In vitro Testmethoden zur Überprüfung der Aktivität natürlicher und

Aus der Abteilung für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte,
Handchirurgie-Zentrum,
im Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil
der Ruhr – Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. U. Steinau
In vitro Testmethoden zur Überprüfung der Aktivität natürlicher und
synthetischer Host Defense Peptide gegen Bakterien und Pilze mit Vergleich
zu klinisch eingesetzten Antibiotika und Antimykotika
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr – Universität Bochum
vorgelegt von
Gottlieb Pazdzierny
aus Kedzierzyn-Kozle
2010
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. L. Steinsträßer
Korreferent: Prof. Dr. med. S. Gatermann
Tag der mündlichen Prüfung: 05.04.2011
Inhaltsverzeichnis:
Seite
1.
Einleitung
2
1.1.
Antibiotika
2
1.1.1. Eine Welt ohne Antibiotika
2
1.1.2. Die Entdeckung der Antibiotika
3
1.1.3. Resistenzentwicklung innerhalb der Antibiotika
5
1.1.4. Lösungsstrategien zur Minimierung der Resistenzentwicklung
11
1.2.
11
Das Angeborene Immunsystem
1.2.1. Host Defense Peptide
13
1.2.2. Cathelicidine
17
1.3.
Aufgaben und Ziele der Studie
20
2.
Material und Methoden
22
2.1.
Radial Diffusion Assay
22
2.2.
Modified CLSI Microbroth Dilution Assay
27
2.3.
CLSI Microbroth Dilution Assay für Pilze
30
3.
Ergebnisse
33
3.1.
Radial Diffusion Assay
33
3.1.1 Grampositive Bakterien
33
3.1.2. Gramnegative Bakterien
34
3.1.3. Pilz
35
3.2.
36
Modified CLSI Microbroth Dilution Assay
3.2.1. Grampositive Bakterien
37
3.2.2. Gramnegative Bakterien
39
3.2.3. Vergleich mit Standardantibiotika
41
3.3.
Modified CLSI Microbroth Dilution Assay für Pilze
44
4.
Diskussion
45
5.
Zusammenfassung
53
6.
Literaturverzeichnis
54
7.
Danksagung
72
8.
Lebenslauf
73
1
1.
Einleitung
1.1.
Antibiotika
1.1.1. Eine Welt ohne Antibiotika
„Although the Soldiery retreated from the Field of Death and encamped out
of the City, the Contagion followed, and vanish´d them; many in their Old Age, and
others in their Prime, sunk under its cruelties; of the Female Sex most died; and
hardly any children escaped; and it was not uncommon to see an Inheritance pass
successively to three or four Heirs in as many days; the Number of Sextons were
not sufficient to bury the Dead.”
- Nathanial Hodges; Loimologia: An account of the 1665 London Plague -
Die Bedrohung der Menschheit durch tödliche Infektionskrankheiten, die sich
mittels Übertragung zu verheerenden Pandemien ausweiten, ist so alt wie die
Menschheit selbst. Dazu zählen nicht nur die oben angesprochene Pest, sondern
auch Cholera, Influenza, Typhus, Tuberkulose und viele andere, deren
Verbreitung letztlich dafür sorgte, dass die Lebenserwartung der Bevölkerung in
früheren Jahrhunderten deutlich eingeschränkt blieb. Aus anderen Erkrankungen,
wie Ohr-, Haut- oder Halsentzündungen resultierten oft Taubheit, Entstellung
und/oder Tod infolge von Sepsis und anderen Komplikationen [116].
Bis ins 19. Jahrhundert hinein, betrug die durchschnittliche Lebenserwartung in
Europa und Nordamerika ca. 50 Jahre und war bestimmt durch – wenn
vorhersagbar – den steten Verlust von Familienmitgliedern, Freunden, Gatten und
Kollegen. Die Angewohnheit sich nach der Gesundheit des Gegenübers zu
erkundigen stammt aus dieser Zeit und war eine Freundlichkeit mit Hintergrund.
Sie basierte auf der immerwährenden Bedrohung durch einen plötzlichen Tod, sei
es durch eine Seuche, einen Unfall oder eine zufällige Infektion, verursacht durch
einen der zahlreichen umweltbezogenen Erreger. Es war eine Welt, in der die
Wahrscheinlichkeit durch eine infektiöse Seuche vorzeitig zu versterben bei 40%
lag und in der Frauen regelmäßig an den Folgen von perinatalen Infektionen
2
verstarben, deren Heilung in heutigen Standards nahezu selbstverständlich ist
[116].
1.1.2. Die Entdeckung der Antibiotika
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts änderte sich die Situation mit der Entdeckung
neuer Mittel im Kampf gegen die Infektionen des Alltags. 1928 beobachtete der
britische Arzt Sir Alexander Flemming, wie ein bestimmter Schimmelpilz namens
Penicillium, der die Bakterienkultur des Wissenschaftlers kontaminiert hatte, diese
abtötete.
Die
Entdeckung
des
Antibiotikums
Penicillin
sollte
der
erste
entscheidende Schritt, auf dem Weg zur einer veränderten Strategie bei der
Behandlung von Infektionen werden. Die Entwicklung vieler weiterer Antibiotika
folgte, darunter die der Cephalosporine aus Pilzen sowie einer Vielzahl anderer
aus den verschiedenen Stämmen des Filamentbakteriums Streptomyces, wie z. B.
Streptomycin, Erythromycin, Tetracyclin und Vancomycin. Dann begannen die
semi-synthetischen
Modifikationen
der
Klassen
von
Penicillinen
und
Cephalosporinen und damit die Produktion von ß-Laktamen der zweiten und
dritten Generation. Die sog. totale Synthese führte dann zur Entwicklung von
Zweitgenerations-Erythromycinen wie Klarithromycin und Azithromycin (Abb. 1).
Abbildung 1: Übersicht über den zeitlichen Verlauf der Entwicklung neuer
Antibiotika [85]
3
Die Einführung dieser Medikamente in den medizinischen Alltag sollte in der
Folgezeit Millionen von Leben retten und die Entwicklung von komplexen
chirurgischen Eingriffen erlauben, solchen die zuvor wegen des Risikos von
postoperativen Infektionen noch als zu risikoreich abgelehnt worden waren. Der
herausragende Erfolg der neuen Medikamente verleitete einige Kliniker und
Wissenschaftler zur Voraussage, der Planet sei in naher Zukunft von allen
pathogenen Bakterien befreit. Alsbald wurde dieser Optimismus durch das
Aufkommen antibiotikaresistenter Bakterien ad absurdum geführt. Zwei Jahre
nachdem Penicillin Mitte der 40er Jahre in der breiten Masse verfügbar geworden
war, registrierten Wissenschaftler das in Erscheinung Treten der ersten Stämme
von penicillin-resistenten Stämmen des Staphylococcus aureus. Von diesen
ersten Fallbeschreibungen aus, eskalierte das Problem in eine ernste Sorge des
öffentlichen
Gesundheitswesens
mit
einer
Bedeutung
auf
der
globalen
ökonomischen, sozialen und politischen Ebene [104].
Als man immer vertrauter wurde mit der Epidemiologie und den Mechanismen der
Resistenz gegenüber antimikrobiellen Medikamenten, sah man sich mit einer
beachtliche Fülle von Möglichkeiten konfrontiert, die Bakterien zur Verfügung
stand, um sich der Wirkung von Antibiotika zu entziehen. Eine einzelne Mutation
kann bereits zur Resistenz eines Stammes führen, ohne dabei seine Pathogenität
oder Lebensfähigkeit zu verändern. In der wissenschaftlichen Theorie kann das
Problem der Mutationsresistenz überwunden werden durch das Verabreichen
einer Kombination von Medikamenten in ausreichender Dosis und Dauer zur
Auslöschung der Infektion. In der klinischen Praxis ist das Gegenteil geläufig.
Immer dann, wenn Falschanwendung und Missbrauch von Antibiotika stattfindet,
entstehen Resistenzen. Zusätzlich töten die so angewendeten Antibiotika die nonresistenten Organismen, den wichtige Status quo des Organismus zerstörend,
schaffen sie Platz für die Vermehrung der resistenten Gegenstücke, die dann ihre
Antibiotika feindlichen Gene verbreiten können. Einige wichtige Beispiele für
solche Organismen sind der methicillin-resistente S. aureus (MRSA), der
penicillin-resistente Streptococcus pneumoniea (PRSP) und der vancomycinresistente Enterococcus spp. (VRE). So sind in der ersten Welt schätzungsweise
60%
von
nosokomialen
Infektionen
durch
antibiotikaresistente
Mikroben
verursacht. Da in den vergangenen Jahren immer mehr Menschen Träger von
4
multiresistenten Keimen wurden, blieben die Infektionen mit solchen Keimen nicht
nur auf das Krankenhaus beschränkt [82, 20]. So bilden diese multiresistenten
Stämme eine immer ernster werdende Bedrohung der Arbeit des plastischen
Chirurgen, weil die Infektion einen großen Beitrag am Versagen der operativen
Behandlung einnimmt.
1.1.3. Resistenzentwicklung innerhalb der Antibiotika
Nach einer Lawine von Entdeckungen zwischen 1930 und 1980 hatte es in den
letzten 20 Jahren deutlich weniger Innovationen im Kampf gegen infektiöse
Organismen gegeben. Pharmazeutische Unternehmen glaubten, es gebe bereits
genug Antibiotika, und begannen Forschungsinvestitionen zur Entwicklung neuer
Mittel zu reduzieren oder sie aus dem wenig profitablen Antibiotikamarkt
umzuleiten [23]. So war es nicht verwunderlich, dass der großen Häufigkeit von
Multiresistenzen nur die begrenzte Einführung neuer Mittel zur Behandlung
bakterieller Infektionen gegenüberstand. Die üblichen Kosten für ein Antibiotikum
von seiner Entdeckung bis zu seiner Markteinführung liegen ca. zwischen 85 Mio.
€ und 300 Mio. €. Ist einmal die effektive Wirksamkeit des Antibiotikums
nachgewiesen und es betritt den klinischen Gebrauch, ist es nur eine Frage der
Zeit bis zum Auftreten der ersten Resistenzen. Klinisch signifikante Resistenzen
entwickeln sich nahezu ständig im Laufe von Monaten bis Jahren [24]. Nimmt man
die riesige Anzahl von Bakterien, die in einem Infektionszyklus involviert ist, dazu
noch die schnelle Generationszeit und die intrinsische Rate von Mutationen von
ungefähr 1 zu 107, so hätte ein Pool von 1010 Bakterien Mutationen in ca. 1000
Loci zur Folge. Trägt nur eine dieser Mutationen zu einer Resistenz gegenüber
dem angewandten Antibiotikum, so werden nur die sensiblen Bakterien sterben,
während der resistente Stamm wächst, den Platz der toten Nachbarn einnimmt
und schließlich die dominante Variante in dieser Population wird. Diese
Organismen können nun entweder ihre Resistenz-Gene an ihr Nachkommen
durch Replikation weitergeben oder sie verwandten Bakterien mittels Konjugation
weiterreichen, wobei genübertragende Plasmide von einem Organismus zum
anderen überbracht werden.
Trotz des häufigen Gebrauchs von Antibiotika im Krankenhaus, bleiben
Infektionen ein alltägliches Problem der Klinik. Während die Verteilung der
pathogenen Keime, die aus chirurgischen Infektionen isoliert werden, sich
5
innerhalb der vergangenen Jahre nicht wesentlich verändert hat [80, 83], stellt die
steigende Frequenz von antimikrobiell resistenten Stämmen ein wachsendes
Problem dar [81]. Bis 2001 hat man über sechs klinische Infektionen mit
Vancomycin-intermediärem S. aureus (VISA) aus den USA berichtet [35], seitdem
ist ihre Zahl nicht nur in den USA weiter gestiegen, es wurde auch ein Anstieg an
Infektionen in Europa und Asien beobachtet [15, 53, 70, 88]. Heutzutage sind
nahezu alle S. aureus Stämme resistent gegenüber Penicillin und das Verhältnis
zu S. aureus Isolaten, die gegenüber Methicillin, Oxacillin oder Naficillin (sog.
MRSA) resistent sind, steigt kontinuierlich, so dass in einigen Regionen Asiens
und der USA eine Prävalenz bis über 50% erreicht wird [56]. Staphylococcus
aureus
ist
und
bleibt
Wundinfektionen
[81].
dabei
die
häufigste
Stämme
dieses
Ursache
von
chirurgischen
Bakteriums
verursachen
Hautentzündungen sowie Abszesse und können sich hämatogen ausbreiten, um
so zu schweren Organschäden oder gar zum Tod zu führen [54]. Die hohe Anzahl
von S. aureus Infektionen in der Chirurgie ist teilweise auf die hohe Rate der
Kolonisation von Haut- und Schleimhautoberfläche der Menschen innerhalb der
Bevölkerung
durch
das
Bakterium
zurückzuführen.
Ungefähr
50%
der
Bevölkerung sind intermittierende Träger der Mikrobe, in Nasenvorhof oder auf der
Haut und ca. 30 % der Menschen sind sogar prolongierte Träger des Bakteriums
in loco typico [17, 86]. Neuere Beweise machen deutlich, dass die präoperative
nasale Eradikation des Keimes mit Mupirocin eine effektive Maßnahme ist, um
postoperative Infektionen bei chirurgischen Patienten zu verhindern [118]. Darüber
hinaus verlassen sich Kliniker wegen der steigenden Anzahl von methicillinresistenten
Koagulase-negativen
Staphylokokken
immer
mehr
auf
das
Vancomycin, welches bei diesem resistenten Keim den letzten Ausweg für beides,
sowohl die chirurgische Prophylaxe als auch die Behandlung von Katheter
(intravaskulär) oder Biomaterial (alloplastisch, e. g. Brustimplantate) assoziierten
Infektionen darstellt [87]. Ein anderer Problemkeim ist der Vancomycin-resistente
Enterococcus. Die Rate von Infektionen mit diesen Bakterien hat sich nicht
verkleinert, dabei ist das Bakterium bei ein Viertel aller Infektionen, die es
verursacht, resistent gegenüber allen von der FDA zugelassenen Antibiotika,
einschließlich des Reservemittels Vancomycin [66]. Enterokokken verursachen
eine Vielzahl von sowohl mono- als auch polymikrobiellen Infektionen,
hauptsächlich bei immunkompromittierten Patienten. Das Spektrum dieser
6
Infektionen reicht dabei von Bakteriämie über Dekubitus bis hin zu diabetischen
Fußulzera. Erworben werden sie entweder endogen aus der patienteneigenen
intestinalen Flora oder exogen aus einer mit dem Keim kontaminierten Umgebung.
Enterokokken sind von Natur aus gegenüber vielen antimikrobiellen Substanzen
resistent und erwerben bereitwillig zusätzliche Resistenzen, diese Eigenschaften
haben sie zu prominenten nosokomialen Pathogenen werden lassen. Wegen
dieser Resistenzen war Vancomycin das praktisch einzige Medikament, auf das
man verlässlich bei der Bekämpfung von durch multi-resistente Enterokokken
verursachten Infektionen zurückgreifen konnte. Jedoch wurden auch hier 1987
erstmalig Resistenzen beobachtet, die sich dann in den folgenden 4-6 Jahren
sogar dramatisch ausgeweitet haben [78]. Die VRE (Vancomycin resistente
Enterokokken) besitzen in ihrem Erbgut fünf Gene, die für ihre High-Level
Resistenz notwendig und ausreichend sind [2, 114]. Zum einen kodieren diese
Gene Peptide der Zellwand und sind so für die Funktion der Zellwand essentiell,
zum anderen verschaffen sie bei Vancomycinmedikation eine entsprechenden
Überlebensvorteil und führen zur Selektion der Resistenz [2]. Da die Bedingungen,
die das Auftreten von Multi-Resistenzen bestärken, auch im neuen Jahrtausend
andauern, ist es von entscheidender Bedeutung flexible Strategien zur Detektion
und Antwort solcher Probleme schnellstmöglich zu entwickeln.
Tabelle 1: Resistenzraten der häufigsten Bakterien auf Intensivstationen
gegenüber gebräuchlichen Antibiotika von 2000 bis 5/2005 auf der Basis der
Daten von SARI (Surveillance der Antibiotika-Anwendung und der bakteriellen
Resistenzen auf Intensivstationen). Dargestellt wurden die Resistenzraten (RR)
und Resistenzdichte (RD) zwischen 2000 und Mai 2005. [76]
7
Das wichtigste Ziel der postoperativen chirurgischen Behandlung ist die früh
einsetzende Heilung ohne Komplikationen. Komplikationen wie postoperative
Wundinfektion, traumatische Wundinfektion, schwere Karbunkel oder das Erysipel
kommen dennoch im klinischen Alltag ständig vor, so ist auch die systemische
prä- und postoperative antimikrobielle Therapie ein integraler Bestandteil der
Therapie neben der chirurgischen Intervention. Die permanent hohe Rate multiresistenter Keime, wie es die Tabelle 1 (Resistenzrate = Anzahl resistenter Isolate
einer Spezies pro 100 Isolate dieser Spezies; Resistenzdichte = Anzahl resistenter
Erreger pro 1.000 Patiententage, wobei pro Patient nur einmal ein resistentes
Isolat gezählt werden darf) darstellt, seien es Staphylokokken (MRSA),
Pneumokokken, E. coli oder Enterokokken (VRE) lässt die Notwendigkeit nach
einer besseren Prävention der postoperativen Infektion erkennen. Im Zeitalter von
Resistenzen gilt es dabei drei entscheidende strategische Ziele zu verfolgen: das
Aufdecken der Resistenz, die Berichterstattung darüber und das Verhindern einer
weiteren Streuung oder Übertragung des Keimes auf andere Personen. Der
wichtigste und einfachste Schritt der Prävention ist dabei die Reinhaltung der
Umgebung des Patienten. Wenn multiresistente Keime schon zum Milieu des
Patienten gehören, dann muss ihre Streuung und Möglichkeit zur Ausbreitung in
diesem Milieu so gering wie möglich gehalten werden. Deshalb sind die Eckpfeiler
in der Minimierung der postoperativen Infektion das Händewaschen und die
Desinfektion der Haut durch das Personal. Denn das Risiko einer Übertragung von
Person
zu
Person
Personalhände
ist
Versorgungseinheiten,
von
multiresistenten
nirgends
auf
größer
denen
Pathogenen
als
man
in
über
überfüllten,
auch
noch
kontaminierte
unterbesetzten
schwerstkranke,
immuneingeschränkte Patienten vorfindet [115].
Neben den chirurgischen Wundinfektionen, sind es vor allem Infektionen über den
Blutweg, die ein ernstes Problem im klinischen Alltag darstellen. Katheter und
Gefäßprothesen sind für Bakterien ein willkommene Örtlichkeit zur Ansiedlung und
in der Folgezeit zur Aufrechterhaltung einer kontinuierlichen Infektion. So liegen
die Letalitätsraten für nosokomiale Blutweginfektionen für S. aureus bei 25%, für
Koagulase-negative Staphylokokken bei 21% und für Enterokokken bei 32% [27].
Obwohl der genaue Beitrag der Resistenz zu dem Ausmaß dieser Raten noch
unklar ist, suggerieren mehrere Studien, dass nosokomiale Infektionen über den
Blutweg die acht höchste Todesursache in den Vereinigten Staaten darstellen
8
[27]. Auch in Europa bedeutet der in den meisten Regionen stattfindende Anstieg
der Resistenzen (Abb. 2) eine Limitierung der Therapiemöglichkeiten. Der
Gebrauch von Antibiotika ist die zentrale Determinante bei der Entwicklung von
Resistenz. Das komplexe Beziehungsgeflecht zwischen Patient, Mikroorganismus
und dem Antibiotikum hat eine große Bedeutung für viele Ärzte. Die antimikrobielle
Therapie des schwer erkrankten Patienten beginnt nahezu immer in der
Unsicherheit über den verursachenden Keim und seiner Empfindlichkeit. So
besteht die sog. blinde empirische Initialtherapie oft aus einer hochdosierten, aufs
breite Erregerspektrum ausgerichteten Gabe eines oder mehrerer Antibiotika. In
dieser Situation kann eine vernünftige Auswahl von Antibiotika nur dann erwartet
werden, wenn der behandelnde Arzt über die in seiner Region vorherrschenden
Empfindlichkeitsmuster der für die Erkrankung relevanter Stämme Kenntnis
besitzt. Wie eminent dies ist, wird anhand von ein paar Zahlen deutlich: zu
irgendeinem gegebenen Zeitpunkt erhalten 25 bis 35 Prozent der hospitalisierten
Patienten eine systemische Antibiotikatherapie, um eine aktive Infektion zu
behandeln oder ihr Ausbrechen zu verhindern. In der Chirurgie beträgt der Anteil
der unangemessenen Behandlung dabei 40-75 %, wie aus den USA über die
letzten 15 Jahre berichtet wurde [42]. In den Vereinigten Staaten werden dabei 30
Verschreibungen auf 100 Personen pro Jahr geschrieben, so dass ein
Verschreibungsvolumen von 4,1 kg Antibiotika auf 100 Personen pro Jahr
resultiert [68]. Dieser enorme Verbrauch von Antibiotika birgt ein ebenso großes
Potential zur Selektierung oder Beschleunigung des Wachstums resistenter
Stämme. Bezogen auf oben erwähnte Zahlen sind vermutlich bis zur Hälfte dieser
Anwendungen unangemessen, so wie z. B. bei dem nutzlosen Behandlung von
viralen Infektionen des oberen Atemtraktes, der Bronchitis und der Pharyngitis.
Neben dem Antibiotikagebrauch selbst spielt die Compliance des Patienten eine
wichtige Rolle. Eine sporadische Compliance ihrerseits ruft gleichsam das
Äquivalent einer wiederholten Monotherapie hervor, mit dazwischenliegenden für
die Resistenzentstehung so entscheidenden Perioden ungehemmten bakteriellen
Wachstums. Um sich der Compliance des Patienten zu vergewissern, wurde viel
Anstrengung in die sog. DOT (directly observed therapy, Patient wird bei
Medikamenteinnahme beobachtet) gelegt, mit dem Ergebnis, dass die Inzidenz
von Resistenz assoziiertem Therapieversagen signifikant minimiert werden konnte
[62].
9
Abbildung 2: Resistenzentwicklung für S. aureus in Europa aus den Daten des
EARSS (European Antimicrobial Surveillence System) vom Jahr der Gründung
1999 bis zum Jahr 2006. Die Pfeile zeigen Anstieg bzw. Rückgang der
Resistenzraten.
10
1.1.4. Lösungsstrategien zur Minimierung der Resistenzentwicklung
Das letzte Jahrzehnt kam es zu einem rapiden Fortschritt auf dem Feld der
molekularen Biologie und ihrer Anwendung im Bereich der infektiösen Erkrankungen [28]. Im 21. Jahrhundert werden molekulare Werkzeuge wie bakterielles
Schnüffeln [43],
Nanobiotechnologie
[16] sowie
Hochdurchsatz-Gen- und
Proteinexpressionsanalyse (Genomics, Proteomics) nicht nur die frühe Diagnose
der Infektion, sondern auch die Erforschung von Angriffspunkten, Inhibition und
Manipulation der Pathogene erleichtern [65]. Einige dieser neuen antimikrobiellen
Strategien zielen in ihrem Design gegen Resistenz- und Virulenzmechanismen
und werden auf diesem Wege eine interessante Herausforderung für den
mikrobiellen Keim darstellen [19]. Angesichts der erodierten Effizienz der sogar
neuesten antimikrobiellen Stoffe haben sich Ärzte im zunehmenden Masse auf die
Fähigkeit der pharmazeutischen Industrie verlassen, auch immer neuere Agenzien
entwickeln zu können. Diese sieht sich ihrerseits einer Eskalation von Kosten
gegenüber, sei es für Entdeckung, Entwicklung, Testung oder Genehmigungsverfahren für Antibiotika konfrontiert, während die Risiken einer unerwarteten
Toxizität oder des schlichten klinischen Scheiterns einer neuen Substanz gleich
geblieben sind [9]. Im Angesicht der Probleme der gesteigerten bakteriellen
Resistenzen gegenüber konventionellen Antibiotika rückt das so genannte
angeborene Immunsystem immer stärker in den Blickpunkt der Forschung. Einen
bedeutenden Teil dieser angeborenen Abwehr stellen die Host Defense Peptide,
früher auch als Antimikrobielle Peptide (AP) bezeichnet, dar. Isoliert aus höheren
Eukaryoten, weisen sie ein weites Feld struktureller Unterschiede auf und eignen
sich gerade deshalb als neuartige Vorlagen für die Entwicklung pharmazeutischer
Komponenten. In diesem Bereich liegt die Aufgabe der Entdeckung von neuen
potentiellen Therapien gegen die aufkommende Multiresistenz vieler Keime.
1.2.
Das Angeborene Immunsystem
Warum gerade in den Regionen des Körpers, die sich in höchsten Masse mit
eindringenden Mikroorganismen auseinandersetzen müssen, eine derart niedrige
Inzidenz von Infektion und entzündlichen Komplikationen vorherrscht, ist darauf
zurückzuführen, dass gerade auf den Oberflächen ein lokaler, hoch effektiver und
auf
ein
breites
antimikrobielles
Spektrum
ausgerichteter
Verteidi11
gungsmechanismus existiert. Entdeckt wurden diese antimikrobiellen Eigenschaften der Epithelien im letzten Jahrhundert durch Metchnikoff. Er beobachtete,
wie Mikroben, die die natürliche Barriere übertreten hatten, von mobilen Zellen
(Phagozyten) gestellt, sowie anschließend regelrecht gefressen (phagozytiert) und
abgetötet wurden. Als er dies Phänomen der Phagozytose und des Abtötens der
Mikroben zum ersten Mal beschrieb, suggerierte er zugleich, dass in den
Phagozyten auch mikrozide Substanzen vorhanden sein müssen, mittels derer der
Tötungsvorgang stattfinde. Diese Substanzen nannte er damals „Fermente“
(spätere Enzyme) [112]. Diese Verteidigungslinie des Wirtsorganismus, die in den
frühen Phasen der Interaktion zwischen eindringenden Mikroorganismen und dem
Wirt tätig ist, beruht nicht auf einer spezifischen Antigen- Erkennung, im
Gegensatz zum so genannten adaptiven Immunsystem. Dieses System, welches
auf Erkennung und gezielter Vernichtung fremdartiger Epitope mittels gezielter
Antikörperherstellung beruht, kann im oben genannten Fall nicht schnell genug
reagieren, um den Organismus vor der einsetzenden Infektion zu bewahren. Die
klonale Expansion von B- und T-Lymphozyten nach einer erstmaligen oder
wiederholten Begegnung mit eindringenden Pathogenen benötigt Tage bis
Wochen, um die maximale Aktivität zu erreichen [32]. Das adaptive Immunsystem
(Antikörperbildung und Antigenerkennung mittels B- und T-Lymphozyten) ist eine
späte evolutionäre Entwicklung, zu finden vor allem in höher entwickelten
Vertebraten. Die spezifische Antigenerkennung durch Lymphozyten spielt natürlich
auch während der initialen Begegnung mit dem Pathogen eine Rolle, wird aber
erst beim Eindringen der Mikroorganismen in den Körper entscheidend, weil dann
von einer Persistenz der Keime ausgegangen wird, die eine langfristige Reaktion
erfordert. Im Gegensatz zu der Spezifität der erworbenen Immunantwort, ist die
angeborene
Immunantwort
unspezifisch
und
funktioniert
auch
ohne
Berücksichtigung des Antigencharakters der Mikrobe.
Die wirksamen Komponenten des Angeborenen Immunsystems unterscheiden
sich deswegen auch entscheidend von dem Erworbenen in derlei Hinsicht, als
dass sie relativ unspezifisch und schnell induzierbar sind. Ihr Wirkungseintritt
beträgt Minuten bis Stunden. Sie sind auf Ziele ausgerichtet, die konservierte
Muster der Erkennung darstellen, solche wie die Lipopolysaccharide (LPS), ein
natürlicher Wandbestandteil von gramnegativen Bakterien, oder die Lipo12
teichonsäure (LTA), Äquivalent der LPS bei grampositiven Bakterien. Die angeborene Antwort ist eine Wirtsleistung, die auf einem integrierten Multiorgansystem
beruht: im Laufe der Entwicklung vom Organismus gestaltet, nicht nur, um
mikrobielle Invasionen zu bekämpfen, sondern auch um Gewebeverletzung und
Zellzerstörung zu minimieren, Reparationsvorgänge zu fördern sowie die
Möglichkeit von sekundären oder opportunistischen Infektionen zu reduzieren [31].
Dieses System richtet sich auch gegen bereits eingedrungene Keime, und füllt so
die zeitliche Lücke bis zur Entwicklung einer adäquaten Antwort der erworbenen
Immunität. Neue Studien zeigen ferner, dass die angeborene Immunantwort nicht
nur die effektive erste Linie der Wirtsverteidigung gegen pathogene Keime bildet,
sondern auch durch Interaktionen die Funktionen des erworbenen Systems
definiert und beeinflusst [14, 31].
1.2.1. Host Defense Peptide
Im letzten Jahrzehnt erkannte man zunehmend die Bedeutung von Host Defense
Peptiden, auch Antimikrobielle Peptide bezeichnet, als die der ersten Verteidigungslinie des Angeborenen Immunsystems. Es existiert eine wachsende
Anzahl von Beweisen dafür, dass ihre Rolle in der Abwehr von Pathogenen
ebenso wichtig für den Wirtsorganismus ist wie Antikörper, Immunzellen und
Phagozyten. Das sich daraus ergebende Konzept ihrer Funktion besteht daraus,
dass die Peptide zur protektiven Wirkung der Barriere-Funktion von Epithelien
durch das Abtöten von eindringenden Mikroorganismen beitragen [34, 69, 89,
109].
Zellen verschiedener Spezies produzieren eine Vielzahl unterschiedlicher
antimikrobieller Substanzen, die sowohl als endogenen Antibiotika als auch als
desinfizierende Agenzien fungieren. Die Host Defense Peptide (HDP) als ein
Bestandteil des Angeborenen Immunsystems sind üblicherweise definiert als
Polypetidverbindungen, bestehend aus weniger als 100 Aminosäuren, mit
antimikrobiellen Eigenschaften, kodiert durch Gene und synthetisiert durch
Ribosomen. Diese Definition unterscheidet sie von den meisten (keinesfalls allen)
Peptidantibiotika der Bakterien und Pilze, die ihrerseits typischerweise auf
speziellen metabolischen Wegen hergestellt werden und oft auch exotische
Aminosäuren beinhalten [39]. Die meisten der HDP sind amphipathisch, kationisch
13
(sie tragen eine positive Nettoladung), und weisen eine definierte Alpha-Helix oder
Beta-Faltblatt-Struktur in membranähnlicher Umgebung (Abbildung 3, 4) auf.
Abbildung 3 (links): Protegrin gehört zu der Gruppe der Cathelicidine und
besteht aus 18 Aminosäuren. Die wesentliche Funktionsstruktur ist determiniert
durch eine beta-Faltblattstruktur, hier blau untermalt. [25]
Abbildung 4 (rechts): Ovispirin-1 auch ein Vertreter der Cathelicidine, ist im
Gegensatz zum Protegrin jedoch mit einer Alpha-Helix in der Sekundärstruktur
ausgestattet. [113]
Sie können in nahezu allen Lebensformen gefunden werden, von Pflanzen
ausgehend über Insekten bis hin zu Tieren, dabei Amphibien, Vögel, Fische und
letztlich auch Säugetiere wie Menschen einschließend [42, 43]. Mehr als 500
dieser Peptide sind bis dato entdeckt worden. In Tabelle 2 sind einige Beispiel von
kationischen Peptiden aus Säugern dargestellt.
Die Haut ist die epitheliale Hauptbarriere zwischen dem Organismus und der
feindlichen Umgebung. Sie übernimmt in dieser Funktion auch die Aufgaben eines
aktiven Abwehrorgans [12]. So ist es auch zu erklären, dass man Host Defense
Peptide als Teil des Angeborenen Immunsystems häufig auf Oberflächen wie Haut
und Schleimhaut findet. Epithelzellen aus gesundem Gewebe demonstrierten die
Expression von beta-Defensinen auf niedrigem Niveau.
Manche Defensine können aber auch durch Behandlung von pro-inflammatorischen Zytokinen, Bakterien oder ihren Abbauprodukten in ihrer Erzeugung
induziert werden. So wird zum Beispiel die Produktion von humanen betaDefensin-2 (HBD-2) in Keratinozyten deutlich heraufreguliert durch die Anwesenheit von gramnegativen Bakterien oder pro-inflammatorischen Zytokinen wie dem
Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) oder Interleukin-1-beta (IL-1-beta) [96].
Die Induzierbarkeit der Peptide in der Immunantwort resultiert in der Fähigkeit
dieser Barriere gegen ein breites Spektrum von pathogenen Keimen innerhalb von
14
Minuten in einer unspezifischen Art und Weise reagieren zu können. Die Kinetik
der Induktion ist dabei überaus vielsagend über die Rolle der frühen
Immunantwort gegen eine Infektion.
Tabelle 2: Zusammenfassung ausgewählter Host Defense Peptide
Peptid
Cathelicidin
Name/n
LL-37/
Ursprung
Mensch
Biochemischen
Hauptzellen und
Eigenschaften
Gewebsquellen
Kationisch, alpha-helikal
hCAP18
Textreferenz
Neutrophile, Mastzellen,
4-6, 36, 39,
Epithelien
44, 47, 52, 61,
63, 84, 90,
101, 106,108,
119
Cathelicidin
CRAMP
Maus
Amphipathisch, alpha-helikal
Cathelicidin
Protegrine
Schwein
Kationisch, Disulfidbrücken
Neutrophile,
9, 38, 110,
Knochenmark
119
Neutrophile
33, 39, 45, 49,
1-5
50, 52, 55, 57,
73, 98, 102,
108, 105, 119,
122-3
Cathelicidin
Ovispirin
Schaf
Kationisch, alpha-helikal
Neutrophile
3, 13, 93, 100,
107, 110, 119
Cathelicidin
Cathelicidin
CAP18
Dodeca-
Hase
Kationisch, alpha-helikal
Neutrophile, Mastzellen,
18, 39, 60,
Epithelien
119,
Kuh
Kationisch, alpha-helikal
Neutrophile
47, 119
Mensch
Kationisch, Disulfidbrücken,
Neutrophile, Epithelien
12, 40, 52, 63,
peptide
Alpha-
Alpha-
Defensine
Defensine
beta-Faltblatt
74, 96,
1-4
Beta-
Beta-
Defensine
Defensine
Mensch
Kationisch, Disulfidbrücken,
Neutrophile, Epithelien
beta-Faltblatt
52, 63, 74, 77,
96
1-4
ThetaDefensine
Plectasin
Pilz
Kationisch, Disulfidbrücken
Pilzbestandteil
8, 77, 79
Beta-Faltblatt
Schließlich werden die Peptide als antimikrobiell bezeichnet, weil sie ein
ungewöhnlich breites Spektrum der Aktivität besitzen. Sie veranschaulichen eine
beeindruckende Fähigkeit, nicht nur grampositive oder gramnegative Bakterien,
sondern auch Pilze [8], einschließlich Hefearten [29], Parasiten [71], Krebszellen
[52] und sogar behüllte Viren wie das HIV [21, 58] und das Herpes-simplex-Virus
[58] abzutöten oder zu neutralisieren. Zusätzlich weisen diese Eiweiße auch einige
antiendotoxische Eigenschaften auf [92], neben den Fähigkeiten immunmodulatorisch einzuwirken z. B. durch die Induktion von TNF-alpha [67].
Besonders wichtig neben den antimikrobiellen Fähigkeiten der Peptide erscheint
gerade für den späteren klinischen Einsatz ihre angiogenetische Potenz [51, 106].
15
In vivo Studien mit HDP zeigten fernen einen systemischen Schutz gegen
Streptococcus
pneumoniea
in
Mäusen
[41],
lokale
Protektion
gegen
polymikrobische orale Mukositis in Hamstern [72], sowie Schutz gegen
Pseudomonas aeruginosa von Verbrennungswunden in Mäusen und Ratten [105].
Gemeinsames Kennzeichen dieser in vivo Studien war die demonstrierte Effizienz
der unterschiedlichsten auch synthetischen HDP bei der Clearence von Bakterien,
die entweder systemisch oder topisch appliziert wurden.
In ihrer Eigenschaft als Peptide ist auch eine weitere Erweiterung der HDPTherapie möglich, nämlich die des Einsatzes in der Gentherapie. Anstelle diese
auf einen Langzeit-Gentransfektion auszurichten, wie zum Beispiel bei der
Korrektur vererbter genetisch bedingter Erkrankungen, wäre eine transiente
Übertragung der Gene zur verbesserten oberflächlichen Wundheilung absolut
ausreichend. Diese wurde zuletzt von Bals et al. demonstriert. Sie transfizierten
Mäuse mit einem adenoviralen Konstrukt, der das Genom eines menschlichen
Host Defense Peptides enthielt. Die Mäuse wiesen hohe Level transgener
Expression des Eiweißes in Serum und Lunge auf. Nach einer subletalen
bakteriellen Infektion zeigten die Tiere signifikant niedrigere Bakterienraten und
eine unterdrückte inflammatorische Antwort. Ebenso demonstrierten die Mäuse
eine deutliche Resistenz gegenüber Endotoxin [4]. Neben der Rolle der HDP in
der Abwehr von Infektionen sind es auch andere Eigenschaften die ausgewählten
kationischen Peptiden
opsonierender
zugeschrieben
Phagozytose
[94],
werden, wie
Chemoattraktion
Stimulation
von
von
non-
IL-8-stimulierten
Neutrophilen [1, 94] und Induktion von Wundheilung [18].
Unter den verschiedenen Klassen von Peptidantibiotika bei den Säugetieren
wurden einigen eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunität zugeschrieben.
Hierzu zählt man verschiedene Cystein-reiche Peptide wie die Defensine und
Protegrine [40, 64, 74] und die strukturell stärker abweichende Cathelicidine [110,
119, 120]. Hergestellt als Präcursoren, benötigen sie ein proteolytisches
Processing, um zur reifen, antimikrobiellen Funktion des Peptides zu gelangen.
Cathelicidine enthalten eine konservierte N-terminale Domain namens Cathelin
und eine strukturell davon unterschiedliche C-terminale Domain, die die
antimikrobielle Aktivität des Peptides trägt. Das CAP18 des Hasen war der erste
16
entdeckte Cathelicidin-Präkursor und sein reifes Peptid weist eine antimikrobielle
Aktivität mit breitem Spektrum [60] auf. In der Folgezeit sind Cathelicidine in vielen
anderen Species identifiziert worden, einschließlich des hCAP18/LL37 im
Menschen [1], CRAMP in Mäusen [38, 99] und dem SMAP29 in Schafen [3, 100].
Mögliche Einschränkungen in Bezug auf den therapeutischen Gebrauch natürlich
vorkommender Host Defense Peptide beim Menschen beinhalten ihre Zytotoxizität
und Faktoren, die sich auf Kosten bei einer groß kalibrierten Produktion beziehen.
Bemühungen, diese Hindernisse zu überwinden, führten zur Entwicklung eines
neuen alpha-helikalen Host Defense Peptides, Ovispirin-1, dessen Struktur sich
an den 18 N-terminalen Resten des Schafscathelicidins SMAP29 orientierte [13,
91, 117]. Bei erhaltener antimikrobieller Effektivität gegenüber gramnegativen und
-positiven Keimen zeigte das neue Eiweiß deutlich geringere Zytotoxizität.
Kleinere strukturelle Modifikationen von Ovispirin-1 führten dann zur Entstehung
von Novispirin G10 und seinen Derivaten. Dieses demonstrierte ähnliche
antimikrobielle Aktivität bei geringer Zytotoxizität und Hämolyse unter Einfluss von
humanem Blutserum sowie die in vivo vorhandene Fähigkeit Pseudomonas
aeruginosa auch in Verbrennungswunden abzutöten [107].
1.2.2. Cathelicidine
Das erste menschliche Cathelicidin, LL37/hCAP-18 wurde zunächst aus einer aus
dem menschlichen Knochenmark isolierten cDNA kloniert [1, 22, 61], bevor dann
seine Gene gemappt wurden [44, 45]. Die folgenden Studien machten deutlich,
dass LL-37/hCAP-18 primär in myeloiden Zellen exprimiert wird, wo es dann in
Granula verbleibt [101]. Die Ableitung seines Gens konnte aber auch im Hoden [1]
und entzündeter Haut [36] nachgewiesen werden. Bals et al. zeigten dann, dass
LL-37/hCAP-18 diffus auch in vielen anderen Epithelien menschlicher Organe
exprimiert wird, einschließlich des Oberflächenepithels der Atemwege sowie
serösen und mukösen Zellen der submukösen Drüsen des oberen Atemtraktes [6].
Dabei wird das Peptid mit der breiten antimikrobiellen Aktivität gegen grampositive
und –negative Organismen in den Oberflächenfilm der Atemwege sezerniert. Eine
weitere Studie der Forscher mit einem Xenograft Modell der Zystischen Fibrose
demonstrierte eindrucksvoll, wie die Expression und Sekretion dieses Peptides vor
bakterieller Kolonisation und Infektion schützt [5].
17
Die Protegrin (PG) Familie unter den Cathelicidinen besteht aus einer Reihe von
HDP (PG-1 bis PG-12), die zuerst in Schweinen identifiziert wurden [57, 122, 123].
Protegrine sind kleine (bis 2 kDa) HDP mit breitem Spektrum, die man in
Neutrophilen von Schweinen findet, wo sie als Cathilin-enthaltende Präkursoren
gelagert werden. Die reifen, also voll prozessierten, Protegrine enthalten dann 1618 Aminosäureresiduen, werden aber als inaktive Präkursoren freigegeben, die
dann extrazellulär durch die neutrophile Elastase aktiviert werden [98]. Wie die gut
charakterisierten Defensine, sind auch Protegrine in hohem Maße homolog und
teilen gemeinsame Merkmale wie kationische Struktur und Cystein-Reichtum. In
Lösung bilden sie eine amphipathische Beta-Faltblatt Struktur, die durch 2
Disulfidbrücken stabilisiert wird. Diese Brücken sind von eminenter Bedeutung für
die antimikrobielle Aktivität, weil sie das Peptid mindestens zehnmal so effektiv
machen wie in der linearisierten Form. Frühere Studien zeigten, dass PG-1 im
Gegensatz zu üblich gebräuchlichen Antibiotika sowohl gramnegative als auch positive Bakterien der log- und Plateau-Phase auf extrem schnelle Art und Weise
abtötet [102].
Der Mechanismus des Tötens ist dabei noch nicht vollständig untersucht. Bisher
vorliegende Studien sprechen dafür, dass durch die Peptide ein spannungsabhängiger Ionenkanal in der bakteriellen Wand geschaffen wird [49, 50, 73, 79].
Protegrine weisen nämlich eine hohe Affinität zu integralen Bestand-teilen der
Bakterienwand auf, solchen wie Lipopolysacchariden in gramnegativen oder
Lipoteichonsäuren in grampositiven. Wenn
eine Schwellenkonzentration des
Protegrins erreicht wird, werden die spannungsabhängigen Ionenkanäle geformt
und die Mikrobe rapide abgetötet [33, 49, 55, 103] (Abbildung 5). Bei niedrigeren
Konzentrationen
wird
dieser
Effekt
nicht
beobachtet,
und
die
Peptide
möglicherweise durch extrazelluläre Proteasen gespalten. PG-1 ist besonders
attraktiv für die klinische Anwendung, weil es, im Gegensatz zu menschlichen
Defensinen, eine breite antimikrobielle Aktivität auch bei physiologischer
Salzkonzentration und in Anwesenheit von Serum besitzt.
18
Abbildung 5: Abgebildet ist der Wirkmechanismus der Host Defense Peptide am
Beispiel des Protegrin (rot-blau). Normalerweise wasserlöslich (blau), vermag es
über seine aliphatische Seite, rot dargestellt, sich an die bakterielle Membran zu
lagern, um dann durch Interaktion mit benachbarten Peptiden eine Pore in der
Membran zu bilden. Diese Poren zerstören die Homöostase des Bakteriums und
führen zu seiner Lyse. [110]
Abbildung 6: Die Abbildung demonstriert am Beispiel des LL-37, einem alphahelikalem Cathelicidin, den amphipathischen Charakter der Peptide. Im elektrostatischen Oberflächenplot stellt die Blaufärbung den hydrophilen Anteil dar. In
dem Schema darunter die Darstellung der hydrophilen (dunkel) und hydrophoben
Anteile (hell) des Peptides, typisch im Übrigen als Strukturmerkmal vieler Peptide.
[113]
19
Letztere werden beide in Wunden und anderen Entzündungsorten gefunden, die
mit einer Störung der kapillären Funktion einhergehen. Steinstraesser et al. haben
dann dank dieser einzigartigen Eigenschaften des Peptides seine auch in vivo
herausragende Fähigkeit zur bakteriellen Clearance in Verbrennungswunden
bestätigen können [105].
1.3.
Aufgaben und Ziele der Studie
Vor diesem Hintergrund bestand die Motivation dieser Studien im Vergleich der
antimikrobiellen Fähigkeiten ausgewählter sowohl natürlicher (PG-1, LL-37/hCAP18, Plectasin) als auch synthetischer Peptide (Novispirin G10, RIR G10, R2 G10,
WS 22, WS 22 N). Das in porkinen Neutrophilen vorkommende Protegrin-1 als
Repräsentant der Protegrine ist relativ klein (18 Aminosäuren), weist eine betaFaltblattstruktur auf und besitzt breite antimikrobielle Aktivität [77]. LL-37/h-CAP
kommt als menschliches Cathlicidin u. a. auf Oberflächenepithelien des Atemtraktes vor, wo es Teil der angeborenen Barriere gegen eine mikrobielle Invasion
ist [5, 6]. Plectasin ist ein aus dem Pilz Pseudoplectania nigrella isoliertes
Defensin, welches vor allem im grampositiven Bereich deutliche Wirksamkeit
besitzt [79]. Die synthetischen Peptide Novispirin G10, RIR G10 und R2 G10 sind
Weiterentwicklungen
des
Ovispirins
(an
den
Stellen
5
bis
7
der
Aminosäuresequenz folgt bei Novispirin G10 ein zweifaches Isoleucin und Arginin
(RII); beim RIR G10 folgt dem Isoleucin ein Arginin; beim R 2 G10 ist das erste
Isoleucin durch Arginin ersetzt) und fürs Novispirin G10 konnte deutliche
Wirksamkeit
gegen
Pseudomonas
aeruginosa
bei
Verbrennungswunden
nachgewiesen werden [107]. WS 22 und WS 22 N sind synthetische Abkömmlinge
des LL-37. Sie bestehen nur aus 22 Aminosäuren, wobei bei beiden die
Aminosäure Nr. 8 der Sequenz von LL-37 (Lysin) durch Tryptophan ersetzt ist.
Beim WS 22 N findet man zusätzlich an der letzten Stelle anstatt des
ursprünglichen Glutamin ein Asparagin. Da die Peptide über so ein breites
Spektrum interessanter Fähigkeiten verfügen und um die Resultate der Tests
miteinander vergleichbar zu machen, entschieden wir uns bei der Überprüfung der
antimikrobiellen
Potenz
für
die
zehn
am
häufigsten
Wundinfektionen
20
verursachenden Keime sowie multi-resistente Isolate aus der Klinik. Unter den
Bakterienstämmen wurden bis auf das klinische Isolat eines MRSA sowie
multiresistente Pseudomonaden vornehmlich Qualitätskontrollstämme verwendet,
um eine Interassay-Reproduzierbarkeit im Hinblick auf die Austestung zu
gewährleisten.
Schließlich
wählten
wir
zum
einen
ein
derzeitiges
Standardverfahren für einen Vergleich der Peptide untereinander, nämlich das
Radial Diffusion Assay. Dieser Versuch dient der Bestimmung der minimalen
effektiven Konzentration (MEK) (in µg/ml) der Host Defense Peptide. Die
Ermittlung dieser erlaubt es, die Aktivität einzelner Peptide oder Peptidgruppen
miteinander zu vergleichen. Eine MEK unter 5 µg/ml wird dabei als klinisch
hochwirksam betrachtet [103]. Daneben wurde das CLSI Modified Microbroth
Dilution Assay durchgeführt. Der Versuch ist das Standardwerkzeug zur
Bestimmung der Aktivität einer antimikrobiellen Substanz, sei sie ein Antibiotikum,
die im Versuch als positive Kontrollen eingesetzt wurden, oder wie hier ein Host
Defense Peptid. Die Methode ist zur Bestimmung der MHK und MBK unter
Mikrobiologen weltweit anerkannt, im Gegensatz zum RDA, bei dem eine MEK
bestimmt wird, die noch nicht überall gleichermaßen als standardisierte Größe gilt.
So ist in der Durchführung beider Methoden die Absicht zu sehen, sowohl ein
Verfahren zu wählen, dessen Ergebnis standardisiert und mit den Resultaten
herkömmlicher antimikrobieller Substanzen stets verglichen werden kann, als
auch ein Verfahren das im besonderen Maße auf die Host Defense Peptide
modelliert wurde. CLSI Microbroth Dilution Assay for Fungi diente der
standardisierten Bestimmung einer MHK bei Pilzen. Im eigentlichen Sinne ist er
eine Abwandlung des oben beschriebenen Modified CLSI Microbroth Dilution
Assay, auf mykotische Kulturen. Verbunden sind die Veränderung mit einer
Anpassung an die Unterschiede der Pilze im Wachstum und Ernährung. Im
Vergleich zu Bakterien äußert sich dies im Wahl anderer Medien und anderen
Kultivierungsbedingungen (Temperatur, Brutzeit).
21
2.
Material und Methoden
2.1.
Radial Diffusion Assay (RDA)
2.1.1 Chemikalien
Monobasischer Natriumphosphatpuffer NaH2PO4 * 2 H2O (J.T.Baker, Deventer,
Niederlande), Dibasischer Natriumphosphatpuffer Na2HPO4 * 7 H2O (J.T.Baker,
Deventer, Niederlande), Agarose (Agarose NEEO Ultra- Qualität, Carl Roth
GmbH,
Karlsruhe,
Deutschland), Essigsäure (0,01%; J.T.Baker,
Deventer,
Niederlande), Deionisiertes Wasser. 100 mM monobasischen Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 4,5 erhielt man aus der Lösung 15,6 g monobasischen
Puffers in 1 L destillierten und deionisierten Wasser. 100 mM dibasischen
Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 9,5 erhielt man aus der Lösung 26,8 g
dibasischen Puffers in 1 L destillierten und deionisierten Wasser. Aus 725 ml des
100 mM dibasischen Puffers und 400 ml des monobasischen Puffers wurden
1,125 L Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4 gemischt. Dieser wurde im
Folgenenden verwendet.
2.1.2. Antibiotika
Ampicillin (Ampicillin K029.1, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland),
Vancomycin (Vial Vancomycin Hydrochlorid, Lilly, Eli Lilly and Co, Indianapolis,
USA), Imipenem (Imipenem Powder No. 3540, Merck & Co Inc., West Point, PA,
USA), Cefotaxim (Cefotaxim+Na, Aventis Pharma GmbH, Deutschland). Die
Antibiotika werden gemäß Gebrauchsanleitung in Lösung gebracht. Dabei werden
folgende Konzentrationen aus Stammlösungen frisch am Versuchstag angefertigt,
die im Versuch als Positiv- oder Negativkontrolle Verwendung finden: Ampicillin 2
mg/ml; Vancomycin 6 mg/ml; Imipenem 2 mg/ml; Cefotaxim 6 mg/ml.
2.1.3. Host Defense Peptide:
Novispirin G10 (Novozymes, Bagsvaerd, Dänemark), R2 G10 a (Novozymes,
Bagsvaerd, Dänemark), RIR G10 a (Novozymes, Bagsvaerd, Dänemark), LL-37
(Novozymes, Bagsvaerd, Dänemark), LL-37 (Novozymes, Bagsvaerd, Dänemark),
WS 22 (Novozymes, Bagsvaerd, Dänemark), WS 22 N (Novozymes, Bagsvaerd,
Dänemark), Plectasin (Novozymes, Bagsvaerd, Dänemark), Protegrin-1 (Bob
22
Lehrer, UCLA,
USA).
Alle
von
Novozymes
gelieferten
Peptide
wurden
rekombinant in E. coli BL21 (DE3) hergestellt. Nach Extrahierung aus den
Zellüberständen der Bakterien erfolgte die Purifikation mit Hilfe der Umkehrphasen
– HPLC (high performance liquid chromotography). Die erreichte Homogenität
betrug 98 %. Deutschland. Das von Bob Lehrer bereitgestellte Protegrin-1 wurde
mittels Festphasensynthese hergestellt und ebenfalls mittels Umkehrphasen –
HPLC gereinigt (Purifikationsgrad >98%). Die Peptide werden alle zunächst in 1
mg/ml Aliqouts in 0,01% Essigsäure gelöst und bei -80°C gelagert. Jeweils frisch
am Versuchstag werden folgende Konzentrationen, angesetzt: 250 µg/ml, 79,1
µg/ml, 25 µg/ml, 7,91 µg/ml, 2,5 µg/ml, 0,79 µg/ml und 0,25 µg/ml.
2.1.4. Bakterien und Pilze
Bakterien: E. coli (DSMZ 1103, ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (DSMZ
1117, ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (DSMZ 30008, ATCC 19606),
Klebsiella pneumoniae (DSMZ 681, ATCC 10031), Proteus mirabilis (DSMZ 4479,
ATCC 29906), Staphylococcus. epidermidis (DSMZ 1798, ATCC 12228),
Enterococcus faecalis (DSMZ 2570, ATCC 29212), Staphylococcus aureus
(DSMZ 1104, ATCC 25923), C-MRSA (klinisches Isolat, Prof. Sören Gatermann,
Institut
der Mikrobiologie,
Ruhr - Universität,
Bochum, Deutschland),
Pseudomonas aeruginosa VA 53383 (klinisches Isolat, Universitätsklinik
Plastischen
Chirurgie,
BG
Kliniken, Bergmannsheil,
der
Ruhr - Universität,
Bochum, Deutschland), Pseudomonas aeruginosa VA 53476 (klinisches Isolat,
Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken, Bergmannsheil, Ruhr
– Universität,
Bochum, Deutschland), Pseudomonas aeruginosa VA 52519
(klinisches Isolat, Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken,
Bergmannsheil, Ruhr – Universität, Bochum, Deutschland). Bei den Stämmen,
die DSMZ gelistet sind, handelt es sich um Qualitätskontrollstämme, die in der
Antibiotikatestung üblich verwendet werden.
Pilze: Candida albicans (klinisches Isolat , Prof. Sören Gatermann, Institut der
Mikrobiologie,
Ruhr - Universität,
Bochum, Deutschland), Candida albicans
(DSMZ 11948, ATCC 24433), Candida albicans (DSMZ 11225, ATCC 90028),
Candida parapsilosis (DSMZ 5784, ATCC 22019), Issatchenkia orientalis
23
(Saccharomyces krusei; DSMZ 6128, ATCC 6258). Leztgenannter Stamm ist ein
Qualitätskontrollstamm für die Austestung von Antimykotika.
2.1.5 Gebrauchsmaterialien
Quadratische Petrischalen (10x10 cm; Greiner-Bio-One, Kremsmünster, Österreich); Petrischalen (rund; 8,5 cm Durchmesser; Greiner-Bio-One,
Krems-
münster, Österreich), Pipetten (Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland), Sterile
Pipettenspitzen (Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland), Konisch zulaufende
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml; Greiner, Kremsmünster,
Österreich), Sterile
Impfösen (Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland), Zentrifugenröhrchen (15 ml;
Greiner, Kremsmünster,
Österreich), Serologische Pipetten (50 ml; Greiner,
Kremsmünster, Österreich), Falcon-Röhrchen (50 ml; Greiner Kremsmünster,
Österreich), 5 ml Reagenzgläser.
2.1.6. Geräte
Spektrophotometer (UV – V – IS - Spektrometer, Perkin Elmer 555, Boston,
Massachusetts,
USA), Nivelliertisch (Greiner, Kremsmünster,
Österreich),
Gelstanze (3 mm Durchmesser; 9 mm Durchmesser, Universitätsklinik
Plastischen
Chirurgie,
BG
Kliniken, Bergmannsheil,
Bochum, Deutschland), Schüttelwasserbad (B.
Melsungen,
Ruhr - Universität,
Braun
Deutschland), Dampfwasserbad (B.
der
Braun
Melsungen
AG,
Melsungen
AG,
Melsungen, Deutschland), Inkubator (37°C; Heraeus, Heraeus Holding GmbH,
Hanau,
Deutschland), Millimeterlineal (Aristo, Rotring GmbH, Hamburg,
Deutschland),
Vortex-Schüttler
(IKA,
Staufen,
Deutschland),
Schablone
(Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken, Bergmannsheil, Ruhr
- Universität, Bochum, Deutschland), Erlmeyer-Kolben (20 ml, 50 ml, 100 ml, 125
ml, 500 ml, 1000 ml, Greiner, Kremsmünster, Österreich), Zentrifuge (Hereaus
Megafuge 3.0 R, Hereaus International GmbH, Hanau,
Magnetrührer
(IKA,
Staufen,
Deutschland),
Autoklav
(H+P
Deutschland)),
Labortechnik,
Oberschleißheim, Deutschland)
2.1.7. Medien und Platten
Trypticase Soy Broth (TSB; Soja-Bouillon; Difco, Detroit, Michigan, USA)
24
Underlay-Agar: 50 ml des 100 mM Natriumphosphatpuffers werden 5 ml SojaBouillon (Difco, Detroit, Michigan, USA) und 5 g Agarose in einem 1 L
Erlenmeyerkolben zugesetzt, anschließend bis 500 ml mit deionisiertem Wasser
aufgefüllt. Der pH-Wert wird auf 7,4 gehalten, falls nötig. Die Suspension wird in
einem Dampfwasserbad zur Lösung gebracht und in 100 ml Erlenmeyerkolben zu
50 ml Portionen aliquotiert. Diese werden bei 121°C für 20 min autoklaviert und bis
zum Gebrauch bei 4°C gelagert. Vor Gebrauch ist der Agar in einem
Dampfwasserbad erneut zur Lösung zu bringen.
Overlay-Agar: Dieser Agar enthält 60 g TSB Pulvermedium und 10 g Agarose pro
1 L deionisiertes Wasser. Die Suspension wird analog zum Underlay-Agar im
Dampfwasserbad zu Lösung gebracht, anschließend in Reagenzgläsern zu 7,5 ml
Portionen aliquotiert. Nach Autoklavierung bei 121°C für 20 min erfolgt Lagerung
bei 4°C. Vor Gebrauch ist der Agar im Dampfwasserbad in Lösung zu bringen.
2.1.8. Computerprogramme
StatView 5.0 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA)
Microsoft Excel XP (Microsoft Corporation, USA)
2.1.9. Anzucht von Bakterien
Eine einzelne Kolonie wird mit einer Impföse aufgenommen, in ein Reagenzglas
mit 3-5 ml Soja-Bouillon transferiert und bei 37°C in einem Schüttelwasserbad für
18-24 h inkubiert. Ein Aliquot (500 µl) der resultierenden stationären Phase der
Kultur wird in 50 ml frischen Soja-Bouillons eingebracht und für 2,5 h bei 37°C und
200 rpm inkubiert.
2.1.10. Versuchsdurchführung
Die gezüchtete Subkultur wird in ein 50 ml Falconröhrchen transferiert und für 10
min bei 4°C und 880 g / 4000 U zentrifugiert. Das so entstehende bakterielle (o.
fungale) Pellet wird einmalig mit 10 ml des kalten 10 mM Natriumphosphatpuffers
gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren wird es in 5 ml desselben Puffers
gelöst. Nun erfolgt die Messung der optischen Dichte (OD) der Probe. 1 ml wird in
eine Messküvette eingebracht und die OD bei 620 nm unter Abgleich mit 1 ml des
25
Puffers
gemessen.
Die
Konzentration
der
Bakterien
(CFU/ml)
in
den
verbleibenden 4 ml wird aus folgender Formel ermittelt:
CFU/ml = OD620nm x 2,5 x 108
Für Pilze: CFU/ml = OD620nm x 0,5 x 108
Nun kann das Volumen der gewaschenen Bakteriensuspension berechnet
werden, welches 2 x 107 CFU enthält (das Inoculum für 50 ml Underlay-Agar):
(2 x 107 CFU)
(CFU/ml) = gesuchtes Volumen
Dieses Volumen der Bakterien wird in 50 ml geschmolzenen, im Wasserbad bei
ca. 45-50°C gehaltenen Underlay-Agar eingebracht und sorgfältig gemischt. Nun
wird ein 15 ml Aliquot in ein 50 ml Falconröhrchen transferiert, auf dem
vorgewärmten Nivelliertisch auf die quadratische Petrischale (10x10 cm; Greiner),
die vorher mittels der Schablone entsprechend eingeteilt wurde, gegeben und dort
gleichmäßig verteilt. Nachdem sich der Agar in der Petrischale ein wenig gesetzt
hat und transportfähig ist, wird er für 30 min bei 4°C gelagert, wo er sich endgültig
verfestigt. Nun werden mittels der Metallstanze, die zur Sterilisation abgeflammt
wird, Zylinder (3 mm im Durchmesser) in den Agar gestanzt. Es entstehen 9
Zylinder in einer 3 x 3 Anordnung. Die verschiedenen Proben werden nun in 5 µl
Aliqouts, wie folgt, in die Zylinder eingebracht (Abb. 7): zu testendes
Antimikrobielles
Peptid:
7
Konzentrationen
in
die
Probenfelder
1-7;
Positivkontrolle: Antibiotikum Probefeld 8; Negativkontrolle: 0,01% Essigsäure in
Probefeld 9. Nach dem Einfüllen werden die Platten zugedeckt und für 3 h bei
37°C inkubiert. Dabei wird jedes Peptid pro Mikroorganismus im Triplett, also
dreifach untersucht. Bei dieser Zwischeninkubation kann die Testsubstanz in den
Agar diffundieren.
Nach 3 Stunden wird jeder Underlay-Agar mit 15 ml geschmolzenem Overlay-Agar
begossen. Dieser beinhaltet die für das Bakterien/Pilzwachstum erforderlichen
Nährstoffe in ausreichender Menge. Sobald sich der Agar verfestigt hat, wird er
zugedeckt umgedreht und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wird
der Durchmesser der entstandenen Hemmzonen mit einem Millimeterlineal
gemessen (auf 0,1 mm genau). Es werden drei Wiederholungen von jedem Peptid
26
(Platte) durchgeführt. Zur Ermittlung der MEK wird von dem Durchmesser der
Hemmzone der Durchmesser des Loches (3 mm) subtrahiert und diese Differenz
über eine Multiplikation mit dem Faktor 10 in so genannte Units überführt (10 U =
1 mm). Diese Units werden bezogen auf die jeweilige Konzentration in StatView
eingegeben. Es wird eine logarithmische Regressionsanalyse durchgeführt, mit
der Konzentration als unabhängiger und den Units als abhängiger Variable. Es
wird nur ein Nullwert mit in die Analyse aufgenommen. Die Regressionsanalyse
liefert eine Gleichung zur Beschreibung der Wachstumskurve dieser Art. Da die
minimale effektive Konzentration äquivalent mit dem X-Achsenschnittpunkt der
Kurve ist, kann die Gleichung zur Bestimmung der MEK mit Y=0 (da XAchsenschnittpunkt) nach X aufgelöst werden und die MEK so ermittelt werden.
Abbildung 7: Beispiel für RDA-Testplatte: Zylinder 1-7 Konzentrationen des Host
Defense Peptides, Zylinder S Negativkontrolle 0,01% Essigsäure, Zylinder A
Positivkontrolle Antibiotikum
Der Versuch dient der Bestimmung der minimalen effektiven Konzentration (MEK)
(in µg/ml) Host Defense Peptide. Die Ermittlung dieser erlaubt es, die Aktivität
27
einzelner Peptide oder Peptidgruppen miteinander zu vergleichen. Eine MEK unter
5 µg/ml wird dabei als klinisch hochwirksam betrachtet.
2.2.
Modified CLSI Microbroth Dilution Assay (MDA)
In der folgenden Auflistung fanden nur zusätzliche oder vom RDA abweichende
Gebrauchsmedien oder Methoden Erwähnung.
2.2.1. Chemikalien
1% Humanes Serum-Albumin (HSA Fraktion V, SERVA Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, Deutschland)
2.2.2. Host Defense Peptide
Es wurden die gleichen Peptide verwendet wie beim Radial Diffusion Assay. Hier
werden Stammlösungen von 1 mg/ml in 0,01% Essigsäure einzelner Peptide
angefertigt. Diese werden dann zu 100 µl Proben aliquotiert und bei -80°C bis zum
Versuchstag gelagert.
2.2.3. Gebrauchsmaterialien
Neben den im RDA erwähnten Geräten fanden hier zusätzlich Verwendung 96Loch Gewebskulturplatten (U-Form; Greiner, Kremsmünster, Österreich), MultiKanal Pipette (10-100 µl, BRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Deutschland).
2.2.4. Medien und Platten
Müller-Hinton-Bouillon (MHB; Merck GmbH, Hohenbrunn, Deutschland)
2.2.5. Anzucht von Bakterien
Eine einzelne Kolonie wird in 3-5 ml Müller-Hinton-Bouillon (MHB) in einem
Reagenzglas transferiert. Dieses wird bei 37°C über Nacht inkubiert. Diese Kultur
wird am nächsten Morgen 1:20 verdünnt, und zwar 50 µl Kultur zu 950 µl MHB in
einer Messküvette zur Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm. Um die
für den Versuch erforderliche Volumen mit einer Konzentration von 4 x 105 CFU/ml
zu bestimmen, ist ein Bakterienabhängiger Umrechnungsfaktor (siehe Tabelle 3)
notwendig. Dabei wird wie folgt gerechnet:
28
Volumen mit definierter CFU/ml = OD600 x (n x CFU/ml)
0,2
Tabelle 3: Beziehung zwischen CFU und Absorbenz [103]
Bakterium
E. coli, K. pneumoniae, Proteus mirabilis
P. aeruginosa, A. baumannii
MRSA, S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis
(n CFUs/ml)
0,2 A 600 nm
8 x 107
7,8 x 107
2 x 107
Im Folgenden wird ein Verdünnungsfaktor berechnet, anhand dessen die
Bakteriensuspension soweit mit MHB verdünnt wird, bis sie die erforderlichen 4 *
105 CFU/ml enthält. Berücksichtigt werden muss, dass man pro Platte ca. 8 ml
Suspension braucht.
2.2.6. Versuchsdurchführung
Zunächst werden 100 µl Peptiddiluent in die Löcher A2 bis A12 einer 96Lochzylinder Gewebskulturplatten (U-Form; Greiner, Solingen, Deutschland)
eingefüllt, dann 200 µl der Peptid- oder Antibiotika-Lösung in Loch A1. Nun
transferiert man 100 µl aus A1 in das Loch A2, mischt gut, indem man die
Flüssigkeit mit der Pipette auf- und abzieht, und transferiert 100 µl in A3, mischt
erneut usw. Das ganze Prozedere führt man bis A11 fort, die 100 µl, die hier
entnommen werden, werden verworfen. So dient A12 als Negativkontrolle, weil er
nur den Peptiddiluenten beinhaltet und keine aktive Substanz. Mit einer MultiKanal-Pipette werden nun jeweils 100 µl Bakteriensuspension in jedes Loch der
Reihe B-D eingebracht. Ein anderes Bakterium wird in die Löcher der Reihen F-H
gefüllt. Nun werden mit der Multi-Kanal-Pipette 11 µl aus den Löchern der
obersten Reihe mit der Peptid/Antibiotika-Lösung in das jeweils korrespondierende
Loch der Bakteriensuspension enthaltenden Reihen eingebracht (A1 in B1, A2 in
B2 etc. auch A1 in C1 etc. und A1 in D1 etc.). Die Gewebskulturplatten werden
nach Ende dieser Prozedur zugedeckt und über Nacht bei 37° inkubiert. Am
nächsten Morgen wird dann die minimale Hemmkonzentration (MHK) abgelesen.
Es ist das letzte Loch, das eine klare Flüssigkeit enthält, (von 1 nach 12 lesend), in
dem also kein bakterielles Wachstum (= keine Trübung) sichtbar ist. Die
29
Konzentration, die hier ausschlaggebend ist,
wird von jeder der drei Reihen
abgelesen. Zur Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK)
werden 10 µl aus den Löchern mit der MHK, der zweifachen, vierfachen und
achtfachen MHK entnommen und in die mit 200 µl Soja-Bouillon gefüllten,
korrespondierenden Löcher einer neuen Gewebsplatte transferiert, anschließend
wird die Platte zugedeckt und erneut über Nacht bei 37°C inkubiert. Das letzte
Loch, das eine klare Flüssigkeit enthält, (von 1-12 lesend) zeigt die Konzentration
der MBK an. Sowohl die MHK als auch MBK werden dreifach bestimmt sowie
unter Verwendung des Student´s T-Tests mittels StatView ausgewertet.
Der Versuch ist das Standardwerkzeug zur Bestimmung der Aktivität einer
antimikrobiellen Substanz, sei sie ein Antibiotikum, die im Versuch als positive
Kontrollen eingesetzt wurden, oder wie hier ein Host Defense Peptid. Die Methode
ist zur Bestimmung der MHK und MBK weltweit anerkannt, im Gegensatz zum
RDA, bei dem eine MEK bestimmt wird, die noch nicht überall gleichermaßen als
standardisierte Größe gilt. So ist in der Durchführung beider Methoden die Absicht
zu sehen, sowohl ein Verfahren zu wählen, dessen Ergebnis standardisiert und
mit den Resultaten herkömmlicher antimikrobieller Substanzen stets verglichen
werden kann, als auch ein Verfahren, das im besonderen Maße auf die Host
Defense Peptide modelliert wurde.
2.3.
CLSI Microbroth Dilution Assay für Pilze
In der folgenden Auflistung fanden nur zusätzliche oder vom RDA oder MDA
abweichende Gebrauchsmedien oder Methoden Erwähnung.
2.3.1. Chemikalien
Destilliertes Wasser; BaCl2 (0,048mol/L; 1,175% Gewicht/Volumen BaCl2 * 2 H2O;
J.T.Baker,
Deventer,
Niederlande); H2SO4 (0,36 N; 1% Volumen/Volumen;
J.T.Baker, Deventer, Niederlande)
2.3.2. Antimykotika
Antimykotika: Clotrimazol mikrofein® (Caelo, Caesar&Lorentz GmbH, Hilden,
Deutschland), Amphotericin B (Bristol-Myers, Squibb GmbH, Regensburg,
Deutschland). Stammlösung des Clotrimazol wird angefertigt, indem 25 mg in 5 ml
30
Ethanol (J.T.Baker, Deventer, Niederlande) zu einer Konzentration von 5 mg/ml
aufgelöst werden. Diese wird aliqoutiert und bei -80°C gelagert.
2.3.3. Medien
10,4 g des pulverförmige RPMI-1640-Mediums (Sigma-Aldrich Co., St. Louis,
USA) werden in 900 ml destillierten Wassers aufgelöst. 34,53 g MOPS Puffer
(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) werden hinzugefügt und verrührt, so dass
eine finale Konzentration von 0,165 mol/L erreicht wird. Der pH-Wert wird auf 7,0
mit 1 M NaOH (J.T.Baker, Deventer, Niederlande) berichtigt. Destilliertes Wasser
wird so zugefügt, dass das Volumen abschließend 1 L beträgt, dann steril filtriert
und bei 4°C gelagert.
2.3.4. Puffer und Lösungen
McFarland 0,5 Bariumsulfat Mischung Standard wird benutzt, um die Dichte des
Inokulums zu standardisieren. 0,5 ml von 0,048 mol/L BaCl 2 (1,175%
Gewicht/Volumen BaCl2*2H2O) werden zu 99,5 ml einer 0,18 mol/L (0,36 N)
H2SO4
(1%
Volumen/Volumen)
hinzugefügt.
Die
korrekte
Dichte
des
Mischungsstandards wird am Spektrophotometer überprüft. Mit einem Gerät, das
einen 1 cm Lichtpfad besitzt und bei Gebrauch einer geeigneten Küvette, sollte die
Auslöschung bei 625 nm zwischen 0,08 und 0,10 liegen, um die richtige Trübung
des 0,5 McFarland Standards zu kennzeichnen. Diese Standard-Mischung wird
anschließend in verschraubbare Falconröhrchen aliquotiert zu Portionen à 4-6 ml
und bei Raumtemperatur im Dunklen gelagert. Vor dem Gebrauch wird der
Standard auf einem Vortex Gerät geschüttelt. Die Trübung wird 3 Monate nach
Herstellung überprüft.
2.3.5. Anzucht von Pilzen
Das Inokulum besteht aus einigen Kolonien, die größer als 1 mm sind und von 24
h alten Kulturen der oben erwähnten Candida Spezies stammen. Die Kolonien
werden in 3 ml sterilem, 0,145 mol/L Salzwasser (8,5 g NaCl in 915 ml H2O;
0,85% NaCl-Lösung) suspendiert. Die resultierende Suspension wird für 15 sec
auf einem Vortex geschüttelt und anschließend die Dichte auf einen 0,5
McFarland Standard abgeglichen und nötigenfalls durch Lösung weiterer Kolonien
31
korrigiert. Weiterhin wird zunächst 1:50, und dann 1:20 mit Salzwasser verdünnt,
um das erforderliche zweifache Test-Inokulum zu erhalten.
2.3.6. CLSI Microbroth Dilution Assay für Pilze
Es wird zunächst über Verdünnung der Antimykotikastammlösung die für den
Versuch erforderlichen Antimykotikalösungen hergestellt. Hierzu werden 25,6 µl
der Stammlösung in 974,4 µl RPMI-1640 Medium gegeben. So wird eine
Konzentration von 128 µg/ml erreicht, die dann über eine Verdünnung durch einen
gleichvolumigen Anteil an Pilz-Inokulum auf 64 µg/ml dilutiert wird. Entsprechend
stellt man fürs Host Defense Peptide eine Startkonzentration von 128 µg/ml her.
Die 96-Loch-Gewebskulturplatte (U-Form; Greiner, Solingen, Deutschland) wird
nun bei B1, C1 und D1 mit entweder 100 µl der Antimykotikalösung (128 µg/ml)
oder der Peptidlösung (128 µg/ml) befüllt. 50 µl des RPMI-1640 Mediums werden
in die Löcher 2-12 der Reihen B-D eingefüllt. 50 µl werden aus B1 entnommen
und in B2 transferiert. Es wird viermal gemischt und wieder 50 µl von B2 in B3
transferiert, erneut viermal gemischt und erneut transferiert etc. Die 50 µl aus Loch
11 werden verworfen, weil die letzte Probe als Negativkontrolle dient.
Entsprechend wird in Reihe C und D verfahren. Die Löcher 1-12 der Reihen B-D
werden nun mit 50 µl des Pilz-Inokulums befüllt, so dass das endgültige Volumen
in jeder Probe 100 µl beträgt. Die Platten werden zugedeckt und bei 35°C für 48 h
inkubiert. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) der Azol-Gruppe der
Antimykotika ist definiert als die niedrigste Konzentration, bei der eine deutliche
Abnahme der Trübung (Stufe 2) beobachtet wird. Entsprechendes Kriterium wird
auch bei den Peptiden in der Auswertung zugrunde gelegt. Hier wird die Platte
dreifach wiederholt. Dieser Versuch dient der standardisierten Bestimmung einer
MHK bei Pilzen. Im eigentlichen Sinne ist er eine Abwandlung des oben
beschriebenen Modified CLSI Microbroth Dilution Assay, der allerdings in erster
Linie auf Bakterien modelliert ist, für Pilzkulturen.
32
3.
Ergebnisse
3.1.
Radial Diffusion Assay
Dieser Versuch diente der Bestimmung der minimalen effektiven Konzentration
(MEK) (in µg/ml) der Host Defense Peptide. Die Ermittlung dieser erlaubte es, die
Aktivität einzelner Peptide oder Peptidgruppen miteinander zu vergleichen. Eine
MEK unter 5 µg/ml wurde dabei als klinisch hochwirksam betrachtet [11]. Er wurde
benutzt, um die antibiotische und antimykotische Aktivität der Host Defense
Peptide, und zwar sowohl der natürlichen als auch ihrer synthetischen
Veränderungen, gegen die Mikroorganismen, die für die meisten Infektionen
menschlicher
Verbrennungswunden
verantwortlich
sind,
miteinander
zu
vergleichen. Hierbei fanden folgende Bakterien Verwendung: als gramnegative, P.
aeruginosa, E.
mirabilis und
coli, K.
drei
pneumoniae,
klinische
Isolate
Acinetobacter
baumannii,
(P. aeruginosa)
Proteus
aus menschlichen
Verbrennungs-wunden, als grampositive, S. aureus, Enterococcus faecalis, S.
epidermidis sowie der multiresistente C-MRSA. Die ATCC bzw. DSMZ gelisteten
Bakterienstämme wurden speziell ausgesucht, denn es handelte sich dabei um
vornehmlich bei Qualitätskontrollen der Antibiotikatestung verwendete Keime. Bei
der Überprüfung der antimykotischen Aktivität gebrauchte man folgenden Pilz:
Candida
albicans.
Insgesamt
wurden
dabei
folgende
Peptide
in
ihrer
antimikrobiellen Aktivität verglichen, zum einen natürliche wie das Protegrin und
das LL-37, zum anderen synthetische Peptide, wie Plectasin oder Novispirin G10,
wie auch dessen Weiterentwicklungen RIR G10, R2 G10, oder auf Veränderungen
des LL-37 basierende synthetische Peptide wie WS 22 N, WS 22.
3.1.1. Grampositive Bakterien
Gegen die wichtigsten grampositiven Bakterienstämme (Tab. 4), die zu
Wundinfektionen bei Brandverletzten führen, nämlich S. aureus, S. epidermidis
und Enterococcus feacalis sowie den C-MRSA zeigte das synthetische Novispirin
G10 die beste antimikrobielle Aktivität. Die MEK (minimale effektive Konzentration,
in µg/ml) lag für alle erwähnten Stämme unter 1 µg/ml. Die MEK der synthetischen
Modifikation des G10, R 2 G10, waren höher als die des G10, jedoch niedriger als
die der weiteren Modifikation, nämlich des RIR G10. Dessen MEK lagen um 5
33
µg/ml für alle Keime. Im Vergleich der beiden natürlichen Peptide, LL-37 und
Protegrin-1 waren die MEK des LL-37 höher als die des Protegrin-1 für alle
getesteten Stämme. Auch die MEK der beiden synthetischen Modifikationen von
LL-37, WS 22 N und WS 22, waren bei Testung aller Bakterien niedriger als die
des natürlichen Stammpeptides. Das synthetische Peptid Plectasin wies
signifikant niedrigere MEK-Werte als LL-37, jedoch signifikant höhere als die
Modifikation WS 22 N.
Tabelle 4: Im RDA demonstriert Novispirin G10 beste antimikrobielle Aktivität
gegen grampositive Bakterien. (+ p<0,05 G10 vs. Rest)
MEK in µg/ml
Novispirin G10
C-MRSA
+
0,38 ± 0,15
S. aureus
S. epidermidis
+
0,89 ± 0,40
0,37 ± 0,07
E. faecalis
+
0,99 ± 0,20
RIR G10
5,08 ± 0,20
4,56 ± 0,04
4,98 ± 0,15
4,73 ± 0,06
R 2 G10
3,25 ± 0,78
1,52 ± 0,07
2,06 ± 0,12
2,33 ± 0,55
13,42 ± 0,25
14,46 ± 0,27
13,11 ± 0,70
14,29 ± 0,47
WS 22 N
0,93 ± 0,28
0,56 ± 0,03
0,62 ± 0,02
2,98 ± 0,65
WS 22
4,11 ± 0,14
1,03 ± 0,22
1,55 ± 0,05
3,83 ± 0,58
Plectasin
3,37 ± 0,00
2,49 ± 0,88
8,20 ± 2,20
10,60 ± 0,19
Protegrin-1
2,01 ± 0,06
0,92 ± 0,04
4,48 ± 0,23
4,46 ± 0,42
LL-37
3.1.2. Gramnegative Bakterien
Gegen die wichtigsten gramnegativen Bakterienstämme (Tab. 5) demonstrierten
mehrere Antimikrobielle Peptide ein breites Wirkspektrum (MEK < 5 µg/ml),
darunter Novispirin G10, R2 G10, RIR G10, WS 22 N, WS 22 und Protegrin-1. So
blieb die MEK von Novispirin bei vier von fünf getesteten Keimen unter 3 µg/ml, für
E. coli 1,327 µg/ml, für K. pneumoniae 1,407 µg/ml, für P. aeruginosa 0,845 µg/ml,
für Acinetobacter baumannii 2,411 µg/ml und lediglich für Proteus mirabilis 6,573
µg/ml.
Damit war Novispirin G10 signifikant (p<0,05) antimikrobieller als die
synthetische Modifikation RIR G10, deren Konzentrationen um 4 µg/ml lagen. Die
andere synthetische Erweiterung der Novispirin Familie, R2 G10, wies bei E. coli
und K. pneumoniae ähnliche Aktivitäten auf (1,547 µg/ml und 1,032 µg/ml) wie das
Stammpeptid, war aber bei den Pseudomonaden, P. aeruginosa und Acinetobacter baumannii, sowie bei Proteus mirabilis signifikant (p<0,05) schlechter.
Von den natürlichen Peptiden im Test überzeugte lediglich Protegrin-1 in seinem
34
antimikrobiellen Spektrum. LL-37 wies die signifikant schlechtesten Werte der
MEK auf. Ganz anders stellten sich die Ergebnisse der synthetischen
Modifikationen des LL-37, des WS 22 N und des WS 22, dar. Beide
demonstrierten nicht nur eine signifikant (p<0,05) bessere Aktivität, sondern
wiesen mit der MEK von 0,52 µg/ml des WS 22 N gegen P. aeruginosa auch die
signifikant niedrigste MEK im Test auf. WS 22 zeigte dabei ein ausgeglichenes
Spektrum. Die MEK für alle Bakterien, außer Proteus mirabilis (MEK von 13,353
µg/ml), lagen deutlich unter 5 µg/ml. Plectasin zeigte für P. aeruginosa,
Acinetobacter baumannii und Proteus mirabilis keine antimikrobielle Aktivität, und
für E. coli und K. pneumoniae mit einer MEK von jeweils 79,102 µg/ml eine sehr
eingeschränkte.
Tabelle 5: Gegen gramnegative Bakterien weist LL-37 im Vergleich zu den
restlichen Peptiden (außer Plectasin) eine schwächere antimikrobielle Aktivität auf.
(# p<0,05)
MEK in µg/ml
E. coli
K. pneumoniea
P. aeruginosa
A. baumannii
P. mirabilis
Novispirin G10
1,32 ± 0,22
1,41 ± 0,51
0,84 ± 0,35
2,41 ± 0,43
6,57 ± 1,98
RIR G10
4,14 ± 0,12
3,65 ± 0,21
4,23 ± 0,10
3,93 ± 0,16
12,47 ± 0,89
R 2 G10
1,55 ± 0,36
1,03 ± 0,30
4,03 ± 0,24
3,46 ± 0,88
13,86 ± 0,22
#
#
#
#
LL-37
12,78 ± 0,65
13,74 ± 0,78
21,47 ± 6,70
14,59 ± 0,34
#
33,72 ± 1,13
WS 22 N
4,14 ± 0,18
4,283 ± 0,11
0,52 ± 0,04
2,43 ± 0,71
5,51 ± 1,97
WS 22
2,49 ± 0,51
1,24 ± 0,19
2,66 ± 0,59
2,69 ± 0,60
13,35 ± 0,51
79,10 ± 0,00
79,10 ± 0,00
0
0
0
2,00 ± 0,14
2,34 ± 0,10
3,26 ± 1,07
5,02 ± 0,19
7,03 ± 1,76
Plectasin
Protegrin-1
In einem weiteren Test (Tab. 6) des Novispirin G10 gegen multiresistente,
klinische Isolate des P. aeruginosa zeigte das Peptid sehr gute Aktivität für alle
Isolate (VA 53476, VA 53383, VA 52519), denn die MEK blieb bei allen unter 4
µg/ml.
Tabelle 6: Novispirin G10 beweist gegen multiresistente klinische Isolate des P.
aeruginosa im Radial Diffusion Assay hocheffektive antimikrobielle Eigenschaften.
MEK in µg/ml
Novispirin G10
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
aeruginosa
VA 53383
VA 53476
VA 52519
3,63 ± 0,19
1,97 ± 0,59
2,81 ± 0,06
1,97 ± 0,60
35
3.1.3. Radial Diffusion Assay gegen Pilze
Bei diesem Test (Abb. 11) gegen Candida albicans demonstrierte Novispirin G10
die signifikant (p<0,05) höchste antimykotische Aktivität (0,783 µg/ml). Auch die
synthetischen Modifikationen zeigten gute Wirksamkeit, wobei jedoch die MEK
des R 2 G10 signifikant niedriger war als die des RIR G10. Sowohl das natürliche
Peptid LL-37 als auch seine synthetischen Abkömmlinge WS 22 N und WS 22
wiesen im Vergleich zu den anderen Peptiden signifikant (p<0,05) schlechtere
antimikrobielle Aktivitäten auf. Hier stellten jedoch die Modifikationen die bessere
antimykotische Wirksamkeit gegenüber ihrem Stammpeptid.
Tabelle 7: Besonders wirksam gegen Candida albicans ist Novispirin G10 im
Vergleich der Peptide im Radial Diffusion Assay. (* p<0,05 G10 vs. Rest)
MEK in µg/ml
Candida albicans
Novispirin G10
0,78 ± 0,02*
RIR G10
4,88 ± 0,11
R 2 G10
1,90 ± 0,34
LL-37
31,28 ± 1,62
WS 22 N
6,92 ± 2,26
WS 22
6,53 ± 2,63
Zusammenfassend demonstrierten in dieser Testreihe des RDA mehrere Peptide
ein breites Spektrum mit hoher Wirksamkeit (MEK < 5 µg/ml) in grampositivem wie
–negativem Bereich. Hierzu zählten die Novispirin Gruppe mit Novispirin G10, RIR
G10 und R 2 G10, die beiden synthetischen Modifikationen des LL-37, WS 22 N
und WS 22, sowie Protegrin-1. Bis auf den Test gegen Proteus mirabilis blieben
die MEK dieser Peptide zumeist deutlich unter 5 µg/ml, und damit in einem
hocheffektiven Wirksamkeitsbereich. Die MEK des Plectasin war nur gegen die
beiden S. aureus-Stämme so effektiv, LL-37 nur gegen den ATCC gelisteten S.
aureus. Gegen Candida albicans bleiben nur die Peptide der Novispirin-Gruppe
mit ihrer MEK unter 5 µg/ml.
3.2.
Modified CLSI Microbroth Dilution Assay
Dieser Versuch ist das Standardwerkzeug zur Bestimmung der Aktivität einer
antimikrobiellen Substanz, sei sie ein Antibiotikum, die im Versuch als positive
36
Kontrollen eingesetzt wurden, oder wie hier ein Host Defense Peptid. Die Methode
ist zur Bestimmung der MHK und MBK unter Mikrobiologen allgemein anerkannt,
im Gegensatz zum RDA, bei dem eine MEK bestimmt wird, die noch nicht überall
gleichermaßen als standardisierte Größe gilt. CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute) Microbroth Dilution Assay für Pilze diente der standardisierten
Bestimmung einer MHK bei Pilzen. Er stellt eine Abwandlung des oben
beschriebenen Modified CLSI Microbroth Dilution Assay für mykotische Kulturen
dar. Beide Versuchsverfahren wurden gemäß den Richtlinien des CLSI
durchgeführt. Die antimikrobiellen Aktivitäten der Peptide wurden gegenüber den
gleichen Mikroorganismen, die schon im Radial Diffusion Assay Verwendung
fanden, getestet. Ausnahme hiervon stellte der Dilution Assay für Pilze, bei dem 4
neue (ATCC und DSMZ gelistete) Pilzstämme aus der Familie des Candida
albicans herangezogen wurden.
Der MDA (Microbroth Dilution Assay) liefert als Ergebnisgröße die MHK (minimale
Hemmkonzentration, in µg/ml) und die MBK (minimale bakterizide Konzentration,
µg/ml), also per defintionem standardisierte Größen. Denn die MHK ist definiert als
die niedrigste Konzentration einer antibakteriellen Substanz, die die Vermehrung
eines Bakterienstammes unter definierten Bedingungen verhindert. Die MBK ist
wiederum die niedrigste Konzentration einer antibakteriellen Substanz, die einen
Bakterienstamm (99,9 % der Population unter definierten Bedingungen) abtötet.
3.2.1. Grampositive Bakterien
In der Novispirin-Gruppe (Tab. 8), bestehend aus Novispirin G10, RIR G10 und R2
G10, waren es vor allem die Modifikationen des Stammpeptides Novispirin, also
RIR G10 und R2 G10, die ein gutes Wirkprofil hinsichtlich der MHK und MBK für
die getesteten Bakterien (S. aureus, C-MRSA, S. epidermidis und E. faecalis) vor
allem bei den Staphylokkoken demonstrierten.
Beim S. aureus wiesen erwähnte Peptide signifikant (p<0,05) niedrigere MHK auf
als Novispirin G10. Die signifikant niedrigste MHK beim C-MRSA zeigte RIR G10.
Sehr niedrige MHK wiesen sowohl Novispirin als auch RIR G10 und R2 G10 beim
S. epidermidis auf. Die signifikant beste Bakterizidie stellte R 2 G10 sowohl beim
S. aureus als auch beim S. epidermidis. Die MBK von RIR G10 (8,333 µg/ml) und
37
R 2 G10 (10,417 µg/ml) für MRSA lagen signifikant (p<0,05) niedriger als die des
Novispirin G10 (50 µg/ml). Schwächere Wirksamkeit wurde im grampositiven
Bereich für die gesamte Novispirin-Gruppe beim E. faecalis festgestellt, denn die
MHK aller Peptide lag bei 50 µg/ml. Nur Novispirin G10 erreichte eine MBK
(66,667 µg/ml).
Tabelle 8: Im Modified CLSI Microbroth Dilution Assay demonstrieren besonders
die RIR G10 und R2 G10 niedrige MHK- und MBK-Werte bei grampositiven
Bakterien. (+ p<0,05 RIR G10 vs. Rest, # p<0,05 R2 G10 vs. Rest).
In µg/ml
Novispirin G10
C-MRSA
S. aureus
S. epidermidis
E. faecalis
50,00 ± 0,00
6,25 ± 0,00
3,13 ± 0,00
50,00 ± 0,00
50,00 ± 0,00
16,67 ± 4,16
6,25 ± 0,00
66,67 ± 33,33
+
1,56 ± 0,00
0,78 ± 0,00
50,00 ± 0,00
8,33 ± 2,08
12,50 ± 0,00
1,56 ± 0,00
0
#
50,00 ± 0,00
MHK
Novispirin G10
MBK
RIR G10 MHK
RIR G10 MBK
3,13 ± 0,00
R 2 G10 MHK
6,25 ± 0,00
1,56 ± 0,00
R 2 G10 MBK
10,41 ± 2,08
4,17 ± 1,04
0,65 ± 0,13
0
LL-37 MHK
0
50,00 ± 0,00
0
100,00 ± 0,00
LL-37 MBK
0
0
0
0
WS 22 N MHK
6,25 ± 0,00
1,56 ± 0,00
3,13 ± 0,00
12,50 ± 0,00
WS 22 N MBK
10,41 ± 2,08
9,38 ± 3,13
7,29 ± 2,75
25,00 ± 0,00
WS 22 MHK
6,25 ± 0,00
3,13 ± 0,00
6,25 ± 0,00
12,50, ± 0,00
WS 22 MBK
12,50 ± 0,00
10,42 ± 2,08
20,83 ± 4,17
29,17 ± 11,02
Plectasin MHK
6,25 ± 0,00
6,25 ± 0,00
25,00 ± 0,00
0
Plectasin MBK
50,00 ± 0,00
25,00 ± 0,00
100,00 ± 0,00
0
0,39 ± 0,00
Ampicillin MHK
0,39 ± 0,00
1,56 ± 0,00
Ampicillin MBK
1,30 ± 0,26
4,16 ± 1,04
Vancomycin MHK
0,19 ± 0,00
0,39 ± 0,00
Vancomycin MBK
0,26 ± 0,06
0,39 ± 0,00
In der LL-37-Gruppe (Tab. 8), die sich aus dem Stammpeptid LL-37 sowie seinen
synthetischen Modifikationen WS 22 und WS 22 N zusammensetzte, waren es in
erster Linie die synthetischen Peptide, die im grampositiven Bereich für alle
Bakterien ein gutes Wirkungsspektrum hinsichtlich der MHK aufzeigten.
38
Beim S. aureus wies WS 22 N die signifikant (p<0,05) niedrigste MHK auf. Die
MBK beider synthetischer Modifikationen lagen um 10 µg/ml. Für C-MRSA bot
sich im Testergebnis ein ähnliches Bild, während die MHK für beide
Veränderungen gleich bei 6,25 µg/ml war, zeigte WS 22 N etwas niedrigere MBK
(10,417 µg/ml) als WS 22 (12,5 µg/ml). Beim S. epidermidis wartete erneut WS 22
N mit der signifikant (p<0,05) niedrigeren MHK und diesmal auch MBK gegenüber
WS 22 auf. Auch für E. faecalis wiesen sowohl WS 22 N als auch WS 22 gute
Wirksamkeit dar. LL-37 zeigte eingeschränkte Wirksamkeit für S. aureus (MHK: 50
µg/ml) und E. faecalis (MHK 100 µg/ml). Im Vergleich mit den Novispirinen zeigten
die synthetischen Modifikationen des LL-37 wie dort die Modifikationen des
Novispirins ein ähnliches Wirkungsspektrum, mit dem Unterschied, dass die WS
22 N und WS 22 signifikant (p<0,05) besser gegen E. faecalis wirksam sind.
Plectasin (Tab. 8) zeigte gute Wirksamkeit im grampositiven Bereich vor allem
gegen Staphylokokken, auch bei multiresistenten (C-MRSA). Die MBK war bei CMRSA und S. epidermidis eingeschränkt.
3.2.2. Gramnegative Bakterien
Die Novispirin-Gruppe (Novispirin G10, RIR G10 und R 2 G10) (Tab. 9) zeigte
geschlossen eine sehr gute Wirksamkeit im gramnegativen Bereich hinsichtlich
der MHK und MBK für die getesteten Keime außer Proteus mirabilis. Für E. coli
lagen alle MHK- und MBK- Werte der Novispirine unter 5,5 µg/ml. Für K.
pneumoniae befanden sich alle gemessenen MHK und MBK sogar unter 1,5
µg/ml. Bei P. aeruginosa wies R 2 G10 die signifikant (p<0,05) niedrigste MHK
und MBK auf.
Die MHK und MBK von RIR G10 und R 2 G10 lagen beim
Acinetobacter
baumannii deutlich unter 2 µg/ml. Gegen Proteus mirabilis zeigte keines der drei
Peptide Wirksamkeit.
Das Wirkspektrum der LL-37-Gruppe (Tab. 9) (das natürliche Peptid LL-37 sowie
die beiden synthetischen Modifikationen WS 22 N und WS 22) stellte sich im
gramnegativen Bereich, wie folgt dar: sehr gute Wirksamkeit von WS 22 N und
WS 22 gegen Acinetobacter baumannii, E. coli und K. pneumoniae sowie
eingeschränkte Wirkung gegen P. aeruginosa und fehlende gegen Proteus
mirabilis. LL-37 war eher eingeschränkt wirksam gegen die drei ersterwähnten
39
Bakterienstämme. So demonstrierten WS 22 N und WS 22 jeweils niedrige MHKund MBK-Werte bei E. coli. Bei K. pneumoniae wiesen WS 22 und WS 22 N MHK
und MBK von unter 5,5 µg/ml auf. Bei Acinetobacter baumannii blieben die MHK
und MBK beider Peptide sogar unter 2,2 µg/ml.
Tabelle 9: Bis auf Proteus mirabilis zeigen Novispirin G10, RIR G10 und R2 G10
hocheffektive Aktivität gegen gramnegative Bakterien. (Schattiert die MBK; +
p<0,05 R 2 G10 vs. Rest)
E. coli
K. pneumoniea
P. aeruginosa
A. baumannii
P. mirabilis
4,17 ± 1,04
1,30 ± 0,26
6,25 ± 0,00
1,17 ± 0,39
0
G10 MBK
5,21 ± 1,04
1,30 ± 0,26
6,25 ± 0,00
3,12 ± 1,56
0
RIR G10 MHK
2,60 ± 0,52
0,39 ± 0,00
6,25 ± 0,00
1,30 ± 0,26
0
RIR G10 MBK
2,60 ± 0,52
1,04 ± 0,26
6,25 ± 0,00
1,30 ± 0,26
0
+
0,91 ± 0,34
3,13 ± 1,56
+
0
4,17 ± 1,04
0,91 ± 0,34
3,13 ± 1,56
0,65 ± 0,13
0
LL-37 MHK
33,33 ± 8,33
100,00 ± 0,00
66,67 ± 16,67
12,50 ± 0,00
0
LL-37 MBK
58,33 ± 22,05
0
100,00 ± 0,000
20,83 ± 4,17
0
WS 22 N MHK
3,13 ± 0,00
3,13 ± 0,00
50,00 ± 0,000
1,56 ± 0,00
0
WS 22 N MBK
8,33 ± 2,08
3,13 ± 0,00
66,67 ± 16,67
2,08 ± 0,52
0
WS 22 MHK
5,21 ± 1,04
3,13 ± 0,00
100,00 ± 0,000
1,56 ± 0,00
0
WS 22 MBK
5,21 ± 1,04
5,21 ± 1,04
166,67 ± 33,33
1,56 ± 0,00
0
3,13 ± 0,0
0,39 ± 0,00
12,50 ± 0,0
6,25 ± 3,13
3,13 ± 0,00
3,13 ± 0,00
MHK/MBK in
µg/ml
Novispirin
G10 MHK
Novispirin
R 2 G10 MHK
R 2 G10 MBK
2,08 ± 0,52
0,39 ± 0,00
Ampicillin
MHK
Ampicillin
MBK
Imipenem
MHK
Imipenem
MBK
16,66 ± 2,08
6,25 ± 0,00
6,25 ± 0,00
33,33 ± 16,66
40
Die Wirkung der LL-37-Gruppe gegen P. aeruginosa war eingeschränkt sowohl in
der MHK der Peptide als auch in der MBK (kein Wert unter 50 µg/ml). Wie schon
in der Novispirin-Gruppe äußerte sich auch hier die fehlende Wirksamkeit gegen
Proteus mirabilis. Plectasin zeigte keinerlei Wirksamkeit im gramnegativen Bereich
für die getesteten Keime. Im Vergleich der beiden Peptidgruppen, Novispirine und
LL-37, zeigte sich deutlich das breitere Wirkspektrum der Novispirine im
gramnegativen Bereich. Bei der LL- 37 Gruppen zeigten zum einen nicht alle
Peptide, LL-37 wies eher eingeschränkte Wirksamkeit auf für E. coli, K.
pneumoniae und P. aeruginosa, die gleiche Wirksamkeitskonstanz. Für WS 22 N
und WS 22, die ein gutes Wirkspektrum kennzeichneten, lagen die VergleichsMHK und MBK auch signifikant (p<0,05) höher als bei den Novispirinen.
Zusammenfassend zeigte die MDA-Testung der Peptide gegen die Keime aus
dem
grampositiven
wie
–negativen
Bereich
in
erster
Linie
das
breite
antimikrobielle Spektrum dieser Peptide, hier seien vor allem die NovispirinGruppe und die synthetischen Abkömmlinge des LL-37 erwähnt. Das Beispiel des
Plectasins verdeutlicht, dass die Entwicklung spezifischer Peptide mit einem
engen Wirkspektrum durch aus möglich ist, lag doch die Hauptwirksamkeit dieses
Peptides vor allem in der Aktivität gegen S. aureus. Zugleich weist die Testung
auch darauf hin, sei es durch die fehlende Wirksamkeit der Peptide gegen Proteus
mirabilis oder die eingeschränkte Aktivität der Novispirine gegen E. faecalis, dass
auch in einem sehr breiten Spektrum Lücken vorhanden sein können.
3.2.3. Vergleich mit Standardantibiotika
Die MHK und MBK von Ampicillin wurden beim S. aureus, E. faecalis und E. coli
mit der MHK und MBK der beiden Peptidgruppen sowie des Plectasin verglichen.
Beim S. aureus (DSMZ 1104, ATCC 25923; Tab. 8) wies Ampicillin zwar die
signifikant (p<0,05) niedrigste MHK und MBK auf, jedoch waren die MHK von RIR
G10, R 2 G10 und WS 22 N in einem ähnlichen als hocheffektiv anzusehendem
Wirkungsbereich.
Beim E. faecalis (DSMZ 2570, ATCC 29212; Tab. 8) zeigte Ampicillin erneut die
im Vergleich signifikant niedrigste (p<0,05) MHK und MBK auf. Hier waren die
41
MHK der Peptide deutlich höher, die besten im Test waren die MHK der
Modifikationen von LL-37, WS 22 N und WS 22, mit jeweils 12,5 µg/ml.
Beim E. coli (DSMZ 1103, ATCC 25922; Tab. 9) lag die MHK des Ampicillins
signifikant (p<0,05) höher als die der synthetischen Novispirine, RIR G10 und R2
G10. Die MHK der restlichen Peptide, bis auf die von LL-37 und Plectasin, waren
darüber hinaus in einem sehr ähnlichen Effektivitätsbereich wie dem des
Antibiotikums (3,125 – 5,208 µg/ml). Die MBK aller Peptide (erneut mit Ausnahme
des LL-37 und Plectasin) waren signifikant (p<0,05) niedriger als die des
Ampicillins. Die Peptide bewiesen bei besserer Hemmung des Wachstums auch
die bessere Bakterizidie gegenüber dem Bakterium als das Antibiotikum.
Die MHK und MBK von Vancomycin wurden beim C-MRSA und S. epidermidis
(DSMZ 1798, ATCC 12228) mit der getesteter Peptiden verglichen. Beim MRSA
(Tab. 8) wies Vancomycin sowohl die signifikant (p<0,05) niedrigste MHK als auch
MBK auf. Das beste Peptid war hierbei RIR G10, eine synthetische Variante des
Novispirin G10, mit einer MHK von 3,125 µg/ml und einer MBK von 8,333 µg/ml.
Beim S. epidermidis (DSMZ 1798, ATCC 12228; Tab. 8) konnten die
synthetischen Novispirine R 2 G10 (0,391 µg/ml) und RIR G10 (0,781 µg/ml) eine
MHK in ähnlichen Bereich wie das Antibiotikum (0,39 µg/ml) erreichen. Auch bei
der MBK, obwohl das Antibiotikum hier mit 0,39 µg/ml den signifikant (p<0,05)
niedrigsten Wert stellte, lagen die beiden Peptide der Novispirin-Gruppe mit ihren
Werten (0,651 µg/ml und 1,563 µg/ml) ebenfalls in diesem hocheffektiven Bereich.
Schließlich wurden auch die MHK und MBK von Imipenem bei K. pneumoniae, P.
aeruginosa und Acinetobacter baumannii mit den MHK und MBK der getesteten
Peptide verglichen. Bei K. pneumoniae (DSMZ 681, ATCC 10031; Tab. 9)
erreichte Imipenem eine MHK von 0,391 µg/ml. In diesem hocheffektiven Bereich
der MHK bleiben auch die MHK der Novispirin-Gruppe (Novispirin G10, RIR G10
und R 2 G10) mit Werten zwischen 0,391 und 1,303 µg/ml. Bei der MBK lagen die
Werte der Peptide sogar signifikant (p<0,05) niedriger als die des Antibiotikums
(Ausnahmen hiervon: LL-37 keine MBK und WS 22 mit einer MBK von 5,208
µg/ml).
42
Ein ähnliches Ergebnisbild brachte der Vergleich bei der Testung gegen P.
aeruginosa (DSMZ 1117, ATCC 27853; Tab. 9) hervor. Die MHK von Imipenem
wies den gleichen Wert auf, wie die von R 2 G10 (beide 3,125 µg/ml). Die MHK
der restlichen Novispirine lag bei 6,25 µg/ml. Bei der MBK lag das Antibiotikum
dann signifikant (p<0,05) höher als das Peptid R 2 G10. Auch die restliche MBK
der Novispirin-Gruppe waren bei 6,25 µg/ml.
Bei Testung gegen Acinetobacter baumannii (DSMZ 30008, ATCC 19606; Tab. 9)
lag die MHK des Imipenem signifikant (p<0,05) höher als die MHK der Novispirine
und auf gleichem Level wie der synthetischen LL-37 Modifikationen. Die MBK
(6,25 µg/ml) des Imipenems lag sogar signifikant (p<0,05) höher als sowohl die
der gesamten Novispirine als auch der synthetischen LL-37-Peptide.
Damit demonstrierten die Peptide hier deutlich ihre hervorragende Fähigkeit zur
Hemmung des bakteriellen Wachstums als auch die eigentlich ihrer Wirksamkeit
zugrunde liegende bakterizide Aktivität, die in diesen Fällen sogar die
Möglichkeiten des Standardantibiotikums Imipenem überstieg.
Insgesamt zeigte der Vergleich der MHK- und MBK-Werte von Standardantibiotika
und der MHK und MBK von Host Defense Peptiden deutlich die Vorteile der
Peptide. Zum einen kam hier deutlich das weite Spektrum der Peptide zutage.
Während sich die Wirksamkeit der einzelnen Antibiotika auf zumeist 2 Keime
beschränkte, auch aus gleichem Grambereich, reichte das Spektrum von Peptiden
wie den Novispirinen oder den synthetischen Abkömmlingen der LL-37-Gruppe
über den größten Teil des grampositiven wie gramnegativen Bereiches. Ferner lag
die Fähigkeit zur Wirksamkeit der Peptide im Gegensatz zu den verwendeten
Antibiotika häufig in der gleichen MHK und MBK. Dies lässt schlussfolgern, dass
hier die Hemmung des Wachstums auf einer tatsächlichen Abtötung der Bakterien
beruhte. Hier schnitten die Antibiotika wie Imipenem oder Ampicillin schlechter ab,
sie bewirkten eine sehr gute Hemmung des bakteriellen Wachstums durch
Mechanismen, die nicht auf einer Abtötung des Bakteriums gründeten.
43
3.3.
Modified CLSI Microbroth Dilution Assay für Pilze
Dieser Versuch sei als Analogon zum Modified CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute) Microbroth Dilution Assay zu betrachten. Er berücksichtigte
in besonderer Weise die Erfordernisse der Kultivierung von Pilzen zum Zwecke
einer antimikrobiellen Testung. Im Test fanden folgende Pilzkulturen Verwendung
Candida albicans ATCC 24433, Candida albicans ATCC 90028, Candida
parapsilosis ATCC 22019, Issatchenkia orientalis ATCC 6258. Als Peptid wurde
Novispirin G10 getestet, Als Antimykotikum benutzte man Clotrimazol.
Die Ergebnisse (Tab. 10) demonstrierten die im Vergleich zum Clotrimazol
eingeschränkte antimykotische Aktivität des G10, lediglich gegen Candida parapsilosis ATCC 22019 lag sie bei 3 µg/ml und erreichte damit ein effektives Niveau.
Im Vergleich dazu lag die MHK von Clotrimazol bei 0,25 µg/ml.
Tabelle 10: Nur gegen Candida parapsilosis demonstriert Novispirin G10 eine
effektive Hemmkonzentration im Microbroth Dilution Assay für Pilze. (+ p<0,05
Clotrimazol vs. Novispirin G10)
Candida
Candida
Candida
Issatchenkia
albicans ATCC
albicans ATCC
parapsilosis
orientalis
24433
90028
ATCC 22019
ATCC 6258
Novispirin G10
64,00 ± 29,0
43,00 ± 21,0
6,00 ± 3,00
53,00 ± 26,0
Clotrimazol
0,25 ± 0,00
MHK in µg/ml
+
0,25 ± 0,00
+
0,25 ± 0,00
+
+
0,25 ± 0,00
44
4.
Diskussion
Bakterielle Wundinfektionen in der Chirurgie verzögern oder kehren gar den
Heilungsprozess
im
Krankenhausstation
Mikrokosmos
können
alle
der
Wunde
um.
erdenklichen
Im
Alltag
der
Einschränkungen
der
Abwehrmechanismen zu solchen Wundinfektionen führen. Besonders betroffen
sind dabei ältere Menschen, sowie Patienten die chirurgischen Eingriffen
unterzogen werden. Im Zeitalter steigender Kosten und der Budgetierung des
Krankenhausaufenthaltes, die zu einem immer höherem Druck auf den
behandelnden Arzt führen, Infektionen, vor allem Wundinfektionen in der
Chirurgie, zu verhindern, um so die Heilung und damit den Aufenthalt des
Krankenhauspatienten nicht zu verzögern, bleibt es vor dem Hintergrund des
zunehmenden Aufkommens an virulenten und der Antibiotikatherapie gegenüber
resistenten Bakterien zugleich immer weniger aus, dass Wundinfektionen
vorkommen, deren Verlauf durch den Mangel an Therapiemöglichkeiten
prolongiert wird. In diesem Lichte existiert schon seit längerer Zeit ein dringender
Bedarf an alternativen Therapien von Infektionen. Im Hinblick darauf eröffnet sich
mit den Antimikrobiellen Peptiden ein viel versprechendes Forschungsfeld.
Die derzeitige Studienlage spricht dafür,, dass die so genannten endogenen
Antibiotika eine Schlüsselrolle in den Immunsystemen nahezu aller tierischen
Spezies einnehmen. Diese Proteine stellen essentielle Komponenten des
angeborenen Teils der Körperabwehr dar, weil sie als Effektorsubstanzen agieren,
die die Fähigkeit besitzen ein breites Spektrum von Mikroorganismen zu zerstören
[11, 64, 66].
Im Gegensatz zur hohen Spezifität der adaptiven Immunität, die es diesem
System unmöglich macht, schnell genug zu reagieren um einen geschwächten
Organismus gegen eine akute Invasion verschiedener Pathogene zu verteidigen.
Der angeborene Teil des Immunsystems hat eben diese Kapazitäten die es ihm
ermöglichen schnell und unspezifisch auf Angriffe zu antworten, durch diese
Fähigkeiten übernimmt es die Funktion der ersten Verteidigungslinie gegenüber
allen
Arten
von
Infektionen.
Einen
zentralen
Bestandteil
dieser
Verteidigungsstrategie stellen die Antimikrobiellen Peptide dar. Viele solcher
45
natürlich vorkommender Peptide sind bereits charakterisiert worden, solche wie
die Defensine, Protegrine, Lysozyme oder die Magainine [121]. Mit der
Aufschlüsselung der genauen Aminosäurensequenz, der Konformation und der
räumlichen Ausfaltung, also der Dekodierung von primärer, sekundärer und
tertiärer Struktur erlangte man die Möglichkeit zur Modifikation dieser und damit
auch zur Veränderung der Funktion des natürlichen Peptides [107]. Was folgte,
war die eigenständige Herstellung neuer Peptide auf der Basis der entweder
natürlichen oder bereits veränderten synthetischen Peptide, z. B. die hier
verwendeten Novispirine G10, RIR G10 sowie R2 G10 oder auch die
Abkömmlinge des LL-37 WS 22 und WS 22 N. In der Folgezeit galt es nun in vitro
Testmethoden zu finden, die einer sinnvolle Überprüfung vor allem der
antimikrobiellen Fähigkeiten gewährleisteten.
Mit dem Radial Diffusion Assay (RDA) und dem CLSI Microbroth Dilution Assay
(MDA für Bakterien und für Pilze) stellten wir zwei solcher Testmethoden zur
Überprüfung der antimikrobiellen Fähigkeiten der Peptide vor [103]. Im Gegensatz
zu vielen anderen Studien zuvor [6, 90, 97, 99, 100, 102, 105, 107], die sich vor
allem
mit
der
Demonstration
der
in
vitro
Fähigkeiten
auf
einzelne
Bakteriengruppen oder gar Bakterien beschränkten, wurde in dieser Arbeit ein
systematischer Vergleich der antimikrobiellen Fähigkeiten vollzogen. Hierzu wurde
ein breite Auswahl aus dem Spektrum der Wundinfektionen verursachenden
Keimen herangezogen.
Die Testung der Agenzien erfolgte unter den definierten Standardbedingungen.
Dies bedeutete, dass es in der jeweiligen Testreihe möglich war eine
Effektivitätsvariable für jedes Peptid zu ermitteln, die quantitativ in der Lage war,
die antimikrobielle Aktivität des Peptides wiederzugeben. Im Falle des RDA
ermittelte man so die MEK (minimale effektive Konzentration; in µg/ml). Beim MDA
erlangte man sogar Kenntnis über die Fähigkeit der Peptide hinsichtlich ihrer
Möglichkeiten zur Hemmung des bakteriellen Wachstums oder zur potenziellen
direkten Abtötung der Keime. Die MHK spiegelte dabei die Hemmung dar
(minimale Hemmkonzentration; in µg/ml), während die MBK das unmittelbare
Abtöten der Keime im Test anzeigte (minimale bakterizide Konzentration; in
µg/ml). Durch die Aufrechterhaltung identischer definierter Standardbedingungen,
46
die auch bei der Testung von Antibiotika beim Microbroth Dilution Assay bestehen,
war es sogar möglich beim MDA die antimikrobielle Fähigkeiten von Peptiden und
klinisch eingesetzten Antibiotika gegenüberzustellen. Unterstützt wurde dies
Vorhaben durch die Verwendung so genannter Quality Control Strains, also
bakteriellen Stämme, die speziell für die antimikrobielle Testung von z. B.
Antibiotika Verwendung finden. Hinsichtlich des Spektrums dieser Stämme griff
man im Test neben solchen Kontrollstämmen auch auf klinische Isolate zurück,
die wiederum besondere Fähigkeiten wie erhöhte Pathogenität oder Multiresistenz
aufwiesen. Insgesamt umfasste die Testbreite unter den Mikroben die zehn
häufigsten Wundinfektionen verursachenden Keime.
Auch wenn die oben genannten Verfahren einzeln oder zum Teil gemeinsam
bereits vorher schon in zahlreichen Studien eingesetzt wurden [6, 90, 97, 99, 100,
102, 105], so war es diese Arbeit, die sich zum Ziel nahm, Ergebnisse beider
Methoden einander gegenüber zu stellen. Auch wenn es in der Konsequenz
bedeutete, dass hinsichtlich der Wirkung einzelner Peptide deutliche Unterschiede
in diesem Vergleich gesehen wurden. In den Ergebnissen auffällig sind
Unterschiede zwischen den Ergebnissen für die MEK und MHK der Host Defense
Peptide, hier zum Beispiel das Novispirin G10. Für eine definitive Erklärung
reichen die hier erbrachten Ergebnisse nicht aus. Vermutlich liegen diese
Unterschiede aber in der Rolle von Proteinasen, die als Virulenzfaktoren der
benutzten Bakterien bekannt sind sowie zur Hemmung der Peptide führen und im
Müller-Hinton-Bouillon (MDA) eher eine Wirkung als im Agargel (RDA) entfalten
[95]. Daneben könnte auch die Zusammensetzung der Medien hier entscheidend
sein. So ist bekannt, dass Glykosaminglykane Host Defense Peptide in ihrer
antimikrobiellen Wirkung hemmen [7]. Hier können die Stärke oder der als
Fleischinfus benannte Teil des Müller-Hinton-Bouillon eine hemmende Rolle
spielen.
Neben den Unterschieden zwischen den beiden Methoden gibt es noch
Unterschiede, de man als stammspezifisch bezeichnen kann, weil sie den
Staphylococcus aureus und den C-MRSA betreffen. So demonstriert erneut die
MDA-Versuchsreihe deutliche Unterschiede in der MHK z. b. für Novispirin G10
bei beiden Bakterien. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung liegt
sicherlich in veränderten Virulenzfaktoren der Bakterien. So sieht man bei einigen
47
Spezies von Staphylococcus aureus ein neues Membranprotein MprF, welches
die negativ geladenen Phospholipide der bakteriellen Zytoplasmamembran mit LLysin modifiziert. Dies führt zu einer Änderung der Ladung und damit zu
Abschwächung der antimikrobiellen Wirkung des Host Defense Peptides [59].
Hinsichtlich der einzelnen Testverfahren wurde in dieser Arbeit bezogen auf die
bereits bekannten Peptide (Novispirin G10, Protegrin-1) die in vitro Ergebnisse,
was die antimikrobielle Fähigkeiten anbetrifft, früherer Studien bestätigt [6, 90,
102, 105, 107]. Daneben konnte anhand der Auswahl der verschiedenen
Bakterienstämme auch ein Stamm mit einer natürlichen Resistenz gegenüber den
HDP (Proteus mirabilis) bestätigt werden. Diese Resistenz ist auf veränderte
Lipopolysaccharide des Bakteriums zurückzuführen [75], so wird das anionische
Lipid A durch die kationische Aminoarabinose ausgetauscht. Es kommt zu einer
Veränderung der Ladung auf der Oberfläche der Bakterienwand und damit quasi
zu einer Wirkungsminderung des über die anionische Ladung bindenden
kationischen Peptides. [30]
Weiterhin demonstrierte sich auch in dieser Studie gegenüber zahlreichen
anderen [93, 97, 107, 110], die die Wirksamkeit einer AP-Familie bzw.
synthetischen Modifikationen von AP im Vergleich zu ihrem Ursprungspeptiden
untersuchten, dass aus einer solchen Modifikation heraus die potenzielle
Erweiterung des antimikrobiellen Spektrums resultiert. Wie die Erweiterung und
Steigerung der antimikrobiellen Fähigkeiten in der LL-37 Gruppe infolge einer
veränderten Aminosäurenstruktur des Stammpeptides durch den Austausch einer
Aminosäure eindrucksvoll zeigte, können durch die Weiterentwicklung der
Peptide, und diese liegt in der synthetischen Modifikation, nicht nur bestehende
Lücken im Spektrum geschlossen, sondern auch bestehende antimikrobielle
Fähigkeiten potenziert werden. Es muss allerdings in Zukunft weiterhin untersucht
werden, ob solche Peptidresistenzen wie oben beschrieben auch mit einer
gezielten Veränderung des Peptides umgangen werden können.
Die Testung der fungiziden Eigenschaften von Host Defense Peptiden mittels
MDA ist zunächst einmalig in der Literatur, offenbarte jedoch einige Diskrepanzen.
So fand sich im Versuchsfeld des RDA eine deutliche antimikrobielle Aktivität, die
48
jedoch unter den Bedingungen des Modified Assay for Fungi nicht nachvollzogen
werden konnte. Hier stellten sich ähnliche Vermutungen, die schon zur Erklärung
der Unterschiede von Ergebnissen des RDA- und des MDA-Testreihen
herangezogen wurden. Aus früheren Versuchen mit Host Defense Peptiden weiß
man um ihre Empfindlichkeit, vor allem hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Aktivität,
gegenüber den unterschiedlichen Medien und z. B. dem Salzgehalt des Mediums
[5]. Das Problem, was sich hieraus stellte, ist das der definierten Bedingungen,
unter den Testreihen wie der MDA durchgeführt werden. Diese definierte
Bedingungen zu verändern, und hierzu gehörte auch das Medium, bedeutete den
Vergleich aufgeben. Erzielten die Peptide im Falle eines anderen Mediums
entsprechend andere MHK-Werte, so könnte man diese nicht mit den Ergebnissen
von Antimykotika vergleichen, weil die erforderlichen definierten Bedingungen in
der Testung der Peptide nicht vorgeherrscht hätten. Hier ist es weiteren Projekten
vorbehalten, das Standardverfahren einer für die HDP geeigneter Modifikation zu
unterziehen.
Auch besonders in dieser Arbeit ist der gesuchte Vergleich der Fähigkeiten der
Peptide mit Antibiotika, der hier in NMDA-Testung vollzogen wurde. Es konnte nun
nicht wie früher bei einzelnen Peptiden, sondern in der gesamten Gruppe
(Novispirine, die Veränderungen des LL-37) die auch in früheren Studien [5, 6]
bereits
angedeutete
Erkenntnis
untermauert
werden,
die
Fähigkeit
zur
Wirksamkeit der Peptide liege im Gegensatz zu den verwendeten Antibiotika
häufig in der gleichen MHK und MBK. Dies lässt schlussfolgern, dass hier die
Hemmung des Wachstums auf einer tatsächlichen Abtötung der Bakterien beruhte
[50, 57, 63, 117]. Die Host Defense Peptide agieren auf einem anderen
Mechanismus aufbauend, sie sind als erste Linie der Verteidigungsstrategie des
angeborenen Immunsystems in ihrer Funktion vor allem auf das Abtöten der
Mirkoorganismen ausgelegt. Im Gegensatz zu den oben aufgeführten Studien [6,
90, 97] wurde in dieser Versuchsreihe nicht auf die Ermittlung der MHK verzichtet.
Erst der Vergleich beider, der MHK und der MBK erlaubt nämlich o. g. Schlüsse zu
ziehen.
Mit den hier dargestellten in vitro Testsystem bestehend aus dem Radial Diffusion
Assay und dem CLSI Microbroth Dilution Assay stehen also zwei standardisierte
49
Verfahren zur Verfügung, die es zweifelsohne erlauben, die antimikrobiellen
Fähigkeiten der so genannten endogenen Antibiotika richtig einzuschätzen. Wie
die Ergebnisse zeigen, ist die Potenz der Host Defense Peptide, hier sind es vor
allem die synthetischen Modifikationen entweder natürlicher Peptide wie WS 22
und WS 22 N, die vom LL-37 abstammen, oder Weiterentwicklungen synthetischer
Peptide, wie der Novispirin-Gruppe, bei der aus dem synthetischen Novispirin G10
mit RIR G10 und R 2 G10 weitere synthetische Abkömmlinge geschaffen wurden,
beachtlich. So demonstrieren sie nicht nur ein bisher bei den Antibiotika nicht
möglich geglaubtes breites antimikrobielles Spektrum. Weitere Vorteile ergeben
sich aus der Struktur der Antimikrobiellen Peptide. Sie sind im Gegensatz zu
Antibiotika, die entweder Derivate von Pilzprodukten sind oder den menschlichen
Zellen ganz fremde Substanzen, aus in der Natur und im menschlichen Körper
ubiquitär vorkommenden Aminosäuren aufgebaut. Da LL-37 sogar menschlichen
Ursprungs ist, stellt sich nicht nur für das Peptid selbst, sondern auch für seine
Derivate WS 22 und WS 22 N die Frage, ob sie in dem Masse allergen wirken
können wie Antibiotika [6]. Diese sind aufgrund ihrer dem menschlichen Körper
fremden Struktur häufig in der Lage nicht nur allergische Reaktionen, aber auch
gastrointestinale Beschwerden, Kreuzreaktionen und andere Komplikationen
hervorzurufen.
Daraus ergibt sich die Folgefrage nach der Zytotoxizität der
Peptide, die in nachfolgenden Untersuchungen (Zytotoxizitätstest, Hämolysetest)
geklärt werden muss. Für einige Peptide ist dies bereits geschehen, so für
Novispirin G10 [107] und Protegrin-1 [105] sowie für LL-37 [6], für deren
Modifikationen wie z. B. die neuen Novispirine oder die synthetischen Derivate des
LL-37 noch nicht. Hier ist es Aufgabe zukünftiger Projekte auf der Basis dieser
Ergebnisse Peptide gezielt für in vivo Forschung auszuwählen.
Dennoch beantworten diese Testreihen nicht nur Fragen hinsichtlich der
Fähigkeiten der Host Defense Peptide, sie stellen viele neue, und diese betreffen
vor allem den Funktionsmechanismus der Moleküle. Zentraler Punkt hierbei bleibt
die Diskrepanz in den Ergebnissen des RDA und MDA. Letztlich weiß man bereits,
um Sensibilität der Aktivität der Peptide gegenüber dem pH oder der
Salzkonzentration der Umgebung [5, 6]. Veränderungen des äußeren Milieus, hier
der Ionen und folglich der Osmolalität, beeinflussen die Struktur der Peptide und
damit ihre antimikrobielle Funktion [49]. Doch sind viele andere Faktoren, die
50
möglichen Einfluss auf die antimikrobiellen Eigenschaften der Peptide haben,
noch unklar. Hier sind weitere Versuchsreihen mit vermehrter Modifikation der
Testbedingungen notwendig, um verantwortlichen Faktoren zu identifizieren.
Der Mechanismus wie Host Defense Peptide Bakterien oder Pilze abzutöten
vermögen, ist noch nicht bis ins Detail erforscht worden. Bei den meisten
bekannten antimikrobiellen Peptiden handelt es sich um positiv geladene
polykationische Peptide, die eine amphipathische Struktur besitzen. Diese Struktur
macht es den Eiweißen möglich an die negativ geladene bakterielle Membran zu
binden. Sie docken förmlich an
mit dem kationischen, hydrophilen Part ihrer
Struktur an die negativ geladene mikrobielle Membran an [49, 50, 73]. Zugleich
können sie mit ihrem apolaren ungeladenen Teil transmembranäre Kanäle bilden,
diese sind für Ionen durchlässig. Die Kanäle führen durch ihre Ionenpermeabilität
zu einem Zusammenbruch des Membranpotenzials infolge des Anstiegs der
Membrandurchlässigkeit und dadurch zum Verlust von Ionen und damit letztlich
zum Kollaps des gesamten Mikroorganismus [33] (Abbildung 26). Allerdings ist
auch möglich, dass allein die Bindung des positiv geladenen Peptides zu einem
Verlust der Membranfluidität führt und damit zu einem Bruch in der Struktur der
mikrobiellen Membran.
Abbildung
8:
Elektronenmikroskopische
Aufnahme eines E. coli
vor (A und B) und nach
Inkubation
(C
mit
Cecropin und D mit LL-37)
mit
Host
Defense
Peptiden. Während in
beiden Fällen letztlich die
Lyse des Bakteriums folgt,
ist der Mechanismus bis
dahin, nicht nur was die
Zeitebene
anbetrifft,
unterschiedlich und im
letzten
Detail
noch
ungeklärt.
Die Resultate dieser Studie verschaffen der Behauptung nachhaltig Geltung, dass
Host Defense Peptide seit Millionen von Jahren einen immensen Beitrag an der
51
Abwehr von Infektionen in verschiedenen Organismen unterschiedlicher Spezies
leisten. In Zukunft könnten aus ihnen die Alternativen zu Antibiotika in der
klinischen Therapie bakterieller Infektionen, vornehmlich von Wundinfektionen, die
durch unterschiedliche Mikroorganismen herbeigeführt werden. Zum einen ihr
breites
Spektrum
und
die
hervorragenden
bakteriziden
und
fungiziden
Eigenschaften, zum anderen ihre Struktur als Peptide und die Möglichkeit zur
Modifikation ihrer Eigenschaften lassen sie zu
potenziellen Substraten in der
Behandlung topischer Infektionen werden, auch wenn hierzu noch weitere Studien
notwendig sind. Aus dem dargelegten Vergleich der Peptide stechen zweifelsohne
einige hervor, wie die Novispirin-Gruppe und die synthetischen Derivate des LL37, jedoch sind gerade mit diesen Peptiden weitere Versuche notwendig, die ihre
möglichen
zellschädigende
Eigenschaften
aufdecken,
wie
Kontrollen
der
Zytotoxizität und Überprüfung potentieller Hämolyse. Darüber hinaus steht dann
die Erhebung der Fähigkeit zur Behandlung
topischer Infektionen in einem
Tiermodell aus (Bochumer Verbrennungsmodell). Der finale Schritt wäre dann die
Demonstration der Effizienz ausgewählter Host Defense Peptide gegenüber
systemischen
Infektionen
sowie
Detektion
möglicher
Nebenwirkungen
in
Tierstudien und klinischen Versuchen. Darüber hinaus steckt gerade wegen der
Struktur als Peptide die Möglichkeit zu einer Anwendung in der Gentherapie.
Letztlich
sind
weitere
Studien
notwendig,
die
sich
auch
mit
den
Funktionsmechanismen auseinandersetzen, um das therapeutische Potenzial der
Peptide besser definieren zu können.
52
5.
Zusammenfassung
In vitro Testmethoden zur Überprüfung der Aktivität natürlicher und
synthetischer Host Defense Peptide gegen Bakterien und Pilze mit Vergleich
zu klinisch eingesetzten Antibiotika und Antimykotika
Problem: Die dramatisch steigende Inzidenz von Wundinfektionen mit multiresistenten Keimen führte bei der Behandlung von Patienten mit gleichzeitig
bestehender
erhöhter
Morbidität
und
Letalität
zu
schwerwiegenden
Komplikationen. Die Suche nach potentiellen Auswegen fokussiert sich in den
letzten Jahren auf das angeborene Immunsystem und dessen Antimikrobiellen
Peptide. Ziel dieser Studie war die in vitro Untersuchung der Wirksamkeit von Host
Defense Peptiden gegenüber klinisch eingesetzten Antibiotika und Antimykotika.
Methode: Getestet wurden das humane Cathelicidin LL-37, LL37-Modifikationen
(WS22 und WS22N), Novispirin G10 ein synthetischer Abkömmling des natürlich
beim Schaf vorkommenden Ovispirins, Novispirin Modifikationen (R 2 G10, RIR
G10), das porkine Peptid Protegrin-1 und das vom Pilz exprimierte Plectasin
gegen die häufigsten Infektionen verursachenden Mikroorganismen sowie multiresistente Isolate, wie MRSA und P. aeruginosa, mittels dem Bilayer Radial
Diffusion Assay und dem CLSI Microbroth Assay. Verglichen wurde die Aktivität
der AP mit klinisch eingesetzten Antibiotika (Ampicillin, Imipenem, Vancomycin).
Ergebnisse: Diese Studie zeigte nur für das humane LL-37 eine eingeschränkte
antimikrobielle Aktivität. Dagegen zeigten die Protegrin-1, LL37 Modifikationen und
die Novispirine ausgesprochen breite und potente Aktivitätsspektra gegen grampositive und -negative Bakterien sowie gegen Candidia albicans. Bei E. coli, K.
pneumoniae, A. baumannii zeigten WS22 und die Novispirine signifikant (p < 0.05)
niedrigere Hemmkonzentrationen (MHK) und antibakteriellen Konzentrationen
(MBK) als Standardantibiotika. Diese Studie veranschaulicht damit, dass Host
Defense Peptide gleichzeitig gegen grampositive und -negative Bakterien wie
auch Pilze wirksam sind.
Diskussion: Host Defense Peptide wie die Novispirine stellen so potentielle
Alternativen oder Ergänzungen zu den gegenwärtig klinisch eingesetzten
Antibiotika zur Therapie von Wundinfektionen mit multi-resistenten Keimen.
53
6.
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of the protegrin family by cDNA cloning. FEBS Lett. 346, 285-288
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/.
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich ganz besonders Herrn Professor Dr. med. Lars
Steinsträsser, Juniorprofessor für molekulare Wundheilung und Gentherapie
danken, der die vorliegende Arbeit sowohl im praktischen als auch im schriftlichen
Teil hervorragend betreut und unterstützt hat.
Ein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hans - Ulrich Steinau und Herrn Prof. Dr. Sören
Gatermann für die Rahmenbedingungen, die diese Promotionsarbeit ermöglicht
haben.
Außerdem möchte ich für die Hilfe bei der Durchführung der Doktorarbeit Dr. rer.
nat. Frank Jacobsen, Janine Mertens, Andrea Gerhards, Jürgen Beller, Alexander
Baraniskin, Kristina Drewermann, Tobias Hirsch und Dominik Mittler danken.
Ein besonderer Dank gilt der Medizinischen Mikrobiologie der Ruhr – Universität –
Bochum, besonders Frau Susanne Friedrich für die Hilfe und Unterstützung bei
der Durchführung der Experimente.
8.
Lebenslauf
Name:
Gottlieb Pazdzierny
Geburtsdatum:
16. 12. 1977
Geburtsort:
Kedzierzyn-Kozle, Polen
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
ledig
Schulische Ausbildung:
09. 1984 – 02. 1988
Grundschule in Kedzierzyn-Kozle (Polen)
02. 1988
Ausreise nach Deutschland
02. 1988 – 06. 1988
Grundschule in Unna
08- 1988 – 07. 1997
Gymnasium in Menden (Sauerland)
07.1997
Abitur
Hochschulausbildung:
10. 1998 – 04. 2005
Studium der Medizin an der Ruhr – Universität Bochum
04. 2004 – 04. 2005
PJ in den Augusta-Krankenanstalten Bochum
Wahlfach Neurologie im EVK Hattingen
07. 2001
Erstes Staatsexamen
06. 2004
Zweites Staatsexamen
04. 2005
Drittes Staatsexamen
05. 2005
Approbation
Beruflicher Werdegang:
10. 2005
Assistenzarzt
in
der
Abteilung
für
Allgemeine
Medizin,
Endokrinologie und Diabetologie in der Med. Klinik I, Prof. Dr. med. H. H. Klein,
BG Kliniken Bergmannsheil Bochum
Publikationen:
Medline gelistete Abstracts
1. Steinstraesser, L., Beller, J., Hirsch, T., Pazdzierny, G., Mittler, D.,
Lehnhardt, M.,
Druecke, D., Steinau, H. U.: Transient cutaneous gene
transfer in burns with liposomes or „naked“ DNA, Langenbeck’s Archives of
Surgery Vol 387 (5-6) Oct 2002, S265, A-148
2. May, P., Steinstraesser, L., Hermann, S., Lehnhardt, M., Hirsch, T.,
Pazdzierny,
G.,
Steinau,
H.
U.:
Dermisersatzstoffe
in
porcinen
Vollhautwunden. Konressband 2003, Springer Verlag Berlin, Heidelberg,
New York, ISBN 3-540-20002-9), 441-442.
3. Schneider, S., Pazdzierny, G., Klein, H. H. Oral antidiabetic therapy. Dtsch
Med Wochenschr. 2006 Dec;131 Suppl 8:S264-7. Review. German
4. Steinstraesser, L., Hirsch, T., Beller, J., Mittler, D., Sorkin, M., Pazdzierny,
G., Jacobsen, F., Eriksson, E., Steinau, H. U. Transient non-viral cutaneous
gene delivery in burn wounds. J Gene Med. 2007 Nov;9(11):949-55.
Kongressbeiträge
5. Steinstraesser L., Baraniskin, A., Pazdzierny, G., Lehnhardt, M., Steinau,
H.
U.:
Antimikrobielle
Verbrennungsmodel.
22.
Aktivität
von
Jahrestagung
humanen
der
Histonen
im
Deutschsprachigen
Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungsbehandlung (DAV), Rottach-Egern,
06.-09. Januar 2004
6. Steinstraesser, L., Baraniskin, A., Pazdzierny, G., Lehnhardt, M., Steinau,
H.
U.:
Antimikrobielle
Verbrennungsmodel.
22.
Aktivität
von
Jahrestagung
humanen
der
Histonen
im
Deutschsprachigen
Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungsbehandlung (DAV), Rottach-Egern,
06.-09. Januar 2004
7. Pazdzierny, G., Hirsch, T., Lehnhardt, M., Gatermann, S., Steinau, H. U,
Steinstraesser, L.: In vitro comparision of naturally occuring and „designer“
antimicrobial peptides with common antibiotics and antimycotics. Plastic
Surgery Research Council 48th Annual Meeting 23-26.4.2003, Las Vegas,
USA
8. Steinstraesser, L., Beller, J., Hirsch, T., Pazdzierny, G., Mittler, D.,
Lehnhardt, M.,
Druecke, D., Steinau, H. U.: Kutaner Gentransfer in
Verbrennungswunden mit Liposomen oder “Nackter” DNA 9. Jahrestagung
der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Gentherapie, 7-9.11.2002 Schloss
Reisensburg bei Günzburg
9. Jacobsen, F., Steinstraesser, L., Beller, J., Mertens, J., Hirsch, T.,
Pazdzierny, G., von Peter, S., Druecke, D., Steinau, H. U.: Transienter
kutaner Gentransfer mit Transfektionsreagenzien oder nackter DNA. 120
Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4.-2.5.2003 in München.
10. Pazdzierny, G., Steinstraesser, L., von Peter, S., Lehnhardt, M., Hirsch, T.,
Lehrer, R. I., Steinau, H. U.: In vitro Vergleich der Aktivität von natürlichen
und designer Antimikrobiellen Peptiden mit klinisch eingesetzten Antibiotika
und Antimykotika. 120 Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4.2.5.2003 in München.
11. Pazdzierny, G., Steinstraesser, L., May, P., Beller, J., Mittler, D., Hirsch, T.,
Steinau, H. U.: Biologisch abbaubare Implantate zur Auffüllung von
Weichgewebsdefekten. 120 Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie
29.4.-2.5.2003 in München.
12. May, P., Steinstraesser, L., Hermann, S., Lehnhardt, M., Hirsch, T.,
Pazdzierny,
G.,
Steinau,
H.
U.:
Dermisersatzstoffe
in
porcinen
Vollhautwunden. 120 Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie 29.4.2.5.2003 in München.
13. Steinstraesser, L., Beller, J., Hirsch, T., Pazdzierny, G., Mittler, D.,
Lehnhardt, M.,
Druecke, D., Steinau H. U.: Transient cutaneous gene
transfer in burns with liposomes or „naked“ DNA, 11. Chirurgische
Forschungstage, 27-29.11.2002 Universität Köln
14. Steinstraesser, L., Beller, J., Hirsch, T., Pazdzierny, G., Mittler, D.,
Lehnhardt, M.,
Druecke, D., Steinau, H. U.: Kutaner Gentransfer in
Verbrennungswunden mit Liposomen oder “Nackter” DNA 9. Jahrestagung
der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Gentherapie, 7-9.11.2002 Schloss
Reisensburg bei Günzburg.
15. Pazdzierny, G., Steinstraesser, L., von Peter, S., Überla, K., Steinau, H. U.:
In vitro Vergleich der Wirksamkeit und Zytotoxizität von natürlich
vorkommenden und “designer” antimikrobiellen Peptiden gegen HIV.
VDPC, 18-21.9.2002 in Heidelberg.
16. Pazdzierny, G., Steinstraesser, L., Hirsch, T., Beller, J., Steinau, H. U.: In
vitro Vergleich der Aktivität von Antimikrobiellen Peptiden mit klinisch
eingesetzten
Heidelberg.
Antibiotika
und
Antimykotika.
VDPC, 18-21.9.2002
in