorgerufen [106]. Unterschiedliche
Autoren konnten nachweisen, dass am insuffizienten Herzen eine Verminderung der
29
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
auswärtsgerichteten transmembranären Ionenströme, bedingt durch eine Abnahme
der Kaliumkanäle, vorliegt [107-111]. Für die reduzierten Kaliumströme werden
verschiedene komplizierte zelluläre und molekulare Mechanismen, wie z.B. ein z.T.
veränderter m-RNA-Level, verantwortlich gemacht [111]. Die Kinetik des kardialen
Aktionspotentials wird wie unter 2.1.2 bereits beschrieben, durch die Aktivität
verschiedener transmembranärer Ionenströme determiniert. Die verminderte Anzahl
der Kaliumkanäle und der damit einhergehende verminderte repolarisierende
Kaliumstrom
führen
zu
einer
verzögerten
Repolarisation
mit
konsekutiver
Verlängerung des Aktionspotentials.
Darüber hinaus konnte in einigen Studien gezeigt werden, dass es beim
insuffizienten Herzen auch zu Veränderungen der Kalziumhömostase kommt, die für
eine vermehrte Proarrhythmie verantwortlich sein kann [106, 107, 109]. Hier steht vor
allem die erhöhte Expression des Na/Ca- Austauschers im Vordergrund, der
physiologisch gegen Ende der Systole durch einen Natriumeinstrom im Tausch
gegen ein Ausschleusen von Kalzium die myokardiale Homöostase gewährleisten
soll
[112].
Die
durch
einen
Anstieg
der
Expression
und
zusätzlichen
Aktivitätssteigerung hervorgerufene Kalziumbeladung könnte in Stresssituationen
durch katecholaminerge Stimulation bei den frühen Stadien der Herzinsuffizienz eine
erhöhte Sensitivität gegenüber -adrenerger Stimulation hervorrufen [110]. Man geht
außerdem davon aus, dass es weiterhin zu einer vermehrten Kalziumbeladung des
sarkoplasmatischen Retikulums mit Entstehung eines so genannten „Kalzium-Leck“
kommt [110]. Eine spontane Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen
Retikulum führt zu einer Aktivitätssteigerung des Na/Ca- Austauschers und so zu
einem Na-Einwärtsstrom mit deutlicher Zunahme positiver Ladungen im Zellinneren
[217]. Dies könnte zum Auftreten von Nachdepolarisationen und getriggerter Aktivität
führen.
Abgesehen
von
chronischen
strukturellen
Veränderungen
kann
sich
das
elektrophysiologische Substrat bei Herzinsuffizienz in sehr kurzer Zeit verändern.
Eine Vielzahl transienter Faktoren, die die Entstehung von Rhythmusstörungen
bedingen, sind die Folge von Regelmechanismen, durch die das Herz versucht, eine
ausreichende Sauerstoffversorgung sicher zu stellen. So kommt es über komplexe
30
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Veränderungen des neuro-humoralen Systems bei der Herzinsuffizienz zu einer
gesteigerten
Aktivität
des
sympathischen
Nervensystems
mit
erhöhten
Noradrenalinwerten im Plasma [113]. Über eine Aktivierung des Renin- AngiotensinAldosteron- Systems (RAAS) [109] oder noch häufiger aufgrund einer Behandlung
mit Diuretika können in kurzer Zeit Elektrolytimbalancen, wie Hypokaliämie oder
Hypomagnesiämie, auftreten. Beide spielen, wie schon unter 2.2.4 erwähnt, bei der
Entstehung von Rhythmusstörungen ebenfalls eine wichtige Rolle und erhöhen das
Risiko für den plötzlichen Herztod. Darüber hinaus erhöhen sie das Risiko
proarrhythmischer Effekte, insbesondere von Klasse III Antiarrhythmika (Sotalol,
Amiodaron),
aber
auch
repolarisationsverlängernder,
nicht
kardiovaskulärer
Medikamente, indem sie die Entstehung polymorpher Kammertachykardien vom
Torsade de Pointes- Typ begünstigen [34]. Neben Tachyarrhythmien sind
orthostatische
Fehlregulationen
aufgrund
vasovagaler
Dysfunktion,
eine
medikamentöse Therapie mit Vasodilatoren bzw. Diuretika, Bradyarrhythmien und
ein fehlender Anstieg des Herzzeitvolumens bei Belastung bei der Entstehung von
Synkopen von Bedeutung [99].
2.3.2 Der plötzliche Herztod
Die Definition des plötzlichen Herztodes ist umstritten, da es nur selten gelingt,
mittels EKG ein solches kardiologisches Ereignis zu verifizieren, und ohne eine
solche Aufzeichnung bleibt der zugrunde liegende Vorgang meist unklar.
Dennoch wird der plötzliche Herztod vielfach als unerwarteter Tod infolge eines
irreversiblen Herz-Kreislauf-Stillstandes definiert, der innerhalb von 1h nach
Auftreten von klinischen Beschwerden eintritt [114]. Dabei wird der plötzliche Herztod
selten
durch
einzelne
Faktoren
hervorgerufen,
sondern
ist
vielmehr
als
multifaktorielles Geschehen aufzufassen. Die Komplexität der Auslösemechanismen
erschwert die Identifizierung von Hochrisiko-Kollektiven im Allgemeinen und macht
die zeitliche Vorhersagbarkeit eines solchen Ereignisses beim individuellen Patienten
unmöglich [115].
31
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Die Häufigkeit des plötzlichen Herztodes ist schwer zu ermitteln, da die Angaben
mehr Schätzungen als genaue Zahlen sind. Man geht jedoch davon aus, dass der
plötzliche Herztod beim Erwachsenen mit einer jährlichen Inzidenz von 0,1-0,2 %
auftritt. Das entspricht in Deutschland zwischen 70.000 und 100.000 Menschen, in
den USA sogar 450.000 Patienten, die einem plötzlichen Herztod erliegen [114]. Dies
ist etwa die Hälfte der kardial bedingten Todesfälle in den USA [116, 117].
Bei einer Großzahl der verstorbenen Personen liegen ursächlich eine strukturelle
Herzerkrankung, wie beispielsweise eine koronare Herzerkrankung oder eine
dilatative Kardiomyopathie vor, die tachykarde Herzrhythmusstörungen verursachen.
Bei der Herzinsuffizienz und der Herzhypertrophie treten adaptive Veränderungen
der Genexpression und Proteinfunktion auf, die arrhythmogene Folgen haben.
Solche
Veränderungen
sind
zunächst
nicht
primär
als
Verlängerung
des
Aktionspotentials oder des QT-Intervalls in Ruhe zu erkennen. Vielmehr führen die
subtilen Veränderungen der repolarisierenden Ionenströme vorerst nur zu einer
verminderten „Repolarisationsreserve“, also einem kleineren zellulären Puffer, der
Schwankungen in den repolarisierenden Strömen des Aktionspotentials auffangen
kann [116]. Unter dem Begriff der Repolarisationsreserve subsummiert man also
verschiedene teils überlappende und redunante Mechanismen der myokardialen
Repolarisation, die eine elektrophysiologische Stabilität gewährleisten und zunächst
eine exzessive QT-Verlängerung durch äußere Einflüsse verhindern [118]. Roden
[118] stellte das Konzept der „Repolarisationsreserve“ auf und konnte zeigen, dass
der Funktionsverlust der an der Repolarisation beteiligten Mechanismen (z.B.
herunterregulierter IKr-Ionenstrom) nicht automatisch zu klinischen Konsequenzen
führt, solange nicht zusätzliche Faktoren wie z.B. subklinische Mutationen von
Ionenkanälen,
anderen
Genen,
Herzinsuffizienz
oder
Linksherzhypertrophie
vorliegen [119]. Die myokardiale Repolarisationsreserve wird zum Beispiel durch
Bradykardie, Hypokaliämie oder aber auch durch ein weibliches Geschlecht
(verlängertes QT-Intervall im Vergleich zu Männern) [74] reduziert.
Bei
Überstrapazierung
myokardialer
Kompensationsmechanismen
durch
verschiedene gleichzeitig auftretende Faktoren kann die Repolarisationsreserve
soweit reduziert werden, dass neben einer QT-Verlängerung polymorphe ventrikuläre
32
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Tachykardien resultieren. Diese terminieren zwar meist spontan, können aber auch
in Kammerflimmern degenerieren und somit zum plötzlichen Herztod führen [121].
Durch die vermehrte Arbeitsbelastung der Myozyten bei Herzinsuffizienz wird ein
verändertes genetisches Programm abgerufen, welches sonst nur in fetalen
Kardiomyozyten abläuft. Dieser Prozess verursacht schließlich auch potentiell
arrhythmogene
elektrophysiologische
Veränderungen
und
strukturelle
Umbauprozesse, insbesondere eine vermehrte fokale Fibrose [116].
Die Analyse der Todesfälle herzinsuffizienter Patienten zeigte, dass etwa die Hälfte
an myokardialem Pumpversagen verstarb, die andere Hälfte am plötzlichen,
arrhythmiebedingten Herztod. In der MERIT-HF Studie konnte gezeigt werden, dass
je ausgeprägter der klinische Schweregrad der Herzinsuffizienz (NYHA-Klasse III-IV),
desto größer die Todesrate durch Pumpversagen ist, während der Anteil plötzlicher
Todesfälle steigt, je niedriger der Herzinsuffizienzgrad (NYHA-Klasse I-II) ist [114].
Etwa 5–10 % der plötzlichen Herztodesfälle betreffen allerdings strukturell völlig
herzgesunde Personen. Der Anteil jüngerer Menschen (< 40 Lebensjahre) beträgt in
dieser Gruppe sogar 10–20 % [122]. Bei älteren Personen sind koronare
Herzerkrankung und dilatative Kardiomyopathie für den überwiegenden Teil der
plötzlichen Herztodesfälle verantwortlich. Bei diesen Menschen beginnt die tödliche
Kaskade in aller Regel mit einer ventrikulären Tachykardie, die in Kammerflimmern
übergeht [123]. Die Ergebnisse zahlreicher Studien zu einer Korrelation zwischen
nicht-anhaltenden VT und dem plötzlichen Herztod sind widersprüchlich, so dass
diesbezüglich keine eindeutige Aussage getroffen werden kann [99]. Bei Patienten
mit Herzinsuffizienz führt die ventrikuläre Tachykardie unabhängig von der
Herzfrequenz schnell zu Synkopen, weil es wesentlich schneller zu einer
hämodynamisch relevanten Abnahme des Herzzeitvolumens kommt. Patienten mit
hämodynamisch tolerierter VT haben jedoch im Vergleich zu Patienten, bei denen
bereits die initiale Episode zu einer Synkope oder einem Herzstillstand führte, ein
geringeres Risiko, an einem plötzlichen Herztod zu versterben [124].
Bei jüngeren Patienten sind neben strukturellen Erkrankungen des Herzmuskels
primär elektrische Erkrankungen des Herzens als wesentliche Differentialdiagnose in
Betracht zu ziehen. Angeborene genetische Veränderungen von kardialen
33
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Ionenkanälen,
Proteinen
Kalziumspeicher
oder
des
von
kontraktilen
Apparats,
Zell-Struktur-Proteinen
der
können
intrazellulären
angeborene
arrhythmogene Erkrankungen verursachen [116]. Dazu gehören das lange QTSyndrom, das kurze QT-Syndrom, das Brugada-Syndrom und die katecholaminerge
polymorphe ventrikuläre Tachykardie [122]. Diese Erkrankungen unterscheiden sich
elektrokardiographisch,
teilweise
durch
spezifische
klinische
Trigger
der
Arrhythmieentstehung, in der invasiven Diagnostik und im therapeutischen
Vorgehen. Molekulargenetische Untersuchungen konnten bei einem Teil der
jeweiligen Erkrankungen Mutationen spezifischer Ionenkanäle aufdecken [122].
Durch
die
zunehmenden
Kenntnisse
im
Rahmen
molekulargenetischer
Untersuchungen mit Aufdeckung sowohl der zugrunde liegenden spezifischen
Ionenkanaldefekte, als auch der Mechanismen der Arrhythmogenese, gewinnt eine
medikamentöse Genotyp-spezifische Therapie an Bedeutung und gibt für die
betroffenen Patienten zukünftig Hoffnung [122].
2.4 Einfluss von Erythromycin auf die Repolarisation
Makrolidantibiotika sind eine relativ neue Klasse von Antibiotika aus der Stoffklasse
der Makrolide. Sie wirken bakteriostatisch durch Hemmung des Enzyms Translokase
und damit der Proteinbiosynthese von Bakterien. Der älteste Vertreter ist
Erythromycin, welches 1952 erstmals aus Streptomyces erythreus isoliert werden
konnte.
„Modernere
Varianten“
sind
Clarithromycin,
Azithromycin
oder
Roxithromycin, die heute halb- oder vollsynthetisch hergestellt werden. Das
Wirkungsspektrum von Erythromycin ist mit dem Wirkungsspektrum von einigen
Penicillinen vergleichbar. Es ist relativ gut verträglich, wodurch sich ähnliche
Anwendungsgebiete ergeben. Daher kann Erythromycin eingesetzt werden, wenn
Allergien gegen β-Lactam-Antibiotika bestehen oder wenn Resistenzen deren
Anwendung verhindern. Das Makrolidantibiotikum hat einen 14-gliedrigen Lactonring
ohne Doppelbindungen. An jedem zweiten C-Atom ist es methylverzweigt und ist
glykosidisch mit Cladinose (C3) bzw. Desoamin (C5) verknüpft [125].
34
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Struktur der Erythromycine
Erythromycin
Allgemeine Struktur
R1
R2
Abb. 7: Strukturformel von Erythromycin.
Erythromycin ist ein Hemmstoff des Cytochroms CYP34 in der Leber. Somit ist die
Biotransformation von Medikamenten, bei denen dieses Enzym beteiligt ist, z. B.
Ciclosporin, Diazepam, Lidocain, Warfarin u. v. a., beeinträchtigt, was zur
Wirkstoffakkumulation durch erhöhte Plasmaspiegel und zur Verstärkung von Hauptund Nebenwirkungen führt, wie das Risiko für das Auftreten von ventrikulären
Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod [126]. Patienten mit Lebererkrankungen
sind besonders gefährdet Torsade de Pointes Tachykardien zu entwickeln, wenn sie
mit Makrolidantibiotika behandelt werden, da diese über die Leber verstoffwechselt
werden und so ihr Wirkspiegel bei Exkretionsstörungen erhöht ist [126]. Abgesehen
von ihrem antibiotischen Effekt wurde bei Makroliden außerdem eine Verlängerung
des
QT-Intervalls
festgestellt
und
damit
einhergehend
proarrhythmische Eigenschaften. Sie spielen damit
unterschiedliche
auch bezüglich einer
Verlängerung der Repolarisation in der Gruppe der nicht-kardiovaskulären
Medikamente eine Rolle [127]. Es konnte in unzähligen Studien gezeigt werden,
dass die Verlängerung der Repolarisation während der Phase 3 durch Blockade der
schnellen
Komponente
des
verzögerten
Gleichrichter-
Kaliumstroms
IKr
hervorgerufen wird [69,128-131]. Wie bereits ausführlich unter 2.2.3 sowie 2.2.4
beschrieben, kann die Repolarisationsverlängerung, vor allem in Zusammenhang mit
35
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
weiteren
prädisponierenden
Hypomagnesiämie,
das
Faktoren
Auftreten
wie
von
Bradykardie,
Hypokaliämie
lebensbedrohlichen
oder
ventrikulären
Tachyarrhythmien vom Torsade de Pointes Typ hervorrufen. Schon vor längerer Zeit
konnten Studien und Fall-Schilderungen TdPs unter Erythromycin, aber auch
Clarithromycin- Therapie sowohl nach intravenöser, wie auch nach oraler Gabe
belegen [132,133-135]. Dabei sind etwa 70 % des Erythromycins an Plasmaproteine
im Blut gebunden und Torsade de Pointes konnten vor allem dann beobachtet
werden, wenn der Erythromycin-Plasmaspiegel seinen Gipfel ca. 2 h nach der i.v.
Gabe erreicht hatte [136]. Zu beachten ist außerdem, dass der Erythromycinspiegel
im Gewebe, also auch im Herzmuskel, nach intravenöser Gabe noch deutlich höher
liegt, als der korrespondierende Plasmaspiegel im Blut, so dass der erreichte
Gewebespiegel so hoch ist, dass zumindest bei in vitro „Patch-Clamp“ Versuchen
eine Kaliumkanalblockade nachweisbar ist, die zu Repolarisationsverlängerung und
potentiellen Rhythmusstörungen führt [130]. Gemessen am weitverbreiten Einsatz
der
Makrolidantibiotika
und
trotz
ihrer
nachgewiesenen
Fähigkeit
zur
Repolarisationsverlängerung, sind die Makrolid- assoziierten Rhythmusstörungen
insgesamt aber eher selten [92].
36
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.5 G-CSF und der Einfluss von Stammzellen am Herzen
Blutzellen stammen von den pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen im
Knochenmark ab. Über verschiedene hämatopoetische Wachstumsfaktoren und
Zytokine wird die Bildung sämtlicher Blutzellen reguliert. Die Wachstumsfaktoren
steigern dabei die Proliferation bestimmter Zellen der Hämatopoese und in vielen
Fällen auch die Funktion der reifen Endzellen [137]. Der Granulozyten-Kolonie
stimulierende Faktor (G-CSF) stimuliert das Überleben und die Proliferation unreifer
Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems (Prä-CFU) und determinierter
Progenitorzellen für neutrophile Granulozyten (CFU-GM). Bei einem Mangel an
neutrophilen Granulozyten zum Beispiel infolge einer Entzündung reagiert der Körper
mit einem Anstieg der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren wie G-CSF [137].
G-CSF kann in der Zwischenzeit auch industriell produziert und für folgende
Therapien eingesetzt werden: 1. Reduktion infektiöser Nebenwirkungen von
Chemotherapien 2. Reduktion von Morbidität und Letalität durch Neutropenie, 3.
Mobilisation von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark in das
periphere Blut, um allogene und autologe Stammzellen für die Transplantation zu
gewinnen
[137].
Die
Verwendung
von
Stammzellen
stellt
einen
neuen
vielversprechenden Ansatz zur Prävention und Therapie der Herzinsuffizienz dar
[138]. Ausdifferenzierte Kardiomyozyten sind in der Regel nicht mehr in der Lage
sich
zu
teilen.
Ihr
Untergang
infolge
einer
Erkrankung
geht
daher
mit
Funktionsverlust und Ersatz durch Narbengewebe und Fibrosierung einher.
Wenngleich verschiedene Forschungsgruppen auch im Herzen die Präsenz von
stammzell-ähnlichen
Kardiomyozyten
Zellpopulationen
differenzierten
[139].
nachweisen
Im
konnten,
Gegensatz
dazu
die
sich
besitzt
in
eine
undifferenzierte Stammzelle die Fähigkeit, sich selbst zu vermehren und reife
ausdifferenzierte Tochterzellen zu bilden. Man unterscheidet dabei zwischen
embryonalen Stammzellen, die aus der inneren Zellmasse des Embryos stammen
und pluripotent sind sowie adulten Stammzellen, von denen man bisher annahm,
dass deren Teilungsfähigkeit und Differenzierungspotential deutlich eingeschränkt
ist. Ein neuer potentieller therapeutischer Ansatz für die Behandlung der
Herzinsuffizienz wäre daher, die untergegangenen Kardiomyozyten durch neue
37
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
funktionelle zu ersetzen, als Alternative zum bisherigen einzigen kausalen
Therapieansatz, der vollständigen Herztransplantation [138].
2.5.1 Struktur des G-CSF
Abb. 8: Bändermodell der Proteinstruktur von G-CSF [84]
Das humane Glykoprotein besteht aus 178 Aminosäuren, ist an der Hydroxylgruppe
des Threonin 133 glykosyliert und besitzt eine Molekülmasse von 19,6 kDa. Die
Zuckerkette macht etwa 4 % des Gesamtgewichts aus und besteht aus α-N-AcetylNeuraminsäure, β-Galaktose und N-Acetyl-Galaktosamin. Die Zuckerkette des GCSF spielt eine wesentliche Rolle bei der Stabilität des Proteins und bei der
Stimulierung bestimmter Funktionen der neutrophilen Granulozyten. Ein weiteres
wesentliches Element der Sekundärstruktur sind zwei Disulfidbrücken. Das Gen von
G-CSF liegt auf Chromosom 17 im Genlocus q11.2-q12 [140].
2.5.2 Stammzelltherapie bei der Herzinsuffizienz
Herkömmliche Therapiestrategien der Herzinsuffizienz beruhen vorwiegend auf einer
Hemmung des Fortschreitens der Erkrankung, ohne dass dabei eine „Restitutio ad
integrum“ erreicht würde. Immer mehr Patienten erlangen allerdings dennoch das
Finalstadium der Herzinsuffizienz, in dem momentan einzig eine Herztransplantation
als Therapie bleibt [141]. Bei einer durchschnittlichen Wartezeit von 9-12 Monaten
38
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
versterben allerdings bereits 30 % der gelisteten Patienten auf der Warteliste [141].
Deshalb stellt sich vor allem auch im Terminalstadium der Herzinsuffizienz die Frage
nach neuen Therapieoptionen, wie der Stammzelltherapie, bei der im Rahmen der
regenerativen Medizin die Erneuerung und der effektive Ersatz von Zellen und
Gewebe im Mittelpunkt stehen [142].
2.5.2.1 Embryonale Stammzelltherapie
Embryonale Stammzelllinien (ES), die aus der inneren Zellmasse (ICM) von
Embryonen im Blastozystenstadium (v.a. im Achtzellstadium) gewonnen werden,
sind pluripotent und haben die Fähigkeit, sich in alle Zelltypen zu differenzieren, wie
in der embryonalen Entwicklung. Dabei sind sowohl Human- wie auch Mäuse-ES
Gegenstand
intensiver
Differenzierung
in
Forschungsbemühungen,
Kardiomyozyten
[143-145].
auch
Die
in
Hinblick
ersten
auf
die
embryonalen
Mäusestammzelllinien (mES) wurden 1981 isoliert, und es konnten inzwischen in
vitro funktionstüchtige Kardiomyozyten davon abgeleitet werden, die sowohl typische
molekulare, zelluläre und physiologische Charakteristika von Herzzellen aufweisen
[145]. Dabei wurden auch die verschiedenen speziellen Zelltypen am Herzen, wie
Vorhof-,
Ventrikel-,
Sinusknoten-
und
Purkinjefaserzellen
anhand
ihrer
charakteristischen Aktionspotentiale gefunden [145]. Für die Differenzierung in
Kardiomyozyten
gibt
es
eine
Reihe
von
Faktoren,
die
bei
dem
Differenzierungsprozess eine wichtige Rolle spielen, wie zum Beispiel die
Zusammensetzung des Nährmediums, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Zusatzstoffe,
die Zelllinie und die Startzahl von Zellen in den sogenannten „Embryoid bodies“
(EBs) [143, 145]. Vieles, was man bisher über die Differenzierung von ES in
Kardiomyozyten weiß, hat man durch die Studien an mES gelernt, aber es konnten
auch einige wichtige Unterschiede zwischen mES und hES festgestellt werden [145].
Als Thomson und seine Mitarbeiter 1998 die ersten humanen embryonalen
Stammzellen ableiteten, galt dies als großer Durchbruch [146]. Dennoch gibt es eine
tiefe Kluft zwischen der Möglichkeit ES in Myokard zu differenzieren und dies klinisch
zu nutzen. Es konnte aber in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass
39
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Transplantate von embryonalem kardialem Gewebe aus ES in normalem Myokard
bestehen und auch Gap Junctions ausbilden [144]. Xiao [146] stellt die Ergebnisse
verschiedener tierexperimenteller Studien vor, in denen embryonale Stammzellen im
insuffizienten Herzmuskel integriert werden konnten. Er kommt dabei zu dem
Schluss, dass sowohl Transplantate von mES, wie auch intravenös applizierte
Stammzellen
sich
erfolgreich
im
geschädigten Myokard ansiedeln und in
funktionsfähige Kardiomyozyten differenzieren, dort die Vaskularisation fördern und
auf diese Weise die Herzfunktion wieder steigern und die Todesrate im
Tierexperiment
signifikant
senken.
Auch
die
Infarktgröße
war
nach
ES-
Transplantationen bei verschiedenen Tiermodellen deutlich reduziert [146]. Zhang
und Mitarbeiter konnten jedoch im „whole-cell patch-clamp“-Modell zeigen, dass die
aus
embryonalen
natürlichen
Stammzellen
Myozyten
differenzierten
deutliche
Kardiomyozyten
gegenüber
Aktionspotentialheterogenität,
verlängerte
Aktionspotentialdauer und leicht zu induzierende getriggerte Aktivität aufweisen. Die
Arbeitsgruppe machte deutlich, dass im „patch-clamp“-Modell ein unerwartetes
arrhythmogenes
Stammzellen
Potential
abgeleitet
Kardiomyozyten
in
Kardiomyozyten
wurden
[147].
verlängerte
So
steckt,
die
von
zeigten
die
ventrikel-ähnlichen
Aktionspotentiale,
frühe
embryonalen
und
späte
Nachdepolarisationen und schließlich sogar PVTs. Auch Zhang [147] vermutet
Veränderungen der Kalium- und Kalziumionenströme an von Stammzellen
abgeleiteten Kardiomyozyten als Auslöser für das nachgewiesene arrhythmogene
Potential.
Ganz andere, vielleicht ebenso gewichtige Probleme stellen jedoch die Tumorgenität,
die Immunogenität und nicht zuletzt ethische Bedenken gegen den Einsatz von hES
beim Menschen dar [144,145, 146].
2.5.2.2 Knochenmarksstammzelltherapie
Zwei
entscheidende
Knochenmarkszellen
Punkte
(BMC)
bieten
und
deren
einen
deutlichen
Subpopulationen
Vorteil
autologer
gegenüber
den
embryonalen Stammzellen. Sie zeigen keine immunologische Abstoßungsreaktion,
da die Zellen aus dem körpereigenen Knochenmark des Patienten gewonnen
40
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
werden können und sie sind ethisch unbedenklich und daher auch gut für klinische
Studien einsetzbar [148]. Stammzellen und Progenitorzellen, die vom Knochenmark
in
die
Blutbahn
Reparatursystem
freigesetzt
für
werden,
Schädigungen
sind
ein
von der Natur angelegtes
der
Organe.
Die
Kapazität
dieses
physiologischen Reparatursystems ist jedoch lediglich für eine geringgradige,
langsame Reparatur ausgelegt, möglicherweise als Gegengewicht zur Alterung der
Organe oder geringen Verletzungen. Bei einer massiven Gewebeschädigung wie
einem Myokardinfarkt ist diese Reparaturfähigkeit allerdings bei weitem überfordert
[149]. Es ist bekannt, dass das Knochenmark ein exzellentes Reservoir für viele
adulte Stammzellen ist und dass vom Knochenmark abgeleitete Stammzellen dazu
fähig sind, Grenzen von Zelllinien zu durchbrechen und sich in verschiedene
Zelltypen wie Hepatozyten, Endothelzellen, Skelettmuskelzellen und Neuronen zu
differenzieren.
Andererseits
wird
die
Fähigkeit
zur
Differenzierung
in
Herzmuskelzellen sehr kontrovers diskutiert [150]. Dennoch sind vom Knochenmark
abgeleitete Stammzellpopulationen
erfolgreich am Herzen eingesetzt worden,
inklusive hämatopoetischer Stammzellen (HSC), mesenchymaler Stammzellen
(MSC) und endothelialer Progenitorzellen (EPC) [151].
Menasché [152] konnte zunächst beeindruckende Erfolge durch die Behandlung von
Patienten mit eingeschränkter linksventrikulärer Funktion und Myokardinfarkt mit
pluripotenten Zellen verzeichnen. Im Folgenden wurde jedoch bei größeren
Patientenzahlen von Rhythmusstörungen berichtet, die soweit führten, dass
prophylaktisch ICDs implantiert werden mussten und die MAGIC-Studie vorzeitig
abgebrochen wurde [153]. Der Grund für die Zunahme des proarrhythmischen
Potentials ist vermutlich die unvollständige Einkopplung der implantierten Zellen in
das funktionelle Synzytium des Herzmuskels: Skelettmuskelzellen bilden - im
Gegensatz zu Herzmuskelzellen – keine für die Zell-Zell- Verbindung notwendigen
Gap junctions aus und sind daher elektrophysiologisch isoliert.
Bei einem anderen klinischen Ansatz schließlich gelang es der Arbeitsgruppe B. E.
Strauer 2001 erstmals isolierte mononukleäre Knochenmarkszellen
einige Tage
nach einem überstandenen Herzinfarkt zu transplantieren. Es kam dabei zu einer
Abnahme der Infarktgröße, zu einer Zunahme der Auswurffraktion, des Herz- und
41
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Schlagindexes und zu einer Abnahme des enddiastolischen Volumens sowie des
linksventrikulären Füllungsdrucks unter Belastung [154, 155].
Dieser ersten
klinischen Studie folgten weitere größere Studien von der Arbeitsgruppe um Prof.
Zeiher (TOPCARE-AMI) [149, 156, 157, ], einer Arbeitsgruppe aus Hannover
(BOOST-Studie) [158] sowie der REPAIR-AMI Studie [159], die allesamt belegen
konnten, dass die intrakoronare Infusion von BMC sowohl klinisch durchführbar und
sicher ist, als auch zu einer deutlichen Verbesserung der linksventrikulären Funktion
nach akutem Myokardinfarkt (MI) führt [160].
Neben den tierexperimentellen und den klinischen Studien nach akutem Herzinfarkt
gibt es bereits auch einige Studien zum Einsatz von Stammzellen bei chronischer
Herzinsuffizienz. Doch bei chronischen Herzerkrankungen sind die Voraussetzungen
für die Stammzelltherapie wesentlich schlechter als nach akutem Infarkt, denn das
frisch ischämische Myokard ist für den Empfang der Zellen durch die Aktivierung des
Endothels, die Expression von Rezeptoren und die Freisetzung von Botenstoffen
bereits sensibilisiert [149]. Eine japanische Arbeitsgruppe um Ishida und Tomita [161]
konnte dennoch am Doxorubicin induzierten Herzinsuffizienzmodell an Ratten
demonstrieren, dass nach Injektion von BMC in die linke freie Ventrikelwand
gegenüber der Vergleichsgruppe sowohl die Mortalitätsrate gesunken, als auch
positive Effekte auf die Vaskularisation beobachtet werden konnten [161] Dieser
positive Effekt konnte durch Aktivierung der Knochenmarkszellen mit Hilfe von GCSF bestätigt werden [162].
2.5.2.3 Mobilisationstherapie mit GCSF
Nach Link und Hess [137] mobilisiert G-CSF in therapeutischen Dosen Stammzellen
und Progenitorzellen aus dem Konchenmark in das periphere Blut. Ischämisches
Gewebe, z.B. Myokard nach einem Herzinfarkt, exprimiert Rezeptoren und entsendet
Botenstoffe [163], welche sowohl das Einwandern, wie auch die Adhäsion und die
Differenzierung der durch G-CSF stimulierten Progenitorzellen steuern. Die
Differenzierung in bestimmte Parenchymzellen erfolgt wahrscheinlich über Zell-ZellKontakte mit den vor Ort bereits vorhandenen, differenzierten Zellen [149]. Sowohl
nach einem Herzinfarkt, als auch bei fortschreitender Herzinsuffizienz, unterliegt der
42
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Herzmuskel einem Umbauprozess, der begleitet wird von einem Zelluntergang mit
Verlust der Gap Junctions, Fibrosierung und Expansion der Ventrikel.
Abb. 9: Schematische Darstellung des Cardiac Remodelling; modifiziert nach [166].
Sugano [164] konnte an Ratten nach akutem Herzinfarkt zeigen, dass bei
subkutaner G-CSF-Injektion die Expansion der Kammern abgemildert werden
konnte. Weitere experimentelle Studien konnten den positiven Effekt von G-CSF auf
das Remodelling nach einem akuten Herzinfarkt (MI) bestätigen [165,166]. Es konnte
gezeigt werden, dass G-CSF nicht nur über die Mobilisation von Stammzellen aus
dem Knochenmark wirkt, sondern auch direkte Wirkung auf die Kardiomyozyten, z.B.
durch Aktivierung verschiedener Signalwege (extrazelluläre signal-regulierende
Kinasen, Signalgeber und Aktivatoren der Transkription) hat. Diese kardioprotektiven
Effekte zeigen sich in der Induktion der Angiogenese und in einer Abnahme der
Apoptose. Schlussendlich kann G-CSF so ein verheerendes Remodeling des linken
Ventrikels und Dysfunktion nach akutem MI verhindern (anti-remodeling effect) [166].
43
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Abb. 10: Anti-remodeling Effekt des G-CSF nach Takano [166].
In einer kürzlich veröffentlichten Studie des Universitätsklinikums Münster konnte ein
weiterer neuer Aspekt nach einer G-CSF Behandlung von Mäusen mit künstlich
induziertem Infarkt beschrieben werden. Es kam nicht nur zu einer Verbesserung der
Pumpfunktion, sondern auch zu einer deutlichen Abnahme der Anfälligkeit für
ventrikuläre
Tachykardien.
Anscheinend
führte
die
G-CSF
Behandlung
im
Randgebiet des Infarktes zu einem deutlich geringeren Abfall der Connexin43Expression im Vergleich zur Placebogruppe und so zu einer Verminderung des
arrhythmischen Potentials [11]. Auch bei großen abgeheilten Infarkten konnte gezeigt
werden, dass die aus dem zurückliegendem Infarkt resultierende chronische
Insuffizienz sich durch eine G-CSF Behandlung deutlich verbessert [167]. Diese
Effekte begründete man auf einer Zunahme der G-CSF-Rezeptoren im insuffizienten
Herzen, einer Aktivierung verschiedener Signalgeber, sarkomerer Proteine, einer
vermehrten
Expression
von
Metalloproteinasen
und
demgegenüber
einer
Reduzierung von TNF, AT1, sowie TGF-1 [167]. Doch der Einsatz von G-CSF im
Myokardmodell wird kontrovers diskutiert. So kam es bei einer Studie mit G-CSF und
intrakoronarer Stammzellinfusion zwar zu einer Verbesserung der Herzfunktion und
44
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
einer Förderung der Angiogenese, aber auch zu einer Erhöhung der Re-Stenose
Anfälligkeit [168]. Eine weitere Arbeitsgruppe berichtete, dass eine subkutane Gabe
von GM-CSF (Granulozten-Monozyten Kolonie stimulierender Faktor) nach akutem
Infarkt keinen Effekt auf die Infarktgröße und die linksventrikuläre Funktion beim
Schwein zeigte [169].
Neben diesen Studien zur Wirkungsweise von G-CSF beim Herzinfarkt liegen auch
erste Ergebnisse bei chronischer Herzinsuffizienz vor, die ebenfalls mit einem
Untergang
von
Kardiomyozyten
einhergeht.
Neben
dem
Effekt
der
Stammzellmobilisation und Migration ins kranke Myokard wird eine direkte Wirkung
des G-CSF auf die Kardiomyozyten durch G-CSF- Rezeptoren und Signalwege
angenommen [170]. Wie auch im Infarktmodell konnte Wei et al. [171] zeigen, dass
bei Adriamycin- induzierter Kardiomyopathie die Fas-Protein Expression, die für die
Kardiomyozyten- Apoptose verantwortlich gemacht wird, deutlich abgeschwächt und
so der Zelltod deutlich vermindert war und die Ultrastruktur der Kammermuskulatur
besser erhalten blieb. Auch hier hatte sich die Pumpfunktion gegenüber der
Vergleichsgruppe verbessert. Takemura et al. [172] hingegen führten die verbesserte
Pumpfunktion,
das
Remodeling
und
die
erhöhte
Überlebensrate
beim
Herzinsuffizienzmodell an der Maus nach Doxorubicininduktion und G-CSF- Gabe
auf einen Rückgang der Autophagozytose (Typ 2 des programmierten Zelltodes) der
Herzzellen zurück. G-CSF induzierte hier durch Aktivierung der molekularen
Signalwege, Erhöhung von Matrix Metalloproteinasen und Reduzierung von TNF
Veränderungen [173]. In einer Studie mit Doxorubicin induzierter Herzinsuffizienz bei
der Maus konnte Takemura [174] diese Ergebnisse bestätigen. G-CSF schützte das
Herz
vor
Atrophie,
Degeneration,
Fibrose,
inflammatorischer
Zellinfiltration,
Herunterregulierung von GATA-4 und Sarcomerer Proteine, „Myosin heavy chain“,
Troponin I und Desmin. Degenerative Veränderungen wie fibrilläres Derangement
und Zerreißungen sowie die Ausweitung des Volumens subzellulärer Organellen
konnte durch die G-CSF Behandlung signifikant abgeschwächt werden. Schließlich
konnte auch in einer ersten kürzlich erschienen tiermedizinischen klinischen Studie
an drei Hunden mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) und Therapieresistenz auf
konventionelle Therapieverfahren nach subkutaner Injektion von G-CSF (10 g/kg)
45
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
eine deutliche Verbesserung der Herzfunktion im Herzultraschall gezeigt werden
[175]. Auch eine erste kleine Studie am Menschen zeigte bei 10 Patienten mit
fortgeschrittener Herzinsuffizienz nach subkutaner G-CSF-Injektion postive Effekte
auf die Herzfunktion, ohne signifikante nachteilige Effekte der Therapie [176]. Es
scheint also, als könne G-CSF nicht nur durch Mobilisation von Stammzellen in der
Krebstherapie eingesetzt werden [177], sondern es gilt weiter herauszufinden, ob
sich die günstigen Eigenschaften von G-CSF am Herzen in weiteren Studien
bestätigen lassen und die genaue Funktionsweise zu studieren. Aufgrund der
Berichte
von
verminderter
Arrhythmieanfälligkeit
nach
G-CSF-Gabe
beim
Infarktmodell [11] und positiver Effekte auf die Herzfunktion auch bei chronischer
Herzinsuffizienz, wollten wir am Beispiel der induzierten Tachymyokardie erstmals
Untersuchungen zur Arrhythmognese am insuffizienten Herzen nach G-CSF-Gabe
durchführen. Es stellt sich die Frage ob eine G-CSF dabei eine positive Rolle bei der
Verhinderung von Proarrhythmie spielt.
2.5.3 Kardiale Connexine
Abb. 11: Struktur von Connexinen mod. Nach [85]
46
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Connexine sind Proteinuntereinheiten, die als Familie von Transmembranproteinen
die sogenannten Gap junctions bilden. Je sechs Connexine lagern sich an der
Membran zu einem Connexon zusammen, das eine Pore umschließt und so einen
Kanal bildet. Zwei Connexone zweier benachbarter Zellen bilden einen Gap junctionKanal. Durch diese Tunnelproteine ist ein direkter Austausch von Molekülen bis zu
einer Größe von 1 kDa zwischen benachbarten Zellen, und damit auch eine
metabolische Kommunikation aneinander grenzender Zellen möglich [178,179]. So
können Ca2+, ATP, Adenosin und cyclische Nukleotide von einer Zelle in die andere
durch die Gap junctions gelangen [180]. Die Hauptaufgabe dieser Kanäle im Herzen
besteht in der Übertragung des Aktionspotentials von Zelle zu Zelle [181]. Dabei ist
die Leitungsgeschwindigkeit entlang der Herzmuskelfaser jedoch sehr viel schneller
als transvers zu ihr, da sie vor allem durch die Na-Kanäle bestimmt wird, während
die transverse Komponente der Weiterleitung vor allem von der Gap junctionKopplung abhängt [179].
Wie bereits unter 2.3.1 erwähnt, erhöhen Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz die
Neigung zu kardialen Arrhythmien und gehen einher mit Veränderungen der
Ionenkanäle aber auch, wie Saffitz et al. [181,182] zeigen mit einer reduzierten
Expression des Gap junction Proteins Cx43. Dies führt unweigerlich zu Störungen
der Erregungsweiterleitung und bildet das Substrat für die Entstehung von
Arrhythmien.
2.6 Der Langendorff- Versuch
Das „isoliert perfundierte Herz nach Langendorff“ ist heute in der pharmakologischen,
physiologischen und klinischen Forschung eine der meist benutzten experimentellen
Methoden, welche es gestattet, die Tätigkeit eines Herzen ex vivo zu untersuchen
[191]. Im Gegensatz zu anderen isolierten Präparationen lassen sich am
Langendorff-Modell
auch
Interaktionen
zwischen
ventrikulären Eigenschaften untersuchen [192].
koronarvaskulären
und
47
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.6.1 Ein geschichtlicher Überblick
Angefangen hat die historische Entwicklung der Methode des isoliert perfundierten
Warmblüterherzens mit der parabiotischen Koronarperfusion Carl Ludwigs und führte
über Newell Martins Herz-Lungen-Präparat bis zu Langendorffs völliger Isolierung
und Perfusion des Herzens. Diese Zeitspanne umfasste 150 Jahre [190].
Carl Ludwig entwickelte 1846 eine Methode zur künstlichen Ernährung des isolierten
Säugetierherzens durch parabiotische Infusion. Mit diesem Prinzip konnte der
reguläre Herzschlag über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden und
sogar eine elektrische Stimulation war möglich. Probleme dieser Methode lagen
jedoch in der schnellen Blutgerinnung sowie in der mangelnden Möglichkeit, den
Herzschlag zu stoppen und das Herz wieder zu beleben. Zwar konnte sich die
Methode Carl Ludwigs nicht durchsetzen, in ihr ist aber der erste entscheidende
Schritt zum isolierten Herz zu sehen [191].
Elie von Cyon schaffte 20 Jahre später ein Modell, in dem er Froschherzen
vollständig aus dem Körper isolierte und mit Kaninchenserum perfundierte.
Der Engländer Newell Martin entwickelte ein Herz-Lungen-Präparat bei dem Herz
und Lungen im Tier verblieben. Damit besaß dieses Modell sowohl einen natürlichen,
intakten Lungenkreislauf, als auch einen künstlichen Körperkreislauf. Als Perfusat
diente defibriniertes Kälberblut, welches zur Oxygenierung mit Hilfe der Lungen
beatmet werden musste. Oscar Langendorff [193] schließlich verzichtete auf die
Oxygenierungsfunktion der Lungen und entnahm das Herz vollständig aus dem
Kadaver. Die retrograde Perfusion über die Aorta und die ausschließliche Perfusion
der Koronararterien ist entscheidend beim Langendorff-Modell. Als Perfusat diente
zunächst homologes Blut, welches später durch saline Nährlösungen ersetzt wurde.
Der letzte Schritt in der Geschichte des isoliert perfundierten Herzen vollzog sich in
der Mitte des 20. Jahrhunderts. Neely und Morgan wandelten das Langendorffperfundierte Herz in ein arbeitendes Herz, indem sie den linken Vorhof perfundierten
[190,191]. Der Begriff Langendorff- Apparatur hat sich dennoch bis heute gehalten.
48
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
2.6.2 Die historische Langendorff-Anlage
Langendorff
[193]
legte
seinem
Modell
das
Prinzip
der
Perfusion
der
Herzkranzgefäße zu Grunde. Als Perfusionsmedium diente Blut, welches defibriniert,
filtriert und erwärmt wurde. Die Injektionskanüle band er in den aufsteigenden Teil
der Aorta vor dem Ursprung der Kopfarterien ein. Entscheidend dafür, dass sich die
Semilunarklappen der Aorta schließen und auch bei kräftiger Aktion der linken
Kammer geschlossen bleiben, so dass das injizierte Blut nur in die Herzkranzgefäße
strömen kann, war ein Injektionsdruck. Die Aortenklappen öffnen sich nur, wenn der
intraventrikuläre Druck den Aortendruck übersteigt. Bedingt durch den geringen
Kammerinhalt konnte allerdings kein allzu hoher Kammerdruck entstehen, so dass
kein hoher Injektionsdruck nötig war.
Durch die Koronargefäße gelangte das Blut in den rechten Vorhof und konnte von
hier abfließen, da der Vorhof bei der Exzision des Herzen weit eröffnet wurde.
Mit dieser Methode gelang es, anscheinend tote, nicht mehr spontan schlagende
Herzen wieder zu energischem und frequentem Schlagen zu bringen. Als kritische
Faktoren erkannte Langendorff die Frische des Blutes, Verunreinigungen, Gerinnsel,
Luftblasen, die passende Temperatur, den passenden Druck sowie mechanische
Verletzungen des Herzens.
Die zur Blutdurchleitung benutzte Vorrichtung musste folgende Kriterien erfüllen: eine
Injektion unter gleichem, regelmäßigem Druck (für das Kaninchenherz 60-80 mmHg),
eine
gleichbleibende
Bluttemperatur
über
das
gesamte
Experiment,
eine
Wiederverwendung des durchs Herz geflossene Perfusats und Schutz des Herzen
vor Vertrocknung.
Der Informationsgewinn aus der Methode nach Langendorff konnte mit modernen
elektronischen, computer-gestützten Mess-, Verrechnungs- und Registriermethoden
in den letzten Jahrzehnten bei gleich bleibender Präparationstechnik erheblich
gesteigert werden. Nach wie vor ist das isoliert perfundierte Herz nach Langendorff
heute im Bereich der physiologischen, pharmakologischen und klinischen Forschung
eine der meist benutzten und zitierten experimentellen Methoden [194]
49
___________________________________________________________________
2.Literaturübersicht
Abb. 12: Historische Darstellung von Langendorffs Perfusionsapparatur 1895 [191].
.
2.6.3 Die Perfusionslösung
Langendorff benutzte Blut derselben Tierart als Perfusionsmedium, idealerweise Blut
des getöteten Tieres. Die Versuche mit Fremdblut waren zeitlich eng begrenzt [193].
Durchgesetzt hat sich aber der Gebrauch saliner Nährlösungen. Als vorteilhaft
erweist sich vor allem das Fehlen unkontrollierbarer endogener Substanzen, wie sie
im Blut vorhanden sind. Künstliches Blut sowie hämoglobinhaltige Lösungen wären
einsetzbar, wobei der Kosten- und Zeitaufwand wesentlich höher, als für die
Herstellung saliner Perfusionsmedien ist [194].
Schon 1898 konnte Rusch [195] nachweisen, dass das Herz auch mit rein saliner
Ringer-Lösung für kurze Zeit schlagend erhalten werden kann. Krebs und Henseleit
[195] entwickelten 1932 eine Salzlösung, die dem Säugetierserum bezüglich der
Zusammensetzung der anorganischen Salze näher kommt und sich durch seinen
höheren Kaliumgehalt sowie durch das Vorhandensein von Magnesium, Phosphat
und Sulfat auszeichnet. Heute ist die Krebs-Henseleit-Lösung das meist benutzte
Perfusionsmedium[194].
50
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3. Material und Methode
3.1 Versuchstiergut
Für die Versuchsreihe wurden weiße Neuseelandkaninchen mit einem Gewicht von
3,0-4,5 kg eingesetzt. Es wurden für die Versuche vier Tiergruppen unterschieden:
24 Schrittmacher-Tiere
13 Tiere HI – G-CSF
11 Tiere HI – ohne G-CSF
24 Sham-operierte- Tiere
13 Tiere Sham – G-CSF
11 Tiere Sham ohne G-CSF
Es kamen dabei nur weibliche Tiere zum Einsatz, da bei Frauen bekannt ist, dass sie
ein längeres QTc-Intervall als Männer haben, und dass somit auch das Geschlecht
einen wesentlichen Einfluss auf elektrophysiologische Vorgänge am Herzen hat
[196]. Klinische Studien haben auch gezeigt, dass Frauen eine erhöhte Neigung zu
medikamenten-induzierten Torsade de Pointes haben [197]. Aus diesem Grund
wurden bei dieser Versuchsreihe keine Rammler eingesetzt, um deutliche Effekte
beim Provozieren der Arrhythmien zu erhalten.
Die Tiere waren in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung (ZTE) des
Universitätsklinikums Münster bei einer Raumtemperatur von 20 °C, einer
Luftfeuchtigkeit von 60 % und einem Licht-Dunkel Zyklus von 12:12 h untergebracht.
Die dort angestellten Fachpflegekräfte waren für die Fütterung, Pflege und
Beobachtung der Tiere verantwortlich. Die perioperative Überwachung der Tiere
erfolgte jedoch durch unsere Arbeitsgruppe. Die Kaninchen wurden mit dem
Standard- Diätfutter für Kaninchen der Firma Altromin® gefüttert, Wasser stand ad
libitum zur Verfügung. Vor dem operativen Eingriff wurde bei jedem Tier das Gewicht
ermittelt, ebenso vor jeder erneuten Manipulation der Tiere. Da nur gesunde Tiere für
die Studie in Frage kamen, mussten vor OP-Beginn alle Tiere klinisch untersucht
3. Material und Methode
51
_____________________________________________________________________________________________________
werden. Um eine Erkrankung auszuschließen, die die Induktion der Herzinsuffizienz
hätte beeinflussen können, wurden die Kaninchen einer Allgemeinuntersuchung
unterzogen.
3.2 Schrittmacherimplantation
Abb. 13: Lagerung des Kaninchens im Operationsraum unter dem C-Bogen
3.2.1 Operationsvorbereitung
Zunächst wurden die Kaninchen, wie bereits erwähnt, allgemeinklinisch untersucht
und gewogen. War die Operationseignung festgestellt, narkotisierten wir das Tier
52
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
durch einmalige intramuskuläre Injektion in den Musculus quadriceps femoralis.
Dafür verwandten wir in der Mischspritze 35mg/kg Ketamin (Ketanest, 25mg/ml SKetaminhydrochlorid, Pfizer) und 5mg/kg Xylacin (Xylacin, 2% Xylacinhydrochlorid,
Ceva Sante Animale Tiergesundheit GmbH). Um die bei dieser Narkoseform offen
stehenden Augen vor Austrocknung und eventuell folgender Konjunktivitis zu
schützen, trugen wir Bepanthen Augensalbe (Roche) auf. Nach Eintritt der Narkose
verbrachten wir das Tier in Rückenlage und konnten nun den Hals des Tieres im
Bereich der rechten Drosselrinne großzügig frei scheren. Außerdem wurde ein
kleines Areal im Nackenbereich geschoren.
Im Operationsraum wurden die Tiere mit tiefer gelagertem Kopf in Rückenlage
verbracht (Trendelenburg-Lagerung). Als Unterlage diente ein von der Arbeitsgruppe
modifiziertes röntgenstrahlendurchlässiges, leicht gepolstertes Plastikregal. An den
Hinterläufen wurden die Kaninchen an der höchsten Stelle der Unterlage fixiert, um
nicht kopfwärts abzugleiten. Der Kopf wurde durch eine Nackenrolle gestreckt und
durch eine angepasste Beatmungsmaske fixiert. Über diese wurde während der
gesamten Operation Sauerstoff mit einem Flow von 10 l/min gegeben. Die Tiere
atmeten dabei spontan. Die Vorderläufe wurden nach kaudal gezogen und mit einem
Klebestreifen, der wie ein Gurt quer über das Kaninchen verlief, fixiert.
Für die Überwachung der vitalen Parameter wurde während der gesamten Operation
ein Elektrokardiogramm aufgezeichnet. So konnte über die bipolaren Ableitungen
nach Einthoven ( I, II, III ), sowie die unipolaren Ableitungen nach Goldberger (aVF,
aVL,
aVR)
die
Herzaktion
beobachtet
werden.
Dazu
dienten
subkutane
Stechelektroden, die an allen vier Extremitäten angebracht wurden.
Über eine in der lateralen Ohrrandvene fixierten Verweilkanüle (Butterfly 50 Venofix
A, 25G Braun) wurde über die Dauer von 1 h etwa 50-70 ml isotone NatriumchloridLösung (0,9 % NaCl, Braun) infundiert. Der frei rasierte Bereich am Hals wurde
schließlich mit Kodan (gefärbte Lösung) desinfiziert.
3.2.2 Operation
Zunächst stellten wir mit Hilfe eines sterilen selbstklebenden Lochtuches (Adhesive
Towel 75x75 cm, Mölnlycke Health Care GmbH) die rechte Halsregion des Tieres
53
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
dar.
Ein
zweites
Tuch
ohne
Loch
diente
der
sterilen
Abdeckung
des
Kaninchenkörpers.
Der Führungskatheter für die Schrittmacherelektrode (Temporary Fixation Lead,
Medtronic) wurde entsprechend der anatomischen Verhältnisse des Kaninchens auf
eine Länge von ca. 15 cm gekürzt.
Nach Aufsuchen der Trachea wurde lateral davon ein ca. 3 cm langer Hautschnitt
durchgeführt. Nun musste die Vena jugularis externa im subcutanen Fettgewebe
aufgefunden und ihrem Verlauf nach auf einer Länge von ca. 1,5 cm frei präpariert
werden. Das so mobilisierte Teilstück der Vene wurde nun jeweils am kranialen und
am kaudalen Ende mit einem chirurgischen Faden (Ethibond Excel grün geflochten,
beschichtet, CP-1, 36 mm, ½ c) so umschlungen, dass sich die Schlaufe durch eine
zweite Schlinge öffnen und schließen ließ und somit das Lumen des Gefäßes bei
Bedarf geöffnet und geschlossen werden konnte.
In leicht gestautem Zustand wurde die Vena jugularis externa nun mit einer Pinzette
aufgespannt und mit dem Skalpell angeritzt. Jetzt konnte das Gefäß mit einem
Gefäßhaken eröffnet und der Führungskatheter durch diese Öffnung ein Stück weit
vorgeschoben werden.
Abb. 14: Vorschieben des Führungskatheters in die freigelegte Vena Jugularis mit Hilfe des
Venenhakens,
54
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Nun musste der OP-Tisch für die Röntgendurchleuchtung so in Position verbracht
werden, dass der Thoraxbereich des Tieres mittig unter der Röntgenröhre zu liegen
kam. Unter Röntgenkontrolle (3 Bilder/Sekunde) konnte der Führungskatheter
vorsichtig vorgeschoben werden. Gleichzeitiger leichter Zug am verschlossenen
kranialen Anteil erleichterte das Vorschieben und verhinderte eine Invagination des
kaudalen Anteils. Außerdem wurde durch die verschlossenen Schlaufen der venöse
Blutstrom unterbrochen und somit der Blutverlust während der Operation minimiert.
Während des Vorschiebens wurde vor allem auch das EKG beobachtet, da bei
korrekter Platzierung des Führungskatheters im rechten Ventrikel kurzfristig beim
Überwinden der Atrioventrikularklappen ventrikuläre Extrasystolen zu sehen waren.
War der Führungskatheter sicher im rechten Herzen platziert, konnte die eigentliche
Schrittmachersonde
über
den
Katheter
vorgeschoben
werden.
Durch
Schwellenbestimmung wurde am Endokard solange getestet, bis der Ort der
minimalen Kammererregungsschwelle mit 1V/ 2mA gefunden war. Die dabei meist
entstandene Schlaufe im Ventrikel war auch auf dem Röntgenbild deutlich sichtbar.
Abb. 15: Röntgenbild des C-Bogens mit vorgeschobenem Führungskatheter.
55
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Nun
musste
der
Führungskatheter
über
die
Schrittmachersonde
wieder
zurückgezogen werden. Dabei wurde ein geringer Druck auf die Sonde ausgeübt, um
deren Position im Ventrikel nicht durch die Manipulation am Führungskatheter zu
verändern. Mit der kaudalen Stauungsschlinge wurde die Sonde nun in der Vene
fixiert. Außerdem legten wir im subkutanen Fettgewebe die Sonde in eine Schlaufe
und befestigten diese durch eine Naht. Das kraniale Ende der Vene wurde mit der
vorhandenen Stauungsschlinge abgebunden und verschlossen. Vom Nacken des
Tieres aus wurde nun mit einer langen Rinderbraunüle (Braunüle MT 3G 14 8cm,
Braun Melsungen) subkutan bis in die Operationswunde ein Stichkanal für die
Schrittmachersonde gelegt, durch den die Schrittmachersonde im Nacken des Tieres
durch die Haut nach außen geführt wurde. So lief die Sonde bis dahin geschützt im
Unterhautfettgewebe des Halses. Auch an der Austrittsstelle im Nacken wurde die
Sonde noch einmal mit einem Stich festgenäht.
Schließlich wurde die Operationswunde mit Einzelheften adaptiert (Prolene 3-0, PS-2
19 mm, 3/8c, blau monofil, nicht resobierbar) und mit in Betaisodona (Mundipharm
GmbH) getränkten Kompressen abgedeckt. Der außerhalb des Kaninchens
befindliche Teil der Schrittmachersonde wurde aufgerollt, in Kompressen gewickelt
und im Nacken des Tieres platziert. Abschließend wurde dem Tier ein Verband
angelegt (Acrylastic dehnbar, 10 cm breit). Um diesem Stabilität zu verleihen wurde
darin ein selbst gebastelter Kragen integriert. Dieser aus einem PlastikJoghurtbecher herausgeschnittene und allseitig abgepolsterte Kragen verhinderte
auch ein Durchkratzen des Verbandes durch die Tiere und schützte so vor einem
Herausziehen der Schrittmachersonde.
Post operativ erhielten die Tiere noch zunächst für ca. 30 Minuten Sauerstoff über
die Gesichtsmaske. Des weiteren versorgten wir die Kaninchen über zwei Tage mit
Meloxicam (0,2 mg/kg s.c., Metacam®) zur Schmerztherapie sowie prophylaktisch
dreimalig im Abstand von 48 h mit Antibiotika (0,1 ml/kg i.m. LangzeitpenicillinStreptomycin, Suspension, Bayer). Wegen der eingeschränkten Beweglichkeit des
Halses wurde den Tieren das Futter und Wasser über Bodennäpfe ad libitum zur
Verfügung gestellt.
3. Material und Methode
56
_____________________________________________________________________________________________________
3.3 Stimulation
3.3.1 Anschließen des externen Schrittmachers
Nach einer fünf- bis siebentägigen Rekonvaleszenzphase wurden die Kaninchen an
den externen Schrittmacher (Medtronic) über die liegenden Schrittmachersonden
angeschlossen.
Dafür wurden die Tiere zunächst mit Domitor® (0,1 ml/kg i.m., Pfizer) sediert und
nach kurzer Wartezeit wieder ein EKG über Stechelektroden an den Extremitäten
abgeleitet. So konnte die Stimulation über den Monitor gut verfolgt werden. Der
Halskragen der Tiere wurde zunächst abgenommen und die Operationswunde auf
Schwellung oder Entzündung hin untersucht. Nun wurden die Enden des im Nacken
der Tiere platzierten Schrittmacherkabels mit einer Backenzange so gebogen, dass
sie in die Stecker am externen Schrittmacher passten. Der Schrittmacher wurde mit
dem Programmiergerät von Biotronik (EPR 1000 plus) programmiert, so dass mit 300
Schlägen pro Minute bei 5,2 V und 0,4 ms stimuliert wurde. Die physiologische
Herzfrequenz bei Kaninchen liegt bei den schwereren Rassen bei ca. 200 Schlägen
pro Minute. Dabei wurde die Stimulationsstärke des Schrittmachers solange
gesteigert, bis ventrikuläre Schrittmacherkomplexe im EKG den Eigenrhythmus des
Kaninchenherzens ablösten. Die Stimulationsschwelle konnte auf diese Weise exakt
bestimmt werden, sie lag meist bei ca. 4 V, etwas unter dem später eingestellten
Wert. Dies sollte eine durchgängige Stimulation des Herzens durch den externen
Schrittmacher sicherstellen, auch wenn die Sonde im Herzen ihre Position leicht
ändern würde. Schließlich wurde ein frischer Verband angelegt, in den das
Schrittmacherkabel mit dem nun angeschlossenen Schrittmacher integriert wurde.
Die Kaninchen erhielten abschließend 0,1 ml/kg Antisedan® (i.m., Pfizer).
3. Material und Methode
57
_____________________________________________________________________________________________________
3.3.2 Intensivierung der Stimulation
Die physiologische Herzfrequenz der Kaninchen liegt bei 180-200 Schlägen pro
Minute. Um die Herzen schrittweise an die Stimulation zu gewöhnen, stimulierten wir
die Tiere zunächst über einen Zeitraum von sieben Tage mit 300 Schlägen pro
Minute. Hiernach erhöhten wir die Frequenz des externen Schrittmachers auf 400
Schläge pro Minute. Für diesen Vorgang wurde die Herzfrequenz mittels Stethoskop
überwacht. Der Zeitpunkt des Umstellens konnte in der überwiegenden Zahl der
Fälle deutlich gehört werden. So konnte eine Sedation der Tiere vermieden werden,
die Tiere waren bei vollem Bewusstsein. War die Frequenzsteigerung jedoch nicht
sicher zu hören, wurden die Tiere kurz sediert, an das EKG angeschlossen und die
Umstellung so überwacht. Gelegentlich war es dann nötig, den Schwellenwert erneut
zu bestimmen und die Volt- oder ms-Zahl zu erhöhen, um ein sicheres Folgen
(Ankoppeln) des Herzens zu gewährleisten. Auch bei den im weiteren Verlauf
folgenden echokardiographischen Untersuchungen wurde die Ankopplung jeweils
erneut überprüft
Abb. 16: Obere EKG-Linie zeigt den natürlichen Herzschlag des Kaninchens, in der unteren
EKG-Linie ist das Kaninchen an den Herzschrittmacher angekoppelt.
58
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.4 Klinische Untersuchung der Tiere
In der Zeit nach der Operation wurden die Kaninchen täglich einer kurzen klinischen
Allgemeinuntersuchung
unterzogen.
Dazu
gehörten
die
Untersuchung
des
Allgemein- und Ernährungszustandes, die Adspektion von Haut, Haarkleid
(besonders im Bereich des Halskragens), Schleimhäuten und Maulhöhle, die
Palpation von Lymphknoten und Abdomen, sowie die Auskultation von Herz und
Lunge. Außerdem wurde das Körpergewicht der Tiere überwacht. Selten fanden sich
leichte Konjunktivitis oder Kratzverletzungen im Bereich des Halsverbandes in den
ersten Tagen nach der Operation. Bei der Auskultation des Herzens wurde vor allem
auf die Herzfrequenz, die Lautstärke der Herztöne sowie vorhandene Herzgeräusche
geachtet, wobei Letztere bei der sehr hohen Herzfrequenz und der häufigen
Überlagerung durch die Atemgeräusche nur bedingt zu beurteilen war. Gegen Ende
der
Herzinsuffizienz-
Induktion
war
immer
eine
deutlich
schlechte
Herzkreislaufsituation der Kaninchen klinisch auszumachen.
3.5 G-CSF Applikation
Vom Tage der Operation an wurden die G-CSF- Versuchsgruppen täglich mit einem
G-CSF Präparat (Granocyte, 34 Mio IE, 264 g, Chugai Pharma Marketing)
behandelt. Dazu wurde das gefriergetrocknete G-CSF mit 6,6 ml isotoner NaClLösung aufgelöst, so dass in einem Milliliter Lösung 40 g G-CSF enthalten waren.
Einem durchschnittlich 4 kg schweren Kaninchen wurde täglich ein Milliliter der
Lösung (10 g G-CSF/ kg KG) im Anschluss an die klinische Allgemeinuntersuchung
subkutan injiziert. Das Präparat wurde über den gesamten Zeitraum der
Insuffizienzinduktion verabreicht, bis zum Tage der Euthanasie des Tieres. Bei der
G-CSF Sham- Versuchstiergruppe injizierten wir das Therapeutikum mindestens
über einen Zeitraum von zwei Wochen.
59
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.6 Echokardiographie
Ab dem 14. Tag nach der Operation wurden regelmäßig echokardiographische
Kontrollen durchgeführt, um den Verlauf der Insuffizienz nicht nur klinisch, sondern
auch anhand vergleichbarer bildgebender Daten verfolgen zu können. So stellte
diese
nichtinvasive
Kontrolle
der
kardialen
Funktion
mittels
Doppler-
Echokardiographie den wichtigsten Teil der Einschätzung des zeitlichen Verlaufs und
der morphologischen Ausprägung der Herzinsuffizienz dar. Da nach neuesten
Erkenntnissen
gerade
die
Xylazin/Ketamin-Anästhesie
deutlich
messbare
kardiodepressive Effekte auf die Herzfunktion hat [198], wurden die Kaninchen
hierfür mit Isoflurane über eine selbst konstruierte Gesichtsmaske in eine flache
Inhalationsnarkose (Einleitung mit 4 Vol.%, Erhaltung mit 2 Vol.% bei 6 l/h O2) gelegt.
Um eine bessere Ankopplung des Schallkopfes zu erreichen, wurden die Tiere
parasternal vor allem im Bereich des dritten bis sechsten Interkostalraumes
geschoren. Anschließend wurde eine Schicht Ultraschallgel auf den Brustkorb
aufgetragen, welches zuvor bei 3000 rpm für zehn Minuten zentrifugiert worden war,
um Lufteinschlüsse zu verhindern, die die akustische Ankopplung stören würden. Für
die transthorakale Echokardiographie nutzen wir einen 12 MHz Sektor- Schallkopf
(SONOS 5500, B2 software package, Philips Medical Systems, The Netherlands),
der vorsichtig in die Gelschicht getaucht wurde, möglichst ohne Druck auf den
Thorax auszuüben. Um zunächst einen Überblick zu bekommen, wurde mit einem
Kurzachsenschall sowie mit dem vier- bzw. fünf Kammerblick in der Längsachse im
B-Mode begonnen. So ließen sich die Länge des linken Ventrikels in der Enddiastole,
Aortenwurzeldurchmesser sowie die Vorhöfe oder auch Perikardergüsse im
bewegten
Bild
beurteilen.
Anschließend
nutzen
wir
im
parasternalen
Längsachsenschnitt auf mittlerer Höhe der Papillarmuskeln den M-Mode, um die
Wanddicken
des
Ventrikelseptums
(IVSS,
IVSD),
der
rechtsventrikulären
Vorderwand, der linksventrikulären Hinterwand (LVPWS, LVPWD) sowie den
Durchmesser des linken Ventrikels (LVDD, LVDS) und Perikardergüsse jeweils
endsystolisch und enddiastolisch ausmessen zu können. Die Messungen wurden
nach der „leading-edge to leading-edge“-Methode der „American Society of
60
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Echokardiography“ durchgeführt [199]. So konnte die so genannte FS (fractional
shorting)
oder
Verkürzungsfraktion
als
grob
orientierender
Parameter
zur
Einschätzung der linksventrikulären systolischen Funktion bestimmt werden. Er dient
als Maß für die Kontraktionsfähigkeit des Ventrikels. Des Weiteren konnten aus den
im M-Mode gemessenen Werten die Ejektionsfraktion (EF) modifiziert nach Simpson
errechnet werden [200]. Auch die EF dient als Maß für die Kontraktionsfähigkeit des
Herzens und ist die Differenz aus enddiastolischem und endsystolischem
linksventrikulärem Volumen, dividiert durch das enddiastolische Volumen. Die
ausgeworfenen Blutvolumina und die Ejektionsfraktion wurden rechnergestützt durch
das Ultraschallgerät bestimmt. Dabei diente uns die EF als ausschlaggebender Wert
für die Beurteilung der Herzinsuffizienz.
Bereits an Tag 14 der hochfrequenten Schrittmacherstimulation zeigten sich typische
Anzeichen einer Links- und Rechtsherzinsuffizienz mit deutlicher Verschlechterung
der linksventrikulären Funktion, Dilatation des rechten und linken Ventrikels sowie
der Vorhöfe. Zum Teil zeigten sich hochgradige Perikardergüsse und eine massive
Verschlechterung der Wandbewegungen. Stellte sich bei den Kaninchen eine
chronische Herzinsuffizienz mit einer Ejektionsfraktion von weniger als 25 % ein, war
das Ziel der Hochfrequenzstimulation erreicht [201].
Abb. 17: Darstellung im M-Mode. Sham-Tier; gute linkventrikuläre Kontraktilität (EF: 74,5 %).
3. Material und Methode
61
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 18: Darstellung im M-Mode: herzinsuffizientes Tier mit deutlich reduzierten
Kontraktionsbewegungen, vergrößertem Ventrikel und dünnerem Myokard (EF: 23,6 %).
Abb. 19: Darstellung im M-Mode: mit G-CSF-behandeltes herzinsuffizientes Tier, ebenfalls
deutlich reduzierte Kontraktionsbewegungen (EF: 10,8 %).
62
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.7 Der Langendorff-Versuch
3.7.1 Präparation des isolierten Kaninchenherzens
Die Kaninchen wurden vor der Präparation zunächst gewogen. Dabei wogen die
Tiere im Schnitt 3,8 kg ± 500 g. Prämediziert wurde über die laterale Ohrrandvene
(V.
auricularis
superficialis)
mit
einem
Butterfly.
Um
eine
intrakardiale
Thrombenbildung zu verhindern, injizierten wir Heparin- Natrium (1000 IU/kg
Liquenium, Hoffmann La Roche AG, Deutschland). Anschließend erreichte man mit
langsamer Thiopental Gabe eine Betäubung der Tiere mit Erschlaffung der
Willkürmuskulatur und Bewusstseinsverlust. Die Überprüfung des Lidreflexes zeigte
uns die Tiefe der Narkose, fiel dieser negativ aus, konnte mit der Präparation
begonnen werden.
Der Tod des Tieres wurde durch Eröffnen der Halsschlaggefäße (Kehlschnitt) am
über Kopf hängenden Tier herbeigeführt. Nach ca. zwei bis drei Sekunden legte der
Assistent das Kaninchen mit dem Rücken auf das Präparationstablett. Durch Zug
jeweils an den Vorder- und Hinterextremitäten hielt der Assistent die Bauchdecke
unter Spannung. Nun eröffnete man parallel zum Rippenbogen die Bauchhöhle so,
dass man, nach Zurückklappen der Leber freie Sicht auf das Zwerchfell hatte. Nach
Ablösen des Zwerchfells wurde die Brustwand mit einer handelsüblichen
Geflügelschere durchtrennt, so dass der knöcherne Thorax zurückgeklappt werden
konnte und man freie Sicht auf das schlagende Herz hatte. Jetzt wurde das Herz von
den umgebenden Strukturen befreit und der Herzbeutel eröffnet. Unter Erhalt eines
ausreichend langen Aortenstumpfes konnte das Kaninchenherz nun entnommen
werden. Das Herz wurde unverzüglich in ein Becherglas getaucht, das mit 37 °C
warmer Krebs-Henseleit Lösung gefüllt war. Da die Versorgung des Herzens
aufrechterhalten werden musste, wurde es schnellstmöglich an die dafür
vorgesehene Kanüle der Langendorff-Anlage gehängt. Um die retrograde Perfusion
gewährleisten
zu
können,
war
jedoch
zunächst
das
Durchtrennen
des
Pulmonalarterienstammes nötig. Erst jetzt konnte man mit Hilfe eines chirurgischen
Fadens (3 metric Vicryl, Ethicon) das Herz an der Glaskanüle befestigen. Bevor das
Herz nun einige Minuten in Ruhe in der Lösung des Becherglases ausbluten konnte,
wurde es von letzten eventuell verblieben Lungen- oder Geweberesten im Bereich
3. Material und Methode
63
_____________________________________________________________________________________________________
der Herzbasis befreit. Blutete das Organ nicht vollständig aus, bevor es ins
endgültige Wasserbad der Langendorff-Anlage getaucht wurde, konnte die Trübung
der Lösung zu einer deutlichen Sichtbehinderung beim korrekten Platzieren der
MAP- Katheter führen. Schließlich diente ein an einer Kanüle befestigter kleiner
Ballon, der über den Vorhof in den linken Ventrikel geschoben wurde, der
Stabilisierung des Herzens. Dafür war es jedoch nötig, ein kleines Loch in das linke
Atrium zu schneiden, um den Ballon vorschieben zu können. Dabei musste man
vorsichtig die Mitralklappe überwinden, um keine Papillarmuskeln zu beschädigen.
Die Ballonkanüle wurde nun mit Pflasterstreifen an der Aortenkanüle fixiert. Diese
Konstruktion diente dazu, das Herz innerhalb des Wärmebades zu stabilisieren und
den Druck im Herzen mittels eines im Ballon befindlichen Druckaufnehmers
kontinuierlich zu registrieren. Letztlich wurde ein kleiner Zugang zu beiden Vorhöfen
frei präpariert, um durch Quetschen mit einer Gewebepinzette im Bereich der AVKnotenregion an der unteren Grenze des Vorhofseptums einen AV-Block zu
induzieren. Dies erfolgte bereits unter EKG-Kontrolle, welches zuvor um das Herz
herum platziert worden war. Daraufhin wurden nach standardisiertem Muster sieben
der vierpoligen monophasischen Aktionspotential (MAP)-Katheter epikardial auf dem
Kaninchenherzen platziert. Der achte MAP-Katheter wurde neben dem Ballon
vorsichtig in den linken Ventrikel vorgeschoben und lag somit endokardial an der
Herzspitze.
Vom Durchtrennen der Jugulargefäße bis zum Anschluss des Herzens an die
Aortenkanüle der Langendorff-Apparatur vergingen durchschnittlich 90 s.
64
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.7.2 Versuchsaufbau
Grundlage der Versuche bildete die Langendorff-Apparatur (Hugo Sachs Elektronik,
Medical Research Instrumentation, March-Hugstetten, Deutschland), die es uns
ermöglichte,
unter
konstanten
Bedingungen
(Perfusionsdruck,
Koronarfluss,
Temperatur) das isolierte Kaninchenherz über die Aorta retrograd zu perfundieren.
So konnten elektrophysiologische Parameter zum Beispiel über ein EKG oder die
Ableitung monophasischer Aktionspotentiale (MAP) gemessen werden.
Abb. 20: Schematische Darstellung der Langendorff- Apparatur der Firma Hugo Sachs
Elektronik
65
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.7.2.1 Perfusionslösung und Wärmebad
Um das Herz mit allen nötigen Elektrolyten und Energie zu versorgen, musste vor
Versuchsbeginn eine Nährlösung hergestellt werden. Dazu wurden an einer
elektrischen Waage (Satorius, BP 210 S) zunächst für die Krebs-Henseleit-Lösung
(KHB) alle nötigen Chemikalien (Sigma-Aldrich) abgewogen und in 10 l deionisiertem Wasser gelöst (siehe Tab.1). Im zweiten Lösungsansatz wurden zwei der
zehn Liter mit reduziertem Kalium-Gehalt hergestellt. Anschließend wurde die
Lösung mit Hilfe von Faltenfiltern (Watman® GmbH, 595 ½) filtriert und konnte nun
zum Einsatz kommen.
Tab. 1: Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösung
Substanz
C (mmol/l)
NaCl
118,00
NaHCO3
24,88
Glucose H2O
5,55
Na-Pyruvat
2,00
MgSo4 x 7 H2O
0,83
CaCl2 x 2 H2O
1,80
KH2PO4
1,18
KCl (5,8mmol)
4,70
oder KCl (1,5 mmol)
0,33
Die Krebs-Henseleit-Lösung wurde mit Hilfe einer Kreiselpumpe (Ecoline VC-MS/CA
6-8) aus dem Vorratsbehältnis mit konstanter Geschwindigkeit (Flow: 52 ml/min)
durch den Wärmetauscher der Langendorff-Anlage zum Herzen gepumpt. Der Flow
wurde vor Versuchsbeginn manuell mit einem Messzylinder überprüft. Die
Perfusionslösung wurde während des gesamten Versuches mit Carbogen, einem
Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid begast, um eine
Sauerstoffsättigung der Lösung zu erreichen. Der Wärmeaustauscher der Anlage
erwärmte das Perfusat mit Hilfe doppelwandiger Röhren, die im Gegenstromprinzip
spiralförmig verliefen, so dass es eine Temperatur von ca. 37 °C hatte, wenn es das
Kaninchenherz erreichte. Das Herz selbst hing ebenfalls in einem durch
66
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
doppelwandiges Glas aufgewärmten Lösungsbad an der Langendorff-Anlage. Die
Temperatur des Wärmebads und der geförderten Lösung wurden vor Beginn und
während des Versuches mit einem digitalen Thermometer überprüft.
Mit einem
konstanten Perfusionsdruck von 90 mmHg, der zuvor an der Apparatur eingestellt
werden konnte, durchfloss das Perfusat über die Perfusionskanüle der Anlage
retrograd die Aorta ascendens und die Koronarien. Anschließend versorgte die
Lösung das Myokard und sammelte sich nach Passage des Sinus coronarius und
des rechten Vorhofs im rechten Ventrikel, um über die eröffnete Arteria pulmonalis in
das Wärmebad ausgestoßen zu werden. Auf diese Weise wurde die Lösung ständig
erneuert, da überschüssige Lösung über ein Ventil aus dem Wärmebad wieder
abfließen konnte.
Mit
Hilfe
von
Dreiwegehähnen
war
es
außerdem
möglich,
verschiedene
Medikamente über einen Perfusor (Perfusor®, Secura, Braun) dem Perfusat zu
zugeben. Ebenso war der Wechsel von normaler Krebs-Henseleit-Lösung (KHB) zu
hypokaliämischer KHB durch Umlegen eines Dreiwegehahnes möglich, ohne dass
dabei Perfusionspausen im Myokard entstanden.
3.7.2.2 EKG-Ableitung
Während des gesamten Versuchs wurde kontinuierlich ein Elektrokardiogramm
abgeleitet. Im Wärmebad der Langendorff-Apparatur befanden sich auf einer von
Hugo Sachs entwickelten Plattform Elektroden einer Vielpol-EKG-Ableitung aus
Silber/Silberchlorid. Sie waren auf der Einrichtung so angebracht, dass sie auch
ohne das Vorhandensein eines Kaninchenkörpers neben der Aufzeichnung der
Extremitäten-Ableitungen
nach
Goldberger
und
Einthoven
zusätzlich
die
Aufzeichnung von sechs Brustwandableitungen simulierten. Die Elektroden wurden
mit Hilfe ihrer aus weichem Gummi bestehenden Arme, die über ein Kugellager mit
der Plattform verbunden waren, dicht um das in das Wärmebad getauchte Herz
platziert. So konnten auch während des Versuches die Positionen der Elektroden
angepasst werden. Die Ableitung der elektrischen Ströme erfolgte ohne direkten
Kontakt
zum
Organ
durch
die
Lösung.
Die
Signale
wurden
mittels
3. Material und Methode
67
_____________________________________________________________________________________________________
Standardverstärkers mit einem 0,1- 300 Hz-Filter verstärkt. Die Aufzeichnung des
EKGs übernahm eine Anlage der Firma Bard (Lab System, Recording and Analysis
for Electrophysiology, C. R. Bard, Inc. 1989-1996).
Abb. 21: EKG-Korb der Langendorff-Anlage.
3.7.2.3 MAP-Ableitung
Abb. 23: Isoliertes Kaninchenherz nach Präparation und Platzierung der Katheter. Das Herz ist
über die Aorta an einer Kanüle befestigt.
68
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Die epikardialen monophasischen Aktionspotentiale wurden mit Hilfe von sieben
kreisförmig um das Herz angeordneten Kathetern (EP Technologies Mountain View,
CA, USA) abgeleitet. Diese waren über Stahlröhrchen mit einem eigens verstellbaren
Federmechanismus so angebracht, dass sie senkrecht auf dem Herzen standen und
den Kontraktionsbewegungen des Herzens mit konstantem Druck folgen konnten.
Ein weiterer achter flexibler Katheter ohne Führungsröhrchen wurde vorsichtig
parallel zum Ballonkatheter in den linken Ventrikel bis zur Herzspitze vorgeschoben,
um endokardiale Messungen durchzuführen. Die Position der Katheter war
standardisiert vorgegeben (drei rechts epikardial, vier links epikardial, einer links
endokardial). Waren sie einmal platziert, wurden sie während des Versuchs nur zur
Optimierung der Signale geringgradig verändert. Die Katheterspitzen mussten nur
dann großzügiger verschoben werden, wenn deutliche Formveränderungen wie
Verkürzung mit Zuspitzung der Signale bestehen blieben. Meist waren kleine lokale
Myokardischämien die Ursache.
Map IV
Map V
Map III
Map VI
Map II
Map I
Map VII
Map VIII
Abb. 22: Standardisierte Platzierung der MAP-Katheter auf dem Herzen.
Mit Hilfe dieser Katheter konnten also monophasische Aktionspotentiale abgeleitet,
und damit Dauer und Ablauf von Depolarisation und Repolarisation des
Myokardgewebes während des gesamten Versuchs wiedergegeben werden. Sowohl
in-vitro [201] als auch in-vivo bei Tiermodellen [202, 203] und beim Menschen [204]
stellt die Aufzeichnung monophasischer Aktionspotentiale ein probates Mittel zur
69
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Bestimmung des Verlaufs der Repolarisation dar. Mit Hilfe dieser auch klinisch
verwendeten Katheter sind jedoch nicht nur MAP-Signale abgeleitet worden, sondern
das Kaninchenherz wurde auch fixfrequent mittels eines Stimulators über den mittig
rechts epikardial platzierten Katheter stimuliert. Alle MAP-Signale wurden verstärkt
und gefiltert (0,1-300 Hz) und zur Offline-Analyse mit einer volldigitalen
Aufzeichnungsanlage (BARD Electrophysiology LabSystem) auf Optical-Disks
aufgezeichnet. Mit einer Rate von 1 kHz und einer Auflösung von 12 bit wurden die
Daten gespeichert und online digitalisiert.
3.7.2.4 Stimulation
Um das Herz mit Hilfe eines Stimulators (universal programmable stimulator, UHS
20, Biotronik, Germany) stimulieren zu können, wurde zuvor, wie unter 3.7.1
beschrieben, unter EKG-Kontrolle das Vorhofseptum nahe der Ventilebene im
Bereich des AV-Knotens so lange gequetscht, bis ein langsamer junktionaler
Ersatzrhythmus den schnelleren Sinusrhythmus ablöste. Hatte der Ersatzrhythmus
eine Zykluslänge von mindestens 900 ms und blieb einige Minuten lang stabil,
konnte mit der Stimulation begonnen werden. Nach erfolgreicher mechanischer
Ablation des AV-Knotens musste zunächst die Stimulationsschwelle bestimmt
werden. Die Stimulation des Herzens erfolgte durch „Square- Wave- Pulse“ mit einer
Dauer von 2 ms durch den rechts epikardialen Katheter. Die Stimulationsstärke (in
mA) wurde so lange gesteigert, bis die elektrischen Impulse eine Kontraktion des
gesamten Herzens auslösten und somit eine Ankopplung stattgefunden hatte. Das
Stimulationsoutput
wurde
nun
verdoppelt
und
damit
die
Frequenztreppe
durchgeführt. Das heißt, dass das Herz jeweils für eine Minute, beginnend bei einer
Zykluslänge von 900 ms stimuliert wurde und dann anschließend die Zykluslänge um
100 ms verkürzt wurde, bis schließlich zur letzten Frequenz mit einer Zykluslänge
von 300 ms. Nach jeder Einlaufzeit bzw. vor jedem neuen Protokollteil wurde diese
Stimulationsschwelle erneut bestimmt und anschließend dieser Wert verdoppelt.
3. Material und Methode
70
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 24: Aufzeichnung der Frequenztreppe mit der BARD-Anlage.
3.7.3 Versuchsprotokoll bzw. Versuchsdurchführung
3.7.3.1 Frequenztreppe
Für den ersten Versuchsteil wurde das Herz zunächst ohne Zugabe von
Medikamenten bei sieben verschiedenen Zykluslängen stimuliert (900-300 ms).
Dafür wurde bei doppelter Stimulationsschwelle eine Frequenztreppe durchgeführt,
bei der beginnend bei 900 ms jeweils mindestens eine Minute stimuliert wurde. Nach
ca. einer Minute hatte sich die MAP-Länge stabilisiert, so dass für die Auswertung
die letzten zehn Sekunden genutzt werden konnten. Die Zykluslänge wurde nun um
je 100 ms nach jeder Minute reduziert bis zur letzten Frequenz von 300 ms.
3.7.3.2 Refraktärzeitbestimmung (S2/S3)
Nach dieser ersten Frequenztreppe folgte die Refraktärzeitbestimmung. Dafür wurde
zunächst wieder für eine Minute bei 900 ms stimuliert. Am Ende der Minute erfolgte
eine programmierte Doppelstimulation (S2-Bestimmung) beginnend mit einem
Abstand von 250 ms. Dabei wurde der zweite Impuls jeweils nach sieben
fixfrequenten Schlägen bei 900 ms immer um 10 ms dichter an den vorherigen
71
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Impuls „herangefahren“, solange bis auf den zweiten Impuls kein Aktionspotential
des Herzens folgte, da sich das Herz noch in der Refraktärphase befand. Für die nun
folgende S3-Bestimmung wurde der zuvor bestimmte Refraktärwert um 20 ms
erhöht, so dass das Herz auf den zweiten Stimulus hin sicher kontrahierte. Der dritte
Stimulus wurde wieder bei 250 ms begonnen und jeweils bei jeder folgenden
programmierten Stimulation nach sieben Schlägen um 10 ms so lange verkürzt, bis
das Herz auf den dritten Stimulus nicht mehr kontrahierte. Mittels programmierter
Ventrikelstimulation sollte ein Kammerflimmern des Kaninchenherzens induziert
werden.
Reagierte
das
Herz
auf
die
programmierte
Stimulation
mit
selbstterminierendem Kammerflimmern, so wurde die Stimulation für mindestens fünf
Minuten ausgesetzt, damit sich das Herz erholen konnte. War dies nicht der Fall, so
erfolgte eine Terminierung des Flimmerns mittels Defibrillator (CPI-Guidant GmbH &
Co, Gießen, Model cpi® 2815). Flimmerte das Herz auch bei dem Versuch den
Refraktärwert erneut zu ermitteln, so wurde nach dieser Wiederholung mit der
nächsten Zykluslänge begonnen.
Abb. 25: Typisches Beispiel für Kammerflimmern nach S2-Stimulation.
72
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.7.3.3 High-Rate-Protokoll
Im
Anschluss
an
die
programmierte
Stimulation
wurde
erneut
die
Stimulationsschwelle bestimmt. Es folgte nun zunächst wieder bei doppelter
Stimulationsschwelle das „High-rate-Protokoll“. Dabei wurde für fünf Sekunden mit
1000 Pulsen pro Sekunde (pps) stimuliert, um so Kammerflimmern zu induzieren.
Reagierte das Herz nicht, wurde nach einer Erholungsphase von einer Minute die
Schwelle verdreifacht und erneut für fünf Sekunden mit 1000 pps stimuliert. Nach
einer Minute Wartezeit wurde schließlich die Schwelle vervierfacht. Flimmerte das
Herz nach der High-Rate-Stimulation wurde eine Pause von fünf Minuten abgewartet
in der sich das Herz erholen konnte, bevor mit dem Protokoll fortgefahren wurde.
Das High-rate-Protokoll wurde ebenfalls einmal wiederholt.
Es wurde hiernach fünf Minuten gewartet, bis sich die MAP-Signale erholt hatten und
wieder stabile Bedingungen herrschten.
Abb. 26: Beispiel für eine „High-rate“-Stimulation ohne Kammerflimmern.
73
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 27: Beispiel für „High-rate“-Stimulation mit anschließendem Kammerflimmern.
3.7.3.4 KHB mit 1,5 mmol/l K+
Der
Stimulator
wurde
zunächst
ausgeschaltet
und
durch
Umlegen
eines
Dreiwegehahnes wurde statt der KHB-Lösung mit 5,8mM K+, KHB-Lösung mit
erniedrigter Kaliumkonzentration (1,5mM K+) infundiert. Nach fünf Minuten
Einlaufzeit legten wir den Dreiwegehahn wieder um, so dass normale Nährlösung
das Herz versorgte und sich die MAP-Signale wieder erholen konnten (ebenfalls fünf
Minuten). Mit diesem Protokollteil schafften wir Bedingungen (Hypokaliämie [69] und
der bereits bestehende AV-Block), die das Risiko für das Auftreten von Torsade de
Pointes erhöhen [205].
Während der fünf Minuten konnte das Auftreten von frühen Nachdepolarisationen,
Torsade de Pointes oder anderen Rhythmusstörungen beobachtet werden. Diese
wurden aufgezeichnet, markiert und später offline ausgewertet.
74
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 28: Beispiel für Torsade de Pointes unter erniedrigter Kaliumkonzentration bei 300 M
Erythromycin nach vorausgegangenen EADs.
3.7.3.5 Erythromycin
Im Anschluss an diesen Baseline-Teil wurde über einen seitlichen Zugang mit Hilfe
eines
Perfusors
(Perfusor®,
Secura,
Braun)
über
10
Minuten
das
Makrolidantibiotikum Erythromycin mit einer Konzentration von 150 M permanent
infundiert. Während dieser Einlaufphase war der Stimulator ausgeschaltet und das
Herz schlug im Eigenrhythmus. Dabei konnten bereits Veränderungen der MAPLänge und Form beobachtet werden.
Es ist bekannt, dass Erythromycin durch
konzentrationsabhängige Hemmung des IKr-Kanals zu einer Verlängerung der
Repolarisation und zu Torsade de Pointes führt [28, 30]. Ziel dieses Protokollteils war
es also, durch das torsadogene Potential des Erythromycins eine weitere Reduktion
der Repolarisationsreserve zu erreichen und so einen zusätzlichen Risikofaktor für
das Auslösen von Proarrhythmie zu haben. Auch hier wurde zunächst eine
Frequenztreppe, wie oben beschrieben, durchgeführt (900-300 ms), bei der jeweils
die letzten zehn Sekunden für die Auswertung genutzt wurden. Dann wurde der
Stimulator ausgestellt und es folgte wieder eine fünfminütige Einlaufphase von
75
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
hypokaliämischer KHB bei fortlaufender Infusion des Makrolidantibiotikums. Yang
und Roden [69] konnten zeigen, dass sogar während maximaler medikamentöser
Blockade des IKr- Kanals eine Reduktion der Kaliumkonzentration zu einer
zusätzlichen Blockade des Kanals führt und damit auch das Risiko für das Auftreten
von Torsade de Pointes erhöht. Anschließend wurde wieder normale Infusionslösung
verwandt. Die Versuche aller vier Versuchsgruppen wurden nach diesem Protokoll
durchgeführt.
3.7.4 Auswertung
3.7.4.1 Repolarisationszeiten und QT-Werte
Während
des
gesamten
Versuchs
wurden
zwölf
EKG-Spuren
und
acht
monophasische Aktionspotentiale über die Bard-Anlage aufgezeichnet. Für die
Auswertung wurden jeweils die letzten 15 MAPs einer Frequenztreppe zunächst
markiert, kopiert und dann digital auf ZIP-Disketten abgespeichert. Die MAP-Kurven
mussten nun über das LabVIEW-Programm, welches von Prof. M. Franz
(Washington, U.S.A.) [206] entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt
wurde, in numerische Excel-Daten konvertiert werden. Gemessen wurde jeweils
APD50 und APD90, also die Länge eines Aktionspotentials, gemessen vom steilsten
Anstieg der Depolarisation bis zu seiner 50 bzw. 90%-igen Repolarisation. Das
verwendete Computerprogramm LabVIEW 2.0 gibt dabei die Werte bis zur
entsprechenden Repolarisation vom Plateau ausgehend an.
Abb. 29: Schematische Darstellung der Messung von MAP50 und MAP90.
76
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
Die aufgezeichneten Signale konnten jedoch nur dann in die Analyse eingehen,
wenn sie reproduzierbar eine stabile Nulllinie, MAP-Dauer und Amplitude mit einer
Abweichung von nicht mehr als 10 % aufwiesen. Dann konnten aus den 15 MAPSignalen die Mittelwerte berechnet werden. Außerdem wurde die Zeit zwischen
längstem und kürzestem simultan aufgezeichnetem MAP, also die Dispersion für
APD50 und APD90, berechnet. Außerdem wurden die minimalen (MAPmin) und
maximalen (MAPmax) Werte und die entsprechende Standardabweichung erfasst.
Aus diesen Werten konnte dann die Dispersion der Repolarisation aus der Differenz
jeweils für den rechten und linken Ventrikel epikardial sowie links endokardial
berechnet werden.
Durch ein Messprogramm unterstützt, mussten die QT-Zeiten manuell ausgemessen
werden und in Excel-Tabellen eingetragen werden. Auch hier wurden daraus
Mittelwerte für die jeweilige Zykluslänge gebildet.
Durch die Aufzeichnung von MAPs kann die Dispersion der Repolarisation
quantifiziert werden.
3.7.4.2 Rhythmusstörungen
Für
die
Auswertung
waren
zwei
verschiedene
Protokollteile
mit
ihren
unterschiedlichen arrhythmogenen Ereignissen relevant. Zunächst wurde im
Protokollteil der programmierten Stimulation (der S2/S3- Bestimmung) und dem
„High-rate“-Protokoll sowohl quantitativ wie auch qualitativ das Auftreten von
Kammerflimmern erfasst. Dabei wurde auch festgehalten, ob das aufgetretene
Kammerflimmern selbstlimitierend war oder ob defibrilliert werden musste. In dem
fünf Minuten dauernden hypokaliämischen Protokollteil, der der Provokation von
Torsade de Pointes galt, wurden die Ereignisse ebenfalls quantitativ erfasst. Die
frühen Nachdepolarisationen wurden jedoch nicht gesondert registriert. Es wurde
festgehalten, ob polymorphe Kammertachykardien vom Torsade de Pointes Typ
überhaupt auftraten und wenn dies der Fall war, wurde die Häufigkeit ausgezählt, um
quantitative
Unterschiede
zu
erfassen.
Torsade
de
Pointes
wurden
nach
Dessertenne als eine polymorphe Kammertachykardie mit mindestens sechs
Schlägen und mit einer um die Nulllinie rotierenden Achse und spontaner
Terminierung definiert [65].
77
3. Material und Methode
_____________________________________________________________________________________________________
3.8 Statistik
Die
Ergebnisse
zusammengetragen
wurden
und
mit
hier
Hilfe
für
die
einer
Datenbank
Auswertung
mit
(Microsoft
dem
Excel)
Statistik-
und
Analyseprogramm SPSS (SPSS für Windows 11.0 und 15.0) vorbereitet. Die
Variablen wurden zunächst mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov- Tests auf
Normalverteilung geprüft. Für die Testung der nicht-parametrischen Variablen
benutzten wir den Friedmann- und den Wilcoxon-Test. Der Mann-Whitney-U-Test
wurde für die nicht-parametrischen Variablen zwischen den verschiedenen Gruppen
verwandt. So wurde der Einfluss von G-CSF und Erythromycin auf die EKGParameter sowie die MAP-Dauer und die Dispersion mit dem Friedmann-Test
erforscht. Für die Aktionspotentiallängen, die Dispersion der Repolarisation, die
echokardiographischen Ergebnisse, die Kammerflimmer- und die TDP-Inzidenzen
zwischen der Sham- und der Herzinsuffizienzgruppe verwandten wir den U-Test
nach Mann und Whitney. Inzidenzen von Kammerflimmern und TDP-Ereignissen
wurden mit dem Chi-Quadrat-Test und dem Fisher-Test analysiert. Einen Wert von
p<0,05 sahen wir als statistisch signifikant an.
Die Auswertungen erfolgten in Zusammenarbeit mit dem hiesigen Institut für
Medizinische Informatik und Biomathematik. Die Betreuung wurde durch Frau Dr. rer.
medic. N. Osada geleistet.
4. Ergebnisse
78
_____________________________________________________________________________________________________
4. Ergebnisse
4.1 Erzeugung einer signifikanten Herzinsuffizienz
Abb. 30: Morphologischer Vergleich eines normalen Herzens (links) mit einem insuffizienten
Herz (rechts) in der Langendorffanlage. Rechts ragt noch das Schrittmacherkabel aus der Vena
cava superior heraus.
Durch die schnelle ventrikuläre Schrittmacherstimulation kam es bei den stimulierten
Tieren zu einer signifikanten Abnahme der Parameter der Herzleistung, die mittels
Echokardiographie ermittelt worden waren. Mit beginnender Stimulation entwickelten
die Kaninchen oft einen deutlichen Aszites, meist kombiniert mit Bewegungsunlust,
Schwäche, Inappetenz, Abmagerung, Dyspnoe und Apathie. Quantitativ zeigte sich
dies bei der Ejektionsfraktion (EF), sowohl bei Tieren mit wie auch ohne G-CSFBehandlung. Die EF nahm von 73 % ± 3 auf 18,1 % bei den nicht behandelten Tieren
und auf 17,1 % bei den mit G-CSF behandelten Tieren ab (p< 0,001).
79
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Zwischen
der
nicht
behandelten
und
der
mit
G-CSF
behandelten
Herzinsuffizienzgruppe trat kein signifikanter Unterschied bei der gemessenen EF
auf. Die EF beider Herzinsuffizienzgruppen (mit und ohne G-CSF) war jedoch
gegenüber der Sham-Kontrollgruppe signifikant reduziert.
80
70
EF in %
60
50
40
30
20
10
0
HI mit GCSF
HI ohne GCSF
Sham ohne GCSF
Versuchsgruppe
Abb.
31:
Signifikante
Abnahme
der
Ejektionsfraktion
vor
und
nach
schneller
Schrittmacherstimulation.
Die „Pacing“-dauer der mit G-CSF behandelten Tiergruppe war nicht signifikant
verlängert (p=0,208) im Vergleich zur nicht behandelten Gruppe. Im Mittel lag bei den
herzinsuffizienten Tieren ohne G-CSF der Wert bei 17 Tagen Laufzeit, bis sich der
Endpunkt der Herzinsuffizienz eingestellt hatte, mit G-CSF- Behandlung dauerte es
zwei Tage länger, bis echokardiographisch eine EF um 20% festgestellt werden
konnte (Median 19 Tage Laufzeit).
Stimulationszeit in Tagen
40
35
30
25
20
15
10
5
0
HI ohne GCSF
HI mit GCSF
Versuchsgruppe
Abb. 32: Stimulationszeiten der Herzinsuffizienzgruppe mit und ohne G-CSF Behandlung.
80
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.2 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die myokardiale
Repolarisation
Die Repolarisationszeiten der Kardiomyozyten waren bei den herzinsuffizienten
Kaninchen im Vergleich mit den gesunden Tieren im Schnitt deutlich verlängert. Dies
zeigte sich sowohl an den im EKG-gemessenen QT-Zeiten als auch an der
Verlängerung der MAP-Signale. Während die QT-Werte jedoch nicht signifikant
verlängert (p>0,05) waren, sondern lediglich eine zunehmende Tendenz zeigten, war
die MAP-Dauer signifikant verlängert.
Tab. 2: Effekt der Herzinsuffizienz (HI) auf die QT-Zeit, die Aktionspotentialdauer bei 90- und
50%iger Repolarisation und die Dispersion der Repolarisation
HI ohne
Baseline
GCSF
Sham ohne
Baseline
GCSF
QT-Zeit
(ms)
Mittl. MAP50
(ms)
Disp. MAP50
(ms)
Mittl. MAP90
(ms)
Disp. MAP90
(ms)
271 ±17
173 ±19
53 ±16
194 ±17
45 ±16
252 ±18
125 ±13
54 ±17
162 ±11
41 ±18
Vor allem der Mittelwert der MAP-Dauer der Herzinsuffizienzgruppe war im MannWhitney- U- Test gegenüber der Sham-Kontrollgruppe signifikant verlängert
(p=0,048) (Abb. 33).
81
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 33: Vergleich der MAP-Dauer unter Ausgangsbedingungen zwischen der HI und der
Sham-Gruppe mit/ohne G-CSF
Die
folgende
Abbildung
zeigt
den
Zykluslängen-
abhängigen
Effekt
der
Herzinsuffizienz auf die MAP-Dauer. Dabei wird deutlich, dass mit Abnahme der
Zykluslänge auch das Ausmaß der MAP-Verlängerung abnimmt.
MAP-Dauer
Zykluslängen-Effekt auf MAP-Dauer
260
240
220
200
HI ohne GCSF
180
160
140
120
100
Sham ohne GCSF
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 34: Zykluslängen-abhängiger Effekt der Herzinsuffizienz auf die MAP-Dauer (MAP90)
82
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Betrachtet man nur die Veränderungen der einzelnen MAPs der herzinsuffizienten
Tiere, so fällt die unterschiedlich starke Verlängerung der MAPs auf. Auch im
Vergleich mit den Sham-Tieren zeigt sich, dass die linksventrikulären epikardialen
MAPs nicht so stark an Länge zunehmen (LV: p=0.064 borderline signifikant), wie die
rechtsventrikulären
endokardiale
epikardialen
(Endo:
Repolarisationszeiten
p=0.048).
an
den
(RV:
Im
p=0.028)
und
das
linksventrikuläre
ist
die
Zunahme
der
Herzens
mit
Folgenden
verschiedenen
Stellen
des
Orginalaufzeichnungen repräsentativer MAPs dargestellt.
Abb. 35: Darstellung der MAPs eines Sham-Tieres unter Ausgangsbedingungen (links) und
unter 300 M Erythromycin (rechts), deutlich zu erkennen ist der Verlängerungseffekt, sowie
die Veränderung der MAP-Form.
4. Ergebnisse
83
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 36: Darstellung der MAPs eines insuffizienten Herzens unter Ausgangsbedingungen
(links) und unter 300 M Erythromycin (rechts), der Verlängerungseffekt ist unter
Herzinsuffizienz stärker ausgeprägt, als bei den Sham-Tieren.
84
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.2.1 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die QT-Zeit
Neben anderen Faktoren wird, wie unter 2.2 bereits beschrieben, der Verlängerung
der QT-Zeit ein gewisses proarrhythmisches Potential zugeschrieben. Es kam mit
der Entstehung einer signifikanten Herzinsuffizienz zwar zu der Tendenz einer QTZeit-Verlängerung, doch war dieser Effekt ohne G-CSF und ohne Gabe des IKrBlockers Erythromycin nicht signifikant p>0,05.
Abb. 37: Vergleich der Mittelwerte der QT-Zeit zwischen HI- und Sham-Gruppe.
In der folgenden Abbildung wird noch einmal der Zykluslängen-abhängige Effekt der
QT-Zeit-Dauer im Vergleich der Herzinsuffizienz- mit der Shamgruppe gezeigt.
QT-Zeit in ms
QT-Zeiten HI vs Sham
350
330
310
290
270
250
230
210
190
HI ohne GCSF
Sham ohne GCSF
300
400
500
600
700
800
900
CL in ms
Abb. 38: Zykluslängen-abhängiger Effekt der QT-Zeit zwischen HI- und Sham-Gruppe ohne GCSF.
85
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.2.2
Einfluss
der
Herzinsuffizienz
auf
die
Dispersion
der
Repolarisation
Das Vorkommen einer erhöhten Dispersion der Repolarisation ist neben der
Verlängerung der QT-Zeit und des Aktionspotentials, wie unter 2.2.1 bereits
beschrieben, eng mit dem Auftreten von ventrikulären Tachyarrhythmien verknüpft.
Bei den vorliegenden Untersuchungen konnten zunächst allein durch Erzeugung
einer Herzinsuffizienz noch keine signifikanten Zunahmen der Dispersion beobachtet
werden. Eine Tendenz dahingehend lässt sich jedoch erkennen.
Dispersion Vergleich Mittelwerte HI vs Sham
60
Dispersion in ms
50
40
30
20
10
0
HI ohne GCSF
Sham ohne GCSF
Abb. 39: Vergleich der Dispersion zwischen HI- und Sham-Gruppe.
Dispersion in ms
Dispersion der Repolarisation
Ausgangsbedingungen mit/ohne GCSF
65
60
55
50
45
40
35
30
25
HI ohne GCSF
Sham ohne GCSF
HI GCSF
Sham GCSF
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 40: Vergleich der Dispersion zwischen HI- und Sham-Gruppe bei den verschiedenen
Frequenzstufen.
86
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Die Dispersion beschreibt allerdings nur die gemittelten Gesamtunterschiede der
monophasischen Aktionspotentialdauern zwischen den herzinsuffizienten Kaninchen
und der Sham-Vergleichsgruppe. Eine Zunahme der Dispersion besagt zunächst
also
nur,
dass
die
Repolarisation
in
den
verschiedenen
Myokardzellen
unterschiedlich stark verlängert wird. Es ist also sinnvoll, sich für eine genauere
Differenzierung
der
Dispersion
regionale
Unterschiede
der
MAP-Dauern
anzuschauen. Wir unterscheiden folgende drei Regionen:
1.) epikardial rechter Ventrikel: MAP 1-4
2.) epikardial linker Ventrikel: MAP 5-7
3.) endokardial linker Ventrikel: MAP 8
So
kann
durch
Vergleich
der
beiden
gemittelten epikardialen Werte die
interventrikuläre Dispersion bestimmt werden (LV&RV). Durch Gegenüberstellung
der Werte links epi- zu links endokardial lässt sich die transmurale Dispersion der
Repolarisation ermitteln (LV&Endo).
p=0.064
150
125
100
p=0.024
75
p=0.041
50
25
0
ms
p=0.001
Sham
Herzinsuffizienz
1
Sham mit G-CSF
Abb. 41: Vergleich der Dispersion bei 300 M Erythromycin.
Herzinsuffizienz
mit G-CSF
87
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 42: Vergleich der interventrikulären Dispersion bei 300 M Erythromycin (Differenz).
Abb. 43: Vergleich der Transmuralen Dispersion bei 300 M Erythromycin (Differenz).
Wie aus den beiden obigen Abbildungen hervorgeht, zeigt sich vor allem unter
Einfluss von Erythromycin, sowohl bei der interventrikulären wie auch ohne G-CSF
bei
der
transmuralen
Dispersion
eine
signifikante
Zunahme.
Unter
88
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Ausgangsbedingungen zeigt sich alleinig durch die Induktion einer Herzinsuffizienz
weder mit noch ohne G-CSF eine signifikante Zunahme von transmuraler oder
interventrikulärer Dispersion.
Schließlich untersuchten wir auch die zeitliche Dispersion, die für die Identifizierung
von Risikopatienten herangezogen werden kann, aber auch als prognostischer
Marker für das proarrhythmische Potential von Medikamenten gewertet wird [51].
Dabei zeigte sich bei unseren Untersuchungen alleinig durch G-CSF-Gabe, oder
alleinig durch Erythromycin keine signifikante Erhöhung (p>0,05) der „beat-to-beat“
Variabilität der Repolarisation (BVR). Erst bei einer Konzentration von 300M
Erythromycin und zusätzlicher G-CSF-Behandlung der Tiere kam es zu einer
signifikanten Zunahme der BVR (p=0,047). Die Signifikanz wurde durch das
Hinzukommen
der
Herzinsuffizienz
noch
einmal
verstärkt
(p=0,019).
nachfolgende Abbildung soll dies verdeutlichen.
Abb. 44: BVR unter Ausgangsbedingungen und 300M Erythromycin mit und ohne G-CSF.
Die
89
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.3 Einfluss der Herzinsuffizienz auf die myokardiale
Refraktärzeit
Wie bereits unter Punkt 2.2.2 beschrieben, beschränkt die Refraktärität die maximale
Frequenz von Aktionspotentialen und spielt somit auch im Zusammenhang mit der
gerichteten Erregungsleitung und der Wiedererregbarkeit der Herzmuskelzelle eine
wichtige Rolle.
Wie aus nachfolgender Tabelle hervorgeht, ist besonders der S2-Wert bei der
Herzinsuffizienzgruppe deutlich höher als bei den Sham-Tieren (p=0,011 =>
signifikant) während der S3- Wert sich bei beiden Gruppen sehr ähnelt (p>0,05) und
jeweils unter dem S2-Wert liegt.
Refraktärwertbestimmung S2/S3 ohne GCSF
240
Refraktärwert in ms
220
200
Sham ohne GCSF S2
180
Sham ohne GCSF S3
HI ohne GCSF S2
160
HI ohne GCSF S3
140
120
100
300
400
500
600
700
800
900
Frequenzstufe in ms
Abb. 45: Refraktärwerte nach programmierter Stimulation (S2/S3- Bestimmung) ohne G-CSF.
90
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.4 Einfluss der Herzinsuffizienz und des Zytokins G-CSF
auf das Entstehen von Kammerflimmern
Mit Hilfe der programmierten Stimulation (S2/S3-Bestimmung) im Anschluss an die
Frequenztreppe sollte vor allem am insuffizienten Kaninchenherzen Kammerflimmern
ausgelöst werden. Auch die darauf folgende „High rate“- Bestimmung diente diesem
Zweck (s. Kap. 3.7.3.2 und 3.7.3.3). Untersucht wurde das Kammerflimmern an vier
Gruppen. Dabei wurde zum einen die Zahl der Tiere ausgewertet, bei denen es zu
Flimmerereignissen
kam,
und
zum
anderen
die
Anzahl
der
Kammerflimmerereignisse selbst. Bei 13 Sham operierten Tieren ohne G-CSF trat
das Flimmern mit einer Inzidenz von 30,77 % auf. Bei 13 herzinsuffizienten Tieren
ohne G-CSF- Behandlung kam es bei 84,62 % zum Kammerflimmern. Von 20 Shamoperierten Tieren mit G-CSF Behandlung zeigte sich lediglich bei 20 % der Tiere
Kammerflimmern. In der letzten Gruppe führte das Protokoll bei 21 herzinsuffizienten
und mit G-CSF behandelten Tieren noch zu 66,67 % zum Kammerflimmern.
Abb. 46: Kammerflimmer-Inzidenz in %, mit und ohne G-CSF.
91
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Betrachtet man die nachfolgende Tabelle, so zeigt sich, dass es bei den Tieren nach
Induktion einer Herzinsuffizienz sowohl mit wie auch ohne G-CSF- Behandlung,
signifikant häufiger zu Kammerflimmern kommt. Dies ist nicht nur im Bezug auf die
Tiere bei denen sich Kammerflimmern zeigte der Fall, sondern auch bei der Anzahl
der Flimmerereignisse an sich. Auch wenn sich aus der oben gezeigten Abbildung
eine Tendenz ausmachen lässt, dass die Behandlung mit G-CSF zu einer Abnahme
der Kammerflimmerereignisse führt, so sind diese Werte nicht signifikant (p>0,05).
Tab. 3: Einfluss der Herzinsuffizienz auf die Kammerflimmerereignisse mit/ohne G-CSFBehandlung (NS = nicht signifikant).
Vergleich der
Gruppen
(CHI-Quadrat-Test)
HI vs. Sham
HI vs.GCSF+HI
Sham vs. GCSF Sham
GCSF+HI vs. GCSF
Sham
Tiere mit Flimmern
Tiere mit Flimmern
Tiere mit Flimmern
S2S3
38% vs. 23% (p=0,67;
NS)
38,5% vs. 35% (p=0,84;
NS)
23,1% vs. 5% (p=0,276;
NS)
HighRate
76,9% vs. 30,8%
(p=0,047)
76,9% vs. 66,7%
(p=0,704; NS)
30,8% vs. 15%
(p=0,393; NS)
66,7% vs. 15%
(p=0,001)
Gesamt
84,6% vs. 30,8%
(p=0,015)
84,6% vs. 70%
(p=0,431; NS)
30,8% vs. 20%
(p=0,681)
35% vs. 5% (p=0,044)
70% vs. 20% (p=0,004)
92
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.5 Einfluss des Zytokins G-CSF bei Herzinsuffizienz auf
die myokardiale Repolarisation
Wie bereits nach Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe vermutet [127], zeigte sich nach
Gabe des Makrolidantibiotikums Erythromycin eine dosisabhängige Verlängerung
von QT-Zeit, Aktionspotentialdauer und der Dispersion der Repolarisation. Gleiches
galt auch für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tiere nach G-CSFBehandlung. Dabei war der Verlängerungseffekt bei allen Gruppen unter 300 M
Erythromycin jeweils am deutlichsten.
Tab. 4: Effekt von G-CSF und Erythromycin auf die QT-Zeit, die Aktionspotentialdauer bei
90%iger Repolarisation und die Dispersion der Repolarisation.
QT-Zeit (ms)
Mittl. MAP90 (ms)
Disp. MAP90 (ms)
HI ohne GCSF,
Baseline
233 ±18
174 ±17
32 ±9
mit Ery
150 uM Ery
259 ± 22
191 ±20
47 ±19
200 uM Ery
280 ±27
196 ±31
52 ±20
300 uM Ery
308 ±39
210 ±37
55 ±22
Sham ohne GCSF,
Baseline
234 ±24
162 ±21
34 ±15
mit Ery
150 uM Ery
254 ±22
167 ±23
39 ±13
200 uM Ery
267 ±20
172 ±21
43 ±20
300 uM Ery
284 ±23
177 ±22
46 ±16
Baseline
279 ±30
191 ±17
43 ±15
150 uM Ery
299 ±23
204 ±24
47 ±19
200 uM Ery
325 ±49
217 ±38
64 ±26
300 uM Ery
396 ±63
250 ±44
100 ±51
Baseline
264 ±36
155 ±20
45 ±17
150 uM Ery
275 ±29
161 ±18
48 ±12
200 uM Ery
298 ±37
172 ±24
54 ±18
300 uM Ery
329 ±42
191 ±26
73 ±24
HI GCSF/Ery
Sham GCSF/Ery
93
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Wie aus obenstehender Tabelle hervorgeht, ist die MAP-Dauer unter G-CSFBehandlung im Vergleich mit den nicht behandelten Tieren vor allem bei einer
Konzentration von 300 M Eryhromycin signifikant (p=0,041) verlängert. Die MAPVerlängerung ist unter G-CSF bei den Shamtieren durchgängig in allen
Konzentrationsstufen signifikant. So ist auch der Verlängerungseffekt der MAPDauer durch die Entwicklung der Herzinsuffizienz unter G-CSF signifikant.
5 mV
100 ms
Abb. 47: Darstellung des MAPs eines insuffizienten Herzens unter Erythromycin und G-CSF.
300
250
MAP-Duration in ms
200
HI GCSF-Ery
SHAM GCSF-Ery
150
HI ohne GCSF
SHAM ohne GCSF
100
50
0
baseline 0
150uM Erythromycin 200uM Erythromycin 300uM Erythromycin
Abb. 48: MAP-Dauer im Mittel der vier Versuchsgruppen bei den verschiedenen
Konzentrationen.
94
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Aktionspotentialdauer in ms
Abb. 49: MAP-Dauer (in ms) der vier Versuchsgruppen bei 300 M Erythromycin.
400
350
300
Baseline HI
300uM Ery HI
250
Baseline Sham
300uM Ery Sham
200
150
100
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 50: MAP-Dauer unter G-CSF im Vergleich Baseline und 300 M Erythromycin.
4. Ergebnisse
95
_____________________________________________________________________________________________________
Letztere Abbildung macht deutlich, dass vor allem durch das Zusammenspiel von GCSF-Behandlung, Erythromycin und der Herzinsuffizienz eine deutliche Zunahme der
MAP-Dauer zu verzeichnen war.
Die nachfolgenden Abbildungen veranschaulichen den Effekt der erzeugten
Herzinsuffizienz auf die MAP-Dauer. Auch unter G-CSF-Behandlung der Tiere zeigt
sich
unter Baseline- Bedingungen ohne Zugabe von Kaliumkanalblockern eine
signifikante Verlängerung der MAP90 bei den herzkranken Tieren.
Abb. 51: Einfluss von G-CSF auf die MAP-Dauer unter Ausgangsbedingungen.
Betrachtet man die Veränderung der MAPs während eines Versuches bei den
unterschiedlichen Frequenzstufen, so fällt auf, dass es mit abnehmender
Zykluslänge auch zu einem Abfall der MAP-Verlängerung kommt.
96
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
MAP-Dauer in ms
380
330
Baseline
280
150uM Ery
200uM Ery
230
300uM Ery
180
130
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 52: Zykluslängen- abhängiger Effekt der MAP-Dauer unter G-CSF bei Herzinsuffizienz
Dieses
Phänomen
einer
„reverse-use-dependence“
bedeutet
eine
stärkere
Verlängerung der Aktionspotentialdauer bei langsamen Zykluslängen im Vergleich zu
schnellen und ist typisch für IKr-Blocker [207].
MAP-Dauer in ms
280
260
240
220
Baseline
200
150uM Ery
180
160
200uM Ery
300uM Ery
140
120
100
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 53: Zykluslängen-abhängiger Effekt der MAP-Dauer bei der G-CSF Sham-Gruppe.
97
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
4.5.1 Einfluss des Zytokins G-CSF bei Herzinsuffizienz auf die QTZeit
Zwar zeigte sich unter dem Einfluss von G-CSF die Tendenz zu einer Verlängerung
der QT-Zeiten, doch dieser Unterschied war nicht signifikant (p>0,05).
Abb. 54: Vergleich der QT-Mittelwerte mit und ohne G-CSF ohne Erythromycin.
Unter G-CSF-Therapie konnte nach Induktion einer Herzinsuffizienz eine borderline
signifikante Verlängerung der QT-Zeit unter Ausgangsbedinungen erreicht werden
(p=0,085).
Die
nachfolgende
Tabelle
zeigt
aber,
dass
wenn
zu
den
Ausgangsbedingungen, der auf die Repolarisation belastend wirkende Faktor
Erythromycin hinzukommt, eine Verlängerung der QT-Zeit erfolgt. Dieser Effekt war
jedoch nicht signifikant (p>0,05) und stellte nur einen Trend dar. War bei den
herzinsuffizienten Tieren dieser Effekt auch ausgeprägter und konnte die Gabe von
G-CSF dies sogar noch einmal verstärken, so konnte dennoch keine signifikante
Zunahme der QT-Zeit durch den Einfluss von G-CSF nachgewiesen werden.
98
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
450
400
QT-Zeit in ms
350
300
HI GCSF-Ery
250
SHAM GCSF-Ery
200
HI ohne GCSF
SHAM ohne GCSF
150
100
50
0
baseline 0
150uM
Erythromycin
200uM
Erythromycin
300uM
Erythromycin
Abb. 55: QT-Mittelwerte mit und ohne G-CSF bei Erythromycingabe.
Wie auch beim Betrachten der MAP-Dauer, fällt bei der QT-Zeit der Zykluslängenabhängige- Effekt durch die Erhöhung der Erythromycingabe auf, wenngleich die
Ausprägung hier geringer ist. Die beiden nachfolgenden Abbildungen verdeutlichen
dies noch einmal.
QT-Zeit HI GCSF/Ery
QT-Zeit in ms
450
400
Baseline
350
150uM Ery
300
200uM Ery
300uM Ery
250
200
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 56: Zykluslängen abhängiger Effekt bei Herzinsuffizienz unter Erythromycin bei G-CSF
Therapie auf die QT-Zeit.
99
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
QT-Zeit Sham GCSF/Ery
450
QT-Zeit in ms
400
Baseline
350
150uM Ery
200uM Ery
300
300uM Ery
250
200
300
400
500
600
700
800
900
Zykluslänge in ms
Abb. 57: Zykluslängen abhängiger Effekt unter Erythromycin und G-CSF auf die QT-Zeit.
4.6 Einfluss des Zytokins G-CSF auf die myokardiale
Refraktärzeit
Aus untenstehender Abbildung geht hervor, dass es keinen deutlichen Unterschied
der Refraktärwerte mit und ohne G-CSF-Behandlung gibt. Demnach hat G-CSF
keinen wesentlichen Einfluss auf die Refraktärzeit. Klar wird lediglich, dass in den
Herzinsuffizienzgruppen, sowohl mit wie auch ohne G-CSF-Behandlung, der
Refraktärwert gegenüber den Sham-Gruppen bei der S2-Bestimmung deutlich erhöht
ist.
Abb. 58: Mittelwerte der Refraktärzeiten mit und ohne G-CSF.
100
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Refraktärwert in ms
Refraktärzeitermittlung mit programmierter
Stimulation
240
220
200
180
160
140
120
100
SM-GCSF S2
SM-GCSF S3
Sham-GCSF S2
Sham-GCSF S3
300
400
500
600
700
800
900
Frequenzstufe in ms
Abb. 59: Werte der Refraktärzeit-Bestimmung durch programmierte Stimulation (S2/S3Bestimmung) mit GCSF.
Mit
oder
ohne
G-CSF-Behandlung
zeigt
sich
der
Trend,
dass
bei
den
herzinsuffizienten Tieren die Werte von S2- und S3-Bestimmung weiter auseinander
liegen und der S2-Wert bei den Insuffizienten im Schnitt höher liegt als bei den
Sham-Tieren.
4.7 Einfluss des Zytokins „G-CSF“ auf die Entstehung von
Torsade de Pointes bei Herzinsuffizienz
Die Rhythmusstörungen vom Torsade de Pointes - Typ wurden nach den bereits
unter 3.7.4 definierten Kritierien nach Dessertenne [65] ausgewertet. Weder während
der Einlaufphasen der verschiedenen Konzentrationsstufen des IKr-Blockers
Erythromycin noch während der sich daran anschließenden Frequenztreppen traten
Torsade de Pointes auf. Erst in den jeweils 5 Minuten nach Beendigung des
Protokolls, wenn bei vorliegendem AV-Block gleichzeitig die Kaliumkonzentration der
KHB- Pufferlösung von 5,88 mmol auf 1,5 mmol reduziert wurde, kam es zum
Auftreten von Torsade de Pointes.
101
4. Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
5mV
200ms
Abb. 60: Typisches Beispiel für TdPs unter 1,5 mmol K+ bei 150 M Erythromycin.
Dabei kam es bei den 13 Sham-Tieren mit G-CSF bei 62 % der Tiere bei der
höchsten Erythromycinkonzentration von 300 M und bei den 13 insuffizienten
Tieren mit G-CSF- Behandlung bei 85% der Versuche zum Auftreten von Torsade
de Pointes. Auch bereits bei 200 M zeigte sich eine deutliche Zunahme der TdPs im
direkten Vergleich der Sham-Tiere mit G-CSF (23 % Inzidenz) mit den insuffizienten
behandelten
Tieren
(46
%
Inzidenz).
Verglichen
mit
Tieren
aus
einer
vorangegangenen Versuchsserie ohne G-CSF-Behandlung, kam es unter G-CSFBehandlung zu mehr Torsade de Pointes, wobei dies lediglich einen Trend darstellte,
der weder im Bereich der Inzidenz, noch bei der Anzahl der Einzelereignisse
signifikant war. Wie aus den nachfolgenden zwei Abbildungen hervorgeht, ist bei
einer Erythromycinkonzentration von 300 M die Anzahl der TdPs bei den
herzinsuffizienten Tieren mit und ohne G-CSF-Behandlung gegenüber den ShamTieren signifikant erhöht. Gleiches gilt für die Gesamtzahl der TdPs bei allen
Konzentrationen zusammengenommen.
4. Ergebnisse
102
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 61: Einfluss der Herzinsuffizienz ohne G-CSF-Behandlung auf die Entstehung von
Torsade de Pointes unter Erythromycin.
Abb. 62: Einfluss der Herzinsuffizienz unter G-CSF-Behandlung auf die Entstehung von
Torsade de Pointes unter Erythromycin.
103
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
5. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir den Einfluss des Zytokins G-CSF auf die
Arrhythmogenese im Tiermodell einer chronischen Herzinsuffizienz. Die Ergebnisse
dieser
Arbeit
geben
Einblicke
und
zeigen
Herzinsuffizienz
Behandlungsstrategie
der
in
die
erste
Herzinsuffizienz
Arrhythmogenese
Ergebnisse
mit
bei
einer
G-CSF.
Nach
chronischer
alternativen
ersten
viel
versprechenden experimentellen Ergebnissen beim Herzinfarktmodell, in denen es
zu einer verminderten Arrhythmieanfälligkeit durch erhöhte Connexin43-Expression
kam [11], stellten wir uns die Frage nach dem Einfluss von G-CSF auf eine
chronische
Herzinsuffizienz.
Dabei
konnten
wir
aufzeigen,
dass
das
antiarrhythmische Potential des Zytokins G-CSF nicht allgemeingültig für die
Herzinsuffizienz postuliert werden kann. Vielmehr muss G-CSF als ein unabhängiger
Faktor verstanden werden, der die Repolarisationsreserve reduziert und keine
regenerativen Effekte bei der Entstehung der Insuffizienz (ischämischer oder nicht
ischämischer Natur) zu haben scheint. Denn entgegen eines nachgewiesenen
antiarrhythmischen Effektes des G-CSF bei Mäusen nach Herzinfarkt, zeigte sich
dieser Effekt bei unserem nicht-ischämischen Herzinsuffizienzmodell nicht.
Wir
konnten in der vorliegenden Studie in diesem Zusammenhang eine verminderte
Repolarisationsreserve
der
insuffizienten
Tiere
unter
G-CSF-Behandlung
nachweisen und so ein proarrhythmisches Potential von G-CSF in unserem Modell
erklären.
Dazu wurde zunächst am intakten Kaninchenherzen ein Modell entwickelt, bei dem
durch schnelle ventrikuläre Schrittmacherstimulation eine chronische Herzinsuffizienz
entstand. Durch das etablierte Verfahren des isolierten, Langendorff-perfundierten
Herzens
konnten
im
Anschluss
elektrophysiologische
Untersuchungen
zur
Arrhythmogenese bei dieser chronischen Herzinsuffizienz durchgeführt werden. Die
so
erhobenen
Daten
geben
Einblick
in
die
zugrunde
liegenden
Entstehungsmechanismen von Arrhythmien bei chronischer Herzinsuffizienz und sie
zeigen den elektrophysiologischen Einfluss des zur Zeit viel diskutierten Zytokins GCSF bei chronischer Herzinsuffizienz auf die Arrhythmogenese. Wie bereits erwähnt,
104
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
steigt unter anderem aufgrund der demographischen Entwicklung die Zahl der Fälle
chronischer Herzinsuffizienz und auch die des plötzlichen Herztodes in den letzten
Jahren an. Dabei wird ein Großteil der Todesfälle ventrikulären Tachyarrhythmien
zugeschrieben [8]. Um nun ursächliche Mechanismen für die Entstehung von
Arrhythmien bei Herzinsuffizienz herauszufinden, muss berücksichtigt werden, dass
Herzinsuffizienzpatienten eine sehr gemischte Gruppe aus post-MyokardinfarktPatienten, Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie und vielfältigen anderen
Ursachen einer Herzinsuffizienz darstellen [99]. In jedem Falle aber stellt die
Therapie von Herzrhythmusstörungen bei Herzinsuffizienz, trotz Therapiefortschritten
in den letzten Jahren, weiter eine Herausforderung dar [100]. Dabei zielt die
herkömmliche Therapie vorwiegend auf eine Hemmung des Fortschreitens der
Herzinsuffizienz ab, so dass auf diese Weise auch die Entstehung von Arrhythmien
vermindert wird, ohne jedoch den Ausgangszustand wieder herstellen zu können
[141].
5.1 Arrhythmogenese bei chronischer Herzinsuffizienz und
dem langen-QT-Syndrom
Der plötzliche Herztod als Folge ventrikulärer Tachyarrhythmien stellt eine der
Hauptursachen für die Mortalität bei chronischer Herzinsuffizienz dar [208]. Dabei
haben wir bei unserem Modell das Hauptaugenmerk auf die nicht ischämische
Herzinsuffizienz gelegt, die im Gegensatz zum Myokardinfarkt weit mehr Fragen bei
der
Entstehung
von
elektrokardiographische
Arrhythmien
offen
Aufzeichnungen
lässt.
über
Da
es
solche
nur
tödlich
selten
gelingt,
verlaufenden
Arrhythmien zu bekommen, ist es oft schwierig den genauen Hergang zu
rekonstruieren. Im Gegensatz dazu ist das klinische Bild des langen-QT-Syndroms
mit den typischen EKG-Veränderungen bei Torsade de Pointes relativ deutlich, doch
auch hier liegen noch immer Unklarheiten bezüglich ihrer Entstehung vor. Es werden
eine Reihe von Mechanismen diskutiert, die für die Entstehung dieser potentiell
lebensbedrohlichen Rhythmusstörung von Bedeutung sind. Zum Beispiel werden
eine verlängerte Repolarisation, eine erhöhte Dispersion der Repolarisation, das
105
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
Auftreten von frühen Nachdepolarisationen sowie eine unterschiedliche Verteilung
der an der Repolarisation beteiligten Kaliumkanäle in Betracht gezogen [66]. Doch
auch bei chronischer Herzinsuffizienz werden häufig komplexe Arrhythmien und
polymorphe ventrikuläre Tachykardien, vor allem in den frühen Stadien, als Ursache
für die hohe Mortalität angesehen [102].
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie spiegeln dies wider. Unter den besonderen
Bedingungen
einer
Tachykardiomyopathie,
Schrittmacherstimulation
hervorgerufen
die
wurde,
durch
zeigte
sich
schnelle
zum
Einen
echokardiographisch eine signifikante linksventrikuläre Funktionsstörung und zum
Anderen
konnte
die
deutliche
Neigung
dieser
insuffizienten
Herzen,
Kammerarrhythmien zu entwickeln, bestätigt und elektrophysiologisch näher
untersucht
werden.
Dazu
legten
wir
unser
Hauptaugenmerk
auf
elektrophysiologische Größen wie die MAP-Dauer, die spatiale (räumliche) und
zeitliche Dispersion, die Refraktärzeit sowie die QT-Zeiten. Alle diese Größen haben
einen Einfluss auf die so genannte Repolarisationsreserve [209].
So kam es bereits unter Ausgangsbedingungen durch die erzeugte Herzinsuffizienz
zu einer signifikanten Zunahme der Aktionspotentialdauer und der Refraktärzeiten,
sowie
zu
einer
Verlängerung
des
QT-Intervalls
und
der
Dispersion
der
Repolarisation. Eine verlängerte Aktionspotentialdauer, und eine damit verbundene
verlängerte Repolarisation ohne weitere medikamentöse Blockade, lässt sich sowohl
mit einer verminderten Funktion der verantwortlichen Kaliumkanäle oder aber mit
einer Reduktion ihrer Anzahl erklären [216]. Man kann daraus schlussfolgern, dass
die
erzeugte
chronische
Kardiomyopathie
ursächlich
und
in
direktem
Zusammenhang mit einer verminderten Funktion oder einer Downregulation der an
der Repolarisation beteiligten Kaliumkanäle steht. Dies entspricht auch den
Befunden
verschiedener
Autoren
[107-111],
die
eine
Reduktion
der
auswärtsgerichteten Kaliumionenströme für die verlängerte Aktionspotentialdauer bei
Herzinsuffizienz verantwortlich machen.
Schließlich
konnte
zusätzlich
durch
die
proarrhythmischen
Effekte
einer
Kaliumkanalblockade des repolarisationsverlängernden Medikaments Erythromycin,
mittels IKr-Blockade das LQT2-Syndrom simuliert werden und die bereits erwähnten
106
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
elektrophysiologischen
Größen
zusätzlich
zur
Herzinsuffizienz
unter
diesen
besonderen Bedingungen untersucht werden. Durch die Zugabe des potenten IKrBlockers Erythromycin kam es bei den insuffizienten Herzen im Vergleich zu den
Kontrolltieren zu einer weiteren deutlichen Repolarisationsverlängerung, was die
Hypothese einer Funktionsminderung oder Downregulation der Kaliumkanäle stützt.
Der deutlichste Verlängerungseffekt war bei den herzinsuffizienten, mit G-CSF
behandelten Tieren unter der höchsten Erythromycinkonzentration zu sehen. Durch
das Erzeugen einer Herzinsuffizienz werden ebenso, wie durch die Gabe von
Erythromycin, in Verbindung mit der so entstandenen Repolarisationsverlängerung,
geeignete Bedingungen für das Entstehen von frühen Nachdepolarisationen
geschaffen. Diese wiederum können als geeigneter Trigger für das Entstehen von
TdPs dienen, wenn der Boden eines geeigneten Substrats vorhanden ist, wie eine
erhöhte Dispersion der Repolarisation [118].
5.1.1 Repolarisationsreserve
Der bereits mehrfach angesprochene Begriff der Repolarisationsreserve wurde 1998
von
Roden
geprägt
[118].
Er
bezeichnet
verschiedene,
teils
redundante
Mechanismen der myokardialen Repolarisation. Da die Repolarisation abhängig ist
vom genauen Zusammenspiel verschiedener Ionenströme und deren spezifischer
Kanäle [18], können Störungen dieses Zusammenspiels schnell zu Komplikationen
führen. Damit nicht jede kleinere Störung dieses Systems wie z.B. die Blockade von
spezifischen Ionenkanälen durch Medikamentenwirkung oder Funktionsverlust
bestimmter Kanäle bei Herzinsuffizienz zu exzessiver QT-Zeit-Verlängerung führt,
sollen sich die verschiedenen redundanten Mechanismen dann an den Vorgängen
der Repolarisation beteiligen und so einen natürlichen Puffer des Herzens bilden
[119]. Es handelt sich also um eine patienten-spezifische Antwort auf die
Repolarisation beeinflussende Störungen [209]. So können Fehler im System der
Ionenkanäle, sei es durch genetische Mutationen (z.B. LQT-Syndrom) oder
Herzinsuffizienz hervorgerufen, zunächst ohne klinische Relevanz bleiben [119].
Entsteht auch kein vollständiger Phänotyp des Long-QT-Syndroms, erhöht sich
107
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
dennoch das Risiko für eine Aktionspotentialverlängerung und die Entstehung von
Arrhythmien, wenn zusätzlich Risikofaktoren hinzukommen und das Risiko
potenzieren [120]. Wirkt also auf eine subklinisch ausgeglichene Veränderung eine
weitere
Störgröße
auf
das
System,
kann
es
zur
deutlichen
Aktionspotentialverlängerung und so zu frühen Nachdepolarisationen mit der Folge
von Rhythmusstörungen wie Torsade de Pointes kommen [118]. Eine solche
subklinische Veränderung der Repolarisationsreserve könnte zum Beispiel die
genetische Mutation im Sinne des LQT-Syndroms sein, aber auch eine gering
ausgeprägte Herzinsuffizienz im NYHA-Stadium 1-2. In einem Screening könnten
solche individuellen subklinischen Voraussetzungen eines Patienten nicht unbedingt
erfasst werden, aber zu erheblichen Komplikationen beim Hinzukommen einer
weiteren Störgröße führen [118].
Im Rahmen dieser Studie konnte deutlich die Verlängerung der Repolarisation der
chronisch geschädigten Myozyten im Vergleich mit den sham-operierten Herzen
gezeigt werden. So kam es in der vorliegenden Arbeit zu einer ausgeprägten
Verlängerung der Aktionspotentialdauer.
In Anbetracht der Erkenntnisse der
Arbeitsgruppe um Roden [118] kann man daraus schlussfolgern, dass die chronische
Herzinsuffizienz
also
Repolarisationsreserve
Herzinsuffizienz
erhöht
eine
der
bedeutende
untersuchten
demnach
die
Rolle
Herzen
bei
der
spielt.
Empfindlichkeit
Reduktion
Eine
der
bestehende
gegenüber
dem
proarrhythmischen Potential IKr-blockierender Substanzen wie Erythromycin. Dies
wiederum impliziert zunächst, dass bei bekannter Herzinsuffizienz eines Patienten
die Verordnung auch bereits etablierter Medikamente besonders sorgfältig
abgewogen werden muss [34]. Im Besonderen gilt dies natürlich für den unkritischen
Einsatz neuerer viel versprechender pharmakologischer Errungenschaften wie dem
Zytokin G-CSF bei bestehender Herzinsuffizienz.
Weiterhin zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit die regionalen Unterschiede in der
Kaliumkanalexpression. Diese unterschiedliche Verteilung wird besonders nach der
Gabe der IKr-Blockers Erythromycin deutlich, wonach die Repolarisationszeiten
(siehe Kap. 4.5, Abb. 53) deutlich voneinander differieren und auch die Dispersion
der Repolarisation zunimmt. Wir können also mit unseren Ergebnissen bestätigen,
108
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
dass der schnelle Kaliumkanal nicht gleichmäßig epi- und endokardial verteilt ist [28,
29].
5.1.2 Spatiale und temporale Dispersion
Die
elektrophysiologischen
Veränderungen,
die
durch
die
chronische
Herzinsuffizienz hervorgerufen werden, sind Bestandteil aktueller Studien [105]. Zu
diesen Veränderungen am Herzen zählt neben der bereits erwähnten Verlängerung
der Repolarisation auch die Zunahme der Heterogenität der Repolarisationszeiten
[105]. Eine Verlängerung der Repolarisation gilt als Risikofaktor für das Entstehen
von frühen Nachdepolarisationen. Sie können als arrhythmogene Trigger bei
Herzinsuffizienz wirken und in Verbindung mit einer Erhöhung der Dispersion der
myokardialen
Repolarisation
zum
Auftreten
von
polymorphen
ventrikulären
Tachykardien vom Typ Torsade de Pointes führen [210]. Für die Entstehung von
TdPs werden unterschiedliche Faktoren angeführt [211]. Dazu gehören eine regional
unterschiedliche Verteilung von Kaliumkanälen, eine erhöhte Dispersion der
Repolarisation
sowie
Entstehungsmechanismus
frühe
Nachdepolarisationen,
nach
wie
vor
wobei
der
Gegenstand
genaue
intensiver
Forschungsbemühungen ist. Die Dispersions-Hypothese, eine ungleichmäßige
temporale [212] und spatiale [213] Verlängerung der Aktionspotentiale als Plattform
für Re-entry wird als grundlegender Mechanismus für TdPs angenommen. Dabei
bilden EADs dafür den Trigger, eine erhöhte Dispersion der Repolarisation (ungleich
lange Repolarisations- und Refraktärzeiten) das Substrat für die Entstehung von
Arrhythmien. Diese Thesen decken sich mit den Ergebnissen dieser Arbeit.
Durch den regional unterschiedlichen Grad der Aktionspotentialverlängerung erhöhte
sich sowohl die
interventrikuläre (p<0,05) wie auch die transmurale Dispersion
(p<0,05) unter Herzinsuffizienz und Erythromycin im Vergleich zu den ShamKontrolltieren signifikant. Bei der zeitlichen Dispersion zeigte sich erst nach
Zusammenkommen
von
300M
Erythromycin
und
G-CSF-Behandlung
eine
signifikante Erhöhung der BVR. Nach Hinzukommen der Herzinsuffizienz stieg die
109
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
BVR weiter signifikant an. Diese veränderten Dispersionen spielen für das Auftreten
und Andauern von Torsade de Pointes wahrscheinlich eine große Rolle, weil so das
Substrat für die Aufrechterhaltung von Re-entry-Arrhythmien geschaffen wird [213].
Der unterschiedliche Grad der Repolarisationsverlängerung lässt auch auf eine
unterschiedliche Verteilung von IKr schließen, wie bereits für IKs beschrieben [35]. Die
„Reverse-use-dependence“, eine stärkere Verlängerung der Zykluslängen bei
langsamen (900 ms) im Vergleich zu schnellen (300 ms) Frequenzen und ein
typisches Zeichen für den IKr-Blocker Erythromycin [207], ist über eine exzessive
Verlängerung
des
QT-Intervalls
bei
langsamen
Zykluslängen
in
den
Entstehungsmechanismus von TdPs ebenso mit einzubeziehen [214], wie die
Veränderung der Refraktärzeiten [59]. Beides konnten wir in unseren Versuchen
bestätigen. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass es durch die Herzinsuffizienz
und unter dem zusätzlichen Einfluss von Erythromycin signifikant häufiger zum
Auftreten von Herzrhythmusstörungen im Sinne von frühen Nachdepolarisationen
und polymorphen ventrikulären Tachykardien kam, als bei den Kontrolltieren.
Alle diese Befunde waren in den durchgeführten Versuchen nach der Behandlung
mit dem Stammzellpräparat G-CSF noch einmal deutlich verstärkt.
5.2 Einfluss von G-CSF auf die Arrhythmogenese bei
chronischer Herzinsuffizienz
Wie eingangs bereits erwähnt, gibt es verschiedene Studien, die einen positiven
Effekt des Zytokins G-CSF beim Herzinfarktmodell nachweisen konnten [11, 164166]. Dabei wurden zwar verschiedene Wirkungsweisen des G-CSF dargestellt, die
genaue Wirkungsweise von G-CSF bei Herzinsuffizienz ist dabei jedoch noch lange
nicht endgültig geklärt. Aufgrund von Berichten, in denen es auch zu verminderter
Arrhythmieanfälligkeit des insuffizienten Herzens in Zusammenhang mit einer
Erhöhung der Connexin43-Expression nach akutem Herzinfarkt kam [11], stellten wir
uns in dieser Studie die Frage nach dem Einfluss von G-CSF auf die
Arrhythmogenese bei nicht-ischämisch bedingter Herzinsuffizienz.
110
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
Es ist bekannt, dass für die Entstehung von Herzrhythmusstörungen bei chronischer
Herzinsuffizienz eine Vielzahl von Mechanismen verantwortlich ist. Dazu zählen
Veränderungen des elektrophysiologischen Substrates, wie das Herunterregulieren
der auswärtsgerichteten Kaliumionenströme [107-111], aber auch strukturelle
myokardiale Umbauprozesse, die einhergehen mit vermehrter fokaler Fibrose [116],
einem
Untergang
der
Myozyten
durch
Apoptose
[171]
oder
Autophagozytosemechanismen [173, 172], sowie einem „Remodeling“ der Gap
Junctions in Verbindung mit einem deutlichen Rückgang der Connexin43Expression [215].
Die Veränderung der Ionenkanaldichte und –verteilung am insuffizienten Herzen
konnte, wie in den beiden vorangegangenen Kapiteln gezeigt wurde, auch in unseren
Versuchen mit Hilfe verschiedener erhobener elektrophysiologischer Größen
bestätigt werden. Dabei zeigte das Zytokin G-CSF zusätzlich zu der bereits durch die
Herzinsuffizienz verminderte Repolarisationsreserve, entgegen unserer Erwartungen,
eine weitere Verstärkung dieses Mechanismus’. So stellte sich heraus, dass unter
dem Einfluss des Stammzellpräparates, sowohl der Effekt der Verlängerung der
Repolarisationszeiten, ebenso wie die Erhöhung von temporaler und spatialer
Dispersion der Repolarsation bei bestehender Herzinsuffizienz signifikant verstärkt
wurde.
Aufgrund
dieser
zusätzlich
durch
G-CSF
stark
verminderten
Repolarisationsreserve kommt es zu vermehrter Proarrhythmie der behandelten
Herzen
im
Vergleich
zur
Kontrollgruppe.
Die
mit
dem
Stammzellpräparat
behandelten Tiere zeigten nicht nur bei bestehender Herzinsuffizienz, sondern auch
bei den gesunden Vergleichstieren einen deutlichen Trend zu verstärkter
Proarrhythmie. Das zeigte sich am signifikant gehäuften Auftreten von Torsade de
Pointes unter G-CSF.
G-CSF übt also einen Einfluss auf die am Aktionspotential beteiligten Ionenströme
aus, der zu einer Reduktion der myokardialen Repolarisationsreserve führt und so
das Auftreten von Torsade de Pointes begünstigt.
Neben der direkten Wirkung des G-CSF auf die Mobilisation von Stammzellen gibt es
verschiedene Berichte nach denen G-CSF auch eine direkte Wirkung auf die
Myozyten durch Aktivierung unterschiedlicher Signalwege hat [165,166]. Zu diesen
111
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
kardioprotektiven Effekten zählen die Induktion der Angiogenese und die Abnahme
der Apoptose, was Suggano [166] unter dem Begriff „anti-remodeling-effect“ nach
akutem Herzinfarkt zusammenfasst. Doch bei chronischer Herzinsuffizienz sind die
Voraussetzungen für eine Stammzelltherapie wesentlich schlechter, als nach akutem
Herzinfarkt. Frisch ischämisches Herzgewebe ist für den Empfang von mobilisierten
Zellen durch Aktivierung des Endothels, die erhöhte Expression von Rezeptoren und
eine erhöhte Freisetzung von Botenstoffen sensibilisiert, dies ist bei chronischen
Prozessen nicht mehr der Fall [149]. Dennoch gibt es Berichte anderer
Arbeitsgruppen, die am Doxirubicin induzierten Herzinsuffizienzmodell durch
Mobilisation von Stammzellen mit Hilfe von G-CSF positive Effekte auf die
Vaskularisation am Herzen und eine gesunkene Mortalität der Tiere feststellen
konnten [162].
Kardioprotektive Effekte wie eine verbesserte Pumpfunktion des Herzens nach
Herzinfarkt, aber im Speziellen auch eine verminderte Arrhythmieanfälligkeit durch
vermehrte
Connexin43-Expression
konnte
eine
Arbeitsgruppe
aus
Münster
nachweisen [11]. Unsere Untersuchungen konnten diese Befunde bei chronischer
Herzinsuffizienz jedoch nicht bestätigen. Im Gegensatz zum Herzinfarktmodell zeigte
sich ein verstärktes proarrhythmisches Potential nach G-CSF Behandlung mit
signifikant höherem Auftreten von polymorphen ventrikulären Tachyarrhythmien vom
Typ Torsade de Pointes, so dass man davon ausgehen kann, dass bei chronischer
Herzinsuffizienz die Wirkungsweise von G-CSF eine Andere zu sein scheint. Das
Modell von akuter ischämischer und chronischer nicht-ischämischer Herzinsuffizienz
ist also in Bezug auf die Wirkungsweise des Stammzellpräparats G-CSF nicht
miteinander vergleichbar. Ein Erklärungsmodell für das verstärkte Auftreten von
Arrhythmien nach G-CSF Behandlung ist die verminderte Repolarisationsreserve, die
durch eine Herunterregulation oder Funktionsminderung der an der Repolarisation
beteiligten Kaliumkanäle hervorgerufen wird, eventuell in Verbindung mit einer
veränderten Connexin43 Expression. Das Zytokin G-CSF scheint keinen positiven
Einfluss bei Herzinsuffizienz auf diese Einflussgrößen der Repolarisation zu haben.
Damit unterstützen wir schon frühere Berichte von Proarrhythmie nach dem Einsatz
pluripotenter Stammzellen. So musste die jüngste MAGIC-Studie wegen des
5. Disskussion
112
_____________________________________________________________________________________________________
Auftretens von Rhythmusstörungen bei einigen Patienten abgebrochen werden [153].
Auch Zhang und seine Mitarbeiter [147] konnten im „whole-cell patch-clamp“ Modell
von Kardiomyocyten, die aus pluripotenten embryonalen Stammzellen abgeleitet
wurden, ein arrhythmogenes Potential mit den klassischen Mechanismen (re-entry,
APD-Verlängerung und getriggerter Aktivität) nachweisen.
G-CSF führte also in unserem chronischen Herzinsuffizienzmodell nicht zu einer
Reduktion von ventrikulären Arrhytmien, sondern verminderte ganz im Gegenteil die
Repolarisationsreserve und führte so zu einem verstärkten proarrhythmischen
Potential.
5.3 Grenzen der Methode
Bei der vorliegenden Studie handelt es sich um experimentelle Untersuchungen am
Modell einer schrittmacherinduzierten Tachykardiomyopathie am Kaninchen. Das
Kaninchenherz ist für diese Untersuchungen besonders gut geeignet, da es dem
Menschenherzen bezüglich der APD-Morphologie sehr ähnlich ist und im Gegensatz
zur Maus eine ähnlich lange Plateauphase aufweist [66]. Hondeghem [207] konnte
jedoch zeigen, dass das Kaninchenherz weniger IKs-Kanäle besitzt als der Mensch
und die Repolarisation überwiegend auf die IKr-Ionenströme beruht. Eine eins zu eins
Übertragung ist also trotz großer Ähnlichkeiten nicht gerechtfertigt.
Dieses sehr spezielle Modell einer chronischen Herzinsuffizienz ist aufgrund der
schrittmacherinduzierten Kardiomyopathie auch nicht ohne weiteres auf eine
natürlich entstandene Herzinsuffizienz bei Mensch oder Tier übertragbar. Die
Ergebnisse dieser Arbeit sind also nicht allgemeingültig, sondern lassen zunächst
nur eine Aussage für dieses spezielle Herzinsuffizienzmodell zu. Weiterhin wurden
für die Induktion der Kardiomyopathie nur junge Kaninchen verwandt, so dass die
Frage bleibt, inwieweit die Ergebnisse auch auf ältere Patienten übertragbar sind, da
davon ausgegangen werden kann, dass das Herz mit dem Alter Umbauprozessen
unterliegt. Außerdem wurden für die Untersuchungen 11-14 Tiere in den
verschiedenen Versuchsgruppen untersucht, was einen Einfluss auf die statistischen
Auswertungen hat. Je größer die Versuchsgruppen, umso präziser ist natürlich die
113
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
Aussagekraft der Ergebnisse. Gleiches gilt auch für die MAP-Ableitungen. Mit acht
Ableitungen, von denen sich nur eine endokardial befand, ist dies natürlich ebenfalls
ein limitierender Faktor für die Interpretation der Messwerte und die Information
bezüglich der transmuralen Dispersion. Aufgrund der geringen Größe des
Kaninchenherzens ist es jedoch so gut wie unmöglich, mehr als einen endokardialen
und sieben epikardiale Katheter aufzunehmen.
Als weitere Einschränkung muss die manuelle Ausmessung der QT-Zeiten genannt
werden, ebenso wie die Echokardiographie. In beiden Fällen wurden die Messungen
jedoch durch ein und dieselbe Person unter gleichen Bedingungen durchgeführt, um
individuelle Messabweichungen soweit wie möglich zu reduzieren.
Schließlich
sei
noch
Stammzellpräparates
in
erwähnt,
der
dass
Tierarztpraxis
der
großflächige
schon
allein
aus
Einsatz
des
Kosten-
und
Praktikabilitätsgründen nur eingeschränkt möglich wäre. Da es zum einen fraglich ist,
ob die Tierbesitzer bereit wären, den recht hohen Preis für eine solche Behandlung
zu tragen, und zum anderen eine längerfristige regelmäßige Anwendung nötig ist, die
vom Patientenbesitzer nicht immer gewährleistet werden kann.
5.4 Ein Ausblick
Die vorliegende Studie betont die Bedeutung des von Roden geprägten Konzepts
der Repolarisationsreserve [118]. In unserem Herzinsuffizienzmodel zeigte sich
durch die Gabe des Zytokins G-CSF eine Reduktion der Repolarisationsreserve noch
bevor klinische Anzeichen wie eine signifikante Verlängerung des QT-Intervalls
auftraten. Die Dispersion der Repolarisation, sowohl die räumliche als auch die
zeitliche Dispersion, stellen als Ausdruck der reduzierten Repolariationsreserve das
notwendige
Substrat
dar,
um
bei
geeignetem
Trigger,
wie
einer
frühen
Nachdepolarisation, polymorphe ventrikuläre Tachykardien auszulösen. Außerdem
schien
bereits
die
chronische
Herzinsuffizienz
zu
einer
Reduktion
der
Repolarisationsreserve zu führen, was sich im Beisein anderer Risikofaktoren
potenzierte, wenn es zu einer weiteren Verlängerung der Repolarisation kam. Dies
114
5. Disskussion
_____________________________________________________________________________________________________
gilt es natürlich im Besonderen bei der Therapie einer chronischen Herzinsuffizienz.
Eine solche medikamentöse Therapie besteht meist aus Betablockern, ACEHemmern, Angiotensin-II-Antagonisten und wird gelegentlich ergänzt durch DigitalisPräparate. Diese Medikamente haben sich bei der Reduktion der Morbidität bei
chronischer Herzinsuffizienz bewährt, wenngleich sie nicht zu einer Genesung führen
können. Es sollte dabei jedoch zusätzlich bedacht werden, dass z.B. Betablocker zu
einer Bradykardie, Diuretika eventuell zu einer Hypokaliämie führen können und dies
in
Zusammenhang
mit
der
durch
die
Herzinsuffizienz
reduzierten
Repolarisationsreserve klinische Symptome, wie Tachyarrhythmien, mit sich bringen
kann. Es gilt also, Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz sehr genau
medikamentös einzustellen und penibel elektrophysiologische Parameter, wie zum
Beispiel die QT-Zeiten im EKG, zu überwachen.
Im Besondern trifft dies für den unkritischen Einsatz neuerer pharmakologischer
Errungenschaften bei Herzinsuffizienz zu, deren Verlängerungseffekt auf die
Repolarisationszeit nicht abschließend geklärt wurde. So zeigte der Einsatz von GCSF nach akutem Myokardinfarkt durch verminderte Runterregulierung der
Connexin43-Expression ein antiarrhythmisches Potential [11]. Elektrophysiologische
Parameter wie QT-Zeiten, Aktionspotentialdauer oder Dispersion der Repolarisation
wurden in dieser Studie jedoch nicht untersucht. In der vorliegenden Studie führte die
Therapie der Schrittmacher-induzierten chronischen Kardiomyopathie mit dem
Stammzellpräparat G-CSF jedoch zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber
repolarisationsverlängernden Medikamenten und stellte dadurch einen neuen
Risikofaktor für das Auftreten von lebensbedrohlichen Rhythmusstörungen dar. Um
eine genauere Aussage über die Entstehungsweise dieses proarrhythmischen
Potentials des Zytokins G-CSF bei chronischer Herzinsuffizienz machen zu können,
bedarf
es
jedoch
weitergehender
Untersuchungen
auf
histologischer
und
molekulargenetischer Basis. Im Gegenzug sollten auch elektrophysiologische
Untersuchungen am Herzinfarktmodell erfolgen, um die Wirkungsweise des G-CSF
besser verstehen zu können. Da das Stammzellpräparat G-CSF auf sehr
vielschichtige Weise auf direktem und indirektem Wege auf verschiedene Gewebe
wirkt und auch das gewählte Versuchsmodel der Herzinsuffizienz einen Einfluss auf
5. Disskussion
115
_____________________________________________________________________________________________________
die Wirkungsweise des Therapeutikums aufweisen kann, sollte von einem
unkritischen Einsatz am herzinsuffizienten Patienten zunächst Abstand genommen
werden, bis der genaue Wirkungsmechanismus des Zytokins abschließend geklärt
werden konnte. Diese Arbeit sollte einen Beitrag dazu leisten, das Verständnis über
die Mechanismen von Herzrhythmusstörungen bei chronischer Herzinsuffizienz
voran zu bringen und erstmals die neue Therapieoption mit dem Stammzellpräparat
G-CSF an diesem Model zu untersuchen.
116
6. Zusammenfassung
_____________________________________________________________________________________________________
6. Zusammenfassung
Dieks, Kati:
Experimentelle Untersuchungen zum Einfluss einer G-CSF Therapie auf die
Arrhythmogenese bei Herzinsuffizienz an Langendorff- perfundierten isolierten
Kaninchenherzen
Hintergrund:
Der plötzliche Herztod, infolge lebensbedrohlicher Arrhythmien, ist einer der
häufigsten
Probleme
bei
chronischer
Herzinsuffizienz.
Die
chronische
Herzinsuffizienz geht mit einer Runterregulation der Kaliumkanäle einher und führt so
zu
proarrhythmischen
repolarisationsverlängernden
Nebeneffekten
Medikamenten.
bei
Jüngste
der
Therapie
Studien
zeigten
mit
eine
Reduktion von ventrikulären Tachyarrhythmien im Herzinfarktmodell nach G-CSFBehandlung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es also herauszufinden, ob sich eine
G-CSF-Therapie vorteilhaft auf die Proarrhythmie im Schrittmacher-induzierten
Herzinsuffizienzmodell auswirkt.
Methoden und Ergebnisse:
Bei 24 weiblichen Neuseelandkaninchen wurde durch drei- bis vierwöchige schnelle
Schrittmacherstimulation (400 Schläge pro Minute) eine chronische Herzinsuffizienz
erzeugt. 24 Kaninchen wurden Sham-operiert und für die gleiche Zeit beobachtet.
Die
Schrittmacher-stimulierten
Tiere
entwickelten
währenddessen
klinische
Anzeichen einer chronischen Herzinsuffizienz, die sich echokardiographisch in einer
signifikant gesunkenen Ejektionsfraktion (EF) messen lies. 11 Sham-operierte (S)
und 11 herzinsuffiziente Kaninchen (H) wurden mit 0,9% NaCl-Lösung behandelt und
dienten als Kontrolle. 13 Sham-operierte Tiere (S-G-CSF) und 13 herzinsuffiziente
Tiere (H-G-CSF) wurden hingegen über einen Zeitraum von 17±4 Tagen mit 10
µg/kg G-CSF s.c. therapiert.
Acht simultan aufgezeichnete endo- und epikardiale monophasische ventrikuläre
Aktionspotentiale der herzinsuffizienen Tiere zeigten nach Induktion eines AV-Blocks
und Stimulation bei Zykluslängen zwischen 900 ms und 300 ms eine signifikant
117
6. Zusammenfassung
_____________________________________________________________________________________________________
verlängerte Repolarisation (+3312 ms (APD90); p<0.01) unter dem Einfluss von
Erythromycin
(300
µM)
im
Vergleich
mit
den
Kontrolltieren.
Desweiteren
beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der spatialen und temporalen
Dispersion der Repolarisation (+93 ms and +62 ms; p<0.05). Als Folge der
gestiegenen transmuralen Dispersion, kam es auch zu einem signifikant höheren
Auftreten von Tachyarrhythmien vom Typ Torsade de Pointes bei Herzinsuffizienz
(127 Episoden vs. 27 Episoden: p<0.05). Mit G-CSF behandelte Herzen zeigten
zusätzlich eine signifikante Zunahme der APD90 (S-G-CSF: +17±6 ms; HF-G-CSF:
+44±16 ms; p<0.05 im Vergleich zu S und HF). Der weitere Anstieg der Dispersion
der Repolarisation unter G-CSF (S-G-CSF: +23±9 ms (spatial), +137
(temporal); HF-G-CSF: +38±14
ms
ms (spatial), +104 ms (temporal); p<0.05 im
Vergleich zu S and HF) führte auch zu einem weiteren Anstieg des Auftretens von
TdPs (S-G-CSF: +16 Episoden; HF-G-CSF: +17 Episoden). Im Gegensatz zum
Herzinfarktmodell
kommt
es
durch
G-CSF-Behandlung
bei
chronischer
Herzinsuffizienz im vorliegenden Modell nicht zu einer Reduktion des arrhythmischen
Potentials.
Schlussfolgerung:
Als Nebenwirkung der G-CSF Therapie kommt es zu einer weiteren Reduktion der
myokardialen
Repolarisationsreserve
in
einem
experimentellen
Modell
der
chronischen Herzinsuffizienz beim Kaninchen.
G-CSF-Therapie führt zu einem Anstieg der APD90 und der Dispersion der
Repolarisation in der vorliegenden Arbeit. Im Gegensatz zum Herzinfarktmodell,
scheint eine Medikation mit G-CSF im Falle einer chronischen Herzinsuffizienz
erfolglos bei der Behandlung von Arrhythmien zu sein.
7.Summary
118
_____________________________________________________________________________________________________
7. Summary
Dieks, Kati:
Experimental analysis of a G-CSF therapy and its influence on the
arrhythmogenesis in chronic heart failure in Langendorff- perfused isolated
rabbit hearts
Background:
Sudden cardiac death due to life-threatening arrhythmias is a major concern in
chronic heart failure (CHF). CHF is associated with downregulation of potassium
channels and may therefore increase the proarrhythmic side-effects of repolarizationprolonging drugs. Recently, G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) therapy
showed a reduction of ventricular tachycardias in an infarction model. Thus, the aim
of the present study was to determine, if chronic G-CSF therapy plays a beneficial
role on proarrhythmia in an experimental model of pacing induced heart failure.
Methods and Results:
In 24 female rabbits, heart failure was induced by three to four weeks of rapid
ventricular pacing (400 beats/min). 24 rabbits were sham-operated and observed for
the same time. The paced rabbits developed clinical signs of congestive heart failure
and a significant decrease of ejection fraction. 11 sham operated- (S) and 11 heart
failure- (HF) rabbits were treated with saline and served as controls, whereas 13
sham operated- (S-G-CSF) and 13 heart failure rabbits (HF-G-CSF) were treated
with 10µg/kg G-CSF s.c. over a period of 17±4 days.
Eight simultaneously recorded endo- and epicardial monophasic ventricular action
potentials showed a significant prolongation of repolarization (+3312ms (APD90);
p<0.01) after induction of AV-block and stimulation at cycle lengths between 900 and
300 ms in the presence of erythromycin infusion (300µM) in HF hearts as compared
with controls. Moreover, an increase in spatial and temporal dispersion of
repolarization (+93ms and +62ms; p<0.05), resulting from an increase in
transmural dispersion contributed to a significant higher rate of torsade de pointes
(TdP) tachycardia in CHF (127 episodes vs. 27 episodes: p<0.05). G-CSF - treated
7.Summary
119
_____________________________________________________________________________________________________
hearts showed a further significant increase in APD90 (S-G-CSF: +17±6ms; HF-GCSF: +44±16ms; p<0.05 as compared with S and HF). The further increase in
dispersion of repolarization (S-G-CSF: +23±9ms (spatial), +137ms (temporal); HFG-CSF: +38±14ms (spatial), +104ms (temporal); p<0.05 as compared with S and
HF), led to an increased incidence of TdP episodes (S-G-CSF: +16 episodes; HF-GCSF: +17 episodes). In contrast to the infarction model treatment with G-CSF
showed no beneficial effect on arrhythmias in CHF independently if they were sham
or failing hearts.
Conclusion:
Adverse effect of G-CSF therapy contributes to a further reduction of myocardial
repolarization reserve in an experimental model of chronic heart failure.
In the present study G-CSF therapy leads to an increase in APD90 and dispersion of
repolarization. In contrast to hearts in a myocardial infarction model, G-CSF therapy
seems to be unsuccessful to prevent arrhythmias in heart failure.
120
8.Literaturverzeichnis
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9. Abkürzungsverzeichnis
139
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9. Abkürzungsverzeichnis
APD
Aktionspotential Dauer
AT1
Angiotensin II Typ 1 Receptor
BMC
Bone Marrow Cells
Cx
Connexin
DAD
delayed Afterdepolarization – späte Nachdepolarisation
DCM
dilated Cardiomyopathy - dilatative Kardiomyopathie
EAD
early Afterdepolarization – frühe Nachdepolarisation
EPC
Endothelial Progenitor Cells
ES
embryonale Stammzellen
mES
Mäuse-ES
hES
Humane-ES
G-CSF
Granulozyten- Kolonie stimulierender Faktor
GM-CSF
Granulozyten-Monozyten Kolonie stimulierender Faktor
HI
Herzinsuffizienz
HSC
Hematopoietic Stem Cells
ICD
implantierbarer Kardioverter- Defibrillator
ICM
inner cell mass
MAP
Monophasisches Aktionspotential
MSC
Mesenchymal Stem Cells
PHT
plötzlicher Herztod
PVT
polymorphe ventrikuläre Tachykardie
TDR
transmurale Dispersion der Repolarisation
TdP
Torsade de Pointes
TGF1
Transforming growth factor beta 1
TNF
Tumor Nekrose Faktor alpha
VT
ventrikuläre Tachykardie
10. Danksagung
140
_____________________________________________________________________________________________________
10. Danksagung
Dr. med. Peter Milberg danke ich von ganzem Herzen für die Erarbeitung des
Dissertationsthemas, die intensive freundschaftliche Betreuung und die jederzeit
gewährte fachliche und persönliche Unterstützung während meiner gesamten
Doktorandenzeit am Universitätsklinikum Münster. Seine Ideen und Anregungen
haben die Ergebnisse dieser Arbeit wesentlich mitbestimmt.
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. med. Lars Eckardt, Universitätsklinikum Münster
für die Überlassung des Themas, die Schaffung der technischen Vorraussetzungen
und die wohlwollende Unterstützung der experimentellen Arbeiten.
Ich danke Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr, Tierärztliche Hochschule Hannover, für
die unkomplizierte und feundliche Betreuung und Zusammenarbeit über diese weite
Entfernung hinweg.
Frau Irina Potthoff, medizinisch technische Assistentin, danke ich für die herzliche
Aufnahme, das freundschaftliche Arbeitsklima und die gute Einarbeitung in die
Methodik, sowie die Hilfe bei der Durchführung der Versuche. Ich habe mich von
Anfang an wohl gefühlt.
Dem Personal der zentralen tierexperimentellen Einrichtung danke ich für die
liebevolle Pflege unserer Kaninchen.
Bei Frau Dr. rer. medic. Nani Osada bedanke ich mich für die freundliche
Unterstützung bei der statistischen Beratung und Auswertung.
Patricia Witte danke ich vor allem für die gesamte großartige Studienzeit,
gemeinsames Lernen, Reiten, Feiern und zermürbende Abende in diversen Laboren.
10. Danksagung
141
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Auch wenn wir uns leider nur noch selten sehen, wirst du immer eine kostbare
Freundin für mich sein.
Weiterhin bedanke ich bei Gerrit Frommeyer und Anne
Kleideiter für das gute
Teamwork. Anne, ich werde die Autofahrten nach Münster mit dir vermissen und
hoffe, dass wir weiterhin in Kontakt bleiben, auch nach der gemeinsamen Zeit. Und
wir haben es doch noch zusammen geschafft!
Mein besonderer Dank gilt auch meiner Schwester und meinen Eltern, die mich die
lange Studienzeit immer unterstützt haben. Ohne diese Familie wäre das alles nicht
möglich gewesen.
Schließlich danke ich mich meinem Mann, Holger Dieks, für viele liebevolle,
aufmunternde, tröstende, verständnissvolle und bestätigende Worte. Ohne deine
mentale Unterstützung wäre diese Arbeit nicht fertig gestellt worden. Ich danke Dir
für unseren Sohn Jonatan. Ohne Euch beiden wäre ich nur die Hälfte, ich liebe Euch
von ganzem Herzen.