Versuch 5: Enzyme (Alkalische Phosphatase)

Versuch 5: Enzyme (Alkalische Phosphatase)
(V5 20.10.08)
Lernziele:
1) Reaktionsgeschwindigkeit, Aktivierungsenergie, chem. Gleichgewicht;
2) Was tun Katalysatoren und Enzyme,
3) Michaelis-Menten Gleichung, Lineweaver-Burk-Diagramm,
4) kompetitive Hemmung, allosterische Regulation, pH-Optimum.
Hintergrund:
Enzyme sind biologische Katalysatoren. Als solche beschleunigen sie chemische
Reaktionen – oftmals um ein Zigtausendfaches, sodaß man Enzyme in solchen Fällen
auch als Ein/Aus-Schalter einer Reaktion betrachten kann. Die enzymatische Aktivität
wird durch viele Faktoren reguliert, z.B. die chemisch-physikalische Umgebung (pHWert, Temperatur, Ionen, etc.), die Verfügbarkeit von Substrat, die Anwesenheit von
bereits gebildetem Produkt, oft auch durch spezifische regulatorische Moleküle, und nicht
zuletzt durch die Konzentration des Enzyms selbst. Die Geschwindigkeit der
katalysierten Reaktion wird dadurch kontinuierlich regelbar, und das Enzym funktioniert
dann wie der Lautstärkeregler an Ihrer Stereoanlage.
Damit ein Molekül eine chemische Reaktion eingehen kann, muss es eine bestimmte
innere Mindestenergie annehmen, die sog. „Aktivierungsenergie“. Eine Substanz ist
umso stabiler, je größer die Differenz ihrer inneren Energie und der Aktivierungsenergie
ist (deshalb lagern wir empfindliche Lebensmittel im Kühlschrank). Die chemische
Reaktion kann also beschleunigt werden, indem man der Verbindung Energie zuführt,
z.B. durch Erhitzen. Dadurch erhöht sich die Chance eines individuellen Moleküls, die
Aktivierungsenergie zu erreichen und damit die Reaktion einzugehen. Auch Enzyme
beschleunigen die Reaktion, indem sie die Differenz zwischen innerer Energie des
Substrats und der Aktivierungsenergie verringern. Die jeweiligen molekularen
Mechanismen sind außerordentlich vielfältig und einfallsreich. Manchmal wird durch die
Bindung an ein Enzymmolekül ein Teil der inneren Energie des Enzyms auf das Substrat
übertragen. In anderen Fällen stabilisiert das Enzym einen Übergangszustand bzw. ein
Zwischenprodukt der Reaktion, was formal einer Herabsetzung der Aktivierungsenergie
gleichkommt.
In Ihrem ersten Experiment werden Sie eine enzymatisch katalysierte Reaktion
durchführen und mehrmals, bei immer höheren Substrat-Konzentrationen, wiederholen.
Dabei werden Sie feststellen, dass eine Erhöhung des Substratangebots zunächst
annähernd proportional zu einer gesteigerten Geschwindigkeit in der Bildung des
Reaktionsproduktes führt. Mit zunehmender Substratkonzentration wird dieser Effekt
immer bescheidener, bis schließlich eine abermalige Substraterhöhung keine weitere
Beschleunigung mehr bewirkt. Der Grund dafür ist, dass Substratmoleküle nur dann
reagieren können, wenn sie an ein Enzymmolekül gebunden haben. Da die Anzahl der
verfügbaren Enzymmoleküle in allen Ihren Ansätzen die gleiche war, tritt mit steigender
Substratkonzentration eine zunehmende Absättigung der Enzymmoleküle ein, sodass für
weiteres Substrat immer weniger freie Enzymmoleküle zur Verfügung stehen, bis
letztlich alle vorhandenen Enzymmoleküle zu jedem Zeitpunkt ein Substratmolekül
gebunden haben. Die Reaktion läuft dann mit maximal möglicher Geschwindigkeit.
Michaelis-Menten Theorie:
Wenn Sie in einem Diagramm die gemessenen Geschwindigkeiten (v) gegen die
jeweiligen Substratkonzentrationen (S) auftragen, erhalten Sie eine nach rechts hin immer
flacher verlaufende Kurve, die sich asymptotisch der maximal möglichen Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) annähert. Sie erinnern sich, dass Vmax dann erreicht wird, wenn
alle Enzymmoleküle jederzeit Substrat gebunden haben. Demzufolge haben bei halbmaximaler Geschwindigkeit nur 50% aller Enzymmoleküle Substrat gebunden. Wenn Sie
in Ihrer Kurve diesen Punkt suchen, können Sie die dafür erforderliche
Substratkonzentration auf der X-Achse ablesen. Hätten Sie nun Gelegenheit, mehrere
Enzyme zu untersuchen, dann könnten Sie vielleicht feststellen, dass diese Kurve mal
steiler, mal flacher ausfallen. Entsprechend würde die Substratkonzentration, die zum
Erreichen der halb-maximalen Geschwindigkeit erforderlich ist, mal geringer, mal höher
sein. Dieses Verhalten reflektiert die Festigkeit („Affinität“), mit der Enzym und Substrat
aneinander binden. Die Substratkonzentration, die zum Erreichen der halb-maximalen
Geschwindigkeit, also zur Besetzung von 50% aller vorhandenen Enzymmoleküle
erforderlich ist, wird damit zu einer wichtigen Kennzahl eines Enzym-Substrat-Paares.
Diese Kennzahl heißt die Michaelis-Menten Konstante („Km“).
Maud Menten hat in ihrer Dissertation bei Leonor Michaelis 1913 ein mathematisches
Modell für dieses Verhalten formuliert. Versuchen Sie doch einmal, die zugrunde
liegenden Überlegungen dieser Theorie nachzuvollziehen. Sie sind in jedem BasisLehrbuch der Biochemie besser und ausführlicher beschrieben, als es in diesem Rahmen
hier möglich wäre. Sie werden dann sehen, warum die Kurve, die Sie in Ihren
Experimenten erhalten haben eine Parabel der Form v = Vmax * S / (Km+S) ergeben
musste.
Lineweaver-Burk und andere Linearisierungsverfahren:
Wenn Sie nun aus denselben Messwerten die Kehrwerte (1/v) bilden und gegen die
Kehrwerte der dazugehörigen Substratkonzentrationen (1/S) auftragen, dann geschieht
etwas Sonderbares: anstelle einer gekrümmten Kurve erhalten Sie eine Gerade, die links
der Y-Achse die X-Achse schneidet. Dieser Schnittpunkt repräsentiert den negativen
Kehrwert von Km. Der Schnittpunkt der Gerade mit der Y-Achse bildet den Kehrwert der
Maximalgeschwindigkeit ab (warum?). Wenn Sie die obige Michelis-Menten Gleichung
nach 1/v auflösen, erhalten Sie die entsprechende Geradengleichung. Dieses sogenannte
Lineweaver-Burk Diagramm hat einige Vorteile, z.B. den, dass eine Gerade bereits durch
zwei Punkte definiert ist, und nicht erst unzählige Wiederholungen des Experiments
durchgeführt werden müssen, um Vmax zu bestimmen. Außerdem ist aus der
asymptotischen Annäherung der Kurve Vmax ohnehin nur näherungsweise zu
bestimmen. Der Nachteil der Lineweaver-Burk Darstellung ist, dass kleine (und deshalb
ungenaue) Messwerte zu großen Kehrwerten führen und deshalb relativ kleine Fehler zu
großen Ungenauigkeiten führen. Später entwickelte Linearisierungsverfahren umgehen
dieses Problem. Aber damit wollen wir Sie bei unseren Erstkontakt mit Enzymen nicht
belasten.
Links das Michaelis-Menten-Diagramm, rechts die Lineweaver-Burk-Auftragung derselben Daten.
Kompetitive Inhibitoren:
Zu den vielen Verbindungen, die eine Enzymreaktion beeinflussen können zählen auch
solche, die eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit mit dem Substrat aufweisen. Solche
Verbindungen können zwar an das katalytische Zentrum des Enzyms binden, werden
aber dort keine (oder eine andere) chemische Reaktion eingehen. Ihre Besetzung des
katalytischen Zentrums verhindert natürlich die gleichzeitige Bindung eines
Substratmoleküls. Allerdings kann sie durch einen entsprechenden Überschuss an
Substrat wieder aus der Bindungsstelle werden. Da beide Verbindungen um die
Bindungsstelle am Enzym im Wettstreit liegen, nennt man solche Substanzen
„kompetitive Inhibitoren“. Die Stärke des hemmenden Effekts hängt ab von der
Konzentration (I) und (verständlicherweise) der Affinität des Inhibitors (Ki) zum Enzym.
Einen kompetitiven Inhibitor kann man an einer scheinbaren Erhöhung des Km-Wertes
erkennen (warum?). Die erreichbare Maximalgeschwindigkeit bleibt jedoch auch in
Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors gleich (warum?).
Mathematisch ergibt sich diese Erhöhung aus dem Term Km’ = Km * (1 + I/Ki). Warum
das so ist würde hier zu weit führen, aber Sie brauchen diese Beziehung in Ihrem
nächsten Experiment, um die Affinität des Inhibitors zu berechnen. Sie werden in Ihren
Experimenten Gelegenheit haben, die Funktionsweise von alkalischer Phosphatase (AP)
zu untersuchen. AP katalysiert die Hydrolyse von Phosphorsäureestern, also die
Abspaltung von anorganischem Phosphat aus einer Vielzahl von organischen
Verbindungen, z.B. phosphorylierten Aminosäure-Seitenketten in Proteinen (welchen?),
den 5’-Enden von Nukleinsäurefragmenten, ATP, etc., ja sogar von Verbindungen, die in
der Natur gar nicht vorkommen. Das dabei anfallende Phosphat, das eben noch Teil des
Substratmoleküls war, hat selbst eine gewisse Affinität zum katalytischen Zentrum des
Enzyms und wirkt damit als kompetitiver Inhibitor. Wie Sie diese messen können,
entnehmen Sie der Arbeitsanleitung in Experiment A weiter unten. Wenn Sie Ihre
Messreihe in einem Puffer wiederholen, der Phosphationen enthält, dann verändert sich
das Aussehen der Michaelis-Menten Kurve und die Gerade im Lineweaver-Burk
Diagramm (wie werden diese im Vergleich zur ungehemmten Reaktion aussehen?)
Allosterische Regulation:
Alkalische Phosphatase hat zwei Bindungsstellen für Zn++ und eine für Mg++ Ionen. An
das Polypeptid gebunden erhöhen diese Ionen die enzymatische Aktivität ganz
entscheidend. Sie sind damit gute Beispiele für allosterische Aktivatoren. Zweiwertige
Kationen werden durch geeignete Chelatoren (woher kommt dieser Name?) stark
gebunden. Die Zugabe von Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) zum Reaktionsansatz
wird dazu führen, dass ein Großteil der Ionen vom Enzym abgezogen und an EDTA
gebunden wird. In Ihrem Experiment C können Sie beobachten, welchen Einfluss das auf
die Reaktionsgeschwindigkeit hat, und dass sich dieser Effekt durch Zugabe von ZnCl2
im Überschuss wieder kompensieren lässt.
Es gibt natürlich auch allosterische Inhibitoren. Da diese, wie der Begriff „allosterisch“
nahe legt, außerhalb des katalytischen Zentrums binden, können sie nicht durch erhöhte
Substratkonzentration aus dem Enzym verdrängt werden. Deshalb ändert sich bei
allosterischen Hemmungen auch der Km-Wert nicht. Weil aber solche Inhibitoren
generell die Aktivität des Enzyms beeinträchtigen, wirkt das so als wäre weniger Enzym
vorhanden. Dadurch verringert sich die maximal mögliche Reaktionsgeschwindigkeit
(wie würden Michaelis-Menten und Lineweaver-Burk Diagramme dann aussehen?).
Bevor es los geht noch ein paar Details zum experimentellen System, mit dem Sie
arbeiten werden:
„Alkalische Phosphatase“ wird so genannt, weil ihr Aktivitätsoptimum im alkalischen
pH-Bereich liegt. Als Testsubstrat verwenden wir p-Nitrophenylphosphat. Die
Abspaltung des Phosphatrests führt zur Bildung eines p-Nitrophenolat-Anions, das eine
charakteristische gelbe Farbe zeigt, anhand derer wir die Konzentration des
Reaktionsprodukts photometrisch messen können.
Ihre Experimente:
Experiment A:
Aufgaben: 1) Bestimmung des Km-Wertes von alkalischer Phosphatase.
2) Bestimmung der Wechselzahl
3) Bestimmung von Km’ in Anwesenheit von 0.5mM Phosphat als
kompetitivem Inhibitor.
4) Berechnung der Inhibitor-Affinität (Ki).
Durchführung:
A.1. Bestimmung der Michaelis-Kontante Km und der Wechselzahl von AP
1) Pipettieren Sie alle angegebenen Lösungen, mit Ausnahme des Enzyms (!), in der
angegebenen Reihenfolge in saubere, trockene Küvetten.
Küvetten #
1
2
3
4
5
Glycin-Puffer, pH 9.6 (µl)
800
800
800
800
800
0.01 M pNPP (µl)
10
20
40
80
160
H2O (µl)
150
140
120
80
-
Enzymlösung (µl)
40
40
40
40
40
2) Stellen Sie die Wellenlänge des Photometers auf 405nm.
3) Stellen Sie die Küvette #1 in das Photometer und gleichen Sie es durch Drücken der
"Set Ref" Taste auf Null ab.
4) Nehmen Sie die Küvette aus dem Photometer, geben Sie die Enzymlösung zu und
verschließen Sie die Küvette mit einem Stück Parafilm. Mischen Sie den Ansatz und
starten Sie dabei gleichzeitig die Stoppuhr.
5) Stellen Sie die Küvette in das Photometer zurück und notieren Sie die Absorption bei
t1=20sec und bei t2=80sec.
6) Wiederholen Sie dieselbe Vorgangsweise mit den anderen Küvetten.
Das gebildete gelbe p-Nitrophenolat ist ein Produkt der enzymatischen Katalyse. Aus der
Absorption E bei 405 nm kann man die Konzentration dieses Produktes bestimmen. Man
muß dazu nur die Schichtdicke d der Küvette (1 cm) und den molaren Extinktionskoeffizienten ε von p-Nitrophenolat (ε = 18000 L*mol-1*cm-1) kennen, dann kann man
mit Hilfe des Lambert-Beer-Gesetzes (E = ε * c * d) die Konzentration c berechnen.
Lassen Sie sich durch diese Gleichungen und Koeffizienten nicht einschüchtern.
Eigentlich handelt es sich dabei nur um eine Schlussrechnung, und ε gibt nur an, wie
hoch die Absorption einer 1M Lösung wäre. Die wenig anschauliche Dimension von ε
ergibt sich dabei aus dem Umstand, dass die Absorption eine dimensionslose Größe ist
und die Konzentration mol/L (mol * L-1) im Nenner steht, die Schichtdicke d ebenso.
Formen Sie also die obige Gleichung nach c um und setzen Sie die gemessene
Absorption für E ein, dann erhalten Sie die Konzentration des Reaktionsproduktes. Die
Reaktionsgeschwindigkeit wird ausgedrückt als Konzentrationsänderung pro Zeiteinheit,
z.B. µmol * L-1 * min-1 oder, was das gleiche ist, µM/min.
Ergebnisse der Messungen:
Küvetten #
1
2
3
4
5
E (405 nm) t=20sec
E (405 nm) t=80sec
∆E/min
v (µM/min)
1/v (min/µM)
[pNPP] (µM)
1/[pNPP] (L/µmol)
E = Absorption (=Extinktion), ∆E = Änderung der Absorption, v = Geschwindigkeit,
[pNPP] = Ausgangskonzentration vom Substrat p-Nitrophenylphosphat (zu berechnen
aus Konzentration und Volumen der Stammlösung und Volumen des gesamten
Ansatzes).
Zeichnen Sie nun aus Ihren Ergebnissen ein Michaelis-Menten und ein Lineweaver-Burk
Diagramm und ermitteln Sie aus beiden Darstellungen Km und Vmax (welche
Diagrammform eignet sich dazu besser?) Vermeiden Sie bei der Erstellung Ihrer
Diagramme Zahlen mit allzuvielen Nullen vor oder hinter dem Komma. Dafür gibt es die
entsprechenden Vorsätze m (10-3), µ (10-6), n (10-9) etc., bzw. Zusätze wie „x10-3“, etc.
Als absoluter Wert ist Vmax wenig aussagekräftig und eignet sich nur für den Vergleich
verschiedener Proben untereinander. Wenn man aber die Konzentration der reinen
Enzymmoleküle im Ansatz kennt, dann kann man über Vmax berechnen, wie viele
Moleküle Substrat ein Molekül Enzym pro Sekunde umsetzen kann. Dieser Wert heißt
die „Wechselzahl“ und ist ein weiteres wichtiges Charakteristikum eines
Enzym/Substrat-Paares. Vmax ergibt sich dann aus der Wechselzahl und der
Konzentration des Enzyms im Ansatz.
Alkalische Phosphatase hat ein Molekulargewicht von 69kDa. Nehmen Sie an, die
Enzym-Stammlösung, die Sie erhalten haben, hätte eine Konzentration von 33µg/mL,
und berechnen Sie damit aus der von Ihnen ermittelten Vmax die Wechselzahl für AP.
A.2 Bestimmung von Km' und Vmax in Gegenwart von anorganischem Phosphat
und Berechnung der Inhibitorkonstante Ki für Phosphat
Der Versuch wird genauso durchgeführt wie A.1., nur enthält diesmal der Glycinpuffer
0.5 mM Phosphat als kompetitiven Inhibitor.
Pipettierschema:
Küvetten #
1
2
3
4
5
Glycin-Puffer, pH 9.6 mit 0.5 mM
800
800
800
800
800
0.01 M pNPP (µl)
10
20
40
80
160
H2O (µl)
150
140
120
80
-
Enzymlösung (µl)
40
40
40
40
40
Phosphat (µl)
Ergebnisse der Messungen:
Küvetten #
1
2
3
4
5
E (405 nm) t=20sec
E (405 nm) t=80sec
∆E/min
v (µM/min)
1/v (min/µM)
[pNPP] (µM)
1/[pNPP] (L/µmol)
Zeichnen Sie Ihre Messwerte in die Diagramme von Experiment A1 ein und bestimmen
Sie auch für den neuen Versuch Km und Vmax. Welchen Einfluss hat anorganisches
Phosphat auf die Reaktionskinetik im Michaelis-Menten Diagramm, bzw. in der
Umformung nach Lineweaver-Burk? Wie würde das mit einem allosterischen Inhibitor
aussehen?
Ergebnisse:
Versuch #
1
Phosphatkonzentration (in der Küvette) (mM)
0
2
Km (µM)
Vmax (µM/min)
Die Inhibitorkonstante Ki beschreibt die Affinität eines Inhibitors zum Enzym.
Ki lässt sich berechnen nach der Gleichung: Km' = Km · ( 1 + I/Ki). [I] ist dabei die
Inhibitorkonzentration. Formen Sie diese Gleichung so um, dass Sie I isolieren können.
Ergebnis: Ki = …………..
Experiment B:
Aufgabe: Bestimmung des pH-Optimums von AP
Der pH-Bereich, in dem alkalische Phosphatase ihr maximale Aktivität zeigt wird
gemessen, indem man Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Dazu wird unter
Substratsättigung des Enzyms die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax)
bestimmt.
Durchführung:
Der Testansatz enthält:
800 µl 0.1 M Glycin-NaOH Puffer (6 Ansätze mit jeweils unterschiedlichem pH-Wert)
80 µl p-Nitrophenylphosphat (0.01 mol/l)
80 µl dest. Wasser
40 µl Enzym
Es stehen Glycinpuffer mit sechs verschiedenen pH-Werten zur Verfügung.
Durchführung der Messung wie in Experiment A1 beschrieben.
pH-Wert
E (405nm) 20 s
E (405nm) 80 s
∆E/min
In einem Diagramm werden die Reaktionsgeschwindigkeiten (als ∆E/min, y-Achse)
gegen die pH-Werte (x-Achse) aufgetragen (warum muss in diesem Fall die
Geschwindigkeit nicht in µM/min umgerechnet werden? Muss man das für die
Bestimmung von Km aus dem Michaelis-Menten oder dem Lineweaver-Burk Digramm?)
Ergebnis: pH-Optimum = ……….
Experiment C:
Die allosterische Regulation der alkalischen Phosphatase wird untersucht, indem
zunächst durch EDTA Zink entzogen und dann durch Zugabe von weiterem Zink der
EDTA-Effekt wieder aufgehoben und überkompensiert wird. Alkalische Phosphatase
benötigt zweiwertige Kationen (Zn, Mg), um aktiv zu sein. EDTA entzieht dem Enzym
diese Ionen, was den Verlust eines allosterischen Aktivators bedeutet. Durch Zugabe von
Zink kann der EDTA-Effekt wieder aufgehoben werden.
Aufgabe: Inaktivierung der AP durch EDTA und Reaktivierung durch Zink.
Durchführung:
Der Standardansatz enthält: 800 µl 0.1M Glycin-NaOH Puffer, pH 9.6
80 µl 0.01 mol/l p-Nitrophenylphosphat
80 µl dest. Wasser
40 µl Enzym
Pipettieren Sie die Lösungen in der angegebenen Reihenfolge in eine Küvette. Nach
Zugabe des Enzyms wird sofort gemischt und bei 405 nm im Photometer abgeglichen.
Sobald die Geräteanzeige 0.000 erscheint, lesen Sie 3 Minuten lang alle 30 s die
Extinktion ab und notieren Sie die Werte.
Mit einem zweiten Ansatz wird genauso verfahren, nur dass vor Zugabe des Enzyms 10
µl EDTA-Lösung zugegeben werden. Nach 3 min geben Sie demselben Ansatz 50 µl
ZnCl2-Lösung zu. Mischen Sie den Ansatz schnell und lesen Sie die Extinktion für
weitere 3 min alle 30 sec ab.
Zur Auswertung erstellen Sie ein Diagramm, in dem Sie die Absorptionswerte beider
Ansätze gegen die Zeit auftragen.
Material-Liste:
Geräte:
Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200 und 20µL.
Reagenzgläser mit Haltern,
Photometer (405 nm)
Küvetten
Stoppuhr
Lösungen:
Glycin-NaOH Puffer, pH 9.6 (0.1 mol/l) (MW=75,07 g/mol)
p-Nitrophenylphosphat (0.01 mol/l) (Na-Salz, MW= 371 g/mol)
Alkalische Phosphatase, 1000 U/ml, 10 mg/ml, mit 1x CIAP-Puffer 1:300 verdünnt
Glycin-NaOH Puffer, pH 9.6 (0.1 mol/l) mit 0.5 mmol/l Dinatriumhydrogen-Phosphat)
Glycin-NaOH Puffer, pH 8.0 (0.1 mol/l)
Glycin-NaOH Puffer, pH 8.8 (0.1 mol/l)
Glycin-NaOH Puffer, pH 9.2 (0.1 mol/l)
Glycin-NaOH Puffer, pH 9.6 (0.1 mol/l)
Glycin-NaOH Puffer, pH 10.0 (0.1 mol/l)
Glycin-NaOH Puffer, pH 10.4 (0.1 mol/l)
EDTA (Ethylendiamintetraacetat) (0.1 mol/l)
ZnCl2-Lösung (0.1 mol/l)