Prof. Dr. R. Glockshuber, Institut für Molekularbiologie und Biophysik
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Prof. Dr. R. Glockshuber, Institut für Molekularbiologie und Biophysik, ETH Hönggerberg, CH-8093 Zürich Dieses Skript beinhaltet nur denjenigen Teil der Vorlesung von R. Glockshuber, der im begleitenden Buch “Fundamentals of Biochemisty” von Voet/Voet/Pratt nicht enthalten ist. Darüber hinaus sind die Kapitel 1.4., 2., 5., 7-10, 13 und 27.3C des Buchs Stoff der Vorlesung. Inhalt Seite 1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.1.1. 1.2.1.2. 1.2.1.3. 1.2.1.4. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.3.1. Proteinfaltung und Proteinstabilität Proteinfaltung: Definition und die zentralen Dogmen Die thermodynamische Stabilität von Proteinen Wechselwirkungen, die die native Tertiärstruktur von Proteinen stabilisieren Wasserstoffbrücken Ionische Wechselwirkungen van der Waals Wechselwirkungen Hydrophobe Wechselwirkungen Die Gesamtstabilität von Proteinen Experimentelle Bestimmung der Proteinstabilität Das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung: Denaturierungsmittelinduzierte Entfaltungsgleichgewichte und die Bedeutung der Kooperativität 1.2.4. Die Temperaturabhängigkeit der Proteinstabilität 1.3. Proteinfaltung in vivo und in vitro 1.3.1. Die Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation, Molekulare Chaperone 1.3.2. Wie schnell können sich Proteine falten? 1.3.3. Mögliche langsame Faltungsreaktionen 1.3.3.1. Isomerisierung von X-Pro Peptidbindungen 1.3.3.2. Die Bildung von Disulfidbrücken 2. 2.1. 2.2. 2.3. Das chemische Bindungsgleichgewicht Die Bedeutung von Bindungs- und Dissoziationskonstanten Die Analogie zwischen Bindungsgleichgewichten und Säure-Base Gleichgewichten Die pH-Abhängigkeit der Gesamtladung von Proteinen 2 2 3 3 3 5 7 8 8 9 9 13 14 14 16 18 18 19 21 21 23 24 Anhang: A1: Spektroskopische Methoden zur Bestimmung der Proteinkonformation in Lösung: Absorptions-, Fluorszenz- und Circulardichroismus-Spektroskopie A1.1-A1.3) 26-31 A2: Physikalische Grössen und ihre Einheiten 33 A3: Biologische Puffersysteme 34 1. Proteinfaltung und Proteinstabilität 1.1. Proteinfaltung: Definition und die zentralen Dogmen Unter dem Begriff „Proteinfaltung“ versteht man den Prozess, bei dem eine unstrukturierte Polypeptidkette (Abkürzung „U“ für „unfolded“) in wässriger Lösung spontan ihre biologisch aktive, dreidimensionale Struktur (Abkürzung „N“ für „native“) einnimmt. Dieser Prozess kann in der Zelle während oder nach der Synthese der Polypeptidkette am Ribosom stattfinden. Entfaltete, unstrukturierte Polypeptidkette (U) Natives, biologisch aktives Protein (N) Der Faltungsprozess beinhaltet die folgenden, zentralen Dogmen der Biochemie von Proteinen: - Die biologisch aktive, dreidimensionale Struktur eines Proteins (der native Zustand des Proteins) ist einzigartig und ausschliesslich durch seine Aminosäuresequenz und Kettenlänge (Primärstruktur) festgelegt. - Die biologisch aktive, dreidimensionale Struktur eines Proteins ist der thermodynamisch günstigste Zustand, den eine Polypeptidkette in wässriger Lösung einnehmen kann. Dies bedeutet, dass wenn man z.B. 1 Million identischer, entfalteter Polypeptidketten in eine physiologische Pufferlösung gibt, jedes einzelne Polypeptid spontan exakt die selbe dreidimensionale Struktur einnimmt. Trotz dieser Tatsache und der ca. 10000 bis heute aufgeklärten Proteinstrukturen, die in der Proteinstrukturdatenbank (http://pdbbrowsers.ebi.ac.uk/) abgelegt sind, ist es bisher nicht möglich, aus der Aminosäuresequenz eines Proteins, das keine Sequenzähnlichkeit mit einem anderen Protein aufweist, dessen dreidimensionale Struktur und damit evtl. auch seine Funktion vorherzusagen. Dieses sogenannte „Proteinfaltungsproblem“ ist in der Tat eines der grössten ungelösten Probleme in der Biochemie und spielt auch eine zentrale Rolle bei der Aufklärung der Funktionen von Genen, die bei der Sequenzierung von Genomen neu entdeckt werden. Bei neu sequenzierten Genomen kann heute in der Regel mindestens einem Drittel der Gene keine Funktion zugeordnet werden. Um zumindest eine Vorhersage über die grobe dreidimensionale Struktur eines Proteins zu machen, muss ein Protein mit unbekannter Funktion mindestens 25% Sequenzidentität zu einem Protein mit bekannter dreidimensionaler Struktur aufweisen. 2 1.2. Die thermodynamische Stabilität von Proteinen Unter der thermodynamischen Stabilität eines Proteins versteht man den Unterschied (∆G) zwischen der Energie des vollkommen entfalteten Zustands (U) des Proteins in Wasser und der Energie der biologisch aktiven Tertiärstruktur (nativer Zustand N) in Wasser. Nachdem die Proteinfaltung in wässriger Lösung eine spontan ablaufende Reaktion ist, liegt das Energieniveau des nativen Zustands tiefer als das des entfalteten Zustands (∆G < 0). U Energie (freie Enthalpie G) ∆G = G(N) - G(U) < 0 N Wenn man sich die Frage stellt, welche Arten von Wechselwirkungen den nativen Zustand eines Proteins gegenüber dem entfalteten Zustand stabilisieren, muss man sich überlegen, warum in Wasser eine bestimmte Wechselwirkung im nativen Zustand günstiger ist als im entfalteten Zustand. Grundsätzlich gilt auch für die Proteinstabilität das thermodynamische Gesetz ∆G = ∆H - T ∆S Für biologische Makromoleküle mit definierter Tertiärstruktur gilt in der Regel: ∆H < 0 (die Proteinfaltung ist exotherm) und ∆S < 0 (insgesamt ist die Proteinfaltung entropisch ungünstig) Enthalpisch günstige Beiträge durch stabilisierende, intramolekulare Wechselwirkungen und entropisch ungünstige Beiträge wirken also bei der Bildung der Tertiätstruktur einander entgegen. 1.2.1. Wechselwirkungen, die die native Tertiärstruktur von Proteinen stabilisieren 1.2.1.1. Wasserstoffbrücken Wasserstoffbrücken sind ein essentieller Bestandteil der Kräfte, die die Struktur biologischer Makromoleküle stabilisieren. Wasserstoffbrücken bestehen immer aus einem Wasserstoffbrückendonor/Akzeptorpaar und sind mit geringfügigen Abweichungen linear. Die wichtigsten H-Brückendonoren und -akzeptoren in Proteinen sind die Amid(NH)- bzw. die Carbonyl(C=O)-Gruppen der Hauptkette, die die Wasserstoffbrücken in regulären Sekundärstrukturen ausbilden. Daneben können jedoch auch alle Aminosäureseitenketten, die Stickstoff-, Sauerstoff-, und Schwefelatome enthalten, an H-Brücken beteiligt sein. Die folgende Tabelle zeigt einige wichtige Beispiele für die Arten von Wasserstoffbrücken in Proteinen und deren Donor-Akzeptor Abstände. 3 Donor Akzeptor –O–H –O–H O– H O=C DonorAkzeptorAbstand (Å) 2.8 Kommentar Abstand = 2.7 Å bei Tyrosin-hydroxygruppe 2.8 N–H O=C 2.9 N–H O– H 2.9 Häufigste Art von H-Brücken. Auch doppelte (gabelförmige) Verbrückung möglich: H N C=O H N Häufigkeit N–H O 0° Abweichung von 180° 30° Wie oben erwähnt sind Wasserstoffbrücken im Idealfall linear (180° Winkel zwischen Donor, Wasserstoff und Akzeptor). Die Analyse der Wasserstoffbrücken in Proteinstrukturen ergibt jedoch, dass häufig Abweichungen von dieser idealen Geometrie beobachtet werden. Bei Abweichungen von über 30° ist die Bezeichnung “Wasserstoffbrücke” nicht mehr gerechtfertigt. Es ist relativ schwierig, den Beitrag einzelner Wasserstoffbrücken zur Proteinstabilität abzuschätzen. Dies liegt einerseits daran, dass auch im entfalteten Zustand Wasserstoffbrückendonoren und -akzeptoren der Proteinkette Wasserstoffbrücken zu Wassermolekülen ausbilden können, so dass insgesamt die Gesamtzahl der Wasserstoffbrücken bei der Proteinfaltung praktisch gleich bleibt. Auch Abweichungen von der idealen Geometrie erschweren eine Abschätzung des energetichen Beitrags von H-Brücken zur Proteinstabilität. 4 Prinzipiell können bei der Bildung von einzelnen Wasserstoffbrücken Energien von 10-40 kJ/mol frei werden. Um einer bestimmten Wasserstoffbrücke in einem Protein (z.B. eine Wasserstoffbrücke zwischen 2 Aminosäureseitenketten) einen zuverlässigen Energiebeitrag zuzuordnen, ist die beste Möglichkeit, eine der Aminosäuren gegen eine ähnlich grosse Aminosäure, die aber keine Wasserstoffbrücke ausbilden kann, auszutauschen und den Unterschied zwischen der Faltungsenergie des Wildtyp-Proteins und der Variante des Proteins (∆∆G) zu bestimmen. Als Faustregel gilt ferner, dass geladene Wasserstoffbrücken (z.B. zwischen der Hydroxygruppe eines Serins und der Carboxylatgruppe eines Aspartats) stärker sind als ungeladene Wasserstoffbrücken (z.B. zwischen einer Serin- und Asparaginseitenkette). 1.2.1.2. Ionische Wechselwirkungen Ionische Wechselwirkungen zwischen positiv und negativ geladenen Aminosäueseitenketten, die aufgrund der Tertiärstrukturbildung in räumliche Nachbarschaft treten, werden häufig in Proteinstrukturen beobachtet und können einen erheblichen Beitrag zur Gesamtstabilität von Proteinen liefern. Der Energiebeitrag einer Salzbücke in Proteinen ist gegeben durch die Formel z ⋅ z ⋅ε 2 ∆E = A B D⋅r wobei ε die Elementarladung ist, zA und zB die Ladungen der beteiligten Gruppen (in Proteinen also immer +1 und –1, weil es nur einfach positiv oder negativ geladene Seitenkettten gibt), r der Abstand zwischen den Ladungen und D die Dielektrizitätskonstante des Mediums. Die Dielektrizitätskonstante eines Mediums gibt den Faktor an, um den ein Medium eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ladungen schwächt gegenüber der Wechselwirkung zwischen diesen Ladungen im Vakuum. Die Dielektrizitätskonstante von Wasser ist sehr hoch und hat einen Wert von 78,3. Dagegen haben unpolare Lösungsmittel deutlich geringere Dielektrizitätskonstanten. Hieraus folgt unmittelbar, dass elektrostatische Wechselwirkungen an der Proteinoberfläche einen geringeren stabilisierenden Beitrag liefern als elektrostatische Wechselwirkungen im Inneren des Proteins, wo die Umgebung hydrophober ist. Die Unsicherheit über die Dielektrizitätskonstante an einem bestimmten Ort in der Proteinstruktur ist der Hauptgrund dafür, warum es äusserst schwierig ist, den stabilisierenden Energiebeitrag einer Salzbrücke quantitativ richtig zu berechnen. Im Extemfall jedoch könnte eine einzige elektrostatische Wechselwirkung bis zu 100 kJ/mol zur Proteinstanilität beitragen. Die Ausbildung von Salzbrücken hat eine wichtige Konsequenz für die pKa-Werte der beteiligten Aminosäuren: Wenn eine Salzbrücke die Tertiärstuktur eines Proteins stabilisiert, folgt unmittelbar, dass auch umgekehrt die Tertiätstruktur des Proteins die Salzbrücke stabilisert. Bei einer die Tertiärstruktur stabilisierenden Salzbrücke wird es im Vergleich zum entfalteten Zustand also schwieriger sein, die positiv geladene Seitengruppe durch hohe pHWerte zu deprotonieren oder die negative geladene Seitenkette durch niedrige pH-Werte zu protonieren, weil durch Verschwinden einer der beiden Ladungen die Salzbrücke zerstört würde. Dies hat zur Folge, dass sich bei einer Salzbrücke, z.B. zwischen einer Lysin- und Aspartatseitenkette, der pKa-Wert der sauren Aminosäure erniedrigt und sich gleichzeitig der pKa-Wert der basischen Aminosäure um den selben Betrag erhöht: 5 ∆pKa (saure As.) = - ∆pKa (basiche As.) r - CH-(CH2)4-NH3+ Lys pKa erhöht sich O2C-CH2-CH Asp pKa erniedrigt sich Allgemeiner betrachtet kann man daraus die folgenden Vorhersagen über abnormal verschobene pKa-Werte von Aminosäureseitenketten machen: - Saure Reste mit erniedrigten pKa-Werten und basische Reste mit erhöhten pKa-Werten sind stabilisierend. Saure Reste mit erhöhten pKa-Werten und basische Reste mit erniedrigten pKa-Werten sind destabilisierend. Aus der Grösse der Verschiebung des pKa-Werts lässt sich der stabilisierende oder destabilisierende Beitrag einer geladenen Seitenkette für die Tertiärstruktur berechnen. Auch destabilisierende, geladene Aminosäureseitenketten kommen in Proteinen vor. Denken Sie sich z.B. ein Enzym mit einer hydrophoben Substratbindungstasche, das einen Aspartatrest im aktiven Zentrum für den katalytischen Mechanismus benötigt. Ein negativ geladener Aspartatrest in hydrophober Umgebung ist energetisch ungünstig, folglich wird sein pKaWert erhöht sein. Neben basischen und sauren Seitenketten tragen auch Helixdipole zu elektrostatischen Wechselwirkungen in Proteinen bei. Jede α-Helix trägt an ihrem N-terminalen Ende eine positive Partialladung und an ihrem C-terminalen Ende eine negative Partialladung. Diese Partialladungen können ihrerseits elektrostatische Wechselwirkungen mit geladenen Seitenketten eingehen. Deshalb sind saure Seitenketten im N-terminalen α-Helixbereich und basische Reste im C-terminalen α-Helixbereich prinzipiell günstig. N δ+ δC 6 CO2- 1.2.1.3. van der Waals Wechselwirkungen (Dispersionskräfte) van der Waals Wechselwirkungen sind ebenfalls elektrostatischer Natur, jedoch liefern einzelne Wechselwirkungen wesentlich geringere Stabilisierungsbeiträge als Salzbrücken. Vielmehr kommt bei van der Waals-Wechselwirkungen vor allem die Summe aller einzelner Wechselwirkungen zum tragen, die durch die Vielzahl der direkten Kontakte in der dicht gepackten Tertiärstruktur von Proteinen zwischen Aminosäureseitenketten entstehen. Grundsätzlich unterscheidet man bei van der Waals Wechselwirkungen die Wechselwirkungen zwischen permanenten Dipolen (Dipol-Dipol-Wechselwirkungen) und induzierten Dipolen (London’sche Dispersionkräfte). Wechselwirkungen zwischen permanenten Dipolen sind z.B. solche zwischen räumlich benachbarten Carbonylgruppen. Die Carbonlygruppen sind permanente Dipole, weil Sauerstoff wesentlich elektronegativer als Kohlenstoff ist und deshalb stets eine positive Partialladung auf dem Kohlenstoff und eine negative Patialladung auf dem Sauerstoff liegt: δ- δ+ δ- δ+ C=O ------ C=O London'sche Dispersionskräfte sind induzierte Dipole, die durch geringfügige Verschiebung der die Atomkerne umgebenden Elektronenwolken zustandekommen. Solche induzierten Dipole kommen v.a. durch Kontakte zwischen hydrophoben Seitenketten im Inneren von Proteinen zustande, beispielsweise zwischen räumlich benachbarten Methylgruppen. Wechselwirkungen zwischen permaneten Dipolen (ca. 10 kJ/mol) sind wesentlich stärker als London’sche Disperionskräfte (ca. 0.3 kJ/mol). Ferner sind van der Waals-Wechselwirkungen stark vom Abstand (d) der beteiligten Atome/Moleküle abhängig und verhalten sich nach dem sogenannten “6/12 Potential”. Eine zu starke Annäherung zwischen Atomen führt zu einer Abstossung der positiv geladenen Atomkerne (proportional zu 1/d12), und die günstige elektrostatische Dipol-Dipol-Wechselwirkung wird mit 1/d6 schwächer. Der van der Waals Abstand ist der energetisch günstigste Abstand zwischen Atomen. Energy EWW ~ A B − 6 12 d d (A und B sind Konstanten) van der Waals distance distance d 7 1.2.1.4. Hydrophobe Wechselwirkungen Unter dem hydrophoben Effekt versteht man das Phänomen, dass Wasser die spontane Tendenz hat, möglichst wenige Kontakte mit hydrophoben Molekülen auszubilden. Der hydrophobe Effekt ist verantwortlich dafür, dass hydrophobe Aminosäureseitenketten in der Regel im Inneren von Proteinen konzentriert sind und den sogenannten “hydrophoben Kern” der Tertiärstruktur bilden, während polare und geladene Seitenketten hauptsächlich an der Proteinoberfläche zu finden sind. Bis heute ist jedoch die genaue physikalische Natur des hydrophoben Effekts nicht exakt verstanden. Die plausibelste Erklärung ist ein Entropiegewinn, der durch die bei der Zusammenlagerung hydrophober Seitenketten freigesetzten Wassermoleküle zustandekommt (vergleiche auch Voet/Voet/Pratt 2.1.). Man stellt sich dabei vor, dass Wassermoleküle in unmittelbarem Kontakt mit hydrophoben Molekülen weniger Möglichkeiten haben, Wassertoffbrücken zu benachbarten Wassermolekülen auszubilden als freie Wassermoleküle, und dass Wassermoleküle um hydrophobe Moleküle herum eine Art Wasserstoffbrückenkäfig bilden. Bei Zusammenlagerung von hydrophoben Molekülen wird ein Teil der Wassermoleküle dieses Käfigs freigesetzt, und diese freigesetzten Wassermoleküle gewinnen zusätzliche Freiheitsgrade, weil sie nun mehr Möglichkeiten zur Wechselwirkung mit benachbarten Wassermolekülen haben. Grundsätzlich sind hydrophobe Wechselwirkungen stark von den Bedingungen abhängig, und zwar wie folgt: - Hohe Temperaturen und hohe Ionenstärken verstärken hydrophobe Wechselwirkungen. - Niedrige Temperaturen und niedrige Ionenstärken schwächen hydrophobe Wechselwirkungen. 1.2.2. Die Gesamtstabilität von Proteinen Auch wenn die Proteinfaltung ein spontan ablaufender Prozess ist, ist die Faltungsenergie von Proteinen typischerweise ein sehr kleiner Betrag, der bei Eindomänenproteinen im Bereich zwischen –20 und –100 kJ mol-1 liegt. Der Grund hierfür ist, dass alle Wechselwirkungen, die die Proteinkette stabilisieren (also H-Brücken, ionische Wechselwirkungen, van der WaalsWechselwirkungen und hydrophobe Wechselwirkungen), gerade eben ausreichen, um den Entropieverlust der Polypeptidkette bei der Faltung auszugleichen. Dies ist am Beispiel der Faltung des Proteins Lysozym in der folgenden Tabelle gezeigt: Loss of chain entropy due to folding: ∆G (kcal mol-1)* + 167 All interactions stabilizing the folded state: - 198 Energy of hydration of residues that are buried in the folded state + 17 ---------- 14 (* 1 kcal/mol = 4.1 kJ/mol) Die Faltungsenergie von Proteinen ist also nur eine kleine Differenz grosser Beträge. 8 1.2.3. Experimentelle Bestimmung der Proteinstabilität 1.2.3.1. Das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung: Denaturierungsmittel-induzierte Entfaltungsgleichgewichte und die Bedeutung von Kooperativität Das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung Das sogenannte Zweizustandsmodell beschreibt das einfachste überhaupt denkbare Modell der Proteinfaltung. Es macht folgende Annahmen: - Es besteht ein thermodynamisches Gleichgewicht zwischen der entfalteten (U) und der nativen (N) Polypeptidkette. Im Gleichgewicht werden keine teilgefalteten Moleküle beobachtet. Das heisst, dass das Protein bei beliebigen Bedingungen immer als Gemisch völlig gefalteter und völlig entfalteter Moleküle vorliegt: U kF N kU Damit lässt sich die Gleichgewichtskonstante K der Proteinfaltung definieren und mit Hilfe der Gibbs-Gleichung die thermodynamische Stabilität ∆G eines nativen Proteins gegenüber seinem entfalteten Zustand angeben: K = [N] / [U] = kF / kU ∆G = – RT ln K Dabei sind kF und kU die mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten 1. Ordnung von Faltung und Entfaltung, R die allgemeine Gaskonstante und T die absolute Temperatur in Kelvin. Gemäss dem Zweizustandsmodell lässt sich die Faltungsenergie von Proteinen dadurch ermitteln, dass man die im Gleichgewicht vorhandenen Konzentrationen [N] und [U] bestimmt. Dabei geht man in der Praxis so vor, dass man das zu untersuchende Protein mit verschiedenen Konzentrationen eines Denaturierungsmittels inkubiert und nach Gleichgewichtseinstellung eine Denaturierungskurve aufnimmt. Dabei wird in der Regel mit Hilfe von Fluoreszenz- oder Circulardichroismus-Spektroskopie bestimmt (siehe Anhang), zu wieviel % das Protein bei der jeweiligen Denaturierungsmittelkonzentration gefaltet und entfaltet vorliegt. Die hierbei am häufigsten eingesetzten Denaturierungsmittel sind Harnstoff und Guanidiniumchorid (GdmCl): O NH2 C H2N C NH2 Harnstoff H2N + Cl - NH2 Guanidiniumchlorid (GdmCl) 9 Ist das Zweizustandsmodell der Proteinfaltung gültig, erhält man symmetrische, S-förmige Denaturierungskurven, wenn man den prozentualen Anteil der denaturierten (oder der nativen) Moleküle gegen die Denaturierungsmittelkonzentration aufträgt (siehe folgende Abbildung, oberer Teil). Im Übergangsbereich der Denaturierungskurve (graue Messpunkte) kann man nun für jede Denaturierungsmittelkonzentration die Gleichgewichtskonstante K und damit auch ∆G bei der betreffenden Denaturierungsmittelkonzentration bestimmen. Trägt man dann die jeweiligen Werte von ∆G wiederum gegen die Denaturierungsmittelkonzentration auf, erhält man eine lineare Beziehung mit der Gleichung ∆G = ∆GH20 + m [Denaturierungsmittel] wobei ∆GH20 die Faltungsenergie in Abwesenheit des Denaturierungsmittels ist und m die sogenannte Kooperativität der Faltung (Einheit: kJ mol-1 M-1). ∆GH20 erhält man also durch lineare Extrapolation der gemessenen ∆G-Werte auf 0 M Denaturierungsmittel. Dabei ist die Kooperativität der Faltung (m-Wert) proportional zur Grösse des Proteins. m ~ Zahl der Aminoäuren in der Proteinkette Dies liegt daran, dass die Kooperativität der Proteinfaltung linear abhängt vom Unterschied zwischen der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche des Proteins im nativen und entfalteten Zustand (Abkürzung: “∆ASA“ für „accessible surface area“), und von der Tatsache, dass ∆ASA seinerseits linear von der Grösse des Proteins abhängt. m ~ ∆ASA ∆ASA ~ Zahl der Aminoäuren in der Proteinkette Liegt der experimentell gemessene m-Wert deutlich unterhalb des für die Grösse des betreffenden Proteins erwarteten Werts, ist dies in der Regel ein deutlicher Hinweis darauf, dass das Zweizustandsmodell keine Gültigkeit mehr hat und auch teilgefaltete Moleküle signifikant im Gleichgewicht populiert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass dieser Fall eintritt, nimmt stark mit der Grösse des Proteins zu. Kleine, monomere Proteine (ca. 50-200 Aminosäuren) verhalten sich in Gleichgewichts-Denaturierungsexperimenten jedoch häufig nach dem Zweizustandsmodell. Eine Konsequenz des Zweizustandsmodells ist, dass ein einzelner Aminosäureaustausch in einem Protein, der die Stabilität des Proteins beeinflusst, nur zu einer Parallelverschiebung der Denaturierungskurve hin zu kleineren oder grösseren Denaturierungsmittelkonzentrationen führt, aber keinen Einfluss auf die Kooperativität hat, weil die Grösse des Proteins und damit der m-Wert unverändert bleibt. 10 %U 100 K = N/U = 0.1 K = N/U = 1; ∆G = -RT lnK = 0 50 K = N/U = 10 Transition midpoint 0 [Denaturant] (M) ∆G = ∆G ∆ H20 + m [Denaturant] slope (m-value) corresponds to the cooperativity of folding 0 [Denaturant] (M) ∆GH20 Extrapolation to 0 M denaturant 11 Um uns die Bedeutung von Kooperativität zu veranschaulichen, machen wir nun ein Gedankenexperiment, bei dem wir folgende Annahmen treffen: - Gegeben sind verschiedene Peptide gleicher Länge, die ein zweisträngiges, antiparalleles β-Faltblatt ausbilden können. Die Peptide unterscheiden sich in der Zahl der möglichen Wasserstoffbrücken, die ausgebildet werden können (1-10 Wasserstoffbrücken). Wir nehmen ferner an, dass die Bildung der 1. intramolekularen Wasserstoffbrücke sehr ungünstig ist ([Moleküle mit H-Brücke]/[Moleküle ohne H-Brücke] = K1 = 10-4), und dass die Ausbildung jeder weiteren H-Brücke um den Faktor 10 günstiger wird (K2 = 10-3; K3 = 10-2 etc.) - Wir berechnen für die verschiedenen Peptide die Gesamtgleichgewichtskonstante K, die wie folgt definiert ist: [Moleküle, die alle möglichen H-Brücken gleichzeitig ausgebildet haben] K= = K1. K2 . K3 … [Moleküle, die keine einzige der möglichen H-Brücken ausgebildet haben] ________________________________________________________________________________________ Wir berechnen nun K für jedes einzelne der Peptide in Abhängigkeit von der Zahl der HBrücken, die das betreffende Peptid insgesamt ausbilden kann: K Number of H-bonds 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 105 K = K1. K2 . K3 … 10-4 10-7 10-9 10-10 10-10 10-9 10-7 10-4 100 105 1 10-5 10-10 1 5 10 Number of possible H-bonds Wir sehen aus dieser Betrachtung unmittelbar, dass erst bei Ausbildung der 10. Wasserstoffbrücke die Gesamtgleichgewichtskonstante grösser als 1 wird und damit ∆G für die gleichzeitige Ausbildung aller Wasserstoffbrücken kleiner 0 wird. Darüber hinaus hat der Einbau der 10. Wasserstoffbrücke eine dramatische Veränderung der Gleichgewichtskonstate um 5 Grössenordnungen zur Folge, was bewirkt, dass praktisch alle Moleküle im Gleich- 12 gewicht alle Wasserstoffbrücken gleichzeitig ausgebildet haben. Somit ist dieses Modell auch mit der Annahme des Zweizustandsmodells, dass Proteinfaltung im wesentlichen ein Allesoder-Nichts Prozess ist, im Einklang. Zusammenfassend bedeutet Kooperativität also, dass bereits vorhandene intramolekulare Wechselwirkungen die Ausbildung weiterer, benachbarter intramolekularer Wechselwirkungen begünstigen. Auch die Abhängigkeit der Kooperativität der Proteinfaltung von der Grösse des Proteins kann man sich so erklären, dass grössere Proteine mehr sich gegenseitig verstärkende intramolekulare Wechselwirkungen ausbilden können als kleine Proteine. 1.2.4. Die Temperaturabhängigkeit der Proteinstabilität Ähnlich wie bei der Denaturierungsmittel-induzierten Entfaltung zeigen Proteine auch bei Erhöhung der Temperatur S-förmige, kooperative Denaturierungskurven. Die Proteinfaltung gehorcht dabei wie bereits besprochen der thermodynamischen Grundgleichung ∆G = ∆H -Τ∆S. Aus den Temperaturabhängigkeiten von ∆H (d∆H/dT = ∆cp) und ∆S (d∆S/dT = ∆cp/T) ergibt sich nach Lösung der Differentialgleichungen und Einsetzen die Gesamtgleichung für die Temperaturabhängigkeit von ∆G: ∆G(T) = ∆Hm – T∆Sm + ∆cp (T-Tm – T ln(T/Tm) Dabei sind Tm der Schmelzpunkt des Proteins, ∆Hm die thermische Umwandlungsenthalpie, die ∆Sm die Umwandlungsentropie und ∆cp der Unterschied zwischen der Wärmekapazität des nativen und entfalteten Proteins. Tm, ∆Hm ∆Sm und ∆cp können durch kalorimetrische Messungen experimentell bestimmt werden. Eine interessante Konsequenz der Temperaturabhängigkeit von ∆G ist die Tatsache, dass es für Proteine neben dem Schmelzpunkt auch einen Kältedenaturierungspunkt gibt, und dass es für jedes Protein eine Temperatur maximaler thermodynamischer Stabilität gibt. Bei den meisten Proteinen ist der Kältedenaturierungspunkt deutlich unterhalb von 0°C. Bei einigen Proteinen jedoch liegt der Kältedenaturierungspunkt im Bereich von 0°C, was dann bereits beim Aufbewahren bei 4°C im Kühlschrank zu teilweiser Denaturierung führen kann. ∆G Kältedenaturierungspunkt 0 Schmelzpunkt Tm 0 Temperatur maximaler Stabilität 13 100 T (°C) 1.3. Proteinfaltung in vivo und in vitro 1.1.1. Die Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation, Molekulare Chaperone Trotz der Tatsache, dass die Information für das Erreichen der funktionellen dreidimensionalen Struktur eines Proteins vollständig in dessen Aminosäuresequenz enthalten ist, kommt es bei der Proteinfaltung in vitro und in vivo häufig vor, dass die Ausbeute der Proteinfaltung geringer ist als 100%. Dies kommt daher, dass als Nebenreaktion zur Proteinfaltung Polypeptidketten irreversibel miteinander aggregieren können. Solche Aggregate werden durch unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinketten zusammengehalten. Diese Wechselwirkungen werden möglich, weil in entfalteten oder nur teilweise gefalteten Polypeptidketten hydrophobe Amiosäureseitenketten exponiert und lösungsmittelzugänglich sind, während sie im gefalteten Protein normalerweise im Inneren des Proteins begraben sind und dessen hydrophoben Kern bilden. biologically active tertiary structure n-x (x + y = n) n unfolded proteins with exposed hydrophobic side chains ( ) n-y irreversible aggregated protein chains, held together by unspecific hydrophobic interactions between exposed hydrophobic side chains Aus der Tatsache, dass Proteinaggregate Oligomere sind und durch hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten werden, lassen sich folgende Überlegungen anstellen, um bei der Rekonstitution von Proteinen in vitro möglichst hohe Ausbeuten zu erzielen: - Da hohe Ionenstärken und hohe Temperaturen unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen verstärken, kann durch niedrige Temperaturen und niedrige Ionenstärken die Proteinaggregation teilweise oder vollständig unterdrückt werden. - Die Aggregation von Proteinen ist mindestens ein bimolekularer Prozess, dessen Geschwindigkeit mindestens quadratisch mit der Konzentration sich faltender Moleküle steigt. Dagegen ist die Faltungsreaktion selbst unimolekular (Halbwertszeit der Reaktion ist konzentrationsunabhängig). Deshalb kann man durch Verwendung niedriger Proteinkonzentrationen während der Rückfaltung den Anteil der Moleküle, die aggregieren, verringern und damit die Faltungsausbeute steigern. 14 - Bedingungen, die die Faltungsreaktion schneller und die Aggregation langsamer machen, erhöhen die Ausbeute der Proteinfaltung. Die Proteinaggregation kommt als Nebenreaktion der Proteinfaltung auch in der lebenden Zelle vor. So kommt es z.B. bei der Überproduktion von grossen Mengen eines rekombinanten Proteins in E. coli häufig dazu, dass sich Aggregate des überproduzierten Proteins bilden, die man auch als Inclusion Bodies bezeichnet. Wie die folgende Abbildung zeigt, können Inclusion Bodies Klumpen bilden, die grosse Teile des Cytoplasmas der E. coli-Zelle ausfüllen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von E. coli Zellen, die im Cytoplasma rekombinantes Protein produzieren, das zu Inclusion Bodies aggregiert. Inclusion Bodies können Ansammlungen granulatähnlicher Aggregate sein (rechts Bild), aber auch grössere Klumpen bilden, die eine grossen Teil des Cytoplasmas ausfüllen (linkes Bild). Auch für die Bildung von Inclusion Bodies in der lebenden Zelle gelten die gleichen physikalischen Gesetzmässigkeiten wie bei der Proteinfaltung in vitro. So kann z.B. häufig durch niedrige Wachstumstemperaturen (die hydrophobe Wechselwirkungen schwächen) (z.B 20°C statt 37°C) die Bildung von Inclusion Bodies verhindert und so die Ausbeute an löslichem, korrekt gefaltetem Protein im Cytoplasma erhöht werden. In bestimmten Fällen kann die Bildung von Inclusion Bodies sogar erwünscht sein. Das ist z.B. der Fall, wenn das zu produzierende rekombinante Protein anfällig ist gegenüber dem Abbau durch cytoplasmatische Proteasen. In Inclusion Bodies sind die Proteinketten in der Regel vor solch einem Abbau geschützt. Auf diese Weise lassen sich sehr grosse Mengen an aggregiertem, rekombinantem Protein produzieren, das anschliessend jedoch erst noch in vitro zurückgefaltet werden muss. Ein weiterer Vorteil der Inclusion Bodies ist deren Unlöslichkeit. So können nach der Lyse der Bakterien alle löslichen E. coli Proteine in einem einfachen Zentrifugationsschritt von den unlöslichen Inclusion Bodies abgetrennt werden. Molekulare Chaperone Um in der lebenden Zelle die Proteinaggregation möglichst gering zu halten, gibt es in allen Organismen eine sehr wichtige Proteinklasse, die Molekularen Chaperone. Dies sind Proteine, die spezifisch und stöchiometrisch entfaltete und/oder unvollständig gefaltete Protein- 15 ketten binden. Molekulare Chaperone erkennen exponierte hydrophobe Seitenketten ungefalteter Proteinketten. Die Proteinketten werden durch die Bindung an die Chaperone vor allem gegenüber irreversibler Aggregation stabilisiert und haben nach Dissoziation von den Chaperonen erneut die Möglichkeit, sich korrekt zu falten. Molekulare Chaperone erhöhen also die Ausbeute der Proteinfaltung, ohne in der Regel die Faltung selbst zu beschleunigen. Die Tatsache, dass die meisten Molekularen Chaperone unter Hitzestressbedingungen besonders stark produziert werden, ist ebenfalls vollkommen im Einklang mit den physikalischen Eigenschaften hydrophober Wechselwirkungen. Einerseits ist bei hohen Temperaturen die Gefahr der Aggregation von Polypeptiden besonders gross, was durch erhöhte Chaperon-Konzentrationen kompensiert werden kann. Andererseits können essentielle zelluläre Proteine bei hohen Temperaturen auch thermisch denaturiert werden. Durch Bindung an thermisch entfaltete Proteinketten verhindern Chaperone deren irreversible Aggregation in der Zelle und ermöglichen nach Temperaturerniedrigung und Ablösen der thermisch entfalteten Ketten deren Rückfaltung in vivo und somit das Überleben einer Zelle nach Hitzestress. 1.3.2. Wie schnell können sich Proteine falten? Das Levinthal-Paradox Wenn man sich vorstellt, ein Protein würde während des Faltungsprozesses zufällig alle seine möglichen Konformationen erproben, um die einzig richtige, native Tertiärstruktur (und damit den energetisch günstigsten Zustand) zu finden, kann man folgende Überlegung anstellen: Angenommen, ein Protein besteht aus 100 Aminosäuren und hat pro Aminosäure 3 verschiedene Konformationsmöglichkeiten (in Wirklichkeit sind es mehr!), dann kann die ganze Proteinkette theoretisch 3100 = 5 . 1047 verschiedene Konformationen einnehmen. Nimmt man ferner an, dass die Zeit für eine einzelne Konformationsänderung 10-13 Sekunden dauert (dies ist in etwa die Zeit für die Rotation um eine C-C Einfachbindung), würde die Proteinkette theoretisch 5 . 1034 Sekunden (das sind 1,6 . 1027 Jahre) benötigen, um sich zu falten. Untersuchngen zur Proteinfaltung in vivo und in vitro haben jedoch gezeigt, dass sich Proteine im Bereich zwischen Millisekunden bis maximal einigen Stunden falten. Dieser apparente Widerspruch wurde erstmals von C. Levinthal diskutiert und ist als das sogenannte “Levinthal-Paradox” in die Gechichte der Biochemie eingegangen. Wie lässt sich der Widerspruch des Levinthal-Paradoxons auflösen? Zunächst ist es offensichtlich, dass Proteine nicht alle möglichen Konformationen bei der Suche nach dem nativen Zustand ausprobieren. Der Trick der Proteine zum schnellen Auffinden der nativen Tertiärstruktur besteht in der Tat darin, dass einmal lokal korrekt gebildete Teilkonformationen während der weiteren Konformationssuche beibehalten werden. Damit ist auch klar, dass bei der Proteinfaltung Kontakte zwischen Aminosäureseitenketten, wie sie im nativen Zustand bestehen, bereits in teilstrukturierten Zwischenstufen vorkommen, und dass somit nativ-ähnliche Kontakte den Faltungsweg von Proteinen bestimmen. Untersuchungen in den letzten Jahren haben gezeigt, dass viele kleine Eindomänenproteine sich im Millisekundenbereich, teilweise sogar im Submillisekundenbereich, falten können. Man geht heute davon aus, dass die Proteinkette, ausgehend von einem Ensemble vieler 16 energetisch ähnlicher entfalteter Zustände, bei der Faltung viele Wege beschreiten kann, bei denen die verschiedensten Zwischenstufen populiert werden können. Alle diese Zwischenstufen sind energetisch günstiger als der entfaltete Zustand. Die dem entfalteten Zustand energetisch nahen Zwischenstufen werden als “Molten Globule” Zustände bezeichnet. Von diesen Zuständen nimmt man an, dass sie zwar Sekundärstrukturelemente enthalten, aber noch keine Tertiärstrukturelemente besitzen. Zwischenstufen, die bereits dem nativen Zustand strukturell und energetisch relativ ähnlich sind, werden als (kinetische) Faltungsintermediate bezeichnet. Das Weiterreagieren dieser Intermediate bestimmt wahrscheinlich die eigentlich gemessene Faltungsgeschwindigkeit, weil die Aktivierungsenergiebarrieren zum Weiterreagieren eines Intermediats immer höher werden, je ähnlicher ein Intermediat dem nativen Zustand ist. Dieses Konzept wird häufig in Form eines sogenannten “Faltungstrichters” dargestellt. In der folgenden Abbildung wurde zur Veranschaulichung des Konformationsraums der Polypeptidkette willkürlich die x- und y-Achse mit Parametern beschriftet (Zahl der nativen Kontakte und Entropie der Proteinkette), die sich beim Übergang von entfalteten Zustandsensemble zum nativen Zustand ändern. unfolded states Energy Molten globule states Intermediates chain entropy Native state native contacts native contacts chain entropy 17 1.3.3. Mögliche langsame Faltungsreaktionen Obwohl sich Proteine prinzipiell im Millisekundenberich falten können, ist die Faltung vieler Proteine deutlich langsamer. Hierfür sind im wesentlichen zwei die Faltung verlangsamende Reaktionen verantwortlich: Die Isomerisierung von X-Pro Peptidbindungen und die Bildung von Disulfidbrücken. Beide Reaktionen sind so langasam, dass sie in der lebenden Zelle durch Enzyme katalysiert sind. Die Anwesenheit von Faltungskatalysatoren und Molekularen Chaperonen ist der Grund, warum die Proteinfaltung in vivo schneller und mit höheren Ausbeuten abläuft als in vitro. Als dritte langsame Faltungsreaktion ist für oligomere Proteine schliesslich noch die Assoziation von Proteinuntereinheiten nach deren Faltung zu nennen, die als mindestens bimolekularer Prozess von den Konzentrationen aller Untereinheiten abhängt. 1.3.3.1. Isomerisierung von X-Pro Peptidbindungen Durch den partiellen Doppelbindungscharakter der C-N Bindung der Peptidbindung gibt es für die der C-N-Bindung benachbarten Cα-Atome eine cis- und eine trans-Sellung. Die transStellung ist bei Peptidbindungen aus sterischen Gründen energetisch wesentlich günstiger, so dass cis-Peptidbindungen in den bisher aufgeklärten Proteinstrukturen im Normalfall nie vorkommen. Eine Ausnahme bilden jedoch X-Pro Peptidbindungen (X = irgendeine Aminosäure): Hier wird durch die Methylengruppe des Prolinrings (bei allen anderen Aminosäuren ist hier nur ein Wasserstoffatom) die trans-Stellung sterisch destabilisiert, so dass die transStellung nur noch geringfügig günstiger ist als die cis-Stellung. Im entfalteten Zustand eines Proteins und bei kurzen, unstrukturierten Modellpeptiden liegen somit im Gleichgewicht 1020% aller X-Pro Peptidbindungen in cis-Stellung vor. Damit ist die X-Pro Isomerisierung, die an jeder X-Pro Peptidbindung eines entfalteten Proteins auftreten kann, auch mitverantwortlich für die strukturelle Heterogenität des entfalteten Zustands (Ensemble enfalteter Zustände). O=C Cα O C HC H EA = 80 kJ/mol C N α X O HC 180° α N Cα X C=O H cis (10-20% in unstrukturierten Peptiden) trans (80-90% in unstrukturierten Peptiden) 18 Aufgrund des minimalen Energieunterschieds zwischen der cis- und trans-Konformation kommen cis-X-Pro Peptidbindungen relativ häufig auch in gefalteten Proteinen vor, wobei dann in allen Molekülen die betreffende Bindung zu 100% in cis-Stellung ist. Es wird angenommen, dass bei der Proteinbiosynthese zunächst alle Peptidbindungen in trans-Stellung synthetisiert werden. Demzufolge muss zur Ausbildung des nativen Zustands eines Proteins, das eine cis-X-Pro Peptidbindung im nativen Zustand aufweist, diese Bindung zuerst von der trans- in die cis-Stellung umklappen. Diese Isomerisierungsreaktion hat eine relativ hohe Aktivierungsenergie von 80 kJ/mol und bei Raumtemperatur eine Halbwertszeit von ca. 100 Sekunden. Sie wird damit für die Proteinfaltung geschwindigkeitsbestimmend. Die Analyse der bisher aufgeklären Proteinstrukturen zeigt, dass cis-X-Pro Peptidbindungen besonders häufig in Turns zwischen β-Faltblattsträngen vorkommen. Dies ist auch plausibel, weil die cis-Peptidbindung eine Umkehr des Verlaufs der Polypeptidkette bewirkt. In der lebenden Zelle ist die Isomersisierung von X-Pro-Peptidbindungen katalysiert durch das Enzym Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPI). In E. coli ist in diesem Zusammenhang besonders der sogenannte Trigger Faktor von Interesse. Trigger Faktor hat PPI-Aktivität und ist gleichzeitig ein Ribosomen-assoziiertes Protein, so dass die Isomerisierung von XPro-Peptidbindungen in vivo sogar kotranslational katalysiert sein könnte. 1.3.3.2. Die Bildung von Disulfidbrücken Die Bildung von Disulfidbrücken ist für die Faltung von sekretorischen Proteinen immer geschwindigkeitsbestimmend, weil Disulfidbrücken sich nicht einfach automatisch ausbilden können, wenn bei der Proteinfaltung die Thiolgruppen zweier Cysteinreste in räumliche Nachbarschaft treten. Der Grund ist, dass bei der Bildung von Disulfidbrücken zwei Elektronen freigesetzt werden, die von einem Oxidationsmittel aufgenommen werden müssen. Proteine mit Disulfidbrücken können sich also nur dann falten, wenn sie mit einem Oxidationsmittel zusammentreffen. Aus diesem Grund gibt es in Zellkompartimenten mit reduzierenden Bedingungen wie z.B. dem Cytoplasma in der Regel keine Proteine mit Disulfidbrücken. Oxidierende Zellkompartimente sind in Eukaryonten das endoplasmatische Retikulum (ER) und in Bakterien das Periplasma, also diejenigen Zellkompartimente, in denen sich sekretorische Proteine falten. In der Tat sind Disulfidbrücken eine typische Eigenschaft sekretorischer Proteine. SH SH S-S + 2 H+ + 2 e- Die folgende Abbildung zeigt die Situation im Periplasma von Escherichia coli. Unter aeroben Bedingungen ist das Oxidationsmittel für die Bildung von Disulfidbrücken im Periplasma von E. coli molekularer Sauerstoff, während unter anaeroben Bedingungen andere 19 Elektronenakzeptoren wie z.B. Fumarat als Oxidationsmittel wirken. Sowohl unter aeroben wie auch unter anaeroben Bedingungen ist das Enzym DsbA das Molekül, das die zur Bildung der Disulfidbrücken erforderlichen Oxidationsäquivalente direkt auf sich faltende Polypeptidketten überträgt. Dies geschieht dadurch, dass DsbA selbst eine katalytische Disulfidbrücke besitzt, die durch Disulfidaustauschreaktionen auf reduzierte Proteinketten übertragen wird. DsbA wird dabei selbst zur Dithiolform reduziert und durch eine weitere Disulfidaustauschreaktion mit dem Protein DsbB in der inneren Bakterienmembran als Oxidationsmittel regeneriert. DsbB wird dann seinerseits durch Chinone als Oxidationsmittel regeneriert, wobei diese, abhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff, ihre Oxidationsäquivalente von Proteinkomplexen der inneren Membran erhalten. Auch die Umlagerung (Isomerisierung) falscher Disulfidbrücken ist in E. coli katalysiert durch das Enzym DsbC. DsbC wird von der Zelle im reduzierten Zustand gehalten, damit es falsche Disulfidbrücken angreifen und reduzieren kann. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) eukaryontischer Zellen übernimmt ein einziges Enzym, die Proteindisulfidisomerase (PDI), die Katalyse von Disulfidbrückenbildung und Disulfidbrückenisomerisierung. PDI enthält wie DsbA und DsbC eine katalytische Disulfidbrücke. Es gibt in der ER-Membran ein PDI-spezifisches Enzym, Ero1p, das Oxidationsäquivalente von FAD auf PDI überträgt. Somit kommen in Eukaryonten die Oxidationsäquivalente für die Bildung von Disulfidbrücken in sekretorischen Proteinen letzlich von FAD (Science 290, 1571). 20 2. Das chemische Bindungsgleichgewicht 2.1. Die Bedeutung von Bindungs- und Dissoziationskonstanten Die Funktion der meisten Proteine besteht in der spezifischen Erkennung und Bindung eines Liganden. Für die Bindung des Liganden L an ein Protein P lässt sich folgendes chemisches Gleichgewicht formulieren: k2 L + P PL k1 Dabei ist k2 die mikroskopische Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung für die Bildung von PL, und k1 die mikroskopische Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung für den Zerfall von PL. Die Gleichgewichtssituation ist nun dadurch definiert, dass die Geschwindigkeit der Bildung des Protein-Ligandenkomplexes PL identisch ist mit der Geschwindigkeit des Zerfalls von PL: d [PL] d [PL] = dt dt k2 [P] [L] = k1 [PL] Das Verhältnis der beiden Geschwindigkeitskonstanten kann nun zu einer neuen Naturkonstante zusammengefasst werden, die man als Dissoziationskonstante KDiss bezeichnet und die Einheit einer Konzentration (M) hat. Häufig benutzt man auch den Begriff Bindungskonstante KBind, um die Stärke einer Ligandenbindung zu beschreiben. Die Bindungskonstante ist der Kehrwert der Dissoziationskonstante und hat die Einheit (M-1). KDiss = k1 [P] [L] 1 = = k2 [PL] K Bind Die Konstanten k1 und k2, und damit KDiss und KBind, sind Naturkonstanten für den betreffenden Protein-Ligandenkomplex. Obige Gleichung ist identisch mit dem Massenwirkungsgesetz. Um uns die Bedeutung des chemischen Bindungsgleichgewichts zu verdeutlichen, nehmen wir den Fall an, dass in einer Lösung der Ligand in einem sehr hohen molaren Überschuss über das Protein vorliegt. Unter diesen Umständen kann die Konzentration des freien Liganden [L] mit der Gesamtkonzentration des Liganden [L]tot gleichgesetzt werden: [L]tot = [L] + [PL]; wenn [L]tot >> [P]tot [L] ≈ [L]tot unter diesen Bedingungen gilt: KDiss = [P] [L]tot ; [PL] K Diss [P] = [L]tot [PL] 21 Es folgt unmittelbar, dass man bei Kenntnis der gesamten Ligandenkonzentration und der Dissoziationskonstante sofort das Verhältnis zwischen [P] und [PL] - und damit auch den prozentualen Anteil des mit Ligand besetzten Proteins in Anbhängigkeit der Ligandenkonzentration - ausrechnen kann. [L]tot [P] / [PL] KDiss/100 KDiss/10 KDiss 10 . KDiss 100 . KDiss 1000 . KDiss 100 : 1 10 : 1 1:1 1 : 10 1 : 100 1 : 1000 Besetzungsgrad des Proteins (% PL im Gleichgewicht) 0.99 % 9.09 % 50 % 90.9 % 99.01 % 99.9 % 100 % PL 50 0 0.001 KD 0.01 KD KD 0.1 KD 10 KD 100 KD 1000 KD Ligand concentration (M) Aus diesen Überlegungen wird ersichtlich, dass die Dissoziationskonstante diejenige Ligandenkonzentration angibt, bei der das Protein im Gleichgewicht zu 50% mit dem Liganden besetzt ist. Hohe Affinitäten für einen Liganden bedeuten also niedrige Dissoziationskonstanten, weil hier bereits geringe Ligandenkonzentrationen zu einer 50%-igen Sättigung der Ligandenbindungsstelle des Proteins ausreichen. Für Bindungskonstanten gilt entsprechend das umgekehrte: Hohe Werte von KBind bedeuten hohe Affinitäten. Proteine haben gemäss ihrer Funktion in der Zelle sehr unterschiedlich starke Affinitäten für ihre natürlichen Liganden. Die Werte natürlicher Dissoziationskonstanten von Proteinen schwanken zwischen 10-3 M und 10-15 M. 22 2.2. Die Analogie zwischen Bindungsgleichgewichten und Säure-Base Gleichgewichten Eine Säure AH (bzw. AH+) kann unter Freisetzung eines Protons H+ in wässriger Lösung zu A− (bzw. A) dissoziieren: A− + H+ AH Man definiert die Gleichgewichtskonstante Ka wie bei einem normalen chemischen Dissoziationsgleichgewicht: Ka = [ A− ] [ H+ ] / [ AH ] Mit den Definitionen [ H+ ] = 10−pH und [ Ka ] = 10−pKa folgt: [ A− ] / [ AH ] = 10pH−pKa Mit Kenntnis des pKa-Werts lässt sich also für eine Puffersubstanz bei jedem beliebigen pHWert das Verhältnis von deprotonierter und protonierter Form berechnen. Das Verhältnis ist 1:1, wenn der pH mit dem pKa identisch ist (100=1). 100 % AH 50 0 pK - 3 pK - 2 pK -1 pK pK + 1 pK + 2 pK + 3 pH Hieraus ergeben sich für die Verwendung von Pufferlösungen folgende wichtige Konsequenzen: a) Die Pufferkapazität einer Puffersubstanz ist bei dem pH-Wert, der ihrem pKa-Wert entspricht, am grössten. b) Die Pufferkapazität nimmt stark ab, sobald der pH-Wert vom pKa-Wert um mehr als 0.5 Einheiten abweicht. Bei noch stärkeren Abweichungen nimmt die Pufferkapazität mit jeder pH-Einheit Abweichung um den Faktor 10 ab! Deshalb wählt man grundsätzlich nur Puffersubstanzen aus, deren pKa-Wert nahe am gewünschten pH-Wert des Experiments liegt. 23 2.3. Die pH-Abhängigkeit der Gesamtladung von Proteinen Als einfaches Beispiel betrachten wir die pH Titrationskurve (Gesamtladung in Abhängigkeit vom pH-Wert) des folgenden Heptapeptids, welches am N-Terminus acetyliert und am CTerminus methyliert ist und deshalb an den Termini keine Ladungen trägt. CH3-CO-NH-Ala1-Asp2-Ala3-Asp4-Ala5-Lys6-Ala7-CO2-CH3 Wir nehmen ferner an, dass der pKa-Wert der Asp Seitenketten 4.0 und der der Lys Seitenkette 11.0 ist. Mit Hilfe der Überlegungungen aus 2.2. ergibt sich für die einzelnen Ladungen der Aminosäureseitenketten und für die Gesamtladung des Peptids folgende pH-Abhängigkeit: pH Ladung von Asp2 Ladung von Asp4 Ladung von Lys6 0 4 7 11 14 0 - 0.5 -1 -1 -1 0 - 0.5 -1 -1 -1 +1 +1 +1 + 0.5 0 Gesamtladung des ganzen Peptids +1 0 -1 - 1.5 -2 Total charge Isoelectric point (pI) and pKa of Asp side chain +1 Number of all basic residues 0 1 4 7 11 14 -1 Cys30 pH Number of all acidic residues -2 pKa of Lys side chain Es ist also möglich, aufgrund der Aminosäurezusammensetzung eines Proteins die pHAbhängigkeit der Gesamtladung und seinen isoelektrischen Punkt pI (pH, bei dem die Gesamtladung 0 ist), vorauszuberechnen. Man führt solche Berechnungen z.B. häufig durch, um für die Reinigung eines Proteins durch Ionenaustauschchromatographie die richtigen pHBedingungen festzulegen: 24 pH < pI Protein ist positiv geladen Bindet an Kationenaustauscher pH > pI Protein ist negativ geladen Bindet an Anionenaustauscher Für die Reinigung von Proteinen bedeuten identische isolelektrische Punkte zweier Proteine nicht, dass diese Proteine sich durch Ionenaustauschchromatographie nicht voneinander trennen lassen. Der Grund ist, dass zwei Proteine mit identischem pI bei pH-Werten abseits vom pI aufgrund ihrer unterschiedlichen Aminosäurezusammensetzung unterschiedliche Gesamtladungen haben können. Sie werden deshalb unterschiedlich stark an einen entsprechenden Ionenaustauscher binden und können deshalb mit Ionenstärkegradienten selektiv eluiert weden. In der Praxis funktioniert die Vorausberechnung des pI eines Proteins aufgrund dessen Aminosäuresequenz mit Computerprogrammen relativ zuverlässig. Prinzipiell können die berechneten pI-Werte von den tatsächlichen pI Werten aber auch abweichen, wenn bestimmte Aminosäureseitenketten im gefalteten Protein abnormale pKa-Werte haben. Im Bereich „Proteomics und Functional Genomics“ wird die gute Übereinstimmung zwischen experimentellen und berechneten pI-Werten auch als Parameter herangezogen, um Proteine aus komplexen Gemischen, die z.B. durch zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt wurden, eindeutig zu identifizieren. 25 Anhang A 1. Spektroskopische Methoden zur Bestimmung der Proteinkonformation in Lösung A 1.1. Absorptionsspektroskopie Definition von Absorption und das Lambert-Beer’sche Gesetz Unter Absorption von Licht versteht man die Eigenschaft einer Substanz, bei einer bestimmten Wellenlänge Lichtquanten aufzunehmen (zu absorbieren). Typischerweise wird die Absorption einer in einer Flüssigkeit gelösten Substanz in einer Küvette mit 1 cm Schichtdicke gemessen. hν Io I d = 1 cm Ein Absorptionsspektrometer ist in der Lage, bei verschiedenen Wellenlängen Unterschiede zwischen der Intensität des auf die Küvette einfallenden und des aus der Küvette austretenden Lichts zu messen. Die vom Spektrometer angezeigte, dimensionslose Grösse Absorption (A) ist als der Logarithmus des Verhältnisses der Intensitäten von einfallendem um austretendem Licht definiert: A = log Io ___ I Das Lambert-Beer’sche Gesetz beschreibt die Tatsache, dass die Absorption A einer Probe linear von der Konzentration der gelösten Substanz (c) und von der Schichtdicke der Küvette (d) abhängt. A ~ c und A ~ d A = ε .c .d Die Proportionalitätskonstante ε wird als Molarer Extinktionskoeffizient einer Substanz bezeichnet. Er hat die Einheit M-1 cm-1 und gibt den Absorptionswert an, den eine 1 molare Lösung der Substanz bei 1 cm Schichtdicke hätte. Der molare Extinktionskoeffizient bezieht sich immer auf eine bestimmte Wellenlänge des Lichts und ist für jede Substanz und jede Wellenlänge eine charakteristische Grösse. Absorptionsmessungen erlauben also bei bekanntem molarem Extinktionskoeffizienten die Bestimmung der Konzentration und der zeitlichen Konzentrationsänderung einer Substanz. 26 Es ist sehr wichtig, dass man sich darüber klar ist, dass die Absorption bezüglich der Intensität der aus der Küvette austretenden Strahlung eine eine logarithmische Grösse ist. Ein Absorptionswert von 1 bedeutet, dass nur noch 10% der einfallenden Strahlung wieder aus der Küvette austreten. Bei einer Absorption von 3 sind es nur noch 0.1% der einfallenden Strahlung. Dies bedeutet, dass bei hohen Absorptionswerten die Intensität der austretenden Strahlung extrem klein wird, so dass Absorptionsänderungen nicht mehr zuverlässig gemessen werden können. Aus diesem Grund sind Absorptionwerte über 2 prinzipiell unzuverlässig. Als Faustregel sollten Sie beherzigen, dass bei Absorptionsmessungen die Absortion der Probe nicht über 1,5 ansteigt. Falls dies dennoch passiert, muss entweder die Probe verdünnt oder die Schichtdicke der Küvette verkleinert werden. Wenn man die Absorption einer Substanz bei verschiedenen Wellenlängen misst, erhält man ihr Absportionsspektrum. Proteine absorbieren Licht nur im UV-Bereich unterhalb von 310 nm, vorausgesetzt sie haben keine Chromophore als Liganden gebunden (wie z.B. Häm in Hämoglobin). Ein typisches Absorptionsspektrum eines Proteins hat ein Maximum bei 275280 nm, ein Minimum bei ca. 250 nm und zeigt keine Absorption über 310 nm. Das Maximum bei 280 nm wird im wesentlichen von den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan bestimmt. Auch Disulfidbrücken tragen zu einem geringen Teil zur Absorption von Proteinen bei. Da Tryptophan eine relativ seltene Aminosäure ist, kann es vorkommen, dass ein Protein keinen Tryptophanrest enthält. Dies ist sofort im Absorptionsspektrum des Proteins erkennbar, welches dann bereits ab 295 nm keine Absorption mehr zeigt und ein Absorptionsmaximum bei ca. 274 nm aufweist. A 280 nm ___ Protein with both Tyr and Trp residues ---- Protein without Trp residues 274 nm No absorbance above 295 nm ca. 250 nm No absorbance above 310 nm 250 310 Wavelength (nm) 280 27 Die wichtigste Anwendung der Absorptionsspektroskopie in der Proteinchemie ist die Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Der molare Extinktionskoeffizient eines Proteins bei 280 nm lässt sich relativ zuverlässig aus seiner Aminosäuresequenz berechnen und ist die Summe der Beiträge aller Tryptophane, Tyrosine und Disulfidbrücken des Proteins: amino acid absorbance maximum ε280 nm (M-1 cm-1) Tryptophan (W) 280 nm 5690 Tyrosine (Y) 274 nm 1280 ~ 280 nm 120 disulfide bridge (SS) ε280 nm (theoretisch) = (nW . 5690 + nY . 1280 + nSS . 120) M-1 cm-1 Dabei bezeichnet nW, nY und nSS die Anzahl der Trp, Tyr und SS-Gruppen im Protein. Genau genommem lässt sich der molare Extinktionskoeffizient eines Proteins nur für das entfaltete Protein berechnen, weil die Umgebung der aromatischen Aminosäuren in jedem Protein anders ist und sich dadurch die Absorptionseigenschaften einzelner Reste geringfügig ändern können. Um für ein natives Protein einen zuverlässigen Wert von ε280 nm zu erhalten, vergleicht man die Absorption des nativen und denaturierten Proteins und korrigiert den berechneten Extinktionskoeffizienten entsprechend: ε280 nm (natives Protein) = (A280 nm, nativ / A280 nm, denaturiert) . ε280 nm (theoretisch) 28 A 1.2. Fluoreszenzspektroskopie Wenn eine Substanz Licht einer bestimmten Energie absorbiert und daraufhin Licht mit geringerer Energie (d.h. grösserer Wellenlänge) wieder abgibt, spricht man von Fluoreszenz. Ebenso wie die Absorptionseigenschaften von Proteinen werden auch deren Fluoreszenzeigenschaften von den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Typtophan bestimmt. Um das Fluoreszenzspektrum eines Proteins aufzunehmen, wird dieses typischerweise bei 280 nm angeregt, wo sowohl Tyr, als auch Trp stark absorbieren. Die vom Protein abgegebene Strahlung wird dann senkrecht zur einfallenden Strahlung detektiert und die Intensität der abgegebenen Strahlung wird bei Wellenlängen zwischen 290 und 450 nm registriert. Excitation λex beam sample λem > λex detector Als Quantenausbeute φF bezeichnet man das Verhältnis zwischen der Zahl der abgegebenen und aufgenommenen Lichtquanten. Da Tryptophan nicht nur die bessere Quantenausbeute hat, sondern auch stärker absorbiert als Tyrosin, ist Tryptophan ein ca. 5.5 mal stärkeres Fluorophor als Tyrosin (siehe Tabelle). Fluorescence properties of tryosine and tryptophan residues Tryptophan (W) Absorptions maximum 280 nm Fluoreszenz maximum 348 nm Quanten ausbeute (φF) 20 % Empfindlichkeit (φF . εmax) bezogen auf Trp 1 Tyrosin (Y) 274 nm 303 nm 14 % 0.18 Aminosäure Neben ihrer hohen Empfindlichkeit hat die Fluoreszenzspektroskopie auch den Vorteil, dass Proteine in der Regel stark unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften im nativen und denaturierten Zustand zeigen. Dies kommt daduch zustande, dass v.a Tryptophanreste bezüglich ihrer Fluoreszenzeigenschaften sehr empfindlich auf Änderungen ihrer Umgebung reagieren. Da Tryptophane bei nativen Proteine meist im hydrophoben Inneren des Proteins begraben sind, verschiebt sich neben der Fluoreszenzintensität auch das Emissionsmaximum von nativen Proteinen gegenüber entfalteten Poykpeptidketten von 350 nm auf 320-335 nm. Proteine, die keine Tryptophane enthalten, zeigen dagegen bei Entfaltung meist nur geringe Fluoreszenzunterschiede, wobei das Fluoreszenzmaximum im nativen und denaturierten Zustand bei ca. 305 nm liegt. 29 Für die spezifische Beobachtung von Tryptophanseitenketten in Proteinen, unabhängig von den Tyrosinseitenketten, kann man die Tatsache ausnutzen, dass Tyrosine bei 295 nm nicht mehr absorbieren, so dass sich durch Bestrahlen bei 295 nm selektiv die Tryptophane in einem Protein anregen lassen. Eine sehr wichtige, weitere Anwendung der Fluoreszenzspektroskopie ist die Bestimmung von kleinen Konformationsänderungen und die Messung von Protein-Liganden-Wechselwirkungen. Bei letzterer Messung nutzt man die Tatsache aus, dass sich in Proteinen nach Bindung eines Liganden häufig die Tryptophanfluoreszenz verändert. Bereits eine 10%ige Fluoreszenzintensitätsänderung bei Bindung reicht in der Regel aus, um durch Fluoreszenztitration die Affinitätskonstante zwischen einem Protein und seinem Liganden quantitativ zu bestimmen. Fluorescence intensity (arbitrary units) 320-335 nm ____ Native protein with Tyr and Trp residues ---- Unfolded protein with Tyr and Trp residues …... Native Protein with Tyr, but no Trp residues 305 nm 350 nm 300 400 440 Wavelength (nm) 30 A 1.3. Circulardichroismus (CD) Spektroskopie Linear polarisiertes Licht ist Licht, bei die elektrischen Feldstärkevektoren aller Lichtstahlen in einer Ebene schwingen. Es wird durch Polarisationsfilter erzeugt, die nur Lichtstrahlen mit elektrischen Feldstärkevektoren in der gekann man durch Man kann sich linear polarisiertes Licht aus zwei überlagerten, entgegengesetzt zirkular polarisierten Lichtwellen vorstellen. Proteine als chirale Moleküle absorbieren rechts und links zirkular polarisiertes Licht mit unterschiedlichen molaren Extinktionskoeffizienten. Dieser Unterschied ∆ε = εL-εR lässt sich mit folgender Formel in die sogenannte molare Elliptizität [θ] umrechnen: [θ] = 3300 . ∆ε Analog zum Lambert-Beerschen Gesetz ist nun die gemessene Elliptizität θ (in Grad) mit der Probenkonzentration c, der Schichtdicke d (in cm) und der molaren Elliptizität [θ] verknüpft. [θ] = θ . 100 . Mr _________________ . c d (Einheit: Grad cm2 dmol-1) Noch häufiger verwendet man als Messgrösse die mittlere molare Elliptizität eines Proteins pro Aminosäure, die als [θ]MRW als bezeichnet wird. Speziell im Fern-UV CD Bereich bei 210-220 nm gibt dieser Wert einen guten Anhaltspunkt für das Ausmass und die Art der Sekundärstrukturbildung in einem Protein. Den Wert von [θ]MRW eines Proteins erhält man einfach dadurch, dass man die gemessene molare Elliptizität durch die Zahl der Aminosäuren des Proteins (n) teilt: [θ]MRW = [θ] / n (Einheit: Grad cm2 dmol-1) Die folgende Abbildung zeigt, dass sich im Fern-UV Bereich zwischen 180 und 250 nm die CD-Spektren von Proteinen mit verschiedenen Sekundärstrukturanteilen ganz charakteristisch unterscheiden. Proteine, die ausschliesslich aus α-Helices aufgebaut sind, haben ein stark negatives CD Signal mit Minima bei 208 und 222 nm und Werten von ca. –20000 Grad cm2 dmol-1, während reine β-Faltblattproteine ein schwächer negatives Signal (ca. –5000 Grad cm2 dmol-1) mit einem Minimum bei 215 nm aufweisen. Da die Fern-UV CD Spektren von entfalteten Proteinen von den Spektren nativer Proteine in der Regel stark verschieden sind (Minimum erst unterhalb 200 nm, siehe Abbildung), bietet die Fern-UV CD Spektroskopie hervorragende Möglichkeiten, Faltungs- und Konformationsübergänge in Proteinen zu verfolgen. Die Gestalt der Fern-UV CD Spektren von Proteinen kommt durch die Umgebung der Peptidbindungen der Protein-Hauptkette zustande, die in diesem Wellenlängenbereich absorbieren. Auch im Nah-UV Bereich (310-250 nm), dem Absorptionsbereich der aromatischen Aminosäuren, zeigen Proteine charakteristische CD-Spektren, deren Gestalt im Gegensatz zu den Fern-UV CD Spektren jedoch nicht vorhersagbar ist. Nah-UV CD Spektren sind in der Tat eine Art Fingerabdruck eines Proteins und für jedes Protein charakteristisch. Sie kommen durch die asymmetrische Umgebung der aromatischen Seitenketten im gefalteten Protein zustande und sind daher ein Mass für die korrekte Tertiärstrukturausbildung. Daher zeigen entfaltete Proteine normalerweise überhaupt kein CD Signal im Nah-UV Bereich. 31 Typische Fern-UV CD Spektren von Proteinen, die ausschliesslich α-Helices bzw. β Faltblätter als reguläre Sekundärstrukturelemente enthalten. [θ θ]MRW (degree cm2 dmol-1) 15000 10000 5000 0 -5000 Unfolded protein 200 250 wavelength (nm) 215 nm Pure β-sheet protein -10000 -15000 Pure α-helical protein -20000 208 nm 222 nm 32 A 2. Physikalische Grössen und ihre Einheiten Für das Verständnis physikalischer Prozesse ist es sehr hilfreich, sich die Einheiten der betreffenden physikalischen Grössen zu vergegenwärtigen. Davon sind die wichtigsten in den folgenden Tabellen zusammengefasst: Abkürzungen für Zehnerpotenzen Bezeichnung Abkürzung tera giga mega kilo milli micro nano pico femto Ångström T G M k m µ n p f Å Zehnerpotenz (Multiplikationsfaktor) 1012 109 106 103 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 -10 1 Å = 10 m = 0.1 nm Einheiten wichtiger physikalischer Grössen Physikalische Grösse Masse Molmasse Volumen Konzentration Ionenstärke Temperatur Freie Enthalpie einer chemischen Reaktion Enthalpieänderung einer chemischen Reaktion Entropieänderung einer chemischen Reaktion Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung Reaktionsgeschwindigkeit Beschleunigungsfaktor Umsatzrate bei Maximalgeschwindigkeit (Vmax) Michaeliskonstante Dissoziationskonstante Bindungskonstante Standard-Redoxpotential bei pH 7.0 Wellenlänge elektromagnetischer Strahlung Frequenz elektromagnetischer Strahlung 33 Abkürzung m MW V c oder [...] I T ∆G ∆H ∆S k1 k2 v kcat/kuncat kcat KM KDiss KBind Eo λ ν Einheit g -1 g mol oder Da L M (oder mol L-1 ) M K J mol-1 J mol-1 J K-1 mol-1 s-1 M-1 s-1 M s-1 dimensionslos s-1 M M M-1 V oder J C-1 m s-1 Physikalische Grösse Absorption Fluoreszenzintensität Mittlere molare Elliptizität pro Aminosäure Kooperativität der Proteinfaltung Abkürzung A FI [θ]MRW m Einheit dimensionslos willkürliche Einheiten Grad cm2 dmol-1 J mol-1 M-1 Abkürzung Wert 273.15 K 6.022 . 1023 mol-1 9.649 . 104 C mol-1 8.315 J K-1 mol-1 2.998 . 108 m s-1 6.626 . 10-34 J s Wichtige physikalische Konstanten Konstante Nullpunkt der Celsius-Skala Avogadrokonstante Faraday-Konstante Allgemeine Gaskonstante Lichtgeschwindigkeit Planck’sche Konstante NA F = NA e R c h A 3. Eigenschaften der am häufigsten verwendeten Puffersubstanzen in der Biochemie Trivialname Puffersubstanz und zum Einstellen des pH-Werts verwendete Säure oder Base Phosphat (pK1) Phosporsäure-NaOH (H3PO4/H2PO4-) Malat (pK1) Malonsäure-NaOH Formiat Ameisensäure-NaOH Succinat (pK1) Bernsteinsäure-NaOH Citrat (pK2) Citronensäure-NaOH Acetat Essigsäure-NaOH Succinat (pK2) Bernsteinsäure-NaOH MES Sulfonsäure-NaOH Cacodylat Dimethylarsinsäure-NaOH Carbonat (pK1) Kohlensäure-NaOH Citrat (pK1) Citronensäure-NaOH Bis-Tris 1,3-Bis(tris(hydroxyethyl)imino)tris(hydroxymethyl)methan-HCl Imidazol Imidazol-HCl MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure-NaOH Phosphat (pK2) Phosporsäure-NaOH (H2PO4-/HPO42-) HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N‘-2-Ethansulfonsäure-NaOH TEA Triethanolamin-HCl Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl Tricin N-(Tris(hydroxymethyl)methyl)glycin Bicin Glycin TAPS Propansulfonsäure-NaOH Morpholin Morpholin-HCl Borat Borsäure-NaOH Ammonium NH3-HCl Ethanolamin Ethanolamin-HCl CHES Cyclohexylaminoethansulfonsäure-NaOH Glycin (pK2) Gylcin-NaOH (H2N-CH2-CO2- / H3N+-CH2-CO2-) Carbonat (pK2) Kohlensäure-NaOH (HCO3-/CO32-) Phosphat (pK3) Phosporsäure-NaOH (H2PO42-/HPO43-) Werte aus Blanchard J.S., Methods Enzymol. 104, 405 ff. 34 pKa at 25 °C 2.15 3.40 3.75 4.21 4.76 4.76 5.64 6.10 6.27 6.35 6.40 6.46 6.95 7.20 7.20 7.48 7.76 8.06 8.05 8.26 8.40 8.49 9.23 9.25 9.50 9.55 9.78 10.33 12.33 dpKa/dT 0.0044 0.0 -0.0018 -0.0016 0.0003 0.0 -0.011 -0.0055 0.0 0.0 -0.020 0.015 -0.0028 -0.014 -0.020 -0.028 -0.021 -0.018 0.018 -0.008 -0.031 -0.029 0.029 -0.025 -0.009 -0.026
