Der superagonistische CD28-Antikörper TGN1412: Ex vivo
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Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik I für Innere Medizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek Der superagonistische CD28-Antikörper TGN1412: Ex vivo Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Thomas Wieser aus Aachen Promoviert am 12. August 2009 Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik I für Innere Medizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek Der superagonistische CD28-Antikörper TGN1412: Ex vivo Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Thomas Wieser aus Aachen Promoviert am 12. August 2009 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2009 Druck: M & S Copy-Druckhaus Köln Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter 1. Berichterstatterin/Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. A. Engert 2. Berichterstatterin/Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgender Person erhalten: Frau Dr. rer. medic. Katrin Reiners, Labor für Immuntherapie der medizinischen Klinik I der Universitätsklinik Köln. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht veröffentlicht. Köln, den Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir im Labor für Immuntherapie der Klinik I für Innere Medizin der Universität zu Köln unter Anleitung von Frau Dr. rer. medic. Katrin Reiners durchgeführt worden. Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Labor für Immuntherapie von Professor Dr. med. A. Engert am Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln, Klinik I für Innere Medizin (Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek) durchgeführt. Herrn Professor Dr. M. Hallek, Herrn Professor Dr. A. Engert und Frau Priv.-Doz. Dr. E. Pogge von Strandmann danke ich für die Möglichkeit und die Mittel, diese Arbeit im Labor für Immuntherapie anzufertigen. Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Katrin Reiners für ihre hervorragende wissenschaftliche Betreuung, ihre stete Diskussionsbereitschaft sowie die zahlreichen praktischen Tipps, die wesentlich zum Gelingen der Arbeit beitrugen. Darüber hinaus gilt mein Dank allen Mitarbeitern des Labors für Immuntherapie, die mit ihrer kollegialen und freundschaftlichen angenehmes Arbeitsklima sorgten. Umgangsart für ein ausgesprochen Für meine Familie Inhaltsverzeichnis Der superagonistische CD28-Antikörper TGN1412: Ex vivo Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten 1 1 1 Einleitung 1.1 Die angeborene und adaptive Immunabwehr 1 1.2 T-Lymphozyten 1 1.2.1 Die Antigenpräsentation an T-Lymphozyten über MHC-Moleküle 1 1.2.2 CD4+, CD8+ und γ/δ T-Lymphozyten 2 1.2.3 T-Zellaktivierung: der T-Zellrezeptor und das 2 Signal-Modell 4 1.2.4 Zentrale und periphere Toleranz 6 1.3 2 Regulatorische T-Zellen 7 1.3.1 Geschichtliche Entwicklung 7 1.3.2 Natürliche und induzierte CD4+ regulatorische T-Zellen 8 + + 1.3.3 Phänotyp der CD4 CD25 Tregs 1.3.4 Eigenschaften und Wirkungsweise der CD4+CD25+ Tregs 12 1.3.5 TGN1412 – ein superagonistischer α-CD28 Antikörper 14 1.3.6 Fragestellungen dieser Arbeit 15 Material und Methoden 2.1 Methoden 2.1.1 Isolierung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) 2.1.2 T-Lymphozyteninkubation in vier Ansätzen: Kostimulation, TGN1412, 9 16 16 16 konventioneller CD28-Ak und IgG4-Isotyp 18 2.1.3 Durchflusszytometrie (FACS = fluorescence activated cell sorting) 19 2.1.4 Messung von IFN-γ und IL-10 im Serumüberstand 26 2.2 Material 28 2.2.1 Antikörper 28 2.2.2 Fluoreszenzgekoppelte Antikörper 28 2.2.3 Lösungen und Puffer 28 2.2.4 Chemikalien 29 2.2.5 Verbrauchsmaterialien 29 2.2.6 ELISA-Kits 29 2.2.7 Compensation Beads 30 3 2.2.8 Geräte 30 2.2.9 Computerprogramme 30 Ergebnisse 3.1 Stimulation von CD4+ T-Lymphozyten durch TGN1412 31 3.2 TGN1412 vermittelt eine TH1-Antwort 32 3.3 T-Zellaktivierung durch TGN1412 33 3.3.1 + Expression von CD25 auf CD4 T-Zellen + high+ 3.3.2 Bildung von CD4 CD25 3.3.3 Die T-Zellaktivierungsmarker CD71 und CD30 3.4 4 31 T-Lymphozyten TGN1412 induziert Treg 33 35 36 37 3.4.1 Foxp3 37 3.4.2 GITR 40 3.4.3 CTLA-4 (CD152) 42 3.4.4 Ox40 (CD134) 44 3.4.5 Neuropilin-1 (Nrp1) 47 3.4.6 Tabellarische Zusammenfassung 47 Diskussion 49 4.1 T-Zellstimulation durch superagonistische α-CD28-Ak 49 4.2 Treg-Expansion: TGN1412 im Rahmen bisheriger Forschung 51 4.3 Klinische Perspektive 55 5 Zusammenfassung 59 6 Literaturverzeichnis 60 7 Anhang 71 8 7.1 Abbildungsverzeichnis 71 7.2 Tabellenverzeichnis 72 Lebenslauf 73 Abkürzungen Abkürzungen Ag Antigen Ak Antikörper APC Antigen präsentierende Zelle α anti B-Lymphozyten Bursa-fabricii-Lymphozyten CD ‚cluster of differentiation’ Da Dalton DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA ‚enzyme-linked immunosorbent assay’ FACS ‚fluorecsence activated cell sorting’ FCS Fötales Kälberserum FITC Fluorescein-Isothiocyanat g Gramm HLA Human leucocyte antigen IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin kg Kilogramm MHC ‚major histocompatibility complex’ min Minute ml Milliliter mm Millimeter moAk monoklonale Antikörper nm Nanometer l Liter OD optische Dichte PBMC Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes PBS ‚phosphate buffered saline’ PE Phycoerythricin pg Pikogramm POD Peroxidase RT Raumtemperatur rpm rounds per minute Abkürzungen SD ‚standard deviation’ (Standardabweichung) T-Lymphozyten Thymus-Lymphozyten TH-Zelle T-Helferzelle TK-Zelle T-Killerzelle TNF Tumor Nekrose Familie Treg natürlich regulatorische T-Zelle Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat TCR T-Zellrezeptor µg Mikrogramm µl Mikroliter Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die angeborene und adaptive Immunabwehr Um gegen infektiöse Krankheitserreger wie Bakterien, Viren und Pilze sowie gegen körpereigene fehlregulierte Zellen verteidigt zu werden, besitzt der menschliche Organismus ein Immunsystem. Dabei können grob zwei Formen unterschieden werden: die angeborene, unspezifische und die adaptive, spezifische Immunität. Die angeborene Immunität ist phylogenetisch älter und stellt die erste Verteidigungslinie des Organismus gegen Krankheitserreger dar. Sie sorgt für eine schnelle Immunantwort, die keiner vorherigen Aktivierung bedarf. Aber sie ist eine unspezifische Abwehrform und besitzt kein immunologisches Gedächtnis gegen früheren Erregerkontakt. Vertreter dieser Immunität sind phagozytierende Zellen (Makrophagen, neutrophile und eosinophile Granulozyten) und Natürliche Killerzellen, sowie Akute-Phase-Proteine und das Komplementsystems (25). Die erworbene oder adaptive Immunität zeichnet sich durch Antigenspezifität, eine Vielzahl an Rezeptoren, die Unterscheidung zwischen Selbst- und Fremd-Antigenen sowie der Bildung eines immunologischen Gedächtnis aus. Dies stellt sicher, dass mithilfe von Gedächtniszellen bei Wiedererkennung eines im Organismus bekannten Krankheitserregers eine schnelle und effektive Abwehrreaktion erreicht wird (46). B-Lymphozyten reifen im Knochenmark und stellen die humorale Form der adaptiven Immunantwort dar. Nach antigenpräsentierenden Antigenkontakt Zellen (APC) entwickeln oder zu sie sich Antikörper entweder zu produzierenden Plasmazellen. Antikörper sind lösliche Kopien des B-Zellrezeptors und können hochspezifisch extrazelluläre Toxine neutralisieren. T-Lymphozyten entwickeln sich ebenfalls aus den hämatopoetischen, pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks, sie reifen jedoch im Thymus heran. Sie sind verantwortlich für die zelluläre Form der erworbenen Immunität. 1.2 T-Lymphozyten 1.2.1 Die Antigenpräsentation an T-Lymphozyten über MHC-Moleküle Im Gegensatz zu B-Zellen können T-Lymphozyten mit ihrem T-Zellrezeptor (TCR) keine löslichen antigenen Strukturen erkennen. Sie sind darauf angewiesen, dass 1 Einleitung ihnen antigene Strukturen durch körpereigene Zellen präsentiert werden. Mithilfe von MHC-Molekülen, speziellen Glykoproteinen, werden kleine Bruchstücke des Antigens (antigene Epitope) an die Zelloberfläche der präsentierenden Körperzellen transportiert und über den TCR durch T-Lymphozyten erkannt. (31) Die MHC-Moleküle, auch HLA (human leucocyte antigens) genannt, wurden erstmals im Rahmen der Immunantwort auf transplantiertes Gewebe entdeckt. Der DNAAbschnitt, der die genetische Information für diese Proteine enthält, nennt man MHC (major histocompatibility complex). Die zugehörigen Glykoproteine sind die MHCMoleküle, welche in zwei Klassen unterteilt sind. Die MHC-Klasse-I-Moleküle finden sich auf nahezu allen kernhaltigen Körperzellen. Sie dienen der Präsentation von intrazellulären Antigenen (Viren, intrazelluläre Bakterien), die sich im Zytoplasma der Zelle befinden. Nach Polypeptidabbau durch Proteasomen werden die antigenen Peptide im endoplasmatischen Retikulum an das MHC-Molekül gebunden und über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert. Dort erfolgt die Präsentation an CD8+ T-Zellen (31, 37, 113). Der Korezeptor CD8 (CD = cluster of differentiation) interagiert hierbei mit den MHC-Molekülen der APC und erhöht dadurch die Affinität des T-Zellrezeptors zum entsprechenden MHC-Molekül (112). MHC-II-Moleküle werden von Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert. Dies sind antigenpräsentierende Zellen. In diesen Präsentationsweg gelangen alle pathogenen Strukturen, die von extrazellulär in einem Endosom aufgenommen wurden. Im Endosom werden die antigenen Peptide durch saure Proteasen abgebaut und dann auf MHC-II-Moleküle geladen (38). Nachdem der Transport des mit Antigen beladenen MHC-II-Moleküls an die Zelloberfläche erfolgt ist, ist die antigenpräsentierende Zelle (APC) in der Lage, das antigene Epitop an CD4+ TLymphozyten zu präsentieren (138). 1.2.2 CD4+, CD8+ und γ/δ T-Lymphozyten Die T-Zellentwicklung beginnt im Knochenmark. Dort entstehen T-Zellvorläufer, die in den Thymus wandern und dort einem Reifungsprozess unterzogen werden. Die frühen T-Zellvorläufer sind sowohl für die Korezeptoren CD4 und CD8 negativ. In der weiteren Entwicklung folgt die Ausbildung des T-Zellrezeptors und eines Zustandes der doppelten Positivität für CD4 und CD8 auf den T-Zellen (144). In diesem Stadium erfolgt eine strenge Selektion der unreifen T-Zellen (75). Hierbei überleben nur diejenigen unreifen T-Zellen, die in der Lage sind, an körpereigene MHC-Moleküle zu 2 Einleitung binden (positive Selektion) (23), aber gleichzeitig körpereigene Antigene ignorieren (negative Selektion) (84). Hiernach entsteht je nach besserer Passform an das MHC-IMolekül eine einfach CD8+ oder eine einfach CD4+ naive T-Zelle bei besserer Interaktion mit MHC-II-Molekülen (112). Diese so entstandenen naiven T-Zellen, die nur 2% aller in den Selektionsprozess eingetretenen T-Zellvorläufer ausmachen, wandern in die sekundären lymphatischen Organe. Kommt es zur Interaktion zwischen Antigen und entsprechendem TCR, werden die T-Zellen aktiviert und sind von nun an als Effektor-T-Zellen in der Lage, in der Peripherie beim erneutem Zusammentreffen mit der gleichen MHC-Peptid Kombination die Elimination des Krankheitserregers einzuleiten. Diese Aktivierung von naiven T-Zellen zu T-Effektorzellen wird als „Priming“ bezeichnet. Ein Teil der aktivierten T-Zellen entwickelt sich zu Gedächtnis TZellen. Diese über Jahre wirkungsvollen Zellen haben die Aufgabe, beim Wiederauftreten eines Pathogens eine schnellere und effektivere Immunantwort durchzuführen (57). Die T-Lymphozyten lassen sich in drei Gruppen einteilen: die γ/δ-, CD4+ und CD8+ TZellen. γ/δ-T-Zellen können Antigene ohne MHC-Restriktion erkennen und befinden sich vornehmlich im Epithelgewebe und im Dünndarm (40). CD8+ T-Zellen, auch T-Killerzellen (Tk-Zellen) oder zytotoxische T-Zellen genannt, werden durch MHC-Peptid-Komplexe der Klasse I stimuliert. Aktivierte Effektor TKZellen zerstören ihre Zielzellen nach Zell-Zell Kontakt durch die Wirkung von Granzymen, Perforinen (34) und die Interaktion FAS/FAS-Ligand (99). Zielzellen der CD8+ T-Effektorzellen sind infizierte oder entartete Körperzellen. So wird die Ausbreitung von intrazellulären Pathogenen und Tumoren verhindert. Die CD4+ T-Zellen sind T-Helferzellen (TH-Zellen). Beim ersten Kontakt mit einem Antigen-MHC-Komplex differenzieren sich naive T-Helferzellen in zwei unterschiedliche Effektorzelltypen, die TH1-Zellen oder TH2-Zellen. Die beiden Populationen unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihre sezernierten Zytokine. Letztlich führen sie dadurch zu fundamental verschiedenen Immunantworten (1, 78). Die TH1-Zellen sezernieren Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (IFN-γ) und TumorNekrose-Faktor-β (TNF-β). Sie aktivieren Makrophagen und zytotoxische T-Zellen und induzieren hierdurch eine zellulär betonte Immunreaktion. TH2-Zellen schütten die Zytokine Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-13 (IL-13) und den Wachstumsfaktor TGF-β aus. Dadurch werden insbesondere BLymphozyten aktiviert und eine humorale Immunantwort eingeleitet (97, 98). Die Differenzierung der naiven T-Helferzellen in diese Effektor-Subpopulationen während 3 Einleitung des ersten Antigenkontakts wird durch verschiedene Zytokine beeinflusst. Interleukin12 (IL-12), welches von Makrophagen, Granulozyten, B-Lymphozyten und dendritischen Zellen gebildet wird, führt zur Induktion einer TH1-Antwort (41). Interleukin-4 (IL-4) wird von T-Zellen gebildet und beeinflusst die naive T-Helferzelle sich nach Stimulation in eine TH2-Zelle zu differenzieren (106). Zudem inhibieren sich die Zytokine der TH1- bzw. TH2-Zellen gegenseitig. IL-10 hemmt die TH1-Antwort und IFN-γ drosselt die TH2-Antwort (1). TH0- und TH3-Zellen sind weitere Subtypen der CD4+ T-Helferzellen. TH0-Zellen zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, sowohl TH1- als auch TH2-Zytokine zu sezernieren (27). TH3-Zellen schütten den Wachstumsfaktor TGF-β aus (19). 1.2.3 T-Zellaktivierung: der T-Zellrezeptor und das 2 Signal-Modell Der humane T-Zellrezeptor (TCR) ist ein heterodimeres Molekül, bestehend aus einer α- und einer β-Polypeptidkette, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die α- und β-Kette beinhalten jeweils eine konstante und eine variable Region. Die Aktivierung naiver T-Zellen findet in den sekundär lymphatischen Organen statt. Sie beginnt mit der Interaktion der variablen Region des TCR mit einem spezifischen Peptid/MHC-Komplex auf der Oberfläche einer APC. Die Korezeptoren CD4 bzw. CD8 binden ebenfalls an die MHC-Moleküle, aber fern der peptidbindenden Domäne, und verstärken dadurch die Affinität des T-Zellrezeptors zum entsprechenden MHC-Molekül um den Faktor 100. Es folgt eine Signaltransduktion über den assoziierten CD3Komplex, die zur Bildung von IL-2 und Expression des IL-2 Rezeptors führt. Durch die anschliessende IL-2-Sekretion und autokrine Stimulierung des IL-2 Rezeptors wird die naive T-Zelle zur Proliferation und Differenzierung in eine Effektorzelle angeregt (49). Aber nur bei bereits aktivierten T-Lymphozyten (Effektor- und Gedächtniszellen) reicht das alleinige antigenspezifische Signal über den TCR (Signal 1) für eine komplette Aktivierung aus. Naive T-Zellen benötigen hingegen zur vollstängigen Aktivierung ein zweites, antigenunspezifisches kostimulatorisches Signal (59, 105). Ohne Kostimulation kommt es zur Apoptose der T-Zelle oder zur Anergie. Dies bedeutet, dass die T-Zelle bei einer späteren Präsentation des Antigens nicht zur IL-2-Sekretion und Proliferation stimuliert wird (39, 59, 68, 69, 75). Das wichtigste kostimulatorische Signal wird durch das auf T-Zellen vorkommende Oberflächenmolekül CD28 vermittelt. CD28 gehört zur Immunglobulin-Superfamilie und wird konstitutiv auf ruhenden T-Zellen exprimiert (59). Seine Bindung an die beiden 4 Einleitung Moleküle CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2), welche von APC exprimiert werden, führt zur IL-2-Produktion sowie zur Expression von CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) (141) und liefert ein Überlebenssignal, das Apoptose oder Anergie der T-Zelle verhindert (39, 114). In diesem Zusammenhang induziert das CD28-Signal die Induktion vom antiapoptotischen Gen Bcl-XL (15). Abbildung 1: Darstellung des 2-Signal-Modells zwischen Antigen-präsentierender Zelle (APC) und + CD4 T-Lymphozyt. Die Bindung des durch ein MHC-Molekül präsentierten Antigens an den T-Zellrezeptor (TCR) stellt das erste Signal zur Aktivierung der T-Zelle dar. Das Oberflächenmolekül CD28 sorgt mit der Bindung der B7-Gruppe (B7.1 oder B7.2) für Signal 2 der T-Zellstimulation. Das inhibierende Pendant des kostimulierenden CD28 ist CTLA-4 (cytotoxic tlymphocyte antigen, CD152). Es ist ebenfalls ein Homodimer aus zwei glykosylierten Polypeptidketten und ist dem CD28 zu 70% homolog (66). Die Expression von CTLA-4 wird durch CD3- und CD28-Signale vermittelt. Es bindet mit CD80 und CD86 die gleichen Liganden wie CD28 (64), aber mit einer 50 - 100 fach höheren Affinität als CD28 (65). Während CTLA-4 auf ruhenden T-Zellen nur gering nachweisbar ist, erfolgt nach T-Zellaktivierung eine verstärkte Expression von CTLA-4 sowohl auf der Zelloberfläche (66, 136) als auch, und hier befindet sich die Mehrheit des gebildeten CTLA-4, intrazellulär (60). Funktionell wirkt CTLA-4 antagonistisch zu CD28 und führt zu einer Reduktion der IL-2 Produktion und verminderten Expression des IL-2-Rezeptors (54, 55). Somit verhindert CTLA-4 eine weitere Aktivierung der T-Zelle. Im Gegensatz zu CD28 führt CTLA-4 nicht zur Expression von anti-apoptotischen Bcl-XL-Genen (13). Vielmehr wird nach Stimulierung von CTLA-4 vermehrte Zell-Apoptose festgestellt (33). Letztlich ist für CTLA-4 eine Funktion in der peripheren Selbsttoleranz nachgewiesen. Zum einen verhindert es die Aktivierung und Proliferation von naiven autoreaktiven T- 5 Einleitung Zellen (siehe 1.2.4) und ist charakteristisches Merkmal des Phänotyps natürlich regulatorischer T-Zellen (siehe 1.3.3). 1.2.4 Zentrale und periphere Toleranz Ein essentieller Bestandteil der immunologischen Homöostase ist die Erkennung und Toleranz gegenüber körpereigenen Bestandteilen und die Zerstörung von körperfremden Strukturen. Der menschliche Körper verfügt über einige Mechanismen, um dieses Grundprinzip zu gewährleisten. Schon während der frühen Entwicklung der T-Lymphozyten im Thymus geschieht eine Selektion von autoreaktiven Zellen (75). Zunächst wird der TCR auf die Fähigkeit überprüft, körpereigene MHC-Moleküle zu erkennen. Jede T-Zelle, die einen TCR besitzt, der nicht oder zu stark mit den körpereigenen MHC-Molekülen interagiert, wird in den kontrollierten Zelltod geleitet (100). Hier wird eine positive Selektion von Vorläuferzellen vorgenommen, die eine geringe bis mittelstarke MHC-Bindung eingehen. Die T-Lymphozyten werden in einem zweiten Schritt auf Autoreaktivität untersucht. Hierbei präsentieren APC körpereigene Peptide auf MHC-Molekülen. Im Fall, dass eine unreife T-Zelle einen TCR besitzt, der dieses „Auto-Antigen“ fälschlicherweise erkennt, wird diese Zelle durch Makrophagen ebenfalls in die Apoptose Schliesslich geführt. Dieser Vorgang wird als negative Selektion bezeichnet (84). sollten nur naive T-Lymphozyten entstehen, die ausschliesslich körperfremde Peptide über eigene MHC-Moleküle erkennen. Die meisten potentiell selbstreaktiven Zellen werden durch die Mechanismen der zentralen Toleranz während der Reifung im Thymus eliminiert. Unglücklicherweise funktioniert dieses zentrale Prüfsystem nicht fehlerfrei (100) und somit gelangen regelmäßig T-Zellen in die Peripherie, welche Selbstantigene erkennen können. Daher verfügt der Organismus über weitere periphere Schutzmechanismen, die autoreaktive Zellen aussortieren und unschädlich machen. Die periphere Toleranz richtet sich entweder direkt gegen selbstreaktive T-Zellen (TZell-intrinsisch) oder wirkt indirekt über zusätzliche Zellen (T-Zell-extrinsisch) (134). Zu den intrinsischen Toleranzmechanismen zählt, dass autoreaktive T-Zellen periphere Autoantigene ignorieren, wenn sie nur sehr gering exprimiert werden. Ausserdem kann die Abwesenheit kostimulatorischer Moleküle oder die Signalübermittlung über CTLA-4 in T-Zellen Anergie ausgelösen (88). Die autoreaktiven Zellen reagieren dann zukünftig nicht mehr auf die Präsentation ihres Autoantigens und sind somit funktionell inaktiv. 6 Einleitung Die wichtige Rolle von CTLA-4 in der peripheren Toleranz wird allein dadurch deutlich, dass CTLA-4 defiziente Mäuse innerhalb kürzester Zeit an einer lymphoproliferativen Erkrankung mit autoimmuner Zerstörung multipler Gewebe versterben (129, 137). Eine Blockade des CTLA-4 Signalwegs führt in verschiedenen Studien zu Intoleranz gegenüber Eigenantigenen und autoimmunen Erkrankungen (50, 89). Zudem können T-Zellen, die durch Autoantigene aktiviert werden, durch bestimmte Zytokin- und Zytokinrezeptor-Interaktionen einen nicht-pathogenen Phänotyp entwickeln. Diese T-Zellen zeigen dann keine Autoimmunität mehr. Außerdem kann in autoreaktiven T-Zellen Apoptose induziert werden. Durch repetitive Begegnung mit ihrem Autoantigen kann die Interaktion des Todesrezeptors Fas mit seinem FasLiganden den kontrollierten Zelltod einläuten. Eine extrinsisch induzierte Toleranz wird über verschiedene Zelltypen erreicht. Dendritische Zellen sind diesbezüglich in der Lage, in autoreaktiven T-Zellen Toleranz und Anergie zu induzieren. Darüberhinaus besitzen regulatorische T-Zellen eine äusserst wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz. 1.3 Regulatorische T-Zellen 1.3.1 Geschichtliche Entwicklung Eine der ersten Theorien über die Existenz von suppressiv wirkenden T-Zellen wurde Ende der sechziger Jahre veröffentlicht. Tierexperimentell wurde herausgefunden, dass am 3. Tag nach ihrer Geburt thymektomierte Mäuse kurze Zeit später autoaggressiv ihre Ovarien abstiessen (82). Adulte Mäuse, die thymektomiert und ausserdem bestrahlt wurden, zeigten folgend eine Thyreoiditis autoimmuner Genese (86). In darauffolgenden Versuchen wurden Ratten, die nach Thymektomie an Thyreoiditis erkrankten, T-Lymphozyten intravenös verabreicht, was zum Rückgang der Entzündung der Schilddrüse führte. (87). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Subpopulation der T-Lymphozyten offenbar eine regulatorische Funktion ausübt, deren Fehlen zu Autoimmunerkrankungen führen kann. Im Jahre 1995 identifizierten Sakaguchi et al. eine Subpopulation von 5-10% der CD4+ T-Lymphozyten, die als Charakteristikum die α-Kette des Interleukin-2-Rezeptors (CD25) tragen und bei der Bekämpfung von autoreaktiven Lymphozyten eine wichtige Rolle spielen (101). Die Injektion von CD4+CD25- Lymphozyten in thymektomierte Mäuse führte zu Autoimmunerkrankungen wie Thyreoiditis, Glomerulonephritis und Polyarthritis. Daraufhin verabreichte CD4+CD25+ T-Zellen konnten die Ausprägung der 7 Einleitung Autoimmunität in diesen Mäusen verhindern. Asano et al. publizierten kurze Zeit später, dass die aus dem Thymus von Mäusen stammenden CD4+CD25+ T-Zellen ab Tag 3 im peripheren Blut zirkulieren. Eine Thymektomie an Tag 3 eliminiert diese regulatorischen T-Zellen und resultiert in autoimmunen Erkrankungen (5). Somit war die wichtige Rolle dieser CD4+CD25+ regulatorischen T-Lymphozyten für das immunologische Gleichgewicht nachgewiesen und schliesslich auch im menschlichen Organismus bestätigt (48, 81). 1.3.2 Natürliche und induzierte CD4+ regulatorische T-Zellen Die natürlichen regulatorischen T-Zellen (Treg) sind die CD4+CD25+ T-Lymphozyten. Sie stammen aus dem Thymus und stellen im Gegensatz zu den induzierten regulatorischen T-Zellen eine eigene CD4+ Zelllinie dar (47). Laut Jonuleit et al. wird der Weg von unreifen T-Zellen zu CD4+CD25+ Tregs in der Selektionsphase im Thymus bestimmt. Jede T-Zelle, die einen TCR besitzt, der nicht oder zu stark mit den körpereigenen MHC-Molekülen interagiert, wird in den kontrollierten Zelltod geleitet (100). So entwickeln sich unreife CD4+ T-Zellen, deren TCR eine geringere Affinität gegenüber den MHC-Molekülen aufweist, zu konventionellen CD4+ T-Lymphozyten. Jene mit einer intermediären Affinität werden schliesslich zu den CD4+C25+ Tregs (47). Neuere Studien weisen auf eine extrathymale Möglichkeit zur Induktion von CD4+CD25+ Treg hin. So konnte im in vivo Maus-Modell gezeigt werden, dass Tregs sich nach Östrogengabe aus CD4+CD25- T-Zellen (121) und aus naiven T-Zellen nach subkutaner Gabe von Ovalbuminpeptid (4) differenzieren können. Diese sind dem Phänotyp und den Eigenschaften natürlicher Tregs identisch. Auch die Forschungsgruppe um Karim konnte eine periphere Bildung von Tregs aus CD4+CD25T-Zellen beobachten (51). Die induzierten regulatorischen T-Zellen werden in der Peripherie durch Induktion aus naiven CD4+ T-Zellen gebildet und ihre immunsuppressive Wirkung erhalten sie nicht über Zell-Zell-Kontakte, sondern durch die Ausschüttung von Zytokinen. Zu ihnen gehören die sogenannten Tr1-Zellen (T regulatorisch 1), die vornehmlich Interleukin-10 (IL-10) ausschütten, und die TGF-β sezernierenden TH3-Zellen (T Helfer 3) (47, 74). Anzumerken sind auch CD8+ T-Zellen mit regulatorischen Eigenschaften, die aber selten vorkommen und deshalb hier vernachlässigt werden (48, 74). 8 Einleitung Abbildung 2: Schematische Darstellung der thymalen Entwicklung natürlich regulatorischer T- Zellen (Treg) und der induzierten regulatorischen T-Zellen nach Jonuleit 2003. 1.3.3 1.3.3.1 Phänotyp der CD4+CD25+ Tregs CD25 (α-Kette des IL2-Rezeptors) Die alpha-Kette des IL2-Rezeptors, CD25, wird neben natürlichen regulatorischen TZellen auch von aktivierten T-Zellen auf der Zelloberfläche präsentiert (81). Die Unterscheidung dieser beiden Populationen kann deshalb nur mithilfe weiterer TregMarker erfolgen. Eine Differenzierung der CD4+CD25+ T-Zellen in CD25low+ und CD25high+ bezüglich der regulatorischen Fähigkeit der Zellen wird von einigen Autoren als wichtig erachtet. So haben Baecher-Allan et al. festgestellt, dass sich innerhalb der CD4+CD25+ TZellpopulation die Tregs vor allem im CD25high+-Bereich befinden (7). Andere Autoren führen keine Unterscheidung der CD4+CD25+ T-Zellen im Hinblick auf regulatorische Aktivität durch und messen somit dieser Differenzierung keine Bedeutung zu (48, 119). 1.3.3.2 CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen–4, CD152) Das unter 1.2.3 beschriebene CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen–4, CD152) ist neben seiner Rolle als inhibitorisch kostimulatorisches Molekül auf konventionellen T-Zellen ein Marker für Tregs (3, 142). CD4+CD25+ natürlich regulatorische T-Zellen exprimieren es konstitutiv intrazellulär und nach Stimulation auch extrazellulär (142). Die Rolle des CTLA-4 scheint für die suppressorische Aktivität regulatorischer T-Zellen äusserst bedeutend zu sein. Obwohl einzelne Studien einen direkten Einfluss von CTLA-4 auf die regulatorischen Eigenschaften von Tregs anzweifeln (48, 61), konnte 9 Einleitung nachgewiesen werden, dass eine in vitro und in vivo Blockade von CTLA-4 mit Antikörpern in einer Reduktion der regulatorischen Aktivität der Tregs resultiert und dass sich autoimmune Krankheiten entwickeln (3, 14, 94, 123). Publikationen aus jüngster Vergangenheit konnten diese These untermauern und zeigen, dass die Blockade der Interaktion zwischen CTLA-4 und B7.1 bzw. B7.2 die suppressorischen Eigenschaften der Tregs reduziert (93) und die agonistische Stimulation von CTLA-4 diese T-Zellpopulation induziert (62). 1.3.3.3 GITR (Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor) CD4+CD25+ Tregs exprimieren weiterhin Marker der TNF (Tumor Nekrose Faktor)Familie. Sie bilden konstitutiv das transmembranäre Glykoprotein GITR (Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor) (72, 110). Es wurde gezeigt, dass die Bindung von GITR mit seinem Liganden oder stimulierenden Antikörpern zum Verlust der suppressorischen Aktivität der Treg-Zelle führt (110). Zudem macht die Interaktion von GITR mit seinem Liganden CD4+CD25- TEffektorzellen, auf denen GITR ebenfalls nach TCR-Stimulation exprimiert wird, resistent gegenüber Tregs (116). Diese Effekte von GITR resultieren in einer stärkeren Immunantwort konventioneller T-Effektorzellen. Im Rahmen der Aktivierung konventioneller T-Zellen und der Inaktivierung von Tregs durch stimulierend wirkende Antikörper gegen GITR wurde in einigen Studien eine Ausbildung bzw. Verschlechterung von Autoimmunerkrankungen nachgewiesen (53, 77, 116). Abweichend von diesem Wirkmechanismus wurde in jüngerer Forschung eine aktivierend kostimulatorische Wirkung von GITR auf Tregs beobachtet (109). Obwohl GITR ein wichtiges Merkmal natürlich regulatorischer T-Zellen ist, ist seine Rolle in der immunologischen Homöostase noch nicht vollständig verstanden. 1.3.3.4 CD134 (Ox40) Mit CD134 (Ox40) gilt ein weiteres Mitglied der TNF-Rezeptor Familie als charkteristisches Treg-Oberflächenmolekül. Neben seiner Rolle als kostimulatorisches Molekül (32) ist Ox40 sowohl auf naiven als auch auf aktivierten natürlichen Tregs nach TCR-Stimulation zu finden (72, 124, 131). Wenngleich Ox40 als phänotypisierendes Merkmal natürlich regulatorischer T-Zellen unbestritten ist, wird die genaue Rolle und Wirkung noch kontrovers diskutiert. Zum einen wurde publiziert, dass Ox40 defiziente Tregs verminderte suppressorische Wirkung besitzen (124). Dies würde eine Treg-stimulierunde Funktion für Ox40 nahelegen. Zum anderen wurde in der Forschungsgruppe um Valzasina entdeckt, dass agonistisch-stimulierende Ox40- 10 Einleitung Ak die suppressorische Treg-Aktivität hemmen (131), was für einen Treg-hemmenden Charakter von CD134 spricht. Für CD4+CD25- T-Zellen konnte gezeigt werden, dass Stimulation mittels Ox40-Ligand die periphere Toleranz von T-Effektorzellen aufhebt und diese vor Suppression durch Tregs schützt (124). Hierdurch wird Autoimmunreaktionen, ähnlich dem GITR-Modell, Vorschub geleistet. Der hemmende Effekt von Ox40 auf die periphere Toleranz konnte auch durch Blockierung der Ox40/Ox40-Ligand Interaktion gezeigt werden, die zur Verminderung autoreaktiver Prozesse führte (130, 139). 1.3.3.5 Foxp3 (forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3) Der “forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3” (Foxp3) ist nach heutigem Kenntnisstand der spezifischste Marker natürlich regulatorischer T-Zellen (142). Der erstmals 2003 im murinen System entdeckte Transkriptionsfaktor ist für die Entwicklung und Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen unerlässlich. Foxp3 ist ein Genabschnitt, dessen Produkt Scurfin (Foxp3) als Transkriptionsfaktor die Genexpression regulatorischer T-Zellen steuert. Insbesondere führt Foxp3 zu einer Transkriptionshemmung von IL-2 und der Bildung von CD25 und CTLA-4 (43, 104). Die thymale Bildung von Tregs ist abhängig von Foxp3 (52). Ein Defekt dieses Transkriptionsfaktors führt zu einem Mangel regulatorischer T-Zellen und resultiert im Tiermodell in einer auto-aggressiven, lymphoproliferativen Erkrankung, die innerhalb kürzester Zeit letal endet (17, 52). Aber Foxp3 ist nicht allein ein Marker von Tregs und wichtig für die Entwicklung von Tregs, sondern er ist eng mit der regulatorischen Funktion der Zelle verknüpft: Je höher die zelluläre Ausprägung von Foxp3, desto grösser sind auch die suppressorischen Eigenschaften der T-Zelle (28, 52). Foxp3-Defekte führen beim Menschen zum IPEX Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy, and enteropathy X-linked syndrome), einer Multiorganerkrankung autoimmuner Gense (9, 43). Foxp3-bildende Zellen haben also auch im Menschen eine immunsuppressorische Funktion. Ein weiterer Beweis dafür ist die Tatsache, dass Patienten mit Autoimmunerkrankungen eine geringere Anzahl Foxp3-exprimierender TZellen besitzen (44). Die CD4+CD25+ T-Zellen stellen die Zellpopulation dar, die vornehmlich Foxp3 exprimiert und somit regulatorische Fähigkeiten besitzt. Es wurde aber herausgefunden, dass im Gegensatz zum murinen Modell auch humane CD4+CD25T-Lymphozyten nach TCR-Aktivierung zur Bildung von CD25 und Foxp3 fähig sind (135). Somit führt die Stimulation naiver CD4+ T-Zellen neben der Entwicklung CD4+ 11 Einleitung Effektorzellen auch zur Bildung von Zellen mit regulatorischen Eigenschaften. Der humane Organismus verfügt daher auch über einen peripheren CD4+CD25- T-Zellpool, der zur Transformation in Tregs fähig ist (143). 1.3.3.6 TGF-ß Die Veröffentlichungen zur Frage der Rolle von TGF-β in der Literatur sind kontrovers. Zum einen wurde entdeckt, dass auf aktivierten Tregs sowohl die zellgebundene als auch lösliche Form in hohem Maße gebildet werden und dass blockierende Antikörper gegen TGF-β die immunsuppressive Aktivität regulatorischer T-Zellen hemmen (80). Chen et al. wiesen 2003 ausserdem nach, dass durch in vitro TGF-β-Gabe CD4+CD25T-Zellen in CD4+CD25+ Tregs transformiert werden können (18). Andererseits zeigten Piccirillo et al., dass durch Gabe von α-TGF-β-Antikörpern die regulatorische Funktion von Tregs nicht beeinflusst wird. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die natürlich regulatorischen T-Lymphozyten in TGF-β-defizienten Mäusen die gleichen immunsuppressorischen Eigenschaften besitzen wie Tregs der Kontrollmausgruppe (90). 1.3.3.7 Neuropilin 1 (Nrp1) Ein neueres Molekül, welches in Verbindung mit Tregs diskutiert wird, ist Neuropilin-1 (Nrp1). Es ein Rezeptor der Semaphorin-Familie und des „vascular endothelial growth factor“ (VEGF). Nrp1 spielt eine Rolle in der neuronalen und angiogenetischen Entwicklung und ist laut der Forschungsgruppe um Bruder konstitutiv auf CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen exprimiert. Zudem exprimieren diese CD4+CD25+Nrp1high+ TLymphozyten auch in grossen Maße FoxP3 und supprimieren effektiv CD4+CD25Zellen (16). In jüngster Vergangenheit zeigte sich, dass die Expression von CD25 in thymalen CD4+ T-Lymphozyten mit einer Nrp1-Expression einhergeht (21). Da aber bisher nur wenige Studien zu diesem Rezeptor veröffentlicht wurden, kann Nrp1 erst als potentieller Marker von Tregs angesehen werden und die zukünftige Entwicklung diesbezüglicher Forschung bleibt abzuwarten. 1.3.4 Eigenschaften und Wirkungsweise der CD4+CD25+ Tregs Regulatorische CD4+CD25+ T-Zellen stellen im humanen System ungefähr 1-3% der CD4+ T-Lymphozyten dar (135). Sie sind anerg und befinden sie sich in einem Zellzyklusarrest in der G1/GO-Phase (48). Tregs reagieren auf die Stimulation ihres TZellrezeptor (TCR) durch Antigenpräsentierende Zellen (APC) nicht mit Proliferation 12 Einleitung und Interleukin-2 (IL-2) Sekretion (56). Vielmehr aktivieren sie nach TCR-Stimulation ihre suppressorischen Eigenschaften. Dies bedeutet, dass sie die Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Effektorzellen kontrollieren und inhibieren können. Einmal aktiviert führen sie diese Inhibition antigen-unabhängig über die Hemmung der IL-2 Transkription und die Expressionshemmung von CD25 auf den Zielzellen durch (79, 91, 127). Diese Hemmung findet auf verschiedene Weise statt. Bewiesen ist eine direkte Hemmung über Zell-Zell-Kontakte (26). Oberflächenmoleküle wie TGF-β (80) oder CTLA-4 (85) senden hierbei ein inhibitorisches Signal an die Effektorzellen. In vitro ist diese Hemmung unabhängig von löslichen Zytokinen. Allerdings konnte in vivo eine Zytokinabhängigkeit in verschiedenen Krankheitsmodellen beobachtet werden (2, 6, 118). Die Mechanismen der Suppression in vivo sind weitaus komplexer als in vitro, da regulatorische T-Zellen unterschiedlicher Subpopulationen im Organismus zusammenarbeiten und die Wege ihres Zusammenspiels noch unerschlossen sind. Eine entscheidende Bedeutung für die Aktivität natürlich regulatorischer T-Zellen scheint das IL-2 zu besitzen (29, 70, 126). So ist die inhibierende Funktion der Tregs nur in Anwesenheit von IL-2 möglich. Eine Neutralisierung von IL-2 durch monoklonale Antikörper führt zu einer Reduktion natürlich regulatorischer T-Zellen und infolgedessen zu autoimmunen Erkrankungen (107). Es existiert anscheinend ein Regelkreislauf, indem die Tregs mit T-Effektorzellen um IL-2 kompetitiv wetteifern. Bindung von IL-2 führt nachfolgend zur Aktivierung der Tregs. Dies zieht intrazellulär eine Signalkaskade nach sich, an deren Ende die Hemmung der IL-2 Transkription und Sekretion steht. Durch den IL-2 Mangel werden die T-Effektorzellen in ihrer Proliferation weiter gehemmt (8, 71). Somit geschieht die Hemmung potentiell autoreaktiver Zellen zum einen über direkte Zellkontakte, teils Zytokin-abhängig, und zum anderen über einen kompetitiven IL-2 Konsum. Mit diesen Eigenschaften spielen die Tregs im Menschen eine wichtige Rolle in der peripheren Selbst-Toleranz. Therapeutische und klinisch relevante Angriffspunkte stellen die Tregs im Gebiet der Autoimmunkrankheiten und der Transplantationsmedizin dar (20, 92). Hier drosseln sie die Immunantwort gegenüber körpereigenem Gewebe und Transplantationsgewebe. Im Gegensatz dazu behindern regulatorische T-Zellen eine effektive Immunantwort im Tumorgewebe. Eine Reduktion der Tregs bei gleichzeitiger Stärkung der zytotoxischen T-Zellen ist bei Tumorerkrankungen deshalb ein erstrebenswertes Therapieziel (83). 13 Einleitung 1.3.5 TGN1412 – ein superagonistischer α-CD28 Antikörper Der superagonistische anti-CD28-Ak TGN1412 ist ein rekombinant hergestellter humanisierter monoklonaler Antikörper gegen das humane CD28-Molekül. Entwickelt wurde der Antikörper von der Firma TeGenero Immune Therapeutics (Würzburg). Konventionelle CD28-Ak sind nur bei zusätzlicher Stimulierung des TCR in der Lage, eine T-Zelle optimal zu aktivieren. Superagonistische CD28-Ak können hingegen Proliferation von T-Zellen induzieren ohne ein zusätzliches TCR-Signal (120). Sie unterscheiden sich von ihrem konventionellem Pendant durch den Bindungort am CD28-Molekül und die intrazelluläre Signalweiterleitung (67). Letztere interagieren mit dem CD28-Molekül im Bereich der Bindungsstelle der natürlichen Liganden B7.1 und B7.2, wohingegen Superagonisten an die Ig-Domäne binden. Dort nutzen sie eine C-D Schleife zur Verbindung mit der T-Zelle. Intrazellulär führt das superagonistische Signal zur Aktivierung von NF-κB, aber es hat keinen Einfluss auf die wichtigen Transduktoren ZAP-70 und die ζ-Kette des TCR-Signalweges. TGN1412 TCR CD28 Abbildung 3: Schematische Darstellung der T-Zellaktivierung und –proliferation durch TGN1412. Der superagonistische Antikörper induziert durch Bindung an das CD28-Molekül eine T-Zellexpansion ohne zusätzliches TCR-Signal. Funktionell wurde im murinen Modell bisher nachgewiesen, dass superagonistische CD28-Ak eine generelle T-Zellaktivierung induzieren und in dieser Hinsicht über den Transkriptionsfaktor GATA-3 eine Tendenz zur TH2-Antwort (96). Die geringe Lymphozytenzahl von lymphopenischen Patienten wird nach superagonistischer 14 Einleitung Stimulation rasch wieder normalisiert (24). Dies verdeutlicht die Fähigkeit von CD28Superagonisten zur massiven T-Zellaktivierung und -expansion. Im Hinblick auf das CD28-Signal in regulatorischen T-Zellen scheint der kostimulatorische Rezeptor eine wichtige Bedeutung für die Homöostase dieser Zellpopulation zu besitzen. CD28-Defizienz führte im murinen Modell zur selektiven Reduktion von CD4+CD25+ Treg ohne Einfluss auf die konventionellen T-Zellen (125). Gegensätzlich bewirkte die Stimulation von CD28 mit superagonistischen Antikörpern eine Induktion und Aktivierung von Treg in vivo und in vitro in der Maus (12). CD28-Superagonisten zeigen im Tiermodell bereits erste klinische Erfolge in der Prävention und Therapie von autoimmunen Erkrankungen. So konnten die autoimmune Neuritis (102), die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (11) und die rheumatoide Arthritis (95) durch in vivo Gabe eines superagonistischen α-CD28 Antikörper in ihrem Krankheitsverlauf gedrosselt und teilweise remittiert werden. Es war sogar möglich, durch präventive Gabe des Superagonisten der Krankheit vorzubeugen. Zusammenfassend präsentiert die bisherige Studienlage superagonistische CD28-Ak als potente T-Zellaktivatoren, insbesondere als Stimulatoren der Tregs, und die Ergebnisse aus den Tierversuchen machen Hoffnung, dass Autoimmuniät und lymphopenische Erkrankungen mit CD28-Superagonisten auch im Menschen potent therapierbar werden könnten. 1.3.6 Fragestellungen dieser Arbeit Somit waren die einzelnen Ziele dieser Arbeit: • Die ex vivo Wirkung des superagonistischen CD28-Ak TGN1412 auf humane CD4+ T-Lymphozyten im Vergleich mit einem kostimulatorischen Ansatz (α-CD3 und αCD28), einer Isotypkontrolle (humaner IgG4) und einem konventionellen CD28-Ak zu untersuchen. • Die Messung des Zytokinmilieus nach TGN1412-Inkubation der Lymphozyten, um Rückschlüsse auf die Differenzierung der CD4+ T-Zellen in TH1- bzw. TH2-Zellen zu gewinnen. • Untersuchung des Effekts von TGN1412 auf die Induktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen. 15 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Methoden 2.1.1 Isolierung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) 2.1.1.1 Zur Blutspende Gewinnung der Leukozytenkonzentrate mononukleären verwendet. Diese peripheren entstehen Lymphozyten bei der wurden Herstellung von Blutkonserven durch Zentrifugation von Vollblut. Sie enthalten neben PBMC auch Erythrozyten, Thrombozyten und Granulozyten. Die Leukozytenkonzentrate werden durch Zusatz von Heparin ungerinnbar gemacht. Zur Verfügung gestellt wurden sie von der Blutbank der Universitätsklinik der Universität zu Köln. 2.1.1.2 Isolierung der mononukleären peripheren Blutzellen mit Hilfe einer Dichtegradienten-Zentrifugation (nach Leucosep) Leucosep dient der Separation von PBMC’s aus humanem Vollblut oder Leukozytenkonzentraten. Das Leucosep-Röhrchen hat als besonderes Merkmal eine Trennscheibe aus Polyethylen. Ein solches 50 ml Leucosep-Röhrchen wurde unter sterilen Bedingungen mit 15 ml Lymphocyte Separation Medium (LSM) gefüllt und bei 2000 rpm 1 min zentrifugiert, so dass sich nun das LSM unter der Trennscheibe befand. 25 ml des heparinisierten Leukozytenkonzentrats wurden in das LeucosepRöhrchen gegeben und bei 2000 rpm für 20 Minuten ohne Bremse bei 4°C zentrifugiert. Während der Zentrifugation werden die Zellen entsprechend ihrer Dichte separiert. Es entstehen vier Phasen. Die Erythrozyten und Granulozyten sedimentieren aufgrund ihrer hohen Dichte, während sich die PBMC (Lymphozyten und Monozyten) in einer Interphase zwischen Serum und LSM konzentrieren. Die Thrombozyten sammeln sich wegen ihrer geringeren Dichte im Überstand oberhalb der PBMCSchicht. Ein Teil des Serums wurde in ein 15 ml Röhrchen aufgenommen, um es in einem Wasserbad zu inaktivieren (56°C, 20 min). Die PBMC enthaltende Interphase wurde in ein frisches 50 ml Röhrchen überführt und dreimal mit je 30 ml AIMV-Medium bei 1100 rpm 16 für 10 min und Raumtemperatur gewaschen, um LSM- und Material und Methoden Thrombozytenrückstände zu entfernen. Die PBMC wurden nach dem Waschgang in 35 ml AIMV-Medium aufgenommen. 2.1.1.3 PBMC-Zählung in der Neubauer-Zählkammer 25 μl der in 35 ml AIMV suspendierten PBMC wurden in ein 0,5 ml Reagiergefäss überführt und mit 75 μl Trypanblau verdünnt. Trypanblau dringt in tote Zellen ein und färbt diese blau. Es dient somit der mikroskopischen Differenzierung zwischen gesunden und abgestorbenen Zellen. Die Anzahl vitaler Zellen wurde nun unter dem Mikroskop in einer NeubauerZählkammer ermittelt. Das Zählnetz setzt sich aus 1x1 mm messenden Quadraten zusammen, die eine Tiefe von 0,1 mm aufweisen. Das Volumen eines solchen Quadrates misst somit 0,1 mm3 = 0,1 µl. Zur PBMC-Zählung wurden alle vier Eckquadranten gezählt. Die Anzahl an vitalen Zellen in der Zellsuspension errechnet sich aus der folgenden Formel: Anzahl gezählter Leukozyten x Verdünnung Leukozyten x 103 Leukozyten = Anzahl ausgezählter Quadrate x Volumen über Quadrat = µl ml Die Anzahl der in den grossen Quadraten gezählten Leukozyten wird mulitpliziert mit dem Verdünnungsfaktor, in diesem Fall ¼ . Im Nenner wird die Anzahl der gezählten Quadrate mit dem Volumen über jedem Quadrat (0,1 µl) multipliziert. Als Ergebnis erhält man die Leukozytenanzahl, die sich in einem µl der AIMV-Zellsuspension befinden. Die Leukozytenzahl/ml ergibt sich durch Multiplizieren mit dem 3 Umrechnungsfaktor 10 . Die PBMC wurden mit einer Zellzahl von 4 x 106 Zellen / ml in AIMV-Medium mit 10% autologem Serum aufgenommen. 17 Material und Methoden Abbildung 4: Neubauer Zählkammer: Zur PBMC-Zählung wurden die vier Eckquadranten ausgezählt 2.1.1.4 Serum-Inaktivierung der Blutspende Das nach Dichtezentrifugation abgenommene Serum wurde in einem 15 ml Röhrchen für 20 Minuten in ein Wasserbad bei 56°C erwärmt, um das enthaltene Fibrinogen und die Gerinnungsfaktoren zu inaktivieren. 2.1.2 T-Lymphozyteninkubation in vier Ansätzen: Kostimulation, TGN1412, konventioneller CD28-Ak und IgG4-Isotyp Unter sterilen Bedingungen wurden in 40 Näpfe einer 96-Loch-Zellkulturplatte je 100 µl der PBMC-Zellsuspension vorgelegt, so dass sich in jedem Napf 4 x 105 Zellen befanden. Die Antikörper wurden in AIMV-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem autologem Serum verdünnt. 100 µl der jeweiligen Antikörperverdünnung wurden zu 10 Näpfen pro Versuchsansatz pipettiert. Zur Kostimulation wurden die Zellen mit 0,04 µg/ml αhumanem CD3 und 0,06 µg/ml α-humanem CD28 inkubiert. In diesem Ansatz sollte eine spezifische Bindung an die Oberflächenantigene CD3 und CD28 der TLymphozyten erfolgen. Genauso wurde mit dem superagonistischen TGN1412 sowie dem konventionellen α-CD28 Ak verfahren, die mit einer Endkonzentration von 5 µg/ml eingesetzt wurden. Beide Antikörper binden spezifisch an das Oberflächenantigen CD28 der T-Lymphozyten. Als Negativkontrolle wurde ein humaner IgG4 κ, der keine spezifische Bindung aufweist, mit einer Konzentration von 1 µg/ml im Napf verwendet. Anschliessend wurde die Zellkulturplatte für 4 Tage in einen Zellinkubator bei 37°C und 5% CO2 deponiert. Diese Methode wurde für 23 PBMC-Ansätze durchgeführt. 18 Material und Methoden Inkubationsansatz Ak Kostimulation α-humaner CD3 α-humaner CD28 Superagonistischer αCD28 Konventioneller α-CD28 Negativkontrolle TGN1412 α-humaner CD28 α-humaner IgG4 Ak-Konzentration in AIMV (10% autologes Serum) Ak-Konzentration im Napf 0,08 µg/ml 0,04 µg/ml 0,12 µg/ml 0,06 µg/ml 10 µg/ml 5 µg/ml 10 µg/ml 5 µg/ml 2 µg/ml 1 µg/ml Tabelle 1: Antikörperkonzentrationen der Inkubationsansätze 2.1.3 2.1.3.1 Durchflusszytometrie (FACS = fluorescence activated cell sorting) Allgemeines zur Durchflusszytometrie Mithilfe der Durchflusszytometrie können die physikalischen und molekularen Eigenschaften von Zellen differenziert und quantifiziert werden. Zur Analyse wird ein Zytofluorometer benutzt. Die Zellsuspension wird durch Druckluft über eine Stahlkapillare in die Messkammer geleitet. Dort werden die Zellen, die nun von einer Trägerflüssigkeit umgeben sind, beschleunigt. Dadurch werden Zellkonglomerate aufgetrennt. Durch die hydrodynamische Fokussierung werden die Zellen, wie an einer Perlenkette aufgereiht, einzeln an 2 Laserstrahlen vorbeigeleitet. Der blaue Laser strahlt Licht mit 488 nm aus, der rote Laser mit 633 nm. Abbildung 5: Prinzip der Durchflusszytometrie 19 Material und Methoden Das Verfahren basiert auf der Messung von Streu- und Fluoreszenzlicht. Streulicht entsteht, indem ein Lichtstrahl bei Auftreffen auf ein Objekt, in diesem Fall eine Zelle, eine Richtungsänderung erfährt ohne die Wellenlänge des Lichtstrahls zu ändern. Beim Auftreffen des Lasers auf die Zelle kommt es zu einem Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC) und zu einem Seitwärtsstreulicht (sideward scatter, SSC). Das Vorwärtsstreulicht entsteht durch Lichtbeugung des Laserstrahls und wird entlang der Achse des einfallenden Lichtes gemessen. Es ist proportional zur Zellgrösse. Das Seitwärtsstreulicht entsteht durch Lichtbrechung sowie –reflexion und wird in einem 90° Winkel zum einfallenden Licht gemessen. Es ist proportional zur Zellgranularität. Wenn eine Zelle Licht absorbiert und mit anderer Wellenlänge wieder aussendet, so spricht man von Fluoreszenz. Fluoreszenz entsteht bei der Durchflusszytometrie durch fluoreszierende Farbstoffe (Flurochrome). Antikörper, die an ein Fluorochrom gekoppelt sind, binden ein spezifisches Oberflächenantigen einer Zelle. Beim Passieren des Laserstrahls absorbiert das Fluorochrom Licht eines bestimmten Wellenlängenbereichs (Absorptionsspektrum) und wird durch dieses angeregt. Daraufhin emittiert es Licht anderer Wellenlänge, welches durch einen Detektor gemessen wird. Dabei emittiert jeder Farbstoff Licht einer für ihn charakteristischen Wellenlänge (Emissionsspektrum). So kann über die Detektion des charakteristischen Emissionsspektrums des jeweiligen Farbstoffs das Zielmolekül der Zelle „sichtbar“ gemacht werden. Bei den Messungen dieser Arbeit wurden zudem Tandemkonjugate (PE-Cy7, APC-AF750) verwendet. Am Beispiel von PE-Cy7 stellen PE und Cy7 verbundene Fluorochrome dar. Bei Lichtemission von PE wird der Farbstoff Cy7 angeregt und emittiert Licht mit charakteristischer Wellenlänge (Tab. 2), das mittels Detektor erfasst wird. Fluorochrom Absorption [nm] Emission [nm] Phycoerythricin (PE) 488 575 PE-Cy7 496 767 APC-AF750 750 785 AF647 649 666 Tabelle 2: Absorptions- und Emissionspektren der verwendeten Fluorochrome Es ist möglich, Zellen mit mehreren Farbstoffen, die an unterschiedliche Antikörper gekoppelt sind, gleichzeitig zu färben. Das FACS-Gerät verfügt nämlich über mehrere 20 Material und Methoden Detektoren, die Licht unterschiedlicher Wellenlänge messen. Somit kann infolge Detektion der unterschiedlichen Emissionsspektren der Farbstoffe Aufschluss über den Oberflächenmolekülbesatz der Zellen gewonnen werden. So lassen sich dann Subpopulationen innerhalb der PBMC ermitteln. Dabei ist die Fluoreszenzintensität abhängig von der Anzahl an gebundenen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern. Je mehr bestimmte Oberflächenantigene auf einer Zelle existieren und den Farbstoffgekoppelten Antikörper binden, desto höher ist die gemessene Fluoreszenzintensität. Die Signale wurden im Zytofluorometer „FACS CANTO“ der Firma BD („Becton and Dickinson“) gemessen und mit Hilfe der „BD FACSDiva Software“ ausgewertet. 2.1.3.2 Antikörper-Färbung und FACS-Messung der stimulierten PBMC Die über 4 Tage inkubierten PBMC wurden in der Zellkulturplatte zunächst bei 1600 rpm für 3 Minuten pelletiert. Der Überstand aus AIMV-Medium und autologem Serum wurde abpipettiert (Kostimulation, und in jeweils TGN1412-Inkubation, ein Reagiergefäss konventionelle je Inkubationsansatz CD28-Inkubation, Isotyp- Kontrolle) aufgenommen. Die Aliquots wurden dann für spätere serologische Untersuchungen bei -20°C eingefroren. Die zentrifugierten Zellen wurden in FACSRöhrchen überführt, indem jeweils die Zellen eines Napfes in ein FACS-Tube pipettiert wurden. So entstanden für jeden der vier Ansätze jeweils 10 FACS-Röhrchen. Nach dreimaligem Waschen bei 2000 rpm für 2 min mit 400 µl FACS-Puffer/Röhrchen wurden die Zellen dunkel auf Eis gelagert. Die PBMC wurden nun mit Flurochrom gekoppelten Antikörpern gefärbt. Tabelle 3 gibt das verwendete FACS-Panel wieder. In Röhrchen eins befinden sich ungefärbte Zellen. Hier wird keine Antikörperfärbung sondern nur 100 µl FACS-Puffer hinzugegeben, damit für die spätere FACS-Messung ein Leerwert existiert. In Röhrchen zwei wurden 100 µl FACS-Puffer vorgelegt und 2 µl Isotyp PE-Cy7 sowie 2 µl CD4 APC-AF750 zugegeben. In diesem Tube konnte später die unspezifische Bindung des PE-Cy7-Antikörpers auf den CD4 positiven Lymphozyten erfasst werden. Die Färbung der Röhrchen drei bis zehn wurde nach dem gleichen Prinzip durchgeführt mit 100 µl FACS-Puffer/Röhrchen, 2 µl APC-AF750/Röhrchen, 2,5 µl AF647/Röhrchen, 2 µl PE-Cy7/Röhrchen und 3 µl PE/Röhrchen. Zunächst wurde die extrazelluläre Färbung mit den Farbstoffen APC-AF750, PE-Cy7 sowie mit den PE-Fluorochromen der Röhrchen 3-8 vorgenommen. Die gefärbten Zellen wurden anschliessend für 30 Minuten dunkel auf Eis gelagert. In dieser Zeit 21 Material und Methoden können die Antikörper an die entsprechenden Oberflächenantigene der Lymphozyten binden. Anschliessend wurden die Zellen dreimal mit 400 µl FACS-Puffer bei 2000 rpm für 2 Minuten gewaschen und zur intrazellulären Färbung permeabilisiert. Die TregMarker Foxp3, GITR und CTLA-4 befinden sich hauptsächlich intrazellulär und können deshalb erst nach Permeabilisierung der Zellen mit Farbstoffen detektiert werden. Diesbezüglich wurden die Zellen jedes Röhrchens nach extrazellulärer Färbung mit 150 µl BD Cytofix/Cytoperm für 20 Minuten bei Raumtemperatur und unter Lichtabschluss inkubiert. Nach erfolgter Permeabilisierung der Zellmembran und Waschgang mit 400 µl BD Perm/Waschpuffer pro Röhrchen (2000 rpm, 2 min) wurden die Zellen der Röhrchen 3-10 mit AF647-Farbstoff und 9-10 zusätzlich mit PE-Farbstoff für 30 Minuten dunkel bei RT gefärbt. Anschliessend wurden die Zellen nach zweimaligem Waschgang mit 400 µl BD Perm/Waschpuffer (2000 rpm, 2 min) in 300 µl FACS-Puffer aufgenommen. Hiernach erfolgte die Messung des extra- und intrazellulären Molekülbesatzes am BD FACSCanto. Röhrchen PE AF647 PE-Cy7 APC-AF750 1 ./. ./. ./. ./. 2 ./. ./. iso CD4 3 CD8 iso CD25 CD4 4 CD30 Foxp3 CD25 CD4 5 iso Foxp3 CD25 CD4 6 CD134(Ox40) Foxp3 CD25 CD4 7 CD71 Foxp3 CD25 CD4 8 Nrp1 Foxp3 CD25 CD4 9 CTLA-4 Foxp3 CD25 CD4 10 GITR Foxp3 CD25 CD4 Tabelle 3: FACS-Panel. In den Zeilen sind die FACS-Tubes 1-10 angegeben, in die die PBMC vorgelegt werden. In den Spalten sind die fluoreszierenden Farbstoffe angegeben, die mit einem Antikörper verbunden sind und den Zellen der Tubes zugeführt werden. Die FACS-Röhrchen wurden mit jeweils 2 µl APC-AF750/Röhrchen, 2 µl PE-Cy7/Röhrchen, 2,5 µl AF647/Röhrchen und 3 µl PE/Röhrchen beladen. Diese Färbung wurde durchgeführt für die vier Inkubationen (Kostimulation, TGN1412-Inkubation, konventionelle α-CD28 Inkubation, Isotypkontrolle). Die fett gedruckten Antikörper wurden zur intrazellulären Färbung benutzt. 22 Material und Methoden 2.1.3.3 Kompensation der Fluorochrome Da die Emissionsspektren der eingesetzten Fluorochrome zum Teil überlappen, kann es bei Mehrfarbfluoreszenzanalysen zur Detektion falsch positiver Signale kommen. Dies hat zur Folge, dass ein Fluorochrom teilweise im falschen Fluoreszenzkanal detektiert wird. Ein Beispiel ist die Kombination von FITC und PE (siehe Abb. 6). Unter nichtkorrigierten Bedingungen emittieren FITC gefärbte Zellen auch im roten Messkanal (PE-Messkanal), während PE zu einem geringeren Maß auch in den grünen Kanal (FITC-Messkanal) strahlt. Berücksichtigt man dies nicht, so erhält man falsch positive Ergebnisse. Abbildung 6: Spektrale Überlappung der Fluorochrome am Beispiel von PE und FITC. Zur Bestimmung der spektralen Überlappung der verwendeten Fluorochrome wurde das „Compensation Particles Set“ (Becton Dickinson) benutzt. Es beinhaltet zwei Arten von Mikropartikeln. Zum einen ein α-Maus Immunoglobulin κ, welches die Leichtketteneinheit von Maus-Immunoglobulinen bindet. Zum anderen ist eine Negativkontrolle (FBS: fetales bovines Serum) enthalten, die keine Bindungsfähigkeit besitzt. In 4 FACS-Röhrchen wurden je 100 µl FACS-Puffer vorgelegt. Je ein Tropfen der Negativkontrolle und des α-Maus Ig κ werden in jedes Tube zugegeben. Nun wurden nach dem Schema in Tabelle 4 jeweils 4 µl des fluoreszierenden Antikörpers zugefügt und bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert. Nach Inkubationsende wurde jedes Tube mit 2 ml FACS-Puffer bei 1100 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Daraufhin wurde vorsichtig der Überstand abpipettiert und die „Compensation Beads“ in 500 µl FACS-Puffer aufgenommen. 23 Material und Methoden Das FACS-Gerät errechnet bei der Messung eine Kompensation, welche von jedem Signalpuls den durch die spektrale Überlappung verursachten Fluoreszenzanteil subtrahiert. Danach ist die spektrale Überlappung korrigiert und die PBMC’s können gemessen werden. Röhrchen PE AF647 PE-Cy7 APC-AF750 C1 C2 C3 CTLA-4 Foxp3 C4 CD25 C5 CD4 Tabelle 4: Antikörper-Färbung der „Compensation beads“ 2.1.3.4 Auswertung der Messergebnisse der Durchflusszytometrie Die graphische Darstellung der Messergebnisse erfolgte als Zweiparameterdarstellung („dot plot“) und als Histogramm. Im dot plot wird der FSC (Zellgrösse, x-Achse) und der SSC (Granularität, y-Achse) gegeneinander aufgetragen. Jeder einzelne Punkt repräsentiert eine Zelle. Durch verschiedene Punktwolken mit unterschiedlichem FSC und SSC liessen sich Subpopulationen der PBMC identifizieren und einzeln analysieren. Die Lymphozyten zeichnen sich durch einen geringeren FSC als die Monozyten aus. Die so identifizierten Lymphozyten konnten dann auf Fluoreszenz untersucht werden. Im Histogramm ist die Fluoreszenzintensität auf der Abszisse und die Anzahl der Zellen auf der Ordinate dargestellt. So liessen sich die Lymphozyten auf die extrazellulären Oberflächenmoleküle CD4, CD25, CD30, CD71, Nrp1 und Ox40 (CD134) sowie auf die intrazellulären Markerproteine Foxp3, GITR und CTLA-4 analysieren. Um valide Ergebnisse für den Oberflächenmolekülbesatz der Spenderlymphozyten zu erhalten, wurde für jeden Farbstoff eine Negativkontrolle angesetzt (Isotyp). Ein mit dem jeweiligen Farbstoff gekoppelter Maus-IgG1-Antikörper sollte nicht an die menschlichen Zellen binden und stellt somit einen Referenzwert für die unspezifische Bindung dar. 24 Material und Methoden Abbildung 7: Darstellung der PBMC als „dot-plot“ und Histogramm. Links: Aufteilung der PBMC nach Vorwärtsstreulicht (FSC) und Seitwärtsstreulicht (SSC). Infolge unterschiedlicher Zellgrösse und Zellgranularität lassen sich die PBMC durch Setzen von Analysefenstern, sogenannten „gates“, in die Subpopulationen Lymphozyten und Monozyten trennen. Die Subpopulationen lassen sich dann getrennt analysieren. Rechts: Die im „dot-plot“ identifizierten Lymphozyten werden hier auf das Oberflächenantigen CD4 untersucht. Lymphozyten mit einer Fluoreszenzintensität geringer als 2 x 10 3 wurden als CD4 3 negativ definiert. Lymphozyten mit einer Fluoreszenzintensität grösser als 2 x 10 wurden als CD4 positiv festgelegt. Definition der CD4+CD25+ T-Zellpopulation. Links: Darstellung der Negativkontrolle Abbildung 8: + der CD4 Lymphozyten mit CD25. Alle Zellen unterhalb einer Fluoreszenzaktivität von ungefähr 1 x 10 3 + haben eine hohe unspezifische Bindung und werden bei der Berechnung der CD25 Zellen nicht mit einbezogen. Rechts: Darstellung der CD25 + + Zellen der CD4 Lymphozyten. Da die Negativkontrolle bei 3 ungefähr 1 x 10 definiert wurde, besitzen alle Zellen oberhalb dieses Wertes das Oberflächenantigen + 4 CD25 (CD25 ). Alle Zellen mit einer Fluoreszenzintensität oberhalb von ca. ca. 2,5 x 10 sind als stark high+ CD25 positiv (CD25 ) definiert. 25 Material und Methoden 2.1.4 Messung von IFN-γ und IL-10 im Serumüberstand Um die Zytokine IFN-γ und IL-10 im Serum der vier Inkubationsansätze TGN1412, Kostimulation, Isotypkontrolle und konventioneller CD28 zu detektieren, wurde ein ELISA (enzyme-linked-immunosorbent assay) verwendet. Bei diesem Verfahren reagiert das zu messende Zytokin als Antigen mit einem Primärantikörper (capture antibody), der an einer Mikrotiterplatte haftet. Ein hinzugegebener Sekundärantikörper (detection antibody), der enzymgekoppelt ist, bindet ebenfalls an das Zytokin. Das gekoppelte Enzym katalysiert später eine Farbstoffreaktion, die photometrisch gemessen werden kann. Die Intensität der Farbstoffreaktion ist hierbei proportional der Zytokinkonzentration. Zunächst wurde jeder Napf einer 96-Loch-Mikrotiterplatte mit 100 µl Primärantikörper (α-human IL-10 oder α-human IFN-γ) besetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Primärantikörper wurde zuvor 1:250 in Beschichtungspuffer verdünnt. Anschliessend wurde die Mikrotiterplatte ausgeschüttet, auf einer Zellstoffunterlage ausgeschlagen und dreimal mit je 200 µl Waschpuffer/Napf gewaschen. Danach erfolgte eine Blockierung restlicher Proteinbindungsstellen mit 200 µl Blockierungslösung/Loch. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde ein erneuter Waschgang (siehe oben) durchgeführt. Zur späteren Quantifizierung wurde eine Standardkurve mit rekombinantem IL-10 bzw. IFN-γ erstellt. Hierzu wurden die rekombinanten Zytokine in Blockierlösung (Assay diluent) in einer Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,2 pg/ml, 16,6 pg/ml und 7,8 pg/ml angesetzt. Nun wurden 100 µl der Standardverdünnungsreihe und der Serumüberstände von 13 PBMC-Inkubationsansätzen in die entsprechenden Löcher der Mikrotiterplatte pipettiert und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. In diesem Schritt bindet vorhandenes Zytokin der PBMC-Serumüberstände an den Primärantikörper. Die Platte wurde hiernach fünfmal gewaschen und anschliessend mit 100 µl/Napf eines enzymgekoppelten Sekundärantikörpers (α-humanes IL-10 bzw. α-humanes IFN-γ) besetzt. Der biotinilierte Sekundärantikörper wurde zuvor 1:250 in Blockierlösung verdünnt und mit dem Enzym-Reagenz (Streptavidin-gekoppelte Peroxidase, 1:250 verdünnt) versetzt. Dieser Schritt führte dazu, dass die Peroxidase über Streptavidin an das Biotin des Sekundärantikörpers bindet. In einer Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde bindet der enzymgekoppelte Sekundärantikörper an das bereits am Primärantikörper gebundene Zytokin. Hiernach erfolgte eine Waschung (siehe oben) mit insgesamt 7 Waschgängen. Schliesslich 26 Material und Methoden wurden 100 µl der Substratlösung SIGMA FAST OPD in jeden Napf pipettiert und lichtgeschützt bei Raumtemperatur für maximal 30 Minuten inkubiert. Anschliessend wurde die Farbreaktion mit 50 µl/Napf einer 25% Schwefelsäure abgestoppt. Am ELISA Reader wurde zuletzt die Extinktion bei 450 nm gemessen. 27 Material und Methoden 2.2 Material 2.2.1 Antikörper α-humaner CD3 BD Biosciences, NJ/USA " CD28 BD Biosciences, NJ/USA " TGN1412 TeGenero, Würzburg/BRD " IgG4, kappa Sigma-Aldrich, München/BRD 2.2.2 Fluoreszenzgekoppelte Antikörper α-humaner CD4 APC-AF750 Caltag Laboratories, Burlingame/USA " CD8 PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " CD25 PE-Cy7 BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " CD30 PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " CD71 PE Immunotools, Friesoythe/Deutschland " CD134 (Ox40) PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " CD152 (CTLA-4) PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " GITR PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " Nrp1 PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA " Foxp3 AF647 Biolegend, San Diego/USA IgG1, kappa PE BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA IgG1, kappa AF647 Biolegend, San Diego/USA IgG1, kappa PE-Cy7 BD Biosciences Pharmingen, NJ/USA α-Maus " 2.2.3 Lösungen und Puffer FACS-Puffer 1x PBS 0,2% BSA 0,2% NaN3 PBS 8 g/l NaCl 0,2 g/l KCl 1,44 g/l Na2HPO4 0,24 g/l KH2PO4 pH 7,4 28 Material und Methoden 2.2.4 Chemikalien Aqua dest. Labor für Immuntherapie, Uniklinik Köln 0,9% NaCl-Lösung Delta-Pharma GmbH, Pfullingen/BRD LSM (Lymphocyte Separation Medium) AIM-V (Bovine Serum Albumin, Lglutamine, Streptomycin sulfat 50 ug/ml, Gentamicin sulfat 10 ug/ml) Trypanblau PAA, Pasching/Österreich BD FACS Flow BD Biosciences, NJ/USA BD FACS Clean BD Biosciences, NJ/USA BD FACS Rinse BD Biosciences, NJ/USA BD Biosciences Pharmingen, San Diego/USA BD Biosciences Pharmingen, San Diego/USA BD Cytofix/Cytoperm BD Perm/Wash Buffer 2.2.5 GIBCO, Karlsruhe/BRD Sigma, St. Louis/USA Verbrauchsmaterialien Leucosep Polypropylenröhrchen (50 ml) Greiner, Frickenhausen/BRD Polypropylenröhrchen (50 ml) Eppendorf Röhrchen (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) Greiner, Frickenhausen/BRD VWR international, Darmstadt/BRD Eppendorf, Hamburg/BRD 96-Well Rundboden Zellkulturplatte Falcon, Oxnard/USA 96-Well Flachboden Mikrotiterplatte Nunc, Wiesbaden/BRD 12x75 mm Falcon-Röhrchen (5 ml) Falcon, Oxnard/USA VWR international, Darmstadt/BRD Greiner, Frickenhausen/BRD Polypropylenröhrchen (15 ml) Serologische Pipetten Pipettenspitzen 2.2.6 ELISA-Kits BD ELISA Kit IL10 BD Biosciences, NJ/USA BD ELISA Kit IFN BD Biosciences, NJ/USA Lösungen und Puffer nach Herstellerangaben angesetzt 29 Material und Methoden 2.2.7 Compensation Beads BD CompBeads α-Maus Ig, kappa BD Biosciences, NJ/USA BD CompBeads Negativkontrolle (FBS) BD Biosciences, NJ/USA 2.2.8 Geräte LaminAir HB2448 Sterilarbeitsbank Heraeus Instruments, Hanau/BRD Zentrifuge GR422 Jouan Incorporated, Winchester/USA Finnpipette 1ml, 200 µl, 40 µl, 10 µl Thermo Labsystems, Vantaa/Finnland Megafuge 1.0 Heraeus Instruments, Hanau/BRD Neubauer Zählkammer Faust/Merck, Darmstadt/BRD Mikroskop Axiovert 25 Zeiss, Jena/BRD Wärmebad GFI, Gilching/BRD Zellinkubator Hera Cell Heraeus Instruments, Hanau/BRD FACSCanto BD Biosciences, NJ/USA Multipipette Eppendorf, Hamburg/BRD Vortex Heidolph, Schwabach/BRD Biofuge 13 Heraeus instruments, Hanau/BRD ELISA-Reader Biotech Instruments, NY/USA Eismaschine AF10 Ziegra Eismaschinen, Isernhagen/BRD Gefrierschränke Sanyo, München/BRD Kühlschränke Siemens, Berlin/BRD Accu-Jet pro Brand, Wertheim/BRD 2.2.9 Computerprogramme FACSDiva Software BD Biosciences, NJ/USA Microsoft Word Microsoft, USA Microsoft Excel Microsoft, USA 30 Ergebnisse 3 Ergebnisse In den dieser Arbeit zugrundeliegenden Experimenten wurde untersucht, wie sich der superagonistische α-CD28 Antikörper TGN1412 auf T-Lymphozyten in PBMC gesunder Blutspender auswirkt. Mithilfe der FACS-Analyse konnte die Expression relevanter intra- und extrazellulärer Moleküle der mit TGN1412 inkubierten TLymphozyten analysiert und mit dem Effekt anderer Inkubationsansätze (siehe Punkt 2.1.2) verglichen werden. In ELISA-Versuchen wurde zudem ermittelt, in welchem Zytokinmilieu sich die Lymphozyten nach TGN1412-Inkubation befinden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit gliedern sich in folgende Abschnitte: • Induktion von CD4+ T-Lymphozyten durch TGN1412. • Genaue Analyse der CD4+ T-Lymphozyten auf die T-Zellproteine CD25, CD30, CD71, CD134 (Ox 40), Nrp1, Foxp3, GITR und CTLA-4 (CD152). • Analyse der Serumüberstände nach Inkubation auf die Zytokine IFN-γ und IL-10 zur Differenzierung einer TH1- bzw. TH2-Antwort durch TGN1412. 3.1 Stimulation von CD4+ T-Lymphozyten durch TGN1412 Um zu differenzieren, ob die Inkubation von T-Lymphozyten mit TGN1412 eher zu einer Bildung von CD4+ Helferzellen oder CD8+ Effektorzellen führt, wurde eine CD4/CD8-Relation zu Hilfe gezogen. Hierbei wurde für jede der 23 Messungen der Prozentsatz an nachgewiesenen CD4+ T-Helferzellen durch den Prozentsatz an CD8+ T-Zellen geteilt. Anschliessend wurde für jeden Inkubationsansatz ein Mittelwert und die zugehörige Standardabweichung errechnet. Die Isotypkontrolle mit α-humanem IgG4 zeigte eine CD4/CD8-Relation von 1,83 mit einer Standardabweichung von 0,7. Dies bedeutet, dass in der Isotypkontrolle im Mittel 1,83-fach so viele CD4+ T-Lymphozyten vorliegen wie CD8+ T-Effektorzellen. Die Isotypkontrolle dient als Vergleichswert der anderen Inkubationsansätze. 31 Ergebnisse Die Stimulation mit TGN1412 führte zu einer CD4/CD8-Relation von 2,13 (SD 0,86). Dies bedeutet, dass der superagonistische α-CD28-Ak im Vergleich zur Isotypkontrolle zu einer vermehrten Proliferation der CD4+ T-Lymphozyten führt. Im Vergleich dazu zeigte sich im kostimulatorischen Ansatz eine Relation von 1,44 (SD 0,84). Unter Stimulation mit α-CD3 und α-CD28 überwiegen somit zwar die CD4+ TZellen gegenüber den CD8+ Effektorzellen, diese Relation ist jedoch verglichen mit der Isotypkontrolle deutlich in Richtung CD8+ verschoben. Das heißt, die Kostimulierung führt zu einer verstärkten CD8+ T-Zell-Proliferation. Im Ansatz mit einem konventionellen α-CD28 wurde eine CD4/CD8-Relation von 1,97 (SD 0,66) gemessen. Die Inkubation mit diesem Antikörper scheint also eher zu einer Induktion von CD4+ T-Lymphozyten gegenüber der Isotypkontrolle zu führen. Verglichen mit dem TGN1412 ist die Wirkung des konventionellen α-CD28 hinsichtlich der Proliferation von CD4+ T-Helferzellen deutlich geringer. 3.2 TGN1412 vermittelt eine TH1-Antwort Um die Wirkung von TGN1412 auf die CD4+ T-Lymphozyten weiter zu differenzieren, wurden ELISA’s der Serumüberstände von 13 Inkubationsansätzen durchgeführt. Untersucht wurden die Überstände auf Interferon- γ (IFN-γ) und Interleukin-10 (IL-10). Die Abbildungen 9 und 10 zeigen, dass in der Isotypkontrolle eine Kombination aus geringem IFN-γ und erhöhtem IL-10 Spiegel nachzuweisen war. Die Seren der 13 Blutspender weisen ohne spezifische T-Zellstimulation daher ein TH2 dominiertes Zytokinmilieu vor. Im kostimulatorischen Ansatz (α-CD3 und α-CD28) wurde der höchste IFN-γ Spiegel gemessen. Folglich wird hier eine im Vergleich zur Negativkontrolle TH1-vermittelte Immunantwort induziert. Dies wird zudem durch die deutlich geringere IL-10 Sekretion als im Isotyp untermauert. Nach spezifischer T-Zellstimulation mit TGN1412 wurde ebenfalls ein durch TH1Lymphozyten geprägtes Zytokinmilieu gemessen. Eine verminderte Nachweisbarkeit von IL-10 und erhöhte Serumspiegel an IFN-γ gegenüber dem Isotypansatz machen dies deutlich. Somit verschiebt auch der superagonistische α-CD28-Ak die Immunantwort Richtung TH1, jedoch nicht so effektiv wie die Kostimulation. Anzumerken ist zudem, dass die hohen Standardabweichungen in beiden ELISAMessungen durch die individuell stark divergierenden Zytokinspiegel bedingt sind. 32 Ergebnisse IFN-y [pg/m l] 100 80 60 40 20 0 Isotyp Abbildung 9: TGN1412 CD3/CD28 Konzentrationen [pg/ml] des IFN-γ im Serumüberstand nach CD3/CD28-Stimulation, TGN1412-Inkubation und Isotypkontrolle. Dargestellt ist der Mittelwert mit Standardabweichung aus 13 Messungen. IL-10 [pg/m l] 300 250 200 150 100 50 0 Isotyp Abbildung 10: TGN1412 CD3/CD28 Konzentrationen [pg/ml] des IL-10 im Serumüberstand nach CD3/CD28-Stimulation, TGN1412-Inkubation und Isotypkontrolle. Dargestellt ist der Mittelwert mit Standardabweichung aus 13 Messungen. 3.3 T-Zellaktivierung durch TGN1412 3.3.1 Expression von CD25 auf CD4+ T-Zellen Um die durch TGN1412 vermehrt gebildeten CD4+ T-Lymphozyten hinsichtlich ihres Aktivierungsstatus zu analysieren, wurden diese Zellen auf das Oberflächenantigen CD25 untersucht. In Abbildung 11 ist der prozentuale Anteil CD25+-exprimierender CD4+ T-Lymphozyten dargestellt. Die Grafik gibt die Mittelwerte aus 23 PBMCMessungen wieder. 33 Ergebnisse Die Inkubation mit α-CD3/α-CD28 ist der effektivste Ansatz zur Induktion der alphaKette des IL-2-Rezeptors auf CD4+ T-Lymphozyten. Im Mittel exprimieren 75,3% (SD 26,9%) der CD4+ T-Lymphozyten nach Kostimulation das Oberflächenantigen CD25. TGN1412 hat ebenfalls aktivierende Eigenschaften. 36,8% (SD 17,8%) der CD4+ TLymphozyten sind zusätzlich noch CD25+, nachdem sie mit dem superagonistischen Antikörper behandelt wurden. Und wie erwartet führen die Isotypkontrolle und der konventionelle α-CD28-Ak zu keiner nennenswerten Bildung von CD4+CD25+ TLymphozyten. Nur 11,4% (SD 5,9%) der mit humanem IgG4 inkubierten CD4+ TLymphozyten zeigen CD25 an der Zelloberfläche. Der konventionelle Antikörper zeigt mit 11,8% (SD 7,5%) CD25+-exprimierender CD4+ T-Zellen keinen Unterschied zur Negativkontrolle und besitzt somit kein Aktivierungspotential. Die Ergebnisse des TGN1412 reichen insgesamt nicht an die der Kostimulation, aber der Superagonist führt zu einer deutlichen Induktion von CD4+CD25+ T-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle und dem konventionellen α-CD28. Die Standardabweichungen in Abb. 11 zeigen, dass die CD25+-Expression zwischen den einzelnen Probanden grossen Schwankungen unterlegen ist. Somit reagieren die Lymphozyten der verschiedenen Blutspender unterschiedlich stark auf die Inkubation mit TGN1412. % CD4+ T-Lymphozyten mit CD25 CD25+ exprim ierende CD4+ T-Zellen 120 100 80 60 40 20 0 Abbildung 11: CD3/CD28 TGN1412 Isotyp CD28 Bildung von CD4+CD25+ T-Lymphozyten nach CD3/CD28 Stimulation, TGN1412- Inkubation, Isotypkontrolle und Behandlung mit konventionellem α-CD28. Dargestellt ist der Mittelwert mit Standardabweichung aus 23 PBMC-Messungen gesunder Probanden. 34 Ergebnisse 3.3.2 Bildung von CD4+CD25high+ T-Lymphozyten CD4+ T-Lymphozyten, die das Oberflächenantigen CD25 in besonders hohem Masse exprimieren, werden als CD4+CD25high+ T-Lymphozyten bezeichnet. Mithilfe der Durchflusszytometrie konnten diese Zellen erfasst werden. Abbildung 12 veranschaulicht den Anteil CD25high+-exprimierender CD4+ T-Zellen in allen vier Inkubationsansätzen. Es ist deutlich, dass die Isotypkontrolle mit durchschnittlich 1,6% (SD 1,2%) pro Messung keine erwähnenswerte CD25high+Bildung auf CD4+ Lymphozyten induziert. Ähnliche Ergebnisse liefert der Ansatz mit konventionellem CD28-Ak. Mit 1,7% (SD 1,6%) CD4+CD25high+ T-Lymphozyten führt auch dieser Ansatz zu keiner T-Zellaktivierung. Nach Kostimulation besitzen hingegen 45,5% (SD 31%) der CD4+ T-Lymphozyten diesen hohen Anteil an CD25. TGN1412 induziert durchschnittlich 14,6% (SD 12,3%) CD25high+-exprimierende CD4+ T-Zellen. Die erheblichen Standardabweichungen deuten analog zur CD25+-Expression an, dass in der Bildung von CD4+CD25high+ T-Lymphozyten nach TGN1412 bzw. α-CD3/α-CD28Stimulation eine grosse Streubreite zwischen den einzelnen Spendern besteht. Die CD4+ Lymphozyten der Probanden reagieren offensichtlich mit einer unterschiedlich starken CD25high+-Expression auf die Stimulation mit TGN1412 und α-CD3/α-CD28. Trotz der grossen Schwankungen in der CD25high+-Expression auf CD4+ TLymphozyten zeigt sich ein klares Bild. Die Stimulation von T-Lymphozyten mit TGN1412 erreicht zwar nicht die Effektivität der Kostimulation mit α-CD3 und α-CD28, führt aber zu einer deutlicheren Bildung von CD4+CD25high+ T-Zellen als in der Negativkontrolle und im Ansatz mit konventionellem α-CD28. Insgesamt bewirkt TGN1412 eine verstärkte Expression des CD25+-Moleküls auf CD4+ T-Zellen. Da die alpha-Kette des IL-2 Rezeptors auf aktivierten T-Zellen temporär und auf natürlich regulatorischen T-Zellen konstitutiv exprimiert wird, kann basierend auf diesen Ergebnissen noch keine definitive Aussage darüber getroffen werden, welche der beiden Zellpopulationen durch TGN1412 induziert wird. Die Differenzierung zwischen unspezifischer T-Zellaktivierung und Induktion regulatorischer T-Zellen durch den superagonistischen CD28-Ak wurde deshalb anhand weiterer Zellmarker untersucht. 35 Ergebnisse % CD4+ T-Lymphozyten mit CD25high CD25high+ exprim ierende CD4+ T-Zellen 80 70 60 50 40 30 20 10 0 TGN1412 CD3/CD28 Abbildung 12: + high+ Bildung von CD4 CD25 Isotyp CD28 Lymphozyten nach CD3/CD28 Stimulation, TGN1412- Inkubation, Isotypkontrolle und konventioneller α-CD28-Behandlung. Dargestellt ist der Mittelwert mit Standardabweichung aus 23 PBMC-Messungen gesunder Probanden. 3.3.3 Die T-Zellaktivierungsmarker CD71 und CD30 Der humane Transferrinrezeptor CD71 und CD30 werden im Rahmen der Aktivierung auf T-Zellen verstärkt exprimiert. Da CD25 nachweislich auf CD4+ T-Zellen nach Behandlung mit TGN1412 verstärkt gemessen wird, soll anhand der Bildung von CD71 und CD30 die effektive T-Zellstimulation durch den superagonistischen CD28Antikörper verifiziert werden. 14,9% (SD 6,9%) der CD4+ T-Zellen exprimieren nach Stimulation mit TGN1412 CD25 und CD71 an ihrer Zelloberfläche. Nach Stimulation mit α-CD3/α-CD28 können auf 34% (SD 26,6%) der CD4+ T-Lymphozyten beide Marker gemessen werden. Hingegen ist CD71 nach Inkubation mit IgG4 oder konventionellem α-CD28 nicht nachweisbar. Dieses Aktivierungsmuster zeigt sich auch in der CD30-Expression. Infolge TGN1412Wirkung bilden 9,6% (SD 8,53%) der CD4+ T-Zellen CD25 und CD30. Damit ist der superagonistische α-CD28 zwar nicht so effektiv wie die Kostimulation (25%, SD 17,1%), aber bewirkt im Vergleich zum Isotyp (0,43%, SD 0,3%) und konventionellen CD28-Ak (0,5%, SD 0,5%) eine deutliche T-Zellaktivierung. Weiterhin zeigt sich, dass die Bildung von CD30 und CD71 auf CD4+CD25+ T-Zellen beschränkt ist. In jedem Inkubationsansatz war bei weniger als 1% der CD4+CD25-TZellen CD71 und C30 messbar. Dies macht deutlich, dass die Proliferationsmarker CD30 und CD71 ausschliesslich auf aktivierten CD4+CD25+ T-Lymphozyten zu finden sind. 36 Ergebnisse Die durch TGN1412 induzierte Expression der Proliferationsmarker CD25, CD71 und CD30 bei CD4+ T-Lymphozyten zeigt die superagonistischen Eigenschaften des Antikörpers. Eine Stimulierung mit konventionellem α-CD28 beeinflusst die TZellaktivität nicht. Hinsichtlich der Stimulierungseffizienz ist der superagonistische Antikörper der Kostimulation mit α-CD3/α-CD28 unterlegen. 3.4 TGN1412 induziert Treg 3.4.1 Foxp3 Foxp3 („forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3“) gilt als der zurzeit spezifischste Marker natürlich regulatorischer T-Zellen. Aufgrund dessen wurde die Induktion des Transkriptionsfaktors auf der CD4+ T-Zellsubpopulation durch TGN1412 im Vergleich zu den anderen Inkubationsansätzen untersucht. Mit einem Mittelwert von 19,8% (SD 13,9%) führt der kostimulatorische Ansatz in unseren 23 Messungen zur ausgeprägtesten Bildung von CD4+ T-Zellen, die für CD25 und Foxp3 positiv sind (Abb.13). Nach Inkubation mit TGN1412 wurden anteilig an den CD4+ T-Zellen 11,4% (SD 10,4%) gemessen. Der Versuchsansatz mit IgG4 stellt als Negativkontrolle die physiologischen, ohne Stimulierung vorkommenden Zellpopulationen der Probanden und somit einen Referenzwert dar. In ihm wurden 1,8% (SD 1,8%) CD25+Foxp3+-exprimierender CD4+ T-Zellen nachgewiesen. Somit erreicht TGN1412 zwar nicht die Induktionsstärke des kostimulatorischen Ansatzes, aber führt gegenüber der „Baseline“ des Isotyp-Ansatzes zu einer deutlichen Expansion von Foxp3+-bildenden natürlich regulatorischen T-Zellen. Zudem ist auffallend, dass im Versuchsansatz mit konventionellem α-CD28 lediglich 0,4% (SD 0,4%) CD25+Foxp3+-exprimierender CD4+ T-Zellen gemessen wurden. Im Vergleich mit der Negativkontrolle mit IgG4 führt der konventionelle CD28-Ak somit zu einer Reduktion CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen. Die hohen Standardabweichungen zeigen, dass grosse individuelle Unterschiede in der Expression von Foxp3 bestehen. Exemplarisch verdeutlicht Abbildung 14 an drei Messungen, dass die Bildung von CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen durch den kostimulatorischen Ansatz und TGN1412 zwischen den Messungen stark variiert. Während in Messung 7 beide Ansätze mit 39% bzw. 37% CD25+Foxp3+exprimierender CD4+ T-Zellen eine effektive Induktion erzielen, zeigt Messung 9 niedrigere Expressionszahlen und Messung 15 mit 11% bzw. 3% die geringste Stimulationsantwort. Dies macht deutlich, dass die Bildung dieser T-Zellsubpopulation 37 Ergebnisse von Spender zu Spender unterschiedlich effektiv ist und somit die Wirkung von TGN1412 eine Spannbreite von hocheffektiv bis gering aufweist. % CD4+T-Lymphozyten mit CD25 und Foxp3 CD25+Foxp3+ exprim ierende CD4+ T-Zellen 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Abbildung 13: CD3/CD28 TGN1412 + CD28 Isotyp + + Bildung von CD25 Foxp3 -exprimierenden CD4 T-Zellen nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation (α-CD3/α-CD28), Isotypkontrolle und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD4+ T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25 und Foxp3 exprimieren. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. % CD4+ T-Lymphozyten mit CD25 und Foxp3 Individuelle Foxp3-Expression 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 CD3/CD28 TGN1412 7 9 15 Messung Abbildung 14: Bildung von + + + CD4 CD25 Foxp3 T-Zellen nach TGN1412-Stimulation und + Kostimulation (α-CD3/α-CD28) in drei Messungen. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD4 TLymphozyten, die gleichzeitig CD25 und Foxp3 bilden. Zusammenfassend induziert TGN1412 den Phänotyp von Tregs. Um zu prüfen, ob der Superagonist ausschliesslich regulatorische T-Zellen expandiert oder eher die Tendenz 38 Ergebnisse zur globalen T-Zellstimulation besitzt, wurde selektiv die CD4+CD25+ T- Zellsubpopulation analysiert (Abbildung 15). Nach Inkubation mit dem superagonistischen α-CD28 bildeten 19,2% (SD 14,3%) der CD4+CD25+ und sogar 23,6% (SD 16,1%) der CD4+CD25high+ T-Zellen zusätzlich Foxp3. Im kostimulatorischen Ansatz zeigt sich ein ähnliches Bild. 17,4% (SD 11,4%) der CD4+CD25+ und 21,4% (SD 11,3%) der CD4+CD25high+ T-Zellen sind Foxp3+. Offensichtlich besitzen die CD4+CD25high+ T-Lymphozyten die höchste Konzentration an Foxp3 innerhalb aller CD4+CD25+ T-Zellen und stellen daher wahrscheinlich den grössten Anteil an Tregs im CD4+ T-Zellkompartiment. Darüberhinaus erfolgt unter Wirkung des superagonisischen CD28-Antikörpers keine ausschliessliche Treg-Induktion. Nach TGN1412-Inkubation zeigen 80,8% der CD4+CD25+ und 76,4% der CD4+CD25high+ T-Zellen keine Foxp3+-Expression. Da Foxp3 das zurzeit spezifischste Kennzeichen von Tregs ist, bedeutet dies, dass die überwiegende Mehrheit der unter TGN1412 proliferierten CD4+CD25+ T-Zellen konventionelle, nicht regulatorische T-Zellen darstellen. Ebenso wirkt der kostimulatorische Ansatz vornehmlich proliferierend auf konventionelle T-Zellen, da nur 17,4% bzw. 21,4% seiner CD4+CD25+/CD25high+ T-Zellen den Transkriptionsfaktor bilden. % CD4+CD25+/CD25high+ TLymphozyten mit Foxp3 Expression von Foxp3 in CD4+CD25+ T-Lym phozyten 50 40 CD3/CD28 30 20 TGN1412 10 0 CD4+CD25+ Abbildung 15: CD4+CD25high+ + CD4+CD25+ Prozentualer Anteil an CD4 CD25 exprimieren. Dargestellt ist die Foxp3-Bildung unter + CD4+CD25high+ + bzw. CD4 CD25 high+ T-Zellen, die Foxp3 Kostimulation und TGN1412-Inkubation. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. 39 Ergebnisse 3.4.2 GITR GITR, ein Marker natürlich regulatorischer T-Zellen, zeigt eine analoge Expression zum Foxp3 in CD25+-exprimierenden CD4+ T-Lymphozyten. Nach Stimulation der Spender-PBMC mit TGN1412 wurden im Mittel 25,5% (SD 24,7%) CD25+GITR+-exprimierende CD4+ T-Lymphozyten nachgewiesen (Abb. 16). Im kostimulatorischen Ansatz sind dies 37,9% (SD 30,8%). Obwohl TGN1412 die GITR+Expression der Stimulation mit α-CD3/α-CD28 nicht erreicht, zeigt der Superagonist einen deutlichen Effekt im Vergleich zur Negativkontrolle (5%, SD 3,8%). Der konventionelle CD28-Ak (3,5%, SD 2,1%) bewirkt, ähnlich zu den Ergebnissen des Foxp3, eine Reduktion der CD4+CD25+GITR+ T-Zellfraktion. % CD4+ Lymphozyten mit CD25 und GITR CD25+GITR+ exprim ierende CD4+ T-Lym phozyten 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Abbildung 16: CD3/CD28 TGN1412 + + Isotyp CD28 + Bildung von CD4 CD25 GITR T-Zellen nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation (α- CD3/α-CD28), Isotypkontrolle und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD4+ T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25 und GITR exprimieren. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. Darüberhinaus wird GITR in CD25+Foxp3+-exprimierenden CD4+ T-Zellen im Versuchsansatz mit dem superagonistischen TGN1412 vermehrt gebildet. In Abbildung 17 ist illustriert, dass nach TGN1412-Inkubation 7,7% (SD 4,4%) der CD4+ T- Lymphozyten zusätzlich CD25, Foxp3 und GITR exprimieren. Der kostimulatorische Ansatz induziert anteilig an den CD4+ T-Zellen 12,9% (SD 10,2%). Der Referenzwert des Isotyp liegt hier bei 0,8% (SD 0,7%) und im konventionellen CD28-Ansatz werden 0,5% (SD 0,4%) CD25+Foxp3+GITR+-exprimierender CD4+ T-Zellen gemessen. 40 Ergebnisse % CD4+ Lymphozyten mit CD25, Foxp3 und GITR CD25+Foxp3+GITR+ exprim ierende CD4+ T-Lym phozyten 25 20 15 10 5 0 Abbildung 17: CD3/CD28 Bildung von TGN1412 CD4+CD25+Foxp3+GITR+ Isotyp CD28 T-Zellen nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation, Isotypinkubation und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der + + + + prozentuale Anteil an CD4 T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25 Foxp3 GITR sind. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. Auch bei diesen Analysen manifestieren sich ausgeprägte Unterschiede in der Expression von GITR zwischen den Spendern. Insgesamt stimuliert TGN1412 aber die Expansion von CD25+GITR+- und CD25+Foxp3+GITR+-exprimierenden CD4+ TLymphozyten, also von Zellen mit phänotypischen Merkmalen regulatorischer T-Zellen. Im Folgenden soll analog zur Untersuchung des Foxp3 die Konzentration von GITR selektiv auf der CD4+CD25+ T-Zellsubpopulation analysiert werden. Diese Zellen stellen die aktivierten T-Lymphozyten dar. Es soll untersucht werden, ob TGN1412 im Vergleich zur Kostimulation innerhalb der aktivierten T-Zellen spezifischer eine Induktion von regulatorischen oder konventionellen T-Zellen bewirkt. Abbildung 18 zeigt die GITR+-Expression in CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25high+ T-Zellen nach Kostimulation und Inkubation mit TGN1412. In beiden Ansätzen zeigen über 50% der aktivierten T-Zellen keine Bildung des Treg-Markers GITR und sind somit keine regulatorischen T-Zellen. Diese Beobachtung ist ein weiterer Beweis dafür, dass die Kostimulation und TGN1412 keine selektiven Treg-Induktoren sondern eher unspezifische T-Zellaktivatoren darstellen. Als weitere Erkenntnis aus Abbildung 18 ist GITR in beiden Versuchsansätzen in höherer Konzentration in der gesamten CD4+CD25+ Population zu finden als in CD4+CD25high+ T-Zellen. Gegensätzlich zur Beobachtung beim Foxp3 ist dies kein Hinweis dafür dass die CD25high+ Fraktion den grösseren Anteil an Tregs stellt. 41 Ergebnisse % CD4+CD25+/CD25high+ TLymphozyten mit GITR Bildung von GITR in CD4+CD25+ T-Lym phozyten 100 80 CD3/CD28 60 40 TGN1412 20 0 CD4+CD25+ Abbildung 18: CD4+CD25high+ + CD4+CD25+ + Prozentualer Anteil an CD4 CD25 exprimieren. Dargestellt ist die GITR-Bildung unter CD4+CD25high+ + high+ bzw. CD4 CD25 T-Zellen, die GITR Kostimulation und TGN1412-Inkubation. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. 3.4.3 CTLA-4 (CD152) Um zu untersuchen, ob der superagonistische α-CD28 TGN1412 eine Expression des T-Zellregulators CTLA-4 bewirkt, wurde der intrazelluläre Anteil von CTLA-4 in CD4+ TLymphozyten bestimmmt (Abb. 19). Unter kostimulatorischem Ansatz wurden im Mittel pro Messung 51,2% (SD 23,8%) CD25+CTLA-4+-exprimierende CD4+ T-Lymphozyten nachgewiesen, im TGN1412Ansatz 35,1% (SD 30,1%), im Isotypvergleich 3,5% (SD 2,3%) und nach Inkubation mit konv. CD28-Ak 4,4% (SD 2,6%). Somit wird die beste Induktion von CD4+CD25+CTLA4+ T-Zellen durch die Kostimulation mit α-CD3 und α-CD28 erreicht. Dennoch ist die Wirkung von TGN1412 auf die Proliferation dieses Zellphänotyps im Vergleich zur Isotypkontrolle und zum konventionellen Ansatz erheblich. Wie zu erwarten war, stellt sich die Expansion von CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ TZellen ähnlich dar. In Abbildung 20 ist ersichtlich, dass nach Kostimulation 16,9% (SD 11,4%) der CD4+ T-Zellen zusätzlich CD25+Foxp3+CTLA-4+ sind, im TGN1412 sind es 14,2% (SD 13,3%), im Isotyp 1,2% (SD 0,9%) und im konv. CD28-Ansatz 0,4% (SD 0,2%). Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Foxp3 und CTLA-4 charakteristische Merkmale natürlich regulatorischer T-Zellen sind, legen die obigen Ergebnisse nahe, dass die Kostimulation und TGN1412 im Vergleich zur Negativkontrolle wirkungsvolle Stimulatoren für Tregs darstellen. Hingegen werden durch den konventionellen CD28- 42 Ergebnisse Ak Treg nicht expandiert, sondern reduziert. Anzumerken ist wiederum, dass die Stimulationsstärke von Spender zu Spender extrem variiert, was sich in den hohen Standardabweichungen widerspiegelt. % CD4+ Lymphozyten mit CD25 und CTLA4 CD25+CTLA4+ exprim ierende CD4+ T-Lym phozyten 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Abbildung 19: CD3/CD28 TGN1412 Isotyp CD28 Bildung von CD4+CD25+CTLA-4+ T-Zellen nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation (α-CD3/α-CD28), Isotypkontrolle und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD4 + T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25 und CTLA-4 exprimieren. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. % CD4+ Lymphozyten mit CD25, Foxp3 und CTLA-4 CD25+Foxp3+CTLA-4+ exprim ierende CD4+ T-Lym phozyten 30 25 20 15 10 5 0 Abbildung 20: CD3/CD28 Bildung von TGN1412 CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ Isotyp CD28 T-Zellen nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation, Isotypinkubation und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der + + + + prozentuale Anteil an CD4 T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25 Foxp3 CTLA sind. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. Bei selektiver Untersuchung der CD4+CD25+ T-Zellpopulation (Abb. 21) ist zum einen ersichtlich, dass CTLA-4 im kostimulatorischen und superagonistischen Versuchsansatz intrazellulär von der Mehrheit der CD4+CD25+ T-Zellen gebildet wird. 43 Ergebnisse 63% (SD 26,3%) der CD4+CD25+ und 79,5% (SD 25,5%) CD4+CD25high+ der TLymphozyten exprimieren CTLA-4 nach Stimulation mit TGN1412. Im kostimulatorischen Ansatz wurden 61,8% (SD 22,6%) CTLA-4+-exprimierende CD4+CD25+ und 71,8% (SD 21,6%) CTLA-4+-exprimierende CD4+CD25high+ T-Zellen gemessen. Diese Ergebnisse zeigen zudem, dass analog zum Foxp3 auch CTLA-4 in höherer Konzentration auf den CD4+CD25high+ als auf den CD4+CD25+ T-Zellen zu finden. % CD4+CD25+/CD25high+ TLymphozyten mit CTLA-4 Bildung von CTLA-4 in CD4+CD25+ T-Lym phozyten 120 100 80 CD3/CD28 60 TGN1412 40 20 0 Abbildung 21: CD4+CD25+ CD4+CD25high+ CD4+CD25+ CD4+CD25high+ Prozentualer Anteil an CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25high+ T-Zellen, die CTLA-4 exprimieren. Dargestellt ist die CTLA-4-Bildung unter Kostimulation und TGN1412-Inkubation. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. 3.4.4 Ox40 Ox40 (CD134) (CD134) zählt nach heutigem Wissensstand ebenfalls zu den Oberflächenmolekülen, die regulatorische T-Zellen charakterisieren. CD134 wird auf CD4+CD25+ T-Zellen in ähnlicher Weise stimuliert wie die vorherigen Marker regulatorischer T-Zellen (Abb. 22). 28% (SD 22,3%) der CD4+ T-Zellen waren, nachdem sie mit dem kostimulatorischen Ansatz behandelt wurden, CD25+Ox40+. TGN1412 induzierte 10% (SD 8,7%) dieser Zellen. Im Isotyp waren 0,6% (SD 0,5%) und im konventionellen CD28-Ansatz 0,4% (SD 0,3%) nachweisbar. Diese Expansionshierarchie zeigt sich auch für CD25+Foxp3+Ox40+-exprimierende CD4+ T-Zellen (Abb. 23). Im kostimulatorischen Versuchsansatz waren 11,6% (SD 11%) CD25+Foxp3+Ox40+-exprimierende CD4+ T-Zellen messbar. Im TGN1412-Ansatz wurden 3,6% (SD 2,9%) der CD4+ T-Zellen mit diesen „regulatorischen Markern“ 44 Ergebnisse nachgewiesen, im Isotyp 0,2% (SD 0,1%) und im konventionellen CD28-Ansatz 0,1% (SD 0,1%). % CD4+ Lymphozyten mit CD25 und Ox40 CD25+Ox40+ exprim ierende CD4+ T-Lym phozyten 60 50 40 30 20 10 0 Abbildung 22: CD3/CD28 TGN1412 + + CD28 Isotyp + Bildung von CD4 CD25 Ox40 T-Zellen nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation (α- CD3/α-CD28), Isotypkontrolle und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD4+ T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25 und Ox40 exprimieren. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. % CD4+ Lymphozyten mit CD25, Foxp3 und Ox40 CD25+Foxp3+Ox40+ exprim ierende CD4+ T-Lym phozyten 25 20 15 10 5 0 Abbildung 23: CD3/CD28 Bildung von TGN1412 + + Isotyp + + CD4 CD25 Foxp3 Ox40 T-Zellen CD28 nach TGN1412-Stimulation, Kostimulation, Isotypinkubation und Inkubation mit konventionellem CD28-Ak. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD4+ T-Lymphozyten, die gleichzeitig CD25+Foxp3+Ox40+ sind. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. Zusammenfassend ist die Kostimulation der stärkste Induktor CD4+CD25+Ox40+ bzw. CD4+CD25+Foxp3+Ox40+ T-Zellen. Der superagonistische CD28-Ak führt, obwohl er 45 Ergebnisse die Expressionswerte der Kostimulation nicht erreicht, gegenüber dem Referenzwert im Isotyp und dem konventionellen CD28-Ak zu einer deutlichen Proliferation dieser regulatorischen T-Zellen. Wie zu erwarten, liegt auch bei der Expression von Ox40 eine grosse individuelle Variationsbreite vor, was die hohen Standardabweichungen des TGN1412 und der Kostimulation verdeutlichen. Abbildung 24 veranschaulicht die prozentuale Ox40-Oberflächenexpression auf CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25high+ T-Zellen nach kostimulatorischem und superagonistischem Versuchsansatz. Auch für den Treg-Marker Ox40 ist eine höhere Konzentration auf CD4+CD25high+ T-Zellen in beiden Ansätzen sichtbar. So existieren nach Kostimulation 23,4% (SD 23,3%) CD4+CD25+ T-Zellen, die Ox40 exprimieren, und 27,2% (SD 25,3%) CD4+CD25high+ T-Zellen mit Ox40 an der Zelloberfläche. Nach Behandlung mit TGN1412 zeigen 9,6% (SD 7%) der CD4+CD25+ Ox40-Expression und 12,2% (SD 9%) der CD4+CD25high+ Zellfraktion. Zudem sind der Großteil der unter TGN1412 und Kostimulation aktivierten CD4+CD25+ T-Zellen negativ für Ox40 (Kostimulation: 76,6%, TGN1412: 90,4%). Wenn Ox40 als weiterer Marker von Treg angesehen wird, sind demnach beide Ansätze keine selektiven Induktoren von Treg als vielmehr unspezifische T-Zellaktivatoren. % CD4+CD25+/CD25high+ TLymphozyten mit Ox40 Bildung von Ox40 auf CD4+CD25+ T-Lym phozyten 60 50 CD3/CD28 40 30 TGN1412 20 10 0 Abbildung 24: CD4+CD25+ CD4+CD25high+ CD4+CD25+ CD4+CD25high+ Prozentualer Anteil an CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25high+ T-Zellen, die Ox40 exprimieren. Dargestellt ist die Ox40-Bildung unter Kostimulation und TGN1412-Inkubation. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus 23 Messungen ermittelt. 46 Ergebnisse 3.4.5 Neuropilin-1 (Nrp1) Als weiterer Oberflächenmarker von Tregs ist Neuropilin-1 (Nrp1) anzusehen. Die Expression von Nrp1 ist nach Studienlage vermehrt auf natürlich regulatorischen TZellen zu sehen. Aus diesem Grund wurden CD4+ T-Zellen auf Nrp1-Bildung infolge Stimulation mit TGN1412 exemplarisch in einer Messung untersucht. In den dieser Arbeit zugrundeliegenden Messungen zeigt Nrp1 eine verstärkte Oberflächenexpression auf CD4+CD25+ T-Zellen nach TGN1412-Stimulation. 14,5% der CD4+ T-Zellen exprimieren nach Behandlung mit dem superagonistischen CD28Ak zusätzlich CD25 und Nrp1. Nur 1,0% der CD4+ T-Zellen sind im Isotyp CD25+Nrp1+. Einzig die optimale T-Zellstimulation mit α-CD3/α-CD-28 induziert noch deutlicher das Nrp1-Molekül an der Zellloberfläche. 30,1% CD25+Nrp1+-exprimierender CD4+ T-Zellen wurden in diesem Ansatz gemessen. Eine Analyse der natürlich regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+) zeigt, dass ein geringer Prozentsatz dieser Zellpopulation nach Stimulierung durch TGN1412 (2,5%) und α-CD3/α-CD28 (8,1%) auch Nrp1 exprimierten. Im Versuchsansatz mit IgG4 wiesen nur 0,3% der CD4+ T-Zellen dieses Expressionsmuster auf. Zusammenfassend führt die Behandlung von CD4+ T-Lymphozyten mit dem superagonistischen CD28-Antikörper zu einer Proliferation der CD4+CD25+Nrp1+ und der CD4+CD25+Foxp3+Nrp1+ T-Lymphozyten. 3.4.6 Tabellarische Zusammenfassung Proz. Expression auf CD4+CD25+ T-Zellen Kos TGN1412 17,4 (11,4) 19,2 (14,3) 21,4 (11,3) 23,6 (16,1) 42,2 (30,3) 46,6 (30,2) T-Zellen mit GITR 40,2 (26,3) 42,1 (26,9) % CD4 CD25 T-Zellen mit CTLA-4 61,8 (22,6) 63,0 (26,3) 71,8 (21,6) 79,5 (25,5) 23,4 (23,3) 9,6 (7,0) 27,2 (25,4) 12,2 (8,9) + + + high+ + + + high+ + + + high+ + + + high+ % CD4 CD25 T-Zellen mit Foxp3 % CD4 CD25 T-Zellen mit Foxp3 % CD4 CD25 T-Zellen mit GITR % CD4 CD25 % CD4 CD25 T-Zellen mit CTLA-4 % CD4 CD25 T-Zellen mit Ox40 % CD4 CD25 T-Zellen mit Ox40 + + Tabelle 5: Analyse CD4 CD25 T-Lymphozyten auf extra- und intrazelluläre Treg-Marker. Angegeben + + sind die Mittelwerte der prozentualen Expression auf CD4 CD25 T-Zellen aus 23 Messungen nach Kostimulation (α-CD3/α-CD28) und TGN1412-Inkubation. Die zugehörigen Standardabweichungen stehen jeweils anschliessend in Klammern. 47 Ergebnisse Proz. Expression auf CD4+ T-Zellen Kos TGN1412 Isotyp CD28 75,3 (26,9) 45,5 (31) 34 (26,6) 25 (17,1) 19,8 (13,9) 37,9 (30,8) 12,9 (10,2) 51,2 (23,8) 16,9 (11,4) 28 (22,3) 11,6 (11) 36,8 (17,8) 14,6 (12,3) 14,9 (6,9) 9,6 (8,5) 11,4 (10,3) 25,5 (24,7) 7,6 (4,4) 35 (30,1) 14,2 (13,3) 10 (8,7) 3,6 (2,9) 11,4 (5,9) 1,6 (1,1) 0,5 (0,4) 0,4 (0,3) 1,8 (1,8) 5 (3,8) 0,8 (0,7) 3,4 (2,3) 1,2 (0,9) 0,6 (0,5) 0,2 (0,1) 11,9 (7,6) 1,7 (1,5) 1,1 (0,5) 0,5 (0,5) 0,4 (0,4) 3,5 (2,1) 0,5 (0,4) 4,4 (2,6) 0,4 (0,2) 0,4 (0,3) 0,9 (0,1) % CD4+ T-Zellen mit CD25 und Nrp1 30,2 14,5 1,1 % CD4+ T-Zellen mit CD25, Foxp3 und Nrp1 8,1 2,5 0,3 % CD4+ T-Zellen mit CD25 % CD4+ T-Zellen mit CD25high % CD4+ T-Zellen mit CD25 und CD71 % CD4+ T-Zellen mit CD25 und CD30 % CD4+ T-Zellen mit CD25 und Foxp3 % CD4+ T-Zellen mit CD25 und GITR % CD4+ T-Zellen mit CD25, Foxp3 und GITR % CD4+ T-Zellen mit CD25 und CTLA-4 % CD4+ T-Zellen mit CD25, Foxp3 und CTLA4 % CD4+ T-Zellen mit CD25 und Ox40 % CD4+ T-Zellen mit CD25, Foxp3 und Ox40 + Tabelle 6: Analyse CD4 T-Lymphozyten auf extra- und intrazelluläre Treg-Marker. Angegeben sind die Mittelwerte der prozentualen Expression auf CD4+ T-Zellen aus 23 Messungen nach Kostimulation (αCD3/α-CD28), TGN1412-Inkubation, Negativkontrolle (Isotyp IgG4) und Inkubation mit konventionellem αCD28-Ak. Die zugehörigen Standardabweichungen stehen jeweils anschliessend in Klammern. Nrp1 wurde exemplarisch in einer Messung mit drei Inkubationsansätzen untersucht. 48 Diskussion 4 Diskussion Die wesentlichen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind: • Der superagonistische α-CD28-Ak TGN1412 aktiviert konventionelle, vornehmlich CD4+ T-Lymphozyten ex vivo ohne zusätzliche TCR-Stimulation. • Die aktivierten T-Zellen zeigen eine TH1-Differenzierung. • TGN1412 induziert die Bildung des Phänotyps natürlich regulatorischer T-Zellen ex vivo. Die Kostimulation (α-CD3/α-CD28) stellt aber einen noch stärkeren Induktor zur Bildung von Treg dar. • TGN1412 ist kein selektiver Induktor von Tregs. • Die expandierten natürlich regulatorischen T-Zellen befinden sich wahrscheinlich im CD4+CD25high+ T-Zellkompartiment des humanen Organismus. • Die T-Zellaktivierung und -induktion durch TGN1412 ist grossen interindividuellen Schwankungen unterworfen. 4.1 T-Zellstimulation durch superagonistische α-CD28-Ak Die allgemein anerkannte Aktivierung naiver T-Zellen bestand lange Zeit im Modell der 2 Signale. Neben der Stimulation des TCR benötigt eine naive T-Zelle ein zusätzliches Signal eines kostimulatorischen Moleküls, um zu einer funktionstüchtigen TEffektorzelle zu reifen (59). Der wohl wichtigste Kostimulus wird hierbei dem CD28Molekül zugesprochen. Die alleinige Bindung von CD28 ohne zusätzliche Stimulation des T-Zellrezeptors führte nicht zur Aktivierung von T-Zellen. Erst durch die Entdeckung superagonistischer CD28-Antikörper wurde eine Methode entwickelt, gezielt T-Zellproliferation ohne ein TCR-Signal zu induzieren. Der superagonistische CD28-Ak TGN1412 zeigt in den Experimenten der vorliegenden Arbeit vergleichbare Ergebnisse zu bereits vorliegenden Forschungsarbeiten an superagonistischen Antikörpern gegen CD28. So konnte gezeigt werden, dass TGN1412 ein spezifischer Induktor CD4+ TLymphozyten ist. Die normale CD4/CD8-Ratio gesunder Erwachsener liegt bei 1-2 (35). Die Negativkontrolle mit IgG4 (1,83) liegt also im Referenzbereich des 49 Diskussion physiologischen Verhältnisses. Das nach Stimulation mit TGN1412 errechnete CD4/CD8-Verhältnis liegt bei 2,13. Dies zeigt, dass nach Behandlung mit TGN1412 im Vergleich zur Negativkontrolle (1,83) und mit konventionellem α-CD28 (1,97) mehr CD4+ als CD8+ T-Zellen proliferiert sind. Dieses Ergebnis ist übereinstimmend mit weiteren Studien, in denen ein superagonistischer α-CD28-Ak eine deutlichere Expansion der CD4+ gegenüber den CD8+ T-Zellen oder B-Lymphozyten erzielte (45, 120). Die Kostimulation mit α-CD3/α-CD28 zeigt mit einer Ratio von 1,44, dass hier vornehmlich eine CD8+ T-Zellproliferation induziert wird. Die unter TGN1412-Wirkung proliferierten Zellen zeigen eine Expression von CD25. Auf 36,8% der CD4+ T-Lymphozyten lässt sich die α-Kette des IL-2 Rezeptors nachweisen. Gegenüber der Negativkontrolle mit dem Isotyp IgG4 ist die CD25+Expression um den Faktor 3,2 erhöht. TGN1412 übertrifft ebenfalls deutlich die CD25+Induktion des konventionellen α-CD28 (Faktor 3,1). Die Gruppen um Tacke (120) und Siefken (111) beobachteten bereits im Tierexperiment, dass die superagonistischen CD28-Ak BW 828 bzw. JJ316 in und ex vivo die IL-2 Sekretion und CD25+-Expression auf T-Zellen ohne TCR-Signal induzieren können und letztlich zu T-Zellproliferation führen. Die Wirkung von konventionellen α-CD28 Antikörpern war dem Effekt der Superagonisten auch in ihren Experimenten unterlegen. TGN1412 führt zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten und weist damit superagonistische Eigenschaften im Vergleich zum konventionellen α-CD28 auf. Die kostimulatorische Behandlung (α-CD3 und α-CD28) naiver T-Zellen stellt dennoch den optimalen Aktivierungs- und Proliferationsstimulus dar. Sie induziert auf 75,32% der CD4+ T-Zellen CD25+-Expression und vermittelt somit ein etwa doppelt so starkes Aktivierungssignal (Faktor 2,1 gegenüber TGN1412). Die superagonistischen Eigenschaften von TGN1412 werden auch durch die verstärkte Expression der Aktivierungsmarker CD30 und CD71 auf CD25+-exprimierenden CD4+ T-Zellen untermauert, die nach Inkubation mit dem Isotyp und konventionellem α-CD28 nicht beobachtet werden konnte. Die Oberflächenexpression von CD30 und CD71 wurde am effektivsten durch den kostimulatorischen Ansatz induziert, was dessen dominante Rolle in der T-Zellaktivierung veranschaulicht. Obwohl TGN1412 das Aktivierungspotential der Kostimulation nicht erreicht, führt der Antikörper dennoch zu einer, im Vergleich zum konventionellen und Isotyp-Ansatz, effektiven Stimulation und Proliferation von CD4+ T-Lymphozyten. Mithilfe dieses artifiziellen Ansatzes können die zur T-Zellaktivierung erforderlichen 2 Signale 50 Diskussion umgangen werden. Der superagonistische Antikörper TGN1412 kann T-Lymphozyten durch alleinige CD28-Stimulation zur Proliferation anregen. Das im Zellüberstand gemessene Zytokinmilieu weist auf eine Differenzierung der unter TGN1412 proliferierten Zellen in TH1-Lymphozyten hin. Wie die Kostimulation führt der superagonistische α-CD28 zu einer verstärkten Bildung von IFN-γ und reziprok zu einer geringeren Sekretion von IL-10 gegenüber der Negativkontrolle (Abb. 9 und 10). Die Stimulationen mit α-CD3/α-CD28 und TGN1412 induzieren also innerhalb der CD4+ T-Zellen eine TH1 geprägte Immunantwort. Hierbei wird die effektivere TH1-Induktion durch den kostimulatorischen Ansatz erreicht. Unter Einbeziehung der o.g. CD4/CD8-Ratios + wirkt die Kostimulation eher + proliferierend auf CD8 T-Zellen und führt innerhalb der CD4 T-Zellen zu einer TH1Differenzierung. Der Superagonist wirkt spezifischer auf CD4+ T-Lymphozyten, welche ebenfalls als TH1-Zellen proliferieren. Nach den Beobachtungen anderer Forschungsgruppen induzieren superagonistische CD28-Ak jedoch eine TH2 getriggerte Immunantwort. In den Versuchen von Lin et al. wurde ein IL-10 bestimmtes Zytokinmilieu nach Behandlung CD4+ T-Lymphozyten mit superagonistischem α-CD28 gemessen (63) und weitere Gruppen wiesen einen supprimierten IFN-γ Spiegel durch CD28-Superagonisten nach (102, 128). RodriguezPalmero et al. machten 1999 die Entdeckung, dass eine CD28 getriggerte TZellstimulation eine TH2-Antwort nach sich zieht (96). Da es sich bei diesen Versuchen um in und ex vivo Tiermodelle handelt, die den immunologischen Rahmenbedingungen eines humanen ex vivo Versuchs nicht entsprechen, liegt hier eine mögliche Erklärung für die beobachtete TH2-Differenzierung im murinen Versuch. Zudem könnte sich der humanisierte TGN1412 in seinen superagonistischen Eigenschaften von seinen Vorgängern unterscheiden, was zu einer veränderten T-Helferzelldifferenzierung führt. Ausserdem liesse sich die differente TH-Entwicklung durch Unterschiede in Struktur, Funktion und Bindungseigenschaften zwischen dem humanen und murinen CD28Molekül erklären. 4.2 Treg-Expansion: TGN1412 im Rahmen bisheriger Forschung Neben ihrem starken Proliferationssignal für konventionelle T-Zellen haben superagonistische CD28-Ak die Fähigkeit, regulatorische T-Lymphozyten zu aktivieren und zu expandieren (63). Dabei wurde die Treg-Induktion in vitro und in vivo im 51 Diskussion Rattenmodell nachgewiesen (11, 63). Es konnte gezeigt werden, dass superagonistische CD28-Stimulation auf den proliferierten Treg eine hohe CTLA-4und Foxp3- Expression induzieren (11, 63). TGN1412 bewirkt in den Versuchen der vorliegenden Arbeit ex vivo eine Induktion von humanen CD4+CD25+ T-Zellen, die dem Phänotyp natürlich regulatorischer T-Zellen entsprechen. Die gemessenen Zellen besitzen alle extra- und intrazellulären Markermoleküle, die zur Identifizierung von Tregs nach aktuellem Forschungsstand notwendig sind. Nach TGN1412-Inkubation werden gegensätzlich zum Isotyp- und konventionellen Ansatz verstärkt CD4+CD25+ und CD4+CD25high+ T-Zellen gebildet. Diese TZellfraktionen beinhalten natürlich regulatorische T-Zellen (7, 48). Die durch den superagonistischen α-CD28 stimulierten T-Zellen exprimieren die klassischen TregMarker Foxp3, GITR, CTLA-4 (CD152), Ox40 (CD134) und Neuropilin-1 (Nrp1). Er bildet deutlich mehr CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25high+ T-Lymphozyten, die diese „regulatorischen Marker“ besitzen, als im Ansatz mit Isotyp oder konventionellem αCD28. Letztere führen mit 1,83% bzw. 0,41% CD4+ T-Zellen, die CD25 und Foxp3 exprimieren, zu keiner Induktion von Tregs, da der physiologische Anteil natürlich regulatorischer T-Zellen an CD4+ T-Lymphozyten im Menschen zwischen 1-3% liegt (135). In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass der konventionelle CD28-Ak augenscheinlich zu einer Reduktion der physiologischen Treg-Populationsgrösse führt (0,41% vs. 1-3% bzw. 1,83% nach Inkubation mit Isotyp IgG4). Zwar konnte in Veröffentlichungen gezeigt werden, dass konventionelle CD28-Ak die inhibitorischen Eigenschaften von Treg auf ihre Zielzellen reduzieren (122), von einer Reduktion der gesamten Treg-Fraktion durch diese Antikörper wurde allerdings bisher nicht berichtet. Die Beobachtungen aus den Versuchen der vorliegenden Arbeit implizieren aber, dass die Stimulation des CD28-Moleküls mit konventionellen Antikörpern zur Abnahme natürlich regulatorischer T-Zellen führt. Dies steht im Kontrast zum eigentlich antiapoptotischen Charakter von CD28 auf T-Zellen (15). TGN1412 induziert im Gegensatz zum konventionellen Antikörper in vitro die humane Treg Population (11,43% CD25+Foxp3+-exprimierende CD4+ T-Zellen). Zusammenfassend besitzt der superagonistische α-CD28 einen Treg-stimulierenden Charakter, wohingegen der konventionelle CD28-Ak zu einer Reduktion natürlich regulatorischer T-Zellen zu führen scheint. Insgesamt proliferieren Treg in den Messungen dieser Arbeit im kostimulatorischen Ansatz am effektivsten. Dies steht im Kontrast zu den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen, deren superagonistischer CD28-Ak der stärkere Stimulator von 52 Diskussion CD4+CD25+ und CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen im Maus- und Rattenmodell war (10, 63). Eine mögliche Erklärung besteht darin, dass der humanisierte TGN1412 eventuell ein geringeres superagonistisches Potential besitzt als Superagonisten in der Ratte oder Maus. Da die o.g. Tierversuche teilweise in vivo und die Messungen dieser Arbeit ex vivo durchgeführt wurden, kann hierin ebenfalls ein Grund für die divergierenden Proliferationspotentiale der Superagonisten liegen. Unabhängig von der Stimulationseffektivität der Kostimulation und des TGN1412, wird in beiden Ansätzen die höchste Konzentration der Treg-Marker (Ausnahme GITR) auf CD4+CD25high+ T-Zellen gemessen. Diese Beobachtung legt nahe, dass Tregs eher in der CD4+CD25high+ Population zu finden sind. Superagonistische CD28-Antikörper wurden in bisherigen Studien als vornehmliche Induktoren natürlich regulatorischer T-Zellen dargestellt (11). Dies bedeutet, dass sie neben ihrer Eigenschaft zur Stimulation konventioneller T-Zellen vor allem zu einer Proliferation der regulatorischen Subpopulation führen und somit die Sensitivität von Tregs für superagonistische Stimulation grösser ist als von konventionellen T-Zellen. So wiesen in einem in vitro Tierversuch alle durch superagonistischen CD28-Ak expandierten Tregs das Foxp3-Protein auf (10). 80-90% der superagonistisch expandierten CD4+CD25+ T-Zellen bildeten in einer in vivo Rattenstudie von Beyersdorf et al. Foxp3 (11). Weitere Forschungsgruppen kamen zu dem Ergebnis, dass die in vivo Applikation ihres superagonistischen CD28-Ak zu einer CD25+Expression ausschliesslich auf Tregs führte (11, 63). Alle expandierten CD4+CD25+ TZellen müssten demnach das Treg spezifische Protein Foxp3 aufweisen. Nach TGN1412-Inkubation sind 19,2% der CD4+CD25+ T-Zellen zusätzlich Foxp3+ (23,6% der CD4+CD25high+ T-Zellen). Definiert man gemäss heutigem Kenntnisstand regulatorische T-Zellen als CD4+CD25+Foxp3+ bedeutet dies, dass weit über 70% der unter TGN1412 proliferierten CD4+CD25+ T-Zellen konventionelle, nicht regulatorische T-Zellen darstellen. Eine hauptsächliche oder selektive Stimulation von Tregs durch TGN1412 ist daher nicht nachzuweisen. Demnach erfolgt die Induktion von Tregs durch superagonistische CD28-Ak im in vivo und ex vivo Tierversuch effektiver als durch TGN1412 ex vivo im Menschen. Der humanisierte α-CD28-Ak TGN1412 hat möglicherweise geringere superagonistische Eigenschaften auf Treg als seine Vorgänger im Tiermodell. Ausserdem könnte die in vivo Stimulation von T-Zellen effektiver sein als in vitro. 53 Diskussion Jedoch induziert der superagonistische CD28-Ak eine deutliche Expansion der TregZellzahl. Damit könnte durch TGN1412 die Möglichkeit bestehen, natürlich regulatorische T-Zellen in der Peripherie zu bilden. Fraglich ist aber, aus welchem Zellpool die expandierten Tregs stammen. Mögliche Quellen können periphere CD4+CD25-Foxp3- T-Zellen sein, die unter TGN1412 und Kostimulation den Phänotyp von Tregs annehmen. Im humanen System wurde diesbezüglich bereits bewiesen, dass CD4+CD25- T-Zellen nach Stimulierung Foxp3 exprimieren und regulatorische Eigenschaften gewinnen können + (135, + 143). + Andererseits besteht die Möglichkeit, dass bestehende CD4 CD25 Foxp3 Tregs in der Peripherie unter superagonistischer Stimulation proliferieren und auf diese Weise zur Expansion natürlich regulatorischer T-Zellen führen. Und genau diese Theorie wurde auch von Lin et al. und Beyersdorf et al. bestätigt (11, 63). Somit ist es wahrscheinlich, dass auch die durch TGN1412 expandierten Tregs infolge Zellteilung existenter CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen enstanden sind. Legrand et al. machten kürzlich die Entdeckung, dass unter in vivo Applikation eines superagonistischen CD28-Ak die thymale T-Zellproduktion zunimmt und peripher vermehrt Tregs gemessen werden können. Demzufolge kann in vivo auch eine selektive Treg Bildung infolge verstärkter Thymusaktivität durch superagonistische CD28-Stimulation erreicht werden (58). Neben der Frage des Ursprungs der durch TGN1412 induzierten Tregs ist auch ungewiss, ob die expandierten Zellen regulatorisch aktiv sind. In diesem Zusammenhang behaupten Morgan et al. und Gavin et al., dass Foxp3 eher einen Aktivierungsmarker peripher stimulierter T-Zellen darstellt als ein Zeichen natürlich regulatorischer T-Zellen (30, 76). Jedoch konnte von Beyersdorf et al. gezeigt werden, dass die mittels superagonistischem CD28-Ak induzierten Tregs gegenüber nichtstimulierten regulatorischen T-Zellen sogar erhöhte inhibitorische Eigenschaften auf konventionelle T-Zellen ausüben (12). Diese Suppression ist dann nur nach TCRStimulation möglich und Zell-Zell-Kontakt abhängig (10). Die unter TGN1412 induzierten Tregs exprimieren neben Foxp3 auch verstärkt die Treg-Marker GITR, CTLA-4, Ox40 und Nrp1. Diese Resultate machen potente regulatorische Eigenschaften der unter TGN1412 gebildeten Tregs wahrscheinlich. Die Wirkung von TGN1412 auf CD4+ T-Lymphozyten besteht zusammenfassend in der globalen T-Zellaktivierung sowie der Induktion von Tregs, die deren physiologische Zellzahl und die Stimulation mit einem konventionellen CD28-Ak deutlich übersteigt. 54 Diskussion Jedoch ist diese Proliferation in ihrer Ausprägungsstärke extremen individuellen Schwankungen unterlegen. Die Lymphozyten der verschiedenen Blutspender reagieren unterschiedlich auf die Inkubation mit TGN1412. Die Aktivierung von CD4+ TZellen, was durch die Expression von CD25 ausgedrückt wird, reicht hierbei von 13% bis 81% CD25+-exprimierender CD4+ T-Lymphozyten. Ebenso existieren je nach Spender 1% bis 48% CD4+ T-Zellen, die CD25high+ sind. Und auch die Bildung von Foxp3, als repräsentativer Marker von natürlich regulatorischen T-Zellen, ist zwischen den Spendern inkonstant. Die Wirkung des superagonistischen CD28-Ak im Hinblick auf T-Zellaktivierung und -induktion von Tregs besitzt folglich eine Spannbreite von gering bis effektiv. Anscheinend hängt die Wirkung des TGN1412 auf CD4+ TLymphozyten sehr von individuellen Faktoren ab. Mögliche Kriterien könnten der CD28-Besatz oder der unterschiedliche Aktivierungsstatus der Spenderzellen sein. 4.3 In Klinische Perspektive Tiermodellen sind CD28-Superagonisten bereits erfolgreich zur Therapie autoimmuner Erkrankungen eingesetzt worden. Positive Ansätze in der Behandlung der autoimmunen Neuritis (102), der experimentell autoimmunen Enzephalomyelitis (11) und der rheumatoiden Arthritis (95) wurden unter 1.3.5 vorgestellt. Tischner et al. bewiesen schliesslich 2006, dass in vivo superagonistisch proliferierte Tregs die autoaggressiven zytotoxischen T-Zellen in sekundär lymphatischen Organen direkt inhibieren (128). Schlussfolgernd wird der Schutz vor Autoimmunität durch superagonistische CD28-Ak mittels einer Expansion von natürlich regulatorischen TZellen und deren Suppressionseffekt auf autoreaktive Zellen erreicht (12). Darüberhinaus haben Superagonisten eine generelle T-Zellaktivierende Wirkung. Die Zellzahl in T-lymphopenischen Ratten wurde nach kurzer Zeit regeneriert (24). Diese Ergebnisse in Tierversuchen gaben Anlass zu berechtigter Hoffnung, dass superagonistische CD28-Ak auch menschliche autoimmune und zytopenische Erkrankungen bekämpfen können. Obwohl die vorliegende Arbeit TGN1412 als einen weiteren vielversprechenden CD28Superagonist ausweist, ist seine klinische Anwendbarkeit aufgrund unserer in vitro Ergebnisse kritisch zu sehen. TGN1412 ist ein unspezifischer T-Zellstimulator. Unter seiner Wirkung expandieren zum einen Tregs, durch deren Vermehrung TGN1412 Anwendung in der Therapie autoaggressiver Erkrankungen finden könnte. Zum anderen induziert der superagonistische α-CD28-Ak konventionelle T-Zellen. Dies 55 Diskussion wäre erstrebenswert zur Bekämpfung von Tumorerrkankungen. Gleichzeitig würden auch potentiell autoreaktive T-Zellen proliferieren und Autoimmunität bewirken. Somit expandieren in vitro durch TGN1412 sowohl immunsupprimierende als auch immunstärkende bis autoaggressive T-Zellfraktionen. Eine Indikation für TGN1412 im klinischen Rahmen wäre somit schwierig zu stellen. Nach einem dramatischen Vorfall im Jahre 2006 ist an eine in vivo Applikation von TGN1412 nicht mehr zu denken. Am 13. März 2006 wurde TGN1412 im Rahmen einer klinischen Phase-1-Studie sechs gesunden Probanden in London verabreicht (0,1 mg/kg Körpergewicht) (117). Eine Stunde nach Infusionsbeginn entwickelten die Probanden Symptome wie Übelkeit, Erbrechen, Diarrhö, Hypotonie und Tachykardie sowie Fieber, Hauterytheme und Dyspnoe. Diese klinischen Folgen gingen laborchemisch mit einem „Zytokinsturm“ einher. Es wurde ein extrem erhöhter Blutspiegel an TNF-α, IFN-γ und der Interleukine 10, 8, 6, 4, 2 und 1 gemessen. Parallel dazu herrschte eine schwere Lympho-, Mono- und Thrombozytopenie. In den ersten 48 Stunden waren CD4+ und CD8+ T-Zellen nicht detektierbar. Die Lymphozytenzahl erholte sich nur langsam und erreichte erst nach 30 Tagen Normalwerte. Die Monozytenregeneration lies nach durchschnittlich 16 Tagen wieder physiologische Werte messen. Neutrophile Granulozyten gerieten zwar nicht in die Zytopenie, aber waren mikroskopisch dysplastisch und hypogranulär. Im weiteren klinischen Niereninsuffizienz, Verlauf disseminierte Funktionseinschränkungen. In entwickelten intravasale diesem einige Patienten Gerinnung und Zusammenhang wurden eine akute respiratorische die Patienten dialysepflichtig und zwei Probanden bedurften der maschinellen Beatmung. In Folge einer peripheren Ischämie kam es zu Finger- und Zehennekrosen eines Patienten. Nach dem Zwischenfall wurde unter Leitung der englischen Zulassungsbehörde MHRA Ursachenforschung betrieben. Ein Fehler in der Produktion oder Applikation sowie eine Kontamination des Antikörpers konnten ausgeschlossen werden (117). Somit musste TGN1412 selbst verantwortlich für diesen Ausgang sein. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist der Pathomechanismus allerdings umstritten. Es ist ungewiss, ob die massive Zytokinausschüttung infolge direkter Ligation des TGN1412 auf T-Zellen oder auf anderen Zelltypen passieren konnte. Hünig et al. vertreten in diesem Zusammenhang die Meinung, dass TGN1412 in vivo nicht nur regulatorische T-Zellen gebunden und stimuliert hat, sondern zu einer Überaktivierung von TH2-Zellen geführt hat, welche der Ausgangspunkt des Zytokinschocks seien (42). Da CD28 ebenfalls auf neutrophilen (132) und eosinophilen (133) Granulozyten nachgewiesen wurde, sehen Kritiker in 56 Diskussion diesen Zellpopulationen Potential, durch Bindung des TGN1412 ein immunologisches Chaos anzurichten. Selbes gilt für T-Killerzellen, die überaktiviert zu Zelllyse und massiver Zytokinausschüttung führen (42). Ausserdem wird in den OberflächenThiolen und Galaktoserezeptoren der Lymhozyten ein möglicher Ausgangspunkt des Zytokinsturms gesehen (73). Ebenso ungeklärt bleibt die enorme Lympho- und Monozytopenie. Somit muss es entweder in diesen Zellpopulationen zum Zelltod gekommen sein, oder zur Wanderung aus dem Blut in lymphatische Gewebe. Diese überraschende Wirkung von TGN1412 im humanen Organismus war nach den präklinischen Tierexperimenten nicht abzusehen. Weder im in vitro noch in vivo Tierversuch bewirkten superagonistische CD28-Ak erhöhte Entzündungsmediatoren oder verminderte Lymphozytenzahlen (11, 45). Vielmehr wurden in diesen Versuchen eine Lymphozytose und supprimierte IFN-γ Spiegel nachgewiesen (102, 128). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen daraufhin, dass auch der humanisierte CD28-Ak TGN1412 ex vivo eine deutliche TZellaktivierung und –proliferation erzielt. Doch im Gegensatz zum Tierversuch induziert TGN1412 ex vivo im Menschen eine IFN-γ Sekretion (siehe Abschnitt 3.2). Eine kürzlich veröffentlichte Studie von Stebbings et al. kommt ebenfalls zu dem Ergebnis, dass TGN1412 die proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IFN-γ in vitro induzieren kann (115). In diesen Versuchen wird TGN1412 nicht löslich, sondern in gebundener Form an Endothelzellen, den Leukozyten präsentiert. Diese Methode soll besser die in vivo Bedingungen repräsentieren und stellt damit ein mögliches Modell dar, wie es zu der enormen Zytokinausschüttung nach in vivo Applikation von TGN1412 kommen konnte. Im Vorfeld zur klinischen Erprobung des Antikörpers wurde eine Applikation im Cynomolgus-Affen durchgeführt. Dessen CD28-Molekül ist laut Hünig et al. dem humanen Rezeptor identisch (42). Andere Publikationen besagen jedoch, dass zwischen dem CD28 dieser Affen und des Menschen strukturelle Unterschiede und Differenzen in der Bindungsaffinität gegenüber TGN1412 bestehen (36). Ob dieses Tiermodell dem humanen System vergleichbar ist, ist also fraglich. Die Gruppe um Stebbings stellt das Affenmodell sogar gänzlich in Frage. Sie verglich im o.g. in vitro Modell den Effekt von TGN1412 auf humane und Cynomolgus-PBMC und -Vollblut (115). Erstaunlicherweise konnten im Cynomolgus-Ansatz keine proinflammatorischen Zytokine detektiert werden, wohingegen TGN1412 im humanen Ansatz zur Freisetzung von TNF-α, IFN-γ sowie IL-6 und IL-8 führte. 57 Diskussion Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und die Studie von Stebbings et al. auf eine Induktion der IFN-γ Sekretion durch TGN1412 ex vivo im Menschen hin. Demnach wirkt der superagonistische α-CD28-Ak neben seinen dramatischen in vivo Effekten im menschlichen Organismus auch ex vivo proinflammatorisch. Dagegen hat TGN1412 keinen superagonistischen Effekt im Cynomolgus Affen. Auch die Tierversuche an Ratte und Maus konnten derartige Zytokinausschüttungen durch superagonistische CD28-Ak nicht nachweisen. Die präklinische tierexperimentelle Erprobung von TGN1412 und deren Aussagekraft auf den Menschen sind damit zweifelhaft. Mögliche Erklärungen für die divergierenden Zytokinsekretionen zwischen den humanen und Tierversuchen liegen in möglichen strukturellen und funktionellen Unterschieden zwischen TGN1412 und den superagonistischen Vorläufermodellen im Tiermodell. Ausserdem ist fraglich, ob das CD28-Molekül der menschlichen T-Zellen dem animalen Rezeptor in Bindungsaffinität, Funktion und molekularem Aufbau ähnelt (36). Darüberhinaus könnte die Existenz von CD28 auf anderen humanen Zelltypen die unterschiedliche Zytokinausschüttung durch TGN1412 zwischen Mensch und Tier erklären. Unphysiologische Zytokinausschüttungen durch andere monoklonale Antikörper sind bereits bekannt (140). Da die Ereignisse um TGN1412 einen weiteren unerwarteten Medikamtentenzwischenfall darstellen, ist ein Überdenken der Zulassungsordnung neuer Wirkstoffe zu klinischen Studien angebracht. In dieser Hinsicht haben die ESG (Expert Scientific Group), die nach dem Londoner Zwischenfall ins Leben gerufen wurde, und das Paul-Ehrlich-Institut Konzepte erarbeitet, die zukünftige Phase-IStudien sicherer machen sollen (22, 103). Obwohl die superagonistische CD28-Stimulation mit TGN1412 im Menschen offensichtlich ungeeignet ist, wäre eine gezielte und steuerbare T-Zellaktivierung und -modulation in Zukunft wünschenswert und bleibt somit Gegenstand der Forschung. 58 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Der rekombinant hergestellte monoklonale Antikörper TGN1412 richtet sich gegen das humane CD28-Molekül auf T-Lymphozyten. Seine Wirkung ist superagonistisch. Dies bedeutet, dass eine Aktivierung von T-Zellen ohne zusätzliche Stimulation des TZellrezeptors erreicht wird. In Tierversuchen wurde nachgewiesen, dass superagonistische CD28-Antikörper in vivo und ex vivo eine effektive T-Zellproliferation bewirken können. Insbesondere wurden durch ihren Effekt CD4+CD25+Foxp3+ natürlich regulatorische T-Zellen (Treg) induziert. Diese Population wirkt immunsupprimierend durch Inhibition anderer Zellen. Erste Erfolge in der Therapie autoimmuner Erkrankungen mittels superagonistischer CD28-Ak wurden tierexperimentell bereits verzeichnet (11, 95, 102). Im Rahmen dieser Arbeit wurde in Hinblick auf mögliche klinische Applikationen die Wirkung von TGN1412 auf humane T-Lymphozyten gesunder Spender ex vivo untersucht. • TGN1412 wirkt ex vivo aktivierend auf humane T-Zellen. Unter Inkubation mit dem superagonistischen α-CD28-Ak proliferieren vornehmlich CD4+ T-Lymphozyten. Diese Zellen zeigen eine TH1-Differenzierung (T-Helfer1-Differenzierung). • Darüberhinaus ist TGN1412 zur Induktion natürlich regulatorischer T-Zellen fähig. Diese Zellen befinden sich nach unseren Versuchen vornehmlich im CD4+CD25high+ T-Zellkompartiment. • Jedoch expandieren unter Wirkung von TGN1412 nicht selektiv Treg. Vielmehr stellt der Superagonist einen unspezifischen Aktivierungs- und + Proliferationsstimulus für konventionelle und regulatorische CD4 T-Zellen dar. Die Induktion von sowohl immunstimulierenden als auch -supprimierenden Zellen macht eine klinische Anwendung problematisch. • Schliesslich gelingt die ex vivo T-Zellaktivierung und -proliferation mittels TGN1412 individuell sehr unterschiedlich und besitzt eine Wirkung von hocheffektiv bis gering. Die in vivo Applikation von TGN1412 an sechs Probanden am 13. März 2006 in London führte zu einer ausgeprägten Entzündungsreaktion mit lebensbedrohlicher Gefährdung der Probanden. Nach diesen ex und in vivo Ergebnissen ist eine klinische Anwendung von TGN1412 mehr als unwahrscheinlich geworden. 59 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis 1. Abbas AK, Murphy KM, and Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383: 787-793, 1996. 2. Annacker O, Pimenta-Araujo R, Burlen-Defranoux O, Barbosa TC, Cumano A, and Bandeira A. 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Curr Opin Immunol 8: 215-224, 1996. 70 Anhang 7 Anhang 7.1 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Darstellung des 2-Signal-Modells zur T-Zellaktivierung..........................5 Abbildung 2: Die Entwicklung regulatorischer T-Zellen................................................9 Abbildung 3: T-Zellaktivierung und –proliferation durch TGN1412.............................14 Abbildung 4: Neubauer Zählkammer..........................................................................18 Abbildung 5: Prinzip der Durchflusszytometrie...........................................................19 Abbildung 6: Spektrale Überlappung der Fluorochrome.............................................23 Abbildung 7: Darstellung der PBMC als „dot-plot“ und Histogramm...........................25 Abbildung 8: Definiton der CD4+CD25+ T-Zellpopulation............................................25 Abbildung 9: Konzentrationen [pg/ml] des IFN-γ im Serumüberstand........................33 Abbildung 10: Konzentrationen [pg/ml] des IL-10 im Serumüberstand.......................33 Abbildung 11: Bildung von CD4+CD25+ T-Lymphozyten.............................................34 Abbildung 12: Bildung von CD4+CD25high+ T-Lymphozyten........................................36 Abbildung 13: Bildung von CD25+Foxp3+-exprimierenden CD4+ T-Zellen.................38 Abbildung 14: Individuelle Foxp3-Expression.............................................................38 Abbildung 15: Expression von Foxp3 in CD4+CD25+ T-Zellen...................................39 Abbildung 16: Bildung von CD25+GITR+-exprimierenden CD4+ T-Zellen...................40 Abbildung 17: Bildung von CD25+Foxp3+GITR+-exprimierenden CD4+ T-Zellen........41 Abbildung 18: Bildung von GITR in CD4+CD25+ T-Lymphozyten..............................42 Abbildung 19: Bildung von CD25+CTLA-4+-exprimierenden CD4+ T-Zellen...............43 Abbildung 20: Bildung von CD25+Foxp3+CTLA-4+-exprimierenden CD4+ T-Zellen…43 Abbildung 21: Bildung von CTLA-4 in CD4+CD25+ T-Zellen.......................................44 Abbildung 22: Bildung von CD25+Ox40+-exprimierenden CD4+ T-Zellen...................45 Abbildung 23: Bildung von CD25+Foxp3+Ox40+-exprimierenden CD4+ T-Zellen........45 Abbildung 24: Bildung von Ox40 auf CD4+CD25+ T-Lymphozyten.............................46 71 Anhang 7.2 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Antikörperkonzentrationen der Inkubationsansätze................................... 19 Tabelle 2: Absorptions- und Emissionspektren der verwendeten Fluorochrome ....... 20 Tabelle 3: FACS-Panel............................................................................................... 22 Tabelle 4: Antikörper-Färbung der „Compensation beads“ ........................................ 24 Tabelle 5: Analyse der CD4+CD25+ T-Lymphozyten auf Treg-Marker.. ..................... 47 Tabelle 6: Analyse der CD4+ T-Lymphozyten auf Treg-Marker.................................. 48 72 8 Lebenslauf Name: Vorname: Anschrift: Geburtsdatum und -ort: Eltern: Familienstand: Staatsangehörigkeit: Wieser Thomas Tittardsfeld 108, 52072 Aachen 04.03.1982 in Aachen Michael und Ursula Wieser geb. Tervooren ledig deutsch Schulbildung 1988 – 1992 Grundschule GGS Laurensberg, Aachen 1992 – 2001 Anne-Frank-Gymnasium, Aachen 05.2001 Abitur, Note: 1,6 Ersatzdienst 08.2001 – 06.2002 Luisenhospital Aachen, Medizinische Klinik Studium 04.2003 – 03.2005 Vorklinisches Studium der Humanmedizin an der Universität zu Köln 03.2005 Physikum, Note: 2,0 2005 – 2009 Klinisches Studium der Humanmedizin an der Universität zu Köln Famulaturen 08.2005 Innere Medizin, St. Antonius KH, Köln 09.2006 Kardiologie, Universitätsklinikum Aachen 10.2006 Gastroenterologie, Universitätsklinikum Köln 08.2007 Chirurgie, St. Vinzenz KH, Köln Studienbegleitende Tätigkeiten 05.2005 – 12.2005 Studentische Hilfskraft orthopädischer OP, St. Franziskus KH, Köln 01.2006 – 02.2008 Studentische Hilfskraft Ambulanz, St. Antonius KH, Köln
