Immunphänotypisierung von Lymphozyten bei Patienten mit nicht
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! Universitätsklinikum Ulm, Klinik für Anästhesiologie Prof. Dr. med. Dr. med. h.c. Michael Georgieff ! ! ! ! ! ! ! ! Immunphänotypisierung von Lymphozyten bei Patienten mit nicht-infektiösen bzw. infektiösen Entzündungsreaktionen, genauer mit Polytrauma, Sepsis, Hämophagozytischer Lymphohistiozytose, Langerhanszellhistiozytose und Overtrainingsyndrom ! ! ! ! ! ! ! Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm ! ! ! ! ! ! eingereicht von Lina Helena Brach ! 2014 ! Amtierender Dekan: ! ! ! ! ! erster Berichterstatter: ! ! ! ! ! zweiter Berichterstatter: ! ! ! ! ! Tag der Promotion: ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Prof. Dr. Thomas Wirth Prof. Dr. Manfred Weiß Prof. Dr. Markus Huber-Lang 14. November 2014 !II Inhaltsverzeichnis ! Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………… V ! 1 EINLEITUNG…………………………………………………………………. 1 ! 1. Immunologische Grundlagen……………………………………………........... 1 ! 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 Die Zellen der lymphatischen Reihe………………………………………….... 2 Natürliche Killerzellen (NK-Zellen)………………………………………………. 2 T-Zellen…………………………………………………………………………... 3 NK T-Zellen……………………………………………………………………..... 4 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 1.3.8 1.3.9 1.3.10 1.3.11 1.3.12 Oberflächenmarker der lymphatischen Zellreihe……….…………………....... 4 CD2………………………………………………………………………………. 5 CD80 und CD86…………………………………………………………............... 5 CD3………………………………………………………………………………. 5 CD56……………………………………………………………………………... 6 CD4………………………………………………………………………………. 6 CD8………………………………………………………………………………. 6 CD25……………………………………………………………………………... 7 CD11b……………………………………………………………………………. 7 CD28……………………………………………………………………………... 7 CD39……………………………………………………………………………... 8 CD244……………………………………………………………………………. 8 IL7R, CD127……………………………………………………………………… 8 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 Krankheitsbilder………………….……………………………………………... SIRS/Sepsis ……………………………………………………………………… Hämophagozytische Lymphohistiozytose (HLH)………………………………… Langerhans-Zell-Histiozytose (LCH)……………………………………................. Overtraining-Syndrom (OTS)….…………………………………………………. Polytrauma (PT)………………………...………………………………................. 9 9 9 10 11 11 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.1.6 Patientenkollektiv………………………………………………………………. Gesunde Probanden………………………………………………………............. HLH………………………………………………………………………….….. LCH………………………………………………………………………….…... Sepsis…………………………………………………………………………….. Overtraining (OTS)……………………………………………………….............. Polytrauma……………………………………………………………………….. 13 13 14 15 15 16 17 2.3 2.3.1 2.3.2 2.2.3 Messung………………………………………….…………………………….... Messmaterialien und Messgeräte………………………………………………….. Methodische Grundlagen der Immunphänotypisierung/FACS……………….…... Arbeitsablauf bei den einzelnen Messungen……………………………………..... 18 18 19 20 ! ! ! 1.5 Fragestellung……………………………………………………………………. 12 ! ! 2. MATERIAL UND METHODEN…………………………………………………. 13 ! ! ! ! !III 2.3 2.3.1 2.3.2 Statistik…………………………………………………………… …………….. 22 Ausreißerbewertung: Grubb´s Test………………………………………………... 22 Mann-Whitney U-Test………………………………………………........................ 22 2. 4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 Klinische Scores der Polytraumapatienten…………………………………...... ISS………………………………………………………………………………... SOFA- Score………………………………………………….………………....... SAPS -3……………………………………………….……………………............ Sepsis- Score………………………………….…………………………………... 23 23 23 23 24 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 Oberflächenmarker der T-Zellen…………………………………………......... Gesamtzahl der T- Zellen…………………………………………………............. Aktivierte T- Zellen……………………………………………………………..... NK- T- Zellen…………………………………………………………………..... 26 26 38 54 ! ! 3. ERGEBNISSE……………………………………………………………………….. 25 ! 3.1 Grubb’s Ausreißerbewertung…………………………………………………... 25 ! 3.2 Mann-Whitney-U-Test………………………………………………………..... 25 ! ! 3.4 ! 3.5 ! Oberflächenmarker von T- und NK-Zellen…………………………………… 56 Oberflächenmarker der NK-Zellen…………………………………………...... 68 5. 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 Klinische Scores der Polytraumapatienten…………………………………...... ISS………………………………………………………………………………... SOFA- Score……………………………………………………………………... SAPS -3…………………………………………………………………................. Sepsis- Score……………………………………………………………………… 76 76 77 78 79 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 Methodische Aspekte………………………………………………………….... 83 Patientenkollektiv………………………………………………………………… 83 Statistik………………………………………………………………….................. 83 Experimentelle Methodik………………………………………………………..... 84 4.2 4.2.1 Inhaltliche Aspekte……………………………………………………………... 86 Diskussion der Auffälligkeiten der einzelnen Oberflächenmarker……...………...... 86 ! 6. Zusammenfassung der Ergebnisse…………………………………………...... 80 ! ! 4. DISKUSSION………………………………………………………………………… 83 ! ! ! 4.3 Schlussfolgerung………………………………………………………………... 101 ! ! 5. ZUSAMMENFASSUNG……………………………………………………………...103 ! ! 6. LITERATURVERZEICHNIS………………………………………………………106 ! ! !IV Abkürzungsverzeichnis ! ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat APC Antigen-präsentierende Zellen BCR B- Zellrezeptor BWK Brustwirbelkörper CARS Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome CCR7 Chemokine (C-C motif) Receptor 7 CD Cluster of Differentation CIK Cytokine-induced Killer Cells CTL Cytotoxic T-Lymphocytes CTLA Cytotoxic T lymphocyte Associated Antigen DAMP Danger Associated Molecular Patterns DPBS Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FACS Fluorescence-activated Cell Sorting FCS Fetales Kälberserum FITC Fluorescein Isothiocynate FSC Forward Scatter GCS Glasgow Coma Scale GM-CSF Granulocyte-Makrophage-Colony Stimulating Factor HLA Human Leukocyte Antigen HLDA Human Leukocyte Differentation Antigen HLH Hämophagozytische Lymphohistiozytose IAHS Infektion- assoziertes Hämophagozytisches Syndrom IFN Interferon IL Interleukin ISS Injury Severity Score ITAM Immunoreceptor Tyrosin-based Activation Motif KIR Killer Cell Immunoglobulin-like Receptor KLRF1 Killer Cell Lectin like Receptor Subfamily F, Member 1 LC Langerhans Cells LCH Langerhans Cell Histiozytosis Lck Lymphozcyte-specific Protein Tyrosin Kinase LFA Leukocyte Function-associated Antigen !V LPS Lipopolysaccharide LWK Lendenwirbelkörper MAS Macrophage Activation Syndrome MHC Major Histocompatibility Complex MFI Mean Fluorescence Index MODS Multiple Organ Dysfunction Syndrome MYBL1 Myeloblastosis Oncogene-like 1 NCAM Neural Cell Adhesion Molecule NK-Zellen Natürliche Killerzellen NK-T-Zellen Natürliche Killer T-Zellen NTDPase Nucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase OTS Overtraining Syndrome PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns PE Phycoerythrin PT Polytrauma RPM Revolutions per Minute SAB Subarachnoidal Blutung SAPS Simplified Acute Physiology Score SHT Schädel- Hirn- Trauma SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome SLAM Signaling Lymphocyte Activation Molecule SOFA Sequential Organ Failure Assessment SSC Sideward Scatter TH T-Helferzelle TCR T- Zellrezeptor TCRA T Cell Receptor α Subunit TGFBR3 TGF-β Receptor III Subunit TNF Tumornekrosefaktor ! ! ! ! ! ! !VI Einleitung 1. 1! Einleitung In der vorliegenden Arbeit wird das Oberflächenmarkermuster einer Untergruppe der weißen Blutkörperchen, der Lymphozyten, bei den Krankheitsbildern Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS), Sepsis, Polytrauma, Hämophagozytischer Lymphohistiozytose (HLH), Langerhans- Zell- Histiozytose (LCH), Sportlern, Sportlern mit Overtraining Syndrom (OTS) und polytraumatisierten Patienten untersucht. Bei diesen Krankheitsbildern sind Störungen der Lymphozyten bekannt. Unklar ist jedoch, welche Oberflächenmarker der Lymphozyten bei diesen Krankheitsbildern verändert sind und ob sich die einzelnen Krankheitsbilder anhand ihrer spezifischen Oberflächenmarkermuster voneinander unterscheiden lassen. ! 2. Immunologische Grundlagen Das Immunsystem des Menschen ist ein hoch entwickeltes, komplexes System, das mittels einer Vielzahl von Wechselwirkungen versucht, den Körper vor schädigenden Einflüssen zu schützen und maligne Zellen zu beseitigen. Klassisch ist die Einteilung des Immunsystems in das angeborene oder unspezifische Immunsystem sowie das adaptive oder spezifische Immunsystem. Das angeborene Immunsystem setzt sich aus chemisch-physikalischen Faktoren wie Haut oder Schleimhaut als Barriere und humoralen sowie zellulären Komponenten zusammen. Humorale Faktoren sind unter anderem Zytokine, Akut-Phase-Proteine und das Komplementsystem. (Schütt u. Bröcker 2009) Zu den zellulären Faktoren zählen neutrophile Granulozyten, Makrophagen und Natürliche Killerzellen. Bereits beim ersten Anzeichen einer Infektion oder auch einer Verletzung reagieren sowohl humorale als auch zelluläre Komponenten direkt auf die möglichen mikrobiellen Krankheitserreger und deren pathogenassozierten molekularen Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), aber auch auf körpereigene endogene Alarmins oder DAMPs (danger associated molecular patterns). (Xu et al. 2009; Zhang et al. 2010) Zum adaptiven Immunsystem gehören die Antigen-präsentierenden Zellen (APC), die T-Zellen, sowie die B-Zellen. Die T-Zellen vermitteln mit Hilfe der APC die zelluläre Abwehr, die B-Zellen die humorale Abwehr. Bei Antigenkontakt werden sowohl Tals auch B-Zellen aktiviert. Sie proliferieren und differenzieren sich mittels somatisch rekombinierter Rezeptoren (T-cell-receptor (TCR), B-cell-receptor (BCR)) zu antigenspezifischen Effektorzellen, die nun antigenspezifisch auf die Erreger reagieren können. Neben Effektorzellen entstehen gleichzeitig Gedächtniszellen, welche bei erneuter Exposition zu einer schnelleren bzw. verstärkten Immunantwort führen. Erst das Zusammenspiel von angeborenem und adaptivem Immunsystem ermöglicht so eine umfassende Immunabwehr. (Schütt u. Bröcker 2009) ! Einleitung 1.2 2! Die Zellen der lymphatischen Reihe Alle Zellen des Immunsystems stammen von pluripotenten Stammzellen ab, welche sich in die myeloische Reihe (Monozyten und neutrophilen Granulozyten) und die lymphatische Reihe (T-Zellen, B-Zellen, Natürliche Killerzellen) differenzieren. (Orkin u. Zon 2008) Der Fokus dieser Arbeit liegt bei den Zellen der lymphatischen Reihe, also den Lymphozyten. Es sollen hier insbesondere die Natürlichen Killerzellen und die T-Zellen mit ihren spezifischen Oberflächenrezeptoren betrachtet werden. ! 1.2.1 Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) NK-Zellen sind große, granuläre Lymphozyten, welche eine wichtige Rolle bei der Immunantwort bei viralen Infekten und Tumoren spielen. (Liu et al. 1995) Die NK-Zellen entstehen aus lymphatischen Vorläuferzellen im Knochenmark und zirkulieren dann im peripheren Blutkreislauf. Sie machen etwa 2 bis 18% der Lymphozyten im peripheren Blut aus und sind Zellen der angeborenen Immunität, sind also vor allem an der frühen Immunantwort beteiligt. (Vivier et al. 2008) NK-Zellen haben im Gegensatz zu den anderen Lymphozyten keine antigenspezifischen Rezeptoren, sie besitzen aber aktivierende und inhibierende Rezeptoren wie beispielsweise die KIRs (killer cell immunoglobulin-like receptors). Die inhibierenden Rezeptoren der NK-Zellen binden an die MHC I- Allele der körpereigenen, gesunden Zellen. Im Normalfall sind die NK-Zellen so also inhibiert. Verlieren nun Zellen etwa im Zuge von Viruserkrankungen oder Tumoren einzelne MHC I- Allele oder exprimieren diese vermindert („missing self recognition“), werden einzelne NK-Zellen enthemmt. Exprimieren die betroffenen Zellen zusätzlich auch noch einen Liganden der aktivierenden NK-Rezeptoren, etwa weil sie „gestresst“ („stress-induced self recognition“) oder von einem Pathogen befallen sind („nonself recognition“), so leiten die NK-Zellen schließlich die Lyse der betroffenen Zelle ein. (Walzer et al. 2005) Die Fähigkeit der NKZellen Targetzellen ohne vorherige Sensibilisierung schnell und effektiv zu bekämpfen, hilft dem Körper dabei auch Zellen zu eliminieren, welche den zytotoxischen T-Zellen entgehen würden. (Bryceson u. Long 2008) NK-Zellen exprimieren CD2, CD16, CD56 und CD57 sowie CD8 und CD11b. (Pichler u. Peter 2006) Entsprechend ihrer CD56Oberflächenexpression lassen sich die NK-Zellen in zwei Gruppen mit unterschiedlichen Eigenschaften unterteilen: CD 56bright sowie CD 56dim. Etwa 90% der NK-Zellen des peripheren Blutes sind CD 56dim CD16 positiv. Sie exprimieren kaum CD56Oberflächenmoleküle, dafür zahlreiche CD16-Oberflächenmoleküle. Außerdem besitzen sie CXCR1 sowie ChemR Rezeptoren, welche eine wichtige Rolle bei der Lyphozytenmigration bei Inflammation spielen. CD 56dim NK-Zellen sind der zytotoxische Anteil der NK-Zellen. Die CD 56bright CD16 negativen NK-Zellen stellen den Hauptanteil der NK-Zellen in Lymphknoten und Tonsillen. Ihr CCR7 Rezeptor stellt sicher, dass sie sich vornehmlich im Einleitung 3! lymphatischen Gewebe aufhalten. Sie produzieren nach Stimulation durch Zytokine (IL-12, IL-15 und IL-18) sowie Interferone (IFN-α/IFN-β) der Monozyten massenhaft selbst Zytokine wie IFN-γ, TNF- β, IL-10, IL-13 sowie GM-CSF und wirken so vor allem immunmodulatorisch. (Vivier et al. 2008) ! 1.2.2 T-Zellen T-Lymphozyten spielen eine zentrale Rolle in der Immunantwort. Sie sind bei Autoimmunität, Allergie, Immundefizienz und lymphoproliferativen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Der Großteil der T-Zellen entwickelt sich aus lymphogenen Vorläuferzellen im Thymus, hier reifen sie zu typischen T-Zellen heran. Nach zufälligem „Rearrangement“ erwerben die Vorläufer T-Zellen entweder einen αβ-TCR (TCR2) oder einen γδ-TCR (TCR1). Beide Rezeptoren sind Heterodimere, welche sich allerdings in ihren Polypeptidketten unterscheiden. Die T-Zellrezeptoren (TCR) sind jeweils mit fünf Polypeptiden, dem CD3Komplex, gekoppelt und erst so funktionsfähig. Der Großteil der zirkulierenden T-Zellen (> 95%) besitzt einen TCR2-Rezeptor. (Call u. Wucherpfennig 2005) Diese TCR2 tragenden TZellen lassen sich weiter in zwei Hauptgruppen einteilen. Zum einen in regulatorische CD4+ T-Helfer-Zellen, welche die B-Zellantwort sowie andere Immunzellreaktionen modulieren und MHC-Klasse II assoziierten Antigene auf professionellen APCs erkennen. Sie machen etwa 55-70% der zirkulierenden T-Zellen aus. Die T-Helferzellen lassen sich weiter einteilen in Th0-Zellen, welche vor allem zu Beginn einer Immunreaktion reagieren und ein sehr breites Zytokinmuster sezernieren (z.B. IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ, TNF-α, IL-10). Bei längerer Aktivierung reifen die Th0-Zellen zu Th1 bzw. Th2-Zellen heran, diese haben ein eingeschränkteres Zytokinmuster. Th1-Zellen aktivieren mittels IFN-γ und TNF-α vor allem Makrophagen, wohingegen Th2 über IL-4 zu starker IgE und IgG-Bildung führen und über IL-5 die eosinophile Entzündungsreaktion unterstützen. Zum anderen gibt es die zytotoxischen CD8+ T-Zellen, welche Peptide auf MHC-Klasse I, also zelleigene Peptide, erkennen. Bei fehlender Toleranz gegenüber dem Peptid und zusätzlicher Stimulation von THelfer-Zellen bzw. einem zusätzlichen Gefahrensignal leiten sie die Zelllyse ein. Sie machen etwa 30-40% der zirkulierenden T-Zellen aus. (Pichler u. Peter 2006) Alle T-Zellen im peripheren Blut exprimieren CD2, CD3, CD5 und CD28 Antigene. Ihre TCR, CD4 und CD8 Moleküle variieren hingegen je nach Subpopulation. Wichtige Aktivierungsmarker der TZellen sind CD69, CD40-Ligand, CD28, CD25 und CD4RO. (Aster u. Bonilla 2010) ! 1.2.3 NK T-Zellen NK-T-Zellen sind eine Subpopulation der T-Zellen. Ihren Namen tragen sie, da sie außer dem typischen T-Zellrezeptor auch noch NK-Zelltypische Oberflächenmarker besitzen. Die NKT-Zellen tragen entweder CD4 (CD4+NK-T-Zellen) oder exprimieren dieses nicht (CD4- Einleitung 4! NK-T-Zellen). Sie erkennen MHC-I-ähnliche CD1d-Moleküle und schütten nach Aktivierung große Mengen an Zytokinen aus. Die ausgeschütteten Zytokine sind bei CD4+ NK-T-Zellen vornehmlich IFN-γ und IL-4. Diese stimulieren die B-Zellaktivierung und wirken antiinflammatorisch. Außerdem wird vermehrt IL-10 sezerniert, welches ebenfalls antiinflammatorisch wirkt und die Makrophagenaktivierung hemmt. (Eger et al. 2006; Coquet et al. 2008) Das von den CD4+ NK-T-Zellen sezernierte IL-4 induziert zudem eine vermehrte Umwandlung von Th0 Zellen in Th2 Zellen. Dieser regulatorische Zelltyp hat eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der peripheren Toleranz und der Modulation der Immunreaktion. (Koreck et al. 2002) CD4- NK-T-Zellen produzieren hingegen vornehmlich TH1-Zytokine, also IFN-γ und TNF. Allerdings konnte bei ihnen auch eine heftige IL-17 Ausschüttung beobachtet werden. Damit wirken sie pro-inflammatorisch. (Eger et al. 2006; Coquet et al. 2008) ! 1.3 Oberflächenmarker der lymphatischen Zellreihe Lymphozyten sind morphologisch nicht voneinander abgrenzbar. Abhängig von ihrem Reifungs- bzw. Aktivierungsgrad exprimieren die Zellen des Immunsystems aber eine Vielzahl verschiedener Oberflächenmoleküle, anhand derer sie sich unterscheiden lassen. Mit speziellen monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch an einen ganz bestimmten Oberflächenmarker binden, werden Immunzellen markiert und mittels der Immunphänotypisierung sichtbar gemacht. So können einzelne Immunzellsubpopulationen unterschieden und dargestellt werden. (Schütt u. Bröker 2009) Als international gültige Bezeichnung der Oberflächenmoleküle hat sich die CD-Nomenklatur bewährt. Bestimmte Oberflächenmarker, welche einen bestimmten Antikörper binden, werden hier als „cluster of differentiation“ (also als Unterscheidungsgruppen) zusammengefasst und nummeriert. So lassen sich beispielsweise T-Helferzellen und CTL dadurch unterscheiden, dass T-Helferzellen CD4+ sind, wohin gegen CTL CD8 exprimieren. Die CD-Nomenklatur wird von der Human-Leukocyte-Differentiation-Antigens (HLDA)- Konferenz regelmäßig aktualisiert und erweitert. Bislang wurden über 300 Cluster ermittelt und aufgenommen. (Zola et al. 2005) ! Im Folgenden werden die speziellen Oberflächenmarker, welche in dieser Arbeit analysiert wurden, kurz vorgestellt. ! ! ! ! Einleitung 1.3.1 5! CD2 Der CD2 Marker, auch E-Rosettenmarker, leukocyte function-associated antigen-2 (LFA2) oder T11-Rezeptor, ist ein Adhäsionsmolekül auf der Oberfläche von 95 % der T-Zellen. Er ist außerdem auf NK-Zellen zu finden. (Sotsios et al. 2000) Der Rezeptor besteht aus zwei Igähnlichen extrazellulären Domänen, einer membrandurchspannenden Domäne und einer positiv-geladenen zytoplasmatischen Domäne. (Davis u. Van der Merwe; 1996) Er interagiert mit anderen Adhäsionsmolekülen, wie beispielsweise dem lymphocyte function-associated antigen-3 (LFA3/CD58) der Antigen-präsentierenden Zellen, damit können T-Zellen auch auf niedrigste Antigenkonzentrationen reagieren. (Wilkins et al. 2003) Zudem ist er als kostimulatorisches Molekül auf T-Zellen aktiv und regt diese zur Zytokinproduktion an. Er reguliert die T- und NK- Zell-induzierte Zytolyse und inhibiert die Apoptose aktivierter peripherer T-Zellen. (Yang et al. 2001) ! 2. CD80 und CD86 CD80 (auch B7-1) und CD86 (auch B7-2) sind Proteine, welche von professionellen APC exprimiert werden. Außerdem werden sie auch von aktivierten T-Zellen exprimiert. (Pichler u. Peter 2006) Damit eine ruhende T-Zelle aktiviert wird, benötigt sie neben der TCR-MHCInteraktion, noch ein weiteres kostimulatorisches Signal. Dieses zweite Signal ist die Interaktion des CD28-Moleküls auf T-Zellen mit CD80 oder CD80-ähnlichen Molekülen (CD86) auf den APC. Fehlt dieses Signal, ignoriert die T-Zelle das vom MHC präsentierte Antigen und reagiert nicht („non-responsiveness“). (Linsley u. Ledbetter 1993) Neben CD28 bindet CD80 bzw. CD86 auch an das cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 (CTLA4). Dieses wird etwa 12 bis 24 Stunden nach der T-Zellaktivierung auf T-Zellen exprimiert. Die Bindung zwischen CD80 bzw. CD 86 und CTLA4 ist sehr viel affiner als die Bindung von CD80 bzw. CD 86 zu CD28. Wird CD80 bzw. CD 86 an CTLA4 gebunden, wird die Transkription des T-Zell-Wachstumsfaktors IL-2 gehemmt und zusätzlich ein inhibitorisches Signal an die T-Zelle vermittelt, die Immunantwort wird somit reguliert. (Stamper et al. 2001) ! 1.3.3 CD3 CD3 (auch T3) ist spezifischer Marker der T-Zellen. Er wird von allen Thymozyten und reifen T-Zellen exprimiert. Er bildet mit dem TCR einen Komplex, erst so wird der TCR überhaupt auf T-Zellen exprimiert und die Antigenerkennung und Signaltransduktion ermöglicht. Das CD3 Molekül scheint dabei aus mindestens sechs Peptiden zu bestehen, welche drei Dimere bilden, εγ, εδ und ζζ. (Yang et al. 2005) Somit besteht ein CD3 Molekül aus den drei Modulen CD3 δ/ε, CD3 γ/ε und CD3 ζζ. Alle CD3 Subtypen haben einen sogenannten ITAM (immunoreceptor tyrosin-based activation motif) intrazytoplasmatisch. Bei Ligandenbindung Einleitung 6! an den TCR wird der ITAM mittels Phosphorylierung aktiviert und setzt die Signaltransduktionskaskade in den T-Zellen in Gang. (Fischer et al. 2005) ! 1.3.4 CD56 CD56 (auch NKH-I) ist eine Isoform des neuralen Adhäsionsmoleküls NCAM und wird auf NK-Zellen exprimiert. Außerdem findet sich CD56 auch auf den sogenannten cytokineinduced killer cells (CIK), welche CD56 und CD3 positiv sind und damit eine Untergruppe der NK T-Zellen darstellen. (Fu et al. 2012) Auch Neuronen, Gliazellen und Thyreozyten exprimieren CD56. Es zählt zu den Typ-I-Transmembran-Glykoproteinen mit dem NCAMGlykoprotein als extrazelluläre Domäne, gehört also zu den Adhäsionsmolekülen und ist im ZNS für Zell-Zell-Adhäsion sowie Neuritenaussprossung verantwortlich. (Vargas et al. 1994) ! 1.3.5 CD4 CD4 ist ein Glykoprotein, welches sich auf einigen T-Zellen, Monozyten und Makrophagen, sowie auf dendritischen Zellen findet. Es ist typischer T-Helferzellen Marker. CD4 besitzt vier extrazelluläre Domänen (D1-4) wobei D1 mit der β2-Untereinheit der MHC Klasse II Moleküle interagiert. Außerdem hat der Marker noch einen intrazellulären kurzen Teil (C) welcher eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielt. CD4 ist also ein wichtiger KoRezeptor des TCR, der sowohl selbst an MHC Klasse II Moleküle bindet und gleichzeitig bei Antigenerkennung von TCR mittels seines intrazellulären Anteils über die Tyrosinkinase Lck die Signalkaskade zur T-Zellaktivierung in Gang setzt. (Barcley et al. 1993; Brady et al. 1993) ! 1.3.6 CD8 CD8 ist vor allem auf zytotoxischen T-Zellen zu finden, wird aber auch von einigen NKZellen und dendritschen Zellen exprimiert. Er besteht aus zwei Disulfid-verbundenen Ketten, welche zumeist als Heterodimer mit je einer α-Kette und einer β-Kette (CD8αβ) vorliegen. Es finden sich allerdings auch Homodimere mit je zwei α-Ketten (CD8αα) vor allem bei intraepithelialen Lymphozyten. Die extrazelluläre α-Kette des CD8 bindet an die α3Untereinheit des MHC Klasse I Moleküls der Zielzelle und schafft so eine enge Verbindung zwischen Zielzelle und T-Zelle. (Devine et al. 1999) Die intrazelluläre Domäne von CD8 induziert über Lck die Signalweiterleitung in der aktivierten T-Zelle. Die Bindungsaffinität von CD8 an MHC Klasse I Moleküle ist zwar geringer ausgeprägt als die von TCR, allerdings ist sie sehr viel schneller aufgebaut. CD8 ist also ebenso wie CD4 ein idealer Ko-Rezeptor für den TCR/CD3-Komplex auf T-Zellen. (Van de Merwe u. Davis 2003) ! ! ! Einleitung 1.3.7 7! CD25 CD25 ist ein Typ I Transmembranmolekül, welches die α-Kette des IL2-Rezeptors bildet. Dieser Rezeptor wird von aktivierten T und B-Zellen exprimiert. Zusammen mit der β-Kette (CD122) ist CD25 für die Bindung von IL-2 an den Rezeptor zuständig. (Wang et al. 2005) IL-2 ist wichtig für die Proliferation und Aktivierung von Lymphozyten. Daher führt eine CD25-Defizienz bzw. das Fehlen funktionsfähiger IL2-Rezeptoren zu einer verminderten Aktivierung und klonaler Expansion von T-Zellen. (Bonilla u. Geha 2003) Neben seiner Funktion bei Aktivierung und Proliferation von T-Zellen, scheint CD25 auch bei der Regulation der Immunantwort eine wichtige Rolle zu spielen. So fungieren vor allem eine Subpopulation von CD4+/CD25+ T-Zellen als regulatorische T-Zellen und verhindern ein Überschießen der Immunantwort. (Szanya et al. 2002; Kukreja et al. 2002) ! 1.3.8 CD11b CD11b gehört zur Familie der Integrine und bildet mit CD18 das Heterodimer CR3. CD11b findet sich auf der Oberfläche von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen, NK-Zellen sowie auf einigen Milz- und Knochenmarkszellen. CD11b ist wichtiger Regulator bei Adhäsion und Migration von Leukozyten. Als einzelnes Protein scheint CD11b dabei vor allem für die Adhäsion zuständig zu sein, für die Migrationsregulation muss es als Komplex mit CD18 vorliegen. CD11b fungiert zudem als Rezeptor für Komplement C3bi und spielt daher bei der Phagozytose komplementmarkierter Partikel eine Rolle. (Kawai et al. 2005) ! 1.3.9 CD28 CD28 wird von etwa 90% aller CD4+ und 50% aller CD8+ T-Zellen exprimiert. Es ist für die Aktivierung von T-Zellen unerlässlich. Sowohl die Antigen- abhängige Stimulierung von T-Zellen über CD3/TCR als auch der Antigen- unabhängige Aktivierungsweg über CD2 benötigen CD28 als Kostimulator. Natürliche Liganden von CD28 sind B7.1 und B7.2. Erst bei Bindung von CD80 bzw. CD86 an CD28 reagieren T-Zellen auf Antigenpräsentation und leiten gegebenenfalls eine Abwehrreaktion ein. (Sotsios et al. 2000) Signale über CD28 steigern außerdem die IL-2-abhänige T- Zellproliferation und die Zytokinproduktion der TZellen. Außerdem regt CD28 die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1 und Th2 Zellen an. (Zdolsek u. Jenmalm 2003) 1.3.10 CD39 CD39 (auch NTDPase-1= ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) ist ein integrales Membranprotein. Es wird von Endothelzellen, Monozyten und Makrophagen, PMN, B-Zellen und einigen wenigen T-Zellen und NK-Zellen exprimiert. (Pulte et al. 2007) CD39 ist wichtiger Inflammationsinhibitor und Thrombozytenaggregationsregulator. Nach Gefäßschädigung oder bei Entzündungsprozessen kommt es vermehrt zur ATP- und ADP- Einleitung 8! Ausschüttung. CD39 hydrolysiert nun extrazellulär diese Nukleotide zu AMP und wirkt so anti-inflammatorisch und anti-thrombotisch. (Atkinson et al. 2006) ! 1.3.11 CD244 CD 244 (auch 2B4) wird auf der Oberfläche ruhender aber auch aktivierter NK-Zellen, auf etwa der Hälfte der CD8+ T-Zellen und wenigen CD4+ T-Zellen, sowie Monozyten, Makrophagen und Granulozyten exprimiert. Die zytoplasmatische Domäne von CD244 besteht aus Tyrosinmotiven (TxYxxV/I), welche mit dem SLAM (signaling lymphocyte activation molecule)-assozierten Protein assoziert sind. Die Funktion von CD244 ist besonders bei NK-Zellen beschrieben. Hier ist CD244 ein wichtiger, hochaffiner Ligand für CD48. Bindet dieses an CD244 kommt es zu einer Steigerung der Zellzytotoxizität, INF-γ Sekretion und Invasion von NK-Zellen. CD244 spielt so eine wichtige Rolle bei der MHCunabhängigen NK-Zellaktivität. (Boles et al. 2001) ! 1.3.12 IL7R Der IL7-Rezeptor ist Mitglied der Hämatopoetin- Familie und liegt sowohl als Membranprotein, als auch in löslicher Form (soluble IL7-R) vor. Exprimiert wird der Rezeptor sowohl von T-Zellen als auch von Makrophagen. Bei Bindung des Liganden IL7 an den Rezeptor wird die Oberflächenexpression herunterreguliert. (Palmer et al. 2008) IL7 reguliert sowohl die Proliferation als auch das Überleben von T-Zellen, sowohl im Thymus als auch peripher. Im Thymus wird es in großen Mengen von ruhenden Stromazellen produziert und reguliert hier das Überleben naiver T-Zellpopulationen. Aber auch peripher spielt IL7 und der IL7R eine wichtige Rolle. Hier wird die homöostatische Zirkulation naiver und memory TZellen, deren Proliferation und ihr Überleben reguliert, (Fry u. Mackall 2005) da IL7 auch anti- apoptotische Wirkung hat. (Beq et al. 2004) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Einleitung 1.4 9! Krankheitsbilder Im Folgenden sollen die für diese Arbeit untersuchten speziellen Krankheitsbilder kurz charakterisiert werden. Bei all diesen Krankheitsbildern gibt es Hinweise, dass die lymphozytäre Zellpopulation von pathophysiologischer Bedeutung ist. ! 1.4.1 SIRS/Sepsis SIRS (systemic inflammatory response syndrome) resultiert aus einem Übergreifen einer ehemals lokalisierten Entzündungsreaktion nicht-infektiöser Genese wie beispielsweise Trauma oder Pankreatitis auf den gesamten Organismus. Besteht zusätzlich noch eine dokumentierte Infektion spricht man von einer Sepsis. Sowohl bei dem SIRS als auch bei der Sepsis ist also nicht nur ein bestimmter Körperbereich von Entzündung betroffen, sondern der gesamte Organismus und auch eigentlich gesundes Gewebe ist involviert. Besonders zu Anfang lässt sich eine starke Hyperinflammation im Körper beobachten. Es werden zahlreiche pro-inflammatorische Mediatoren freigesetzt und sehr viele Immunzellen aktiviert. Gleichzeitig treten aber auch anti-inflammatorische Prozesse in Kraft, (compensatory antiinflammatory response, CARS). (Marshall 2001) Physiologischerweise versucht der Organismus so, invasive Pathogene zu eliminieren (Proinflammation) und gleichzeitig lokale und systemische Gewebeschädigung möglichst zu regulieren (Antiinflammation). Die spezifische Immunantwort ist dabei abhängig vom auslösenden Pathogen (Erregerlast und Virulenz) und den genetischen Charakteristika sowie möglichen bereits bestehenden Komorbiditäten des Patienten. Gerät die Immunantwort angesichts besonders pathogener Krankheitskonstellationen aus dem Gleichgewicht, kommt es zu einem Überschießen der Immunantwort. Dabei scheinen pro-inflammatorische Reaktionen für die systemische Gewebeschädigung und anti-inflammatorische Gegenregulation für die vermehrte Anfälligkeit für Zweitinfektionen bei der schweren Sepsis verantwortlich. (Angus u. Van der Poll 2013) Bei der Immunantwort septischer Patienten kann der hyper-inflammatorische Anteil überwiegen, andere Patienten erscheinen wiederum eher immunsupprimiert. Hier überwiegen hypoinflammatorische Prozesse. Die Sepsis ist also kein gleichförmiges Krankheitsbild, sondern zeigt sich in ihrem Verlauf unterschiedlich. (Muller Kobold et al. 2003) Die im Organismus während der Sepsis ablaufenden Leukozytenveränderungen lassen sich mittels Durchflusszytometrie gut erfassen. (Woehrle et al. 2008) ! 1.4.2 Hämophagozytische Lymphohistiozytose (HLH) Die HLH ist eine seltene Erkrankung des Immunsystems, welche zumeist außerordentlich schwere Verläufe zeigt. Es kommt zu einer überschießenden, ineffektiven Immunantwort mit sehr hohen Zytokinleveln, welche zu klinischen und hämatologischen Problemen führt. Die Überaktivierung von insbesondere T-Zellen, aber auch Makrophagen, scheint auf einer Einleitung 1! 0 Fehlfunktion von zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen zu beruhen. Patienten mit HLH zeigen ein charakteristisches Krankheitsbild mit Fieber, Hepatosplenomegalie, Zytopenie, Hypofibrinogenämie, Hyperglyceridämie und erhöhtem Serumferritin. (Arceci 2008) Dieses Krankheitsbild ist dem des SIRS sehr ähnlich und führt ohne Behandlung schließlich zum Tode. (Kumar et al. 2006) Es lassen sich die angeborene (primäre, familiäre) Form mit genetischen Defekten von der erworbenen (sekundären) Form unterscheiden. Bei der angeborenen Form lassen sich genetische Defekte identifizieren, welche zu einer Funktionsbeeinträchtigung von NK- und T- Zellen führen. Die erworbene Form ist meist infektionsassoziiert (IAHS), kommt aber auch ver mehrt bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie z.B. Rheuma oder auch bei Malignompatienten vor. Sowohl bei der angeborenen als auch der erworbenen Form führt eine verstärkte Aktivierung und Proliferation von Lymphozyten und Makrophagen zu einer erhöhten Ausschüttung von proinflammatorischen Mediatoren vor allem Zytokinen (IFN-γ, TNF-α, sCD25, IL-1, IL-6 sowie IL-8) und einer überschießenden Immunantwort. Im Verlauf der Krankheit kommt es zunehmend zur Phagozytose von Blutzellen und deren Vorläufern. (Janka 2007; Créput et al. 2008) ! 1.4.3 Langerhans-Zell-Histiozytose (LCH) Die LCH gehört zur Gruppe der Histiozytosen. Sie geht mit einer Infiltration dendritischer Zellen in verschiedenen Organen und Geweben einher. (Favara et al. 1997) Es sind allerdings nicht die typischen Langerhans-Zellen der Haut, welche Organe infiltrieren, sondern myeloide dendritische Zellen, welche dieselben Antigene (CD1a, CD207) exprimieren. (Allen et al. 2010) Zusätzlich präsentieren LC in LCH- Läsionen den Monozytenmarker CD14, welcher bei normalen LC der Haut nicht gefunden wird. Es sind unreife dendritische Zellen, welche im Gegensatz zu reifen LC sehr wenig Antigen präsentieren. (Geissmann et al. 2001) Es wird eine gestörte interzelluläre Kommunikation zwischen den Effektorzellen, vor allem T-Zellen und den professionellen APC (hier den Langerhans-Zellen) diskutiert. (Schmitz u. Favarra 1998) Dies untermauern auch Genexpressionsexperimente, welche zeigen, dass vor allem Osteopontin und andere Gene, welche T-Zellen rekrutieren und aktivieren hochreguliert sind. Besonders die regulatorischen T-Zellen scheinen bei der LCH vermehrt zu expandieren. (Senechal et al. 2007) Die LCH lässt sich in eine frühe Form, welche bereits in der Kindheit auftritt und eine späte Form im Erwachsenenalter einteilen. Weiterhin unterscheidet man bei der LCH, ob lediglich ein Organ befallen ist (meist Haut, Knochen oder Lymphknoten) oder ob eine systemische Krankheit mit diffusem Organbefall bzw. Befall sogenannter RisikoOrgane wie Leber, Lunge, Milz, Knochenmark, vorliegt. (Broadbent et al. 1994) ! ! Einleitung 1.4.4 1! 1 Overtraining-Syndrom (OTS) Das OTS äußert sich in einer Vielzahl von Symptomen, welche auf eine Maladaption an die Trainingsanforderungen hinweisen. Typisch sind schnellere Ermüdbarkeit und verminderte Leistungsfähigkeit in Trainingsperioden. Unter intensivem Training weist der Körper höhere Stresslevel auf, an die er sich aber im Normalfall adaptiert und diese dann auch toleriert (overload training). Neben dem durch körperliches Training erzeugtem Stress wirken sich auch Faktoren wie Wachstum bei Jugendlichen, Infektionen, Verletzung, aber auch psychische Verfassung auf das Stresslevel aus. Geraten nun Stresslevel und erforderliche Regenerationszeit aus dem Gleichgewicht, kommt es zum OTS. Typische Symptome sind veränderter Ruhepuls, Schlaflosigkeit, vermehrtes Schwitzen, emotionale Instabilität und schnelle Ermüdbarkeit. Gewohnte Trainingsanforderungen können nicht mehr eingehalten werden. Auch im Labor zeigen sich typische Veränderungen. Es kommt zu einer Erhöhung von Serum-Urea/Uricacid und Cortisol sowie einer Erniedrigung von Eisen und Ferritin bei normalem Hämatokrit. Die Anzahl von CD3, CD4, CD8 und NK-Zellen sinkt. (Pearce 2002) ! 1.4.5 Polytrauma (PT) Auch nach Polytrauma ist das Immunsystem des Körpers massiv beeinträchtigt. Direkt nach dem schweren Trauma (first hit) kommt es zumeist zur Entwicklung einer systemischen Entzündungsreaktion (SIRS). Besonders pro-inflammatorische Entzündungsmediatoren wie TNF, IL-1, IL-6 und IL-8 werden ausgeschüttet. (Faist u. Wichmann 1997) Letztendlich kann dies zu einer erheblichen Gewebeschädigung führen, welche im schlimmsten Fall zum Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) führt. Das MODS ist nach wie vor eine der schwerwiegendsten Komplikationen bei Polytrauma. Obwohl die Mortalität in den letzten Jahren deutlich gesunken ist, ist die Inzidenz des MODS immer noch sehr hoch. (Nast-Kolb et al. 2001) In den letzten Jahren wurde davon ausgegangen, dass es nach Traumageschehen initial zu einem SIRS kommt. Im Verlauf kommt es dann kompensatorisch zu einer Immunsuppression bzw. Immunparalyse (CARS). Besonders die Zell-vermittelte Immunität, vor allem die Interaktion zwischen Monozyten und T-Zellen, scheint hier massiv beeinträchtigt zu sein. Die Anfälligkeit der Patienten für Zweitinfektionen ist jetzt besonders groß („second hit“). (Faist et al. 1996) Neueste Studien weisen allerdings darauf hin, dass unmittelbar nach Traumageschehen auf Genomebene sowohl pro- als auch antiinflammatorische Gene vermehrt transkribiert werden. Pro-inflammatorische und antiinflammatorische Prozesse laufen also möglicherweise unmittelbar nach Traumageschehen zeitgleich im Organismus ab. Phänotypisch wird die Immunosuppression allerdings teilweise erst nach einigen Tagen sichtbar. (Xiao et al. 2011) Bei den in diese Arbeit untersuchten speziellen Krankheitsbildern gab es Hinweise, dass die lymphozytäre Zellpopulation eine pathophysiologischer Rolle spielt. Es ist jedoch nicht Einleitung 1! 2 bekannt, inwieweit sich die lymphozytären Oberflächenmarkermuster bei den dargestellten Krankehitsbildern ähnlich sind bzw. unterscheiden. Daher wurden die oben genannten lymphozytären Oberflächenmarker untersucht, um in der vorliegenden Arbeit die folgenden Fragen zu klären. ! 1.5 Fragestellung In der folgenden Arbeit werden die CD- Marker verschiedener Patientengruppen, deren Immunsystem massiv beeinträchtigt war, mit einer gesunden Kontrolle verglichen. ! Folgende Fragen sollen dabei geklärt werden: ! 1. Sind die einzelnen Gruppen in ihrem CD-Markerprofil homogen oder unterscheiden sich die einzelnen Patienten auch innerhalb ihrer Gruppe deutlich voneinander? ! 2. Gibt es innerhalb der einzelnen Gruppen CD-Markerabweichungen, die im Vergleich zur gesunden Gruppe besonders auffallend sind? ! 3. Gibt es besondere Auffälligkeiten im Vergleich der Sport- Gruppe mit den OTS- Patienten? ! 4. Lassen sich bei den Polytrauma-Patienten im Krankheitsverlauf besondere Auffälligkeiten feststellen? ! Material und Methoden 1! 3 2. Material und Methoden 2.1 Patientenkollektiv ! Für diese Arbeit wurden Blutproben von 67 Probanden bzw. Patienten gemessen, die der Sektion Experimentelle Anästhesie in Ulm von verschiedenen Kliniken zugesandt wurden bzw. direkt in der Sektion Anästhesiologische Intensivmedizin abgenommen wurden. ! 2.1.1 Gesunde Probanden In die gesunde Vergleichsgruppe wurden insgesamt 14 Probanden aufgenommen. All diese Probanden waren junge, gesunde Individuen ohne chronische Erkrankungen im Alter von 20 bis 25 Jahren (Proben 12332-12415; n=6; „Kontrolle“) sowie junge, gesunde Hochleistungssportler einer Rudermannschaft im Alter von 14 bis 16 Jahren (Proben 12540-12547; n=8; „Sport“). Da sich insbesondere das adaptive Immunsystem im Laufe des Lebens verändert, sind als Bezugswerte junge, gesunde Individuen zu bevorzugen. Die Sportmannschaft soll im Ergebnisteil als eigene Gruppe behandelt werden. Sie ist zudem insbesondere im Vergleich zur Gruppe der Overtraining- Patienten interessant. ! Tabelle 1: Gemessene Blutproben des Gesunden Vergleichs; unter Angabe der Patientennummer; des Geschlechts (m=männlich; w=weiblich); des Alters in Jahren; sowie der Untergruppen-Zugehörigkeit [1a (=Kontrolle); 1b (= Sport)] ! n= 14 ! Geschlech t Alter 12332 w 24 Kontrolle 12342 m 25 Kontrolle 12347 w 22 Kontrolle 12414 w 22 Kontrolle 12415 w 22 Kontrolle 12470 m 20 Kontrolle 12540 m 15 Sport 12541 w 17 Sport 12542 w 18 Sport 12543 m 16 Sport 12544 w 17 Sport 12545 m 15 Sport 12546 m 18 Sport 12547 m 18 Sport Material und Methoden 2.1.2 1! 4 HLH In dieser Gruppe wurden insgesamt 15 Patienten gemessen. Die Patienten waren im Alter zwischen 0 und 82 Jahren, wobei nur drei der Patienten über 50 Jahre alt waren (n=3). Alle anderen Patienten waren zwischen 0 und 16 Jahre alt (n=12). Bei sechs der Patienten war die Diagnose HLH gesichert, bei neun bestand lediglich ein begründeter Verdacht. Bei der Messung wurden neun der Patienten therapiert, bei vier der Patienten ließ sich nicht nachvollziehen ob zum Messzeitpunkt therapiert wurde und zwei der Patienten erhielten nachweislich keine Therapie. Trotz dieser großen Heterogenität innerhalb der Gruppe soll diese hier als ein Ganzes betrachtet werden, da die Blutproben aller Patienten zumindest mit dem begründeten Verdacht einer HLH eingesandt wurden. ! Tabelle 2: Gemessene Blutproben der HLH- Patienten (HLH= Hämophagozytotische Lymphohistiozytose); unter Angabe der Patientennummer; des Geschlechts (m=männlich; w=weiblich); des Alters in Jahren; sowie der derzeitigen Therapie ! n= 15 ! ! ! ! ! Geschlech t Alter 12162 w 59 Verdacht auf HLH Nicht bekannt 12330 w 5 Verdacht auf HLH Nicht bekannt 12407 m 3 Gesicherte HLH Nicht bekannt 12359 m 0 Gesicherte HLH Therapie 12417 w 6 Gesicherte HLH Therapie 12465 w 14 Gesicherte HLH 12475 m 7 Gesicherte HLH Therapie 12485 m 3 Verdacht auf HLH Therapie 12486 m 9 Verdacht auf HLH Therapie 12487 w 2 Verdacht auf HLH Nicht bekannt 12498 m 82 Verdacht auf HLH Therapie 12526 m 15 Gesicherte HLH Therapie Keine Therapie 12539 w 3 Verdacht auf HLH Therapie 12466 m 72 Verdacht auf HLH Therapie 12663 w 16 Verdacht auf HLH Keine Therapie Material und Methoden 2.1.3 1! 5 LCH In dieser Gruppe wurden insgesamt 14 Patientenproben in den Evangelischen Kliniken Gelsenkirchen (Prof. Dr. Doberauer)entnommen und in der experimentellen Anästhesie in Ulm gemessen. Die Patienten waren im Alter zwischen 18 bis 67 Jahren. Bei keinem von ihnen trat die Krankheit bereits im Kindesalter auf, sie sind also alle zur späten Form der LCH zu zählen. Unter Therapie befanden sich zum Messzeitpunkt nachweislich zwei der Patienten, zwei wurden nicht therapiert, von den andern zwölf Patienten lagen keine gesicherten Daten vor. ! Tabelle 3: Gemessene Blutproben der LCH- Patienten (LCH= Langerhanszell-Histiozytose); unter Angabe der Patientennummer; des Geschlechts (m=männlich; w=weiblich); des Alters in Jahren; sowie der derzeitigen Therapie !! n=14 ! ! Geschlech t Alter 12323 m 57 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12496 w 22 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12549 w 57 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12372 w 67 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12165 m 31 Gesicherte LCH Therapie 12484 w 31 Gesicherte LCH Keine Therapie 12490 w 43 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12536 w 43 Gesicherte LCH Therapie 12594 m 35 LCH- Verdacht Nicht bekannt 12586 w 56 Gesicherte LCH Keine Therapie 12164 w 46 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12529 m 36 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12599 m 50 Gesicherte LCH Nicht bekannt 12453 w 18 LCH-Verdacht Nicht bekannt 2.1.4 Sepsis In dieser Gruppe wurden die Proben von 8 verschiedenen Patienten gemessen, welche sich mit einer Sepsis auf der Anästhesiologischen Intensivstation des Universitätsklinikums Ulm befanden. Die Patienten waren im Alter von 30 bis 73 Jahren. ! !! ! Material und Methoden 1! 6 Tabelle 4: Gemessene Blutproben der Sepsis- Patienten; unter Angabe der Patientennummer; des Geschlechts (m=männlich; w=weiblich); des Alters in Jahren; und Schweregrad der Erkrankung ! n= 8 Geschlecht Alter 10990 m 68 Septischer Schock 11555 m 47 Septischer Schock 12326 w 63 Septischer Schock 12357 m 44 Schwere Sepsis 12361 w 30 Septischer Schock 12471 w 50 Septischer Schock 12494 w 45 Septischer Schock ! ! 11553 w 73 Septischer Schock 2.1.5 Overtraining (OTS) Hier wurden die Proben von 8 Patienten gemessen, welche sich mit dem Verdacht eines OTS in der Abteilung für Sportmedizin des Universitätsklinikums Ulm befanden. All diese Patienten betrieben bzw. hatten früher Hochleistungssport betrieben. Sechs der Patienten waren unter 35 Jahre alt d.h. zwischen 15 und 32 Jahre alt. Zwei der Patienten waren mit 44 Jahren und 62 Jahren deutlich älter. Die Geschlechterverteilung fiel in dieser Gruppe besonders auf. So befand sich lediglich eine weibliche Patientin in dieser Gruppe. ! ! Tabelle 5: Gemessene Blutproben der Overtraining- Patienten; unter Angabe der Patientennummer; des Geschlechts (m=männlich; w=weiblich); des Alters in Jahren; sowie der ausgeübten Sportart n= 8 ! ! ! ! ! Geschlecht Alter Sportart 12241 m 44 Fußball 12285 m 22 Eishockey 12286 m 32 Fechten 12308 m 62 Gewichtheben 12334 m 15 Fußball 12532 m 22 Fußball 12534 w 24 Triathlon 12659 m 27 Rudern Material und Methoden 2.1.6 1! 7 Polytrauma Die Patienten in dieser Gruppe befanden sich ebenfalls alle auf der Anästhesiologischen Intensivstation des Universitätsklinikums Ulm. Ihnen wurde jeweils 0h, 12h, 24h, 48h, 5d und 10d nach Polytraumageschehen Blut entnommen und dieses dann gemessen. Die Patienten in dieser Gruppe waren zwischen 25 und 81 Jahre alt, sieben von ihnen waren Männer. Einer der Patienten hatte vornehmlich Weichteilverletzungen in Thorax und Abdomen. Vier der Patienten befanden sich nach Sturzgeschehen in der Klinik. Sie hatten alle ein SHT sowie eine SAB, zwei von ihnen jeweils eine Rippenserienfraktur, die anderen beiden eine Wirbelkörperfraktur. Die verbleibenden drei Patienten kamen alle im Straßenverkehr zu Schaden. Zwei wurden jeweils als Fußgänger von einem PKW erfasst; einer war in einen Motorradunfall involviert. Bei diesen Patienten lagen jeweils eine Beckenringverletzung, verschiedene Extremitätenfrakturen sowie im Falle des Motorradfahrers eine BWK- Fraktur mit sensomotorischem Querschnitt vor. ! Tabelle 6: Gemessene Blutproben der Polytrauma- Patienten; unter Angabe der Patientennummer; des Geschlechts (m=männlich; w=weiblich); des Alters in Jahren; sowie dem Verletzungsmuster des Patienten; SHT (=Schädel-Hirn-Trauma), SAB (=Subarachnoidalblutung), BWK (=Brustwirbelkörper), LWK (=Lendenwirbelkörper) ! n= 8 Geschlecht Alter Polytrauma 12319 m Von Bullen an die Wand gedrückt; Lungenkontusionen, Milzruptur, 25 Leber- und Magenruptur 12309 m Treppensturz; SHT, SAB, 81 Rippenserienfraktur, Hämatothorax 12382 m Treppensturz, SHT, SAB, Rippenserienfraktur, 70 Impressionsfrakturen 12374 m Sturz; SHT, SAB, LWK-Fraktur, 48 Beckenringfraktur, Lungenkontusion 12508 m Sturz; SHT, Kalottenfraktur, SAB, intrakranielle Hypertension, 45 Scapulafraktur, LWK-Fraktur 12405 w Von PKW erfasst; Beckenringfraktur, Unterschenkelfrakturen, 73 Rippenserienfraktur 12558 m Von PKW erfasst; Beckenringfraktur, Humerus/ 76 Radiusfraktur 12273 m Motorradunfall; Beckenring- und BWK-Fraktur; sensomotorischer 34 Querschnitt Material und Methoden 1! 8 2.3 Messung 2.3.1 Messmaterialien und Messgeräte Folgende Materialien und Geräte wurden für die Messung des Probematerials verwendet: - EDTA- Röhrchen: S-Monovetten (66x11mm; 2,7ml; von Sarstedt/Nümbrecht); 1,6mg EDTA pro ml Blut - FALCON- Röhrchen (12x75mm, 5ml; von BD Biosciences) - Pipetten 200µl, 100 µl , 50 µl, 3 µl - Fetales Kälberserum (FCS) - FACS Lysing Solution (Konzentration 1:10; von BD Biosciences) - Isotonische Phosphat-gepufferte Salzlösung: DPBS (von GIBCO/invitrogen) - CellFIX (Konzentration 1:10 mit dest. H2O; von BD Biosciences) - Antikörper Tabelle 7: Verwendete Antikörper mit Anbieter (Ig = Immunglobulin, CD = Cluster of Differentiation, FITC = Fluoresceinisothiocyanat , PE = Phycoerythrin) ! Antikörper Anbieter 1. Isotyp: Mouse (FITC) / BD Mouse- Kombi (PE) 2. CD 86 (FITC) DIACLONE research 3. CD 2 (PE) Beckman Coulter 4. CD 56 (PE) BD 5. CD 244 (PE) Beckman Coulter 6. CD 3 (FITC) Immunotech 7. CD 16 (FITC) DIACLONE research 8. CD 39 (FITC) Serotech 9. CD 28 (FITC) Serotec 10. CD 4 (FITC) BD 11. CD 25 (PE; FITC) BD 12. CD 11b (PE) BD 13. CD 8 (PE) Beckman Coulter 14. CD 127 (= IL7R )(PE) R & D Systems !- Vortex-Genie 2 (Scientific Industries) - GS-6R-Zentrifuge (Beckman Coulter) - FACS-Calibur ( BD Biosciences) - Software: Cellquest pro® - Software: GraphPad Prism Version 5.00 (Firma GraphPad Software Inc.) - Software: Makro erstellt von Christian Schmidt, Statistiker, zur speziellen Auswertung des CD- Marker- Protokolls Material und Methoden 2.3.2 1! 9 Methodische Grundlagen der Immunphänotypisierung/FACS Die Immunphänotypisierung der Blutproben erfolgte mittels der Durchflusszytometrie, im Englischen auch FACS („fluorescence activated cell sorting“) genannt. In der Durchflusszytometrie werden mit fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern markierte Zellen in Suspension gemessen. Die verwendeten „angefärbten“ Antikörper binden hierbei an spezielle Antigene auf den Zielzellen und machen diese so bei der späteren Messung sichtbar. Laserstrahlen registrieren die so markierten Zellen. Mittels dieses optischen Messverfahrens ist es möglich 10000 Zellen in wenigen Sekunden bis Minuten zu messen und zu analysieren. Benutzt wurde das FACSCalibur von BD Biosciences. Dieses Gerät arbeitet mit einem blauen Argonlaser (488nm) und einem roten Diodenlaser (635nm). Die Laserstrahlen treffen im Winkel von 90° auf die vorbeifließenden Zellen. Die dabei erzeugte Streuung der Strahlen wird von Sammellinsen gebündelt und an Fotodetektoren weitergeleitet. Die Zellen können so nach unterschiedlicher Größe (Vorwärtsstreuung/FSC), verschiedenartiger Struktur (Seitwärtsstreuung/SSC) und spezieller Fluoreszenz-Markierung (FITC/PE) unterschieden und identifiziert werden. Aufgrund der verschiedenen Emissionsund Absorptionsspektren der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe war es möglich diese in der Durchflusszytometrie zusammen zu verwenden und so Zellen noch genauer zu charakterisieren. (bdbiosciences.com) ! ' Abbildung 1: Schematische Darstellung des Strahlenganges eines FACS-Geräts. [FSC(=Vorwärtsstreuung); SSC(=Seitwärtsstreuung); FITC(=Fluoresceinisothiocyanat); PE(=Phycoerythrin)] Material und Methoden 2.2.3 2! 0 Arbeitsablauf bei den einzelnen Messungen Das verwendete Blut wurde in EDTA- Röhrchen der experimentellen Anästhesie zugesandt bzw. direkt dort abgenommen. Das EDTA (Ethylendiamintetraacetat) in den Röhrchen verhindert dabei die Gerinnung der Probe, da es irreversibel das dazu nötige Calcium bindet. Nach Entfernung des Blutplasmas wurde die Blutprobe mit FCS aufgefüllt und gut vermischt. Nun wurden jeweils 70 µl Blut in 25 auf Eis gestellte FALCON-Röhrchen pipettiert und dann mit jeweils 3 µl der verschiedenen Antikörper versetzt. Im selben Röhrchen konnten hierbei jeweils ein PE und ein FITC markierter monoklonaler Antikörper verwendet werden, da diese ein unterschiedliches Absorptionsspektrum aufweisen. Die Proben wurden nun mittels des Vortex- Genie 2 gut durchmischt und 25 Minuten in völliger Dunkelheit auf Eis inkubiert. Danach wurde jeweils 2,5 ml FACS Lysing Solution zugegeben um die Erythrozyten in den Proben innerhalb der nächsten 12 Minuten zu lysieren. Die Proben sollten im Anschluss daran klar sein. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten bei 980 RPM und 10°C zentrifugiert, der Überstand abgegossen und mittels 2ml DPBS resuspendiert. Nach erneutem 5 minütigem Zentrifugieren der Proben und Resuspendierung mit DPBS, erfolgte die Fixierung der Proben mittels 50 µl Cell Fix. Die so markierten und fixierten Zellen wurden jetzt im FACSCalibur gemessen und anschließend mit der Software Cellquest pro® analysiert. Diese erstellt für jeden Marker und jede Zellpopulation ein Histogramm („Dot Plot“), in welches alle Fluoreszenz- markierten, für eine bestimmte Markerkombination also positiven, Zellen eingetragen werden. Manuell wurden nun noch sogenannte „regions of interest“ gesetzt und so der Anteil der mit Antikörpern markierten Zellen einer bestimmten Zelllinie (Lymphozyten, Monozyten oder Granulozyten) gegenüber der Gesamtzahl der Zellen genauer abgegrenzt. Die Ergebnisse werden dann in Form von Streudiagrammen dargestellt. Material und Methoden 2! 1 ' Abbildung 2a: Darstellung der gemessenen Zellen mittels Dot-Plot, nach Setzen von „regions of interest“; R1= Lymphozyten; R2= Monozyten; R3= Granulozyten; SSC= Sideward- Scatter (Granularität), FSC= Forward- Scatter (Zellgröße). ! ! ! Abbildung 2b: Beispiel eines Dot-Plots des Lymphozytenfensters; ein roter Punkt entspricht einem Lymphozyten; y- Achse: CD2- Antikörper (PE- markiert), x- Achse: CD86- Antikörper (FITC- markiert) ! Alle Messergebnisse wurden danach mittels eines speziell hierfür entwickelten Makro verarbeitet und dargestellt. Anschließend wurden sie in das Programm GraphPad Prism Version 5.00 (Firma GraphPad Software Inc.) übertragen und so die im Ergebnissteil dargestellten Diagramme erzeugt. ! Material und Methoden 2.3 2! 2 Statistik Die für diese Arbeit gewonnenen Daten sollten genutzt werden um möglicherweise neue Hypothesen zu generieren. Ihre Auswertung erfolgte nach dem Prinzip einer explorativen Datenanalyse. Die erstellten Diagramme wurden dabei sowohl deskriptiv als auch mittels statistischer Testverfahren beurteilt. Das Signifikanzniveau lag dabei bei α = 5% (p< 0,05). ! 2.3.1 Ausreißerbewertung: Grubb´s Test Aufgrund von Mess- oder Dokumentationsfehlern sowie pathologischen Besonderheiten können extrem hohe oder niedrige Werte entstehen. Diese werden als Ausreißer bezeichnet. Auffällige Messwerte werden hierzu einzeln beleuchtet. Fielen beispielsweise bei den Polytraumapatienten bei einem der Patienten immer sehr hohe bzw. sehr niedrige Werte auf, war von einem speziellen klinischen Hintergrund auszugehen. Zur Ausreißerbewertung wurde zudem der Grubb´s Test verwendet. Dieser überprüft, ob die Wahrscheinlichkeit gegeben ist, dass unter Annahme der Normalverteilung ein bestimmter Wert zu den restlichen Werten passt. Abhängig von den gemessenen Werten wird ein so genannter kritischer Wert als Bezugswert angenommen. Überschreitet nun einer der gemessenen Werte diesen Wert, ist es wahrscheinlich, dass es sich bei diesem Wert um einen Ausreißer handelt. Auffällige Messwerte, bei denen nun also ein Mess- oder Dokumentationsfehler nicht ausgeschlossen werden konnte und auch der Grubb´s Test Signifikanz zeigte, wurden so aus dem Datensatz ausgeschlossen. Zur Berechnung nach Grubb´s wurde der Onlinerechner QuickCalcs online (Online Calculators for Scientists der GraphPad Software, San Diego, California, USA Inc.) verwendet. ! 2.3.2 Mann-Whitney U-Test Der Mann-Whitney U-Test (auch U-Test) ist ein nichtparametrischer statistischer Test. Parameterfreie Tests unterscheiden sich von parametrischen Tests dadurch, dass Art und Anzahl der Parameter flexibel und nicht von vornherein festgelegt sind. Nichtparametrische statistische Methoden testen Hypothesen, machen dabei aber keine Annahmen über die Wahrscheinlichkeitsverteilung der untersuchten Variablen und sind somit auch anwendbar wenn Verteilungsvoraussetzungen nicht erfüllt sind. Der U-Test überprüft hierbei nun ob zwei unabhängig voneinander erhobene Verteilungen A und B zur selben Grundgesamtheit gehören. Die Nullhypothese H0 (= „Die beiden Stichproben entstammen der gleichen Grundgesamtheit“)wird dabei angenommen. Beide Gruppen (Xm und Xn) werden zunächst zusammengefasst und dann jedem Wert ein bestimmter Rang zugeordnet, d.h. die kleinste Beobachtung bekommt den Rangplatz 1, die nächst größere den Rangplatz 2, usw. Nach Bestimmung der Ränge wird für jede der Gruppen Material und Methoden 2! 3 noch die Rangsumme Rx und Ry berechnet. Gilt H0 so sollten die beiden Gruppen in der zuvor gebildeten Rangreihenfolge in etwa gleich verteilt sein. Rx und Ry also in etwa gleich groß sein. Außerdem werden auch noch Ux und Uy bestimmt: ' . Dies geschieht um auszuschließen, dass eine der Gruppen besonders hohe und niedrige Werte hat, wohin gegen die andere nur mittlere Werte aufweist. Hier wären die Rangsummen dann in etwa gleich, obwohl keine gemeinsame Grundgesamtheit vorliegt. Damit der Mann-Whitney U-Test hinreichend genau ist, müssen ausreichend große Stichproben vorliegen, nämlich n ≥ 4 und m ≥ 4. (Methodenberatung Universität Zürich 2010) ! 2. 4 Klinische Scores der Polytraumapatienten Aufschluss über die klinische Situation und den Schweregrad der Erkrankung eines Patienten können insbesondere verschiedene, klinisch Scores geben. Sie helfen Patienten zu klassifizieren und damit besser vergleichbar zu machen. Für diese Arbeit sollen insgesamt drei Scores genauer betrachtet werden. 2.4.1 ISS Der ISS (= Injury Severity Score) erfasst den Schweregrad der Verletzungen nach Polytraumageschehen. Dazu wird der Körper in sechs Regionen unterteilt und diese dann jeweils nach der Schwere der Verletzungen in diesem Bereich bewertet. Dabei werden Punkte von 1- 6 vergeben und diese dann mit den jeweiligen Punkten der anderen Körperregionen verrechnet. Dabei ergeben sich Werte von 1 bis 75. Je schwerwiegender die Verletzungen eines Patienten umso höher ist der ermittelte Scoring-Wert. (Largiadèr et al. 2008) 2.4.2 SOFA- Score Der SOFA (= Sequential Organ Failure Assessment) Score wird verwendet, um das Ausmaß von Organdysfunktion von Patienten auf der Intensivstation zu beurteilen. Er basiert auf der Bewertung von sechs verschiedenen Organsystemen, dem respiratorischen, dem kardiovaskulärem, dem hepatischen, dem renalen, dem neurologischen und dem Gerinnungssystem. Hier werden je nach Funktionsfähigkeit des einzelnen Systems Punkte von 1-4 vergeben. Vier entspricht dabei einer besonders schlechten Organfunktion. (Ferreira et al. 2001.¸Vincent et al. 1996) 2.4.3 SAPS -3 Der SAPS 3 (= Simplified Acute Physiology Score) ist eine Weiterentwicklung des SAPS II. Es werden dabei 20 verschiedene Variablen berücksichtigt. Nach Moreno et al. empfiehlt sich eine Gliederung dieser Kriterien in drei Blöcke. Block 1 erfasst die Situation des Patienten vor Aufnahme, Block 2 diejenige bei Aufnahme, Block 3 bildet die physiologische Situation des Material und Methoden 2! 4 Patienten ab. Zusätzlich zu diesem sogenannten SAPS 3 Admisson Score wird außerdem noch der „SAPS 3 Propability of Death Score“ erfasst. Der so berechnete Gesamtscore kann dann den Schweregrad der Erkrankung eines Patienten angeben. (Metnitz et al. 2005; Moreno et al. 2005) ! 2.4.4 Sepsis- Score Der Sepsis- Score wird verwendet um eine mögliche septische Konstellation eines Patienten auf der Intensivstation zu erkennen bzw. deren Schweregrad abzuschätzen. Um diesen Score grafisch darzustellen, werden Punkte vergeben. Dabei bedeuten 0 Punkte = keine Infektion bzw. Organdysfunktion, 1 Punkt = Infektion, 2 Punkte= Bakterämie, 3 Punkte = SIRS, 4 Punkte = Sepsis, 5 Punkte = Schweres SIRS, 6 Punkte= Schwere Sepsis, 7 Punkte = SIRSSchock und 8 Punkte = Septischer Schock. (Anästhesiologische Intensivstation des Universitätsklinikum Ulm) ! ! Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Grubb’s Ausreißerbewertung 2! 5 Alle Gruppen wurden zunächst auf auffällige hohe oder niedrige Messwerte hin überprüft. Konnten Messfehler oder Dokumentationsfehler nicht ausgeschlossen werden, so wurde mittels des Grubb's Ausreißertest nach Ausreißern gesucht. Bei Signifikanz des Messwertes wurde dieser Wert nach Prüfung der Fraglichkeit aus dem Kollektiv entfernt. ! 3.2 Mann-Whitney-U-Test Anschließend wurde mittels des Mann-Whitney-U- Tests überprüft, ob zwischen den verschiedenen Gruppen und der gesunden Vergleichsgruppe ein statistischer Unterschied im Bezug auf die gemessenen „% Gated“- bzw. „Mean“-Werte nachgewiesen werden konnte. „% Gated“-Werte: Hier wird der prozentuale Anteil der markerspezifisch positiven Zellen, z.B. CD3 positive Zellen, im Lymphozyten-Zellfenster dargestellt. Der prozentuale Anteil bezieht sich dabei auf die Gesamtzellzahl in diesem Fenster. „Mean-Werte“: Der Mean-Wert beleuchtet die durchschnittliche Expressionsdichte eines bestimmten Markers (z.B. CD3) auf den markerspezifisch gegateten Zellen. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3 2! 6 Oberflächenmarker der T-Zellen ! 3.3.1 ! 3.3.1.1 ! Gesamtzahl der T- Zellen CD3 % Gated 100 Prozentwert der CD3-exprimierenden Zellen 80 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT LC H Se ps is PT 0h LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! ! Abbildung 3: Darstellung des Prozentwertes der CD3-exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert der CD3-exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 8a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD3 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0293 0,1990 0,8953 0,0200 0,3450 0,4418 P-Wert Summe * ns ns * ns Ns Signifikant Ja Nein Nein Ja Nein Nein 7,000 28,00 37,00 6,00 16,00 24,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! Mann-Withney-U Ergebnisse 2! 7 Tabelle 8b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD3 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,7619 0,2571 0,1014 0,3450 0,2949 0,0200 0,0022 P-Wert Summe ns ns ns ns ns * ** Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Ja Ja 10,00 6,000 9,000 16,00 13,00 6,000 0,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD3 ist typischer T-Zellmarker, der vor allem auf Thymozyten sowie reifen T-Zellen exprimiert wird. Auffallend sind bei den Ergebnissen dieses Markers besonders die Patientengruppen der HLH- und der Sepsispatienten. Beide Gruppen weisen eine besonders große Streuung der Messwerte auf. Die Messwerte der fünf anderen Gruppen liegen deutlich über 40% aber unter 90%. Bei jeder dieser fünf Gruppen liegen die Messpunkte eher nahe beieinander. Bei den HLH- Patienten fällt außerdem auf, dass die therapierten Patienten im oberen Messwertebereich liegen. Signifikante niedrigere CD3 % Gated- Werte als die gesunde Vergleichsgruppe weisen bei diesem Marker die Sepsis- Gruppe (p=0,0200) sowie die Sport- Gruppe (p=0,0293) auf. Die Polytrauma- Gruppe bewegt sich für die Messzeitpunkte 0h bis 48h im Bereich der gesunden Kontrolle. Erst die Zeitpunkte 5d und 10d zeigen einen deutlich niedrigeren Median. Statistisch äußert sich dies im signifikanten Unterschied von PT 5d (p= 0,0200) sowie PT 10d (p=0,0022). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 2! 8 3.3.1.2 CD4 3.3.1.2.1 CD4%- Gated 80 Prozentwert der CD4-exprimierenden Zellen 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT LC H Se ps is PT 0h LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 4 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD4-exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD4-exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 9a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD4 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,2284 0,0216 0,9650 0,1079 0,0426 0,1304 P-Wert Summe ns * ns ns * Ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Ja Nein 14,00 15,00 38,00 11,00 8,00 17,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 2! 9 ! Tabelle 9b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD4 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,6095 0,9048 0,5338 0,5728 0,6282 0,8518 0,8182 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 9,000 8,000 16,00 19,00 17,00 22,00 16,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD4 ist typischer T-Helferzellmarker. Die Messwerte des gesunden Vergleichs liegen alle im Bereich von 34% bis 53 %. Ähnlichkeit damit zeigen lediglich die Werte der Sport- Gruppe. Die Messwerte der anderen vier Gruppen sind sehr viel weiter gestreut. So weist die HLHGruppe Werte von 3,61% bis 62,12% auf, ihr Median liegt deutlich unter dem der anderen Gruppen. Auch die Werte der OTS- Gruppe liegen eher im unteren Bereich (9,89% bis 41,67%). Signifikant niedrigere Medianwerte zum gesunden Vergleich lassen sich bei CD4 sowohl bei der Gruppe der HLH- Patienten (p=0,0216) als auch bei der Gruppe der OTSPatienten (p=0,0426) ausmachen. Auch die Polytrauma- Gruppen weisen alle eher gestreute Messwerte auf. Bis auf die Gruppe PT 0h, deren Median deutlich höher liegt, liegen ihre Mediane allerdings alle sehr dicht beisammen und sind demjenigen des gesunden Vergleichs auch sehr ähnlich. Signifikante Unterschiede zum gesunden Vergleich zeigt keine der Polytrauma- Gruppen. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.1.2.2 3! 0 CD4 MFI ! 30000 MFI 20000 10000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 5 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD4 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD4 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 10a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD4 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0593 0,0091 0,5362 0,0293 0,0929 0,7209 P-Wert Summe ns ** ns * ns Ns Signifikant Nein Ja Nein Ja Nein Nein 9,000 11,00 34,00 7,000 10,50 28,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U ! Ergebnisse 3! 1 ! Tabelle 10b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD4 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,6095 0,7619 0,9452 0,8518 0,9452 0,7546 0,6991 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 9,000 10,00 20,00 22,00 20,00 21,00 15,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Die Expressionsdichte von CD4 liegt beim gesunden Vergleich im Bereich von 6325 bis 18805. In der Gruppe der HLH-, der LCH- und der Sepsis- Patienten fallen Werte auf die deutlich unter dem kleinsten Wert des gesunden Vergleichs liegen. Dies ist insbesondere in der HLH- Gruppe auffällig, hier liegt eine Akkumulation von Messwerten unter 6300 vor. Lediglich drei Werte liegen in dieser Gruppe über diesem Wert und damit im Wertebereich des gesunden Bereichs. Auch in der Sepsis-Gruppe häufen sich die Werte im unteren Bereich. Die Mediane beider Gruppen liegen deutlich unter demjenigen der gesunden Kontrolle. Der Mann-Whitney-U- Test zeigt, dass ein signifikanter Unterschied zwischen der HLHGruppe (p=0,0091) sowie der Sepsis- Gruppe (p=0,0293) und dem gesunden Vergleich besteht. Außerdem auffällig ist der ausgesprochen geringe P-Wert der Sport- Gruppe (p=0,0593) sowie der OTS- Gruppe (p=0,0929) im Vergleich zur Kontrolle. Die Werte der Polytrauma- Patienten streuen insgesamt. Größten Messwertebereich weisen dabei die Zeitpunkte 48h, 5d und 10d auf. Auch die Mediane der Gruppe 5d und 10d sind abgesenkt. Signifikante Unterschiede zum gesunden Vergleich ergeben sich allerdings keine. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.1.3 3! 2 CD8 ! 3.3.1.3.1 ! CD8 % Gated 100 Prozentwert der CD8-exprimierenden Zellen 80 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT is 0h PT PT Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 6 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD8-exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD8-exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 11a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD8 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS OTS/ P-Wert (Gauss´sche 0,1812 0,9690 0,9671 0,8518 0,5887 0,6620 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 13,00 44,00 41,00 22,00 14,00 20,00 ! Sport Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 3! 3 ! Tabelle 11b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD8 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4286 0,1143 0,1014 0,9497 0,6282 0,0813 0,0260 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns * Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Ja 3,000 4,000 9,000 23,00 17,00 10,00 4,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) !! Mann-Withney-U CD8 ist ein typischer Marker der zytotoxischen T-Zellen, wird aber auch von einigen wenigen NK-Zellen exprimiert. Die Messwerte der gesunden Vergleichsgruppe liegen als deutlich sichtbare Wolke im Bereich von 26,71% bis 40,36%. Sowohl die HLH-, die Sepsis- Gruppe als auch die Polytrauma- Gruppen lassen eine größere Streuung der Werte erkennen. Größte Streuung weist hierbei die HLH- Gruppe mit Werten von 4,84% bis 91,79% auf. Die HLHGruppe scheint zudem aus zwei Populationen zu bestehen, therapierte Patienten siedeln sich auch hier gehäuft im oberen Messwertebereich an. Statistisch ergibt sich allerdings lediglich bei der Gruppe PT 10d ein signifikanter Unterschiede zum gesunden Vergleich (p=0,0260), ihr Median ist deutlich abgesenkt. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3! 4 3.3.1.3.2 CD8 MFI 250000 200000 MFI 150000 100000 50000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 7 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD8 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD8 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 12a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD8 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 1,0000 0,0317 0,3571 0,3450 0,6052 0,5054 P-Wert Summe ns * ns ns ns Ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Nein Nein 24,00 14,00 28,00 16,00 19,50 25,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U ! Ergebnisse 3! 5 Tabelle 12b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD8 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,3810 0,7619 0,8357 0,3450 0,7308 0,2949 0,1320 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 5,000 10,00 19,00 16,00 18,00 13,00 8,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) !! Mann-Withney-U Die Werte liegen auch hier eher gestreut vor. Die Messwerte der gesunden Kontrolle liegen alle über 3500 aber unter 12000. Die anderen Gruppen liegen mit ihren Medianen alle unterhalb derjenigen des gesunden Vergleichs. Am Auffälligsten ist dies bei den HLHPatienten, im Vergleich zu den Gesunden zeigt die HLH- Gruppe dann auch einen signifikant Unterschied. (p=0,0094). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.1.4 3! 6 IL7-R % Gated 80 Prozentwert der IL7R-exprimierenden Zellen 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT 0h PT is Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 8: Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der IL7-R (=Interleukin 7 Rezeptor) exprimierenden Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der IL7R exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie ! ! Tabelle 13a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich IL7-R (=Interleukin 7 Rezeptor). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,4136 0,4590 0,3221 0,9497 0,3450 0,8785 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 17,00 35,00 29,50 23,50 16,00 30,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U !! Ergebnisse 3! 7 ! Tabelle 13b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich IL7-R (=Interleukin 7 Rezeptor). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,8307 0,0381 0,1014 0,2284 0,1807 0,5181 0,6304 P-Wert Summe ns * ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Nein Nein Nein 10,50 2,000 9,000 14,00 11,00 18,50 14,50 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Exprimiert wird der IL-7 Rezeptor sowohl von T-Zellen als auch von Makrophagen. Er reguliert die Proliferation und das Überleben von T-Zellen, sowohl im Thymus als auch peripher. Die Messwerte dieses Markers liegen in allen Gruppen relativ gestreut vor. Die größte Messbereichsspanne zeigt sich hierbei bei der LCH- Gruppe, die Werte liegen hier im Bereich von 0% bis 50,27%, sowie die Gruppe PT 4h mit Werten von 16,3% bis 72,28%. Ein signifikanter Unterschied ergibt sich für den Vergleich der Gruppe PT 4h mit dem gesunden Vergleich (p=0,0381). Der Median der Gruppe PT 4h liegt dabei deutlich höher als derjenige des gesunden Vergleichs. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3! 8 3.3.2 ! Aktivierte T- Zellen 3.2.1 CD4/25 3.3.2.1.1 CD4/25 % Gated Prozentwert der CD4/25-exprimierenden Zellen 80 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT LC H Se ps is PT 0h LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 9 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD4/25 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD4/25 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie ! Tabelle 14a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD4/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,1209 0,0176 0,7589 0,4136 0,3450 0,7984 P-Wert Summe ns * ns ns ns Ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Nein Nein 11,50 14,00 35,00 17,00 16,00 29,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 3! 9 Tabelle 14b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD4/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,3524 0,1143 0,6282 0,6620 0,5338 0,7546 0,4848 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 7,000 4,000 17,00 20,00 16,00 21,00 13,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) !! Mann-Withney-U Die Marker Kombination CD4/25 markiert aktivierte T-Lymphozyten, insbesondere THelferzellen, welche CD4 positiv sind. CD25 ist wichtiges Oberflächenmolekül bei der Proliferation und Aktivierung von Lymphozyten. Auffallend anders als die anderen Gruppen verhält sich die Gruppe der HLH- Patienten. Es sind zwei Populationen auszumachen. Zum einen häufen sich Werte im unteren Bereich, vier Werte liegen dagegen sehr hoch, sie übersteigen 3,3%. Der Median der HLH- Gruppe ist deutlich nach unten abgesenkt. Dies ist im Vergleich der HLH- Gruppe zur gesunden Vergleichsgruppe signifikant (p=0,0176). Auch bei der Sepsis- Gruppe scheint es zwei Populationen zu geben. Je eine im eher unteren Messbereich und eine eher im höheren Messbereich. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.2.1.2 4! 0 CD4/25 MFI 6000 MFI 4000 2000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 10 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD4/25 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD4/25 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 15a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD4/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,8329 0,0019 0,1052 0,5237 0,7694 0,7209 P-Wert Summe ns ** ns ns ns Ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Nein Nein 18,00 0,000 17,00 15,00 17,50 28,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U ! Ergebnisse 4! 1 ! Tabelle 15b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD4/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4127 0,0635 0,2020 0,5237 0,4318 0,2222 0,1775 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 6,000 2,000 9,000 15,00 12,00 11,00 7,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Auch bei der Expressionsdichte des Markers CD4/25 zeigt sich bei allen Gruppen bis auf die HLH- Gruppe eine weite Streuung der Messwerte. Die Werte der gesunden Kontrolle liegen im Bereich von 1128 bis 2027. Auffällig ist hier, dass in allen anderen Gruppen bis auf die HLH- Gruppe höhere Maximalwerte vorliegen (Sport 2386; LCH 3182; Sepsis 3619; OTS 3619; PT 2757). Der Median der LCH- Gruppe ist dabei deutlich nach oben verschoben. Der Median der HLH- Gruppe ist im deutlichen Gegensatz dazu nach unten abgesenkt. Alle Messwerte der HLH- Gruppe befinden sich unterhalb des Messbereichs des gesunden Vergleichs. Statistisch ergibt sich daher für die HLH- Gruppe im Vergleich zur gesunden Vergleichsgruppe ein signifikanter Unterschied (p=0,0019). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 4! 2 3.3.2.2 CD8/25 3.3.2.2.1 CD8/25 % Gated Prozentwert der CD8/25-exprimierenden Zellen 8 6 4 2 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT is 0h PT Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 11 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD8/25 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD8/25 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 16a: Vergleich aller Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD8/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0293 0,3706 0,2417 0,6620 0,8518 0,0281 P-Wert Summe * ns ns ns ns * Signifikant Ja Nein Nein Nein Nein Ja 7,000 33,00 23,00 20,00 22,00 11,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 4! 3 ! Tabelle 16b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD8/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,2571 0,0238 0,0350 0,0293 0,0047 0,0127 0,6991 P-Wert Summe ns * * * ** * ns Signifikant Nein Ja Ja Ja Ja Ja Nein 6,000 0,000 6,000 7,000 2,000 5,000 15,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Die Marker Kombination CD8/25 markiert aktivierte T-Lymphozyten, insbesondere zytotoxische T-Zellen, welche CD8 positiv sind. CD25 ist wichtiges Oberflächenmolekül bei der Proliferation und Aktivierung von Lymphozyten. Die Messwerte der Sepsis- Gruppe und den PT- Gruppen liegen weit gestreut vor. In beiden Gruppen fällt ein relativ hoher Maximalwert auf (Sepsis 5,11%; PT 48h 6,67%). Eine Akkumulation von Messwerten lässt sich sowohl bei der gesunden Kontrolle, der Sport-, der LCH-, als auch der HLH -Gruppe feststellen. Der Median der Sport- Gruppe ist dabei im Gegensatz zum dem des gesunden Vergleichs deutlich nach oben verschoben (p= 0,0293). Auch die Mediane aller PT- Gruppen ab 4h sind nach oben verschoben. Signifikante Unterschiede finden sich dabei zwischen dem gesundem Vergleich sowie den PT- Gruppen 4h (p=0,0238), 12h (p=0,0350), 24h (p=0,0293), 48h (p=0,0047), 5d (p=0,0127). Der Median der Sport-Gruppe ist hier deutlich höher als derjenige der OTS- Gruppe (p=0,028). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.2.2.2 4! 4 CD8/25 MFI 500 400 MFI 300 200 100 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 12 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD8/25 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD8/25 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 17a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD8/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0181 0,3109 0,0117 0,1903 0,0697 0,7546 P-Wert Summe * ns * ns ns Ns Signifikant Ja Nein Ja Nein Nein Nein 3,000 30,00 10,00 14,00 10,00 21,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 4! 5 ! Tabelle 17b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD8/25 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4005 0,8781 0,0331 0,0407 0,0430 0,0294 0,0250 P-Wert Summe ns ns * * * * * Signifikant Nein Nein Ja Ja Ja Ja Ja 8,000 9,000 6,000 8,000 8,000 7,000 4,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Die Messwerte der gesunden Kontrolle sind im unteren Bereich angesiedelt. In der HLHsowie der PT- Gruppe 24h fallen jeweils zwei Populationen auf. Je eine ebenfalls eher im unteren Bereich, die andere deutlich über dem Messwertebereich der gesunden Kontrolle. Die Sport- sowie die LCH- Gruppe liegt mit ihren Messwerten über denjenigen des gesunden Vergleichs, die Mediane sind deutlich nach oben verlagert. Gleiches gilt für die PT- Gruppen außer zum Zeitpunkt 0h. Statistisch weisen sowohl die Sport- (p=0,0181) als auch die LCH(p=0,0117) sowie die PT- Gruppen 12h (p=0,0331), 24h (p=0,0407), 48h (p=0,0430), 5d (p=0,0294) sowie 10d (p=0,0250) signifikant höhere Werte als die Kontrollgruppe auf. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 4! 6 3.3.2.3 CD2/86 3.3.2.3.1 CD2/86 % Gated Prozentwert der CD2/86-exprimierenden Zellen 20 15 10 5 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 13 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD2/86 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD2/86 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 18a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD2/86 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,4452 0,0526 0,1078 0,7308 0,1807 0,3062 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 15,00 18,00 22,00 18,00 11,00 16,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 4! 7 Tabelle 18b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD2/86 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,8307 0,1667 0,0734 0,4136 0,0350 0,0704 0,1320 P-Wert Summe ns ns ns ns * Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Ja Nein Nein 10,50 3,000 8,000 17,00 6,000 9,500 8,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD86 ist wichtiger Marker der APC, findet sich aber nach deren Aktivierung auch auf aktivierten T-Zellen. Um lediglich aktivierte T-Zellen zu messen, wählt man CD86 in Kombination mit CD2. Die Messwerte des gesunden Vergleichs weisen bei dieser Markerkombination eine deutliche Häufung im Bereich von 0,05% bis 1,49% auf. Besonders auffällig zeigt sich die HLHGruppe. Hier liegen die Werte einer Subgruppe im Bereich der Gesunden, die der anderen Subgruppe deutlich höher. Einen besonders hohen Median weist die PT- Gruppe 48h auf, dieser ist statistisch signifikant (p=0,0350). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.2.3.2 4! 8 CD2/86 MFI 20000 15000 10000 MFI 2500 2000 1500 1000 500 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 14 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD2/86 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD2/86 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 19a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD2/86 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 1,0000 0,0668 0,1148 1,0000 0,6842 0,3829 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 17,00 16,00 16,00 20,00 14,50 17,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U ! Ergebnisse 4! 9 Tabelle 19b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD2/86 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4127 0,1429 0,1775 0,2844 0,0025 1,0000 0,0823 P-Wert Summe ns ns ns ns ** Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Ja Nein Nein 6,000 2,000 7,000 12,00 0,000 20,00 5,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Auch bei der Expressionsdichte der Markerkombination liegen die Messwerte der gesunden Vergleichsgruppe deutlich akkumuliert im unteren Bereich vor (5 bis 262). Die Werte der HLH- und Sepsis- Gruppe zeigen eine etwas deutlichere Streuung, insbesondere die HLHGruppe fällt auch hier auf. Ihre Messwerte liegen im Bereich von 61 bis 19568 vor. Eine Subpopulation von vier Messwerten zeigt dabei Werte über 10000. Auch die Werte der PT- Gruppen liegen eher gestreut vor. Bei den Zeitpunkten 24h und 5d sind eine sehr niedrige sowie eine eher hohe Population auffällig. Am deutlichsten unterscheidet sich die Gruppe PT 48h von der gesunden Kontrolle. Ihr Median ist sehr viel höher gelegen (p=0,0025). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 5! 0 3.3.2.4 CD28 3.3.2.4.1 CD28 % Gated 100 Prozentwert der CD28-exprimierenden Zellen 80 60 40 20 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 15 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD28 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD28 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 20a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD28 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0007 0,0391 0,3026 0,0426 0,0813 0,8785 P-Wert Summe *** * ns * ns Ns Signifikant Ja Ja Nein Ja Nein Nein 0,000 18,00 29,00 8,000 10,00 30,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U ! Ergebnisse 5! 1 Tabelle 20b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD28 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,9143 0,6095 0,0513 0,4908 0,1807 0,0813 0,0152 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns * Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Ja 11,00 9,000 7,000 18,00 11,00 10,00 3,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD28 wird von etwa 90% aller CD4+ und von 50% aller CD8+ T-Zellen exprimiert. Es ist für die Aktivierung von T-Zellen unerlässlich. Im Diagramm zeigt sich für alle Gruppen, bis auf die Sport- Gruppe, tendenziell eher eine Streuung der Messwerte. Die Gruppe der HLHPatienten streut sehr weit (1,41% bis 85,38%), sie weist zudem zwei Gruppen auf. Ihr Median ist im Vergleich zur gesunden Kontrolle deutlich nach unten verschoben. Deutlich niedrigere Medianwerte als der gesunde Vergleich zeigen auch die Sport- (p=0,0007), die HLH(p=0,0391), die Sepsis- Gruppe (p=0,0426) sowie die Gruppe PT 10d (p=0,0152). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.3.2.4.2 5! 2 CD28 MFI 15000 MFI 10000 5000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 16 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD28 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma 24h nach Traumageschehen (=PT24h)] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD28 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 21a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD28 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0080 0,0176 0,0635 0,0593 0,0200 0,7209 P-Wert Summe ** * ns ns * Ns Signifikant Ja Ja Nein Nein Ja Nein 4,000 14,00 19,00 9,000 6,000 28,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U !! ! Ergebnisse 5! 3 Tabelle 21b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD28 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,7619 0,0667 0,2343 0,1812 0,1255 0,0426 0,3939 P-Wert Summe ns ns ns ns ns * ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Ja Nein 10,00 3,000 12,00 13,00 6,000 8,000 12,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Auch bei der Expressionsdichte von CD28 zeigt sich tendenziell, bis auf die Sport- Gruppe, eher eine Streuung der Messwerte. So liegen die Messwerte der gesunden Vergleichsgruppe im Bereich von 4367 bis 7235. Insbesondere die Werte Akkumulation der Sport-Gruppe sticht ins Auge, hier liegen Messwerte lediglich im Bereich von 3745 bis 4902 vor. Auch die HLHGruppe ist auffällig. Der Wertebereich der HLH- Gruppe reicht von 57 bis 9716. Die Medianwerte der Sport- (p=0,0080), der HLH- (p=0,0176), der OTS- Gruppe (p=0,0200) und der Gruppe PT 5d (p=0,0426) sind signifikant niedriger als die der gesunden Kontrolle. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 5! 4 3.3.3 ! NK- T- Zellen 3.3.3.1 CD3/56% Gated 25 Prozentwert der CD3/56-exprimierenden Zellen 20 15 10 5 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT PT 0h is Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 17 : Darstellung des Prozentwertes der CD3/56-exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert der CD3/56-exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie , goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 22a: Vergleich aller Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD3/56 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS PT24 Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0293 0,0015 0,4560 0,1812 0,0513 0,7546 0,3969 P-Wert Summe * ** ns ns ns Ns ns Signifikant Ja Ja Nein Nein Nein Nein Nein 7,000 3,000 30,00 13,00 7,000 21,00 20,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 5! 5 ! Tabelle 22b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD3/56 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=LangerhansZellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4762 0,7143 0,2343 0,7546 0,4744 0,4136 0,3095 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 8,000 7,000 12,00 21,00 15,50 17,00 11,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Die Markerkombination CD3/56 erfasst hier die NK-T-Zellen, welche sowohl den TZellmarker CD3 als auch den typischen NK-Zellmarker CD56 tragen. Auch hier liegen die Werte der meisten Gruppen eher gestreut vor. Lediglich bei der SportGruppe, der HLH- Gruppe, sowie der OTS- Gruppe akkumulieren die Werte eher. Zudem weist jede dieser Gruppen im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe eher niedrigere Messwerte auf. Es zeigen sich statistisch signifikant niedrigere Werte der Sport- Gruppe (p=0,0229) als auch der HLH- Gruppe (p=0,0015) im Vergleich zur Kontroll- Gruppe. Auch der nur knapp oberhalb des Signifikanzniveaus liegende P-Wert (p=0,0513) der OTS- Gruppe ist auffällig. Die Messwerte der PT- Gruppen scheinen bis zum Zeitpunkt 12h anzusteigen um danach wieder abzufallen. Signifikante Unterschiede zum gesunden Vergleich ergeben sich hier allerdings keine. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 5! 6 3.4 Oberflächenmarker von T- und NK-Zellen 3.4.1 CD2 3.4.1.1 CD2 % Gated Prozentwert der CD2-exprimierenden Zellen 150 100 50 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 0h 4h PT PT is PT Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 18 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD2 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD2 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie ! ! Tabelle 23a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD2 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS PT24 Sport P-Wert (Gauss´sche 0,1079 0,3706 0,1489 0,0293 0,7546 0,2448 0,3282 P-Wert Summe ns ns ns * ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Ja Nein Nein Nein 11,00 33,00 24,00 7,000 21,00 14,50 22,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 5! 7 Tabelle 23b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD2 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,7619 0,9143 0,2949 0,2448 0,7308 0,0200 0,0043 P-Wert Summe ns ns ns ns ns * ** Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Ja Ja 10,00 11,00 13,00 14,50 18,00 6,000 1,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD2 ist ein Adhäsionsmolekül auf der Oberfläche von 95 % der T-Zellen, außerdem ist es auf NK-Zellen zu finden. Die Messwerte dieses Markers liegen in den einzelnen Gruppen eher nahe beieinander. Lediglich die HLH- sowie die Sepsisgruppe und die PT- Gruppen 5d und 10d weisen eine größere Streuung der Werte auf. Sechs Messwerte der Sepsis- Gruppe, fünf Messwerte der PT- Gruppe 5d sowie vier der PT- Gruppe 10d liegen unterhalb des niedrigsten Wertes der Kontrollgruppe von 74,76 %. Bei der HLH- Gruppe fällt außerdem auf, dass die therapierten Patienten mit ihren Messwerten zumeist im oberen Messbereich liegen. Signifikant niedrigere Mediane als die Kontrollgruppe zeigen die Sepsisgruppe (p= 0,0293) sowie den PT- Gruppen 5d (p=0,0200) und 10d (p=0,0043). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.4.1.2 5! 8 CD2 MFI 15000 MFI 10000 5000 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT 0h is PT Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 19 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD2 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD2 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 24a: Vergleich aller Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD2 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS PT24 Sport P-Wert (Gauss´sche 0,3660 0,6931 0,8883 0,2824 0,4381 0,4136 0,1893 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 14,00 34,00 34,00 15,00 17,50 17,00 16,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U !! Ergebnisse 5! 9 !! Tabelle 24b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD2 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,1714 0,7619 0,4452 0,4136 0,9372 0,2824 0,5887 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 5,000 10,00 15,00 17,00 17,00 15,00 14,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) !! Mann-Withney-U Die Messwerte sind hier in allen Gruppen eher gestreut, nur in der OTS- Gruppe ist eine deutliche Akkumulation von Werten im Bereich um etwa 2000 festzustellen. Ein signifikanter Unterschied zur gesunden Kontrolle liegt allerdings für keine der Gruppen vor. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 6! 0 3.4.2 CD39 3.4.2.1 CD39 % Gated 40 Prozentwert der CD39-exprimierenden Zellen 30 20 10 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT PT 0h is Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 20 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD39 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD39 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 25a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD39 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS PT24 Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0027 0,4137 0,0094 0,5728 0,0593 0,1812 0,0650 P-Wert Summe ** ns ** ns ns Ns ns Signifikant Ja Nein Ja Nein Nein Nein Nein 2,000 34,00 10,00 19,00 9,000 13,00 14,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 6! 1 ! Tabelle 25b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD39 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,3524 0,0238 0,1014 0,1812 0,0350 0,0027 0,1797 P-Wert Summe ns * ns ns * ** ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Ja Ja Nein 7,000 0,000 9,000 13,00 6,000 2,000 9,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD39 ist wichtiger Inflammationsinhibitor und Thrombozytenaggregationsregulator. Es wird vor allem von Endothelzellen, Monozyten und Makrophagen, aber auch einigen wenigen TZellen und NK-Zellen, exprimiert. Die Messwerte dieses Markers liegen in den einzelnen Gruppen eher gestreut vor. Allerdings lassen sich deutliche Unterschiede feststellen. So liegen die Mediane der Kontroll-, der HLHund der Sepsis- Gruppe eher im unteren Bereich. Diejenigen der OTS- und LCH- Gruppe sowie der PT- Gruppen 0h und 12h eher im mittleren Bereich. Besonders hohe Mediane weisen alle anderen PT- Gruppen und die Sport- Gruppe auf. Im Vergleich zur gesunden Kontrolle liegen die Werte der Sport- Gruppe (p=0,0027), der LCH- Gruppe (p=0,0094) und der PT- Gruppen 4h (p=0,0238), 48h (p=0,0350) und 5d (p=0,0027) deutlich höher. Bei den HLH- und LCH- Patienten fällt auf, dass die therapierten Patienten hier eher Werte im unteren Messwertebereich zeigen. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.4.2.2 6! 2 CD39 MFI 2500 2000 MFI 1500 1000 500 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 21 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD39 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD39 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie , goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 26a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD39 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS PT24 Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0047 0,4137 0,0187 1,0000 0,4381 0,2824 0,1605 P-Wert Summe ** ns * ns ns Ns ns Signifikant Ja Nein Ja Nein Nein Nein Nein 3,000 34,00 13,00 24,00 17,50 15,00 18,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U ! Ergebnisse 6! 3 ! Tabelle 26b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD39 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4762 0,1667 0,1375 0,2824 0,0813 0,0080 0,0931 P-Wert Summe ns ns ns ns ns ** ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Ja Nein 8,000 3,000 10,00 15,00 10,00 4,000 7,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Auch die Expressionsdichte dieses Markers streut in den einzelnen Gruppen sehr deutlich. Lediglich in der OTS- Gruppe fällt eine Häufung von Werten im Bereich von 624 bis 724 auf, lediglich zwei Messwerte liegen unterhalb dieses Bereichs. Auch die PT- Gruppe 12h zeigt eine leichte Akkumulation von Werten. Die Messwerte der Kontrollgruppe liegen hier wieder eher im unteren Bereich, lediglich ein Wert übersteigt 500. Hierzu am unterschiedlichsten stellen sich die Sport- sowie die LCH- Gruppe dar. In der Sportgruppe liegen alle Messwerte deutlich über 500, in der LCH- Gruppe liegt lediglich ein Messwert unter 500. Signifikant höhere Werte im Vergleich zur Kontrollgruppe lassen sich sowohl in der Sportgruppe (p=0,0047), in der LCH- Gruppe (p=0,0187) sowie der PT- Gruppe 5d (p=0,0080) feststellen. Auch hier fällt bei HLH- und LCH- Patienten auf, dass die therapierten Patienten sich eher im unteren Messwertebereich befinden. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 6! 4 3.4.3 CD244 3.4.3.1 CD244 % Gated 100 Prozentwert der CD244-exprimierenden Zellen 80 60 40 20 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 22 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD244 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD244 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 27a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD244 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,1079 0,5593 0,2364 0,1419 0,1079 0,5054 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 11,00 37,00 25,00 12,00 11,00 25,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 6! 5 ! Tabelle 27b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD244 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4762 0,0095 0,0513 0,4908 0,2949 0,0200 0,3095 P-Wert Summe ns ** ns ns ns * ns Signifikant Nein Ja Nein Nein Nein Ja Nein 8,000 0,000 7,000 18,00 13,00 6,000 11,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD 244 wird auf der Oberfläche ruhender aber auch aktivierter NK-Zellen und auf etwa der Hälfte der CD8+ T-Zellen und sehr wenigen CD4+ T-Zellen exprimiert. CD244 kann daher als typischer Marker der zytotoxischen Lymphozyten angesehen werden. Die Messwerte dieses Markers liegen in der Kontrollgruppe relativ nahe beieinander im Bereich von 19,27% bis 31,84%. Im Gegensatz dazu streuen die Messwerte aller anderen Gruppen sehr viel weiter. Insbesondere die HLH- Gruppe ist hier auffällig. Sie weist Werte von 1,25% bis 87,5% auf. Die therapierten HLH- Patienten siedeln sich eher im oberen Messwertebereich an. Auch die PT- Gruppen, außer PT 4h, streuen stark, weisen aber insgesamt eher höhere Werte auf. Die höchsten Mediane aller Gruppen sind dabei bei 4h und 12h zu finden. Signifikante Unterschiede zum gesunden Vergleich lassen sich bei den PTGruppen 4h (p=0,0095) sowie 5d (p=0,0200) finden. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 6! 6 3.4.3.2 CD244 MFI Prozentwert der CD244-exprimierenden Zellen 30000 20000 10000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 23 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD244 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD244 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 28a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD244 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,9497 0,8457 0,2655 0,2284 1,0000 0,7209 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 23,00 42,00 28,00 14,00 23,50 28,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) !! ! Mann-Withney-U Ergebnisse 6! 7 Tabelle 28b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD244 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,9143 0,3524 0,1014 0,2824 0,4452 0,0813 0,6991 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 11,00 7,000 9,000 15,00 15,00 10,00 15,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Die Messwerte der Expressionsdichte von CD244 liegen eher gestreut vor. Eine besonders große Streuung fällt erneut bei den HLH- Patienten auf. Die Messwerte liegen im Bereich von 955 bis 22189, wobei sich die therapierten Patienten hier wieder eher im oberen Messbereich ansiedeln. Gegenläufiges ist bei den LCH- Patienten zu beobachten. Hier finden sich die therapierten Patienten eher im unteren Messbereich. Signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe finden sich bei keiner der Gruppen. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 6! 8 3.5 Oberflächenmarker der NK-Zellen 3.5.1 CD11b 3.5.1.1 CD11b % Gated 100 Prozentwert der CD11b-exprimierenden Zellen 80 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT is 0h PT PT Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 24 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD11b exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD11b exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 29a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD11b (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0593 0,1990 0,9671 0,4136 0,9497 0,0148 P-Wert Summe ns ns ns ns ns * Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Ja 9,000 28,00 41,00 17,00 13,00 9,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 6! 9 Tabelle 29b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD11b (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,2571 0,0667 0,0513 0,1812 0,4848 0,1812 0,9372 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 6,000 3,000 7,000 13,00 13,00 13,00 17,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD11b ist wichtiger Regulator bei der Adhäsion und Migration von Leukozyten. Die Messwerte liegen hier in der Kontroll- und der Sport- Gruppe sowie den PT- Gruppen 4h, 12h, 24h und 5d eher akkumuliert vor, wobei der Median der gesunden Kontrolle deutlich unter demjenigen der anderen Gruppen liegt. Die Messwerte in den anderen Gruppen sind sehr viel weiter gestreut. Die Werte der Sport-Gruppe sind tendenziell höher als die der gesunden Kontrolle (p=0,0593). Die Werte der Sport- Gruppe sind deutlich höher als die der OTS-Gruppe (p=0,0148). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.5.1.2 7! 0 CD11b MFI 15000 MFI 10000 5000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 25 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD11b (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD11b auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 30a: Vergleich aller Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD11b (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,0007 0,1078 0,9671 0,5728 0,4136 0,0002 P-Wert Summe *** ns ns ns ns *** Signifikant Ja Nein Nein Nein Nein Ja 0,000 22,00 41,00 19,00 17,00 0,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 7! 1 ! Tabelle 30b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD11b (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,7619 0,0190 0,1807 0,0426 0,4848 0,3450 0,0931 P-Wert Summe ns * ns * ns Ns ns Signifikant Nein Ja Nein Ja Nein Nein Nein 10,00 1,000 11,00 8,000 13,00 16,00 7,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Bei der Expressionsdichte von CD11b fällt auf, dass sich die Messwerte der Kontroll-, der OTS- sowie der HLH- Gruppe als Wolken gehäuft eher im unteren Bereich befinden, keiner ihrer Messwerte übersteigt 5000. Im Gegensatz dazu fällt insbesondere die Sport- Gruppe auf. Hier liegen alle gemessenen Werte über 6000, sie streuen bis etwa 13500. In der LCH- und der Sepsis- Gruppe sind jeweils eine Gruppen mit sehr niedrigen und eine Gruppe mit hohen Messwerten auffällig. Die Werte aller PT- Gruppen liegen gestreut vor. Ihre Mediane sind im etwas höher angesiedelt als derjenige der gesunden Kontrolle. Im Vergleich mit der gesunden Kontrolle weist die HLH- Gruppe deutlich niedrigere Werte (p=0,1078) auf. Die Werte der Sport- Gruppe (p=0,0007) sowie der PT- Gruppen 4h (p=0,0190) und 24h (p=0,0426) liegen hingegen deutlich über denen der Kontrollgruppe. Die Werte der Sport-Gruppe liegen erheblich höher als die der Sport- Gruppe mit der OTSGruppe (p=0,0002). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 7! 2 3.5.2 CD56 3.5.2.1 CD56 % Gated 80 Prozentwert der CD56-exprimierenden Zellen 60 40 20 10 d 5d PT PT 48 h PT 24 h PT 12 h 4h PT PT 0h PT is Se ps LC H LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ! Abbildung 26 : Darstellung des Prozentwertes ( = % Gated) der CD56 exprimierenden Lymphozyten (CD= Cluster of Differentiation) im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse;Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Prozentwert (= % Gated) der CD56 exprimierenden Zellen Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! ! Tabelle 31a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD56 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). ! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,6620 0,1105 0,9626 1,0000 0,6620 0,4418 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein 20,00 24,00 35,00 24,00 20,00 24,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 7! 3 !! Tabelle 31b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD56 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,1714 0,1143 0,4452 1,000 0,4848 0,6982 0,5887 P-Wert Summe ns ns ns ns ns Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein 5,000 4,000 15,00 24,00 13,00 20,50 14,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U CD56 (auch NKH-I) ist eine Isoform des neuralen Adhäsionsmoleküls NCAM und wird auf NK-Zellen exprimiert. Die Messwerte dieses Markers liegen in allen Gruppen zumeist unter 35%. Lediglich je ein Messwert in der Sepsis- und in der PT- Gruppe 4h sowie zwei Werte der HLH- Gruppe liegen über 30%. Insgesamt sind die Mediane der HLH- Gruppe sowie der PT- Gruppe 0h allerdings am deutlichsten nach unten verschoben. Signifikante Unterschiede gibt es keine. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.5.3.2 7! 4 CD56 MFI ! 4000 MFI 3000 2000 1000 LC H Se ps is PT 0h PT 4h PT 12 h PT 24 h PT 48 h PT 5d PT 10 d LH H TS O Sp or t K on tr ol le 0 Patientengruppe ' Abbildung 27 : Darstellung der Expressionsdichte ( MFI= Mean Fluorescence Intensity) von CD56 (CD= Cluster of Differentiation) auf den Lymphozyten im Scatterdiagramm; einzelne Messpunkte entsprechend den Einzelmesswerten der Blutprobenanalyse; Grauer Balken = Median x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Hauptdiagnose [Kontrolle, Sport, HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), Sepsis, OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT) in Stunden (h) bzw. Tagen (d) nach Traumageschehen] y-Achse: Expressionsdichte (= MFI) von CD56 auf den gemessenen Lymphozyten Ausgefüllte Symbole bei HLH und LCH Patienten: schwarz= Therapiestatus unbekannt, weiß= keine Therapie, goldfarben= Therapie !! Tabelle 32a: Vergleich der Patientengruppen mit der gesunden Kontrollgruppe sowie Vergleich der Overtraininggruppe mit der Sportgruppe bezüglich CD56 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). Mann-Whitney-U- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ Test Sport HLH LCH Sepsis OTS Sport P-Wert (Gauss´sche 0,6216 0,0611 0,0098 0,4351 0,7694 0,5737 P-Wert Summe ns ns ** ns ns Ns Signifikant Nein Nein Ja Nein Nein Nein 16,00 13,00 5,000 14,00 17,50 26,00 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) Mann-Withney-U Ergebnisse 7! 5 Tabelle 32b: Vergleich der Polytrauma- Patienten mit der gesunden Kontrollgruppe bezüglich CD56 (CD= Cluster of Differentiation). HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (=Langerhans-Zellhistiozytose), OTS (=Overtraining), Polytrauma (=PT). !! Mann-Whitney- Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ Kontrolle/ OTS/ U-Test PT0h PT4h PT12h PT24h PT48h PT5d PT10d P-Wert (Gauss´sche 0,4127 0,7302 0,6623 0,7242 0,0480 0,9433 0,2468 P-Wert Summe ns ns ns ns * Ns ns Signifikant Nein Nein Nein Nein Ja Nein Nein 6,000 8,000 12,00 17,00 5,000 19,00 8,000 Approximation) unterschiedliche Mediane? (P<0,05) ! ! Mann-Withney-U Die Werte des gesunden Vergleichs befinden sich hier gestreut im Bereich von 565 bis 1262. Alle anderen Gruppen weisen deutlich niedrigere Minima auf. Bis auf die LCH- sowie die PTGruppe 48h haben auch alle Gruppen deutlich höhere Maxima. Bei der HLH- Gruppe fallen zwei Populationen auf. Sieben Messwerte sind dabei besonders niedrig, unter 150, angesiedelt. Der Median der HLH- Gruppe ist ebenfalls sehr niedrig. Signifikant niedrigere Werte als der gesunde Vergleich zeigen sich bei der LCH- Gruppe (p=0,0098) sowie der PT- Gruppe 48h (p=0,0480). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 7! 6 3.6 Klinische Scores der Polytraumapatienten 3.6.1 ISS ! 60 50 Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Scoringwert 40 30 20 10 0 ! Abbildung 28: Darstellung der ISS (= Injury Severity Score)- Werte der Polytrauma- Patienten 1-8 nach Polytraumageschehen; Raute = Patienten, welche eine Sepsis entwickelten (Patient 4,5,7,8); Dreieck = Patienten ohne Sepsis (Patient 1,2,3,6); je höher der ermittelte Wert, desto höher der Schweregrad der Verletzungen. ! Die polytraumatisierten Patienten zeigen in im ISS Werte zwischen 27 und 51. Den geringsten Scoring-Wert weist dabei Patient 6 mit 27 Punkten auf. Auch die Patienten 2 und 3 (jeweils 33 Punkte) sowie 8 (36 Punkte) und 4 (38 Punkte) liegen eher im unteren Bereich und sind somit weniger schwer verletzt als die Patienten 1 (45 Punkte), 5 (48 Punkte) und 7 (51 Punkte). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.6.2 ! 7! 7 SOFA-Score 16 Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 14 12 Scoringwerte 10 8 6 4 2 0 24 48 120 240 Erhebungszeitpunkte in Stunden ! Abbildung 29: Darstellung der SOFA (= Sequential Organ Failure Assessment)- Score- Werte (ohne GCS (=Glasgow Coma Scale) der Polytrauma- Patienten 1-8 im Verlauf zu den Zeitpunkten 24 Stunden, 48 Stunden, 120 Stunden und 240 Stunden. Raute = Patienten, welche eine Sepsis entwickelten (Patient 4,5,7,8); Dreieck = Patienten ohne Sepsis (Patient 1,2,3,6); je höher der ermittelte Wert, desto schlechter die Organfunktion und damit der Zustand des Patienten ! Die SOFA- Werte der Polytraumapatienten lassen sich in zwei Gruppen gliedern. Die Patienten 5, 7 und 8 weisen deutlich höhere Werte als die restlichen Patienten auf, d. h. ein deutlich höheres Ausmaß an Organfunktionsstörungen. Patient 5 bessert sich bezüglich der Organfunktionen im Verlauf, 8 zeigt sich gleichbleibend und 7 steigt deutlich an. Die zweite Gruppe mit deutlich niedrigeren Messwerten bilden die anderen Patienten 1, 2, 3, 4 und 6. Von Patient 1 lagen uns leider nur zwei Messwerte vor, da der Patient glücklicherweise bereits nach zwei Tagen von Intensivstation auf Normalstation verlegt werden konnte. ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.6.3 7! 8 SAPS 3 90 Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 80 70 Scoringwerte 60 50 40 30 20 10 0 24 Erhebungszeitpunkte in Stunden ! Abbildung 30: Darstellung der SAPS 3 (= Simplified Acute Physiology Score 3)- Werte der Polytrauma- Patienten 1-8 zum Zeitpunkt 24 Stunden; Raute = Patienten, welche eine Sepsis entwickelten (Patient 4,5,7,8); Dreieck = Patienten ohne Sepsis (Patient 1,2,3,6); je höher der ermittelte Wert, desto höher der Schweregrad der Erkrankung sowie desto schlechter die Prognose des Patienten. ! Auch hier wird eine Aufteilung der Patienten in zwei Gruppen sichtbar. Diese entspricht der des SOFA- Scores, jedoch zeigt sich auch Patient 4 hier, im Gegensatz zu seinen SOFAScores, deutlich im höheren Bereich. Die höchsten gemessenen Werte weist auch im SAPS 3 Score wieder Patient 7 auf. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.6.4 7! 9 Sepsis 9 Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 8 7 Scoringwerte 6 5 4 3 2 1 0 24 48 120 240 Erhebungszeitpunkte in Stunden ! Abbildung 31: Darstellung der Sepsis- Score- Werte der Polytrauma- Patienten 1-8 im Verlauf zu den Zeitpunkten 24 Stunden, 48 Stunden, 120 Stunden und 240 Stunden. Raute = Patienten, welche eine Sepsis entwickelten (Patient 4,5,7,8); Dreieck = Patienten ohne Sepsis (Patient 1,2,3,6). ! Patient 1 befand sich zum Messzeitpunkt 24h noch im SIRS-Schock, bessert sich dann aber im Verlauf und konnte bereits nach zwei Tagen auf Normalstation verlegt werden. Bei Patient 2 fand sich zu allen Messzeitpunkten ein SIRS, Patient 3 entwickelte aus seinem SIRS nach 48h ein schweres SIRS. Patient 6 wies im Gegensatz dazu eine günstigere Entwicklung auf, so entwickelte sich bei ihm aus einem schweren SIRS (24h) ein SIRS (48h) und schließlich wies er keine Organdysfunktion mehr auf (120h, 240h). Die Patienten 4, 5, 7 und 8 entwickelten alle samt eine schwere Sepsis. Patient 5, 7, und 8 zeigten schließlich im Verlauf sogar einen septischen Schock. Die septischen Patienten 4, 5, 7, und 8 zeigten auch bei ihren SAPS-3 Werten deutlich höhere Werte als der Rest der Gruppe. Die Patienten 5, 7 und 8 wiesen außerdem auch in ihren SOFA-Scores deutlich höhere Werte als die restlichen Polytrauma-Patienten auf. ! ! ! ! ! ! ! Ergebnisse 3.7 8! 0 Zusammenfassung der Ergebnisse Für die vorliegende Arbeit wurden die Blutproben von insgesamt 67 Probanden gesammelt und mit der Immunphänotypisierung zellspezifische Oberflächenmarker gemessen. Das Patientenkollektiv wurde in die Gruppen Kontrolle, Sport, OTS, HLH, LCH, Sepsis und Polytrauma 0h, 4h, 12h, 24h, 48h, 5d und 10d eingeteilt. In der HLH- sowie der LCHGruppe wurden zudem noch therapierte, nicht- therapierte sowie Patienten ohne bekannten Therapiestatus unterschieden. Als statisitscher Test wurde der Mann- Whitney-U- Test gewählt, welcher die einzelnen Gruppen jeweils mit der gesunden Kontrollgruppe vergleicht. Zudem wurde mit diesem Test jeweils auch die Sport- mit der OTS- Gruppe verglichen. ! 3.7.1 Gesamtzahl der T-Zellen 3.7.1.1 Therapiestatus bei HLH und LCH Für die T-Zellmarker CD3 sowie CD 8 ließen sich bei den therapierten HLH- Patienten deutlich höhere % Gated- Werte ausmachen. 3.7.1.2 Statistisch signifikante Unterschiede Für die T-Zellpopulationen ergaben sich dabei signifikante Unterschiede mit P-Werten < 0,05 für: - CD3: Die Sport- (p=*), die Sepsis- Gruppe(p=*) sowie die PT- Gruppen 5d (p=*) und 10d (p=**) wiesen im Vergleich zur gesunden Kontrolle signifikant niedrigere Werte auf. - CD4: Signifikant niedriger als die gesunde Kontrolle waren die % Gated-Werte der HLH- (p=*) sowie die OTS- Gruppe (p=*). Die MFI- Werte der HLH-(p=**) sowie der Sepsis- Gruppe (p=*) waren ebenfalls signifikant niedriger. - CD8: Hier ergab sich für die Gruppe PT 10d (p=*) für den % Gated- Wert ein signifikant niedriger Median. Für die MFI- Werte wies die HLH- Gruppe (p=*) signifikant niedrigere Messwerte auf. ! ! ! ! ! ! ! ! ! - IL7R: Die PT- Gruppe 4h wies hier einen signifikant höhere Messwerte auf (p=*). Ergebnisse 8! 1 3.7.2 Aktivierte T-Zellen 3.7.2.1 Therapiestatus bei HLH und LCH Für die T-Zellmarker ließen sich keine auffälligen Unterschiede zwischen den therapierten, nicht- therapierten und Patienten ohne bekannten Therapiestatus bei den Gruppen HLH und LCH feststellen. 3.7.2.2 Statistisch signifikante Unterschiede Für die aktivierten T-Zellpopulationen ergaben sich dabei signifikante Unterschiede mit P-Werten < 0,05 für: - CD4/25: Die % Gated- Werte der HLH- Gruppe (p=*) waren signifikant niedriger als diejenigen des gesunden Vergleichs. Auch die MFI- Werte der HLH- Gruppe (p=**) zeigten signifikant niedrigere Werte. - CD8/25: Die % Gated- Werte der Sport- (p=*), der PT- Gruppen 4h (p=*), 12h (p=*), 24h (p=*), 48h (p=**), 5d (p=*) erwiesen sich im Vergleich mit der gesunden Kontrolle als signifikant höher. Die MFI- Werte der Sport- (p=*), LCH- (p=*) sowie der PT- Gruppen 12h (p=*), 24h (p=*), 48h (p=*), 5d (p=*), 10d (p=*) waren ebenfalls signifikant höher. Auch der Vergleich der % Gated- Werte der Sport- (p=*) mit der OTS- Gruppe (p=*) ergab signifikant höhere Werte für die Sport- Gruppe. - CD2/86: Hier waren sowohl die % Gated- Werte (p=*) wie auch die MFI- Werte (p=*) der PT- Gruppe 48h signifikant höher gelegen als der gesunde Vergleich. - CD28: Die % Gated- Werte der Sport- (p=***), HLH- (p=*), der Sepsis- Gruppe (p=*) sowie der PT- Gruppe 10d (p=*) zeigten sich im Vergleich zur Kontrollgruppe als signifikant niedriger. Die MFI- Werte der Sport- (p=**), HLH- (p=*), OTSGruppe (p=*) und PT 5d (p=*) erwiesen sich ebenfalls als signifikant niedriger ! 3.7.3 NK- T-Zellen 3.7.3.1 Therapiestatus bei HLH und LCH Für die NK- T-Zellmarker ließen sich keine auffälligen Unterschiede zwischen den therapierten, nicht- therapierten und Patienten ohne bekannten Therapiestatus bei den Gruppen HLH und LCH feststellen. 3.7.3.2 Statistisch signifikante Unterschiede Für die NK- T-Zellpopulationen ergaben sich dabei signifikante Unterschiede mit P-Werten < 0,05 für: - ! ! ! CD3/56: Die Sport- (p=*) sowie die HLH- Gruppe (p=**) wies im Vergleich zur gesunden Kontrolle signifikant niedrigere Werte auf. Ergebnisse 8! 2 3.7.4 Gemischte Marker 3.7.4.1 Therapiestatus bei HLH und LCH Für die NK- T-Zellmarker ließen sich bei den % Gated- Werten des Markers CD2 sowie CD244 eher höhere Werte für die therapierten HLH- Patienten feststellen. Bei den % Gated- und MFI- Werten des Markers CD39 fanden sich hingegen die therapierten HLH und LCH- Patienten eher im unteren Messwertebereich. 3.7.4.2 Statistisch signifikante Unterschiede Für die T- und NK- Zellpopulationen ergaben sich dabei signifikante Unterschiede mit P-Werten < 0,05 für: - CD2: Die % Gated- Werte waren hier bei der Sepsis- Gruppe (p=*) und den PTGruppen 5d (p=*) und 10d (p=**) signifikant niedriger als diejenigen der gesunden Kontrolle. - CD39: Die % Gated- Werte der Sport- (p=**), der LCH- Gruppe (p=**) sowie der PT- Gruppen 4h (p=*), 48h (p=*) und 5d (p=**) waren signifikant höher als die des gesunden Vergleichs. Auch bei den MFI- Werten zeigte sich für die Sport- (p=**), die LCH- Gruppe (p=*) sowie die PT- Gruppe 5d (p=**) diese Auffälligkeit. - CD244: Hier zeigten sich signifikant höhere % Gated Messwerte für die PT- Gruppen 4h (p=**) und 5d (p=*). ! 3.7.5 NK- Zell- Marker 3.7.5.1 Therapiestatus bei HLH und LCH Für die NK-Zellmarker ließen sich keine auffälligen Unterschiede zwischen den therapierten, nicht- therapierten und Patienten ohne bekannten Therapiestatus bei den Gruppen HLH und LCH feststellen. 3.7.5.2 Statistisch signifikante Unterschiede Für die NK- Zellpopulationen ergaben sich dabei signifikante Unterschiede mit P-Werten < 0,05 für: - CD11b: Die % Gated- Werte zeigten für den Vergleich der Sport- mit der OTSGruppe einen signifikant höhere Messwerte für die Sport- Gruppe (p=*). Auch bei den MFI- Werten zeigte sich für diesen Vergleich signifikant höhere Werte (p=***). Außerdem zeigten sich die MFI- Werte der Sport- (p=***) und der PT- Gruppe 4h(p=*) und 24h (p=*) im Vergleich zur gesunden Kontrolle signifikant höher. - ! CD56: Die MFI- Werte der LCH- Gruppe (p=**) sowie der PT- Gruppe 48h (p=*) erwiesen sich hier als signifikant niedriger als die gesunde Kontrolle. Diskussion 8! 3 4 Diskussion 4.1 Methodische Aspekte 4.1.1 Patientenkollektiv Insgesamt konnten für diese Arbeit 67 Blutproben analysiert werden. Diese wurden in der Sektion „Experimentelle Anästhesie“ abgenommen (Kontrolle, Sport) oder aber der Sektion von anderen in- und ausländischen Kliniken speziell für eine Immunphänotypisierung (HLH, LCH) zugeschickt bzw. von anderen Abteilungen des Universitätsklinikums (Sepsis, OTS, PT) zugesandt. Für die Aufnahme der Patienten in ein bestimmtes Patientenkollektiv spielte hierbei weder das Alter noch das Geschlecht, Vorerkrankungen oder derzeitige therapeutische Maßnahmen eine Rolle. Alle der experimentellen Anästhesie über einen Zeitraum von 9 Monaten zugesandten Proben wurden lediglich diagnosespezifisch unterschieden und so in die verschieden Gruppen verteilt. Ein gewisser Selektionseffekt aufgrund von Patientenalter, Geschlecht oder anderen Faktoren ist dabei nicht auszuschließen. So weist die PT-Gruppe beispielsweise vornehmlich ältere Patienten (über 60 Jahre) auf, wohingegen in der HLHGruppe vornehmlich jüngere Patienten (unter 50 Jahre) zu finden sind. In der OTS-Gruppe überwiegt das männliche Geschlecht deutlich (eine weibliche Patientin, sieben männliche Patienten). Diese Effekte waren bei einem derartig kleinen Stichprobenumfang und dem begrenzten Messzeitraum nicht zu vermeiden. Bewusst selektiert wurde in der vorliegenden Arbeit die Kontroll- sowie die Sport-Gruppe. Hier wurden ausschließlich junge, gesunde Probanden gemessen, da sich das Immunsystem im Laufe des Lebens nach durchgemachten Infekten und im Zuge vermehrt auftretender chronischer Krankheiten massiv verändert. (Sansoni et al. 2008) Für die gesunden Bezugsgruppen sollten eben diese Effekte möglichst vermieden werden. ! 4.1.2 Statistik Nach diagnosespezifischer Verteilung der Patienten in die verschiedenen Gruppen, ergaben sich Stichproben mit relativ kleinem Umfang. Für beweisende statistische Aussagen waren diese deutlich zu klein. Es kamen daher auch keine parametrischen Tests zum Einsatz, wie sie für beweisende statistische Aussagen nötig gewesen wären. Für die vorliegende Arbeit wurde der Mann- Whitney- U- Test verwendet. Dieser ist als nichtparametrischer Test auch für kleine Stichprobenumfänge geeignet, bei welchen Zufallsvariablen wie beispielsweise die Verteilung oder die Varianz in der Regel nicht bekannt sind. Mittels des Rangsummen- Prinzips wird dabei, ohne Vorraussetzung einer Gauss´schen Normalverteilung, jedem Messwert eine spezifische Rangzahl zugeordnet. Die Teststatistik wird nach Errechnung der so entstandenen Rangsumme gebildet. Es werden also lediglich die Ränge der Daten und nicht die eigentlichen Messwerte analysiert. Dabei besteht die Gefahr, dass nicht die gesamte Aussagekraft der Daten genutzt wird. Auch bleibt eine Diskussion 8! 4 Datenmanipulation folgenlos, sofern sich dadurch die Rangfolge der Rangzahlen nicht verändert. Die Testkraft eines nicht- parametrischen Tests ist also deutlich geringer, als diejenige eines parametrischen Tests wie beispielsweise des t-Tests. Das heißt, dass die Nullhypothese bei nicht-parametrischen Tests wesentlich schneller fälschlicherweise angenommen wird, obwohl die Alternativhypothese richtig gewesen wäre. Für die vorliegenden Daten bei derart kleinen Stichproben sind nicht- parametrische Tests allerdings die einzig sinnvollen statistischen Tests. So wird durch die Bewertung von Rangzahlen anstelle von absoluten Messwerten auch die Verzerrung aufgrund besonders hoher bzw. niedriger Messwerte („Ausreißer“) deutlich vermindert. Um die Verzerrung der Messdaten durch Ausreißer bestmöglich gering zu halten, kam zudem der Grubbs- Ausreißer-Test zum Einsatz. So genannte Ausreißer können dabei Mess- oder Dokumentationsfehler sein, aber auch im speziellen pathologischen Hintergrund des Patienten begründet sein. Ein pathologischer Hintergrund bei sehr hohen bzw. niedrigen Messwerten ist für die vorliegende Arbeit relevant und sehr interessant. Daher wurde nun zunächst die Gesamtsituation auffälliger Messwerte genauer beleuchtet und diese dann gegebenenfalls zur Testung nach Grubbs herangezogen, um somit Mess- und Dokumentationsfehler auszuschließen. Aufgrund der sehr geringen Gruppengrößen kann hierbei aber nicht völlig ausgeschlossen werden, ob es sich bei sehr hohen bzw. sehr niedrigen Messwerten nicht auch um eine natürliche Streuung von Messwerten handelt. Nicht alle in den Diagrammen sichtbaren Unterschiede erwiesen sich als statistisch signifikant. Das heißt ein Unterschied besteht entweder nicht oder er kann aufgrund der geringen Fallzahlen nicht nachgewiesen werden. (Weis 2005) Die vorliegende Arbeit soll lediglich Hinweise auf mögliche Besonderheiten und Unterschiede bei den verschiedenen Krankheitsbildern geben, und dient dazu Hypothesen zu generieren. Die Signifikanzprüfung mit einem Signifikanzniveau von 0,05 dient dabei einer verbesserten Übersicht und erbringt keinerlei statistische Beweise. Diese müssten mittels weitaus größerer Fallzahlen erbracht werden. ! 4.1.3 Experimentelle Methodik Das Immunsystem des Menschen ist ein äußerst komplexes und kompliziertes System. Die Durchflusszytometrie bietet die Möglichkeit dieses genauer zu beleuchten. Mittels Fluoreszenz- markierter Antikörper ist es möglich die spezifische Antigenexpression bestimmter Zellen darzustellen und damit Rückschlüsse auf Zellzahl, Zelllinientyp und Differenzierungsgrad der Zellen zu ziehen. Dies gehört bei bestimmten Erkrankungen vor allem in der Hämatologie, wie beispielsweise Lymphomen oder der CLL (chronisch lymphatischen Leukämie), bereits zur Standarddiagnostik. Doch auch bei anderen Krankheiten könnte die Immunphänotypisierung wichtige Aufschlüsse geben, da sie die Diskussion 8! 5 Möglichkeit bietet die immunologische Situation eines Patienten relativ schnell und kostengünstig genauer zu beleuchten. Insbesondere Patienten deren Immunsystem massiv beeinträchtigt ist, können von einer derartigen Diagnostik profitieren. In der vorliegenden Arbeit wurden nun Krankheitsbilder bei denen das Immunsystem bekanntermaßen beeinträchtigt ist anhand ihrer Oberflächenmarker mit einer gesunden Kontrolle verglichen. Dabei auftretenden Besonderheiten in der lymphatischen Zelllinie konnten so detektiert werden und sollen dazu dienen neue Hypothesen im Bezug auf ein bestimmtes Krankheitsgeschehen zu generieren. Die Durchführung der Durchflusszytometrie ist nach Unterweisung und in einem darauf ausgerichteten Labor relativ einfach. Allerdings können auch falsche Messwerte bei jedem einzelnen, der zumeist manuellen, Arbeitschritt entstehen. Die monoklonalen Antikörper mit denen gearbeitet wurde sind ausgesprochen licht- und wärmeempfindlichen. Zum Teil mussten sie außerdem noch speziell verdünnt werden. Das Pipettieren der Antikörper in die einzelnen Blutproben erfolgte manuell und erforderte einige Konzentration. Auch die zeitnahe Bearbeitung des eingesandten Blutes war nicht immer gleichgut gewährleistet, da Proben z. T. beispielsweise aus England geschickt wurden. Mögliche Auffälligkeiten wie nicht detektierbare Antikörper aufgrund von Pipettierfehlern bzw. nicht mehr funktionierenden Antikörpern oder aber auch extrem geringe Zellzahlen in einer Probe konnten erst bei der Messung im FACSGerät festgestellt werden. Nicht immer war dann noch genug Blut des Patienten vorrätig um eine Probe mit einem bestimmten Antikörper erneut zu markieren. Einige mögliche weitere Patienten gingen so dem Patientenkollektiv verloren. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Diskussion 4.2 8! 6 Inhaltliche Aspekte In dieser Arbeit wurden die CD- Markerprofile verschiedener Patientengruppen deren Immunsystem massiv beeinträchtigt ist mit einer gesunden Kontrolle bzw. untereinander verglichen. Besonderes Augenmerk lag dabei auf der möglichen Rolle von Lymphozyten, also der T- und NK-Zellen, beim jeweiligen Krankheitsgeschehen. ! 4.2.1 Diskussion der Auffälligkeiten der einzelnen Oberflächenmarker 4.2.1.1 Gesamtzahl der T-Zellen 4.2.1.1.1 CD3 CD 3 ist typischer T-Zellmarker, der von allen Thymozyten und reifen T-Zellen exprimiert wird. Die Messung dieses Markers mittels Immunphänotypisierung erfasst dementsprechend die Gesamtzahl der im Blut zirkulierenden T-Zellen. Die Messwerte in den einzelnen Gruppen lagen zumeist relativ nahe beieinander. Lediglich die HLH- und die Sepsisgruppe zeigten eine größere Streuung ihrer Messwerte insbesondere fielen hier viele niedrige Messwerte auf. Bei den HLH- Patienten lag dabei insbesondere der unbehandelte Anteil im unteren Bereich (Abb.3). Die T-Zellanzahl scheint also bei beiden Krankheitsbildern ausgesprochen variabel aber in sich ähnlich zu sein. Dies passt zu den Beobachtungen Kumars wonach Patienten mit unbehandelter HLH oftmals ein dem SIRS relativ ähnliches Krankheitsbild zeigen. (Kumar et al. 2006) Statistisch signifikant niedrigere Werte als der gesunde Vergleich wiesen die Sepsisgruppe aber auch die Sportgruppe auf. Auch bei Leistungssport scheint also die Zahl der im Blut zirkulierenden T-Zellen vermindert. Im Allgemeinen wird von einer Vermehrung der im Blut zirkulierenden T-Zellen bei körperlicher Betätigung ausgegangen. So zeigt sich in einer US-Studie, dass sich sportliche Aktivität bei Tumorpatienten nach Chemotherapie positiv auf die Anzahl der funktionsfähigen T-Zellen im Blut auswirkt. (Hayes et al. 2003) Auch andere Studien zeigen, dass die T-Zellanzahl bei sportlicher Betätigung erst einmal deutlich ansteigt. Gleichzeitig zeigen sie allerdings auch, dass direkt im Anschluss an hohe körperliche Leistung in der Regenerationsphase des Körpers sowohl T- als auch NK-Zellzahlen deutlich abnehmen. Dies beruht insbesondere auf einer verminderten Ausschüttung von IL-2 sowie INF-γ, was zu einer geringeren TZellproliferation führt. (Pedersen u. Hoffman-Goetz 2000; Gleeson u. Bishop 2005) Die für diese Arbeit gemessene Rudermannschaft gab ihre Proben unmittelbar im Anschluss an ein einwöchiges Trainingslager ab, befand sich also in eben dieser Situation der Regeneration nach höchster Leistungserbringung. Die hier gemessenen Werte sprechen somit für die in der Literatur beschriebenen Annahmen. Die deutlich niedrigeren Messwerte der Sepsisgruppe passen zu den Beobachtungen Venet et al., welche zeigen konnten, dass insbesondere die Anzahl der γδ- T- Zellen im peripheren Blut im septischen Schock deutlich verringert waren. Dies könnte mitverantwortlich für eine Diskussion 8! 7 vermehrte Anfälligkeit für Zweitinfektionen in diesem Stadium der Sepsis sein. (Venet et al. 2005) Die von uns gemessenen Patienten befanden sich, bis auf eine Ausnahme, bei Messung alle im septischen Schock. Einen weiteren Beleg für diese Annahme liefern die Polytrauma-Patienten. Bei der Polytrauma-Gruppe zeigten sich für die Zeitpunkte 5d und 10d signifikant niedrigere Werte als bei der gesunden Kontrolle. Dabei waren vor allem die Messwerte von Patient 7 zu beiden Zeitpunkten auffällig niedrig. Zum Zeitpunkt 10d wies außerdem Patient 5 einen sehr niedrigen Messwert auf. Sowohl Patient 5 also auch Patient 7 wiesen zum Zeitpunkt 5d (=120h) eine schwere Sepsis auf und entwickelten schließlich zum Zeitpunkt 10d (=240h) einen septischen Schock. (siehe Abb. 30) Beide Patienten zeigten zudem bei Aufnahme im SAPS-3 Score die höchsten Werte der gesamten Gruppe auf, nämlich 69 (Patient 5) bzw. 77 (Patient7) (Abb. 29). Auch im ISS zeigten diese beiden Patienten die jeweils höchsten Werte der Gruppe 48 (Patient 5) und 51 (Patient 7), waren also am schwersten verletzt. Im SOFA Score zeigte Patient 7 bei jedem einzelnen der Erhebungszeitpunkte die höchsten Scoringwerte im Gruppenvergleich (Abb. 28). Die klinische Verschlechterung dieser Patienten wie sie die Scoringwerte belegen, ging also mit einer deutlichen Verminderung der T-Zellzahl einher. Dies spiegeln die Messwerte in Abb. 3 wieder. ! 4.2.1.1.2 CD4 CD4 ist wichtiger Oberflächenmarker der T-Helferzellen., außerdem ist er auf Monozyten und Makrophagen zu finden. Da in dieser Arbeit lediglich das Lymphozytenfenster betrachtet wird, wird hier nur die CD4- Expression der T-Helferzellen beschrieben. (Barcley et al. 1993; Brady et al. 1993) Sowohl in der Gruppe der OTS- als auch in der Gruppe der HLH- Patienten zeigte sich im Vergleich zur gesunden Kontrolle ein verringerter Anteil CD4 positiver T-Zellen (Abb.4). Auch die Expressionsdichte von CD4 war bei den HLH- Patienten deutlich verringert (Abb. 5), lediglich drei Messwerte befanden sich hier in einem ähnlichen Bereich wie diejenigen der Kontrollgruppe. Eine geringere CD4- Expression zeigten außerdem auch die SepsisPatienten. Eine verringerte Anzahl von CD4 positiven T-Zellen bei den HLH- Patienten passt zu den Beobachtungen von McCall et al., die einen CD4/CD8- Quotienten von zumeist < 1 bei HLH- Patienten feststellen konnten. Allerdings wird dies dort insbesondere der pathologisch erhöhten Anzahl von CD8 positiven zytotoxischen T-Zellen zugeschrieben. (McCall et al. 2012) Die HLH gilt mittlerweile als ein hyperinflammatorisches Syndrom aufgrund einer gestörten Funktion insbesondere von zytotoxischen T- und NK-Zellen. (Arceci 2008) Regulatorische CD4- positive T-Zellen scheinen beim Krankheitsgeschehen, trotz belegter Dominanz von Th1- assoziierten Zytokinen, eher eine untergeordnete Rolle zu spielen. So Diskussion 8! 8 zeigten Jordan et al. im Mausmodell, dass sich eine Depletion von CD8 positiven T-Zellen günstig auf den Krankheitsverlauf auswirkten. Depletion von CD4-positiven Zellen oder NK-Zellen hatte keinen derartigen Einfluss. Die in dieser Arbeit beobachtete geringere Anzahl von regulatorischen CD4 positiven T-Zellen, welche in ihrer Funktion auch antiinflammatorisch wirken, könnte somit möglicherweise darauf hindeuten, dass gerade auch sehr wenige CD4 positive T-Zellen bzw. eine geringe Expression von CD4 zum schweren Krankheitsverlauf beiträgt. So zeigte Jordan im Mausmodell außerdem, dass bei einer völligen Depletion von CD4 positiven Zellen bei Mäusen mit HLH Symptomatik, diese ausnahmslos an der Krankheit verstarben. (Jordan et al. 2004) Die signifikant geringere Anzahl von CD4 positiven T-Zellen bei den OTS- Patienten im Vergleich zur gesunden Kontrolle ist wohl auf drei besonders niedrige Messwerte in dieser Gruppe zurückzuführen. Alle anderen Messwerte befinden sich im gleichen Bereich wie die Sportgruppe, welche mit ihrem Median auch etwas unterhalb der gesunden Kontrolle angesiedelt ist. Diese Beobachtungen passen zu denjenigen Gleeson und Bishops wonach in Phasen nach intensivem Training insbesondere die Anzahl zirkulierender Th1 und NK-Zellen absinkt. (Gleeson u. Bishop 2005) ! 4.2.1.1.3 CD8 Der Marker CD8 markiert hier im Lymphozytenfenster vor allem zytotoxische T-Zellen, allerdings tragen auch einige NK-Zellen diesen Marker. (Devine et al. 1999) Auffällig präsentierte sich hier erneut die HLH-, aber auch die Sepsis- Gruppe. Ihre Messwerte zeigten im Gegensatz zu denjenigen der Kontrollgruppe eine sehr deutliche Streuung, sowohl nach oben als auch nach unten (Abb.6). Die HLH- Gruppe wies zudem als einzige der Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant niedrigere MFI- Werte auf (Abb.7). Nach McCall et al., die die hyperinflammatorische Reaktion bei HLH unter anderem einer vermehrten Proliferation von zytotoxischen Zellen zuschreiben, würde man bei der HLH- Gruppe sehr hohe % Gated- Messwerte erwarten. (McCall et al. 2012) Insgesamt lagen auch etwa die Hälfte der Messwerte der HLH- Patienten über denjenigen des gesunden Vergleichs. Hier fiel auf, dass sich die vier höchsten, gemessenen Werte alle jeweils bei therapierten Patienten fanden. Auf den ersten Blick mag dies erstaunen, allerdings war uns die Gesamtdauer der Therapie vor bzw. bis zum Messzeitpunkt bei keinem der Patienten bekannt. Es ist also möglich, dass sich besagte Patienten zum Messzeitpunkt am Anfang der Therapie befanden und die Therapie bislang noch wenig Wirkung zeigte. Zudem wurde bei der HLHGruppe im Vergleich zur gesunden Kontrolle eine signifikant niedrigere Expressionsdichte von CD8 gemessen. Auch dies könnte für die pathologische Veränderung der CD8 positiven Zellen beim Krankheitsbild der HLH sprechen, denn die Induktion der Apoptose und Regulierung der zytotoxischen Aktivität von zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen erfolgt Diskussion 8! 9 wahrscheinlich über eine Bindung an CD8. So konnten Contini et al. nachwiesen, dass lösliche HLA-A, -B, -C und –G- Moleküle durch Bindung an CD8 die Apoptose von CD8 positiven T- und NK-Zellen induzieren und gleichzeitig deren zytotoxische Aktivität verringern. Bindung an CD8 wirkt hier also anti-inflammatorisch. (Contini et al. 2003) Eine verringerte Expression von CD8 bei HLH und die damit eventuell verbundene verminderte Hemmung zytotoxischer Immunreaktionen könnte eine der Ursachen für die Fehlregulation und Hyperinflammation bei der HLH sein. Insgesamt scheint nämlich nicht unbedingt eine besonders hohe Anzahl zytotoxischer Zellen, sondern insbesondere die fehlende Regulation und deutlich gestörte Funktion der T- und NK-Zellen für das Krankheitsgeschehen verantwortlich. (Filipovich 2009) Eine signifikant niedrigere Anzahl von CD8 positiven Zellen zeigte die PT 10d- Gruppe im Vergleich zur gesunden Kontrolle. Tendenziell ist bei den Polytraumapatienten im Messverlauf ab 4h ein relativ kontinuierlicher Abfall an CD8 positiven Zellen zu beobachten. Den höchsten Median weist dabei die Gruppe 4h auf. Dabei sind sich die Messzeitpunkte 4h und 12h; 24h und 48h sowie 5d und 10d jeweils sehr ähnlich. Eine Einteilung in verschiedene Phasen der Immunantwort nach Polytrauma in Induktionsphase (Tag 1-4), Immunregulationsphase (Tag 5-10) und Effektorphase (Tag 11-24) wie sie beispielsweise Mkhouian et al. in ihrer Immunreaktionsstudie nach Polytrauma verwenden, scheint also durchaus sinnvoll zu sein. (Mkhouian et al. 2009) Die in unserer Arbeit beobachtete stetige Abnahme der CD8- Zellzahl im Zeitverlauf nach Polytrauma passt zu diesen Phasen. Ein Absinken am Zeitpunkt 10d deutlich unter den Wert der gesunden Kontrolle spricht für die These einiger Autoren, dass es im Zuge der Immunreaktion nach Polytrauma zu einer verstärkten Immunsuppression bis hin zur Immunparalyse kommen kann. Dabei ist insbesondere die Zell- vermittelte Immunität, vor allem diejenige mittels T- Zellen und Monozyten, betroffen. (Faist et al. 1996) Ein Zusammenhang mit besonders hohen ScoringWerten ließ sich für den Marker CD8 weder bei SAPS-3, SOFA noch beim Sepsis-Score finden. ! 4.2.1.1.4 IL7R Für diesen Marker zeigten sich für die gemessenen % Gated- Werte bei keiner der Gruppen, außer der PT 4h-Gruppe, signifikante Unterschiede. Die PT 4h Gruppe wies dabei einen deutlich höheren Median als die gesunde Kontrolle auf. In der Gruppe war allerdings insbesondere ein sehr hoher Messwert auffällig, welcher den Median nach oben hin verschob und somit das Ergebnis möglicherweise etwas verzerren könnte (Abb.8). Insgesamt fiel jedoch auf, dass sich die PT- Gruppen 4h, 12h, 24h sowie 48h allesamt mit ihrem Median deutlich oberhalb des gesunden Vergleichs befanden. IL7-R wird von humanen T- Zelllinien sowie Makrophagen exprimiert. Bei Bindung des IL-7-Liganden an den Rezeptor wird die T-Zell- Diskussion 9! 0 Proliferation und Aktivierung angeregt, außerdem wirkt diese Bindung anti- apoptotisch. (Beq et al. 2004) Im Krankheitsfall ist IL-7 wichtiger Entzündungsmediator. Eine Erhöhung von IL-7 und auch seinem Rezeptor IL7-R wurden bei Krankheiten wie Artherosklerose, Psoriasis, rheumatoider Arthritis und chronischen Darmerkrankungen festgestellt. All diese Erkrankungen sind von einer überschießenden Entzündungsreaktion des Körpers gekennzeichnet. Zudem konnten Willis et al. zeigen, dass bei Mäusen mit Colitis anti- IL7RAntikörper die Entzündungsreaktion über eine Reduktion von T-Zellzahl und –Funktion hemmen konnten. Insbesondere die Anfangsphase nach Polytrauma ist von einer, oftmals überschießenden, Entzündungsreaktion gekennzeichnet. Auch hier scheint IL-7 neben den typischen pro- inflammatorischen Zytokinen wie TNF, IL-1, IL-6 und IL-8 eine Rolle zu spielen. (Willis et al. 2012) Die IL-7 Level und eine hohe Anzahl IL7R exprimierender Zellen zu den Zeitpunkten 4h bis 12h sprechen für diese Annahme. Beim Vergleich mit den klinischen Scores der Polytraumapatienten ließen sich keine auffälligen Regelmäßigkeiten feststellen. ! 4.2.1.2 4.2.1.2.1 Aktivierte T-Zellen CD4/25 CD25 ist als Teil des IL-2-Rezeptors, welcher von aktivierten B- und T-Zellen exprimiert wird, wichtig für die Proliferation und Aktivierung von Lymphozyten. (Bonilla u. Geha 2003) Die Markerkombination CD4/25 erfasst so alle aktivierten CD4- positiven T-Zellen. Signifikant niedrigere Messwerte zeigten hier im Vergleich zur gesunden Kontrolle die HLHPatienten. Es zeigten sich hier zwei Populationen, die meisten Messwerte waren im Bereich unter 5 % zu finden, lediglich vier Messwerte überstiegen diesen Wert. Von diesen vier hohen Messwerten befanden sich zudem lediglich zwei überhaupt im Bereich der gesunden Kontrolle (Abb.9). Auch bei der Expressionsdichte von CD4/25 zeigte die HLH- Gruppe als einzige der Gruppen signifikant niedrigere Messwerte als der gesunde Vergleich (Abb.10). Bei den aktivierten CD4 positiven T-Zellen zeigte sich also in unserer Messung tendenziell ein sehr ähnliches Bild wie bei der Gesamtzahl der CD4 positiven T-Zellen (siehe 4.2.1.1.2). Allerdings unterscheiden sich sowohl die gemessenen % Gated- Werte als auch die MFI- Werte der HLH- Patienten hier noch einmal deutlicher von der gesunden Kontrolle. So lag der P-Wert der % Gated- Werte von CD4/25 im Mann-Whitney-U- Test bei 0,0176 (P-Wert CD4 % Gated: 0,0216) und der P-Wert der MFI- Werte bei 0,0019 (P-Wert CD4 MFI: 0,0091). Beim Krankheitsbild der HLH scheinen also insbesondere die aktivierten CD4 positiven T-Zellen vermehrt betroffen und reduziert zu sein. ! ! ! Diskussion 4.2.1.2.2 9! 1 CD8/25 In Kombination mit CD8 markiert der Marker CD25 alle aktivierten zytotoxischen T-Zellen. Die NK-Zellen werden somit im Lymphozytenfenster hier nicht erfasst. Die Mediane der % Gated- Werte waren im Vergleich zur gesunden Kontrolle für die SportGruppe, sowie die PT- Gruppen PT 4h, PT 12h, PT 24h, PT 48h und PT 5d deutlich nach oben verschobenen. (Abb.11) Die von uns hier gemessene signifikant höhere Anzahl von CD8/25 positiven T-Zellen der Sport- Gruppe im Vergleich zur gesunden Kontrolle erstaunt anfangs. Nach Gleeson und Bishop verringert sich die Lymphozytenzahl unmittelbar im Anschluss an intensives Training. Dies konnten wir in unserer Messung bereits bei den CD3 positiven Zellen erkennen. Gleeson und Bishop schreiben das Absinken der Lymphozytenzahl allerdings insbesondere einem Absinken der Th1 und NK- Zellen zu. Dies bestätigt sich hier vielleicht noch einmal. So waren bei Messung der CD8 positiven Zellen (siehe 4.2.1.1.3) noch keinerlei signifikanten Unterschiede der Sport-Gruppe im Vergleich zur gesunden Kontrolle festzustellen. Dies könnte unter anderem daran liegen, dass bei der Markierung mit CD8 ohne die Kombination mit CD25 auch einige NK- Zellen in den einzelnen Gruppen erfasst wurden. Zur Rolle der aktivierten zytotoxischen T-Zellen liegen derzeit im Zusammenhang mit intensiver Leistungserbringung noch keine eindeutigen Daten vor. Allerdings konnten Hayes et al. anhand von CD4/CD69 positiven T- Helferzellen zeigen, dass die Lymphozytenaktivierung bei sportlicher Betätigung ansteigt. (Hayes et al. 2003) Die hier gemessenen CD8/25- Werte könnten einen Hinweis darauf darstellen, dass dies bei zytotoxischen T-Zellen ähnlich ist und diese Aktivierung, sowie der Anstieg der Gesamtzellzahl auch in der Regenerationsphase nach intensivem Training bestehen bleibt. Eine interessante Beobachtung ist bei diesem Marker außerdem die signifikant niedrigeren Messwerte der OTS– Gruppe im Vergleich zur Sport- Gruppe. Dies könnte einen Hinweis darauf geben, dass eine Erhöhung der aktivierten zytotoxischen T-Zellen über den Normalwert hinaus nicht unbedingt eine Dysregulation der Immunantwort bzw. eine überschießende Entzündungsreaktion zur Folge haben muss. Eine vermehrte CD8/CD25 positive T-Zellanzahl scheint, wie auch die erhöhte Expression dieser Marker gerade in körperlichen Ausnahmesituationen, aufzutreten. Die gemessenen, signifikant höheren Zellzahlen in den PT- Gruppen PT 4h, PT 12h, PT 24h, PT 48h und PT 5d sowie die signifikant höhere CD8/25 Expression zu all diesen Zeitpunkten, bis auf PT 4h, passen zu diesen Ergebnissen. Das Vorliegen zahlreicher aktivierter zytotoxischer T- Zellen ist typisch für Entzündungsreaktionen des Körpers. (Faist et al. 1996) Beim Vergleich mit den klinischen Scores fiel auf, dass sich zum Zeitpunkt 24h diejenigen Patienten mit den niedrigsten ScoringWerten mit ihren CD8/25 % Gated- Werten im höchsten Bereich befanden. Die Patienten mit Diskussion 9! 2 eher hohen Scoring- Werten, welche im Verlauf schließlich auch eine Sepsis entwickelten, zeigten allesamt sehr niedrige Messwerte. Bei den darauf folgenden Messzeitpunkten durchmischte sich diese Aufteilung dann. Die MFI- Werten vermittelten ein ähnliches Bild. Hier lag zum Zeitpunkt 48h und zudem zu den Zeitpunkten 5d und 10d eine deutliche Trennung der beiden Polytrauma- Subgruppen vor, mit hohen MFI- Werten bei Patienten mit niedrigen Scoring- Werten und niedrige MFI- Werte bei Patienten mit hohen Scoring- Werten. Die Entzündungsreaktion nach Polytrauma mit deutlich höheren CD8/25 Zellzahlen und Expression als bei gesunden Individuen scheint also nicht unbedingt Zeichen einer Fehlregulation des Organismus oder einem Überschießen der Immunreaktion zu sein. Wie sich in unseren Messungen zeigte, wiesen nämlich insbesondere diejenigen Patienten, bei denen ein fehlendes Ansprechen von CD8/25 detektiert wurde, einen schlechteren klinischen Verlauf auf. Diese Beobachtungen könnten für die These Filipovichs sprechen, die für die Hyperinflammation, wie beispielsweise bei der HLH, insbesondere auch fehlende CD8 positive T-Zellen nennt. (Filipovich 2009) ! 4.2.1.2.3 CD2/86 CD2 ist auf 95% der T-Zellen sowie auf NK-Zellen zu finden. (Sotsios et al. 2000) In Kombination mit CD86 werden hier aktivierte T-Zellen erfasst. Signifikant höhere Werte als die Kontrolle wiesen hier die Patienten der Gruppe PT 48h sowohl bei ihren % Gated- als auch den MFI –Werten auf (Abb. 13; Abb. 14). Bei den % Gated- Werten befanden sich mehr als die Hälfte der Werte oberhalb des höchsten Wertes der gesunden Kontrolle. Bei den MFI- Werten lagen sogar alle Werte oberhalb des Referenzbereichs des gesunden Vergleichs. Vom Zeitpunkt 24h zum Zeitpunkt 48h hin stiegen sowohl die % Gated- wie auch die MFI- Werte aller PT- Patienten bis auf eine Ausnahme (Patient 3) an. Patient 3 fiel jeweils mit seinen % Gated und MFI- Werten ab. Gleichzeitig entwickelte er auf dem Boden eines SIRS (24h) ein schweres SIRS (48h, 120h, 240h) mit deutlich verschlechterten Organfunktionen (siehe SOFA-Score Abb.28). Keiner der anderen Patienten bis auf Patient 7 (SOFA- Score) und Patient 8 (Sepsis-Score) zeigten vom Zeitpunkt 24h zum Zeitpunkt 48h hin einen Anstieg ihrer klinischen Scoring- Punkte und damit eine klinische Verschlechterung. CD86 wird von APC exprimiert und findet sich nach Interaktion mit dem CD28- Molekül auf den so aktivierten T-Zellen. Etwa 12- 24h später exprimieren die aktivierten T-Zellen schließlich auch CTLA4. Bindet CD86 nun an dieses Molekül, dann werden vermindert Wachstumsfaktoren sezerniert und zusätzlich ein inhibitorisches Signal an die T-Zelle gesendet. (Stamper et al. 2001) Die Markerkombination CD2/86 markiert also aktivierte TZellen, aber auch aktivierte T-Zellen in der Spätphase der Aktivierung, in welcher sie bereits eher immunoregulatorische Funktionen wahrnehmen. Verschiedene Studien konnten zeigen, Diskussion 9! 3 dass die Interaktion zwischen CD80 bzw. CD86 auf APCs mit dem CD28- Molekül und dem CTLA4 Antigen auf T-Zellen wichtiges regulatorisches Signal bei der T-Zellaktivierung darstellt. (Bolognesi et al. 2000) Die signifikant höheren Werte von CD2/86 positiven Zellen, wie auch die Expression dieser Marker zum Zeitpunkt 48h in unseren Messungen, könnte im Rahmen dieser Erkenntnisse eventuell mit der zunehmenden Regulation der Entzündungsreaktion nach voran gegangener starker Inflammation, und damit sehr vielen aktivierten T-Zellen, zusammenhängen. Es wäre somit von einer vermehrten Bindung von CD86 insbesondere an CTLA4 zu denken. Die Bindung an dieses Molekül würde dann die Entzündungsreaktion regulieren. Für diese Annahme spricht auch die klinische Verschlechterung des Patienten (Patient 3), der mit seinen Messwerten vom Zeitpunkt 24h zu 48h nicht anstieg. Allerdings zeigten sich bei den anderen Patienten in den klinischen Scores keinerlei besonders auffällige Regelmäßigkeiten. Außerdem auffällig, wenn auch nicht signifikant anders, zeigte sich die HLH Gruppe. Hier zeigten vier der Patienten, sowohl in der % Gated- als auch in der MFI- Messung, im Gegensatz zu den anderen Patienten dieser Gruppe, aber auch im Gegensatz zu allen anderen Gruppen, Messwerte, die ausgesprochen hoch lagen. Dabei fiel auf, dass sich drei dieser vier Patienten zum Zeitpunkt der Messung unter Therapie befanden. Auch diese Beobachtungen könnten für die These einer zunehmenden Regulation nach voran gegangener starker Entzündung mit einer Bindung von CD86 an CTLA4 sprechen. Die Therapie würde in diesem Fall hier also erste Früchte tragen. All diese hypothetischen Annahmen sind so nicht eindeutig belegbar, denn genauso gut könnte bei jedem Einzelnen der Patienten eine besonders starke Entzündungsreaktion mit vielen aktivierten pro- inflammatorisch aktiven T-Zellen und einer Bindung von CD86 an CD28 vorliegen. Um hier besser beurteilen zu können, welche der Bindungen denn gerade vorliegt, ist eine zusätzliche Betrachtung des Ko- Rezeptors CD28 bzw. CTLA4 in Kombination mit CD86 unbedingt angezeigt. ! 4.2.1.2.4 CD28 CD28 ist wichtiger Kostimulator, der sowohl bei der Antigen-abhängigen als auch der Antigen- unabhängigen Aktivierung von T-Zellen, eine wichtige Rolle spielt.(Sotsios et al. 2000) Im Vergleich zur gesunden Kontrolle zeigten hier die Sport-, die HLH-, die Sepsis sowie die PT 10d- Gruppe signifikant niedrigere % Gated- Messwerte. Die Messwerte der SportGruppe waren dabei sogar höchst signifikant niedriger, als diejenigen des gesunden Vergleichs waren und zeigten eine deutliche Messwerte-Wolke (Abb.15). All diese Gruppen zeigten sich bereits bei der Messung von CD3, also der Gesamtzahl der T-Zellen, mit ihren Medianen deutlich unterhalb der gesunden Vergleichsgruppe. Die Sepsis- und die Sport- Gruppe wiesen Diskussion 9! 4 bereits dort signifikant niedrigere Messwerte auf, die HLH- sowie die PT 10d- Gruppe zeigten sich zwar niedriger, allerdings nicht signifikant niedriger. Dies könnte ein weiterer Hinweis dafür sein, dass insbesondere die CD4 positiven Zellen sich bei den einzelnen Gruppen verändern, denn 90% der der CD4 positiven T-Zellen, aber nur etwa 50 % der CD8 positiven T-Zellen exprimieren CD28. (Sotsios et al. 2000) Der höchst signifikant unterschiedliche PWert der Sportgruppe passt zu diesen Beobachtungen. So verringern sich nach intensivem Training in der Regenerationsphase besonders die CD4 positiven T-Zellen. (Gleeson u. Bishop 2005) Auch, der im Gegensatz zu der Gesamtzahl der T-Zellen, bei CD28 signifikant niedrigere P-Wert der HLH- Gruppe spricht für eine Verringerung insbesondere der CD4 positiven Zellen. Dies zeigte sich bereits bei der Messung der CD4 und der CD4/25 positiven Zellen. Auch mit ihren MFI- Werten zeigten sich sowohl die Sport- als auch die HLHGruppe signifikant niedriger als der gesunde Vergleich. Die geringere CD28 positive TZellzahl bei der PT 10d Gruppe sowie die verringerte Expressionsdichte von CD28 bei der PT 5d Gruppe fiel zudem auf. Eigentlich würde man mit zunehmender Regeneration nach Polytrauma eher einen Anstieg der T- Zellen auf Niveau der gesunden Kontrolle vermuten. Es fällt auf, dass insbesondere diejenigen Patienten, welche im Verlauf eine Sepsis bzw. einen septischen Schock entwickelt hatten sowohl mit ihren % Gated Messwerten (5d) als auch mit ihren MFI- Werten (5d, 10d) deutlich im unteren Bereich lagen. Die signifikant niedrigeren Messwerte der Polytrauma- Patienten bei diesem Marker sind also vor allem von diesen Patienten bedingt. Wenig CD28 positive Zellen bzw. eine zu geringe CD28 Expression und die damit einhergehende fehlende Aktivierung von T-Zellen scheint also schwere Krankheitsverläufe bis hin zu einer septischen Konstellation nach Polytrauma zu begünstigen. Auf eine verminderte Aktivierung von T-Zellen nach schwerem Trauma weisen auch die Ergebnisse von Xiao et al. hin. Diese fanden heraus, dass neun der zehn nach Traumageschehen am deutlichsten supprimierten Genomfamilien jene waren, die an der Antigen-Präsentation und T-Zellaktivierung beteiligt waren. Dies waren beispielsweise S100A8 (calgranulin), MYBL1 (myeloblastosis viral homologue, v-myb), KLRF1 (Killer cell lectin like receptor subfamily F, member 1), TGFBR3 (TGF-β receptor III subunit), und TCRA (T cell receptor α subunit). (Xiao et al. 2011) ! ! ! ! ! ! ! ! Diskussion 4.2.1.3 NK-T-Zellen 4.2.1.3.1 CD3/56 9! 5 Die Markerkombination CD3/56 findet sich auf den so genannten NK- T-Zellen, welche eine spezielle Subpopulation der T-Zellen darstellen. Sie sind entweder CD4 positiv oder CD4 negativ und wirken abhängig davon anti- bzw. pro-inflammatorisch. (Eger et al. 2006; Coquet et al. 2008) Signifikant niedrigere Messwerte ließen sich hier im Vergleich zur gesunden Kontrolle bei den Sport- wie auch den HLH- Patienten feststellen. Die Messwerte beider Gruppen lagen außerdem im Vergleich zu denjenigen aller anderen Gruppen weitaus weniger gestreut vor (Abb.17). Signifikant weniger NK-T- Zellen fanden sich unter anderem auch im Blut von Patienten mit Psoriasis oder aber Rheuma. (Koreck et al. 2002) Beides sind Autoimmunerkrankungen, welche mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergehen. Die anderen Zellreihen wie Gesamt T-Zellanzahl, Gesamt B-Zellanzahl, T- Helferzellzahl, zytotoxische T-Zellanzahl und NK-Zellanzahl zeigten im Vergleich zur gesunden Vergleichsgruppe keine signifikanten Unterschiede. Auch nach einer Behandlung stiegen die NK-T-Zellzahlen bei Psoriasispatienten zwar an, blieben aber trotzdem weiterhin unterhalb des Niveaus des gesunden Vergleichs. Eine zentrale Rolle im Krankheitsgeschehen der Psoriasis scheinen also unter anderem die NK-T-Zellen zuspielen. Insbesondere ein Mangel an dem von NK-T-Zellen sezernierten IL-4 wird als mögliche Ursache einer vermehrten Entzündungsreaktion bei der Psoriasis angenommen. Es scheint also vor allem die antiinflammatorische Funktion der NK-T-Zellen gestört. (Koreck et al. 2002) Auch bei den HLHPatienten könnte die niedrige NK-T-Zellzahl und die verminderte Modulation der Immunreaktion das Krankheitsgeschehen und die Hyperinflammation begünstigen. Die in unserer Messung festgestellten signifikant niedrigeren Messwerte bei den HLH- Patienten passen zu dieser Vermutung. Auch die niedrigeren Messwerte der Sportgruppe passen zu den bisher gewonnenen Ergebnissen. Die Sportgruppe zeigte sich bereits in der Messung von CD4 positiven T-Zellen niedriger als der gesunde Vergleich. Wie von Eger et al. bereits konstatiert, sind es vor allem die CD4 positiven NK-T-Zellen, welche anti-inflammatorische Wirkung haben. (Eger et al. 2006) Auch bei der Sport- Gruppe könnte also diese Subpopulation der NK-T-Zellen in der Regenerationsphase reduziert vorliegen. Eine vermehrte Neigung zu starken Entzündungsreaktionen könnte dann bei Sportlern in der Regenerationsphase ein mögliches Risiko darstellen. ! 4.2.1.4 NK- und T-Zellen 4.2.1.4.1 CD2 CD2 ist auf T- Zellen und NK- Zellen zu finden. Bindung an den CD2-Rezeptor auf TZellen erhöht ein Ansprechen auf IL-12, welches insbesondere die Th1 Immunantwort Diskussion 9! 6 induziert. (Zdolsek u. Jenmalm 2003) Die Messwerte des gesunden Vergleichs lagen in unsrer Messung als Wolke gehäuft vor. In unserer Messung unterschieden sich sowohl die Gruppe der Sepsis als auch die PT 5d- und 10d Gruppe deutlich vom gesunden Vergleich. Sie wiesen signifikant niedrigere % Gated- Messwerte auf, außerdem streuten die Messwerte sehr viel weiter (Abb.18). Eine reduzierte Anzahl CD2 positiver Zellen lässt auch deutlich niedrigere TZell-assoziierte Zytokinlevel vermuten. Diese Vermutung passt zu den Ergebnissen Cabioglu et al., welche bei Patienten mit schwerer Sepsis reduziertes IL-6 und TNF α nachweisen konnten. (Cabioglu et al. 2002) Diese Zytokine sind typische T-Lymphozyten assoziierte Zytokine. Alle von uns gemessenen Patienten befanden sich zum Zeitpunkt der Messung im septischen Schock bzw. in einer schweren Sepsis. Deutlich reduzierte IL-6 und TNF α Konzentrationen waren zu erwarten. Auch die niedrigen Messwerte der PT 5d und 10d Gruppe fügt sich in dieses Bild. Die beiden jeweils niedrigsten Messwerte zu beiden Erhebungszeitpunkten zeigten jeweils die Patienten 8 und 7 (PT 5d) bzw. 5 und 7 (PT 10d). All diese Patienten befanden sich zu den Messzeitpunkten bereits in einer Sepsis oder im septischen Schock. Auch wiesen sie ein hohes Ausmaß an Verletzung (ISS), Organdysfunktion (SOFA Score) und Schweregrad der Erkrankung (SAPS3) auf. Patient 7 zeigte sich bei beiden Messungen von CD2 im Vergleich zu den anderen Polytrauma- Patienten am niedrigsten. Auch wies er die stärkste Verschlechterung seiner Organfunktionen (SOFA-Score) vom Zeitpunkt 48 auf 120h (5d) auf. Patient 7 verschlechterte sich also klinisch am eindrücklichsten, war aber auch bereits zu Anfang der am schwersten verletzte Patient (ISS 51 Punkte). Er war schließlich der einzige, der von uns gemessenen Patienten, welcher sein Trauma nicht überlebte. Dies passt zu den Ergebnissen Cabioglu et al., welche bei NichtÜberlebenden zwar höhere CRP und Procalcitonin- Level feststellten, die T-Lymphozyten assozierten Zytokine IL-2, IL-6, IL-10 sowie TNF α aber deutlich erniedrigt vorfanden. (Cabioglu et al. 2002) ! 4.2.1.4.2 CD39 CD39 wirkt anti-thrombotisch sowie anti-inflammatorisch indem es extrazellulär Nukleotide zu AMP hydrolisiert. (Atkinson et al. 2006) In unserer Messung lagen die Werte des gesunden Vergleichs, der Sepsis- sowie der HLHGruppe eher im unteren Bereich. Hiervon unterschieden sich die Sport-, die LCH- sowie die PT- Gruppen 4h, 48h und 5d am deutlichsten. Sie alle wiesen signifikant höhere % GatedMesswerte auf (Abb.20). Die Sport-, LCH- und PT 5d- Gruppe zeigten zudem auch signifikant höhere MFI- Werte (Abb.21). Bei den LCH- sowie HLH- Patienten fiel zudem in beiden Messreihen auf, dass sich die unter Therapie befindlichen Patienten mit ihren Messwerten eher im unteren Bereich befanden. CD39 ist insbesondere bei starker Inflammation ein wichtiges Oberflächenmolekül, welches mit seiner anti-inflammatorischen Diskussion 9! 7 Funktion den Entzündungsprozess reguliert und ein Überschießen der Immunantwort verhindern hilft. Die niedrigen Werte des gesunden Vergleichs, der Sepsisgruppe und der therapierten HLH- und LCH-Patienten passen zu dieser Annahme. Eine mögliche Entzündungsreaktion im gesunden Vergleich wird als relativ gering angenommen, eine antiinflammatorische Gegenregulation mittels CD39 ist hier nicht nötig. Bei den therapierten HLH- und LCH- Patienten passen die niedrigen CD39- Zellzahlen zu zwei gegenläufigen Annahmen. Bei gutem Anschlagen der Therapie, ist eine Entzündungsreaktion möglicherweise verringert und somit weniger anti- inflammatorische Gegenregulation mittels CD39 nötig. Allerdings könnte die niedrige CD39- Zellzahl auch für eine mangelnde Immunsuppression und damit für eine, bei beiden Krankheitsbildern typische, überschießende Inflammation sprechen. Um hier genauer zu differenzieren, müsste man die klinische Situation der Patienten zum Messzeitpunkt noch genauer beleuchten. Dies war in unserer Messung leider nicht möglich. Bei den Sepsispatienten, welche sich bei der Messung alle, bis auf eine Ausnahme, bereits im Stadium des septischen Schocks befanden, ist ebenfalls von einer geringen CD39- Zellzahl auszugehen. Die, insbesondere zu Anfang des Krankheitsgeschehens beobachtete, Hyperinflammation ist im Stadium des septischen Schocks oftmals bereits einer Hypoinflammation gewichen. (Muller Kobold et al. 2003) Eine anti-inflammatorische Gegenregulation von CD39 ist bei einer Immunosuppression wie sie im septischen Schock vorliegt nicht mehr möglich. Die niedrigen CD39 Level passen zu diesen Annahmen. Die signifikant höheren CD39 Werte der Sport-, der LCH- (insbesondere der nicht therapierten Patienten) sowie der PT- Gruppen 4h, 48h und 5d lassen eine vermehrte Inflammation bei diesen Patientengruppen vermuten. CD39 würde hier dann als antiinflammatorisches Molekül versuchen der Inflammation gegenzusteuern. Verschiedene Studien belegen, dass regelmäßiges Training inflammatorische Marker wie CRP oder auch IL-6 bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Krankheiten deutlich vermindern kann. Andererseits kann akutes und intensives Training diese auch erhöhen. Der inflammatorische Stress, dem diese Patienten aufgrund ihrer Erkrankung sowieso schon vermehrt ausgesetzt sind, überwiegt dann deutlich. (Ploeger et al. 2009; Lara Fernandes et al. 2011) Auch bei gesunden Probanden scheint es nach intensiver Leistungserbringung zu einer vermehrten Inflammationsreaktion des Organismus zu kommen, dieser wird aber im gesunden Organismus mit erhöhten CD39- Leveln gegengesteuert. Dies ist mögliche Erklärung für die hohen CD39 Werte der Sportgruppe, welche direkt im Anschluss an ein einwöchiges Hochleistungstrainingslager erhoben wurden. Auch in den Polytrauma- Gruppen und der LCH- Gruppe schien eine im Vergleich zur gesunden Kontrolle vermehrte Entzündungsreaktion vorzuliegen. Bei der Polytrauma- Gruppe fiel im Vergleich mit den erhobenen klinischen Scores auf, dass sich sowohl bei den % Gated- als auch bei den MFIWerten (12h, 24h, 48h, 5d) jeweils diejenigen Patienten, die im Verlauf eine Sepsis bzw. einen Diskussion 9! 8 septischen Schock entwickelten, im unteren Bereich befanden (Patient 4, 5, 7, 8). Ihre Messwerte lagen jeweils im Bereich der gesunden Kontrolle bzw. der Sepsisgruppe, obwohl die Mediane dieser Zeitpunkte oftmals signifikant höher lagen als derjenige der gesunden Kontrolle. Unsere Messungen zeigten also, dass bei den Polytraumapatienten mit mildem Krankheitsverlauf (niedrigere Scoring- Werte) im Vergleich zum gesunden Vergleich deutlich höhere CD39 Zellzahlen und Expression vorlagen. Diejenigen Patienten, die sich klinisch mit schweren Krankheitsverläufen präsentierten oder gar verstarben (Patient 7) wiesen hingegen eher niedrige CD39 Level auf. CD39 könnte also im Polytraumakontext wichtiger protektiver Marker sein, der falls er vermindert vorliegt einen schwerwiegenden Krankheitsverlauf begünstigt. ! 4.2.1.4.3 CD244 CD244 ist auf etwa 50% der CD8 positiven und auf wenigen CD4 positiven T-Zellen sowie NK-Zellen zu finden. Es trägt zu einer Steigerung der Zelltoxizität und INF γ- Sekretion bei. (Boles et al. 2001) Bei diesem Marker fiel in unserer Messung auf, dass alle Gruppen bis auf die gesunde Kontrollgruppe und die Sport- Gruppe in ihren Messwerten sehr weit streuten. Besonders deutlich zeigte sich dies bei der HLH- Gruppe. Hier fiel zudem auf, dass die therapierten Patienten dieser Gruppe tendenziell sehr viele CD244 positive Zellen aufwiesen. Insgesamt zeigten alle Gruppen bis auf die PT 0h Gruppe durchschnittlich deutlich höhere Messwerte als der gesunde Vergleich. Signifikant höhere Messwerte zeigten sich dabei bei den Gruppen PT 4h und 5d (Abb.22). Eine deutlich erhöhte Expression des SLAM als ein Teil des CD244Moleküls auf T-Zellen zeigte sich in Synovialflüssigkeit und -gewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis. Hier lag der Anteil an SLAM auf T-Zellen deutlich höher als der SLAM Anteil im peripheren Blut dieser Patienten, aber auch im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle. (Isomäki et al. 1997) Dies könnte ein Hinweis auf die vermehrte Entzündungsreaktion bei diesem Krankheitsbild sein und wie diese insbesondere auch von einer vermehrten Interaktion von CD244 mit Immunzellen getriggert wird. Die Beobachtungen von Ferrante et al. lassen ähnliches vermuten. So konnten sie zeigen, dass bei Patienten mit multipler Sklerose erhöhte SLAM+ Lymphozytenzahlen vorlagen. (Ferrante et al. 1998) Bei den PT- Gruppen zeigte Patient 7 sowohl in der CD244 Messung PT 4h als auch PT 5d den höchsten Messwert innerhalb der Gruppe. Auch in jedem der klinischen Scores wies dieser Patient zum Zeitpunkt 5d die höchsten Scoringwerte im Vergleich mit den anderen Patienten auf. Für den Zeitpunkt 4h lagen uns leider keine klinischen Werte vor. Auch die Patienten 4, 5, 8 zeigten sich zu den Erhebungszeitpunkten 4h, 12h, 48h und 5d mit ihren CD244 % Gated- Werten eher im höheren Messwertebereich (Abb.22). All diese Patienten entwickelten im Verlauf eine Sepsis bzw. einen septischen Schock. Hohe CD244- Level und Diskussion 9! 9 damit eine hohe zytotoxische Aktivität der Zellen scheint sich also auch hier deutlich negativ auf den Organismus auszuwirken und eine verstärkte Entzündungsreaktion zu begünstigen. ! 4.2.1.5 NK-Zellen 4.2.1.5.1 CD11b CD11b findet sich unter anderem auf Granulozyten, Monozyten und NK-Zellen. Er ist wichtiger Regulator bei Adhäsion und Migration von Zellen. (Kawai et al. 2005) Bei unserer Messung fiel insbesondere die Sport-Gruppe ins Auge. Sie unterschied sich mit signifikant höheren % Gated- und MFI- Werten von der Gruppe der OTS- Patienten (Abb.24; Abb.25). Die Expressionsdichte von CD11b zeigte sich sogar höchstsignifikant verschieden (p= 0,0002). Im Vergleich zur gesunden Kontrolle zeigte die Sport-Gruppe zwar auch insgesamt höhere % Gated- Werte, allerdings waren lediglich die MFI- Werte signifikant höher. Auch hier allerdings höchstsignifikant höher (p= 0,0007). Signifikant mehr CD11b exprimierten außerdem im Vergleich zur Kontrollgruppe die PT- Gruppen 4h und 24h. Die von uns erhobenen Messungen passen zu den Beobachtungen mehrerer Studien, die belegen konnten, dass bei intensiver sportlicher Betätigung sowohl Plättchen als auch Leukozyten vermehrt aktiviert werden und schließlich auch vermehrt vorliegen. Sportliche Aktivität erhöht die P-Selectin- Expression auf den Thrombozyten sowie die CD11b Expression auf Neutrophilen und Lymphozyten. Die Aggregation von Plättchen und Leukozyten nimmt dabei deutlich zu. (Hu et al. 2004) Diese deutlich prothrombotischen Effekte der sportlichen Aktivität scheinen für sich genommen bei gesunden Probanden keine negativen Konsequenzen zu haben. Interessanterweise fanden sich bei den OTS- Patienten zwar auch noch eine im Vergleich zur gesunden Kontrolle leicht erhöhte CD11b positive Zellzahl, bei der Expressionsdichte dieses Markers lagen die OTS- Patienten dann allerdings sogar leicht unter dem gesunden Vergleich. Dies könnte möglicherweise entweder für eine sehr schnelle Normalisierung der CD11b positiven Zellen bei sportlicher Inaktivität oder aber für ein eventuell schlechtes und nicht physiologisches Ansprechen auf die erhöhten Stresslevel bei intensivem Training sprechen. Eine solche Fehlregulation würde dann unter Umständen ein mögliches Krankheitsgeschehen begünstigen. So konnten Huang et al. bei Kindern mit SIRS und Sepsis zeigen, dass sie im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle deutlich mehr CD11b auf Neutrophilen exprimierten. Die Expression von CD11b war bei der Gruppe mit SIRS im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nicht verschieden, allerdings zeigte sie sich bei der Gruppe mit schwerer Sepsis signifikant niedriger. Eine Verringerung der CD11b Expression wurde hier in Kenntnis der klinischen Situation als ein mögliches Anzeichen der klinischen Verschlechterung der Patienten beim Krankheitsbild der Sepsis gewertet. (Huang et Diskussion 1! 00 al. 2009) Auch bei unseren Messungen zeigte sich die Sepsisgruppe mit ihrem Median deutlich unter dem des gesunden Vergleichs. Bis auf die PT- Gruppe 0h lagen alle PT- Gruppen mit ihrem Median über demjenigen des gesunden Vergleichs. Die vermehrte Expression von CD11b auf den Lymphozyten ist auch hier wohl von den erhöhten Stressleveln nach Polytrauma bedingt. Eine Anpassung an diese scheint physiologischerweise mit einem Anstieg von CD11b auf Lymphozyten einherzugehen, wie dies auch in unseren Messungen ab dem Messzeitpunkt 4h der Fall war. Regelmäßigkeiten im Anstieg als auch in den klinischen Scores ließen sich dabei nicht eruieren. ! 4.2.1.5.2 CD56 Für CD56 zeigten sich in unserer Messung lediglich bei der Expressionsdichte des Markers signifikante Unterschiede (Abb. 27). Die LCH- Gruppe sowie die PT- Gruppe 48h wiesen hier jeweils signifikant niedrigere Messwerte als der gesunde Vergleich auf. Auch die HLHGruppe zeigte sich auffällig niedrig. CD56 ist eine Isoform des neuralen Adhäsionsmoleküls NCAM und wird auf NK-Zellen exprimiert. Die menschlichen NK- Subpopulationen können anhand ihres CD56- Moleküls und dessen Oberflächenexpressionsdichte in CD56 bright sowie CD56 dim eingeteilt werden. Etwa 90% der NK- Zellen sind dabei CD56dim. Bei der initialen Immunantwort ist insbesondere die Interaktion von Monozyten mit den NK-Zellen von Bedeutung. Die Monozyten stimulieren dabei die NK-Zellen zur Produktion immunregulatorischer Zytokine. (Cooper et al. 2001) Eine fehlende Expression wie sie sich in unsrer Messung insbesondere bei den Gruppen LCH und PT 48h aber auch bei der HLHGruppe zeigte, könnte hier somit eventuell für das verminderte Ansprechen bzw. eine verzögerte Interaktion mit Monozyten in der frühen Immunantwort sprechen. Eine inadäquate Reaktion auf Infekte wäre dann eine mögliche Folge. Einen Zusammenhang mit der klinischen Situation der Polytraumapatienten ließ sich für den Marker CD11b anhand der erhobenen klinischen Scores nicht finden. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Diskussion 4.3 1! 01 Schlussfolgerung Mittels der Durchflusszytometrie konnten in unserer Arbeit Hinweise auf spezifische Oberflächenmarkerprofile bzw. deren Veränderungen bei spezifischen Krankheitsbildern gewonnen werden. Erstaunlicherweise zeigten sich klinisch auffällige Patientengruppen wie die OTS- oder auch die LCH- Gruppe in sehr wenigen Oberflächenmarkern vom gesunden Vergleich signifikant verschieden. Die eigentlich als zusätzliche gesunde Bezugsgruppe gewählte Sportmannschaft nach Training präsentierte sich hingegen mit deutlich mehr, signifikant von der Kontrolle verschiedenen, Oberflächenmarkern. Dies macht deutlich, dass die in der Immunphänotypisierung detektierbaren Abweichungen nicht unbedingt mit einer Pathologie assoziert sein müssen. Gleichzeitig zeigte sich, dass bereits einwöchige intensive körperliche Betätigung zu deutlichen immunologischen Veränderungen im Körper führt. Bei den Polytraumapatienten fiel eine deutliche Trennung in zwei Subgruppen, mit bzw. ohne septischen Verlauf, auf. Patient 4,5,7 und 8 entwickelten im Verlauf eine Sepsis und ähnelten in ihrem Markerprofil dabei deutlich der Sepsisgruppe (CD2↓, CD3↓, CD28↓). Die GesamtT-Zellzahl war bei allen septischen Patienten vermindert, die Aktivierung der T-Zellen zudem gestört. Bei den Polytraumapatienten fiel außerdem auf, dass deutliche Markerabweichungen vom gesunden Vergleich (CD39↑, CD8/25↑) im Krankheitsfall mit einem günstigen klinischen Verlauf assoziiert waren, d. h. gute Regeneration ohne septische Komplikationen. So zeigten die Polytraumapatienten, welche im Verlauf keine Sepsis entwickelten, signifikant höhere CD39 und CD8/25 –Zellzahlen als die gesunde Kontrolle. Diese beiden Marker fanden sich zudem bei der gesunden Sport-Gruppe nach intensivem Training und der nachfolgenden verstärkten Inflammationslage des Organismus. Die septischen Patienten zeigten sich mit ihren CD39 und CD8/25 Messwerten zu allen Messzeitpunkten eher im unteren Messwertebereich. Das Fehlen einer verstärkten Gegenregulation (CD39↓) bei starker Entzündungsreaktion des Körpers nach Polytrauma sowie eine reduzierte effektive Immunantwort bei möglichen Infekten (CD8/25↓) in dieser Situation, könnte also für besonders schwere Krankheitsverläufe nach Polytrauma bis hin zur Sepsis mitverantwortlich sein. Zusammenfassung 5. 1! 02 Zusammenfassung Die in dieser Arbeit betrachteten T- und NK-Zellen sind wichtige Komponenten der Immunantwort. Abhängig von Reifungs– und Aktivierungsgrad exprimieren sie unterschiedliche Oberflächenmarker. Dabei wurde versucht mögliche Unterschiede bestimmter Oberflächenmarkerprofile bei verschiedenen Gruppen (Sepsis, Sport, OTS (OvertrainingSyndrom), HLH (Hämophagozytische Lymphohistiozytose), LCH (Langerhans-Zell-Histiozytose), PT (Polytrauma) 0h, PT 4h, PT 12h, PT 24h, PT 48h, PT 5d, PT 10d) im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle bzw. untereinander zu detektieren. Es sollten Veränderungen einzelner Antigene bei einem bestimmten Krankheitsbild festgehalten und möglicherweise Oberflächenmarker, welche sich zur Unterscheidung und Diagnostik der verschiedenen Pathologien eignen könnten, identifiziert werden. Es wurden dazu Blutproben von 67 Probanden im Durchflusszytometer gemessen. Dabei wurde die Prozentzahl (% Gated) der Zellen sowie deren Expressionsdichte (MFI= mean fluorescent intensity) für die Oberflächenantigene CD3, CD4, CD8, CD2, CD28, CD39, IL7R, CD244, CD56, CD11b, CD4/25, CD8/25, CD2/86, CD3/56 erfasst. Insgesamt zeigte sich die OTS- Gruppe lediglich in ihren signifikant niedrigeren CD4 % Gated Zellzahlen von der Kontrolle verschieden. Von der Sport-Gruppe unterschied sie sich mit signifikant niedrigeren CD11b (% Gated und MFI) und CD8/25 (% Gated) Messwerten. Die Sport-Gruppe zeigte im Vergleich zur Kontrolle signifikant niedrigere % Gated Werte für CD3, CD3/56, CD28 und niedrigere MFI- Werte für CD28 und CD11b sowie signifikant höhere % Gated und MFI- Werte für CD8/25 und CD39. Anders als zu Anfang erwartet unterschied sich also insbesondere die gesunde Sport- und nicht die OTS- Gruppe klar von der Kontrolle. Nach intensivem Training lag also im Organismus eine inflammatorische Konstellation vor, die jedoch nicht von Krankheitswert war. Die klinisch eindrücklich „kranken“ OTS- Patienten zeigten in unseren Messungen keine derart auffälligen immunologischen Abweichungen. Auch die LCH- Gruppe unterschied sich, anders als erwartet, lediglich mit signifikant höheren CD8/25 (MFI) und CD39 (% Gated; MFI)- sowie signifikant niedrigeren CD56 (MFI)-Werten von den gesunden Kontrollen. Diese Abweichungen weisen auf eine verstärkte Entzündungs-reaktion (CD39; CD8/25) sowie auf eine pathologische Immunreaktion mit gestörter Inter-aktion von Monozyten und NK-Zellen bei der LCH hin (CD56). Die HLH- Gruppe unterschied sich deutlich von der LCH- Gruppe. Sie zeigte im Vergleich zur Kontrolle signifikant niedrigere Messwerte für CD4, CD4/25, CD28 (jeweils % Gated und MFI), CD8 (MFI) sowie CD3/56 (% Gated). Bei der HLH scheinen also verminderte T-Helfer-Zellzahlen sowie eine fehlende Aktivierung von T-Zellen mittels CD28 für das Krankheitsgeschehen mit verantwortlich zu sein. Die verminderte Expression von CD8 weist auf eine fehlende Regulierung der zytotoxischen Zellen und damit auf ein mögliches Überschießen der Immunreaktion bei den HLH- Patienten hin. Die Sepsis- Zusammenfassung 1! 03 Patienten wiesen signifikant niedrigere CD3, CD28 sowie CD2 Zellzahlen auf. Zudem war die Expressionsdichte von CD4 signifikant niedriger. Diese Marker weisen auf eine Verringerung sowie fehlende Aktivierung von T-Zellen bei einer Sepsis hin. Bei der Polytraumgruppe fiel auf, dass sich die Gruppe bei vielen Markern (CD3, CD28, CD2, CD8/25, CD39, CD244) deutlich in zwei Subgruppen unterschied, die Patienten 1,2,3 und 6 ohne septischen und die Patienten 4,5,7,8 mit septischem Krankheitsverlauf. Zum Zeitpunkt PT 5d waren CD3, CD2 (jeweils % Gated) sowie CD28 (MFI), bei PT 10d CD3 und CD28 (jeweils % Gated) wie auch in der Sepsis-Gruppe jeweils signifikant niedriger als die Kontrollgruppe. Signifikant höhere Zellzahlen CD244 positiver Zellen wurden bei den Poly-traumapatienten zu den Zeitpunkten 4h und 5d gemessen. Insbesondere die Messwerte der septischen Polytraumapatienten zeigten sich bei CD2, CD3 und CD28 niedriger bzw. bei CD244 höher als die gesunde Kontrolle. Eine verringerte Gesamt-T-Zellzahl (CD3) sowie das verminderte Ansprechen von T-Zellen im Falle einer Abwehrreaktion des Organismus (CD28, CD2) bei gleichzeitig deutlich erhöhten zytotoxischer Aktivität (CD244), wie bei den septischen Polytraumapatienten, könnten sich also negativ auf den Krankheitsverlauf nach Polytrauma auswirken. Signifikant höhere Messwerte als die Kontrolle wiesen die Polytrauma-patienten zudem für den Marker CD 39 und CD8/25 auf. Die septische Polytrauma- Patientensubgruppe zeigte dabei allerdings zu allen Messzeitpunkten eher CD39- und CD8/25- Werte im unteren Bereich. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass eine vermehrte Aktivierung anti-inflammatorischer Vorgänge (CD39) aber auch vermehrte zytotoxische Aktivität (CD8/25) nach schwerem Trauma für die Regeneration und Protektion des Organismus benötigt werden. Fehlt diese verstärkte Gegenregulation (CD39) bei starker Inflammation könnte dies zu einer verzögerten bzw. unzureichenden Regeneration nach Polytrauma beitragen. Kommt es bei bestehender Infektion zur verminderten Gegenregulation (CD39) bzw. können pathogene Keime nicht effizient bekämpft (CD8/25) werden, könnte dies eine Sepsis, schwere Sepsis oder septischen Schock mit erschwerter Regeneration und schlechter Prognose begünstigen. Die in dieser Arbeit gemessenen Probandengruppen sind deutlich zu klein, um mögliche Referenzwerte für Patienten mit einer spezifischen Krankheit für die Durchflusszytometrie zu ermitteln. Diese Arbeit ist Hypothesen-generierend und kann lediglich Tendenzen aufzeigen. Weitere Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven sind nötig, um die Immunphänotypisierung in weiteren klinischen Bereichen, wie bei Polytraumatisierten und Sepsispatienten, als ein wichtiges diagnostisches und Therapie-steuerndes Hilfsmittel einsetzen zu können. ! 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Zuletzt noch ein Dankeschön an meine Familie, die mir dies alles mit ihrer umfassenden Unterstützung in allen Lebenslagen überhaupt erst ermöglicht hat. Vielen herzlichen Dank. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
