Analytik der Plasmaproteine

BAUSTEINE DES LEBENS
Vom Griechischen proteios – erstrangig →
Wichtigkeit der Proteine.
Ohne Proteine kein Leben.
• Plasmaproteine – heterogenes Gemisch aus
Proteinen, zwei Drittel davon Albumin.
Proteine und Proteide
Einfache Proteine – nur AS
Zusammengesetzte Proteine – AS + andere Stoffe
= PROTEIDE
Beispiele:
• Glycoproteide: AS + KH (z.B. Lysozym der
Tränenflüssigkeit)
• Lipoproteide: AS + Fett (LDL)
• Nukleoproteide: AS + Nukleinsäuren
• Chromoproteide: AS + Farbstoffe (z.B. Hämoglobin)
Aufbau, Struktur der Proteine
Aminosäuren: = Ampholyte
Carboxylgruppe: saure Eigenschaften
Aminogruppe: basische Eigenschaften
Aminosäuren unterscheiden sich durch ihre Seitenketten (R).
Aminosäuren sind Zwitterionen
Am isoelektrischen Punkt sind Proteine neutral, haben
keine Nettoladung (Differenz aus + und – Ladung)
Denaturierung von Proteinen
Hydrophobe Bindungen (Disulfidbrücken,
Wasserstoffbrücken und Van der Waals-Kräfte) werden
gelöst, Peptidkette liegt fast gestreckt vor, native Form
nicht mehr vorhanden. biologische Funktion geht verloren.
-Erwärmung über 40 Grad (Fieber)
-pH-Veränderung durch Säuren/Laugen
- Ultraschall
- Strahlung
- starkes Schütteln
- organische Lösungsmittel (Alkohol)
Denaturierung von Proteinen
Reversible (umkehrbar) Denaturierung, wenn die
Primärstruktur noch vorhanden ist.
Reversible Denaturierung durch:
- Leichte pH-Verschiebung → pH Veränderung
- Erwärmung → Abkühlung und Einstellen eines
günstigen pH-Werts (Fieber über 42 Grad – Enzyme
irreversibel zerstört)
Aufgaben der Proteine
• Blutgerinnung: Antithrombin, Fibrinogen,
Plasminogen
• Enzyme: Alanin-Amino-Transferase ALAT,
Aspartin-Amino-Transferase ASAT, GammaGutamyltranspeptidase GGT, Alkalische
Phosphatase AP, Lactat-Dehydrogenase
LDH,…
• Immumabwehr: Komplementfaktoren C3, C4;
Immunglobuline IgG, IgM, IgE, IgA.
Aufgaben der Proteine
• Kolloidosmotischer Druck: Albumin. Mangel
oder Verlust führt zu Ödemen (Bauchwasser)
• pH-Pufferung: Hämoglobin
• Proteaseinhibitoren: α1-Antitrypsin, α2Makroglobulin.
• Signalvermittlung: Insulin
Aufgaben der Proteine
• Transport: Albumin, Caeruloplasmin,
Haptoglobin, Hämopexin
Entzündungsreaktion: Akute-Phase Proteine
wie CRP, Infektmarker wie Interleukin 6.
• Ausgangsstoffe für Hormone (Insulin) und
Neurotransmitter (Serotonin)
• Sauerstofftransport: Hämoglobin, Myoglobin
(02 Speicher im Muskel)
Proteine in der Diagnostik
- Enzyme in Reagenzien zum Nachweis von
Substraten in der Patientenprobe,
- oder Proteine als Substrate zum Nachweis von
Enzymen.
- Markerproteine für verschieden Geschehen und
Krankheiten im Körper: APP,
Hämolyseparameter, Herz-KreislaufRisikomarker, Tumormarker
Wichtige Proteine/Proteingruppen
ALBUMIN
Wichtigstes Plasmaprotein mengenmässig: 60 % Albumin,
16% Ig, 24% Übrige;
Syntheseort: Leber
Transport von hydrophoben Substanzen: Fettsäuren,
Bilirubin, Spurenelementen, Vitaminen, Hormone,
Kationen (Ca2+, Mg2+)
Aufrechterhaltung kolloidosmotischer Druck in den
Gefässen.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
ALBUMIN
Albuminmangel führt zu Ödemen, z. B. Bauchwasser =
Aszites (zusammen mit portaler Hypertension)
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
Entzündungsreaktion nach Verletzungen oder
Infektionen mit dem Ziel:
• den Erreger zu eliminieren; die
Gewebsschädigung zu begrenzen,
• die Reparaturmechanismen in Gang zu setzen,
• den Gesamtorganismus wieder zu einer
normalen Funktion zu bringen.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
Ablauf der Akute-Phase-Antwort
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
Gruppe von Proteinen, deren Konzentration im Plasma bei
Entzündungen und Gewebsschäden um mehr als 25% ansteigt
(APP), Konzentration der AAPP sinkt dabei. Sinn: APP sind
regulatorisch am Entzündungs-u. Aufräumprozess beteiligt.
Funktion:
• Lokalisation der Entzündung/Verhinderung der Ausbreitung
• Unterstützung des Immunsystems
Anstieg wird durch Mediatoren (TNFα, IL 6, Interferon-Gamma)
aus Zellen der Immunabwehr stimuliert – Antwort auf eine
Entzündung.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
PROTEIN
ANSTIEG [PLASMA]
- CRP, SAA
- α1-Antitripsin
- Fibrinogen
bis zu 2000fach
2 – 5fach
- Caeruloplasmin
- Komplementfaktoren
C3/C4
- saures α-1-Glykoprotein
- Haptoglobin
2fach
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
Diagnostischer Nutzen der APP:
Diagnose und Therapieverlauf – Anstieg der
Plasmakonzentration der APP korreliert mit dem
Ausmass der Entzündung oder Gewebsschädigung.
Wichtiger Anhaltspunkt für die Therapie: Halbwertszeit
(HWZ): CRP = 6-8 h; saures α-1-Glykoprotein,
Caeruloplasmin 2-3 Tage; Fibrinogen, Haptoglobin, α1-Antitrypsin = 4 Tage
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
Kriterien für einen guten Marker von Entzündungen
(APP):
• Anstieg bei jeder Entzündung, aber Differenzierung
der Infekte möglich (viral, bakteriell)
• deutlicher Anstieg im Vergleich zu Referenzbereich
• kurze Halbwertszeit
• rasche, automatisierbare Bestimmung
• keine Beeinflussung durch andere Krankheiten oder
Geschehen im Körper.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
Proteine die zwar in der AP ansteigen aber
obige Kriterien nicht ganz erfüllen:
• Haptoglobin: Wird durch intravasale Hämolyse
beeinflusst
• Fibrinogen: Ist an der Gerinnung beteiligt und
ist somit nicht entzündungsspezifisch
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
CRP
Heute das diagnostisch wichtigste APP.
Interleukin 6 aus Makrophagen am
Entzündungsort stimuliert CRP-Synthese in der
Leber.
CRP ist Teil des Immunsystems – opsoniert die
Erreger – aktiviert so Komplementreaktion, die
Phagozytose durch Makrophagen und stimuliert
Leukozyten.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
CRP:
• Schnelle Reaktionszeit: Anstieg nach 4-6 h deutlichster Anstieg aller APP; kurze
Halbwertszeit ca. 6–8 h
• Bestimmungen: Turbidi- oder nephelometrisch,
innerhalb ½ Stunde.
• CRP ist entzündungsspezifisch, im Gegensatz zu
Temperaturmessung, Blutsenkung und
Leukozytenzählung
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
CRP
Referenzwert: < 3 mg/l
Anstieg bis 2000fach – Maximumwerte nach 12 - 24
Stunden – bezeichnend für Art des Infekts:
• < 10 mg/l: Erkältung, Schwangerschaft, Angina,
Asthma, virale Infekte
• 10 – 100 mg/l: Herzinfarkt, Bronchitis, Cystitis, Gicht,
Pankreatitis, schwere virale Infekte
• > 100 mg/l: Grössere Verletzungen, Sepsis
(Blutvergiftung), postoperativ.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
AKUTE-PHASE-PROTEINE
CRP BESTIMMUNGSINDIKATIONEN:
- Diagnose, Therapiebeurteilung
- HIV-Patienten – immungeschwächt, daher massiv
gefährdet für Infekte
- postoperative Komplikationen
- rheumatische Erkrankungen
- Frühzeitiger Blasensprung – zur Überwachung
intrauteriner Infektionen
Wichtige Proteine/Proteingruppen
ANTI-AKUTE-PHASE-PROTEINE
Ihre Konzentration sinkt in der akuten Phase einer
Entzündung:
-
Präalbumin
Albumin
Transferrin
Wichtige Proteine/Proteingruppen
WEITERE WICHTIGE MARKERPROTEINE
Interleukin 6, Tumornekrosefaktor α
Direkte Marker der Entzündung – freigesetzt aus
Makrophagen am Entzündungsort (im
Gegensatz zu zytokininduzierten APP).
- Neugeborenensepsis: Unreife Leber –
wenig/kein CRP
Nachteil: HWZ 20 Min. zu kurz, aufwändige
Bestimmung.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
WEITERE WICHTIGE MARKERPROTEINE
PROCALCITONIN
Selektiv für systemische Infektionen durch Bakterien, Pilze,
Protozoen; steigt 2 h nach Kontakt an– reagiert nicht auf
Vireninfekte, Abstossungsreaktionen und Neoplasien –
GEEIGNET ZUR ABGRENZUNG VIRALER/BAKT.
INFEKTE – ERGÄNZEND ZU CRP
GRANULOZYTEN-ELASTASE
Freigesetzt aus neutrophilen GZ und Endothelzellen im
entzündetem und nekrotisierendem Gewebe, während der
Phagozytose. HWZ 1 h – Ansprechen auf Therapie lässt sich
schnell erkennen - ERGÄNZUNG ZU CRP
Wichtige Proteine/Proteingruppen
WEITERE WICHTIGE MARKERPROTEINE
NEOPTERIN
Aktivität unspezifischer Abwehr (Komplement, Monozyten)
- Screening von Blutspenden (HIV, CMV)
- HIV-Patienten – Anstieg vor AK-Nachweis bei Infektion
Therapiebeurteilung: Invers proportional zu Abnahme T-HelferZellen
- Transplantationen: Prognose für Komplikationen, erspart
Biopsien
HAPTOGLOBIN/HÄMOPEXIN
- Transportproteine – tiefe Konzentration zeigt intravasale
Hämolyse an; Hämopexin hat tiefere Detektionsgrenze
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF
Grundlegend für Herz-Kreislauferkrankungen
→ Atherosklerose: Gefässchädigung durch
Risikofaktoren – Einlagerung von LDL –
Makrophagen phagozytieren – Schaumzellen –
Plaquesbildung – Gefäss verengt, verhärtet –
Verschluss/Ablösung Thrombus – Embolie
oder Myokardinfarkt.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF
•
•
•
•
•
•
hs-CRP
Homocystein
Mikroalbumin
Natriuretische Peptide BNP und ANP
Lipoprotein (a) (siehe Skript: Lipide)
Myoglobin, Troponin, CK-MB (siehe Skript:
Enzyme - MKI-Diagnostik)
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF
hs-CRP:
CRP mit sensitiver Nachweismethode
(Latexpartikel verstärkt) bestimmt, Referenzwert
< 1 mg/l.
Zeigt zwischen 1 – 3 mg/l eine beginnende
Atherosklerose an.
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF
HOMOCYSTEIN
Aminosäure – Zwischenprodukt bei der Umwandlung
(Methylierung) von Methionin in andere AS
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROTEINE HERZ/KREISLAUF
HOMOCYSTEIN
Wirkt bei Plasmakonzentrationen von > 12 μmol/l
zusammen mit LDL in einem oxidativen Prozess
gefässchädigend → eigenständiger Risikofaktor
kardiovaskulärer Erkrankungen.
- Genetisch bedingte Enzymdefekte im
Homocysteinstoffwechsel
- Mangel an Vitaminen B12, B6, Folsäure
- Niereninsuffizienz oder Medikamenteninterferenz
Wichtige Proteine/Proteingruppen
MARKERPROEINE HERZ/KREISLAUF
NATRIURETISCHE PEPTIDE BNP/ANP (brain
natriuretic peptid/atrial natriuretic peptid):
Ausgeschüttet aus den Herzmuskelzellen bei Erhöhung des
Blutvolumens, bei hohem BD. Wirken vermindernd auf
das Blutvolumen.
Erhöhte Werte – Zeichen einer Herzinsuffizienz. Guter
Prognosemarker bei bestehender Herzinsuffizienz.
Analytik der Plasmaproteine
Siehe Labortechnik
Analytik der Plasmaproteine
GESAMTPROTEIN
BESTIMMUNGSINDIKATION
GESAMTPROTEIN:
- Ergänzungsuntersuchung Serumelektrophorese
- Störungen im Wasserhaushalt
- Nachweis Dysproteinämie
- Verlaufskontrolle z.B. Leber- NierenDarmerkrankungen
Analytik der Plasmaproteine
GESAMTPROTEIN
Biuret-Methode Gesamtprotein
Präanalytik: Patient sollte liegen, keine schwere
Muskelarbeit vorher → 10 % höhere Werte.
Testprinzip: Protein und Kupfer-II-Ionen bilden in
alkalischer Lösung blau-violette Komplexe –
Voraussetzung: 2 Peptidbindungen (Tripeptid).
Intensität der Farbentwicklung ist proportional
Peptidbindungen – damit Proteinkonzentration.
Anreicherung: Denaturierung und Ausfällung zur
Proteinbestimmung: Liquorprotein, Urinprotein
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNOLOGISCH: NEPHELOTURBIDIMETRIE
Nephelo- und Turbidimetrie
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNOLOGISCH: ELISA
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNOLOGISCH: KOMPETITIVER TEST
AG
AK
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNOLOGISCHE PRINZIPIEN
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNOLOGISCH: RIA
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNOLOGISCH: MIKROPARTIKELENZYMIMMUNOASSAY MEIA
Herzparameter: Troponin, CK-MB, Hormone, Tumormarker.
Prinzip: Sandwich-Immunoassay – spezifische, monoklonale AK
liegen an Mikropartikel gebunden im Reagenz vor:
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Prinzip:
Unterschiedlich schnelle und weite Wanderung
von in Lösung befindlichen Proteinen auf einer
Folie im elektrischen Feld. Aufgrund
unterschiedlicher Ladung werden
Plasmaproteine in Fraktionen aufgetrennt.
Trennmedium – Pufferlösung mit konstantem
pH-Wert.
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Warum wandern die Proteine?
Proteine besitzen freie Amino- und Carboxylgruppen
Saurer pH-Wert → Proteine positiv geladen
Alkalischer pH-Wert → Proteine negativ geladen
IEP → Proteine neutral
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Warum wandern die Proteine?
Nettoladung: Differenz von positiver und negativer
Ladung → Voraussetzung für Wanderung.
Am IEP keine Wanderung
IEP von:
- Albumin: bei pH 4.6
- Alpha-Globuline: bei pH 4.8
- Beta-Globuline: bei pH 5.2
- Gamma-Globuline: bei pH 6.4
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Puffer-pH 8.6 - Proteine liegen als Anionen (-) vor und wandern zur
Anode (+Pol). Albumin grösste Nettoladung (IEP 4.6) - Wanderung
am schnellsten und weitesten
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
INDIKATIONEN FÜR DIE DURCHFÜHRUNG:
-
Erkennen der Ursache bei Dysproteinämien
Proteinverluste
Erkennen und Verlaufbeurteilungen bei
Paraproteinämien (Plasmazellerkrankungen)
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Die Nettoladung ist für Geschwindigkeit
entscheidend
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Je kleiner das Teilchen desto schneller
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Völlig verschiedene Stoffe können gleich schnell
wandern (in Bezug auf Grösse und Ladung)
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Durchführung der Zellulose-Acetat-Elektrophorese
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Färbung und Auswertung:
Färbung mit Ponceau-Rot – Folie transparent Auswertung mit Densitometer
Gesamtprotein als Ausgangswert
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
•
Albuminfraktion:
–
•
Alpha-1-Fraktion (Alpha-1-Globulin):
–
–
–
•
Hämopexin
Transferrin
Beta-Lipoprotein (LDL)
Komplement
Am Übergang von Beta zu Gamma:
–
–
•
prä-Beta-Lipoprotein (VLDL/Triglyzeride)
Beta-Fraktion (Beta-Globulin):
–
–
–
–
•
Alpha-2-Makroglobulin
Coeruloplasmin
Haptoglobin
Alpha-2-Fraktion bzw. Übergang von Alpha-2 zu Beta:
–
•
alpha-1-Lipoprotein (HDL)
alpha-1-Glykoprotein
alpha-1-Antitrypsin
Alpha-2-Fraktion (Alpha-2-Globulin):
–
–
–
•
Albumin,
Antikörper der Klasse IgA
Fibrinogen (nur bei der Plasmaeiweiß-Elektrophorese)
Gamma-Fraktion (Gamma-Globuline):
–
Antikörper der Klasse IgG und IgM
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Normale Elektrophorese
Albumin 60%
Alpha1-Globuline 4%
Alpha2-Globuline 8%
Beta-Globuline 12 %
Gamma-Globuline 16%
Analytik der Plasmaproteine
SERUMELEKTROPHORESE
Elektrophoresenmuster
a. Normale Elektrophorese
b. Akute Entzündung
c. Chronische Entzündung
d. Leberzirrhose
e. Multiples Myelom
f. Antikörpermangelsyndrom
g. Nephrotisches Syndrom
Analytik der Plasmaproteine
IMMUNFIXATIONSELEKTROPHORESE
Negative (normale; links) und positive (pathologische, rechts)
Immunfixations-Elektrophorese. Als positiv gilt eine Immunfixation
bei Nachweis klar abgegrenzter Banden (Pfeile). Im vorliegenden
Fall existiert ein Paraprotein vom Typ IgG Lambda
Analytik der Plasmaproteine
SDS-PAGE
Auftrennung aufgrund Molekülgrösse
Analytik der Plasmaproteine
ISOELEKTRISCHE FOKKUSIERUNG
Auftrennung der Proteine
aufgrund ihres IEP längs
einem stabilen pH-Gradienten
Liquorproteinuntersuchung
Analytik der Plasmaproteine
KAPILLARELEKTROPHORESE
Analytik der Plasmaproteine
KAPILLAREKTROPHORESE
Der elektroosmotische
Fluss (EOF)
Die positiven Teilchen im Puffer
verursachen einen Fluss in Richtung
Minus-Pol, den EOF
Analytik der Plasmaproteine
KAPILLAREKTROPHORESE
Puffer gefüllte Glaskapillare 30 – 100 cm lang Ø 25 – 100
μm.
Spannung von 30 000 V.
Vorteile gegenüber herkömmlicher EP:
- keine Anfärbung
- wenig Probenmaterial (< 10 nl)
- automatisierbar
- gute Auflösung
- Ergebnisse nach wenigen Minuten
Analytik der Plasmaproteine
ISOELEKTRISCHE FOKKUSIERUNG
Zur Liquorproeindiagnostik – Auftrennung aufgrund IEP
DYSPROTEINÄMIEN
Störung der Plasmaprotein-Zusammensetzung
Vermehrung, Verminderung, Neuauftreten
(pathologisch) von Plasmaproteinen .
IMMER Verminderung von Albumin oder Zu/Abnahme von Ig (Vermehrung Albumin kommt nicht
vor).
Normale Verteilung der Plasmaproteine:
Referenzwert 66-83 g/l
•
•
•
60% Albumin
16% Immunglobuline (Ig)
24% übrige Plasmaproteine
DYSPROTEINÄMIEN
ECHTE HYPERPROTEINÄMIE (> 90 g/l)
- Plasmazellerkrankung: Erhöhte Ig-Synthese (monokl.)
- Ig-Zunahme infolge Infekt (Tuberkulose, Leberzirrhose) vorübergehend, bei erheblicher Ig-Zunahme; verzögerter
Albuminabnahme.
ECHTE HYPOPROTEINÄMIE (< 40 g/l):
Kennzeichen: Ödeme und Ergüsse.
- Verminderung Albumin- oder Ig-Synthese
- Proteinverlust über Niere (Albumin) oder Darm bei Colitis (alle
Proteine sind gleichermassen vermindert).
- Malabsorbtionssyndrom, Antikörpermangel (AIDS)
DYSPROTEINÄMIEN
Pseudoproteinämien
Störungen im Wasserhaushalt – mit Gesamtproteinbestimmung nicht
zu erkennen: Zusätzlich Ergebnisse von Hämatokrit und
Serumelektrophorese.
PSEUDOHYPERPROTEINÄMIE
Erbrechen, Durchfall, Dursten
Hämatokrit, Gesamtprotein sind (scheinbar) erhöht – Wasser im Gefässystem fehlt
PSEUDOHYPOPROTEINÄMIE: Verdünnungshypoproteinämie
Starker Blutverlust – proteinarmes Gewebswasser strömt in
Blutgefässe, Ende Schwangerschaft.
Hämatokrit, Gesamtprotein (scheinbar) vermindert – Wasser im Gefässystem
nimmt zu
DYSPROTEINÄMIEN