Interaktion des respiratorischen Synzytialvirus mit primären
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Aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Interaktion des respiratorischen Synzytialvirus mit primären Lungenepithelzellen THESE zur Erlangung des Grades eines Doktor rerum naturalium Dr. rer. nat. durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Katherina Goris aus Hannover Hannover 2009 Supervisor: Prof. Dr. Georg Herrler Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Georg Herrler Prof. Dr. Karsten Feige Prof. Dr. Thomas Tschernig 1. Gutachten: 2. Gutachten: Prof. Dr. Georg Herrler Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Virologie Prof. Dr. Karsten Feige Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Pferde Prof. Dr. Thomas Tschernig Medizinische Hochschule Hannover Institut für funktionelle und angewandte Anatomie Prof. Dr. Andrea Maisner Philipps-Universität Marburg Institut für Virologie Datum der mündlichen Prüfung: 28.04.2009 Diese Arbeit wurde im Rahmen des SFB 587 durch die DFG gefördert. Nils i Zusammenfassung Katherina Goris Interaktion des respiratorischen Synzytialvirus mit primären Lungenepithelzellen Das Oberflächenglykoprotein F des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) spielt eine wichtige Rolle in der Anfangsphase der Infektion. Es ist nicht nur für die Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran und die daraus resultierende Synzytienbildung verantwortlich, sondern verfügt auch über Bindungseigenschaften. Bekannt ist die Interaktion des F-Proteins mit heparinähnlichen Strukturen. Zudem gibt es Hinweise auf die Bindung an einen definierten Proteinrezeptor. Versuche mit Deletionsmutanten haben gezeigt, dass das F-Protein ausreichend ist, um eine Infektion einzuleiten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von RSV mit respiratorischen Epithelzellen zu untersuchen. Um die primären Zielzellen des bovinen RSV (BRSV), die bovinen respiratorischen Epithelzellen (BAEC), zu untersuchen, wurden zwei Kultursysteme für enddifferenzierte BAEC etabliert: das „Air-liquid interface (ALI)-System“, in dem die respiratorischen Epithelzellen bis hin zur Zilienbildung enddifferenzieren, und Lungenpräzisionsschnitte (PCLS; presicion-cut lung slices) bei denen die respiratorischen Epithelzellen im ursprünglichen Gewebeverband verbleiben. Infektionsstudien mit diesen Kultursystemen primärer enddifferenzierter BAEC konnte gezeigt werden, dass BRSV nicht in der Lage war, eine Infektion in enddifferenzierten BAEC zu etablieren, während das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 bei gleicher Multiplizität der Infektion (MOI) die Zellen sehr effizient infizierte. Zilientragende BAEC waren im ALI-System nur dann sensitiv gegenüber einer BRSV-Infektion, wenn dieses mit einer relativ hohen MOI appliziert worden war. In PCLS war das respiratorische Epithel auch bei Einsatz eines hochtitrigen Virus resistent gegenüber einer Infektion durch BRSV. Diese Ergebnisse lassen mutmaßen, dass die durch BRSV vermittelte Erkrankung des Respirationstrakts von Kälbern den ii Einfluss verschiedener Umweltfaktoren voraussetzt, um das respiratorische Epithel für das Virus empfänglich zu machen. Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung des zellulären Bindungspartners des HRSV F-Proteins. Zu diesem Zweck wurde ein rekombinantes Sendaivirus verwendet, SeV-hF, das auf der Oberfläche anstelle der Sendaiproteine HN und F das HRSV-F-Protein trägt. Mit diesem Virus wurden Bindungstests mit auf Nitrozellulose immobilisierten zellulären Membranproteinen durchgeführt. Die Proteinsequenz eines mutmaßlichen Interaktionspartners von HRSV wurde mittels time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS) bestimmt. Es handelt sich hierbei um das Hitzeschockprotein gp96 (Glykoprotein 96 kDa), das hauptsächlich im ER lokalisiert ist, aber auch auf der der Zelloberfläche einer Vielzahl von Zellen vorkommt. Die funktionelle Charakterisierung von gp96 als potentieller Rezeptor für HRSV ist der Gegenstand künftiger Studien. iii Abstract Katherina Goris Interaction of the respiratory syncytial virus with primary airway epithelial cells The surface glycoprotein F of respiratory syncytial virus (RSV) plays an important role during the initiation of infection. In addition to causing the fusion of the viral envelope with the cellular membrane, which results in syncytia formation, it also has binding properties. Known is the interaction of the F protein with heparin-like glycosaminoglycans. Furthermore, the available evidence suggests the binding to a defined protein. Results obtained with deletion mutants indicate that the F protein is sufficient to initiate the infection cycle. Aim of this PhD thesis was to investigate the interaction of RSV with respiratory epithelial cells. The primary target cells of bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine respiratory epithelial cells (BAEC) have been studied using two culture systems for well-differentiated BAEC: the air-liquid interface (ALI) system, where filter-grown BAEC differentiate into the different cell types of a respiratory epithelium, and presicion-cut lung slices (PCLS) where BAEC are maintained in the original tissue organisation. On the basis of infection studies with these two culture systems of well-differentiated BAEC it has been shown that at the same multiplicity of infection (MOI) BRSV was not able to establish an infection in well-differentiated BAEC whereas bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) efficiently infected these cells. Ciliated BAEC in ALI culture became sensitive to BRSV, when the virus was applied at relatively high MOI. In PCLS, the ciliated epithelium was refractory to infection by BRSV even when high-titered virus way applied. Our findings raise the possibility that the respiratory tract disease in calves caused by BRSV may require environmental stimuli that render BAEC susceptible to infection. iv The second aim of this thesis was the identification and characterisation of a cellular binding partner of the HRSV F protein. For this purpose, binding tests with the recombinant Sendai virus SeV-hF have been performed. This virus carries the HRSV F protein on the surface instead of the SeV surface proteins HN and F and was used to detect the binding to cellular membrane proteins immobilised on nitrocellulose The protein sequence of a putative interaction partner of HRSV-F was determined by time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS). The protein sequenced was identified as the heat shock protein gp96 (glycoprotein of 96 kDa). Gp96 is mainly localised in the ER but also expressed on the surface of different cells. A potential role of gp96 as a receptor for HRSV has to be analyzed in future studies. v Inhaltverzeichnis Zusammenfassung ...........................................................................................................i Abstract ..........................................................................................................................iii Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................... v Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................x Abbildungsverzeichnis.................................................................................................xiii Tabellenverzeichnis ......................................................................................................xv 1. Einleitung .........................................................................................................................1 1.1. Das respiratorische Synzytialvirus............................................................................1 1.1.1. Taxonomie......................................................................................................1 1.1.2. Epidemiologie und Übertragung ....................................................................3 1.1.3. Klinik..............................................................................................................3 1.1.4. Pathologie.......................................................................................................5 1.1.5. Immunität .......................................................................................................6 1.1.6. Virusmorphologie und Genomaufbau ...........................................................6 1.1.7. Eigenschaften des F-Proteins .......................................................................10 1.2. Das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 .....................................................................11 1.3. Das Sendai-Virus ....................................................................................................12 1.4. Das bovine Coronavirus..........................................................................................13 1.5. Das bovine Herpesvirus Typ 1................................................................................14 1.6. Polarisierter Viruseintritt in Epithelzellen ..............................................................15 1.7. Das Hitzeschockprotein gp96 .................................................................................17 2. Zielsetzung .....................................................................................................................19 3. Material ..........................................................................................................................20 vi 3.1. Zelllinien .................................................................................................................20 3.2. Zellkulturmedien .....................................................................................................21 3.3. Antibiotika, -mycotika ............................................................................................21 3.4. Viren........................................................................................................................21 3.5. Antikörper ...............................................................................................................21 3.5.1. Primäre Antikörper.......................................................................................23 3.5.2. Sekundäre Antikörper ..................................................................................23 3.6. Substrate..................................................................................................................23 3.7. Kit............................................................................................................................24 3.8. Vergleichsproteine ..................................................................................................24 3.9. Chemikalien ............................................................................................................24 3.10. Medien, Puffer und Lösungen.................................................................................26 3.10.1. Polyacrylamidgel-Elektrophorese ................................................................26 3.10.2. Westernblot ..................................................................................................27 3.10.3. Zellkultur und Molekularbiologie ................................................................28 3.10.4. Membranproteinisolierung ...........................................................................29 3.10.5. SeV-Anzucht ................................................................................................30 3.10.6. Immunfluoreszenz ........................................................................................30 3.10.7. Immunoplaquetest ........................................................................................30 3.11. Geräte ......................................................................................................................31 3.12. Zellkulturmaterial....................................................................................................31 4. Methoden........................................................................................................................32 4.1. Zellkulturen .............................................................................................................32 4.1.1. Anlegen von Gefrierkulturen .......................................................................33 4.1.2. DAPI-Test ....................................................................................................33 4.2. Primäre Zellkulturen ...............................................................................................34 4.2.1. NHBE-Zellen ...............................................................................................34 4.2.2. Isolation boviner respiratorischer Epithelzellen...........................................34 vii 4.2.3. Air-liquid interface (ALI) Kulturen ............................................................35 4.2.4. Presicion-cut lung slices (PCLS)..................................................................36 4.2.5. Lebend-tot-Färbung......................................................................................37 4.2.6. Bronchokonstriktion der PCLS ....................................................................37 4.3. Anzucht von Viren ..................................................................................................38 4.3.1. Humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV) ......................................38 4.3.2. Bovines Respiratorische Synzytialvirus (BRSV).........................................39 4.3.3. Bovines Parainfluenzavirus Typ 3 (BPIV3).................................................38 4.3.4. Bovines Herpesvirus Typ 1/GFP (BHV-1/GFP)..........................................39 4.3.5. Rekombinante Sendai-Viren (SeV-L/GFP; SeV-hF; SeV-dsRed)...............39 4.4. Virusreinigung mittels Dichtegradientenzentrifugation..........................................40 4.5. Plaquetest ................................................................................................................41 4.6. Virusinfektion von Zellkulturen..............................................................................42 4.6.1. Infektion von Deckglaskulturen ...................................................................42 4.6.2. Infektion von Filterkulturen .........................................................................42 4.6.3. Infektion von PCLS......................................................................................43 4.7. Immunfluoreszenztests............................................................................................43 4.8. Membranproteinisolierung......................................................................................44 4.9. BCA-Test ................................................................................................................44 4.10. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ..................................................................45 4.11. Coomassie-Färbung ................................................................................................45 4.12. Western Blot ...........................................................................................................46 4.13. Virusbindung an immobilisierte Membranproteine................................................46 4.14. Proteinidentifikation mittels time-of-flight tandem mass spectrometry ................47 5. Ergebnisse ......................................................................................................................48 5.1. Präparation differenzierter Bronchialepithelzellen aus bovinen Lungen................48 5.1.1. Air-liquid Interface Kulturen .......................................................................48 5.1.2. Precision-cut lung slices............................................................................... 51 viii 5.1.3. Infektion primärer boviner respiratorischer Epithelzellen in ALI-Kultur durch das bovine respiratorische Synzytialvirus .............................................53 5.1.4. Vergleich Infektion durch BRSV und HRSV bei BAEC in unterschiedlichen Differenzierungsstadien ...................................................................................53 5.1.5. Vergleichende Infektion von nicht differenzierten humanenrespiratorischen Zellen (NHBE) durch HRSV und BRSV ........................................................55 5.2. Infektion von enddifferenzierten BAEC durch BRSV ..........................................56 5.2.1. Infektion von permanenten Zelllinien durch BRSV ....................................56 5.2.2. Infektion von enddifferenzierten BAEC durch BRSV mit niedriger MOI ..58 5.2.3. Infektion von enddifferenziereten BAEC durch BRSV bei erhöhter MOI ..59 5.2.4. Infektion von enddifferenziereten BAEC durch BRSV mit hoher MOI......61 5.3. Infektion von ausdifferenzierten BAEC durch andere respiratorische Viren .........62 5.3.1. Infektion durch das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 .................................62 5.3.2. Infektion durch das bovine Herpesvirus Typ 1 ............................................64 5.3.3. Infektion durch das bovine Coronavirus ......................................................65 5.3.4. Infektion durch verschiedene Sendaiviren ...................................................66 5.3.4.1.SeV-L/GFP.............................................................................................66 5.3.4.2.SeV-hF ...................................................................................................68 5.4. Infektionsstudien an bovinen Lungenpräzisionsschnitten (PCLS) mit BRSV .......68 5.4.1. BRSV-Infektion von Lungenpräzisionsschnitten bei geringem Virusiter ...69 5.4.2. BRSV-Infektion von Lungenpräzisionsschnitten bei höherem Virustiter ...69 5.5. Infektion der PCLS mit anderen respiratorischen Viren.........................................71 5.5.1. Infektion durch BPIV3 .................................................................................71 5.5.2. Infektion durch BHV-1/GFP ........................................................................72 5.5.3. Infektion durch SeV-L/GFP .........................................................................73 5.6. Identifizierung eines zellulären Interaktionspartners von HRSV ...........................75 5.6.1. Membranproteinisolierung und Auftrennung mittels SDS-PAGE...............75 5.6.2. SeV-hF-Overlay mit immobilisierten Membranproteinen ..........................77 ix 5.6.3. Identifizierung des Interaktionspartners von HRSF-F mittels time-of-flight tandem mass spectrometry............................................................................... 78 5.6.4. Nachweis des Hitzeschockproteins gp96 in HBE Zellen.............................80 6. Diskussion ......................................................................................................................82 6.1. Die Untersuchung der Interaktion zwischen BRSV und dem bovinen respiratorischen Epithel...........................................................................................82 6.1.1. Empfänglichkeit nicht differenzierter BAEC gegenüber einer BRSV Infektion...........................................................................................................83 6.1.2. Untersuchung der BRSV-Infektion mit zwei verschiedenen Kultursystemen für primäre respiratorische Epithelzellen ........................................................84 6.1.3. Mögliche Erklärungen für die Resistenz (aus)differenzierter BAEC gegenüber einer Infektion durch BRSV...........................................................86 6.1.4. Die Frage nach den primären Zielzellen von BRSV....................................90 6.2. Identifizierung des zellulären Rezeptors von HRSV ..............................................91 6.2.1. Das Hitzeschockprotein gp96 als Rezeptorkandidat ....................................92 6.3. Zukünftige Analyse und funktionellen Charakterisierung von gp96 als zellulären Rezeptor von HRSV................................................................................................93 7. Literatur ..........................................................................................................................94 8. Anhang .........................................................................................................................104 Eidesstattliche Erklärung .....................................................................................104 Danksagung..........................................................................................................105 x Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AK Antikörper ALI air-liquid interface APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure ATCC American tissue culture collection BCA Bicinchonininsäure BCoV bovines Coronavirus BHV1 bovines Herpesvirus Typ 1 BPIV3 bovines Parainfluenzavirus Typ 3 BRDC bovine respiratory disease complex BRSV bovines respiratorisches Synzytialvirus BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa DABCO 1,4-Diazobicyclo[2.2.2]octane DC Dendritische Zelle DNA Desoxyribonukleinsäure DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid d.p.i. days post infection DTT Dithiothreitol EDTA Ethylen-diamin-tetra-acetat EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium ER Endoplasmatisches Retikulum evtl. eventuell xi et al. und andere (et alli) FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS Fetales Kälberserum g Gramm GFP grün fluoreszierendes Protein h Stunden HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-(2-Ethansulfonsäure) HRP horseradish peroxidase, Peroxidase aus Meerrettich HRSV humanes respiratorisches Syncytialvirus HSV Herpes-simplex-Virus h.p.i. hours post-infection H2O Reinstwasser Ig Immunglobulin kDa kilo-Dalton konz. konzentriert M molar mA milli Ampère mab monoklonaler Antikörper min Minuten µg Mikrogramm µl Mikroliter MOI multiplicity of infection mRNA messenger RNA nm Nanometer Ohm OD optische Dichte PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese PBS phosphat buffered saline, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung PBSM PBS ohne Calcium- und Magnesium-Salze xii PCLS presicion-cut lung slices, Lungenpräzisionsschnitte PCR polymerase chain reaction, Polymerase Kettenreaktion Pen/Strep Penicillin/Streptomycin PFU plaque forming units, Plaque-bildende Einheiten p.i. post-infection r rekombinant RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute) RSV respiratorisches Synzytialvirus RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SeV Sendai Virus Tab. Tabelle TEMED N,N,N‘,N‘,-Tetramethyl-Ethylendiamin TER transepitheliarer elektrischer Widerstand Tris Trishydroxymethylaminomethan u.a. unter anderem V Volt z.B. zum Beispiel xiii Abbildungsverzeichnis Abb. 1-1: Schematische Darstellung eines RSV-Partikels und dessen Genomaufbau ..........................................................................................7 Abb. 4-1: Grafische Darstellung der ALI-Kultur von BAEC im Membranfiltersystem.........................................................................................37 Abb. 5-1: Air-liquid interface (ALI) Kulturen enddifferenzierter boviner Bronchialepithelzellen (BAEC) ........................................................................50 Abb. 5-2: Polarisierung und Differenzierung der BAEC in ALI-Kultur...........................51 Abb. 5-3: Vitalität der PCLS einen Tag nach der Präparation ..........................................52 Abb. 5-4: Infektion nicht- und enddifferenzierter BAEC durch BRSV bzw. HRSV........................................................................................................55 Abb. 5-5: Infektion nicht-differenzierter NHBE Zellen durch HRSV bzw. BRSV ..........56 Abb. 5-6: Infektion permanenter Zelllinien (Vero, MDBK, HBE) durch BPIV3 und BRSV..........................................................................................................57 Abb. 5-7: BRSV-Infektion von BAEC bei niedriger MOI................................................59 Abb. 5-8: BRSV-Infektion von BAEC in einem vielschichtigen Bereich des Epithels ..........................................................................................60 Abb. 5-9: BRSV-Infektion von BAEC bei hoher MOI .....................................................61 Abb. 5-10: Infektion des zilientragenden Epithels ALI-kultuvierter BAEC durch BPIV3......................................................................................................63 Abb. 5-11: Infektion des respiratorischen Epithels durch BHV-1 im äußeren Randbereich.......................................................................................................65 Abb. 5-12: BCoV-Infektion des respiratorischen Epithels enddifferenzierter BAEC ................................................................................................................66 Abb. 5-13: SeV-Infektionen des respiratorischen Epithels enddifferenzierter BAEC ........67 xiv Abb. 5-14: BRSV-Infektion boviner PCLS.........................................................................70 Abb. 5-15: BPIV3-Infektion boviner PCLS ........................................................................72 Abb. 5-16: BHV-1 Infektion boviner PCLS........................................................................73 Abb. 5-17: SeV-Infektion boviner PCLS ............................................................................74 Abb. 5-18: Coomassie-gefärbtes SDS-Gel aufgetrennter Membranproteine von HBE-Zellen ................................................................................................76 Abb. 5-19: SeV-hF-Overlay auf Nitrozellulose transferierter Membranbroteine verschiedener Zelllinien.......................................................79 Abb. 5-20: Identifizierung des heat shock protein gp96 als zellulärer Bindungspartner des HRSV F-Proteins.............................................................80 Abb. 5-21: Nachweis des Hitzeschockproteins gp96 in Membranproteinisolaten aus HBE Zellen .................................................................................................81 xv Tabellenverzeichnis Tabelle 1-1 : Taxonomie - Virusfamilie Paramyxoviridae ................................................2 Tabelle 1-2 : Der bovine respiratory disease comlex im Überblick ..................................5 Tabelle 3-5.1. : Primäre Antikörper .....................................................................................23 Tabelle 3-5.2 : Sekundäre Antikörper.................................................................................23 Tabelle 4-1 : Eingesetzte Zellkulturen .............................................................................32 1 Einleitung 1. Einleitung 1.1. Das respiratorische Synzytialvirus Erstmals isoliert wurde das respiratorische Synzytialvirus im Jahre 1956 aus den oberen Atemwegen eines schwer erkrankten Schimpansen. Aufgrund dessen erhielt es zunächst die Bezeichnung chimpanzee coryza agent (Morris et al., 1956). Nur ein Jahr später gelang es (Chanock et al., 1957) das Virus bei Kindern mit schwerer respiratorischer Erkrankung nachzuweisen. Es erhielt anschließend den Namen Respiratorisches Synzytialvirus (RSV). Diese Bezeichnung ist begründet auf der Fusionseigenschaft des Virus, die zur Ausbildung mehrkerniger Riesenzellen, so genannter Synzytien, führt. Das bovine respiratorische Synzytialvirus (BRSV) konnte zehn Jahre später, 1967, in der Schweiz, aus Rindern isoliert werden (Paccaud und Jacquier, 1970). Humanes und bovines RSV weisen nicht nur ähnliche Krankheitsverläufe, sondern auch starke Übereinstimmungen in den Genomsequenzen auf. Zudem konnte im Jahre 1975 in Infektionsstudien gezeigt werden, dass ein aus dem Menschen isoliertes RSV für Kälber pathogen war (Jacobs und Edington, 1975). Eine analoge Humanpathogenität von BRSV ist jedoch nicht bekannt (Kimman und Westenbrink, 1990). 1.1.1. Taxonomie RSV wird in das Genus Pneumovirus, gemeinsam mit dem Genus Metapneumovirus, in die Unterfamilie Pneumovirinae innerhalb der Familie der Paramyxoviridae eingegliedert (siehe Tabelle 1-1). Neben der Unterfamilie der Pneumovirinae gibt es bei den Paramyxoviren noch die Unterfamilie der Paramyxovirinae mit ihren fünf Genera: Respirovirus, Rubulavirus, Morbillivirus, Avulavirus und Henipavirus (Collins et al., 2001). Die Viren der Genera Paramyxovirus, Avulavirus und Morbillivirus weisen hämagglutinierende Eigenschaften auf, wobei nur die beiden erstgenannten Neuraminidaseaktivität besitzen. Trotz der Ähnlichkeiten im Genomaufbau, Replikationszyklus und in der Partikelmorphologie sind die Vertreter des Einleitung 2 Genus Pneumovirinae nicht in der Lage Erythrozyten zu hämmagglutinieren. Die Ordnung Mononegavirales schließlich wird durch die Familie der Paramyxoviridae, zusammen mit den Familien Rhabdoviridae, Bornaviridae und Filoviridae, gebildet (Pringle, 1999). Benannt ist diese Ordnung nach dem Genom der betreffenden Viren, das als nicht-segmentierte einzelsträngige RNA negativer Polarität vorliegt. Unterfamilie Genus Vertreter Paramyxovirinae Respirovirus Humanes/ bovines Parainfluenzavirus Typ 1 und Typ 3 Rubulavirus Mumpsvirus Humanes Parainfluenzavirus Typ 2 und Typ 4, Canines Parainfluenzavirus Typ 2 Avulavirus Newcastle Disease-Virus Aviäres Paramyxovirus Typen 2-9 Morbillivirus Masernvirus Hundestaupevirus Rinderpestvirus Henipavirus Hendravirus Nipahvirus Pneumovirinae Pneumovirus Humanes/bovines RSV murines Pneumovirus Metapneumovirus Aviäres Pneumovirus Humanes Metapneumovirus Tabelle 1-1: Taxonomie - Virusfamilie Paramyxoviridae 3 Einleitung 1.1.2. Epidemiologie und Übertragung Weltweit ist das humane RSV die Hauptursache für virale Infektionen des Respirationstraktes von Säuglingen und Kleinkindern, besonders im Alter von sechs Wochen bis zu mehreren Monaten. Bereits im Alter von vier Jahren, besitzen 80% aller Kinder Antikörper gegen das Virus. In den USA werden jährlich 85.000-144.000 Kinder im ersten Lebensjahr wegen einer HRSV-Infektion hospitalisiert (Shay et al., 1999), die z. T. lebensbedrohlich verläuft. Das tritt insbesondere bei Kindern auf, die unter bronchopulmonaler Dysplasie und Herzfehlern leiden und somit einer Risikogruppe angehören. Einer solchen werden außerdem ältere und immunsupprimierte Personen, wie z.B. Transplantationspatienten, zugeteilt (Falsey et al., 1995; Harrington et al., 1992). Die Infektion mit HRSV ist hochansteckend, wobei man in einem Milliliter Speichel bis zu 106 infektiöse Viruspartikel finden kann (Modrow et al., 2003). Die Übertragung des Erregers erfolgt vorwiegend aerogen durch Tröpfcheninfektion, sowie durch direkten Kontakt mit kontaminierten Gegenständen von infizierten Personen. Dabei findet die Infektion von Kindern vor allem in den Wintermonaten statt (Alonso et al., 2007). Analog zu HRSV wird BRSV die Bedeutung des wichtigsten viralen Erregers von Atemwegserkrankungen bei Rindern beigemessen (Gabathuler et al., 1987; Gillette und Smith, 1985), wobei es hauptsächlich zur Infektion von Kälbern im Alter von vier Wochen bis sechs Monaten kommt. Hierbei unterscheidet man die Serotypen A und B, die mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern (mab) gegen das G-Protein bestimmt werden können (Collins et al., 1990; Valarcher und Taylor, 2007). BRSV-Infektionen bei Rindern traten in Deutschland erstmals etwa 1981 in Erscheinung (Liebermann und Riebe, 1981). Wie epidemiologische Tests ergeben haben, weisen über 70% der Tiere Antikörper gegen das Virus auf (Lotthammer und Ehlers, 1990). 1.1.3. Klinik Klinisch lässt sich zwischen verschiedenen Krankheitsverläufen, milder bis lebensbedrohlicher Formen, unterscheiden. Nach der Inkubationszeit, die in der Regel vier bis fünf 4 Einleitung Tage anhält, kommt es zunächst zur Infektion der oberen Atemwege. Als Symptome treten hier Entzündungen der Rachen- und Luftröhrenschleimhäute, sowie der Bronchien auf, die mit Fieber und Schnupfen einhergehen können (Anderson et al., 1990; Martinez, 2003). Daraus kann sich eine Bronchitis mit Cyanose und Lungenentzündung entwickeln. Das Alter des Kindes scheint bei der Schwere der Erkrankung eine Rolle zu spielen, da solche Formen häufiger bei Kindern unter sechs Monaten auftreten (Sigurs et al., 2000; Stein et al., 1999). In ähnlicher Weise kommt es durch BRSV besonders während der Wintermonate vorzugsweise zur Infektion von Kälbern, im Alter von sechs Wochen bis mehrere Monate. Diese leiden daraufhin ebenso an einer Erkrankung des Respirationstrakts mit ähnlichen Symptomen. Die Infektion tritt dabei häufig als Faktorenkrankheit zusammen mit weiteren viralen Erregern, wie z. B. dem bovinen Parainfluenzavirus Typ 3 (BPIV3), dem bovinen Herpesvirus Typ 1 (BHV-1), dem Virus der bovinen Virusdiarroe (BVDV) und Kälbercoronaviren (BCoV), sowie bakteriellen Erregern wie z.B. Pasteurella spp., Chlamydien und Mykoplasmen auf. Sammelbegriffe ansteckender Erkrankungen des Respirationstraktes, also so genannter Faktorenkrankheiten, die keinem typischen Krankheitsverlauf oder Krankheitsbild zugeordnet werden können, werden unter bovine respiratory disease complex (BRDC), Enzootische Bronchpneumonie (EBP) des Rindes, Enzootische Rinderpneumonie, Rindergrippe oder shipping fever zusammengefasst. EBP ist unter anderem die häufigste Ursache für Verluste in der Kälberaufzucht (Fulton et al., 2000; Lehmkuhl und Gough, 1977; Srikumaran et al., 2007; Stott et al., 1980). Die Letalität einer RSV-Infektion liegt bei 20-30%, wobei Reinfektionen in erster Linie subklinische Verlaufsformen aufweisen. Beim Rind wird das Virus noch etwa drei Wochen nach der Infektion ausgeschieden (Kimman et al., 1987; Tjornehoj et al., 2003). Wo und wie das Virus zwischen den Ausbrüchen überlebt, ist jedoch unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass sowohl HRSV als auch BRSV in der Lage sind, im infizierten Wirt zu persistieren (Schwarze et al., 2004; Valarcher und Taylor, 2007). Einleitung 5 Bovine Erreger Umweltfaktoren Viral Bakteriell Endogen Exogen Respiratorisches Synzytialvirus Pasteurellen Fehlende Immunkompetenz Stallklima Parainfluenzavirus Typ 3 Mycoplasmen Immunsuppression Herpesvirus Typ1 Chlamydien Habitus Virus der bovinen Virusdiarrhö Hämophylus spp. Erschöpfung Standortwechsel Transport Futterwechsel Ernährungsfehler Parasiten Tabelle 1-2: Der bovine respiratory disease comlex im Überblick 1.1.4. Pathologie Zunächst gelangt das Virus in die oberen Atemwege des Respirationstrakts. Dort vermehrt es sich in den Zellen des Schleimhautepithels und breitet sich daraufhin in den unteren Respirationstrakt aus. Histopathologisch konnte gezeigt werden, dass BRSV vorwiegend im zilientragenden respiratorischen Epithel, sowie in Pneumozyten des Typs II repliziert (Verhoeff et al., 1984; Viuff et al., 1996). Für HRSV ist durch in vitro-Infektionsstudien an ausdifferenzierten humanen respiratorischen Epithelzellen bekannt, dass die Infektion von apikal erfolgt und vornehmlich zilientragende Epithelzellen betrifft (Zhang et al., 2002). Verläuft die RSV-Infektion schwer, treten signifikante pathologische Veränderungen der infizierten Bereiche der Bronchien sowie des Alveolargewebes auf. Hierbei kommt es, histopathologischen Untersuchungen zufolge, zur Zerstörung der Zellen, welche die peribronchiale Infiltration durch Makrophagen, eosinophile Granulozyten und andere Lymphozyten zur Folge haben. In erster Linie wird die Obstruktion der Atemwege durch die vermehrte Schleim- und Ödembildung hervorgerufen (Thomas et al., 1984; Viuff et al., 2002). Bis heute konnte jedoch nicht geklärt werden, ob die Zerstörung der Zellen auf die 6 Einleitung direkte Wirkung des Virus oder auf infolge der Infektion auftretende immunpathologische Prozesse zurückzuführen ist (Johnson et al., 2007). 1.1.5. Immunität Die primäre Infektion mit RSV hinterlässt keine anhaltende protektive Immunität. Reinfektionen sind bereits innerhalb weniger Monate, sogar mit dem gleichen Serotypen, möglich (Glezen et al., 1986; Henderson et al., 1979). Bei Kälbern, im Gegensatz zu HRSVinfizierten Kindern, verläuft die Erkrankung dann meist symptomlos (Baker et al., 1986). Kommt es jedoch umgekehrt in erwachsenen Tieren zur primären Infektion, entwickeln diese schwere Symptome (Inaba et al., 1970). Während der Infektion mit RSV kommt es zur Bildung neutralisierender Antikörper, sowohl gegen das G-Protein als auch gegen das F-Protein (Anderson et al., 1988), wobei dem F-Protein eine wichtigere immunologische Rolle beigemessen wird. So konnte bei Kälbern gezeigt werden, dass eine gegen das F-Protein gerichtete passive Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern, einen pulmonalen Schutz gegen eine BRSV Infektion zur Folge hat (Thomas et al., 1998). Zudem haben eben solche Antikörper eine neutralisierende Wirkung, welche die Aufnahme des Virus in die Zelle verhindert (Stott und Taylor, 1985). In vivo induzieren solche Vakzinen jedoch hauptsächlich Antikörper, die zwar das Virus binden, aber nicht in der Lage sind, dieses zu neutralisieren. Auch die Zellfusion vermag durch die produzierten Antikörper nicht gehemmt zu werden. 1.1.6. Virusmorphologie und Genomaufbau Die RSV-Partikel haben überwiegend eine sphärische Gestalt mit einem Durchmesser von 150-300 nm. Außerdem treten gelegentlich filamentöse Formen, mit einem Durchmesser von 60-100 nm und einer Länge von bis zu 10 (Collins et al., 2001). Das helikale Nukleokapsid mit einem Durchmesser von 12-15 nm ist von einer Membranhülle umgeben. Diese stammt ursprünglich von der Plasmamembran der infizierten Wirtszelle ab und enthält Einleitung 7 drei inserierte viruscodierte Oberflächen-Glykoproteine (Collins et al., 1999). Das Genom besteht aus einer einzelsträngigen, nicht segmentierten RNA mit negativer Polarität (Huang und Wertz, 1982) und weist eine Länge von 15.222 Basen auf. Es kodiert für neun virale Strukturproteine sowie die viralen Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Die einzelnen Gene liegen in einer bestimmten Anordnung auf der Nukleinsäure vor, die in Abb. 1-1 dargestellt ist. F-Protein G-Protein SH-Protein M-Protein L-Protein N-Protein P-Protein M2-Protein Membranhülle Genom 3’ 5’ NS1 NS2 N P M S H G F M2 L Abb. 1-1: Schematische Darstellung eines RSV-Partikels und dessen Genomaufbau Das Genom ist mit den N-, P-, M2-1- und L-Proteinen zu einem, wie bereits beschrieben, helikalen Nukleokapsid komplexiert (Collins et al., 2001). Den Hauptbestandteil bildet das 8 Einleitung das Nukleoprotein N, welches in enger Assoziation mit dem Genom vorliegt und als Stabilisator, der das Genom vor der Zerstörung durch Nukleasen schützt, dient. Zudem kann die RNA nur in diesem assoziierten Zustand transkribiert werden (Collins et al., 2001). Das L-Protein (L für large), welches bei allen Paramyxoviren in hohem Maße konserviert ist, besitzt hierzu die enzymatische Aktivität einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase. Ergänzt wird diese Polymeraseaktivität durch das Phosphoprotein P, welches zum einen die L- und N-Proteine bindet und zum anderen, im Komplex mit dem L-Protein, das Capping und die Methylierung am 5’-Ende, sowie die 3’-Polyadenylierung der mRNA bewirkt (Barik et al., 1995; Dupuy et al., 1999). Für die Proteine M2-1 und M2-2 liegen zwei offene Leserahmen innerhalb des M2-Gens vor. Das M2-1 Protein fungiert als Transkriptionselongationsfaktor, ist für die Replikation des Virus jedoch nicht essentiell. Das M2-2 Protein hingegen spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der RNA-Synthese (Collins et al., 2001; Fearns und Collins, 1999). Eine maßgebliche Beteiligung am Zusammenbau des Viruspartikels, dem so genannten self- assembly, sowie dem Knospungsprozess, wird dem Matrixprotein M zugeschrieben. Es liegt in nicht glykolysierter Form vor und bildet in Assoziation mit der Membranhülle eine so genannte Matrixschicht an deren Innenseite aus. Es besitzt die Fähigkeit, im Zytoplasma der infizierten Wirtszelle mit den anderen viralen Glykoproteinen sowie dem Nukleokapsid zu interagieren (Henderson et al., 2002). In die das Nukleokapsid umgebende Membranhülle sind drei Glykoproteine eingelagert: das small hydrophobic Protein SH, das Glykoprotein G sowie das Fusionsprotein F. Das SH-Protein ist für das Virus nicht essentiell, spielt aber eine Rolle bei der Inhibierung des -Signalwegs (Fuentes et al., 2007). Bei dem mucin-ähnlichen G-Protein handelt es sich um ein stark glykolysiertes Membranprotein vom Typ II, das somit mit dem aminoterminalen Ende in der Membran verankert ist (Teng und Collins, 2002; Teng et al., 2001). Ca. 64% seines Molekulargewichts sind auf Zuckerseitenketten zurückzuführen, die überwiegend O-glykosidisch mit Serin- oder Threoninresten verbunden sind (Wertz et al., 1989). Die Funktion des G-Proteins ist die Adsorption der Viruspartikel an die Zelloberfläche, wobei heparin-ähnliche Strukturen auf der Zelloberfläche spezifisch gebunden werden. Die Expression des G-Proteins ist für die Einleitung 9 Replikation von HRSV und BRSV in vivo wichtig (Schmidt et al., 2002; Teng et al., 2001). In vitro hingegen sind Virusmutanten, denen das G-Protein auf der Oberfläche fehlt, replikationsfähig. Das F-Protein, das im Viruspartikel als Trimer vorliegt, gehört zu der Klasse der integralen Typ-I-Membranproteine und ist somit mit einem C-terminalen Membrananker und einer kurzen zytoplasmatischen Domäne ausgestattet (Calder et al., 2000). Am N-Terminus besitzt es eine Signalsequenz, die den Transport des Translationskomplexes zur Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) dirigiert, und nach der Verankerung des Vorläuferpeptids F0 in dieser, abgespalten wird. Auf dem nachfolgenden Weg zur Plasmamembran wird das Protein zum einen an einem Cystein-Rest (AS 550) in der Membranankerregion acetyliert (Arumugham et al., 1989) und zum anderen an wenigen Stellen N-glycolysiert (Morrison, 1988). Das als biologisch inaktives Vorläuferprotein synthetisierte F0 (69 kDa) wird im Trans-GolgiNetzwerk durch Furin oder eine furin-ähnliche zelluläre Protease in die Untereinheiten F1 (50 kDa) und F2 (19 kDa) gespalten (Basak et al., 2001; Gruber und Levine, 1985). Im Unterschied zu anderen viralen Fusionsproteinen erfolgt die Spaltung nicht nur an einer, sondern zwei multibasischen Spaltstellen, KKRKRR136 und RARR109, wodurch es zur Freisetzung eines 27 AS langen Peptids (pep27) kommt (Gonzalez-Reyes et al., 2001; Zimmer et al., 2001). Für BRSV ist bekannt, dass dieses Peptid ein Tachykininmotiv enthält, welches die entsprechende Signaltransduktionsaktivität besitzt. Aus diesem Grunde hat es auch die Bezeichnung Virokinin erhalten. Es ist in der Lage, die Tachykininrezeptoren 1 und 3 zu aktivieren und darüber die Kontraktion der glatten Muskulatur zu bewirken (Zimmer et al., 2003). Bronchokonstriktion sowie Bronchosekretion, welche bekanntermaßen durch Trachykinine induziert werden (Joos und Pauwels, 2001), treten auch bei BRSV-Infektionen von Kälbern auf. Das pep27 ist jedoch für die Reifung sowie die Infektiösität von BRSV in Zellkultur nicht wichtig (Zimmer et al., 2002). Über die Funktion des bei der Spaltung des HRSV F0-Proteins freigesetzten pep27 ist noch nichts bekannt. Die beiden Untereinheiten F1 und F2 bleiben über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden, wobei der F1-Anteil mit dem carboxyterminalen Ende in der Membran verankert ist (Elango et al., 1985; Gruber und Levine, 1985). Nach dem Transport des fusionsaktiven FProteins an die Plasmamembran, leitet es dort die pH-unabhängige Fusion dieser mit der 10 Einleitung Plasmamembran der benachbarten Zelle ein. Dadurch entstehen die für das Virus namengebenden Synzytien. Das Fusionsprotein ist außerdem, bei einer natürlichen Infektion mit RSV, das Hauptziel der humoralen Immunantwort (Kimman et al., 1987). 1.1.7. Eigenschaften des F-Proteins In der frühen Anfangsphase der Infektion vermittelt das F-Protein von RSV die Fusion der Virusmembran mit der Plasmamembran der Zelle, und spielt daher eine wichtige Rolle beim Viruseintritt in die Zelle (Pastey und Samal, 1997). Der N-Terminus des F1-Proteins weist einen stark hydrophoben Bereich von 25 Aminosäuren auf. Bei anderen Paramyxoviren konnnte gezeigt werden, dass dieses so genannte „Fusionspeptid“ die Verschmelzung der viralen Membran mit der Plasmemembran der Wirtszelle vermittelt. Auch bei RSV ist das Fusionspeptid auf dem F1-Anteil lokalisiert (Gonzalez-Reyes et al., 2001). Zusätzlich verfügt das F-Protein über Bindungseigenschaften. Bisher ist bekannt, dass das F-Protein, wie auch das G-Protein, in der Lage ist, an heparin-ähnliche Strukturen (Glykosaminglykane) zu binden. Gezeigt werden konnte, dass Deletionsmutanten von RSV, denen die Glykoproteine G und SH fehlen, und somit nur das F-Protein auf der Oberfläche tragen, vermehrungsfähig sind (Karger et al., 2001; Techaarpornkul et al., 2001). Somit muss das F-Protein, um eine Infektion einleiten zu können, auch über rezeptorbindende Eigenschaften verfügen. Bei der Zugabe von löslichem Heparin wird die Infektiösität von RSV zwar reduziert, eine vollständige Hemmung kann jedoch nicht erzielt werden. Das deutet darauf hin, dass RSV, vermutlich mit Hilfe des F-Proteins, an einen zusätzlichen Rezeptor bindet. Trotz des unterschiedlichen Wirtstropismus des humanen (HRSV) und bovinen Virus (BRSV) äußert sich dieser nicht in der Empfänglichkeit permanenter Zelllinien. Spezifische Unterschiede treten nur bei der Infektion primärer respiratorischer Epithelzellen sowie peripherer Blutlymphozyten und Makrophagen auf. Zur näheren Untersuchung dieses Unterschieds, wurden chimäre F-Proteine, bei denen je eine Untereinheit (F1 bzw. F2) von BRSV und die andere von HRSV stammte, erzeugt. Es ergab sich, dass der Wirtstropismus von der 109 AS umfassenden F2-Untereinheit bestimmt wird (Schlender et al., 2003). 11 Einleitung Die Homologie der Aminosäuresequenz liegt beim F-Protein bei 80-84%, was vergleichende Untersuchungen zwischen verschiedenen Stämmen von HRSV und BRSV zeigen. Innerhalb der BRSV-Stämme konnte sogar eine Homologie von über 95% nachgewiesen werden (Mallipeddi und Samal, 1993a; Mallipeddi und Samal, 1993b; Pastey und Samal, 1993). Das F-Protein scheint also, im Gegensatz zum G-Protein, welches nur 29 % Homologie zwischen den verschiedenen BRSV-Stämmen aufweist, hochkonserviert zu sein (Lerch et al., 1989). Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass das RSV F-Protein in der Lage ist, an den Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) zu binden, wodurch es zu dessen Aktivierung kommt (KurtJones et al., 2000). 1.2. Das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 Erstmals beschrieben wurde das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 (BPIV3), isoliert aus Kälbern mit Anzeichen auf „shipping fever“, im Jahre 1959 (Reisinger et al., 1959). BPIV3 gehört, ebenso wie RSV, zur Familie Paramyxoviridae, ist dort allerdings in die Unterfamilie Paramyxovirinae, in das Genus Respirovirus eingeordnet (siehe Tabelle 1-1). Somit handelt es sich auch bei BPIV3 um ein Negativstrang-RNA-Virus (Chanock et al., 2001). Nach RSV sind das humane PIV3 (HPIV3) sowie BPIV3 bei Kleinkindern und Kälbern die häufigste Ursache für Virusinfektionen der unteren Atemwege (Lee et al., 2005). Die Infektion äußert sich klinisch erst als Erkrankung der oberen Atemwege und führt in schwereren Fällen (10-30%) zur Ausbildung einer Bronchitis, Bronchiolitis oder sogar Pneumonie. Auch im Fall von PIV3 sind Reinfektionen häufig (Bose und Banerjee, 2002; Henderson, 1987). Der Aufbau von PIV3 ähnelt dem von RSV und unterscheidet sich nur im HämagglutininNeuraminidase-Protein (HN), die als Oberflächenprotein anstelle des SH- und G-Proteins in die Membranhülle inseriert ist, sowie im Fehlen des M2-Proteins. Bei der Initiation der Infektion durch PIV3 kommt es zum Zusammenspiel des HN- mit dem F-Protein, wobei das HN-Protein die Anheftung an die Wirtszelle und das F-Protein die Fusion der zellulären mit der viralen Membran vermittelt (Chanock et al., 2001). Das HN-Protein erkennt dabei N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure)-Moleküle, die auf der Zelloberfläche Modifikationen von einer Vielzahl von Lipid- und Proteinkomponenten 12 Einleitung darstellen. Der spezifische Sialinsäure-enthaltende Rezeptor ist jedoch noch nicht bekannt. Das F-Protein induziert, wie bei RSV, die pH-unabhängige Fusion (Chanock et al., 2001; Lamb und Kolakofsky, 2001). Für HPIV3 ist bekannt, dass primär vornehmlich die zilientragenden Zellen des humanen respiratorischen Epithels von apikal infiziert werden. Dabei scheint die darauf folgende Zerstörung dieser Zellen maßgeblich zur Pathogenese des Pseudokrupps, der Bronchitis und Bronchiolitis, beizutragen (Zhang et al., 2005). Die Eintrittspforte für eine BPIV3 Infektion von Kälbern ist hingegen noch nicht identifiziert, worden. 1.3. Das Sendai-Virus Gemeinsam mit dem humanen Parainfluenzavirus Typ 1 (HPIV1), HPIV3 und BPIV3, ist das Sendai-Virus (SeV) in das Genus Respirovirus in der Unterfamilie Paramyxovirinae eingeordnet und gehört damit, wie RSV, zur Familie Paramyxoviridae (siehe Tabelle 1-1) (Chanock et al., 2001). Erstmals aus der Lunge eines an Pneumonie verstorbenen Kindes in der Stadt Sendai isoliert, wurde das Sendai-Virus zunächst für ein humanes Virus gehalten (Kuroya und Ishida, 1953). Später stellte sich jedoch heraus, dass es sich hierbei um ein murines Parainfluenzavirus, sehr ähnlich dem HPIV1, handelt. Insbesondere von der Infektion betroffen sind Mäuse, Ratten, Hamster und Meerschweinchen, so dass das SeV bei der Labortierhaltung eine große Rolle spielt (Abinanti, 1961; Parker et al., 1978). Tiere, die von der Infektion betroffen sind, leiden oft an chronischen Erkrankungen der Atemwege, die mit erschwerter Atmung, Niesen sowie Lustlosigkeit einhergeht und sich zu einer Rhinitis, Bronchitis und Bronchoalveolitis entwickeln kann (Heath, 1979; Percy und Palmer, 1997; Sparrow, 1980). In älteren Tieren jedoch verläuft die Infektion oft subklinisch. Das SeV ist genau wie BPIV3 aufgebaut und ähnelt, mit Ausnahme des Oberflächenproteins HN und den fehlenden G- und SH- sowie M2-Proteinen, RSV. Auch beim SeV erfolgt die Adsorption an sialinsäurehaltige Glykoproteine oder Glykolipide, die als zellulärer Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt werden, durch das HN-Protein (Scheid und Choppin, 1974a; 1974b). Die Penetration erfolgt daraufhin nach der vom F-Protein induzierten Fusion der Virus- mit der zellulären Plasmamembran (Wu et al., 1980). Die Spaltung des inaktiven Vorläuferproteins F0 erfolgt zuvor durch trypsinähnliche Proteasen, wie der Tryptase Clara in 13 Einleitung den Lungen von Mäusen, die nicht in allen Zellen vorkommen. In Zellkultur ist es daher notwendig, bei Infektionsversuchen mit SeV exogenes Trypsin dem Medium zuzufügen (Tashiro et al., 1992). Außerdem ist das HN-Protein essentiell für die Funktionalität des F-Proteins (Bousse et al., 1994). Aufgrund seiner Neuraminidase-Aktivität spielt das HNProtein auch bei der Freisetzung neuer Viren aus der infizierten Zelle eine Rolle. Endständige N-Acetyl-Neuraminsäurereste (Sialinsäuren) werden durch HN von den Rezeptormolekülen abgespalten, so dass die neu gebildeten Virionen sich von der Zelloberfläche lösen und weitere Zielzellen infizieren können (Scheid und Choppin, 1974b). In der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich ein rekombinantes SeV, welches das Fusionsproteins des HRSV exprimiert, eingesetzt. Es diente zur Identifizierung der zellulären Bindungspartner des HRSV F-Proteins (siehe 4.13.). Als Kontroll-Virus wurde das SeV-dsRed verwendet, bei dem anstelle des Gens für RSV-F das Gen für den Farbstoff dsRed eingebaut worden war. Dieser Farbstoff wird in der Natur von der Scheibenanemone Discosoma ssp. gebildet und beeinträchtigt nach der Expression im Zytoplasma die SeVInfektion nicht. 1.4. Das bovine Coronavirus Das bovine Coronavirus (BCoV) gehört zu der Familie Coronaviridae in der Ordnung Nidovirales. Im Genus Coronavirue, das sich in drei Verwandtschaftsgruppen unterteilt, ist BCoV ein Vertreter der Gruppe 2. Es enthält ein nicht-segmentiertes, einzelsträngiges, plusstrang-orientiertes RNA-Genom, das mit den Nukleokapsid-Proteinen zu einem helikalen Nukleokapsid komplexiert ist. Dieses wiederum ist von einer Membranhülle umgeben, in die das Oberflächen(surface)protein S und die Hämagglutinin-Esterase HE inseriert sind (Lai und Cavanagh, 1997). Das S-Protein vermittelt, in der Anfangsphase der Infektion, die Anheftung an die Oberfläche der Zielzelle. Zum einen ist die Bindung des S-Proteins an Sialinsäuren, im speziellen die N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure, essentiell und zum anderen an einen spezifischen Rezeptor, der für BCoV jedoch noch nicht identifiziert werden konnte. Weiterhin leitet es die Fusion der Virusmembran mit der zellulären Plasmamembran ein, so dass das Virusgenom in 14 die Zelle eingeschleust werden kann. Einleitung Das HE-Protein weist eine Rezeptor-zerstörende Eigenschaft auf, die auf einer 9-O-Acetylesterase-Aktivität beruht (Herrler et al., 1991; Schultze et al., 1991a; 1991b). Trotz der Bindungsaffinität zu Neu5,9Ac2, die jedoch geringer ausfällt als beim S-Protein, wird spekuliert, dass nicht die Bindung an die Wirtszelle, sondern die Inaktivierung der Rezeptor-Determinante Neu5,9Ac2, Aufgabe des HE-Proteins ist. Somit wird die Ausbreitung der Viren erleichtert, da sich keine Virusaggregate an der Zelloberfläche bilden können (Kunkel und Herrler, 1993; Vlasak et al., 1988). BCoV hat einen Tropismus sowohl für das intestinale als auch für das respiratorische Epithel entwickelt. Eine Infektion ist am häufigsten assoziiert mit einer Diarrhö, es kann aber auch zu einer Erkrankung des Respirationstrakts von neugeborenen Kälbern kommen (Clark, 1993). Die Transmission erfolgt dabei fäkal-oral oder aerogen über Tröpfcheninfektion, so dass sowohl der Intestinaltrakt als auch der Respirationstrakt die Eintrittstpforte für das Virus darstellen. BCoV repliziert dabei zum einen in Enterozyten des Dünndarms sowie Kolons, zum anderen im Epithel des oberen Respirationstrakts (Saif et al., 1986). Außerdem ist bekannt, dass BCoV auf Filtern gewachsene polarisierte MDCK I Zellen über die apikale und nicht die basolaterale Membran infiziert (Lin et al., 1997; Schultze et al., 1996). Wie auch bei anderen bovinen respiratorischen Viren sind Risikofaktoren für eine Infektion mit BCoV diskutiert worden. Dabei spielen besonders Stressfaktoren wie Futterwechsel, enge Haltung, Laktation, kalte Temperaturen sowie große Temperaturschwankungen eine wichtige Rolle (Campbell und Cookingham, 1978; White et al., 1989). Aber auch der Immunstatus der Tiere und Infektionen mit anderen Erregern können Einfluss auf eine Infektion nehmen. In Hinblick auf den bovine respiratory disease complex (BRDC) ist die Rolle der bovinen Coronaviren für das Krankheitsgeschehen jedoch noch strittig. 1.5. Das bovine Herpesvirus Typ 1 Auch bekannt unter dem Namen „Virus der infektiösen Rhinotracheitis des Rindes“ (IBR) gehört das bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) zur Familie Herpesviridae. Es handelt sich somit um ein relativ großes Virus (150-200 nm) mit mehr als 30 Strukturproteinen, die auf einem doppelsträngigen DNA-Genom codiert sind. Weiter ist BHV-1 eingeordnet in die 15 Einleitung Unterfamilie der -Herpesvieren und dort Vertreter des Genus Varicellovirus (Roizman und Knipe, 2001). Eine BHV-1 Infektion äußert sich hauptsächlich durch respiratorische Erkrankungen bei Jungtieren, die in erster Linie subklinisch verlaufen, aber auch der Grund für schwerere Krankheitsverläufe sein können. Die Morbidität liegt bei nahezu 100%, wobei die Mortalität, besonders wenn Komplikationen auftreten, 10% erreichen kann. Zudem wurden Schleimhauterkrankungen der Genitalien beschrieben, die von Subtypen des BHV-1 verursacht werden. Die Übertragung erfolgt aerogen durch Tröpfcheninfektion oder durch den direkten Kontakt der Tiere (Engels et al., 1981; Tikoo et al., 1995). Die durch BHV-1 induzierte Immunsuppression unterstützt häufig den BRDC (siehe Tabelle 1-2), an dem auch andere Erreger beteiligt sind (Carter et al., 1989). So treten oft Sekundärinfektionen mit Bakterien wie z.B. Pasteurella haemolytica oder P. multocida auf, die daraufhin ihrerseits eine Lungenentzündung verursachen können (Griebel et al., 1987a; 1987b). Histopathologisch lassen sich epitheliare Läsionen sowie ein Verlust des zilientragenden Epithels über den gesamten Respirationstrakt nachweisen (Nelson et al., 1972; Shroyer und Easterday, 1968). Die Eintrittspforte und auch der zelluläre Rezeptor für BHV-1 sind noch nicht bekannt. In vitro Studien zeigen jedoch, dass BHV-1 in der Lage ist, an Heparin zu binden (Byrne et al., 1995). Infolge der akuten Infektion, etabliert BHV-1 die Viruslatenz in sensorischen Ganglien (Trigeminusganglion, Medulla oblongata), während der keine infektiösen Virionen produziert werden (Ackermann et al., 1982). Bei immunsuppressiver Einwirkung kann die Infektion reaktiviert werden. Es kommt daraufhin zur erneuten Ausscheidung des Virus und in manchen Fällen wieder zur Erkrankung des Tieres (Thiry et al., 1987). 1.6. Polarisierter Viruseintritt in Epithelzellen Viren benötigen aufgrund ihrer Eigenschaft als obligater, intrazellulärer Parasiten zur Replikation und Weitergabe ihres Virusgenoms bestimmte Wirtszellen. Diese werden vom Einleitung 16 Virus über zelluläre Rezeptoren auf der Plasmamembran erkannt und spezifisch über virale Oberflächenproteine gebunden. Bei Viren mit einer Membranhülle kommt es daraufhin entweder zur Verschmelzung der viralen mit der zellulären Membran oder, nach der rezeptorvermittelten Endozytose des Virus, mit der zellulären endosomalen Membran. Auf diese Weise gelingt es dem Virus, die Wirtszelle zu penetrieren und das Virusgenom ins Zytoplasma oder den Nukleus zu entlassen (Compans und Herrler, 2005). Epithelien bestehen aus einer ein- oder mehrreihigen Zellschicht, und können verschiedene Zelltypen aufweisen, von zilientragenden bis hin zu Mukus-produzierenden Zellen, wie z.B. im respiratorischen Epithel. Die einzelnen Zellen liegen in einem engen Zellverbund vor, der durch bestimmte Proteinkomponenten wie etwa tight junctions (Zonulae occludentes), aufrechterhalten wird. So kommt es zu einer polaren Ausrichtung des Epithels, durch welche sich bestimmte Membrandomänen funktionell voneinander unterscheiden lassen. Auf der Seite des Lumens befindet sich die apikale Membran, die somit eine natürliche Barriere des Organismus zur Umwelt darstellt. Dem inneren Milieu zugewandt ist die basolaterale Membran, durch welche die Zelle mit Nährstoffen versorgt werden kann. Zudem stehen die einzelnen Zellen des Epithels über diese Membran miteinander in Verbindung, so dass ein Kommunikationsaustausch der Zellen möglich ist. Die oben erwähnten tight junctions bringen die benachbarten Zellen in der Nähe des apikalen Bereichs in engen Kontakt zueinander. Sie verhindern auch das Vermischen der Membrankomponenten zwischen der apikalen und der basolateralen Seite (Tsukita et al., 2001). So kommt es, dass beide Membrandomänen eine unterschiedliche Zusammensetzungen an Proteinen und Lipiden aufweisen (Simons und Fuller, 1985). Durch die polare Ausrichtung der Zellen im Epithel werden frühe und späte Phasen der Infektion durch Viren beeinflusst. So spielt in der frühen Phase der Infektion die Präsenz und Verteilung bestimmter zellulärer Rezeptoren in der Plasmamembran eine große Rolle bei der Empfänglichkeit der Zelle gegenüber einer Infektion durch das Virus (Compans und Herrler, 2005). So ist es für Viren, die den Organismus über den Respirationstrakt oder den Gastrointestinaltrakt infizieren von großer Bedeutung, dass sich der zelluläre Rezeptor in der apikalen Membran befindet. Ein solches Virus, das die Infektion der Wirtszelle über die apikale Membran einleitet, indem es an oberflächen-gebundene Sialinsäuren bindet, ist z.B. das humane Parainfluenzavirus Typ 3 (Zhang et al., 2005). Einleitung 17 Auf der anderen Seite existieren auch Viren, die die Wirtszelle vorwiegend über die basolaterale Membrandomäne infizieren, wie z.B. das Herpes Simplex-Virus (HSV) oder das Virus der vesikulären Stomatitis (VSV). Wie solche Viren die epitheliare Barriere überwinden, ist noch Gegenstand der Forschung (Fuller et al., 1984; Schelhaas et al., 2003). 1.7. Das Hitzeschockprotein gp96 Neben den oben beschriebenen Viren spielt bei der vorliegenden Arbeit auch das Hitzeschock-Protein gp96 eine Rolle. Deshalb wird es hier kurz vorgestellt. Proteine unterliegen bestimmten Faltungprozessen, um nach der Translation die funktionelle Form einzunehmen. Die korrekte Protein-Faltung wird von so genannten molekularen Chaperonen unterstützt. Diese umfassen eine Vielzahl von hochkonservierten Proteinfamilien, die sowohl im Zytosol, als auch im ER und in den Mitochondrien vorkommen und mit 1-2%, die häufigsten zellulären Proteine darstellen (Bukau et al., 2000; Csermely et al., 1998). Neben ihrer Funktion in der Protein-Faltung, gehören auch die Bindung und Stabilisierung instabiler Konformationen anderer zellulärer Proteine zu ihren Aufgaben, wobei sie die Renaturierung dieser Proteine erleichtern. Sie verhindern somit die Aggregation zellulärer Proteine oder initiieren den proteolytischen Abbau bei irreparabler Schädigung (Hartl, 1996). Viele Chaperone sind zudem stressinduzierbar. In solchen Stresssituationen, wie z.B. Hitze, Glukosemangel oder Virusinfektionen, ist der korrekte Ablauf zellulärer Mechanismen gefährdet und die Denaturierung oder Degradation von Polypeptiden kann die Folge sein. Die Synthese bestimmter Chaperone wird in diesen Situationen induziert bzw. erhöht, weshalb diese auch als Hitzeschockproteine (Hsp) bezeichnet werden (Lindquist, 1986). Hitzeschockproteine werden nach ihrem Molekulargewicht in verschiedene Familien unterteilt. Mit am besten untersucht und immunologisch relevant ist die Hsp90-Familie, zu welcher auch das Glykoprotein 96 (gp96), auch bekannt unter dem Namen Glukoseregulierendes Protein grp94, zählt. Es besitzt ein Molekulargewicht von 94-96 kDa, sowie eine 47%-ige Homologie zu zytosolischem Hsp90. Die Homologie von humanem bzw. murinem gp96 zu Xenopus laevis beträgt 75% (Gupta, 1995; Robert et al., 2001). Einleitung 18 Lokalisiert ist gp96 hauptsächlich im ER, da es eine carboxyterminale Signalsequenz, das KDEL-Motiv, besitzt, welche als Retentionssignal fungiert (Altmeyer et al., 1996). Geringere Mengen an gp96 findet man aber auch an der Zelloberfläche verschiedener Zellen (Robert et al., 1999). Da es noch keine Röntgen-Kristallstruktur von gp96 gibt, konnten bisher nur indirekt Rückschlüsse auf Struktur und Funktion von gp96 gezogen werden. Dabei geht man von der bekannten Struktur der hoch konservierten Hsp90-Familie aus (Qu et al., 1994). Demnach ist es gp96 wahrscheinlich möglich zu dimerisieren, wodurch eine Peptidbindungstasche entsteht, in welcher Peptide von ca. neun AS aufgenommen werden können. Eine solche Peptidbindungstasche konnte bereits am C-Terminus des Proteins detektiert werden (Linderoth et al., 2000). Elektronenmikroskopische Untersuchungen mit Gold-markiertem Hsp70 und gp96 zeigen, dass diese spezifisch an Clathrin-reiche Oberflächenregionen (clathrin coated pits) von Makrophagen und Monozyten binden. Zudem konnte die spezifische Bindung von gp96 auf antigenpräsentierenden Zellen wie Makrophagen, B-Zellen und dendritischen Zellen (DCs) gezeigt werden (Arnold-Schild et al., 1999). Als erster Rezeptor für gp96 an der Zelloberfläche konnte, durch cross-linking Versuche von gp96 mit Plasmamembranfraktionen von Makrophagen sowie anschließender Sequenzierung der gebundenen Proteine, CD91 identifiziert werden. CD91 ist bekannt als Rezeptor für -Makroglobulin, low density lipoprotein (LDL) und zudem involviert in die Rezeptorvermittelte Endozytose (Binder et al., 2000). Des Weiteren wurden TLR 2 und 4 als potentielle Rezeptoren für gp96 identifiziert. In DCs kommt es dabei durch die Bindung von gp96 zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFanschließend jedoch nur, wenn Gp96 endozytiert wird (Vabulas et al., 2002). In jüngsten Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass gp96 selbst als eine Art Rezeptor fungieren kann. So erleichtert gp96 als Plasmamembran gebundenes Protein über eine direkte Interaktion den zellulären Eintritt des Clostridium difficile-Toxins A (TxA) (Na et al., 2008). 19 Zielsetzung 2. Zielsetzung Ziel dieser Arbeit ist es, die initiale Phase der Infektion durch das respiratorische Synzytialvirus an respiratorischen Epithelzellen von der zellulären Seite aus zu untersuchen. Um hierbei die Bedeutung des F-Proteins für die Interaktion von RSV mit den primären Zielzellen zu analysieren, soll zudem der Interaktionspartner des F-Proteins identifiziert und charakterisiert werden. Die Untersuchungen werden in erster Linie im bovinen System an den Zielzellen, also primären Zellen des respiratorischen Epithels, durchgeführt. Dazu stehen zwei Kultursysteme primärer respiratorischer Epithelzellen (BAEC) zur Verfügung: das „Air-liquid interface (ALI)-System“, in dem die respiratorischen Epithelzellen bis hin zur Zilienbildung enddifferenzieren, und die Lungenpräzisionsschnitte (PCLS; presicion-cut lung slices), zur Untersuchung der Interaktion von BRSV mit respiratorischen Epithelzellen in der originalen Gewebeverteilung. Beide Systeme sind bei anderen Spezies (Mensch, Maus) etabliert, wurden bislang aber noch nicht bei der Rinderlunge verwendet. Auf zellulärer Ebene soll somit beantwortet werden, welche Zellen aus dem respiratorischen Epithel von BRSV primär infiziert werden. Für HRSV stellte sich heraus, dass die Infektion vornehmlich zilientragende Zellen betrifft (Zhang et al., 2002). Weiter soll in Bindungsanalysen der zelluläre Bindungspartner des HRSV F-Proteins identifiziert werden. Für die Bindungstests isolierte zelluläre Membranproteine, die anschließend auf Nitrozellulose immobilisiert vorliegen, werden mit F-haltigem Virus inkubiert. Ein Zellprotein, an welches das Virus bindet, wird dann als Interaktionspartner von HRSV-F angesehen. Die auf diese Weise detektierten Proteinbanden können aus SDS-Gelen ausgeschnitten und zur Bestimmung der Proteinsequenzen mittels Massenspektrometrie eingesetzt werden. Wenn bei diesem Protein geklärt werden kann, ob es sich dabei um den Rezeptor von HRSV handelt, lässt sich dann untersuchen, ob der Rezeptor den Tropismus von RSV bestimmt. 20 Material 3. Material 3.1. Zelllinien 16 HBE14o- Humane Bronchialepithelzellen; Dr. Gruenert, Human Molecular Genetics Unit, Department of Medicine, University of Vermont, Burlington, USA BHK-21 Baby hamster kidney cells; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig Vero Permanente Zelllinie aus Nierenepithel der grünen Meerkatze; American Type Culture Collection (ATCC) FKN Fetale Kälbernierenzellen; Jutta Pipereit, Institut für Virologie, Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover MDBK Madin-Darby bovine kidney cells; Wolfgang Garten, Philipps-Universität Marburg KOP-R primäre Zelllinie aus bovinem Oropharynxgewebe; No RIE 244, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, NHBE primäre Zellen aus dem bronchialen Epithel humaner Lungen Cambrex, Walkersville, Maryland, USA Material 21 3.2. Zellkulturmedien Eagle´s Minimum Essential Medium (EMEM) Gibco BRL, Karlsruhe Dulbecco´s modified Eagle Medium (EDULB) Gibco BRL, Karlsruhe EDULB, Magnesium- und Calcium-frei Gibco BRL, Karlsruhe HAM´s F12 Medium Biochrom, Hamburg Medium 199 1x mit Hank´s Salzen Biochrom RPMI 1640 Medium Gibco BRL, Karlsruhe PBSM/ PBS Gibco BRL, Karlsruhe Fetales Kälberserum (FKS) Biochrom, Hamburg ® Ultroser G PALL Life Science, New York Versen-Trypsin 0,125% Gibco BRL, Karlsruhe Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe 3.3. Antibiotika, -mycotika Penicillin-Streptomycin Gibco BRL, Karlsruhe Kanamycin Roth, Karlsruhe Enrofloxacin Bayer, Leverkusen Amphoterizin B aus Streptomyces Sigma, Deisenhofen Chlotrimazol Sigma, Deisenhofen 3.4. Viren Humanes respiratorisches Synzytialvirus Stamm A2, (HRSV-A2) Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton, Großbritannien Humanes respiratorisches Synzytialvirus Stamm Long, (HRSV-Long) H.- Jürgen Streckert, Ruhr-Universität Bochum, Deutschland 22 Material Rekombinante Sendai-Viren (SeV/dsRed, SeV-hF, SeV/L-GFP) Stamm Fushimi Wolfgang Neubert, Max-Planck-Institut für Biochemie, Molekulare Virologie, Martinsried, Deutschland Rekombinantes bovines respiratorisches Synzytialvirus (BRSVwt) Karl-Klaus Conzelmann, Max-von-Pettenkofer-Institut, München Bovines respiratorisches Synzytialvirus (BRSV) Stamm ATue51908 Karl-Klaus Conzelmann, Max-von-Pettenkofer-Institut, München Zur Konstruktion des GFP-exprimierenden rekombinanten BRSV (BRSV-GFP) wurde eine Klonierungskassette, welche den offenen Leserahmen für GFP enthielt, mittels PCR generiert. Die GFP-Kassette wurde über eine Not1-Restriktionsstelle in das BRSVAntigenom inseriert, oberhalb des NS1 Gens am 5’ terminalen Ende. Diese Arbeit wurde im Vorfeld von Frau Dr. Wiebke Köhl durchgeführt. Bovines respiratorisches Synzytialvirus, pathogener Stamm, Snook (BRSV-SNK) Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton, Großbritannien Bovines Parainfluenzavirus Typ 3 (BPIV3) Friedrich-Loeffler-Institut (Insel Riems, Deutschland) Bovines Herpesvirus Typ 1 GFP (BHV-1/GFP) Günther M. Keil, Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut (Insel Riems, Deutschland) Material 23 3.5. Antikörper 3.5.1. Primäre Antikörper Antikörper Ursprung Verdünnung Anhang Quelle Anti-BPIV3, Ziege IgG, polyklonal 1:200 - VMDR Anti-Cytokeratin human Anti-RSV 18G6 Maus IgG, monoklonal (Clone LP 34) Maus IgG, Serum 1:100 - 1:25 - Anti-RSV F-Protein Maus IgG, monoklonal 1:200 - Dako Hamburg Dr. Zimmer TiHo Hannover Serotec Anti- -Tubulin Maus IgG, monoklonal 1:500 Cy3 Sigma Anti-Mucin-5AC, human Anti-ZO-1, human Maus IgG1 1:20 - Acris Ratte IgG, monoklonal 1:100 - Chemicon 3.5.2. Sekundäre Antikörper Antikörper Ursprung Verdünnung Anhang Quelle Anti-Maus IgG Kaninchen IgG 1:500 HRP Dako Anti-Maus IgG Ziege IgG 1:200 FITC Sigma Anti-Ziege IgG Kaninchen IgG 1:200 FITC Sigma Anit-Ziege IgG Kaninchen IgG 1:500 HRP Dako Anti-Ratte IgG Ziege IgG 1:200 FITC Sigma 3.6. Substrate Super Signal® West Maximum Sensitivity Substrate Pierce Rockford, USA Material 24 3.7. Kit BCA Protein Assay Pierce Live/Dead mammalian Viability/Cytotoxicity assay kit Fluo Probes 3.8. Vergleichsproteine PageRuler Prestained Protein Ladder MBI-Fermentas, St. Leon-Rot 3.9. Chemikalien ACE Sigma, Deisenhofen Aceton Roth, Karlsruhe Acetliertes Trypsin (bovine Pankreas) Sigma, Deisenhof Acrylamidlösung 30% „rotiphorese® Gel 30“ Roth, Karlsruhe agarose LM GQT GERBU, Gaiberg APS Bio-Rad, München Blocking-Reagenz Roche, Mannheim Bovines Serumalbumin Roth, Karlsruhe Bromphenolblau Merck, Darmstadt Calciumchlorid Roth, Karlsruhe Complete, Proteinaseinhibitorcocktail Roche, Mannheim Coomassie-Briliantblau Merck, Darmstadt DABCO Sigma, Deisenhofen DAPI (4-6-Diamidino-2-Phenylindol-Di-Hydrochlorid) Sigma, Deisenhofen Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt DNase I (bovine Pancreas) Roche, Mannheim DTT (1,4-Dithiotreitol) Roth, Karlsruhe EDTA Roth, Karlsruhe EGTA Roth, Karlsruhe Essigsäure Roth, Karlsruhe Material 25 Ethanol Merck, Darmstadt Glucose Roth, Karlsruhe Glycerin Roth, Karlsruhe Glycin Roth, Karlsruhe Kaliumchlorid Merck, Darmstadt Kaliumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe Metacholin (Acetyl- -Methylcholinchlorid) Sigma, Deisenhof Methanol Roth, Karlsruhe Methylzellulose Sigma, Deisenhofen Mowiol 4-88 Calbiochem, Heidelberg Natriumacetat Merck, Darmstadt Natriumchlorid Roth, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth, Karlsruhe Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth, Karlsruhe 2-Propanol (Isopropanol) Roth, Karlsruhe Paraformaldehyd Sigma, Deisenhofen Protease IVX, aus boviner Pankreas Sigma, Deisenhofen Rubidiumchlorid Merck, Darmstadt Tris-Hydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth, Karlsruhe Triton-X-100 Roth, Karlsruhe Tween 20 Roth, Karlsruhe Wasserstoffperoxid Merck, Darmstadt Material 26 3.10. Medien, Puffer und Lösungen 3.10.1. Polyacrylamidgel-Elektrophorese SDS-Laufpuffer (10x) SDS 10,0 g TRIS 30,0 g Glycin 144,0 g H2O ad 1 l Sammelgel (2 ml-Ansatz) H2O 1,4 ml TRIS/HCl (1M) pH 6,8 0,25 ml Acrylamidlösung 30% 0,33 ml SDS 10% (in H2O) 20 l APS 10% (in H2O) 20 l TEMED 2 l Trenngel (10% ; 5 ml-Ansatz) H2O 2,0 ml TRIS/ HCl (1,5 M) pH 8,8 1,3 ml Acrylamidlösung 30% 1,7 ml SDS 10% (in H2O) 50 l APS 10% (in H2O) 50 l TEMED 4 l Coomassi-Färbelösung Coomassie-Brilliantblau 0,5 g Ethanol 200 ml Essigsäure (konz.) 50 ml H2O 250 ml Material 27 SDS-Probenpuffer (2x) 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 10 ml 10% SDS 20 ml Glycerin 10 ml H2O 9 ml 2% Bromphenolblau (20 mg/ml in H2O) 3.10.2. Westernblot Anoden-Puffer I (pH 9,0) 1M Tris 300 ml H2O 500 ml Ethanol 200 ml pH-Wert mit HCl einstellen Anoden-Puffer II (pH 7,4) 1M Tris 25 ml H2O 770 ml Ethanol 200 ml pH-Wert mit HCl einstellen Kathoden-Puffer (pH 9,0) 1M Tris 25 ml Aminocapronsäure 5,25 g H2O 770 ml Ethanol 200 ml pH-Wert mit HCl einstellen Material 28 3.10.3 Zellkultur und Molekularbiologie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS) NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g MgCl2 x 6H2O 0,1 g CaCl2 x 2H2O 1,3 g H2O ad 1 l PBS ohne Calcium und Magnesium pH 7,2 (PBSM) NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g H2O ad 1 l PBSM/0,1%-Tween PBSM 2l Tween-20 2 ml Methylzellulose EMEM 500 ml Penicillin-Streptomycin 100 mg/l Methylzellulose 0,8% (w/v) FKS 3% (v/v) Inkubationsmedium (bovine Bronchien) EMEM 500 ml Penicillin-Streptomycin 100 mg/l Kanamycin 50 mg/l Material 29 Enrofoxacin 10 mg/l Amphotericin B 2,5 mg/l Clotrimazol 1 mg/l DNase I 10 mg/l DTT 500 mg/l Digestionsmedium (bovine Bronchien) Inkubationsmedium 500 ml Protease IVX 0,1% Air-liquid interface Medium Edulb 490 ml Ham`s F12 490 ml Penicillin-Streptomycin 100 mg/l Kanamycin 50 mg/l Enrofoxacin 10 mg/l Amphotericin B 2,5 mg/l Clotrimazol 1 mg/l 3.10.4 Membranproteinisolierung TRIS-Puffer TRIS-HCl pH 7,4 10 mM EDTA 1 mM (Proteaseinhibitoren) Complete 1 Tablette/40 ml Material 30 3.10.5 SeV-Anzucht Acetyliertes Trypsin 1 mg in 1 ml Medium (DMEM) ohne FCS Sterilfiltrieren, aliquotieren, lagern bei -20°C 3.10.6 Immunfluoreszenz DAPI DAPI 1 mg/ml in H2O Mowiol Eindeckelmedium Mowiol 2,5 g Glycerol 6g H2O 6 ml 0,2 M TRIS (pH8,5) 12 ml DABCO Endkonz. 2,5% Aliquotieren, lagern bei –20°C 3.10.7 Immunoplaquetest Methylzellulose sterile Methylzellulose (4.000 Centipoisens)2 g DMEM mit 2% FKS und Antibiotika 250 ml Unter Rühren bei 4°C lösen (ca. 2 Tage) ACE-Stocklösung 3-Amino-9-Ethylcarbazol 2 mg Dimethylformamid 300 ml Material 31 AEC-Gebrauchslösung Natriumacetatpuffer 50 mM (pH 5,0) 5 ml AEC-Stocklösung 300 l 3% H2O2 50 l 3.11 Geräte Inverses Mikroskop Leitz, Wetzlar Krumdieck Tissue Slicer MD 4000-01, TSE Systems Bad Homburg 8mm Tissue Coring Tool, TSE Systems Bad Homburg Dispergiergerät ULTRA-TURRAX® Janke & Kunkel (Potter) Staufen Fluoreszenzmikroskop Axiophot Zeiss, Göttingen Spektral und konfokales Multiphoton System Leica DM IBRE + LEICA TCS SP2 Leica Microsystems, Heidelberg Ohm-Meter (Millicell®ers) Millipore, Schwalbach 3.12 Zellkulturmaterial Gewebekulturflaschen, 25 cm2 Nunc, Wiesbaden Gewebekulturflaschen, 75 cm2 Nunc, Wiesbaden 96-Napf-Platten Nunc, Wiesbaden 96-Napf-Platten Costar, Bodenheim 24-Napf-Platten Greiner, Nürtingen Transwell® Filtersysteme, 0,4 m Greiner, Nürtingen Methoden 32 4. Methoden 4.1. Zellkulturen Die Kultivierung der verschiedenen Zellkulturen fand in 75 cm2-Zellkulturflaschen bei 37°C und 5% CO2 statt. Zur Passagierung, die alle drei bis vier Tage erfolgte, wurde das Medium abgenommen, die Zellen einmal mit Trypsin/EDTA gewaschen und mit 1 ml Trypsin/EDTA inkubiert. Nach dem Ablösen der Zellen wurde die Trypsinierung durch die Zugabe von 1 ml fetalem Kälberserum (FCS) gestoppt. Die Suspension wurde in 9 ml des jeweiligen Mediums mit fetalem Kälberserum resuspendiert und die Zellen im Verhältnis 1:20 bis 1:50 passagiert. Eine Ausnahme bildeten die KOP-R Zellen, die lediglich alle 14 Tage im Verhältnis von maximal 1:4 passagiert wurden. Tabelle 4-1: Eingesetzte Zellkulturen Zelllinie Zellkulturmedium BHK 21 EMEM HBE Ham’s F12 :EDULB (1:1) Vero Kälberserum Antibiotika, -mycotika 5% Pen/Strep 10% Pen/Strep EDULB 5% Pen/Strep MDBK EDULB 10% Pen/Strep KOP-R EDULB 10% - FKN EDULB 5% - BAEC AEGM 10% Pen/Strep, Enrofloxacin, Kanamycin, Amphoterizin B, Clotrimazol 33 Methoden 4.1.1. Anlegen von Gefrierkulturen Zur Lagerung und Konservierung der verschiedenen Zelllinien sowie der primären BAEC wurden –80°C Gefrierkulturen angelegt. In einer 75cm²-Zellkulturflasche konfluent gewachsene Zellen wurden abtrypsiniert und in 9 ml des entsprechenden Mediums mit FCS aufgenommen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 rpm für 10 min pelletiert und, nach Verwerfen des Überstandes, in 3 ml Einfriermedium resuspendiert. Dieses bestand aus dem jeweiligen Medium, das zuvor mit 10% FKS und 10% Glycerin versetzt worden war. Anschließend erfolgte das Einfrieren der Zellen in 1 ml Aliquots bei –80°C. Zum Verwenden der Gefrierkulturen wurden diese bei 37°C im Wasserbad aufgetaut, in 15 ml des entsprechenden Mediums resuspendiert und unter den angegebenen Bedingungen in 75cm2-Zellkulturflaschen kultiviert. 4.1.2. DAPI-Test Alle zwei bis vier Wochen wurden die Zellkulturen mittels DAPI-Test auf Mycoplasmen untersucht. Dazu wurden die Zellen am Vortag dünn auf Deckgläschen ausgesät. Nach dem Waschen mit PBS folgte eine 15 min -Lösung (1:1000 in Ethanol) pro Deckgläschen. Schließlich wurden die Zellen zweimal mit destilliertem H20 gewaschen und mit einem Tropfen Mowiol auf einem Objektträger fixiert. Über Fluoreszenzmikroskopie wurden die Zellen auf evtl. vorhandene Mycoplasmen untersucht. Zusätzlich zum DAPI-Test wurden die Zellen alle zwei Monate einem Mycoplasmen- ELISA (Firma Roche) unterzogen, wobei nach Hersteller-Angaben verfahren wurde. Alle auf Mycoplasmen positiv getesteten Zellen wurden entsorgt. 34 Methoden 4.2. Primäre Zellkulturen 4.2.1. NHBE-Zellen Diese primären Zellen aus dem bronchialen Epithel humaner Lungen wurden in 75cm2Zellkulturflaschen mit AEGM ohne Serum kultiviert. Die Passagierung der Zellen fand ein Mal pro Woche bei einer Konfluenz von 60-80% im Verhältnis 1:4 statt. Aufgrund des fehlenden Serums musste das Trypsin/EDTA mittels eines Zentrifugationsschritts (1000 rpm; 10 min) von den Zellen entfernt, und diese in serumfreiem AEGM resuspendiert werden. Die maximale Anzahl der Passagen lag bei zehn. Alle 2 Tage erhielten die Zellen einen Mediumwechsel. 4.2.2 Isolation boviner respiratorischer Epithelzellen Zunächst wurden die Hauptbronchien mit einem Skalpell frei präpariert, jeweils in einem Stück aus der Lunge entnommen und in Bechergläser mit steriler PBS überführt. Unter der Sterilbank wurden sie anschließend gründlich vom umgebenden Binde- und Lungengewebe befreit. Nach zweimaligem Waschen wurden die Hauptbronchien in sterile Bechergläser gegeben und mit Inkubationsmedium überschichtet. Die Inkubation erfolgte bis zum Folgetag bei 4°C. Um die respiratorischen Epithelzellen später leicht isolieren zu können, wurden die Hauptbronchien einem Proteaseverdau unterzogen. Dazu wurden diese in sterile Bechergläser mit Digestionsmedium überführt und ein weiteres Mal über Nacht bei 4°C inkubiert. Zur Isolation der BAEC erfolgte als erstes die longitudinale Eröffnung der zuvor in PBS gewaschenen Hauptbronchien. Mit dem Skalpell wurde dann die luminale Seite drei bis vier Mal abgeschabt und die dadurch isolierten Zellen in 45 ml steriler PBS resuspendiert. Nach der Zentrifugation der Zellen für 10 min bei 1000 rpm wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 5 ml airway epithelial cell growth medium (AEGM) resuspendiert. Zur besseren Auftrennung wurde die Zellsuspension anschließend durch ein Zellsieb gefiltert und auf drei 75cm2-Zellkulturflaschen aufgeteilt. Diese wurden mit jeweils 15 ml AEGM 35 Methoden beschickt und bis zum Mediumwechsel am Folgetag bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. 4.2.3 Air-liquid interface (ALI)-Kulturen Die In-vitro-Kultivierung differenzierter respiratorischer Epithelzellen auf kollagenisierten, mikroporösen Zellkultureinsätzen wurde auf der Basis eines im humanen System bereits beschrieben Protokolls durchgeführt (Bals et al., 2004). Am Vortag wurden die Filterkultureinsätze zur Kollagenisierung mit 100 µl Kollagen-Lösung beschickt und über Nacht im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die BAEC aus den 75cm2-Zellkulturflaschen wurden bei Erreichen einer Konfluenz von höchstens 80% wie beschrieben trypsiniert und in einem Zentrifugationsschritt mit 1000 rpm für 10 min pelletiert. Daraufhin wurden die Zellen in AEGM resuspendiert und mit einer Zellzahl von 2,5 x 105 Zellen pro Filtereinsatz in einem Volumen von jeweils 250 µl auf die zuvor für 10 min mit AEGM befeuchteten Membranen der Filtereinsätze ausgesät. Die unteren Kammern wurden mit 750 µl AEGM pro Vertiefung befüllt und die Zellen von nun an im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Der Mediumwechsel erfolgte alle zwei Tage, wobei am ersten Tag nach dem Aussäen die Zellen zuvor ein Mal apikal mit PBS gewaschen wurden, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Nach etwa fünf Tagen, bei Erreichen einer 100%-igen Konfluenz der Zellen, kam es zur Induktion der ALIBedingungen. Dazu wurde das Medium in der unteren Kammer gegen ALI-Medium ausgetauscht. Die Zellen wurden in der oberen Kammer ein Mal mit PBS gewaschen und von diesem Zeitpunkt an apikal nicht mehr mit Medium versorgt, sondern unter „Belüftung“ kultiviert (siehe Abb. 4-1). Auch hier erfolgte der Mediumwechsel, jedoch nur basal, alle zwei Tage. Nach etwa zwei bis drei Wochen war die Ausdifferenzierung des Epithels, aufgrund des Zilienschlags einiger Zellen, bereits mikroskopisch auszumachen. 36 Methoden 4.2.4. Lungenpräzisionsschnitte (PCLS; presicion-cut lung slices) Als Basis für die Anfertigung der PCLS wurde ein im equinen System etabliertes Protokoll genutzt (Vietmeier et al., 2007). Die Entnahme der Rinderlungen wurde vom Schlachtbetrieb durchgeführt, so dass im ersten Schritt der lobus accessorius vorsichtig mit dem Skalpell herauspräpariert werden konnte. Dabei war darauf zu achten, dass die das Lungengewebe umgebende Pleura nicht verletzt wurde. Um später Gewebeschnitte herstellen zu können, musste das weiche und elastische Lungengewebe des Lobus zunächst verhärtet werden. Dies wurde durch die Befüllung des Lobus mit einer low-melting point-Agarose mittels einer Knopfkanüle über den durch die Entnahme angeschnitten Bronchus erreicht. Diese spezielle Agarose, die mit einer Endkonzentration von 1,5% in RPMI-Medium gelöst wurde, war bereits bei 37°C flüssig und verfestigte sich langsam wieder bei RT. Dadurch konnten höhere Temperaturen und damit verbundene Gewebeschäden vermieden werden. Nach einer Inkubation des Lungenlappens für 30 min auf Eis, um die Aushärtung der Agarose zu beschleunigen, wurden ca. 0,5 cm dicke Lungenscheiben, in deren Anschnitt die Bronchioli zu sehen waren, senkrecht zum Verlauf der Atemwege präpariert. Aus diesen wurden dann zylindrische Gewebezylinder, mit einem mittig gelegenen Bronchiolus, ausgestanzt, aus welchen mit Hilfe des Krumdieck Tissue Slicers PCLS mit einer Schnittdicke von ca. 300-500 µm erstellt wurden. Die Agarose wurde in den darauf folgenden sechs halbstündigen Waschschritten der PCLS in RPMI bei 37°C entfernt und diese dann über Nacht im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 gelagert. Am Tag darauf wurden die PCLS aufgrund ihrer Vitalität, die zunächst mikroskopisch über den Zilienschlag des respiratorischen Epithels im Bronchiolus ermittelt wurde, für die folgenden Versuche selektiert. Methoden 37 Apikale Filterkammer BAEC Epithelzellschicht Basale Filterkammer Abb. 4-1: Grafische Darstellung der ALI-Kultur von BAEC im Membranfiltersystem 4.2.5. Lebend-tot-Färbung Über die Messung zweier Zellvitalitätsparameter, der intrazellulären Esterase Aktivität und der Plasmamembran-Integrität, wurde, mittels des Live/Dead mammalian Viability/Cytotoxicity assay kit, die Vitalität der PCLS überprüft. Mit dem im Kit enthaltenen Calcein AM sowie Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) wurde dabei nach Herstellerangaben verfahren. 4.2.6. Bronchokonstriktion der PCLS Eine weitere Methode zur Überprüfung der Vitalität der PCLS ist die durch Metacholin hervorgerufene Bronchokonstriktion der glatten Muskulatur der Bronchioli. Zunächst wurde die Konzentrations-Wirkungsbeziehung, mit Hilfe des Einsetzens verschiedener MetacholinKonzentrationen, ermittelt. Dazu wurden PCLS mit jeweils 1 ml RPMI in eine 24-well Platte umgesetzt. Aus einer zuvor angesetzten Verdünnungsreihe, von 102 bis 108 mol/l Metacholin, wurden dann, mit der niedrigsten Konzentration beginnend, jeweils 10 µl der jeweiligen Methoden 38 Verdünnung zu den PCLS gegeben. Nach 5 min Inkubation wurde der Schritt mit der nächst höheren Konzentration wiederholt, bis die Bronchokonstriktion bei den Bronchioli einsetzte, die während des gesamten Versuchs mikroskopisch beobachtet wurde. Mit der ermittelten Konzentration wurde dann die Vitalität der PCLS aus verschiedenen Präparationen festgestellt. Um eine induzierte Bronchokonstriktion wieder aufzuheben, wurde ein Mediumwechsel mit frischem, Metacholin-freiem Medium durchgeführt und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, bis die Entspannung der glatten Muskulatur um den jeweiligen Bronchiolus eintrat. Die Fotos wurden mit einer Kamera, die die mikroskopische Ansicht bei einer Vergrößerung von 1:10 zeigte, gemacht. 4.3. Anzucht von Viren 4.3.1. Humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV) Die Virusvermehrung von HRSV-GFP fand auf HBE-Zellen statt. Dafür wurden 4,5 x 106 Zellen in eine 25cm²-Zellkulturflasche ausgesät. Zeitgleich wurden die Zellen mit einer MOI von 1 PFU/Zelle infiziert. Die infizierten Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank kultiviert. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel mit frischem Medium (5% FKS). Virus und Zellen wurden für weitere 2 Tage inkubiert. Zur Virusernte wurde der virushaltige Zellkulturüberstand mit 0,1 M MgSO4 und 0,05 M HEPES pH=7,4 (Endkonzentrationen) versetzt, abgenommen und zur Abtrennung der Zelltrümmer für 5 min bei 4°C und 1559 x g zentrifugiert. Das Virus wurde in 1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann bei -80°C gelagert. 4.3.2. Bovines respiratorische Synzytialvirus (BRSV) Für die Virusvermehrung von BRSV wurden FKN- oder MDBK-Zellen verwendet (Spilki et al., 2006). Am Vortag wurden die Zellen in eine 75cm2-Zellkulturflasche so ausgesät, dass ein zu 60% konfluenter Monolayer vorlag. Die Infektion fand mit einer MOI von 0,1 PFU/Zelle 39 Methoden statt. Nach dreistündiger Inkubation unter Schwenken bei 37°C und 5% CO2 wurde das Inoculum abgenommen und durch 13 ml des entsprechenden Mediums (5% FCS) ersetzt. Die folgende Inkubationszeit im Brutschrank betrug 4-6 Tage, bis ein deutlicher zytopathischer Effekt (CPE) zu erkennen war. Zur Virusernte wurde das Medium abgenommen und, um Zelltrümmer zu entfernen, bei 4000 rpm und 4°C für 15 min zentrifugiert. Der virushaltige Überstand wurde schließlich in 1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. 4.3.3. Bovines Parainfluenzavirus Typ 3 (BPIV3) Die Anzucht des BPIV3 erfolgte auf ähnlicher Weise, wie es oben für BRSV beschrieben ist. Der Unterschied bestand zum einen in der verwendeten Zelllinie, die in diesem Fall Kop-R Zellen darstellte. Zum anderen betrug die Inkubationszeit, bis zum Erreichen des deutlich zu erkennenden zytopathischen Effekts und der darauf folgenden Virusernte, hier 3-4 Tage. 4.3.4. Bovines Herpesvirus Typ 1/GFP (BHV-1/GFP) Die Anzucht des BHV-1/GFP erfolgte in ähnlicher Weise wie bei BRSV, einschließlich der Wirtszellen Kop-R. Hier betrug die Inkubationsdauer bis zum Erreichen des CPE und zur Ernte 2-3 Tage. 4.3.5. Rekombinante Sendai-Viren (SeV-L/GFP; SeV-hF; SeV-dsRed) Die Anzucht rekombinanter Sendai-Viren erfolgte auf Vero-Zellen, die am Vortag 1:5 in eine neue 75cm²-Kulturflasche ausgesät worden waren, so dass am nächsten Tag ein konfluenter Zellrasen vorlag. Dieser wurde zunächst dreimal mit EDULB ohne FKS gewaschen, bevor die Zellen mit einer MOI von 0,1 PFU/Zelle in einem Volumen von 3 ml EDULB infiziert wurden. Danach folgte eine schwenkende Inkubation für 2 h bei 37°C und 5% CO2 im Methoden 40 Brutschrank. Der Überstand wurde daraufhin abgenommen und durch 20 ml frisches Medium ohne FKS, und im Fall des SeV-L/GFP sowie SeV-dsRed mit 1 , ersetzt. Nach zwei Tagen, bei Auftreten eines starken CPE, erfolgte die Virusernte, wobei der virushaltige Zellkulturüberstand abgenommen und, zur Abtrennung der Zelltrümmer, für 5 min bei 4°C und 4000 rpm zentrifugiert wurde. Die vollständige Aktivierung des SeV-L/GFP wurde mit einer Zugabe von 5 folgenden Inkubation von 1 h bei 37°C erreicht. Danach wurde der Zellkulturüberstand mit 5% FKS versetzt, um das Trypsin zu inaktivieren und die Viren zu stabilisieren. Das Virus wurde in 1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert. 4.4. Virusreinigung mittels Dichtegradientenzentrifugation Am Vortag in 145mm-Zellkulturschalen ausgesäte und nun konfluent gewachsene VeroZellen, wurden mit einer MOI von 0,1 PFU/Zelle mit SeV-hF oder SeV-dsRed infiziert. Bei deutlichem CPE, nach üblicherweise zwei Tagen, wurde der virushaltige Zellkulturüberstand geerntet. Die Zelltrümmer wurden anschließend durch Zentrifugation bei 4000 rpm für 15 min bei 4°C pellettiert und verworfen. Aus dem Überstand wurden die Viruspartikel durch Ultrazentrifugation bei 25000 rpm (1 h; 4°C) sedimentiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde das virushaltige Pellet in PBSM resuspendiert. Zur Reinigung der Virussuspension über einen kontinuierlichen Saccharosegradienten (20–50% w/w) wurde dieser über ein 0,5 ml Kissen aus 60%-iger Saccharose geschichtet. Nach der Zentrifugation, die bei 36.000 rpm (3 h; 4°C) stattfand, wurde die entstandene Virusbande mit einer 1 ml Spritze (Kanüle 1,2 × 40) abgenommen und in PBSM verdünnt. Daraufhin wurde das Virus durch eine Zentrifugation bei ebenfalls 36.000 rpm (1 h; 4°C) pellettiert und in 100 µl PBSM aufgenommen. Die Lagerung von 10 µl Aliquots erfolgte bei Proteinkonzentrationsbestimmung fand durch Messungen im Photometer bei 280 nm statt. 41 Methoden 4.5. Plaquetest Die Quantifizierung der infektiösen Viruspartikel in der nach der Virusernte vorliegenden Suspension erfolgte mittels Plaquetest. Vero-Zellen wurden auf einer 24-well Platte mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 über Nacht im Brutschrank kultiviert. Von der Virussuspension wurde zur Bestimmung des Virustiters eine Verdünnungsreihe in 10er Schritten in EDULB angelegt (Doppelansatz). Nach dem Waschen der Zellen mit EDULB wurden jewe ünnungsstufen zugegeben und im Brutschrank für 1 h schwenkend inkubiert. Daraufhin wurde in jede Vertiefung 1 ml steriler Methylzellulose pipettiert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte für 3 Tage bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank. Nach dem Abnehmen der Methylzellulose und zweimaligem Waschen der Zellen mit PBS, wurden diese mit 3%-igem Paraformaldehyd fixiert (20 min bei RT). Danach wurden die Zellen zweimal mit 0,1 M Glycin-Lösung gewaschen, um das Paraformaldehyd wieder zu entfernen. Anschließend fand die Permeabilisierung der Zellen durch die Zugabe von 0,2% Triton-X-100 statt. Der erste Antikörper war gegen das RSV Matrix-Protein (mab 18G6) gerichtet und wurde vor der Verwendung 1:25 in PBS verdünnt. Pro Vertiefung wurde e örperverdünnung aufgetragen. Es erfolgte eine Inkubation von 1 h bei RT, nach welcher die Zellen drei Mal mit PBS gewaschen wurden. Der Peroxidase-gekoppelte Sekundärantikörper (Kaninchen Anti-MausHRP) wurde zunächst 1:500 in PBS verdünnt und anschließend für 1 h bei RT auf die Zellen gegeben. Wieder wurden die Zellen drei Mal mit PBS gewaschen. Anschließend fand die Zugabe des Substrats in Form von 300 µl/Vertiefung AEC statt. Die darauf folgende Inkubationszeit betrug 10 bis 15 min, bis das Substrat abgenommen und die Platte zweimal mit Leitungswasser gewaschen wurde. Schließlich wurden die gefärbten Plaques am Mikroskop ausgezählt und der Virustiter in plaque forming units pro ml (PFU/ml) angegeben. 42 Methoden 4.6. Virusinfektion von Zellkulturen 4.6.1. Infektion von Deckglaskulturen Für Infektionsstudien mit NHBE Zellen wurden sterile Deckgläschen in die Vertiefungen von 24-well Kulturplatten eingesetzt. Die Zellen wurden mit einer Zellzahl von 2 x 105 Zellen/ml auf die Deckgläschen ausgesät und mit jeweils 1 ml serumfreiem AEGM pro Vertiefung im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Am Folgetag wurden die Deckgläschen mit AEGM gewaschen, so dass nicht anhaftende Zellen entfernt werden konnten. Die Infektion mit HRSV bzw. BRSV wurde mit einer MOI von 0,1 durchgeführt, indem die entsprechende Menge Virus in einem Volumen von 200 µl/well resuspendiert und auf die Zellen pipettiert wurde. Nach der Infektion, die bei 37°C und 5% CO2 schwenkend im Brutschrank für 3 h erfolgte, wurde das Inoculum von den Zellen entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen (37°C; 5% CO2) wurden die Zellen auf den Deckgläschen vorsichtig drei Mal mit PBS gewaschen und die Infektion mittels Immunfluoreszenztest bzw. GFP-Expression detektiert. 4.6.2. Infektion von Filterkulturen Vor der Infektion der BAEC bzw. der auf Filtermembranen ausgesäten permanenten Zelllinien (Vero, MDBK und HBE) wurden diese gründlich, BAEC bis zu zehn Mal, um sezernierten Mukus von der Zelloberfläche des Epithels zu entfernen, mit steriler PBS gewaschen. Für die Infektion wurden 150 µl virale Suspension in die apikale Kammer appliziert und 2-3 h bei 37°C und 5% CO2 schwenkend im Brutschrank inkubiert. Nach dem Entfernen des Inoculums wurden die Zellen für weitere 2-3 Tage, im Fall der BAEC unter ALI-Bedingungen, bei den übrigen Zelllinien mit dem jeweiligen Medium ebenfalls in der oberen Kammer, kultiviert. Die Infektion wurde nach der Fixierung der Zellen mit 3% Paraformaldehyd, mittels Immunfluoreszenztest oder über die GFP-Expression infizierter Zellen, im Fluoreszenzmikroskop bestimmt. 43 Methoden 4.6.3. Infektion von PCLS Die PCLS wurden zunächst mit Medium gewaschen, bevor die Zellen mit 300 µl der viralen Suspension infiziert wurden. Die Inkubationszeit betrug daraufhin 2-3 h unter Schwenken im Brutschrank (37°C; 5% CO2), nach welcher das Volumen mit frischem Medium auf jeweils 1 ml aufgefüllt wurde. Am Folgetag wurden das Medium gewechselt und die Schnitte für weitere 2-7 Tage bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die Detektion der Infektion erfolgte fluoreszenzmikroskopisch im Immunfluoreszenztest oder über die Expression des GFP in infizierten Zellen. 4.7. Immunfluoreszenztests Um Virus-Antigen in infizierten Zellen sichtbar zu machen, aber auch um bestimmte Zellproteine nachzuweisen, wurde der Immunfluoreszenztest eingesetzt. Zunächst wurden die Zellen bzw. PCLS bei Raumtemperatur für 20 min mit 3% Paraformaldehyd fixiert. Zur Bindung überschüssigen Paraformaldehyds und anschließender Entfernung wurden die Zellen erst einmal mit 0,1 M Glycin-Lösung gewaschen und daraufhin 5 min darin inkubiert. Sollten ebenfalls intrazelluläre Proteine gefärbt werden, musste vor der Antikörperinkubation mittels 0,2% Triton-X-100 für 5 min permeabilisiert werden. Die Antikörperverdünnungen wurden in 1% BSA hergestellt, wobei für Deckgläschen ein Volumen von für Filtermembranen eines von je 100 µl und für PCLS eines von je 300 µl eingesetzt wurde. Nach einer Inkubationszeit von 1 h bei RT, wurden die Zellen drei Mal mit PBS gewaschen und anschließend mit dem ebenfalls in 1% BSA verdünnten Sekundärantikörper inkubiert. Die Inkubation für 1 h erfolgte je nach Konjugat des Antikörpers im Dunkeln, um ein Ausbleichen zu verhindern. Hiernach wurde drei Mal mit PBS und, um Salze zu entfernen, ein Mal mit destilliertem. H2O gewaschen, bevor die Zellen dann mit Mowiol auf Objektträger eingebettet wurden. Methoden 44 4.8. Membranproteinisolierung Um die Membranproteine von HBE- und NHBE-Zellen im Virus-Overlay einzusetzen, wurden diese zunächst isoliert. Alle Arbeitsschritte fanden auf Eis statt. Waren die zuvor in 145mm-Zellkulturschalen ausgesäten Zellen zu einem dichten Monolayer gewachsen, wurden sie zweimal mit PBSM gewaschen und anschließend in je 10 ml PBSM mit einem Zellschaber abgeschabt. Die Zellensuspension wurde in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 2700 rpm für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Das entstandene Zellpellet wurde in 1 ml PBSM resuspendiert und tropfenweise, unter Schwenken, zu 20 ml TRISPuffer gegeben. Es erfolgte eine Inkubation von 20 min, nach welcher die Zellsuspension 20-30 Mal im Potter bearbeitet wurde, so dass durch die hervorgerufenen Scherkräfte die Zellen aufgespalten wurden. Um die Zellkerne zu entfernen, wurden diese bei 1700 rpm (5 min; 4°C) pelletiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Das Zellkernpellet wurde in 5 ml TRIS-Puffer resuspendiert und ein zweites Mal bei gleichen Bedingungen zentrifugiert. Auch der hier entstandene Überstand wurde vorsichtig abgenommen und mit dem ersten Überstand vereinigt. Um schließlich die Membranfraktion zu erhalten, wurde diese aus den Überständen in der Ultrazentrifuge bei 25.000 rpm und 4°C für 1 h pellettiert. Das Pellet wurde mit einer Kanüle (Ø 0,9 x 40 mm gelagert. Eines der Aliquots wurde für die Bestimmung der Proteinkonzentration im BCAProtein-Assay verwendet. 4.9. BCA-Test Zur Bestimmung des Proteingehalts der Membranproteinisolate wurde ein kommerziell erhältlicher BCA-Protein-Assay (Firma Pierce) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 2O) wurden jeweils im Doppelansatz in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben und mit je 2 Inkubation von 30 min bei 37°C wurde die Extinktion bei 570 nm im ELISA-Reader 45 Methoden gemessen. Anhand des Standards konnte anschließend die Proteinkonzentration berechnet werden. 4.10. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese In einer diskontinuierlichen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDSPAGE) wurden die Membranproteine ihrer Größe nach aufgetrennt (Laemmli, 1970). Zunächst erfolgte die Auftrennung im Sammelgel bei konstant 80 V und daraufhin im Trenngel, mit einer Acrylamidkonzentration von 10%, bei konstant 120 V. Die Elektrophoresen wurden ausschließlich unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt, wobei die Membranproteine zuvor 1:1 mit 2 x SDS-Probenpuffer gemischt und pro Tasche 20 µg auf das Gel aufgetragen wurden. Als Marker wurden vorgefärbte Proteine mit Molekulargewichten zwischen 14,3 und 220 kDa verwendet. 4.11. Coomassie-Färbung Nach der Elektrophorese wurde das SDS-Gel zunächst kurz gewässert und anschließend in einer Glasküvette für 30 min in der Coomassie-Lösung geschwenkt, wobei das Gel vollständig mit der Lösung bedeckt war. Danach wurde die Färbelösung abgegossen und das Gel in einem Gemisch mit 40% Ethanol und 10% Essigsäure für etwa zwei Stunden entfärbt, bis die einzelnen Proteinbanden gut sichtbar waren. Dabei wurde die Lösung zum Entfärben alle halbe Stunde gewechselt. Nach der erneuten Wässerung des Gels konnten diese zur weiteren Aufbewahrung über Nacht zwischen zwei Zellophanfolien gespannt und getrocknet oder bei 4°C in H2O gelagert werden. Methoden 46 4.12. Western Blot Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden mit Hilfe einer Halbtockenvariante des Western Blots auf Nitrozellulose (Kyhse-Andersen, 1984) transferiert. Der Transfer der Proteine aus dem Trenngel auf die Nitrozellulosemembran fand bei konstanter Stromstärke von 0,8 mA/cm² über einen Zeitraum von 60 min statt. Für den anschließenden SeV/hFOverlay sowie die Detektion von bestimmten Proteinen wurden die freien Proteinbindungsstellen der Membran, durch die Inkubation über Nacht bei 4°C in BlockingReagenz geblockt. 4.13. Virusbindung an immobilisierte Membranproteine Die Mempranproteine wurden nach der Auftrennung im SDS-Gel auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und diese über Nacht im Blocking-Reagenz geschwenkt. Die Membran wurde zunächst, wie auch nach jedem Inkubationsschritt, dreimalig mit PBSM/0,1%-Tween für jeweils 10 min gewaschen. Die erste Inkubation fand mit 20 µg des gereinigten SeV-hF bzw. SeV-dsRed pro Blot unter Parafilm für 1 h bei 4°C statt. Zur Detektion der gebundenen Viruspartikel wurde der Blot mit einem Antikörper gegen das RSV F-Protein inkubiert (1:200 in PBSM, Parafilm, 1 h, 4°C). Anschließend folgte die letzte Antikörperinkubation mit Peroxidase-gekoppelten Anti-Maus-Immunglobulinen aus Kaninchen (1:1000 in PBSM, Parafilm, 1 h, 4°C). Die Zugabe des chemilumineszierenden Substrats (Super Signal) erfolgte für 5 min, wonach schließlich die gebundenen Peroxidasekomplexe mit Hilfe des Chemiimagers (Bio-Rad) sichtbar gemacht wurden. Zwischen den jeweiligen Inkubationen fanden jedes Mal drei Waschschritte mit PBSM statt. Zur Detektion bestimmter Proteine wurde, bis auf die Inkubation mit gereinigtem Virus, in gleicher Weise verfahren. Der erste Antikörper war in diesem Fall gegen das jeweilige Protein selbst gerichtet. 47 Methoden 4.14. Proteinidentifikation mittels time-of-flight tandem mass spectrometry Die durch den Virus-Overlay ermittelten Banden wurden aus Coomassie-gefärbten SDSGelen ausgeschnitten, trypsiniert und die Proteine anschließend vom Gel getrennt (Shevchenko et al., 1996). Die Proteinsequenzen wurden mittels time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS) bestimmt. Das Verfahren wurde von Falk Büttner im Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Mit Hilfe des Programms ProteinLynx Global Server (Version 2.1; Waters) konnten die Proteine anschließend identifiziert werden, indem die humane Genomdatenbank durchsucht und die Peptidsequenzen des gesuchten Proteins mit dieser verglichen wurden. Ergebnisse 48 5. Ergebnisse 5.1 Präparation differenzierter Bronchialepithelzellen aus bovinen Lungen Trotz des unterschiedlichen Wirtstropismus des humanen (HRSV) und bovinen respiratorischen Synzytialvirus (BRSV) äußert sich dieser nicht in der Empfänglichkeit permanenter Zelllinien für eine Infektion durch diese beiden Viren. Spezifische Unterschiede treten nur bei der Infektion primärer respiratorischer Epithelzellen sowie peripherer Blutlymphozyten und Makrophagen auf (Schlender et al., 2003). Als primäre Zielzellen einer RSV-Infektion konnten in vivo respiratorische Epithelzellen der Atemwege identifiziert werden. Um spezies-spezifische Unterschiede zu analysieren sowie die primäre BRSV-Infektion an den ursprünglichen Wirtszellen zu untersuchen, wurden zwei Kultursysteme etabliert: das Air-liquid-interface (ALI)-System, in dem die respiratorischen Epithelzellen bis hin zur Zilienbildung ausdifferenzieren, und die Lungenpräzisionsschnitte (PCLS; presicion-cut lung slices), zur Untersuchung der Interaktion von RSV mit respiratorischen Epithelzellen im Gewebeverband. In Infektionsstudien mit HRSV und BRSV sowie mit verschiedenen BRSVMutanten soll zunächst die RSV-Infektion von primären Zellen des respiratorischen Epithels mit diesen beiden Zellsystemen analysiert werden. 5.1.1. Air-liquid Interface Kulturen Die erfolgreiche In-vitro-Kultivierung differenzierter respiratorischer Epithelzellen auf kollagenisierten, mikroporösen Zellkultureinsätzen wurde im humanen System bereits beschrieben (Bals et al., 2004). Mit diesem Protokoll als Basis wurde das air-liquid interface (ALI)-System für ausdifferenzierte bovine respiratorische Epithelzellen (BAEC; airway epithelial cells) etabliert. bovine Ergebnisse 49 Für die Isolierung der BAEC stand während der gesamten Zeit dieser Arbeit eine ausreichende Quelle zur Verfügung, da Rinder- sowie Kälberlungen von Schlachthöfen bezogen werden konnten. Zunächst wurden die isolierten und in 75cm2-Zellkulturflaschen kultivierten BAEC auf zuvor kollagenisierte Filtereinsätzen mit mikroporösen Membranen (Firma Greiner) ausgesät und bei täglichem Wechsel des Mediums (basal sowie apikal) bis zur vollständigen Konfluenz kultiviert. Wurde daraufhin das Medium apikal von den Zellen entfernt und im ALI-System für mindestens zwei Wochen kultiviert, differenzierten die BAEC zu einem mehrreihigen Epithel, bestehend aus den verschiedenen Zelltypen, aus. In Abb. 5-1 A ist nach DAPIFärbung die charakteristische Verteilung der Zellkerne, die im respiratorischen Epithel auch übereinander liegen können, zu erkennen. Zum Beweis des epitheliaren Zellcharakters wurde ein Antikörper gegen Zytokeratin, einem charakteristischen Epithelzellmarker, eingesetzt (Abb. 5-1 C). Die auf dem Filter kultivierte Zellschicht bestand ausschließlich aus Epithelzellen, wobei aufgrund der unterschiedlichen Ebenen von Zilien und nicht ziliierter Zelloberflächen, zilientragende Zellen bei dieser Ansicht nicht gefärbt erschienen. Die Ausdifferenzierung der BAEC, die mit der Ausbildung zilientragender sowie Mukusproduzierender Zellen einherging (Abb. 5-1 B), begann gewöhnlich um den zehnten Tag der Kultivierung unter ALI-Bedingungen. Mittels einer -Tubulin-Färbung konnten die Zilien der ziliierten Zellen an der Oberfläche des Epithels sichtbar gemacht werden. Die Becherzellen wurden indirekt, über die Detektion des von diesem Zelltyp produzierten (zellenbedeckenden) Mukus mittels eines AK gegen Muzin-5AC, nachgewiesen (Abb.5-1 C). Zellen, die Zilien trugen und daher auch keinen Schleim produzierten, wurden mit diesem Nachweissystem nicht gefärbt. Bereits am Anfang der Differenzierung kam es zur Ausbildung einer polarisierten Zellschicht auf den mikroporösen Filtermembranen. Diese Entwicklung konnte zum einen über die Messung des transepitheliaren elektrischen Widerstands gezeigt werden (Abb.5-2 A). Dieser erreicht bereits kurz nach dem Aussäen einen Höchstwert von ca. 2 . Im Vergleich dazu erreichen nicht polarisierende Zellschichten von z.B. Vero-Zellen maximale Werte von 0,5 2 (Daten nicht gezeigt). Nach der Umstellung auf die ALI-Bedingungen fiel der Widerstand zunächst ab und blieb daraufhin auf einer Höhel 2 . Ähnliche Kurvenverläufe sind in der Literatur mit z.B. ALI-Kulturen muriner respiratorischer 50 Ergebnisse Epithelzellen beschrieben worden (You et al., 2002). Zum anderen kommt es in solchen Epithelien zur Ausbildung von tight junctions, enge Verbindungen zwischen Nachbarzellen, die eine Diffusionsbarriere darstellen, die hier über die Expression des tight junction Proteins ZO-1 nachgewiesen wurden (Abb.5-2 B). Die ALI-Kulturen behielten den enddifferenzierten Zustand bis zu sechs Wochen bei und konnten in diesem Zeitraum für Untersuchungen und Infektionsstudien genutzt werden. Abb. 5-1: Air-liquid interface (ALI)-Kulturen enddifferenzierter boviner Bronchialepithelzellen (BAEC). A: Zwei Wochen unter ALI-Bedingungen kultivierte BAEC differenzierten zu einem mehrreihigen Epithel aus, das mittels DAPI-Färbung und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wurde. B: Mukoziliäre Differenzierung von zwei Wochen lang unter ALI-Bedingungen kultivierten BAEC. Zilien wurden mittels eines Antikörpers gegen ß-Tubulin gefärbt (rot). Mukus-produzierende Zellen wurden indirekt mittels eines Antikörpers gegen Muzin-5AC detektiert (grün). C: Verteilung zilientragender Zellen innerhalb des respiratorischen Epithels. Nach zweiwöchiger ALI-Kultivierung wurden die BAEC gegen Zytokeratin (grün), einem epitheliaren Zellmarker, und ß-Tubulin (rot), zur Visualisierung der Zilien, gefärbt. Aufgrund der unterschiedlichen Ebenen der Zilien und der nicht ziliierten Zelloberfläche, ist die Cytokeratinfärbung mancher Zellen bei dieser Ansicht nicht zu erkennen. Ergebnisse 51 Abb. 5-2: Polarisierung und Differenzierung der BAEC in ALI-Kultur. A: Typischer Kurvenverlauf des transepitheliaren elektrischen Widerstands von BAEC in Filterkultureinsätzen. Bis zum Übergang zu den ALI-Bedingungen konnte ein Höchstwert der transepitheliaren Resistenz gemessen werden, die daraufhin etwas abfiel, jedoch einen relativ hohen Wert beibehielt. B: Nachweis von tight junctions im respiratorischen Epithel. Zwei Wochen nach ALI-Kultivierung von BAEC konnten die tight junctions mittels eines Antikörpers gegen das charakteristische Markerprotein ZO-1 nachgewiesen werden. 5.1.2. Precision-cut lung slices Die Gültigkeit der Infektionsergebnisse aus Infektionsstudien an ALI-Kulturen sollte über ein zweites Kultursystem, den Lungenpräzisionsschnitten (PCLS; precision-cut lung slices), in welchem die respiratorischen Epithelzellen in der originalen Gewebeverteilung vorliegen, bestätigt werden. Zunächst wurde die Vitalität der PCLS mittels verschiedener Kriterien bestimmt. Während der gesamten Versuchsdauer war die Zilienaktivität des bronchialen Epithels mikroskopisch zu beobachten. Auch wenn dieses Kriterium der Vitalität bereits aussagekräftig über die Lebensfähigkeit der PCLS war (Ebsen et al., 2002; Wohlsen et al., 2003), wurden noch zwei weitere Methoden herangezogen (Abb. 5-3). Die durch die Zugabe von Metacholin induzierte 52 Ergebnisse Bronchokostriktion war bei vitalen PCLS deutlich zu erkennen. Dieser Effekt war konzentrationsabhängig, da die Bronchokonstriktion erst ab einer Konzentration von 10-6 mol/l oder mehr stattfand. Außerdem war er reversibel, denn nach dem Entfernen des Metacholins kam es zur Reversion der Kontraktion (Abb. 5-3 A). Abb. 5-3: Vitalität der PCLS einen Tag nach der Präparation. A: Bronchokonstriktion. PCLS aus Rinderlungen wurden für einen Tag kultiviert und anschließend mit verschiedenen Konzentrationen von Metacholin behandelt. Die Zugabe von Metacholin bei einer Konzentration von 106 mol/l induzierte innerhalb weniger Sekunden die Bronchokonstriktion. Dieser Effekt ließ sich durch den Entzug des Metacholins wieder rückgängig machen. B: Live/dead viability assay. Lebende Zellen sind in grün zu sehen und tote in rot. Die Zellen des respiratorischen Epithels, die zum Lumen des Bronchiolus gerichtet waren, sind mit einem weißen Pfeil gekennzeichnet (oben). Im unteren Bild sind die Zellen der Alveolen zu sehen. 53 Ergebnisse Zusätzlich wurde eine Färbeprozedur, der Live/Dead Viability assay, eingesetzt, um lebende und tote Zellen in den PCLS sichtbar zu machen. Schnitte, die mittels dieser Methode auf die Vitalität der Zellen untersucht wurden, zeigten, dass Zellen des respiratorischen Epithels, des umgebenden Gewebes und der Alveolen 24 h nach der Präparation fast vollständig vital waren (Abb.5-3 B). In der äußersten Zellschicht der PCLS sowie vereinzelt in anderen Gewebeschichten waren wenige tote Zellen zu erkennen. Diese hohe Vitalität der PCLS verschlechterte sich nur langsam, so dass die PCLS noch sechs Tage nach der Präparation im adäquaten Zustand vorlagen und für Infektionsstudien geeignet waren. 5.2. Infektion primärer boviner respiratorischer Epithelzellen in ALI-Kultur durch das bovine respiratorische Synzytialvirus 5.2.1. Vergleich Infektion durch BRSV und HRSV bei BAEC in unterschiedlichen Differenzierungsstadien Wie bereits beschrieben unterscheidet sich die Permissivität von permanenten Zellinien gegenüber einer BRSV- und HRSV-Infektion kaum voneinander. BAEC, die erst eine Woche unter ALI-Kulturbedingungen gehalten wurden und somit zwar polar (siehe 5.1.) jedoch aber noch nicht ausdifferenziert waren, wurden für vergleichende Infektionsstudien mit BRSV und HRSV eingesetzt. So sollte untersucht werden, ob bereits in diesem Stadium der Differenzierung des bovinen Epithels Unterschiede in der Infizierbarkeit durch das humane bzw. bovine Virus festzustellen sind. Die BAEC wurden auf zuvor kollagenisierte Filter ausgesät, bei kompletter Konfluenz in ALI-Bedingungen überführt und nach einer weiteren Woche mit HRSV bzw. BRSV bei einer Multiplizität der Infektion (MOI: multiplicity of infection) von 0,1 infiziert. Das jeweilige Virus wurde dazu in der entsprechenden Menge im Volumen von 150 µl apikal appliziert und nach zweistündiger Inkubationszeit wieder vom Filter entfernt. Nach drei Tagen wurden die Zellen mit 3% Paraformaldehyd fixiert und mit einem AK gegen das RSV-F-Protein inkubiert. Nach der Reaktion mit dem FITC-gekoppelten zweiten Antikörper konnten die infizierten Zellen, mittels Immunfluoreszenz detektiert werden (Abb. 5-4). 54 Ergebnisse Eine Infektion durch HRSV-Long war nur bei sehr wenigen Zellen zu erkennen. Die BAEC schienen bereits in diesem nicht ausdifferenzierten Zustand größtenteils unempfänglich gegenüber einer HRSV-Infektion gewesen zu sein. Zudem schien sich das Virus während der dreitägigen Inkubation nicht ausgebreitet zu haben, da nur einzelne Zellen infiziert waren und keine Synzytienbildung festzustellen war; bei einigen permanenten Zelllinien sind nach dieser Infektionsdauer charakteristische vielkernige Riesenzellen zu sehen. Mit BRSVwt infizierte, nicht enddifferenzierte Zellschichten auf den Filtermembranen zeigten ein ähnliches Bild der Infektion. Auch hier waren kaum Zellen durch BRSV infiziert worden, wobei auch diese einzeln vorlagen und nicht zur Synzytienbildung übergegangen waren. Zum Vergleich der Infektion von enddifferenzierten BAEC mit HRSV und BRSV, wurden die ALI-Kulturen erst nach mindestens 2,5 Wochen, wenn die einzelnen Kriterien der Enddifferenzierung erreicht worden waren (siehe 5-1), mit dem jeweiligen Virus infiziert. Die Infektion wurde auf die gleiche Weise durchgeführt und detektiert wie bereits zuvor bei den nicht enddifferenzierten ALI-Kulturen beschrieben. In diesem Stadium ist die Resistenz der BAEC gegenüber einer HRSV-Infektion noch ausgeprägter. Fast gar keine Zellen sind durch HRSV infiziert worden (Abb. 5-4). Auch BRSV war kaum in der Lage, Zellen des respiratorischen Epithels auf den Filtermembranen zu infizieren. Vereinzelt waren BRSV-infizierte Zellen zu detektieren, jedoch auch hier im geringeren Maße als bei nicht enddifferenzierten BAEC. Zusammengefasst scheinen nicht enddifferenzierte BAEC für eine Infektion durch HRSV, aber auch durch BRSV, kaum empfänglich zu sein, wobei sich mit der Differenzierung der Zellen zum mehrreihigen Epithel, die Resistenz gegenüber einer HRSV-, aber auch einer BRSV-Infektion steigert. 55 Ergebnisse Abb. 5-4: Infektion nicht- und enddifferenzierter BAEC durch BRSV bzw. HRSV. Für 1 oder 3 Wochen unter ALI-Bedingungen kultivierte BAEC wurden mit BRSVwt oder HRSVLong bei einer MOI von 0,1 infiziert. Die Infektion wurde 3 d.p.i. über die Färbung des HRSVbzw. BRSV F-Proteins im Fluoreszenzmikroskop detektiert. 5.2.2. Vergleichende Infektion von nicht differenzierten humanen respiratorischen Zellen (NHBE) durch HRSV und BRSV Um die HRSV- bzw. BRSV-Infektion primärer respiratorischer Epithelzellen im humanen System mit den Ergebnissen der Infektion an BAEC vergleichen zu können, standen normal human broncheal epithelial (NHBE) Zellen (Firma Cambrex) zur Verfügung. Für die Infektionsstudien wurden die NHBE-Zellen auf Deckgläschen in 24-well Kulturplatten ausgesät und somit im nicht differenzierten Zustand eingesetzt. Nach dem Aussäen wurden die Zellen mit serumfreiem Medium bis zum Folgetag inkubiert und nach dem Waschen mit HRSV-Long oder BRSVwt (MOI=0,1) infiziert. Das Inoculum wurde 3 h.p.i. durch frisches Medium ersetzt, und die Zellen für weitere drei Tage im Brutschrank inkubiert. Die Infektion wurde am Fluoreszenzmikroskop nach Immunofluoreszenzfärbung gegen das RSV F-Protein ausgewertet. 56 Ergebnisse Abb. 5-5: Infektion nicht-differenzierter NHBE Zellen durch HRSV bzw. BRSV. NHBE Zellen wurden einen Tag nach dem Aussäen auf Deckgläschen mit HRSV-Long bzw. BRSVwt bei einer MOI von 0,1 infiziert. Nach 3 Tagen. wurden infizierte Zellen mittels eines Antikörpers gegen das RSV F-Protein gefärbt und im Fluoreszenzmikroskop detektiert. Wie in Abb. 5-5 zu sehen ist, waren NHBE Zellen sensitiv gegenüber einer HRSV-Infektion. Nicht nur einzelne Zellen, auch einige Zellareale, in denen die Infektion von Zelle zu Zelle übertragen worden war, waren durch HRSV infiziert worden. BRSV hingegen war nicht oder kaum in der Lage, die NHBE Zellen zu infizieren. Anders als bovine, scheinen humane primäre respiratorische Epithelzellen bereits im nicht differenzierten Stadium einen deutlichen Unterschied in der Empfänglichkeit gegenüber HRSV und BRSV zu machen. 5.3. Infektion von enddifferenzierten BAEC durch BRSV 5.3.1. Infektion von permanenten Zelllinien durch BRSV Zur eingehenderen Untersuchung der Infektion enddifferenzierter BAEC durch BRSV, sowie der Identifizierung der primären Zielzellen von BRSV, wurden Infektionsstudien an 3-6 Wochen unter ALI-Bedingungen kultivierten BAEC durchgeführt. Für diese Zwecke wurde das rekombinante Virus BRSV-GFP verwendet, das in infizierten Zellen zur Expression von GFP führt. Wegen der Eigenfluoreszenz dieses Proteins kann für die Sichtbarmachung der Ergebnisse 57 infizierten Zellen auf eine Inkubation mit Antikörpern verzichtet werden. Zunächst wurde das Virus mit einer MOI von 0,1 eingesetzt. Diese Virusmenge führt in permanenten Zellkulturen bereits zu einer deutlichen Infektion, wie in Abb. 5-6 (unten) zu sehen ist. Hier wurden Zellen verschiedener Spezies (Vero, MDBK und HBE) auf Filter ausgesät und 48 h.p.i. auf BRSVGFP-infizierte Zellen fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Die Infektion von Nierenepithelzellen der grünen Meerkatze (Vero), an welche das Virus adaptiert war, und Madin Darby bovine kidney cells (MDBK) durch BRSV-GFP war bereits bei dieser relativ niedrigen MOI äußerst effizient, so dass es zudem zur Ausbildung von Synzytien kam. Selbst die Zugabe von BRSV-GFP zu einer humanen Bronchialepithelzelllinie (HBE) resultierte in der Infektion der Zellen, wenn auch in deutlich geringerer Anzahl und ohne Synzytienbildung. Abb. 5-6: Infektion permanenter Zelllinien (Vero, MDBK, HBE) durch BPIV3 und BRSV. Auf kollagenisierten Filtermembranen konfluent gewachsene Zellen wurden mit dem jeweiligen Virus bei einer MOI von 0,1 apikal inoculiert. Nach 2 Tagen wurden die Zellen fixiert und mit einem Antikörper gegen -Tubulin gefärbt (rot). BRSV-infizierte Zellen wurden mittels der Eigenfluoreszenz des virus-induzierten GFP detektiert (grün). BPIV3-infizierte Zellen wurden über die Immunfluoreszenzfärbung von Virusantigen nachgewiesen (grün). Ergebnisse 58 5.3.2. Infektion von enddifferenzierten BAEC durch BRSV mit niedriger MOI Differenzierte BAEC wurden 3 h nach der BRSV-GFP-Infektion (MOI=0,1) für weitere drei Tage unter ALI-Bedingungen inkubiert. Anschließend kam es über konfokale Fluoreszenzmikroskopie zur Auswertung, wobei infizierte Zellen über die BRSV-vermittelte GFP-Expression und zilientragende Zellen mittels eines Antikörpers gegen -Tubulin detektiert wurden. Unter diesen Bedingungen waren nur sehr wenige BRSV-infizierte Zellen zu detektieren, die sich hauptsächlich im Randbereich des Epithels auf der Filtermembran befanden (Abb. 5-7, oben). In diesem Bereich war die Differenzierung der Zellen weniger ausgeprägt, was schon mikroskopisch durch die Abnahme der Anzahl zilientragender Zellen zu erkennen war. Außerdem reichte das Epithel hier nicht bis an das Plastik des Filtereinsatzes heran, war dort auch nicht angeheftet, so dass hier keine geschlossene Zellschicht mehr vorlag. Die BAEC waren somit für das Virus in diesem Bereich von jeder Seite zugänglich, eine Diffusionsbarriere im eigentlichen Sinne war hier nicht mehr gegeben. Die BRSV-Infektion war darüber hinaus ausschließlich in Zellen, die keine Zilien trugen, nachzuweisen (Abb. 5-7, unten). In einigen Fällen konnte die Bildung von Synzytien beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Auch eine verlängerte Inkubationszeit, nach der apikalen Infektion der BAEC durch BRSV, änderte kaum etwas an dem Infektionsbild. Bei einer zehntägigen Infektionsdauer war die Infektion auf sehr wenige Zellen beschränkt, die in keinem Fall Zilien trugen (Abb. 5-7). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass BRSV bei der geringen MOI von 0,1 nicht in der Lage ist, eine Infektion in enddifferenzierten BAEC zu etablieren. Ergebnisse 59 Abb. 5-7: BRSV-Infektion von BAEC Infizierte bei niedriger Zellen MOI. wurden 3 (Bilder links) bzw. 10 (Bilder rechts) Tage nach der Infektion (MOI von 0,1) fixiert und mit einem Antikörper gegen ß-Tubulin (rot) gefärbt. Virusinfizierte Zellen wurden über die GFP-Expression (grün) visualisiert. Mit BRSV infizierte Zellen befanden sich hauptsächlich im Randbereich des Epithels, in welchem die Differenzierung der Zellen weniger ausgeprägt war (weißer Pfeil, obere Bilder). Von der Infektion waren ausschließlich Zellen, die keine Zilien trugen, betroffen (untere Bilder). 5.3.3. Infektion von enddifferenziereten BAEC durch BRSV bei erhöhter MOI Wegen der geringen Empfänglichkeit der bovinen respiratorischen Epithelzellen für eine BRSV-Infektion wurde die eingesetzte Virusmenge erhöht. Im Falle der ausdifferenzierten BAEC in ALI-Kultur wurde die Multiplizität um den Faktor 10 erhöht (MOI=1). Die Infektion sowie der Nachweis der infizierten Zellen erfolgten wie oben bei den Versuchen mit niedriger MOI. Auch bei einer Erhöhung der MOI auf den Wert 1 blieb das zuvor gewonnene Infektionsbild der Zellen durch BRSV erhalten. Zwar sind mehr Zellen im Epithel durch BRSV infiziert worden als zuvor bei der Infektionsstudie mit einer MOI von 0,1, jedoch befinden sich diese ebenso hauptsächlich im Randbereich der Filtermembran. Zilientragende Zellen waren auch hier nicht von der Infektion betroffen (Daten nicht gezeigt). Auffällig war allerdings, dass bei einigen infizierten Epithelien, die nicht sehr gleichmäßig, sondern vielmehr in manchen Bereichen „hügelig“ gewachsen waren, die Infektion gerade in 60 Ergebnisse solchen Zellanhäufungen zu detektieren war. Bei näherer Betrachtung lässt sich erkennen, dass BRSV-infizierte Zellen sich dabei nicht in der oberen Zellschicht dieser Strukturen, in der die Zellen enddifferenziert waren und zum großen Teil Zilien trugen, befanden (Abb.5-8 oberste Ebene). Auch hier waren zilientragende Zellen nie infiziert (Abb.5-8, -5 µm). Vorwiegend in unteren Zellschichten, hier 20 µm weiter hinunter zur Nähe der kollagenisierten Filtermembran, befanden sich bereits 3 d.p.i. kleine Areale BRSV-infizierter Zellen (Abb.5-8, -20 µm). In dem die Zellanhäufungen umgebenden Epithel, das gleichmäßig mehrreihig gewachsen war, waren wiederum kaum infizierte Zellen zu detektieren. Abb. 5-8: BRSV-Infektion von BAEC in einem vielschichtigen Bereich des Epithels. Enddifferenzierte BAEC wurden 3 d.p.i. durch BRSV mit einer MOI von 1 fixiert, gegen ß-Tubulin gefärbt (rot) und im konfokalen Fluoreszenzmikroskop in verschiedenen Ebenen betrachtet. Infizierte Zellen wurden über die BRSV-vermittelte GFP-Expression detektiert. In der obersten Ebene, den Zilien der zilientragenden Zellen an der Oberfläche des Epithels, und eine Ebene darunter (-5 µm) befanden sich keine infizierten Zellen. Erst in unteren Zellschichten (-20 µm) ließ sich die BRSVInfektion detektieren. 61 Ergebnisse Insgesamt lässt sich aufgrund der Ergebnisse vermuten, dass enddifferenzierte BAEC nur eine geringe Sensitivität gegenüber einer Infektion durch BRSV aufweisen; allerdings ist das Virus bei einer MOI von 1 in der Lage, eine Infektion in unteren Zellschichten des respiratorischen Epithels zu etablieren. Diese Bedingungen waren jedoch nur gegeben, wenn spezielle Strukturen im Epithel auftraten. Das Bild der Infektion bei „normal gewachsenen Epithelien aus BAEC in ALI-Kultur war ansonsten ähnlich dem, bei einer BRSV-Infektion mit einer MOI von 0,1. 5.3.4. Infektion von enddifferenziereten BAEC durch BRSV mit hoher MOI Um die BRSV-Infektion ausdifferenzierter BAEC bei einer noch höheren Multiplizität zu untersuchen, wurde das Virus mit einer MOI von 3,5 auf der apikalen Seite der Zellen appliziert. Drei Tage nach der Infektion erfolgte dann über die GFP-Expression der BRSVinfizierten Zellen am konfokalen Fluoreszenzmikroskop die Auswertung der Infektion. Im Gegensatz zur Infektion mit geringerer MOI traten GFP-exprimierende Zellen nicht nur im Randbereich des Epithels auf. Vielmehr waren BRSV-infizierte Zellen unter diesen Bedingungen über den gesamten Filter verteilt aufzufinden (Abb. 5-9, links). Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass zilientragende Zellen in diesem Fall ebenfalls sensitiv gegenüber einer BRSV-Infektion waren (Abb. 5-9, rechts). Abb. 5-9: BRSV-Infektion von BAEC bei hoher MOI. 3 Tage nach der Infektion der enddifferenzierten BAEC durch BRSV bei einer MOI von 3,5 wurden die Zellen fixiert und gegen ß-Tubulin gefärbt (rot). Im konfokalen Fluoreszenzmikroskop wurden BRSVinfizierte Zellen über die GFP-Expression detektiert. Wurde das Virus mit einer hohen MOI von 3,5 appliziert, waren BRSV-infizierte Zellen über das gesamte Epithel verteilt (links). Zudem waren in diesem Fall auch zilientragende Zellen von der Infektion betroffen (rechts). 62 Ergebnisse Zusammengefasst lässt sich aus den Ergebnissen schließen, dass BRSV durchaus in der Lage ist, ausdifferenzierte BAEC zu infizieren, jedoch nur, wenn eine höhere MOI eingesetzt wird als bei permanenten Zelllinien, wie z.B. bei Vero- oder MDBK-Zellen, üblich ist. 5.4. Infektion von enddifferenzierten BAEC durch andere respiratorische Viren Um sicherzugehen, dass die Resistenz der BAEC-ALI-Kulturen gegenüber einer BRSVInfektion mit geringer MOI nicht vom ALI-System selbst ausgeht, wurden zusätzlich Infektionsstudien mit anderen respiratorischen Viren durchgeführt. Hierdurch sollte geklärt werden, ob überhaupt die Möglichkeit besteht, enddifferenzierte BAEC, die unter ALIBedingungen kultiviert werden, mit Virus zu infizieren. 5.4.1.Infektion durch das bovine Parainfluenzavirus Typ 3 In permanenten Zellkulturen führt BPIV3, mit geringer MOI appliziert, bereits zur deutlichen Infektion, wie in Abb. 5-6 (oben) zu sehen ist. Zellen verschiedener Spezies (Vero, MDBK und HBE) wurden für diese Infektionsstudie auf Filtermembranen ausgesät und 48 h.p.i. auf BPIV3 infizierte Zellen mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Infektion von MDBK Zellen durch BPIV3 war bereits bei einer MOI von 0,1 MOI äußerst effizient, so dass die gesamte Zellschicht von dieser betroffen war. Auch die Inkubation von Vero und HBE Zellen mit BPIV3 resultierte in einer Infektion, auch wenn diese in geringerem Maße ausfiel. Zur Untersuchung der Infektion durch BPIV3 und der Identifikation der primären Zielzellen im respiratorischen Epithel, wurden ausdifferenzierter BAEC von der apikalen Seite ausgehend infiziert. Dazu wurde das Virus mit einer MOI von 0,1 in die obere Kammer von 2-6 Wochen alten BAEC-ALI-Kulturen appliziert und für 2 h inkubiert. Die Zellen wurden 2 d.p.i. mit 3% Paraformaldehyd fixiert und mittels Immunfluoreszenzfärbung mit einem 63 Ergebnisse Antikörper gegen Virusantigen mikroskopisch auf infizierte sowie zilientragende Zellen untersucht. Wie in Abb. 5-10 zu sehen ist, befanden sich BPIV3-infizierte Zellen über das gesamte respiratorische Epithel auf der Filtermembran verteilt. Es war kein spezielless Verteilungsmuster zu erkennen, wie es bei BRSV-infizierten BAEC bei der gleichen MOI zu beobachten war. Zudem waren bereits bei dieser geringen MOI eine Vielzahl der BAEC durch BPIV3 infiziert worden. Die Inkubationszeit war bei BPIV3 im Vergleich zu BRSV deutlich verkürzt, eine Infektion war bereits nach 1-2 Tagen zu erkennen. Beim genaueren Betrachten konnte man sehen, dass fast ausschließlich zilientragende Zellen von der BPIV3Infektion betroffen waren (Abb. 5-10, rechts). In diesem Kultur-System ging die Virusausbreitung über zilientragende Zellen, z.B. auf Mukus-produzierende Zellen, nur sehr selten hinaus. Abb. 5-10: Infektion des zilientragenden Epithels ALI-kultuvierter BAEC durch BPIV3. Das Virus wurde für 2 h mit einer MOI von 0,1 auf die apikale Oberfläche der Zellen appliziert. Zwei Tage nach der Infektion der ALI-Kulturen wurden die Zellen fixiert und Zilien mittels eines Antikörpers gegen -Tubulin visualisiert (rot). BPIV3-infiziete Zellen (grün) konnten über Immunfluoreszenzfärbung detektiert werden. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Virusinfektion des respiratorischen Epithels, das in diesem ALI-System aus enddifferenzierten BAEC bestand, bereits bei einer MOI von 0,1 64 Ergebnisse durchaus möglich ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass zilientragende Zellen des respiratorischen Epithels Hauptkandidaten für primäre Zielzellen von BPIV3 sind. 5.4.2. Infektion durch das bovine Herpesvirus Typ 1 Die Infektion der enddifferenzierten BAEC im ALI-System durch BHV-1/GFP wurde auf gleiche Weise durchgeführt, wie die zuvor beschriebene Infektion der Zellen durch BPIV3. Bei derselben MOI von 0,1 wurde 2 Tage nach der apikalen Applikation des Virus die Infektion fluoreszenzmikroskopisch über die GFP-Expression infizierter Zellen ausgewertet. Die durch BHV-1/GFP vermittelte Infektion der BAEC wies eine spezifische Verteilung im respiratorischen Epithel auf. Infizierte Zellen befanden sich hauptsächlich am äußeren Rand des mehrreihigen Epithels und somit im Randbereich der Filtermembran (Abb. 5-11). Auch wenn nicht nur einzelne Zellen, sondern ganze Zellareale am Rand des Epithels eine Infektion aufwiesen, breitete sich diese nicht oder nur selten zu den Zellen in der Mitte der Epithels aus. Um welche Art von Zellen es sich bei den primären Zielzellen von BHV-1/GFP handelt, ob z.B zilientragende oder Mukus-produzierende Zellen, konnte in der Infektionsstudie an enddifferenzierten BAEC nicht geklärt werden. Anstelle eines Zelltyps, der in erster Linie eine Infektion aufwies, waren die verschiedenen Zelltypen des respiratorischen Epithels aus BAEC in gleichem Maße von der Infektion betroffen. Zusammenfassend scheint BHV-1/GFP in der Lage zu sein, im Gegensatz zu BRSV, bereits bei geringer eingesetzter MOI alle vertretenen Zelltypen im respiratorischen Epithel zu infizieren. Ähnlich zu einer BRSV-Infektion ist hier die Verteilung BHV-1/GFP infizierter Zellen spezifisch auf den Randbereich des Epithels beschränkt. Möglicherweise spielt hier die Zugänglichkeit der Zellen eine Rolle, denn im Randbereich sind die Zellen auch von der basolateralen Seite infizierbar, während die Zellen in der Mitte der Filtermembran nur von der apikalen Seite für das Virus zugänglich sind. Ergebnisse 65 Abb. 5-11: Infektion des respiratorischen Epithels durch BHV-1 im äußeren Randbereich. Zwei Tage nachdem das Virus apikal auf die ALI-kultivierten enddifferenzierten BAEC gegeben worden war, wurden die Zellen fixiert und die Infektion Fluoreszenzmikroskop gewertet. Zellen im aus- BHV-1/GFP-infizierte wurden mittels GFP- Expression detektiert und befanden sich fast ausschließlich am äußeren Rand des Epithels. 5.4.3. Infektion durch das bovine Coronavirus Zwei Tage nach der Infektion der BAEC-Epithelzellschicht in ALI-Kultur durch BCoV wurden die Zellen fixiert und die Infektion über die Immunfluoreszenzfärbung mikroskopisch auf virales Antigen untersucht. In Abb. 5-12 ist deutlich zu sehen, dass das respiratorische Epithel aus ausdifferenzierten BAEC sensitiv gegenüber einer Infektion durch BCoV war. Über 50% der BAEC waren durch das Virus infiziert worden, wobei kein spezifisches Verteilungsmuster bei den infizierten Zellen zu erkennen war. Daraus lässt sich schließen, dass respiratorische Epithelzellen empfänglich für eine Infektion durch BCoV sind. Durch die überaus hohe Anzahl infizierter Zellen hat es den Anschein, als würde dabei kein bestimmter Zelltyp bevorzugt durch das Virus infiziert werden. Ergebnisse 66 Abb. 5-12: BCoV-Infektion des respiratorischen Epithels enddifferenzierter BAEC. Sechs Wochen unter ALI-Bedingungen kultivierte BAEC wurden apikal durch die Zugabe von BCoV infiziert und 3 d.p.i. fixiert. Virus-infizierte Zellen wurden mittels Immun- fluoreszenzfärbung visualisiert und im Fluoreszenzmikroskop detektiert. 5.4.4. Infektion durch verschiedene Sendaiviren 5.4.4.1. SeV-L/GFP Bei der Infektionsstudie an enddifferenzierten BAEC mit Sendaivirus (SeV) wurde, wie zu Anfang bei der Infektion mit BRSV, eine MOI von 0,1 eingesetzt. Dabei kam es zum Einsatz des rekombinanten Sendaivirus L/GFP (SeV-L/GFP), das, zu leichteren Nachweis infizierter Zellen, im Genom vor dem L-Protein eine GFP-Kassette besaß. Die Zellen wurden 5 d.p.i mit 3% Paraformaldehyd fixiert und im Fluoreszenzmikroskop auf die SeV-vermittelte GFP-Expression untersucht. 67 Ergebnisse In Abb. 5-13 ist deutlich zu sehen, dass bereits bei der geringen eingesetzten MOI von 0,1 nahezu das gesamte respiratorische Epithel aus enddifferenzierten BAEC durch SeV-L/GFP infiziert worden war. Somit war kein Unterschied zwischen der Sensitivität der verschiedenen Zelltypen des respiratorischen Epithels gegenüber einer Infektion durch SeV-L/GFP festzustellen. SeV-L/GFP ist also in der Lage, bereits bei geringer Multiplizität eine Infektion im respiratorischen Epithel aus ALI-kultivierten BAEC zu etablieren. Abb. 5-13: SeV-Infektionen des respiratorischen Epithels enddifferenzierter BAEC. Fünf Wochen unter ALI-Bedingungen kultivierte BAEC wurden apikal mit SeV-L/GFP bzw. SeV-hF bei einer MOI von 0,1 infiziert, sowie zur Kontrolle ohne Virus behandelt. Zwei Tage später wurden die Zellen fixiert und die Infektion im Fluoreszenzmikroskop über die SeVvermittelte GFP-Expression detektiert. Ergebnisse 68 5.4.4.2. SeV-hF Nachdem sich enddifferenzierte BAEC als äußerst sensitiv gegenüber einer Infektion durch SeV-L/GFP erwiesen hatten, war es interessant zu untersuchen, ob das Sendaivirus-HRSV/F (SeV-hF) ebenfalls in der Lage ist, das respiratorische Epithel aus BAEC zu infizieren. Bei SeV-hF handelt es sich um ein chimäres Virus, das neben einer GFP-Kassette noch das für das Fusionsprotein kodierende Gen von HRSV enthält, während die Gene für SendaiOberlfächenproteine HF und F fehlen. So kommt es bei der Replikation von SeV-hF zum Einbau des F-Proteins von HRSV in die virale Membranhülle anstelle der SeVGlykoproteine. Mit Hilfe dieser Viruschimäre konnte festgestellt werden, ob auch das HRSVF-Protein für die Einleitung einer Infektion der BAEC genutzt werden kann. Durchgeführt wurde die Infektion auf gleiche Weise, wie zuvor die Infektion durch das SeV-L/GFP. Die fünf Tage nach der Infektion fixierten respiratorischen Epithelzellen aus ausdifferenzierten BAEC erwiesen sich als weitgehend resistent gegen eine Infektion durch SeV-hF. Nur vereinzelt ließ sich SeV-hF-vermittelte GFP-Expression in BAEC detektieren (Abb. 5-13). Aus den Ergebnissen der Infektionsstudien mit BAEC lässt sich schließen, dass Sendaivirus durch den Austausch der Oberflächenproteine HN und F durch das F-Protein von HRSV-F seine Fähigkeit verliert, eine Infektion in ALI-kultivierten BAEC zu etablieren. 5.5. Infektionsstudien an bovinen Lungenpräzisionsschnitten (PCLS) mit BRSV Bei den Infektionsstudien mit ausdifferenzierten BAEC aus ALI-Kulturen hatte sich ergeben, dass die respiratorischen Epithelzellen nicht sehr sensitiv gegenüber einer BRSV-Infektion sind. Durch die Anwendung eines alternativen Zellsystems sollte die Gültigkeit dieses überraschenden Befunds untermauert werden. Lungenpräzisionschnitte erschienen dafür besonders interessant, da bei ihnen die differenzierten Epithelzellen im ursprünglichen Gewebeverband vorliegen. Zur Infektion der Rinderlungenschnitte mit BRSV-GFP wurden zum einen verschiedene Titer der Virussuspensionen eingesetzt, und zum anderen unterschiedliche Inkubationszeiten nach Ergebnisse 69 der Infektion eingehalten. Für die Infektion mit BRSV-GFP, wurden PCLS mit 300 µl der Virussuspension für 3 h inkubiert und nach zwei, fünf oder zehn Tagen mit 3% Paraformaldehyd fixiert. Die Auswertung erfolgte über konfokale Fluoreszenzmikroskopie, nachdem die Zellen zur Visualisierung der Zilien mit einem cy3gekoppelten Antikörper gegen -Tubulin gefärbt worden waren. Virusinfizierte Zellen konnten über die BRSV-vermittelte GFP-Expression detektiert werden. 5.5.1. BRSV-Infektion von Lungenpräzisionsschnitten bei geringem Virusiter Zwei Tage nach der Infektion der PCLS mit BRSV (105 PFU/ml) konnte keine virusvermittelte GFP-Expression im zilientragenden Epithel der Bronchioli detektiert werden. BRSV-infizierte Zellen waren durchaus vorhanden, jedoch nur in Zellschichten, die sich unterhalb des respiratorischen Epithels befanden (Abb. 5-14 A). Wurde die Inkubationszeit, nach der Infektion der Schnitte auf fünf Tage erhöht, war die Virusinfektion zwar auf benachbarte Zellen im Bindegewebe weitergegeben worden, nicht aber auf zilientragende Epithelzellen (Abb. 5-14 B). In PCLS, die erst am zehnten Tag nach der Infektion fixiert wurden, war eine weitere Ausbreitung der Infektion festzustellen (Abb. 5-14 C). Dennoch war noch immer keine GFPExpression im zilientragenden Epithel nachzuweisen (Abb. 5-14 D). In diesem Fall waren BRSV-infizierte Zellen ebenso hauptsächlich um den Bronchiolus herum lokalisiert. Zudem traten, wenn auch in weitaus geringerem Maße, infizierte Zellen im Bereich der Alveoli auf (Daten nicht gezeigt). 5.5.2. BRSV-Infektion von Lungenpräzisionsschnitten bei höherem Virustiter In weiteren Infektionsstudien mit BRSV an PCLS wurde der Titer des Inoculums um das 100fache, auf 107 PFU/ml, erhöht. Untersucht wurde die Infektion in den Schnitten zwei und fünf Tage nach der Infektion. Sowohl nach zwei (Abb. 5-14 E) als auch nach fünf Tagen (Abb. 514 F), trat das gleiche Bild der Infektion durch BRSV auf. Wie zuvor bei einem niedrigeren 70 Ergebnisse Titer Befanden sich BRSV-infizierte Zellen hauptsächlich in unteren Zellschichten, um den Bronchiolus lokalisiert, niemals aber in Epithelzellen, die zum Lumen des Bronchiolus ausgerichtet waren. Abb. 5-14: BRSV-Infektion boviner PCLS. Einen Tag nach der Präparation wurden PCLS mit BRSV-GFP infiziert. Virus-infizierte Zellen sind durch die virus-vermittelte GFPExpression grün, gefärbt. Zudem wurden die Zellen der PCLS gegen ß-Tubulin gefärbt (rot). PCLS, mit einem Titer von 105 PFU/ml inoculiert, wurden zwei (A), fünf (B) oder zehn (C, D) d.p.i. fixiert. PCLS, mit einem Titer von 107 PFU/ml inoculiert, wurden zwei (E) oder fünf (F) d.p.i. fixiert. Die Bilder B, D und F sind zur deutlicheren Ansicht in höherer Vergrößerung dargestellt. Zusammengefasst lassen sich die hier gemachten Beobachtungen mit den Ergebnissen aus der BRSV-Infektion der ALI-Kulturen ausdifferenzierter BAEC vereinbaren. Auch in PCLS weisen die zilientragenden Zellen des respiratorischen Epithels eine weitgehende Resistenz gegenüber einer BRSV-Infektion auf. Im Gegensatz zu den ALI-Kulturen reichen bei den Lungenschnitten nicht einmal die erhöhten Virusmengen für eine Infektion. Ergebnisse 71 Die Frage nach den primären Zielzellen von BRSV und dem Weg der Übertragung der Infektion auf respiratorische Epithelzellen bleibt nach diesen Infektionsstudien offen. 5.6. Infektion der PCLS mit anderen respiratorischen Viren 5.6.1. Infektion durch BPIV3 Zilientragende Epithelzellen haben sich bei den Infektionsstudien an enddifferenzierten BAEC in ALI-Kultur als die primären Zielzellen von BPIV3 herausgestellt. Um diese Ergebnisse mit Lungenpräzisionsschnitten zu bestätigen, wurden PCLS für 2 h mit BPIV3 (105 PFU/ml) inoculiert. Nach 48 h fand zunächst die lichtmikroskopische Kontrolle der BPIV3- und nicht-infizierten PCLS statt. Bereits zu diesem Zeitpunkt waren deutliche zytopathische Veränderungen bei BPIV3-infizierten PCLS zu detektieren, die in nichtinfizierten Kontroll-PCLS nicht zu erkennen waren. Der CPE äußerte sich in der beginnenden Zerstörung des respiratorischen Epithels, die charakterisiert war durch abgelöste Zellen im Lumen des jeweiligen Bronchiolus. Fünf Tage nach der Infektion war das gesamte respiratorische Epithel im Bronchiolus in BPIV3-infizierten PCLS zerstört und abgelöst (Daten nicht gezeigt). Im Anschluss an die lichtmikroskopische Kontrolle wurden die Schnitte fixiert und nach der Immunfluoreszenzfärbung der Zellen gegen -Tubulin und Virusantigen im konfokalen Fluoreszenzmikroskop untersucht. In Abb. 5-15 ist deutlich zu erkennen, dass in erster Linie die Zellen des respiratorischen Epithels von der Infektion durch BPIV3 betroffen waren, auch wenn infizierte Zellen ebenso in anderen Bereichen, wie z.B. den Alveoli, oder in der Nähe von Blutgefäßen, zu finden waren (Daten nicht gezeigt). Bei näherer Betrachtung fällt auf, dass hauptsächlich solche respiratorischen Epithelzellen infiziert worden waren, die in Kontakt mit dem Lumen des Bronchiolus standen, sich also in der obersten Schicht des Epithels befanden. Dabei waren meist zilientragende Zellen von der Infektion betroffen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass zilientragende respiratorische Epithelzellen die Zielzellen der primären Infektion durch BPIV3 sind, wobei diese in einem zytopathischen Effekt resultiert. 72 Ergebnisse Abb. 5-15: BPIV3-Infektion boviner PCLS. Zwei Tage nach der Infektion der PCLS durch BPIV3 mit einem Titer von 105 PFU/ml wurden die Zellen fixiert und mit Hilfe von Antikörper gegen Virusantigen (grün) sowie gegen ß-Tubulin (rot) gefärbt. Bilder der Infektion wurden am konfokalen Fluoreszenzmikroskop in geringer (A) und hoher (B) Vergrößerung gemacht. 5.6.2. Infektion durch BHV-1/GFP Bei der Infektion enddifferenzierter BAEC in ALI-Kultur entstand der Anschein, dass sich Zellen des zilientragenden Epithels durch BHV-1/GFP durchaus infizieren lassen, jedoch nur, wenn diese auch von der basolateralen Seite her zugänglich waren. Um die Infektion durch BHV-1/GFP in PCLS untersuchen zu können und festzustellen, ob die Zellen des respiratorischen Epithels tatsächlich primär von der Infektion betroffen sind, wurden PCLS für 2 h mit BRSV-1/GFP (105 PFU/ml) inkubiert. Die Auswertung erfolgte 2 d.p.i., nach der Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung der Zellen gegen -Tubulin, mit dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Infizierte Zellen wurden über die BHV-1/GFPvermittelte GFP-Expression nachgewiesen Auch für BHV-1 ergab sich, dass die Zellen des respiratorischen Epithels den Hauptort der Infektion darstellten (Abb. 5-16). Dabei erwiesen sich auch zum Lumen des Bronchiolus gewandte Epithelzellen als infiziert. Daneben wurde die Infektion auch bei respiratorischen Epithelzellen in der unteren Zellschicht, zur Lamina propria gewandt, nachgewiesen. Trotz 73 Ergebnisse des geringen eingesetzten Titers von 105 PFU/ml, war bereits nach der kurzen Inkubationszeit von zwei Tagen, eine Vielzahl der Zellen im Epithel von der Infektion betroffen. Nach dieser Infektionsstudie lässt sich für BHV-1/GFP schließen, dass in erster Linie respiratorische Epithelzellen von der Infektion betroffen sind. Da die Zellen von allen Seiten zugänglich waren, schien hier kein limitierender Faktor vorzuliegen, was die hohe Zahl infizierter Zellen in den PCLS, im Gegensatz zu den Ergebnissen mit ALI-Kulturen, erklärte. Abb. 5-16: BHV-1 Infektion boviner PCLS. Die Lungenschnitte wurden mit BHV-1/GFP (105 PFU/ml) infiziert und nach zwei Tagen fixiert. Zur Analyse im konfokalen Fluoreszenzmikroskop wurden die Zellen mit einem Antikörper gegen ß-Tubulin gefärbt (rot). Infizierte Zellen sind auf Grund der virus-vermittelten GFP-Expression grün dargestellt. Die Bilder sind in geringer (A) und hoher (B) Vergrößerung aufgeführt. 5.6.3. Infektion durch SeV-L/GFP SeV-L/GFP war in den Infektionsstudien an enddifferenzierten BAEC in ALI-Kultur in der Lage, in den Zellen des respiratorischen Epithels auch bei niedriger MOI von 0,1 eine Infektion zu etablieren. Darüber hinaus hatte sich 5 d.p.i. die Infektion auf das gesamte Epithel ausgeweitet. Mit PCLS sollte untersucht werden, ob sich diese Ergebnisse mit einem alternativen Kultursystem bestätigen lassen. 74 Ergebnisse Für die Infektion wurde ein Virustiter von 105 PFU/ml gewählt und das Virus für 2 h appliziert. Die Fixierung der Zellen mit 3% Paraformaldehy erfolgte 5 Tage nach der Infektion. Die Auswertung der Infektion über die virus-vermittelte GFP-Expression fand daraufhin am Fluoreszenzmikroskop statt. In Abb. 5-17 ist deutlich zu erkennen, dass das gesamte respiratorische Epithel durch SeV-L/GFP infiziert worden war. In diesem Bereich war die Infektion zudem primär lokalisiert. Im umliegenden Gewebe hingegen, wie z.B. den Alveoli oder Blutgefäßen, waren so gut wie keine GFP-exprimierenden Zellen zu detektieren. Daraus lässt sich schließen, dass in bovinen PCLS das respiratorische Epithel Ort der primären Infektion durch SeV-L/GFP ist. Abb. 5-17: SeV-Infektion boviner PCLS. Fünf Tage nach der Infektion der PCLS mit SeV-L/GFP (MOI=0,1) wurden die Schnitte fixiert und im Fluoreszenzmikroskop auf die SeVvermittelte GFP-Expression untersucht. 75 Ergebnisse 5.7. Identifizierung eines zellulären Interaktionspartners von HRSV Ziel dieser Arbeit ist es, die Bedeutung des F-Proteins für die Interaktion von RSV mit respiratorischen Epithelzellen von der zellulären Seite aus zu untersuchen. Dabei soll in diesem zweiten Abschnitt der Interaktionspartner des F-Proteins identifiziert und charakterisiert werden. Bisher ist bekannt, dass das F-Protein, wie auch das G-Protein, in der Lage ist, an heparin-ähnliche Strukturen (Glykosaminglykane) zu binden (Karger et al., 2001; Techaarpornkul et al., 2001). Zudem konnte mit Hilfe von vermehrungsfähigen RSV-Deletionsmutanten, denen die Glykoproteine G und SH fehlen, und die somit nur das F-Protein auf der Oberfläche tragen, gezeigt werden, dass das F-Protein auch über rezeptorbindende Eigenschaften verfügen muss, mit denen es eine Infektion einleiten kann. Der von der F2-Untereinheit vermittelte Wirtstropismus könnte so über die Bindung eines spezifischen Proteinrezeptors erklärt werden. Ist der zelluläre Rezeptor für RSV bekannt, kann anhand dessen Expressionsmuster in den genannten primären Zellsystemen festgestellt werden, ob der Rezeptor tatsächlich einen determinierenden Faktor für den Tropismus von RSV darstellt. 5.7.1. Membranproteinisolierung und Auftrennung mittels SDS-PAGE Um die Identifizierung eines Interaktionspartners von HRSV zu erleichtert, sollte die Membranfraktion verschiedener Zellen isoliert werden. Die für den Transfer auf Nitrozellulosemembran verwendeten Membranproteine stammten in erster Linie von humanen respiratorischen Zellen. Zum einen stand dazu die permanente Zelllinie humaner bronchialer Epithelzellen (HBE) und zum anderen primäre humane Bronchialepithelzellen (NHBE) zur Verfügung. Die Membranfraktion der Zellen wurde isoliert, wie es im Methodenteil beschrieben ist (siehe 4.8.). Die Membranproteine wurden zunächst unter nicht-reduzierenden Bedingungen mit Hilfe der SDS-PAGE aufgetrennt. Zum Nachweis der isolierten Membranproteine, deren Menge zuvor 76 Ergebnisse im BCA-Test bestimmt wurde, wurden 20 µg/Spur in der SDS-PAGE eingesetzt und anschließend durch den Farbstoff Coomassie-Brilliantblau angefärbt. In Abb. 5-18 ist ein typisches Verteilungsmuster der Membranproteine im Coomassiegefärbten SDS-Gel zu sehen. Mehrere Banden verschieden großer Proteine waren in unterschiedlicher Menge zu detektieren. Abb. 5-18: Coomassie-gefärbtes SDS-Gel aufgetrennter Membranproteine von HBEZellen. Membranproteine verschiedener Präparationen von HBE-Zellen (1, 2 und 3) wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend durch eine CoomassieFärbung sichtbar gemacht. Zwei der Proteinbanden (schwarze Pfeile) wurden nach deren Bestimmung im SeV-hF-Overlay (siehe Abb. 5-19) herausgeschnitten und zur Proteinidentifikation in der Massenspektrometrie eingesetzt. Parallel aufgetrennte Proteine wurden anschließend für den SeV-hF-Overlay auf Nitrozellulosemembranen transferiert. Ergebnisse 77 5.7.2. SeV-hF-Overlay mit immobilisierten Membranproteinen Um den zellulären Bindungspartner des HRSV F-Proteins zu identifizieren, wurde SeV-hF verwendet. Dieses rekombinante Sendaivirus trägt auf der Oberfläche anstelle der Sendaiproteine HN und F das HRSV-F-Protein (Zimmer et al., 2005) (siehe auch 5.4.4.2.). Als Kontroll-Virus diente SeV-dsRed, bei dem die SeV Oberflächenproteine HN und F vorhanden waren und anstelle des Gens für RSV-F das Gen für den Farbstoff dsRed eingebaut worden war. Dieser in der Natur von der Scheibenanemone Discosoma ssp. gebildete Farbstoff führt zu keiner Beeinträchtigung des Virus. Für die Bindungstests wurden die auf Nitrozellulose immobilisierten zellulären Membranproteine mit den rekombinanten Sendaiviren inkubiert. Gebundenes Virus konnte daraufhin mittels eines primären Antikörpers gegen das RSV-F-Protein und eines sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörpers, nach der Zugabe des Substrats, im Chemiimager detektiert werden. Als Interaktionspartner von HRSV-F wurde dann ein solches Zellprotein angesehen, welches mit SeV-hF, aber nicht mit SeV-dsRed ein positives Signal ergab. Dieses auf der Nitrozellulosemembran befindliche mutmaßliche Rezeptorprotein konnte dann verwendet werden, um das Protein in der gelelektrophoretischen Auftrennung der Membranfraktion mit anschließender Coomassie-Färbung, wie sie zum Nachweis der Membranproteine durchgeführt wurde (Abb. 5-18), zu lokalisieren. In Abb. 5-19 ist das Ergebnis von zwei auf diese Weise durchgeführten Nachweisen zu sehen. Neben den Markerproteinen wurden die Membranproteine von NHBE, BAEC und HBE Zellen in jeweils zwei verschiedene Spuren des SDS-Gels aufgetragen. Auf der rechten Seite der Membran sind die durch SeV-hF erkannten und als Bande sichtbaren Proteine zu sehen. Die linke Seite der Membran wurde mit dem Kontroll-Virus SeV-dsRed behandelt, und zeigt Proteine, die nicht für das HRSV-F-Protein spezifisch sind. Vergleicht man die Proteinbanden auf beiden Seiten, traten in den Spuren der Membranproteine von NHBE und HBE Zellen, die mit dem SeV-hF inkubiert worden waren deutlich Proteinbanden auf, die auf der Seite, die mit dem SeV-deRed inkubiert worden war, fehlen. Bei Membranproteinisolaten aus NHBE Zellen waren drei solcher Proteinbanden auszumachen, die eine Größe von ca. 130, 110 und 105 kDa aufwiesen. In der oberen Abb. 5-19 waren die Proteinbanden der gleichen Größe auf der SeV-hF-Seite des overlay, wenn auch sehr viel schwächer, ebenfalls bei 78 Ergebnisse Membranproteinisolaten aus HBE Zellen festzustellen. In der unteren Abb. 5-19 traten dazu vergleichbar zumindest die Proteinbanden mit der Größe von 105 und 110 kDa in der Spur aufgetragener Membranproteine aus HBE Zellen auf. Die mittels dieser Methode auf der Nitrozellulosemembran nachgewiesenen Proteine, scheinen zelluläre Bindungspartner des HRSV F-Proteins zu sein und sind somit potentielle Rezeptorkandidaten. Diese Proteine wurden daraufhin zur Identifizierung aus einem Coomassie-gefärbten Acrylamidgel isoliert. 5.7.3. Identifizierung des Interaktionspartners von HRSF-F mittels time-of-flight tandem mass spectrometry Die durch SeV-Overlay detektierten Banden wurden aus Coomassie-gefärbten SDS-Gelen ausgeschnitten. Nach der Trypsinierung der Proteine wurden sie vom Gel getrennt (Shevchenko et al., 1996), und die Proteinsequenzen mittels time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS) bestimmt. Durch Proteinsequenzierung wurde anschließend die Aminosäuresequenz von Teilpeptiden des Rezeptorkandidaten bestimmt, welche genutzt werden können, um in der humanen Datenbank nach dem Protein zu suchen, das diese Peptidsequenzen enthält. In Abb. 5-20 sind Auszüge aus den jeweiligen workflow results der Analysen der ausgeschnittenen Proteinbanden (Abb. 5-18) aufgeführt, wobei das obere Ergebnis (A) das des Proteins oberhalb von 130 kDa und das untere Ergebnis (B), das des Proteins bei 105 kDa angibt. Das >130 kDa große Protein, konnte mit 8 übereinstimmenden Teilpeptidsequenzen (Matches) in der Datenbank dem Hitzeschockprotein gp96 zugeordnet werden. Das gleiche Ergebnis wurde, mit 17 Übereinstimmungen der Teilpeptidsequenzen mit der Datenbank, bei der Analyse des Proteins bei 105 kDa erhalten. Aus den Resultaten der Proteinidentifikation der Rezeptorkandidaten von HRSV lässt sich vermuten, dass es sich hierbei um das Hitzeschockprotein (Hsp) gp96 als zellulären Bindungspartner des HRSV F-Proteins handelt. In weiteren Studien zur Rezeptoranalyse muss folglich geklärt werden, ob es sich hier um den zellulären Rezeptor von HRSV handelt. Ergebnisse 79 Abb. 5-19: SeV-hF-Overlay auf Nitrozellulose transferierter Membranbroteine verschiedener Zelllinien. Die Membranproteinisolate von NHBE, BAEC und HBE-Zellen wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit den Markerproteinen (M) auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Diese wurde mit SeV-hF (rechts) bzw. dem Kontrollvirus SeV-dsRed (links) inkubiert. Gebundenes Virus wurde mittels eines primären Antikörpers gegen RSV-F und eines sekundären, Peroxidase-gekoppelten Antikörpers nach der Zugabe des Substrats im Chemiimager detektiert. 80 Ergebnisse Abb. 5-20: Identifizierung des heat shock protein gp96 als zellulärer Bindungspartner des HRSV F-Proteins. Die mittels des SeV-hF-Overlays detektierten Proteinbanden wurden aus parallel angefertigten Coomassie-gefärbten SDS-Gelen aufgetrennter Membranproteine von HBE Zellen ausgeschnitten (Abb. 5-18). Das jeweilige Protein wurde anhand einzelner Peptidsequenzen durch time-of-flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS) identifiziert. A: Ausschnitt aus der Bestimmung des Proteins der oberen Bande (>130 kDa). B: Ausschnitt aus der Bestimmung des Proteins der unteren Bande (110 kDa). 5.7.4. Nachweis des Hitzeschockproteins gp96 in HBE Zellen Der in der Proteinidentifikation ermittelte zelluläre Bindungspartner des HRSV F-Proteins gp96 sollte zunächst in Membranproteinisolaten der schon für den SeV-hF-Overlay genutzten HBE Zellen nachgewiesen werden. Dazu wurden die Membranproteine zwei verschiedener Isolate aus HBE-Zellen im Acrylamid-Gel mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran wurde daraufhin mit einem Antikörper gegen gp96 inkubiert, der an die immobilisierten Hsp gp96 binden sollte. Als sekundärer wurde ein Peroxidase-gekoppelter Antikörper verwendet, so dass nach der Zugabe des Substrats vorhandenes gp96 als Proteinbande im Chemiimager sichtbar wurde. 81 Ergebnisse In Abb. 5-21 sind deutlich Proteinbanden zu erkennen, die in beiden Präparationen der HBE Membranproteinisolate auftreten. Zwei der detektierten Banden für gp96 befinden sich bei einer Größe von ca. 105 kDa und über 130 kDa, vergleichbar mit der Größe der Proteine, die im SeV-hF-Overlay als zelluläre Bindungspartner des HRSV F-Proteins ermittelt werden konnte. Abb. 5-21: Nachweis des Hitzeschockproteins gp96 in Membranproteinisolaten aus HBE Zellen. Membranproteine verschiedener Präparationen von HBE Zellen (H1, H2) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Mit einem Antikörper gegen gp96 wurde daraufhin das Protein gebunden und mittels eines Peroxidasegekoppelten Sekundärantikörpers, nach der Zugabe des Substrats, im Chemiimager detektiert. Zusammengefasst lässt sich aus dem Ergebnis schließen, dass das Hsp gp96 durchaus in der Membranproteinfraktion von HBE Zellen vorkommt. Außerdem stimmen die Größen der Proteinbanden für gp96 und den Rezeptorkandidaten für HRSV überein. Diskussion 82 6. Diskussion 6.1. Die Untersuchung der Interaktion zwischen BRSV und dem bovinen respiratorischen Epithel In der vorliegenden Arbeit wurde das erste Mal über die Etablierung primärer Kulturen differenzierter boviner Bronchialepithelzellen zur Untersuchung der Infektion durch das bovine respiratorische Synzytialvirus berichtet. Aus In vivo-Studien war bereits bekannt, dass das respiratorische Epithel das primäre Ziel einer BRSV-Infektion im Rind darstellt. Die Replikation des Virus fand im luminalen Teil des respiratorischen Epithels statt, wobei die Virusvermehrung im oberen Respirationstrakt der Infektion im unteren Respirationstrakt vorausging (Viuff et al., 2002). BRSV ist eng mit dem humanen RSV verwandt. Die Epidemiologie sowie Pathogenese der Infektion durch diese Viren verlaufen sehr ähnlich (Van der Poel et al., 1994). Zudem sind in vitro in permanenten Zelllinien kaum Unterschiede in der Empfänglichkeit gegenüber einer Infektion mit BRSV oder HRSV festzustellen, auch wenn der unterschiedliche Wirtstropismus dieser Viren stark ausgeprägt ist. Dieser spiegelt sich in Zellkultur jedoch nur in differenzierten respiratorischen Epithelzellen sowie in peripheren Blutlymphozyten und Makrophagen wider (Schlender et al., 2003). Die Infektion von HRSV wurde bereits in ALI-Kulturen enddifferenzierter humaner respiratorischer Epithelzellen (HAEC) untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Infektion polarisiert ist und vornehmlich zilientragende Zellen des respiratorischen Epithels betrifft (Zhang et al., 2002). Um die primäre Infektion durch BRSV zu untersuchen und die Zielzellen zu identifizieren, wurden zwei Kultursysteme primärer respiratorischer Epithelzellen gewählt. Aufgrund der charakteristischen Merkmale differenzierter Epithelzellen, spiegeln Infektionsversuche in diesen Kultursystemen die Infektion des Wirts besser wider, als permanente Zelllinien. 83 Diskussion 6.1.1. Empfänglichkeit nicht differenzierter BAEC gegenüber einer BRSV Infektion Im air-liquid interface (ALI)-System differenzierten die aus bovinen Bronchien isolierten respiratorischen Epithelzellen zu den verschiedenen Zelltypen des Epithels aus. Dabei konnte zunächst in den verschiedenen Phasen der Differenzierung des Epithels die Sensitivität der Zellen gegenüber einer BRSV und HRSV Infektion untersucht werden. Die Infektionsversuche mit BRSV und HRSV an polarisierten, aber nicht enddifferenzierten primären BAEC in ALI-Kultur wiesen in diesem Stadium nur einen geringen Unterschied in der Empfänglichkeit gegenüber einer RSV-Infektion auf. Auch wenn die BRSV-Infektion in einer höheren Anzahl infizierter Zellen resultierte als die HRSV-Infektion, waren insgesamt, verglichen mit der Infektion permanenter Zelllinien, nur wenige Zellen für BRSV empfänglich. Die geringe Infizierbarkeit der BAEC durch BRSV im Stadium der Differenzierung des polarisierten Epithels ist jedoch nicht ungewöhnlich, verglichen mit Infektionsstudien anderer respiratorischer Viren. Das humane Parainfluenzavirus Typ 3 ist ebenso wie HRSV und BRSV für eine effiziente Infektion von permanenten Zellkulturen bekannt (Bose und Banerjee, 2002; Bose et al., 2001; Moscona, 1997). In Infektionsstudien an HAEC verschiedener Differenzierungsstadien in ALI-Kultur konnte jedoch gezeigt werden, dass die Empfänglichkeit der Zelle gegenüber einer HPIV3-Infektion nicht in jeder Differenzierungsphase gleich bleibend hoch ist. Auch wenn die Zellen während der ersten Woche auf den Filtermembranen empfänglich für eine HPIV3-Infektion waren, war diese während der Differenzierung des bereits polarisierten Epithels in der zweiten Woche stark reduziert (Zhang et al., 2005). In der finalen Phase, mit dem Einsetzen der Ziliogenese, steigerte sich diese Empfänglichkeit der Zellen wieder und erreichte ihren Höhepunkt als die HAEC sich im Zustand eines enddifferenzierten zilientragenden Epithels befanden. Ab diesem Zeitpunkt wurden fast ausschließlich zilientragende Zellen des respiratorischen Epithels durch HPIV3 infiziert. Vergleicht man die HRSV- und BRSV- Infektion humaner respiratorischer Epithelzellen (HAEC), spiegelt sich hier der Unterschied im Wirtstropismus bereits wider. HRSV war, im Gegensatz zu BRSV, in weitaus höherem Maße dazu in der Lage eine Infektion in den HAEC zu etablieren, wobei diese jedoch nur in der Anfangsphase, im nicht differenziereten oder polarisierten Stadium, untersucht wurde. 84 Diskussion Ein möglicher Grund für die geringe Infizierbarkeit der polarisierten BAEC nach einer Woche ALI-Kultivierung durch BRSV könnte sein, dass der zelluläre Rezeptor für BRSV in diesem Stadium nicht ausreichend auf der Oberfläche der BAEC exprimiert wird. Wäre es möglich den Rezeptor zu identifizieren und dessen Expression während der Differenzierungsphase der Zellen auf der Zelloberfläche zu analysieren, könnt die Frage geklärt werden, ob der Rezeptor einen determinierenden Faktor für den Tropismus von RSV darstellt. 6.1.2. Untersuchung der BRSV-Infektion mit zwei verschiedenen Kultursystemen für primäre respiratorische Epithelzellen Bei der BRSV-Infektion enddifferenzierter BAEC im ALI-System stellte sich heraus, dass zilientragende respiratorische Epithelzellen nur dann sensitiv gegenüber einer Infektion mit BRSV waren, wenn das Virus mit einer hohen MOI von 3,5 appliziert wurde. Die Infektion des Epithels mit BRSV bei einer geringeren MOI von 0,1, die in permanenten Zelllinien bereits effizient verläuft, konnte nur in wenigen, ausschließlich nicht zilientragenden Zellen am Rand des Epithels detektiert werden. Auch eine Verlängerung der Inkubationszeit bis auf 10 Tage p.i. änderte nichts an dem Infektionsbild. Dieses Ergebnis war jedoch überraschend, wurde doch zuvor beschrieben, dass die zilientragenden respiratorischen Epithelzellen die primären Zielzellen von BRSV darstellen (Valarcher und Taylor, 2007). Die Resistenz des zilientragenden Epithels gegenüber einer BRSV Infektion konnte auch in Infektionsstudien an PCLS beobachtet werden. Zellen mit einer Ausrichtung zum Lumen des jeweiligen Bronchiolus waren in keinem Fall von der Infektion betroffen, selbst dann nicht, wenn der eingesetzte Titer von BRSV auf 107 PFU/ml erhöht wurde. Mit BRSV infizierte Zellen konnten zwar in den PCLS detektiert werden, jedoch nur in Zellschichten unterhalb des respiratorischen Epithels. Die Infektion dieser Zellen erfolgte dabei möglicher Weise nur aufgrund der direkten Inoculation des Virus mit dem Gewebe, wodurch das Epithel als Diffusionsbarriere umgangen werden konnte. In vivo-Studien haben gezeigt, dass die Replikation von BRSV in bronchiolären oder alveolären Epithelzellen zwei Tage nach der Infektion noch nicht zu detektieren war. Diese konnte erst vier d.p.i. nachgewiesen werden, Diskussion 85 als die Ausbildung von Synzytien ebenfalls erstmals auftrat (Viuff et al., 2002). Welche Zellen primär in die Infektion involviert sind und über welchen Weg das Virus in die Zellen des respiratorischen Epithels gelangt war, wurde in diesen Studien nicht geklärt. Jedoch führte auch eine verlängerte Inkubationszeit der PCLS nach der Infektion mit BRSV zwar zur Ausbreitung der Infektion auf benachbarte Zellen, diese erreichte aber niemals die Zellen an der Oberfläche des respiratorischen Epithels. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um dieses unerwartete Ergebnis zu erklären. Zum einen ist bei einem Großteil der Infektionsstudien BRSV-GFP, ein an Zellkultur adaptiertes Virus, das keine Krankheitssymptome in Kälbern induzierte, eingesetzt worden. Um ausschließen zu können, dass die Resistenz des zilientragenden respiratorischen Epithels gegenüber einer BRSV-GFP Infektion durch die Attenuierung des Virus hervorgerufen wird, wurden außerdem Infektionsstudien mit dem virulenten BRSV-Snook Stamm, der für Tierexperimente verwendet wird, durchgeführt (Valarcher et al., 2006). Dieses pathogene Virus ist nach der Isolierung aus der Lunge infizierter Kälber nur ein Mal auf fetalen Kälbernierenzellen passagiert worden und daher nicht wie BRSV-GFP an Zellkulturen adaptiert. Es stellte sich heraus, dass enddifferenzierte BAEC ebenfalls resistent gegenüber einer Infektion durch den Snook-Stamm von BRSV waren, genau wie im Falle einer BRSVGFP Infektion (Daten nicht gezeigt). Das gleiche Ergebnis wurde bei Infektionsstudien an BAEC in ALI-Kultur durch das Elternvirus von BRSV-GFP (ohne das ins Genom inserierte GFP-Gen), BRSVwt, erzielt (Daten nicht gezeigt). Die Etablierung der ALI-Kulturen enddifferenzierter BAEC wurde am Anfang der Arbeit mit respiratorischen Epithelzellen erwachsener Tiere durchgeführt. Der Wechsel zu BAEC von Kälbern, die in etwa sechs Monate alt waren, änderte nichts an den Ergebnissen der Infektionsstudien mit BRSV. Somit konnte zudem ausgeschlossen werden, dass die Resistenz des zilientragenden Epithels gegenüber einer BRSV-Infektion eine Eigenschaft der Zellen der betreffenden Alterstufen darstellt. In Zukunft bleibt zu untersuchen, ob die Epithelzellen noch jüngerer Tiere (1-5 Monate) ebenso resistent sind gegen eine BRSV-Infektion. Durch Infektionsstudien mit BPIV3 konnte ausgeschlossen werden, dass es sich hierbei lediglich um eine durch die Kultursysteme induzierte Resistenz gegenüber apikalen 86 Diskussion Virusinfektionen handelt. Analog zu der Infektion enddifferenzierter HAEC durch HPIV3 (Zhang et al., 2005) ergab sich für BPIV3, dass in ALI-Kultur enddifferenzierter BAEC fast ausschließlich zilientragende Zellen des respiratorischen Epithels infiziert wurden. Dieses Bild der Infektion durch BPIV3 wurde bereits beim Einsatz einer niedrigen MOI von 0,1 PFU/ml beobachtet. Durch Infektionsstudien an PCLS konnte zudem bestätigt werden, dass auch im Gewebeverbund primär Zellen des respiratorischen Epithels Ziel einer BPIV3Infektion sind. Diese resultierte außerdem bereits nach zwei Tagen in einem zytopathischen Effekt, der sich in der Destruktion des respiratorischen Epithels äußerte. In vivo wurde in der frühen akuten Phase der durch das BPIV3 hervorgerufenen Pneumonie bei Kälbern die Replikation des Virus in Epithelzellen des Respirationstrakts und Alveolarmakrophagen beschrieben. Dabei konnte ebenso der Verlust von Zilien und zilientragenden Zellen in den kleinen Bronchien und Bronchioli festgestellt werden (Bryson et al., 1983). Ebenso konnte gezeigt werden, dass das BCoV bei apikaler Applikation in der Lage ist, in enddifferenzierten BAEC in ALI-Kultur eine Infektion zu etablieren. Schon bei der BCoVInfektion von auf Filtern gewachsenen polarisierten MDCK I Zellen stellte sich heraus, dass diese über die apikale und nicht die basolaterale Membran stattfindet (Lin et al., 1997; Schultze et al., 1996). Dabei ist die Bindung des S-Proteins an Sialinsäuren, im Speziellen die N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure, und an einen spezifischen Rezeptor essentiell, um die Infektion einzuleiten. Dieser spezifische Rezeptor konnte für BCoV jedoch noch nicht identifiziert werden. 6.1.3. Mögliche Erklärungen für die Resistenz enddifferenzierter BAEC gegenüber einer Infektion durch BRSV Das Unvermögen von BRSV, eine Infektion in BAEC zu etablieren, könnte mit der Zugänglichkeit des zellulären Rezeptors des Virus zusammenhängen. Während für die Anheftung von RSV an die Zelloberfläche Glykosaminoglykane hinreichend sind, wird für den Viruseintritt in die Zelle die Interaktion mit einem spezifischen Rezeptorprotein postuliert (Techaarpornkul et al., 2002). Dieses Rezeptorprotein scheint ein weit verbreitetes Protein zu sein, da eine Vielzahl von Zelllinien verschiedener Spezies empfänglich für eine Infektion Diskussion 87 durch BRSV und HRSV sind. Dennoch wurde die Infektion des zilientragenden respiratorischen Epithels als Spezies-spezifisch beschrieben. Durch vergleichende Infektionsstudien mit rekombinanten Vieren wurde festgestellt, dass der Wirtstropismus von der F2-Untereinheit des viralen Fusionsproteins bestimmt wird, da nur solche chimären Viren, die die F2-Untereinheit von HRSV enthielten, auch in der Lage waren, HAEC zu infizieren (Schlender et al., 2003). Infektionsstudien mit SeV-L/GFP, das ähnlich dem BPIV3 aufgebaut ist, ergaben, dass die Zellen des respiratorischen Epithels Ziel der primären Infektion durch das Virus sind. Sowohl BAEC in ALI-Kultur, als auch in PCLS waren nach kurzer Zeit komplett durch das Virus infiziert worden. Die Adsorption an die zelluläre Oberfläche erfolgt bei SeV über das HNProtein, das an sialinsäurehaltige Glykoproteine oder Glykolipide bindet (Scheid und Choppin, 1974a; 1974b). Sialinsäuren stellen Modifikationen von einer Vielzahl von Lipidund Proteinkomponenten auf der Zelloberfläche dar. So schien die SeV-L/GFP-Infektion der respiratorischen Epithelzellen trotz der Tatsache, dass es sich hier um ein bovines System handelte, nicht ungewöhnlich zu sein. Es ist auch bekannt, dass das Virus ursprünglich aus der Lunge eines infizierten Kindes isoliert worden ist (Kuroya und Ishida, 1953). Im Gegensatz dazu konnte in vergleichenden Infektionsstudien mit dem SeV-hF an enddifferenzierten BAEC in ALI-Kultur gezeigt werden, dass es hier nicht oder kaum zur Infektion durch das Virus kam. Dieses rekombinante SeV exprimiert, anstelle seiner eigenen Oberflächenproteine HN und F, das Fusionsprotein des HRSV auf der Zell und Virusoberfläche. Somit wurde gezeigt, dass, wie bei Infektionsversuchen mit HRSV-GFP, SeV zwar mit den eigenen Glykoproteinen, aber nicht über das HRSV-F-Protein in der Lage ist, eine Infektion in enddifferenzierten BAEC zu etablieren. Das HRSV F-Protein, das zur Anheftung an die Zelle und für die darauf folgende Penetration an ein spezifisches Rezeptorprotein binden muss, ist nicht ausreichend für die Einleitung der Infektion von BAEC. Dies könnte zwar mit einer spezies-spezifischen Erkennung des Rezeptors erklärt werden, es ist aber auch möglich, dass das Rezeptorprotein nicht in ausreichender Menge auf der Oberfläche der Zellen exprimiert wurde. Diese Möglichkeit wurde bereits bei der Infektion des respiratorischen Epithels während verschiedener Differenzierungsphasen diskutiert. Der sehr enge Zellverbund im respiratorischen Epithel, der u.a. durch tight 88 Diskussion junctions hervorgerufen wird, ist Grund für einen erschwerten Viruseintritt. Die kritische Rezeptordichte für einen effizienten Viruseintritt könnte in einem solchen Epithel höher sein als es, aufgrund der weniger eng gepackten Struktur, bei permanenten Zelllinien der Fall ist. Diese Erklärung würde auch zu der Tatsache passen, dass BRSV-infizierte Zellen immer im Randbereich der Filtermembran zu detektieren waren. In diesem Bereich lagen die Zellen im weniger differenzierten Stadium vor und befanden sich zudem nicht mehr eng gepackt im Verbund des Epithels, sondern waren auch von der basolateralen Seite her zugänglich. Für verschiedene Viren, wie z.B. Masern- oder Arenaviren, konnte gezeigt werden, dass die Resistenz des respiratorischen Epithels gegenüber einer Infektion durch diese Viren in der Lokalisation des zellulären Rezeptors, der sich in diesen Fällen auf der basolateralen Membran befindet, begründet ist (Dylla et al., 2008; Leonard et al., 2008). Allerdings gelang eine Infektion der BAEC durch BRSV auch dann nicht, wenn die Polarität des Epithels durch eine vorangegangene EGTA-Behandlung zur Zerstörung der dichten Zellverbunde aufgehoben worden war (Daten nicht gezeigt). Auch im Anschluss an eine Verletzung des Epithels, durch welche die Zellen von allen Seiten her zugänglich gemacht werden, war mit BRSV-GFP in diesem Bereich nicht möglich (Daten nicht gezeigt). Außerdem ist in Infektionsstudien mit enddifferenzierten HAEC nachgewiesen worden, dass die HRSVInfektion hauptsächlich über die apikale Membran stattfindet (Zhang et al., 2002). Bei der Infektion der PCLS durch BRSV stellte sich weiterhin heraus, dass ausschließlich Zellen in Zellschichten unterhalb des respiratorischen Epithels von der Infektion betroffen waren, und dass auch sich im Gewebe ausbreitendes Virus nicht in der Lage war, die Oberfläche des zilientragenden Epithels über die basolaterale Membran zu erreichen. Die vergleichende Infektion der BAEC durch BHV-1/GFP macht zudem deutlich, dass es sich bei BRSV-GFP nicht um eine Infektion von der basolateralen Seite handelt. Das Infektionsbild von BHV-1/GFP ähnelte in enddifferenzierten BAEC in ALI Kultur zwar dem von BRSV, da fast ausschließlich BAEC im Randbereich des Epithels eine BHV-1/GFP Infektion auf wiesen. Da die Zellen in diesem Bereich von allen Seiten her zugänglich waren, lässt sich für BHV-1 vermuten, dass die Infektion von basolateral aus erfolgt, wie es in Zellkultur auch für das humane Herpesvirus 1 beschrieben worden ist (Marozin et al., 2004; Schelhaas et al., 2003). Diese Vermutung erhärtete sich nach der BHV-1/GFP Infektion der PCLS. Hier waren in erster Linie Zellen des respiratorischen Epithels von der Infektion Diskussion 89 betroffen, wobei sich diese auch auf zilientragende Zellen in der obersten Schicht des Epithels erstreckte. Diese wurden vermutlich aufgrund der direkten Inoculation dieser Zellen mit dem Virus erreicht, wodurch die natürliche Barriere, das respiratorische Epithel, umgangen werden konnte. Für BRSV ließ sich eine Infektion dieser Zellen in keinem Fall nachweisen. Die mögliche Erklärung der Resistenz enddifferenzierter BAEC gegenüber einer BRSVInfektion aufgrund der herunterregulierten Expression des zellulären Rezeptors lässt vermuten, dass es durch bestimmte Umweltfaktoren zur Hochregulierung kommen kann. Solche Induktoren der Rezeptorexpression könnten Stressfaktoren wie z.B. Standortwechsel, Klimaveränderungen und Ernährungsfehler oder Koinfektionen durch andere Mikroorganismen sein. Dies würde zudem eine Erklärung für das Muster einer BRSVInfektion in Rindern sein. BRSV ist, wie auch BPIV3 und BHV-1, einer der ersten Erreger im bovine respiratory disease comlex (BRDC) (Lehmkuhl und Gough, 1977; Srikumaran et al., 2007). Dabei können bakterielle Koinfektionen zur Schwere der Erkrankung beitragen. Da auch Umweltfaktoren in der Ausbildung der Erkrankung involviert sind, wird BRDC auch als Faktorenkrankheit bezeichnet. Würde nun einer dieser genannten Faktoren die Hochregulierung des zellulären Rezeptors für BRSV im respiratorischen Epithel bewirken, ließe sich damit erklären, warum in vivo im Rind die Infektion zilientragender respiratorischer Epithelzellen durch BRSV beschrieben ist, wohingegen die Etablierung der BRSV-Infektion der BAEC im intakten Epithel nicht stattfindet. Dazu würde auch die Tatsache passen, dass die Infektion durch BRSV-GFP nur in BAEC, die nicht Teil des intakten Epithels waren, nachzuweisen war. Zum einen waren wie bereits beschrieben, infizierte Zellen im Randbereich des Epithels, in welchem die Integrität der Zellen gestört war, zu beobachten. Zum anderen konnte die BRSV-Infektion von BAEC nur in solchen Strukturen des respiratorischen Epithels detektiert werden, die untypisch und sogar anormal für dieses waren. So waren Zellen im unteren Teil eines unnatürlicher Weise vielschichtigen Bereichs des respiratorischen Epithels durch BRSV-GFP infiziert worden, wobei diese Infektion sich nicht auf die oberste enddifferenzierte Zellschicht des intakten zilientragenden Epithels ausbreitete. 90 Diskussion Für ein besseres Verständnis der Pathogenese von BRSV-Infektionen in Rindern, ist es daher von großer Bedeutung in weiterführenden Studien den zellulären Rezeptor von BRSV zu identifizieren. 6.1.4. Die Frage nach den primären Zielzellen von BRSV Um welche Zellen es sich bei den primären Zielzellen von BRSV handelt, konnte abschließend, trotz des Einsatzes der beiden Kultursysteme, nicht geklärt werden. Selbst im Gewebeverbund der PCLS, wurde nicht deutlich, welche Zellen durch BRSV primär infiziert werden. Neben den oben erwähnten Erklärungen durch differenzielle Regulierung der Rezeptorexpression sollte auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass zunächst Zellen des Immunsystems durch BRSV infiziert werden, die die Infektion dann auf das respiratorische Epithel weitergeben. Das morphologische Erscheinungsbild der BRSV-infizierten Zellen erweckte den Anschein, dass es sich hier um dendritische Zellen (DC) oder Makrophagen handeln könnte. Über dendritische Zellen, die sich unterhalb der zilientragnden Epithelzellschicht der Bronchioli oder Alveolen befinden, wurde berichtet, dass sie während respiratorischer Infektionen die ersten Zellen sind, die naive T-Zellen aktivieren (van Haarst et al., 1994). Zudem ist es DCs möglich, über Zellausläufer ins Lumen der Bronchioli zu gelangen und dort Antigen aufzunehmen. In manchen Fällen sind DCs als die Zellen beschrieben worden, die zuerst mit dem Pathogen interagieren (Banchereau und Steinman, 1998). Für RSV ist bekannt, dass aus Monozyten abgeleitete DCs produktiv durch das Virus infiziert werden. Die in vivo Empfänglichkeit von DC aus der Lunge und Alveolarmakrophagen im neonatalen LammModell gegenüber einer BRSV-Infektion konnte bereits nachgewiesen werden (Fach et al., 2007). Zudem wird diskutiert, dass HRSV in der Lage ist, in dendritischen Zellen zu persistieren, um zwischen den periodischen Ausbrüchen der durch das Virus vermittelten respiratorischen Erkrankung zu überleben (Hobson und Everard, 2008). Der Versuch, BRSV-infizierte Zellen in den PCLS mit spezifischen Antikörpern als DC zu identifizieren, scheiterte jedoch aufgrund der unspezifischen Bindung dieser Antikörper im gesamten Gewebe der PCLS. 91 Diskussion 6.2. Identifizierung des zellulären Rezeptors von HRSV Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Bedeutung des F-Proteins für die Interaktion von HRSV mit respiratorischen Epithelzellen untersucht und der zelluläre Interaktionspartner des F-Proteins identifiziert und charakterisiert werden. Für das HRSV F-Protein ist bereit bekannt, dass es, wie auch das G-Protein, in der Lage ist, an heparin-ähnliche Strukturen (Glykosaminglykane) zu binden (Karger et al., 2001; Techaarpornkul et al., 2001). Zudem wird dem F-Protein eine rezeptorbindende Eigenschaft zugeschrieben. Mit Hilfe von vermehrungsfähigen Deletionsmutanten, die an der Oberfläche nur das F-Protein besaßen und denen die Glykoproteine G und SH fehlten, konnte gezeigt werden, dass das F-Protein allein ausreichend ist, um eine Infektion einzuleiten. Die Bindung an mehr als eine Oberflächenkomponente konnte bereits für einige Viren gezeigt werden, und spiegelt den komplexen Prozess der Einleitung einer Infektion wider (Deng et al., 1996; WuDunn und Spear, 1989). Zudem könnte im Fall von RSV durch die Bindung eines spezifischen Proteinrezeptors der von der F2-Untereinheit vermittelte Wirtstropismus erklärt werden. Mit der Identifizierung und Charakterisierung des zellulären Rezeptors für HRSV kann dann ermittelt werden, ob der Rezeptor tatsächlich einen determinierenden Faktor für den Tropismus von RSV darstellt. Zur Identifizierung des zellulären Bindungspartners von HRSV wurden aus verschiedenen Zelllinien, die sich effizient mit HRSV infizieren ließen, Membranproteine isoliert. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der gewonnenen Membranproteine unter nichtreduzierenden Bedingungen wurden diese auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Bekannt ist, dass eine Vielzahl von Proteinen auf der Nitrozellulosemembran aufgrund von Renaturierung enzymatisch aktiv sind und somit konformationsabhängige Epitope präsentieren (Schwegmann-Wessels et al., 2004; 2002). So konnten die auf der Membran immobilisierten Proteine für Bindungsversuche mit dem SeV-hF benutzt werden. Aufgrund der mäßigen Vermehrungseigenschaften wurde HRSV als Ligand für nicht besonders erfolgsversprechend angesehen. Daher wurde das rekombinante SeV-hF eingesetzt, das ebenfalls das HRSV F-Protein auf der Oberfläche enthält. Dieses konnte zu wesentlich höheren Titern vermehrt und zudem als gereinigte Viruspräparation erhalten werden. 92 Diskussion 6.2.1. Das Hitzeschockprotein gp96 als Rezeptorkandidat In Bindungsversuchen der auf Nitrozellulose immobilisierten zellulären Membranproteine mit dem SeV-hF als F-Protein-Liganden, interagierten zwei Zellproteine deutlich mit dem HRSV F-Protein. Diese waren nach deren Detektion im Chemiimager als Proteinbanden mit einer Größe von ca. 110 kDa und über 130 kDa auf dem Teil der Membran, der mit dem SeV-hF, aber nicht auf dem Abschnitt, der mit dem Kontroll-Virus SeV-dsRed inkubiert worden war, zu sehen. Nach der somit nachgewiesenen Interaktion dieser Proteine mit dem HRSV F-Protein, wurden diese als Rezeptorkandidaten für HRSV angesehen. Mittels dieser auf Nitrozellulosemembran nachgewiesenen Proteine, konnten dann die jeweiligen Stücke im Acrylamidgel ausgeschnitten werden, um durch Proteinsequenzierung mittels des ESI-QTOF-Massenspektrometers die Aminosäuresequenz von Teilpeptiden dieser zu bestimmen. Bei dem Vergleich der ermittelten Sequenzen mit der humanen Datenbank konnte festgestellt werden, dass es sich in beiden Fällen um das Hitzeschockprotein gp96 handelt. Für dieses hauptsächlich im Zytoplasma lokalisierte Protein wurde bestätigt, dass geringere Mengen sich auch an der Zelloberfläche verschiedener Zellen detektieren lassen (Robert et al., 1999), besonders bei Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen (Arnold-Schild et al., 1999). Dabei bindet gp96 an der Zelloberfläche selbst an ein Rezeptorprotein, welches als CD91 identifiziert werden konnte. Die Tatsache, dass CD91, bekannt als Rezeptor für -Makroglobulin und low density lipoprotein (LDL), in die Rezeptor-vermittelte Endozytose involviert ist (Binder et al., 2000), passt durchaus zu der Vermutung, dass es sich bei gp96 um den Rezeptor von HRSV handelt. Des Weiteren wurden Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4 als potentielle Interaktionspartner von gp96 identifiziert. Auch hier scheint es eine Verbindung zu RSV zu geben, da gezeigt werden konnte, dass das RSV F-Protein in der Lage ist an TLR4 zu binden, wodurch es zu dessen Aktivierung kommt (Kurt-Jones et al., 2000). Schon im Zusammenhang mit dem Clostridium difficile-Toxin A (TxA) konnte die Rezeptoreigenschaft von gp96 nachgewiesen werden. So erleichtert gp96 als Komponente der Plasmamembran über die Interaktion mit TxA den zellulären Eintritt des Toxins (Na et al., 2008). 93 Diskussion 6.2. Zukünftige Analyse und funktionellen Charakterisierung von gp96 als zellulären Rezeptor von HRSV Erste Versuche zur Rezeptoranalyse des gp96 mittels eines gegen das Protein gerichteten Antikörpers wurden bereits durchgeführt. Dabei ergab sich, dass in Präparationen von HBE Membranproteinisolate, die über SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembran transferiert worden waren, sich Proteinbanden für gp96 bei einer Größe von ca. 105 kDa und über 130 kDa befanden. Diese sind direkt vergleichbar mit der Größe der Proteinbanden aus dem Bindungstest mit dem SeV-hF, die als zelluläre Bindungspartner des HRSV F-Proteins ermittelt und als gp96 identifiziert wurden. In weiterführenden Studien wird mittels des Antikörpers gegen gp96 die Verteilung des Rezeptorkandidaten in verschiedenen Zellen, die sich gut oder schlecht mit HRSV infizieren ließen, untersucht. Um sicherzustellen, dass es sich bei dem als gp96 identifizierten Protein um den Rezeptor von HRSV handelt, muss in zukünftigen Versuchen eine funktionelle Charakterisierung folgen, um die Rezeptorfunktion von gp96 zu bestätigen. Dazu wird z.B. das Gen für gp96 in ein Expressionsplasmid eingefügt und in solchen Zellen zur Überexpression gebracht, die sich nicht oder kaum durch HRSV infizieren lassen. Werden diese Zellen nach der Transfektion mit dem Plasmid empfänglich für eine HRSV-Infektion, ist die Bedeutung von gp96 als Rezeptor von HRSV gezeigt. 94 Literatur 7. Literatur Abinanti, F.R. 1961. Respiratory and enteric viruses in man and animals. Public Health Rep. 76:897-902. Ackermann, M., E. Peterhans, und R. Wyler. 1982. DNA of bovine herpesvirus type 1 in the trigeminal ganglia of latently infected calves. Am J Vet Res. 43:36-40. Alonso, A., J.M. Andres, J.R. Garmendia, I. Diez, J.M. Gil, und J. Ardura. 2007. Bronchiolitis due to respiratory syncytial virus in hospitalized children: a study of seasonal rhythm. Acta Paediatr. 96:731-5. Altmeyer, A., R.G. Maki, A.M. Feldweg, M. Heike, V.P. Protopopov, S.K. Masur, und P.K. Srivastava. 1996. Tumor-specific cell surface expression of the-KDEL containing, endoplasmic reticular heat shock protein gp96. Int J Cancer. 69:340-9. Anderson, L.J., P. Bingham, und J.C. Hierholzer. 1988. Neutralization of respiratory syncytial virus by individual and mixtures of F and G protein monoclonal antibodies. J Virol. 62:4232-8. Anderson, L.J., R.A. Parker, und R.L. Strikas. 1990. Association between respiratory syncytial virus outbreaks and lower respiratory tract deaths of infants and young children. J Infect Dis. 161:640-6. Arnold-Schild, D., D. Hanau, D. Spehner, C. Schmid, H.G. Rammensee, H. de la Salle, und H. Schild. 1999. Cutting edge: receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. J Immunol. 162:3757-60. Arumugham, R.G., R.C. Seid, Jr., S. Doyle, S.W. Hildreth, und P.R. Paradiso. 1989. Fatty acid acylation of the fusion glycoprotein of human respiratory syncytial virus. J Biol Chem. 264:10339-42. Baker, J.C., T.R. Ames, und R.J. Markham. 1986. Seroepizootiologic study of bovine respiratory syncytial virus in a dairy herd. Am J Vet Res. 47:240-5. Bals, R., C. Beisswenger, S. Blouquit, und T. Chinet. 2004. Isolation and air-liquid interface culture of human large airway and bronchiolar epithelial cells. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2:49-51. Banchereau, J., und R.M. Steinman. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392:245-52. Barik, S., T. McLean, und L.C. Dupuy. 1995. Phosphorylation of Ser232 directly regulates the transcriptional activity of the P protein of human respiratory syncytial virus: phosphorylation of Ser237 may play an accessory role. Virology. 213:405-12. Basak, A., M. Zhong, J.S. Munzer, M. Chretien, und N.G. Seidah. 2001. Implication of the proprotein convertases furin, PC5 and PC7 in the cleavage of surface glycoproteins of Hong Kong, Ebola and respiratory syncytial viruses: a comparative analysis with fluorogenic peptides. Biochem J. 353:537-45. Binder, R.J., D.K. Han, und P.K. Srivastava. 2000. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nat Immunol. 1:151-5. Bose, S., und A.K. Banerjee. 2002. Role of heparan sulfate in human parainfluenza virus type 3 infection. Virology. 298:73-83. 95 Literatur Bose, S., A. Malur, und A.K. Banerjee. 2001. Polarity of human parainfluenza virus type 3 infection in polarized human lung epithelial A549 cells: role of microfilament and microtubule. J Virol. 75:1984-9. Bousse, T., T. Takimoto, W.L. Gorman, T. Takahashi, und A. Portner. 1994. Regions on the hemagglutinin-neuraminidase proteins of human parainfluenza virus type-1 and Sendai virus important for membrane fusion. Virology. 204:506-14. Bryson, D.G., M.S. McNulty, R.M. McCracken, und P.F. Cush. 1983. Ultrastructural features of experimental parainfluenza type 3 virus pneumonia in calves. J Comp Pathol. 93:397-414. Bukau, B., E. Deuerling, C. Pfund, und E.A. Craig. 2000. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101:119-22. Byrne, K.M., D.W. Horohov, und K.G. Kousoulas. 1995. Glycoprotein B of bovine herpesvirus-1 binds heparin. Virology. 209:230-5. Calder, L.J., L. Gonzalez-Reyes, B. Garcia-Barreno, S.A. Wharton, J.J. Skehel, D.C. Wiley, und J.A. Melero. 2000. Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies. Virology. 271:122-31. Campbell, S.G., und C.A. Cookingham. 1978. The enigma of winter dysentery. Cornell Vet. 68:423-41. Carter, J.J., A.D. Weinberg, A. Pollard, R. Reeves, J.A. Magnuson, und N.S. Magnuson. 1989. Inhibition of T-lymphocyte mitogenic responses and effects on cell functions by bovine herpesvirus 1. J Virol. 63:1525-30. Chanock, R., B. Roizman, und R. Myers. 1957. Recovery from infants with respiratory illness of a virus related to chimpanzee coryza agent (CCA). I. Isolation, properties and characterization. Am J Hyg. 66:281-90. Chanock, R.M., B.R. Murphy, und P.L. Collins. 2001. Fields Virology. Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia. Clark, M.A. 1993. Bovine coronavirus. Br Vet J. 149:51-70. Collins, P.L., E. Camargo, und M.G. Hill. 1999. Support plasmids and support proteins required for recovery of recombinant respiratory syncytial virus. Virology. 259:251-5. Collins, P.L., M.G. Hill, und P.R. Johnson. 1990. The two open reading frames of the 22K mRNA of human respiratory syncytial virus: sequence comparison of antigenic subgroups A and B and expression in vitro. J Gen Virol. 71 ( Pt 12):3015-20. Collins, P.L., K. McIntosh, und R.M. Chanock. 2001. Fields Virology. Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia, PA. 1443-1485 pp. Compans, R.W., und G. Herrler. 2005. Mucosal Immunology. Academic Press., San Diego. 769-782 pp. Csermely, P., T. Schnaider, C. Soti, Z. Prohaszka, und G. Nardai. 1998. The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol Ther. 79:129-68. Deng, H., R. Liu, W. Ellmeier, S. Choe, D. Unutmaz, M. Burkhart, P. Di Marzio, S. Marmon, R.E. Sutton, C.M. Hill, C.B. Davis, S.C. Peiper, T.J. Schall, D.R. Littman, und N.R. Landau. 1996. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature. 381:661-6. 96 Literatur Dupuy, L.C., S. Dobson, V. Bitko, und S. Barik. 1999. Casein kinase 2-mediated phosphorylation of respiratory syncytial virus phosphoprotein P is essential for the transcription elongation activity of the viral polymerase; phosphorylation by casein kinase 1 occurs mainly at Ser(215) and is without effect. J Virol. 73:8384-92. Dylla, D.E., D.E. Michele, K.P. Campbell, und P.B. McCray, Jr. 2008. Basolateral entry and release of New and Old World arenaviruses from human airway epithelia. J Virol. 82:6034-8. Ebsen, M., G. Mogilevski, O. Anhenn, V. Maiworm, D. Theegarten, J. Schwarze, und K. Morgenroth. 2002. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathol Res Pract. 198:747-53. Elango, N., M. Satake, J.E. Coligan, E. Norrby, E. Camargo, und S. Venkatesan. 1985. Respiratory syncytial virus fusion glycoprotein: nucleotide sequence of mRNA, identification of cleavage activation site and amino acid sequence of N-terminus of F1 subunit. Nucleic Acids Res. 13:1559-74. Engels, M., F. Steck, und R. Wyler. 1981. Comparison of the genomes of infectious bovine rhinotracheitis and infectious pustular vulvovaginitis virus strains by restriction endonuclease analysis. Arch Virol. 67:169-74. Fach, S.J., D.K. Meyerholz, J.M. Gallup, M.R. Ackermann, H.D. Lehmkuhl, und R.E. Sacco. 2007. Neonatal ovine pulmonary dendritic cells support bovine respiratory syncytial virus replication with enhanced interleukin (IL)-4 And IL-10 gene transcripts. Viral Immunol. 20:119-30. Falsey, A.R., R.M. McCann, W.J. Hall, M.A. Tanner, M.M. Criddle, M.A. Formica, C.S. Irvine, J.E. Kolassa, W.H. Barker, und J.J. Treanor. 1995. Acute respiratory tract infection in daycare centers for older persons. J Am Geriatr Soc. 43:30-6. Fearns, R., und P.L. Collins. 1999. Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol. 73:5852-64. Fuentes, S., K.C. Tran, P. Luthra, M.N. Teng, und B. He. 2007. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J Virol. 81:8361-6. Fuller, S., C.H. von Bonsdorff, und K. Simons. 1984. Vesicular stomatitis virus infects and matures only through the basolateral surface of the polarized epithelial cell line, MDCK. Cell. 38:65-77. Fulton, R.W., C.W. Purdy, A.W. Confer, J.T. Saliki, R.W. Loan, R.E. Briggs, und L.J. Burge. 2000. Bovine viral diarrhea viral infections in feeder calves with respiratory disease: interactions with Pasteurella spp., parainfluenza-3 virus, and bovine respiratory syncytial virus. Can J Vet Res. 64:151-9. Gabathuler, R., H. Boller, K. Gabathuler, R.O. Hess, R. Kocherhans, und R. Wyler. 1987. [Infectious respiratory tract diseases in cattle in the winter of 1985/86: detection of infection by bovine respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 by immunofluorescence in nasal swab samples and by antibody titer increase in serum (ELISA)]. Schweiz Arch Tierheilkd. 129:457-71. Gillette, K.G., und P.C. Smith. 1985. Respiratory syncytial virus infection in transported calves. Am J Vet Res. 46:2596-600. Glezen, W.P., L.H. Taber, A.L. Frank, und J.A. Kasel. 1986. Risk of primary infection and reinfection with respiratory syncytial virus. Am J Dis Child. 140:543-6. Gonzalez-Reyes, L., M.B. Ruiz-Arguello, B. Garcia-Barreno, L. Calder, J.A. Lopez, J.P. Albar, J.J. Skehel, D.C. Wiley, und J.A. Melero. 2001. Cleavage of the human 97 Literatur respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 98:9859-64. Griebel, P.J., L. Qualtiere, W.C. Davis, A. Gee, H. Bielefeldt Ohmann, M.J. Lawman, und L.A. Babiuk. 1987a. T lymphocyte population dynamics and function following a primary bovine herpesvirus type-1 infection. Viral Immunol. 1:287-304. Griebel, P.J., L. Qualtiere, W.C. Davis, M.J. Lawman, und L.A. Babiuk. 1987b. Bovine peripheral blood leukocyte subpopulation dynamics following a primary bovine herpesvirus-1 infection. Viral Immunol. 1:267-86. Gruber, C., und S. Levine. 1985. Respiratory syncytial virus polypeptides. V. The kinetics of glycoprotein synthesis. J Gen Virol. 66 ( Pt 6):1241-7. Gupta, R.S. 1995. Phylogenetic analysis of the 90 kD heat shock family of protein sequences and an examination of the relationship among animals, plants, and fungi species. Mol Biol Evol. 12:1063-73. Harrington, R.D., T.M. Hooton, R.C. Hackman, G.A. Storch, B. Osborne, C.A. Gleaves, A. Benson, und J.D. Meyers. 1992. An outbreak of respiratory syncytial virus in a bone marrow transplant center. J Infect Dis. 165:987-93. Hartl, F.U. 1996. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature. 381:571-9. Heath, R.B. 1979. The pathogenesis of respiratory viral infection. Postgrad Med J. 55:122-7. Henderson, F.W. 1987. Pulmonary infections with respiratory syncytial virus and the parainfluenza viruses. Semin Respir Infect. 2:112-21. Henderson, F.W., A.M. Collier, W.A. Clyde, Jr., und F.W. Denny. 1979. Respiratorysyncytial-virus infections, reinfections and immunity. A prospective, longitudinal study in young children. N Engl J Med. 300:530-4. Henderson, G., J. Murray, und R.P. Yeo. 2002. Sorting of the respiratory syncytial virus matrix protein into detergent-resistant structures is dependent on cell-surface expression of the glycoproteins. Virology. 300:244-54. Herrler, G., S. Szepanski, und B. Schultze. 1991. 9-O-acetylated sialic acid, a receptor determinant for influenza C virus and coronaviruses. Behring Inst Mitt:177-84. Hobson, L., und M.L. Everard. 2008. Persistent of respiratory syncytial virus in human dendritic cells and influence of nitric oxide. Clin Exp Immunol. 151:359-66. Huang, Y.T., und G.W. Wertz. 1982. The genome of respiratory syncytial virus is a negativestranded RNA that codes for at least seven mRNA species. J Virol. 43:150-7. Inaba, Y., Y. Tanaka, T. Omori, und M. Matumoto. 1970. Isolation of bovine respiratory syncytial virus. Jpn J Exp Med. 40:473-4. Jacobs, J.W., und N. Edington. 1975. Experimental infection of calves with respiratory syncytial virus. Res Vet Sci. 18:299-306. Johnson, J.E., R.A. Gonzales, S.J. Olson, P.F. Wright, und B.S. Graham. 2007. The histopathology of fatal untreated human respiratory syncytial virus infection. Mod Pathol. 20:108-19. Joos, G.F., und R.A. Pauwels. 2001. Tachykinin receptor antagonists: potential in airways diseases. Curr Opin Pharmacol. 1:235-41. Karger, A., U. Schmidt, und U.J. Buchholz. 2001. Recombinant bovine respiratory syncytial virus with deletions of the G or SH genes: G and F proteins bind heparin. J Gen Virol. 82:631-40. Kimman, T.G., und F. Westenbrink. 1990. Immunity to human and bovine respiratory syncytial virus. Arch Virol. 112:1-25. 98 Literatur Kimman, T.G., F. Westenbrink, B.E. Schreuder, und P.J. Straver. 1987. Local and systemic antibody response to bovine respiratory syncytial virus infection and reinfection in calves with and without maternal antibodies. J Clin Microbiol. 25:1097-106. Kunkel, F., und G. Herrler. 1993. Structural and functional analysis of the surface protein of human coronavirus OC43. Virology. 195:195-202. Kuroya, M., und N. Ishida. 1953. Newborn virus pneumonitis (type Sendai). II. The isolation of a new virus possessing hemagglutinin activity. Yokohama Med Bull. 4:217-33. Kurt-Jones, E.A., L. Popova, L. Kwinn, L.M. Haynes, L.P. Jones, R.A. Tripp, E.E. Walsh, M.W. Freeman, D.T. Golenbock, L.J. Anderson, und R.W. Finberg. 2000. Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus. Nat Immunol. 1:398-401. Kyhse-Andersen, J. 1984. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J Biochem Biophys Methods. 10:203-9. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-5. Lai, M.M., und D. Cavanagh. 1997. The molecular biology of coronaviruses. Adv Virus Res. 48:1-100. Lamb, R., und D. Kolakofsky. 2001. Fields Virology. Lippincott Wiliams Wilkins, Philadelphia, PA. Lee, M.S., R.E. Walker, und P.M. Mendelman. 2005. Medical burden of respiratory syncytial virus and parainfluenza virus type 3 infection among US children. Implications for design of vaccine trials. Hum Vaccin. 1:6-11. Lehmkuhl, H.D., und P.M. Gough. 1977. Investigation of causative agents of bovine respiratory tract disease in a beef cow-calf herd with an early weaning program. Am J Vet Res. 38:1717-20. Leonard, V.H., P.L. Sinn, G. Hodge, T. Miest, P. Devaux, N. Oezguen, W. Braun, P.B. McCray, Jr., M.B. McChesney, und R. Cattaneo. 2008. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118:2448-58. Lerch, R.A., E.J. Stott, und G.W. Wertz. 1989. Characterization of bovine respiratory syncytial virus proteins and mRNAs and generation of cDNA clones to the viral mRNAs. J Virol. 63:833-40. Liebermann, H., und R. Riebe. 1981. [Isolation of bovine syncytial virus in East Germany]. Arch Exp Veterinarmed. 35:917-9. Lin, X., K.L. O'Reilly, und J. Storz. 1997. Infection of polarized epithelial cells with enteric and respiratory tract bovine coronaviruses and release of virus progeny. Am J Vet Res. 58:1120-4. Linderoth, N.A., A. Popowicz, und S. Sastry. 2000. Identification of the peptide-binding site in the heat shock chaperone/tumor rejection antigen gp96 (Grp94). J Biol Chem. 275:5472-7. Lindquist, S. 1986. The heat-shock response. Annu Rev Biochem. 55:1151-91. Lotthammer, K.H., und J. Ehlers. 1990. [Epidemiologic studies of the detection of viral infection agents in calf losses in the Weser-Ems region]. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 97:418-20. 99 Literatur Mallipeddi, S.K., und S.K. Samal. 1993a. Sequence variability of the glycoprotein gene of bovine respiratory syncytial virus. J Gen Virol. 74 ( Pt 9):2001-4. Mallipeddi, S.K., und S.K. Samal. 1993b. Structural difference in the fusion protein among strains of bovine respiratory syncytial virus. Vet Microbiol. 36:359-67. Marozin, S., U. Prank, und B. Sodeik. 2004. Herpes simplex virus type 1 infection of polarized epithelial cells requires microtubules and access to receptors present at cellcell contact sites. J Gen Virol. 85:775-86. Martinez, F.D. 2003. Respiratory syncytial virus bronchiolitis and the pathogenesis of childhood asthma. Pediatr Infect Dis J. 22:S76-82. Modrow, S., D. Falke, und U. Truyen. 2003. Molekulare Virologie. Akademischer Verlag GmbH Heidelberg, Berlin. Morris, J.A., R.E. Blount, und S. R. E. 1956. Recovery of cytopathogenic agent from chimpanzees with coryza. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. . 92 544-549. Morrison, T.G. 1988. Structure, function, and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins. Virus Res. 10:113-35. Moscona, A. 1997. Interaction of human parainfluenza virus type 3 with the host cell surface. Pediatr Infect Dis J. 16:917-24. Na, X., H. Kim, M.P. Moyer, C. Pothoulakis, und J.T. LaMont. 2008. gp96 is a human colonocyte plasma membrane binding protein for Clostridium difficile toxin A. Infect Immun. 76:2862-71. Nelson, D.R., C.J. Mare, und R.D. Glock. 1972. Infectious bovine rhinotracheitis (Herpesvirus bovis) infection in swine. Am J Vet Res. 33:1209-15. Paccaud, M.F., und C. Jacquier. 1970. A respiratory syncytial virus of bovine origin. Arch Gesamte Virusforsch. 30:327-42. Parker, J.C., M.D. Whiteman, und C.B. Richter. 1978. Susceptibility of inbred and outbred mouse strains to Sendai virus and prevalence of infection in laboratory rodents. Infect Immun. 19:123-30. Pastey, M.K., und S.K. Samal. 1993. Structure and sequence comparison of bovine respiratory syncytial virus fusion protein. Virus Res. 29:195-202. Pastey, M.K., und S.K. Samal. 1997. Analysis of bovine respiratory syncytial virus envelope glycoproteins in cell fusion. J Gen Virol. 78 ( Pt 8):1885-9. Percy, D.H., und D.J. Palmer. 1997. Pathogenesis of Sendai virus infection in the Syrian hamster. Lab Anim Sci. 47:132-7. Pringle, C.R. 1999. Virus taxonomy--1999. The universal system of virus taxonomy, updated to include the new proposals ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses during 1998. Arch Virol. 144:421-9. Qu, D., R.A. Mazzarella, und M. Green. 1994. Analysis of the structure and synthesis of GRP94, an abundant stress protein of the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol. 13:117-24. Reisinger, R.C., K.L. Heddleston, und C.A. Manthei. 1959. A myxovirus (SF-4) associated with shipping fever of cattle. J Am Vet Med Assoc. 135:147-52. Robert, J., A. Menoret, S. Basu, N. Cohen, und P.R. Srivastava. 2001. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31:186-95. Robert, J., A. Menoret, und N. Cohen. 1999. Cell surface expression of the endoplasmic reticular heat shock protein gp96 is phylogenetically conserved. J Immunol. 163:41339. 100 Literatur Roizman, B., und D.M. Knipe. 2001. Fields Virology. Lipincott Williams Wilkins, Philadelphia, PA. Saif, L.J., D.R. Redman, P.D. Moorhead, und K.W. Theil. 1986. Experimentally induced coronavirus infections in calves: viral replication in the respiratory and intestinal tracts. Am J Vet Res. 47:1426-32. Scheid, A., und P.W. Choppin. 1974a. The hemagglutinating and neuraminidase protein of a paramyxovirus: interaction with neuraminic acid in affinity chromatography. Virology. 62:125-33. Scheid, A., und P.W. Choppin. 1974b. Identification of biological activities of paramyxovirus glycoproteins. Activation of cell fusion, hemolysis, and infectivity of proteolytic cleavage of an inactive precursor protein of Sendai virus. Virology. 57:475-90. Schelhaas, M., M. Jansen, I. Haase, und D. Knebel-Morsdorf. 2003. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J Gen Virol. 84:2473-84. Schlender, J., G. Zimmer, G. Herrler, und K.K. Conzelmann. 2003. Respiratory syncytial virus (RSV) fusion protein subunit F2, not attachment protein G, determines the specificity of RSV infection. J Virol. 77:4609-16. Schmidt, U., J. Beyer, U. Polster, L.J. Gershwin, und U.J. Buchholz. 2002. Mucosal immunization with live recombinant bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and recombinant BRSV lacking the envelope glycoprotein G protects against challenge with wild-type BRSV. J Virol. 76:12355-9. Schultze, B., H.J. Gross, R. Brossmer, und G. Herrler. 1991a. The S protein of bovine coronavirus is a hemagglutinin recognizing 9-O-acetylated sialic acid as a receptor determinant. J Virol. 65:6232-7. Schultze, B., K. Wahn, H.D. Klenk, und G. Herrler. 1991b. Isolated HE-protein from hemagglutinating encephalomyelitis virus and bovine coronavirus has receptordestroying and receptor-binding activity. Virology. 180:221-8. Schultze, B., G. Zimmer, und G. Herrler. 1996. Virus entry into a polarized epithelial cell line (MDCK): similarities and dissimilarities between influenza C virus and bovine coronavirus. J Gen Virol. 77 ( Pt 10):2507-14. Schwarze, J., D.R. O'Donnell, A. Rohwedder, und P.J. Openshaw. 2004. Latency and persistence of respiratory syncytial virus despite T cell immunity. Am J Respir Crit Care Med. 169:801-5. Schwegmann-Wessels, C., M. Al-Falah, D. Escors, Z. Wang, G. Zimmer, H. Deng, L. Enjuanes, H.Y. Naim, und G. Herrler. 2004. A novel sorting signal for intracellular localization is present in the S protein of a porcine coronavirus but absent from severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus. J Biol Chem. 279:43661-6. Schwegmann-Wessels, C., G. Zimmer, H. Laude, L. Enjuanes, und G. Herrler. 2002. Binding of transmissible gastroenteritis coronavirus to cell surface sialoglycoproteins. J Virol. 76:6037-43. Shay, D.K., R.C. Holman, R.D. Newman, L.L. Liu, J.W. Stout, und L.J. Anderson. 1999. Bronchiolitis-associated hospitalizations among US children, 1980-1996. Jama. 282:1440-6. Shevchenko, A., M. Wilm, O. Vorm, und M. Mann. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68:850-8. 101 Literatur Shroyer, E.L., und B.C. Easterday. 1968. Studies on the pathogenesis of infectious bovine rhinotracheitis following aerosol exposure. Cornell Vet. 58:442-61. Sigurs, N., R. Bjarnason, F. Sigurbergsson, und B. Kjellman. 2000. Respiratory syncytial virus bronchiolitis in infancy is an important risk factor for asthma and allergy at age 7. Am J Respir Crit Care Med. 161:1501-7. Simons, K., und S.D. Fuller. 1985. Cell surface polarity in epithelia. Annu Rev Cell Biol. 1:243-88. Sparrow, S. 1980. Diseases of pet rodents. J Small Anim Pract. 21:1-16. Spilki, F.R., R.S. de Almeida, J. Campalans, und C.W. Arns. 2006. Susceptibility of different cell lines to infection with bovine respiratory syncytial virus. J Virol Methods. 131:130-3. Srikumaran, S., C.L. Kelling, und A. Ambagala. 2007. Immune evasion by pathogens of bovine respiratory disease complex. Anim Health Res Rev. 8:215-29. Stein, R.T., D. Sherrill, W.J. Morgan, C.J. Holberg, M. Halonen, L.M. Taussig, A.L. Wright, und F.D. Martinez. 1999. Respiratory syncytial virus in early life and risk of wheeze and allergy by age 13 years. Lancet. 354:541-5. Stott, E.J., und G. Taylor. 1985. Respiratory syncytial virus. Brief review. Arch Virol. 84:152. Stott, E.J., L.H. Thomas, A.P. Collins, S. Crouch, J. Jebbett, G.S. Smith, P.D. Luther, und R. Caswell. 1980. A survey of virus infections of the respiratory tract of cattle and their association with disease. J Hyg (Lond). 85:257-70. Tashiro, M., Y. Yokogoshi, K. Tobita, J.T. Seto, R. Rott, und H. Kido. 1992. Tryptase Clara, an activating protease for Sendai virus in rat lungs, is involved in pneumopathogenicity. J Virol. 66:7211-6. Techaarpornkul, S., N. Barretto, und M.E. Peeples. 2001. Functional analysis of recombinant respiratory syncytial virus deletion mutants lacking the small hydrophobic and/or attachment glycoprotein gene. J Virol. 75:6825-34. Techaarpornkul, S., P.L. Collins, und M.E. Peeples. 2002. Respiratory syncytial virus with the fusion protein as its only viral glycoprotein is less dependent on cellular glycosaminoglycans for attachment than complete virus. Virology. 294:296-304. Teng, M.N., und P.L. Collins. 2002. The central conserved cystine noose of the attachment G protein of human respiratory syncytial virus is not required for efficient viral infection in vitro or in vivo. J Virol. 76:6164-71. Teng, M.N., S.S. Whitehead, und P.L. Collins. 2001. Contribution of the respiratory syncytial virus G glycoprotein and its secreted and membrane-bound forms to virus replication in vitro and in vivo. Virology. 289:283-96. Thiry, E., J. Saliki, M. Bublot, und P.P. Pastoret. 1987. Reactivation of infectious bovine rhinotracheitis virus by transport. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 10:59-63. Thomas, L.H., R.S. Cook, S.G. Wyld, J.M. Furze, und G. Taylor. 1998. Passive protection of gnotobiotic calves using monoclonal antibodies directed at different epitopes on the fusion protein of bovine respiratory syncytial virus. J Infect Dis. 177:874-80. Thomas, L.H., E.J. Slott, A.P. Collins, und J. Jebbett. 1984. Experimental pneumonia in gnotobiotic calves produced by respiratory syncytial virus. Br J Exp Pathol. 65:19-28. Tikoo, S.K., M. Campos, und L.A. Babiuk. 1995. Bovine herpesvirus 1 (BHV-1): biology, pathogenesis, and control. Adv Virus Res. 45:191-223. Tjornehoj, K., A. Uttenthal, B. Viuff, L.E. Larsen, C. Rontved, und L. Ronsholt. 2003. An experimental infection model for reproduction of calf pneumonia with bovine 102 Literatur respiratory syncytial virus (BRSV) based on one combined exposure of calves. Res Vet Sci. 74:55-65. Tsukita, S., M. Furuse, und M. Itoh. 2001. Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2:285-93. Vabulas, R.M., S. Braedel, N. Hilf, H. Singh-Jasuja, S. Herter, P. Ahmad-Nejad, C.J. Kirschning, C. Da Costa, H.G. Rammensee, H. Wagner, und H. Schild. 2002. The endoplasmic reticulum-resident heat shock protein Gp96 activates dendritic cells via the Toll-like receptor 2/4 pathway. J Biol Chem. 277:20847-53. Valarcher, J.F., J. Furze, S.G. Wyld, R. Cook, G. Zimmer, G. Herrler, und G. Taylor. 2006. Bovine respiratory syncytial virus lacking the virokinin or with a mutation in furin cleavage site RA(R/K)R109 induces less pulmonary inflammation without impeding the induction of protective immunity in calves. J Gen Virol. 87:1659-67. Valarcher, J.F., und G. Taylor. 2007. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res. 38:153-80. Van der Poel, W.H., A. Brand, J.A. Kramps, und J.T. Van Oirschot. 1994. Respiratory syncytial virus infections in human beings and in cattle. J Infect. 29:215-28. van Haarst, J.M., H.J. de Wit, H.A. Drexhage, und H.C. Hoogsteden. 1994. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10:487-92. Verhoeff, J., M. Van der Ban, und A.P. van Nieuwstadt. 1984. Bovine respiratory syncytial virus infections in young dairy cattle: clinical and haematological findings. Vet Rec. 114:9-12. Vietmeier, J., F. Niedorf, W. Baumer, C. Martin, E. Deegen, B. Ohnesorge, und M. Kietzmann. 2007. Reactivity of equine airways--a study on precision-cut lung slices. Vet Res Commun. 31:611-9. Viuff, B., K. Tjornehoj, L.E. Larsen, C.M. Rontved, A. Uttenthal, L. Ronsholt, und S. Alexandersen. 2002. Replication and clearance of respiratory syncytial virus: apoptosis is an important pathway of virus clearance after experimental infection with bovine respiratory syncytial virus. Am J Pathol. 161:2195-207. Viuff, B., A. Uttenthal, C. Tegtmeier, und S. Alexandersen. 1996. Sites of replication of bovine respiratory syncytial virus in naturally infected calves as determined by in situ hybridization. Vet Pathol. 33:383-90. Vlasak, R., W. Luytjes, W. Spaan, und P. Palese. 1988. Human and bovine coronaviruses recognize sialic acid-containing receptors similar to those of influenza C viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 85:4526-9. Wertz, G.W., M. Krieger, und L.A. Ball. 1989. Structure and cell surface maturation of the attachment glycoprotein of human respiratory syncytial virus in a cell line deficient in O glycosylation. J Virol. 63:4767-76. White, M.E., Y.H. Schukken, und B. Tanksley. 1989. Space-time clustering of, and risk factors for, farmer-diagnosed winter dysentery in dairy cattle. Can Vet J. 30:948-951. Wohlsen, A., C. Martin, E. Vollmer, D. Branscheid, H. Magnussen, W.M. Becker, U. Lepp, und S. Uhlig. 2003. The early allergic response in small airways of human precisioncut lung slices. Eur Respir J. 21:1024-32. Wu, P.S., R.W. Ledeen, S. Udem, und Y.A. Isaacson. 1980. Nature of the Sendai virus receptor: glycoprotein versus ganglioside. J Virol. 33:304-10. WuDunn, D., und P.G. Spear. 1989. Initial interaction of herpes simplex virus with cells is binding to heparan sulfate. J Virol. 63:52-8. 103 Literatur You, Y., E.J. Richer, T. Huang, und S.L. Brody. 2002. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283:L1315-21. Zhang, L., A. Bukreyev, C.I. Thompson, B. Watson, M.E. Peeples, P.L. Collins, und R.J. Pickles. 2005. Infection of ciliated cells by human parainfluenza virus type 3 in an in vitro model of human airway epithelium. J Virol. 79:1113-24. Zhang, L., M.E. Peeples, R.C. Boucher, P.L. Collins, und R.J. Pickles. 2002. Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology. J Virol. 76:5654-66. Zimmer, G., S. Bossow, L. Kolesnikova, M. Hinz, W.J. Neubert, und G. Herrler. 2005. A chimeric respiratory syncytial virus fusion protein functionally replaces the F and HN glycoproteins in recombinant Sendai virus. J Virol. 79:10467-77. Zimmer, G., L. Budz, und G. Herrler. 2001. Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein. Cleavage at two furin consensus sequences. J Biol Chem. 276:31642-50. Zimmer, G., K.K. Conzelmann, und G. Herrler. 2002. Cleavage at the furin consensus sequence RAR/KR(109) and presence of the intervening peptide of the respiratory syncytial virus fusion protein are dispensable for virus replication in cell culture. J Virol. 76:9218-24. Zimmer, G., M. Rohn, G.P. McGregor, M. Schemann, K.K. Conzelmann, und G. Herrler. 2003. Virokinin, a bioactive peptide of the tachykinin family, is released from the fusion protein of bovine respiratory syncytial virus. J Biol Chem. 278:46854-61. Anhang 104 8. Anhang Danksagung Insbesondere danke ich Herrn Prof. Dr. Georg Herrler, der mir nicht nur ein äußerst spannendes Thema überlassen, sondern auch mein Interesse für die Forschung gefestigt hat. Ich danke ihm für die fachliche Anleitung und Diskussionsbereitschaft, sowie für die Möglichkeit meine eigenen Ideen zu entwickeln und umzusetzen. Frau Dr. Christel Schwegmann-Weßels danke ich für die Betreuung in der Anfangsphase der Arbeit, die mir den Einstieg sehr erleichtert hat. Außerdem freue ich mich sehr darüber, dass Du mich auch nach Deiner Babypause mit fachlichem Wissen und anregenden Diskussionen unterstützt. Sabine Uhlenbruck danke ich zum einen für die Anfertigung der PCLS und die Arbeit mit diesen, zum anderen für die großartige Zusammenarbeit. Danke, dass Du nicht nur fachlich für mich da warst und die Zeit mit mir zusammen „durchgestanden“ hast. Bei meinen Supervisoren Herrn Prof. Dr. Karsten Feige und Herrn Prof. Dr. Thomas Tschernig bedanke ich mich für die hilfreichen Betreuungsgruppengespräche und wertvollen Ratschläge. Frau Prof. Dr. Andrea Maisner danke ich für die Übernahme der externen Begutachtung dieser Arbeit. Bei Herrn Dr. Falk Büttner bedanke ich mich Proteinsequenzierungen und die nette Zusammenarbeit. für die Durchführung der 105 Anhang Bei Herrn Prof. Dr. Dr. Robert Bals möchte ich mich für die Methodik zur Erstellung von ALI-Kulturen bedanken, ebenso bei Herrn Christian Herr für die hilfsbereite Beantwortung meiner Fragen zu diesem System Frau Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein danke ich für ihr fachliches Wissen in Bezug auf die Rinderlungenschnitte und die damit verbundenen hilfreichen Diskussionen. Herrn Dr. Rudolf Bauerfeind danke ich für die Einarbeitung am konfokalen Lasermikroskop. Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern des Instituts für Virologie für ihre Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima bedanken. Besonderer Dank geht an meine „Büro-Mitbewohner“ André und Caro, die viel Humor bewiesen haben und mittlerweile gute Freunde sind. Den „Labor-Mitbewohnern“ Alexandra, Anna, Christine, Diane, Jörg, Julia, Katarina, Maren, Markus H., Markus L., Martina, Meike, Nazeer, Nicole, Sabine, Sahar, Sandra und Trust danke ich für die schönen und lustigen Momente nicht nur während der Arbeitszeit. Erst die Unterstützung meiner Familie und insbesondere meiner Mutter hat mir ermöglicht diesen Weg zu gehen. Ich danke Euch, dass Ihr immer an mich glaubt. Danke Schwesterchen - sehen wir dann... Heike und Helmut danke ich für ihre Oase, in die ich immer einkehren kann. Danke für so Vieles. Nils, Danke für jeden Tag...
