PowerPoint-Präsentation - Universitätsklinikum Düsseldorf
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Universitätsklinikum Düsseldorf Plasmaproteindiagnostik Vorlesung Klinische Chemie und Hämatologie Dr. Derik Hermsen Plasmaproteine Definition • • • • • • Präsenz im Plasma Primäre Funktion im Plasma Synthese in der Leber oder im Immunsystem Abgabe in das Interstitium und Blut Höchste Konzentration im Blutplasma Definierte Halbwertszeit Plasmaproteine Funktionell und strukturell sehr heterogen • • • • • • Transportproteine Immunglobuline Enzyme, (Gerinnungsfaktoren) Anti-Enzyme (Proteinaseinhibitoren) Proteohormone Proteine mit noch unbekannten Funktionen Plasmaproteine, Funktionen Enzyme, Gerinnnung Hormone, Puffer Transport Onkotischer Druck Immunabwehr Plasmaproteine, Funktionen Transportproteine Immunabwehr Albumin Immunglobuline Coeruloplasmin Komplementfaktoren Transferrin Lipoproteine Akute Phase Proteine Haptoglobin CRP u.a. Präalbumin Proteinaseinhibitoren a1-Antitrypsin a2-Makroglobulin Veränderungen der Plasmaproteine 1. Stufe der Diagnostik: Bestimmung des Gesamteiweiß Methode: z.B. Biuret-Methode, Normbereich: 66 – 83 g/l Mögliche Ergebnisse Hypoproteinämie allgemeine Erniedrigung der Plasmaproteinkonzentration unter 66 g/l Hyperproteinämie allgemeine Erhöhung der Plasmaproteinkonzentration über 83 g/l Veränderungen der Gesamtproteinkonzentration Hypoproteinämien Hyperproteinämien Nephrotisches Syndrom Malassimilationssyndrom Exsudative Enteropathie Exsudative Dermatosen Mangelernährung/Kachexie massive Blutungen toxische Leberschädigungen Defektpathoproteinämien Agammaglobulinämie Analbuminämie B-Zellerkrankungen, z.B. MM Makroglobulinämie kompensierte Leberzirrhose chronisch-entzündliche Prozesse Kollagenosen Tuberkulose rheumatoide Arthritis Dehydratationszustände Polyurie Diarrhoe Hyperemesis hypervolämische Zustände Plasmaproteindiagnostik 2. Stufe der Diagnostik Gesamteiweiß ( > 100 strukturbekannte Proteine) Spezielle Fragestellung Screening Defektproteinämie Dysproteinämie Einzelproteinbestimmung Serumeiweißelektrophorese hohe diagnostische Spezifität hoher methodischer und finanzieller Aufwand geringe diagnostische Spezifität geringer methodischer Aufwand Veränderungen der Plasmaproteine Defektpathoproteinämie Bei mehr als 30 Plasmaproteinen sind hereditäre Mangelzustände bekannt, die meist mit einer klinischen Symptomatik verbunden sind. Diese genetischen Defektzustände können beruhen auf der fehlenden Synthese eines Proteins infolge hochgradiger Verminderung oder Abwesenheit funktioneller mRNA, z.B. bei kongenitaler Analbuminämie der Synthese strukturanomaler Proteine, die zu einer defekten Ausschleusung des Proteins führt, z.B. bei hereditärem Alpha-1-Antitrypsinmangel der Synthese und Sekretion strukturvarianter Proteine mit mehr oder weniger vollständigem Verlust der normalen Funktion, z.B. bei hereditärer Dysfibrinogenämie Veränderungen der Plasmaproteine Dysproteinämie bezeichnet relative Verschiebungen des Plasmaproteinprofils, die nicht notwendigerweise mit Hyper- oder Hypoproteinämie einhergehen müssen. Sie treten relativ häufig im Verlauf akuter oder chronischer Entzündungen, Verbrennungen, Lebererkrankungen, Nierenerkrankungen, Tumoren, Proteinverlustsyndromen und bei Mangelernährung auf. Die akut entzündungsbedingten Dysproteinämien werden als Akut-Phase Reaktion zusammengefasst und sind bedingt durch Synthesesteigerung spezifischer Proteine. Eine weitere Ursache sind Störungen im Stoffwechsel der Immunglobuline. Dysproteinämie Eiweißelektrophorese • Wanderung von geladenen Teilchen im elektrischen Feld • Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Relation der verschiedenen Proteinfraktionen im Serum • Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens ist abhängig von seiner Ladung, Größe und Form und den Versuchsbedingungen • Wanderungsgeschwindigkeit ist direkt proportional der angelegten Spannung und der Ladung und umgekehrt proportional dem Radius der Teilchen • Trennung der Serumproteine im elektrischen Feld ist eine Differenzierung auf Grund unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften, es kann daher nicht auf chemische Einheitlichkeit geschlossen werden • Albuminfraktion stellt eine homogene Substanz dar, andere Fraktionen entstehen durch Überlagerung verschiedener Proteine mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften Serum Eiweißelektrophorese Normalbefund Akute Entzündung Chronische Entzündung Nephrotisches Syndrom Plasmaproteine, Elektrophorese, Leberzirrhose Antikörper-Mangel Syndrom Monoklonale Gammopathie Prinzip der SPE Monoklonale Gammopathie Immunologische Bestimmungsmethoden • Sie beruhen auf der reversiblen Bindung von Antigen und Antikörpern zum Immunkomplex Ag + Ak Ag-Ak (Immunkomplex) • Zu bestimmendes Protein stellt das Antigen dar, der Antikörper ist monospezifisch gegen dieses Protein gerichtet • In Abhängigkeit vom Konzentrationsverhältnis der Reaktionspartner bilden sich Immunkomplexe unterschiedlicher Größe aus • Große Immunkomplexe präzipitieren, kleine Immunkomplexe verbleiben in Lösung • Zugabe einer definierten Antikörpermenge im Reaktionsansatz ist Voraussetzung zur quantitativen Bestimmung einer unbekannten Antigen-(Plasmaprotein-)Konzentration Heidelberger Kurve Heidelberger Kurve Radiale Immundiffusion Immunpräzipitation in freier Lösung Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie · Konzentration des Antigens ist dem Meßsignal bei Antikörperüberschuß proportional · In Lösung befindliche Antigen-Antikörperkomplexe streuen und absorbieren Licht · Turbidimetrie erfaßt die Trübungsänderung des Ansatzes durch Immunkomplexbildung absorptionsphotometrisch bei 340 nm · Nephelometrie erfaßt die durch Immunkomplexe bedingte Lichtstreuung · Signalverstärkung durch Latexpartikel ist möglich · Konzentrationsbestimmung erfolgt über Standardkurve Nephelometrie Turbidimetrie Universitätsklinikum Düsseldorf IFE Elektrophoretische Trennung von Proteinen in einem Trägermedium (Agarosegel) • Immunpräzipitation in situ, d.h. das Gel wird mit monospezifischen Antikörpern gegen IgG, IgA, IgM sowie gegen Kappa- und Lambda-Leichtketten überschichtet und inkubiert • Auswaschen von ungebundenen Antikörpern und Proteinen • Färbung der Immunpräzipitate durch Proteinfarbstoffe • Immunglobuline werden so einzelnen sichtbar gemacht • Jede Klasse hat >10 Mil. Idiotypen die in der IF ein breites, homogenes Präzipitationsband ergeben • Bei monoklonalen Gammopathien wird ein einzelner Idiotyp vermehrt gebildet, es entsteht ein schmales Präzipitationsband Immunpräzipitation in Gel Immunfixationselektrophorese Indikation Nachweis und Identifikation von monoklonalen Gammopathien Identifikation Klassifikation Typisierung Schwere Kette (H-Kette) Leichte Kette (L-Kette) Immunglobulinaufbau variabler Teil L-Kette 2 Typen: k, l konstanter Teil H-Kette bestimmt die Ig-Klasse IgG - g IgE - e IgA - aIgD - d IgM - m Prinzip der IFE Immunfixationselektrophorese Einteilung der monoklonalen Gammopathien n. ihrem Aufbau komplette Immunglobuline (2 H- und 2 L-Ketten) Multiples Myelom (Plasmozytom, M. Kahler) IgA, IgG, IgD, IgE M. Waldenström selten IgM Myelom IgM, häufig mit Kältagglutininen verbunden inkomplette Immunglobuline Bence-Jones-Paraproteinämie Schwerkettenkrankheit nur freie Leichtketten diese werden zu Beginn der Krankheit immer im Urin nachgewiesen nur schwere Ketten Immunreaktionen mit markierten Reaktionspartnern Markierte Reaktionspartner werden als Tracer bezeichnet Zur Markierung stehen verschiedene Substanzen zur Verfügung • Radioimmunoassay (RIA) Radionuklide, z.B. 125Jod • Enzymimmunoassay (EIA) Enzyme, z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase • Fluoreszenzimmunoassay (FIA) Fluorogene Substanzen, z.B. Fluorescin- und Tetramethylrhodamin-isothiocyanat • Lumineszenzimmunoassay Luminogene Substanzen, z.B. Acridiniumester Kompetitiver Immunoassay Universitätsklinikum Düsseldorf Y Y Y + Messignal Y Y Y + Antigenkonzentration Kompetitiver Immunoassay: Analyt und Tracer konkurrieren um limitierte Antikörperbindungsstellen. Das Messignal ist umgekehrt proportional zur Analytkonzentration. Kompetitiver Immunoassay Nicht-Kompetitiver Immunoassay Antigenkonzentration Sandwich Immunoassay: Analyt reagiert mit einem im Überschuss vorliegenden (Catcher) Antikörper. Der zweite Antikörper (Detektor) bindet zum Sandwich Komplex. Das Messignal ist proportional zur Analytkonzentration. Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Messignal + Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y + Y Y Y Y Y Universitätsklinikum Düsseldorf Sandwich Assay Ergebnisinterpretation von Immunoassays 1. Konzentrationsbestimmung und kein funktioneller Test 2. Messweert ist abhängig von der Spezifität des Antikörpers. Cave Kreuzreaktionen 3. Messbereich entspricht der Konzentration der eingesetzten Kalibratoren 4. Verwendung unterschiedlicher Referenzmaterialien führt zu unterschiedlichen Ergebnissen.
