INHAL TSVERZEICHNIS 1.1 Die hämatopoetisehe Stammzelle und
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INHAL TSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die hämatopoetisehe Stammzelle und ihre Differenzierung 1 1.2 T-Lymphozyten und ihre Entwicklung 4 1.3 T-Lymphozyten und ihre Funktionen 10 1.3.1 aß T-Zellen 10 1.3.1.1 Effektor T-Zellen 10 1.3.1.2 Regulatorische T-Zellen 13 1.3.1.3 y8 T-Zellen 16 1.3.1.3.1 Effektorfunktionen von yö T-Zellen 17 1.3.1.3.2 Antigenerkennung durch yS T-Zellen 20 1.3.1.3.3 Extrathymische Entwicklung von TCRytf lELs 20 1.4 21 Hämatopoetisehe Modellsysteme 1.4.1 Die humanisierte NSG-Maus als Modell der humanen Hämatopoese 1.4.2 Das OP9-Modell-System zur ex vivo T-Zell-Generierung aus 21 CD34* Blutstammzellen 1.5 2 23 Zielsetzung der Arbeit 25 MATERIAL UND METHODEN 26 2.1 Chemikalien und Reagenzien 26 2.2 Studiendesign in vivo Analysen 26 2.2.1 Versuchstiere 26 2.2.2 Testung in vitro generierter T-Zell-Vorläufer (CTLP) 27 2.3 Zellbiologische Methoden 28 2.3.1 Kulturbedingungen und Zellkulturmedien 28 2.3.1.1 In der Zellkultur verwendete Zytokine, Supplemente/Stimulantien und Proteine 28 2.3.1.2 In der Zellkultur verwendete Antikörper 30 I http://d-nb.info/1029424683 INHALTSVERZEICHNIS 2.3.2 Zelllinien 30 2.3.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 31 2.3.4 Ablösen und Passagieren von Zellen 31 2.3.5 Gewinnung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation 32 2.3.6 Präparation und Aufbereitung von Feeder- und akzessorischen Zellen 32 2.3.7 Generierung V81*CD4* T-Zell-Klone 33 2.3.8 Generierung und Aktivierung myeloider Dendritischer Zellen zur Kokultivierung mit V81*CD4* T-Zellen 2.3.9 34 Präparation und Generierung suppressiver T-Zellen zur Kokultivierung mit V81*CD4* T-Zellen 35 2.3.10 Messung der Zellproliferation mittels CFDA-SE- oder PKH67-Markierung 36 2.3.11 Gewinnung von CD34* Blutstammzellen (HSC) 37 2.3.12 Gewinnung von thymischen Epithelzellen (TEC) 37 2.3.13 Gewinnung und Kultivierung mesenchymaler Stammzellen (MSC) 37 2.3.14 Gewinnung von NK-Zellen, B-Zellen, Monozyten, CD4* und CDS* T-Zellen 38 2.3.15 In vitro Generierung von T-Zell-Progenitoren aus CD34* Stammzellen 38 2.3.15.1 V81*CD4*T-Zell-Klone in Kokultur mit OP9-N/DLL-1 39 2.3.16 T-Zell-Aktivierung und Expansion 40 2.3.17 Herstellung und Präparation konditionierter Zellkulturüberstände Stimulation von V81*CD4* T-Zell-Klonen 2.4 II Immunologische und Proteinbiochemische Techniken zur 41 41 2.4.1 Magnet-aktivierte Zellsortierung 41 2.4.2 Durchflusszytometrie (FACS) 43 2.4.2.1 Intrazelluläre Detektion von Zytokinen und Transkriptionsfaktoren 44 2.4.2.2 Analyse des TCRVß-Repertoires mittels Durchflusszytometrie 45 2.4.2.3 Für die Durchflusszytometrie verwendete Antikörper 45 2.4.3 Indirekte Immunfluoreszenzfärbungen 49 INHALTSVERZEICHNIS 2.4.3.1 Für die Immunfluoreszenzfärbung verwendete Antikörper 50 2.4.4 Herstellung von Zelllysaten 51 2.4.5 Bestimmung der Proteinkonzentration 52 2.4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 52 2.4.7 Western-Blot 54 2.4.7.1 Für den Western-Blot verwendete Antikörper 56 2.5 Histologische Methoden 57 May-Grünwald-Färbung 57 2.5.1 2.6 3 Molekularbiologische Methoden 57 2.6.1 RNA-Isolierung 57 2.6.2 DNA-Isolierung 58 2.6.3 cDNA-Synthese 58 2.6.4 PCR-Primer und Primerdesign 58 2.6.5 RT-PCR 60 2.6.6 Agarose-Gelelektrophorese 61 2.6.7 Real-time PCR 61 2.6.8 Fragmentlängen-Analyse (TCR-CDR3-Spectratyping) 63 2.6.8.1 T-Zell-Rezeptor Va-.Spectratyping" 63 2.6.8.2 T-Zell-Rezeptor Vß-„Spectratyping" 63 2.7 Statistische Methoden 63 2.8 Ethikvoten und Tierversuche 64 ERGEBNISSE 3.1 65 Verbesserung der Immunrekonstitution nach Transplantation CD34* Blutstammzellen durch Gabe vordifferenzierter (CTLP) 3.1.1 T-Zell-Progenitoren 65 4 Phänotypisierung hochreiner CD34 Zellen 65 III INHAL TSVERZEICHNIS 3.1.2 CD34* Zellen differenzleren zu T-Zell-Progenitoren auf murinen OP9-N/DLL-1 3.1.3 3.2 Stromazellen 66 Vordifferenzierte humane CTLPs forcieren die T-Zellrekonstitution in vivo 69 VS1*CD4* T-Zellen als potentielle Quelle extrathymischer T-Zell- Entwicklung? 75 3.2.1 Allgemeines 75 3.2.2 Phänotypisierung generierter V61 *CD4* T-Zell-Klone 76 3.2.2.1 Morphologie generierter V81 *CD4* T-Zell-Klone 76 3.2.2.2 V81*CD4* T-Zell-Klone besitzen das Markerrepertoire regulatorischer T-Zellen 77 3.2.2.2.1 Die Foxp3-Expression ist modulierbar 81 3.2.2.3 V81*CD4* T-Zellen sind aktivierte Gedächtnis-T-Zellen 83 3.2.2.4 V81*CD4* T-Zell-Klone zeigen ein ThO-Zytokinprofil 85 3.2.2.5 VS1 *CD4* T-Zellen exprimieren Marker für Zytotoxizität 89 3.2.2.6 V5rCD4* T-Zellen exprimieren myeloide Marker 90 3.2.2.7 V81 *CD4* T-Zellen exprimieren unterschiedliche Zytokinrezeptoren 92 3.2.2.8 V81*CD4* T-Zell-Klone exprimieren verschiedene Chemokinrezeptoren 94 3.2.2.9 V81 *CD4* T-Zell-Klone exprimieren Marker hämatopoetischer Progenitoren 96 3.2.2.10 V81*CD4* T-Zell-Klone zeigen RAG-1/-2 und pre-TCRa-Expression 98 3.2.2.11 V51*CD4* T-Zell-Klone exprimieren TCRa- und TCRß-Ketten 99 3.2.2.12 Zusammenfassung der Phänotypisierung 110 3.2.3 V81*CD4* T-Zell-Klone transdifferenzieren zu aß T-Zellen 113 3.2.3.1 Einfluss stimulierter PBMNCs auf die Transdifferenzierung 114 3.2.3.2 von Überständen suppressiver CD4* T-Zellen auf die 119 3.2.3.3 Übersicht der Experimente zur Transdifferenzierung 121 3.2.4 Einfluss verschiedener Kulturbedingungen auf die Expression von RAG-1 3.2.5 IV Einfluss Transdifferenzierung und pre-TCRa in V81*CD4* T-Zellen 123 Analyse transdifferenzierter aß T-Zellen (K1 -17 und P7-13sw) 130 INHAL TSVERZEICHNIS 4 DISKUSSION 4.1 140 In vitro Generierung v o n T-Zell-Progenitoren zur Verbesserung der Immunrekonstitution 4.2 Phänotyp der 140 V61*CD4* T-Zell-Klone und der Versuch der physiologischen Einordnung 4.3 Progenitorphänotyp der V81*CD4* 146 T-Zellen und ihr Potential als extrathymischer aß T-Zell-Progenitor 4.4 4.5 Induktion der Transdifferenzierung 150 und Phänotyp extrathymisch gereifter aß T-Zellen 155 Ausblick 162 5 ZUSAMMENFASSUNG 164 6 LITERATURVERZEICHNIS 166 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 180 8 TABELLENVERZEICHNIS 188 9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 190 10 KONTRIBUTION 196 11 PUBLIKATIONEN UND VORTRÄGE 197 12 DANKSAGUNG 198 V
