Western Blot

Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014
Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“
Western Blot
Der Western Blot ist eine analytische Methode zum Nachweis bestimmter Proteine in einer Probe.
Der Nachweis erfolgt mit spezifischen Antikörpern, die das gesuchte Protein erkennen und daran
binden.
Zuerst wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese aufgetrennt.
Elektrophorese
Die Auftrennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit von Teilchen/Stoffen im elektrischen Feld.
Elektrisch geladene Teilchen wandern im elektrischen Feld zum entgegengesetzten Pol:


Positiv geladene Teilchen (Kationen) wandern zum Minus-Pol (=Katode)
Negativ geladene Teilchen (Anionen) wandern zum Plus-Pol (=Anode).
Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von der Größe und Ladung eines Teilchens.
Es gibt eine Variante der Elektrophorese wodurch Proteine auf einem Gel nur nach ihrer Größe aufgetrennt werden.
In der Probenvorbereitung wird zu den Proteinen ein Probenpuffer gegeben. Dieser enthält unter
anderem das anionische Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat), welches an die Proteine bindet und
ihnen eine konstante und starke negative Ladung gibt.
Im Probenpuffer befindet sich außerdem ein Farbstoff, der den Fortschritt der Auftrennung sichtbar
macht.
Außerdem enthält der Probenpuffer chemische Substanzen, welche die räumliche Struktur (Faltung)
des Proteins verändern und Proteine dadurch „entfaltet“ werden.
Dies ist wichtig, da ein Antikörper bestimmte Strukturen (Epitope) des Proteins erkennt und diese frei
vorliegen müssen. Diese Veränderung des Proteins nennt man auch Denaturierung.
Abbildung 1: Nach der Probenvorbereitung liegen Proteine in gestreckter Form
dar und besitzen eine konstante negative
Ladung. Quelle: http://www200.unigraz.at/ipcwww/Elearning/Appa_PDF/7Elektro
phorese.pdf
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Dadurch wandern die negativ geladenen Proteine im elektrischen Feld zum positiv geladenen Pol
(Anode). Kleine Proteine wandern schneller als große Proteine.
Am Ende des Vorganges sind alle Proteine nach Größe sortiert (jede Bande stellt ein Protein dar, vgl.
Abbildung 2).
Abbildung 2: gefärbtes Polyacrylamidgel:
die Auftrennung des Proteingemisches
erfolgte von oben nach unten (vom
negativen zum positiven Pol). Zu sehen
sind die aufgetrennten Proteine von 8
Proben.
Quelle: http://www.bio-rad.com/enus/product/coomassie-stains
Zusätzlich zu den Proben wird ein Größenmarker auf das Gel geladen. Durch vergleich der Proteinbanden mit den Banden des Markers kann ihre Größe abgeschätzt werden. Durch weitere Verfahren
können bestimmte Proteine vom Gel nachgewiesen werden z.B mittels Western Blot.
Western Blot
Western Blot bezeichnet den Vorgang für die Übertragung von Proteinen auf eine Membran. Die
Übertragung der Proteine vom Gel auf die Membran macht sie für verschiedene Nachweismethoden
zugänglich. Die Übertragung erfolgt ebenfalls mit Hilfe eines elektrischen Feldes, indem die Proteine
Richtung Anode (pos. geladen) wandern. In einer Kassette wird die Membran auf das Gel gelegt, und
in Filterpapier und Schwämmen eingebettet.
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Abbildung 3: Darstellung eines Blotvorganges. Die Proteine wandern im elektrischen Feld aus dem Gel in
die Membran (von der Katode zur Anode).
Quelle: http://www.leinco.com/general_wb
Blocken
Da die Membran Proteine bindet und der Nachweis mit Antikörpern (ebenfalls Proteinen) erfolgt,
müssen alle Stellen der Membran, auf denen kein Protein gebunden hat für die Bindung weiterer
Proteine blockiert werden. Dies erfolgt durch Zugabe von z.B. Milch oder einer anderen Proteinlösung.
Detektion
Die Detektion der Proteine erfolgt mit Hilfe von Antikörpern.
Zuerst wird ein Primärantikörper dazugegeben, der gegen das gesuchte Protein gerichtet ist und spezifisch daran bindet.
Danach wird ein zweiter Antikörper (= Sekundärantikörper) dazugegeben, der den Primärantikörper
erkennt und daran bindet. Wurde der Primärantikörper z.B. in Mäusen hergestellt muss der zweite
Antikörper gegen die Spezies Maus gerichtet sein.
Dieser zweite Antikörper ist an ein Enzym gekoppelt, das ein Substrat umsetzt, wodurch aufgrund
einer chemischen Reaktion sichtbares Licht freigesetzt wird. Diese Reaktion nennt man auch Chemolumineszenz. Diese entstandene Lichtreaktion kann von einem Fotofilm festgehalten werden. Nach
der Entwicklung dieses Filmes sind an den Stellen, wo sich die gesuchten Proteine an der Membran
befinden, schwarze Banden zu erkennen. Je höher die Konzentration des gesuchten Proteins ist, desto größer und stärker sind die Banden.
Abbildung 4: Prinzip des Proteinnachweises
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Quelle: http://www.leinco.com/general_wb
Ergebnis des Western Blots:
Abbildung 5: Ergebnis eines Western Blots von 5
verschiedenen Proben. Auf einem Film sind je nach
Konzentration des gesuchten Proteins unterschiedlich
starke schwarze Banden zu erkennen.
Quelle: http://www.piercenet.com/previews/2011articles/western-blotting-enhanced-chemiluminescence/
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WESTERN BLOT-PROTOKOLL
Tag 1
Schritt 1 – Probenvorbereitung
Pipettierschema Western Blot
Position
Probe
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Marker
Probe 1
Probe 1
Probe 1
Probe 1
Probe 1
Probe 1
Probe 1
Probe 1
Probe 1
ProbenKonzentration eingesetzte
Probenpuffer Homogenisations- Gesamt
volumen
µg/µl
Menge (µg)
(Lämmli) (µl)
puffer (µl)
(µl)
(µl)
4,50
4,50
4,50
4,50
4,50
4,50
4,50
4,50
4,50
5,00
10,00
20,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
60,00
1,11
2,22
4,44
6,67
7,78
8,89
10,00
11,11
13,33
 gut durchmischen und zentrifugieren
Schritt 2 – Herstellung des Elektrophorese-Puffers
200 ml 5x SDS Puffer (Stock-Lösung)
+ 800 ml ddH2O
1000 ml Elektrophorese-Puffer
Schritt 3 – Elektrophorese




das Gel in die Gelkammer geben
die Gelkammer mit Elektrophorese-Puffer füllen
8 µl All Blue Standard in das erste Well pipettieren
20 bzw. 30 µl Probe in die weiteren Wells pipettieren
Einstellung der Stromstärke:
1 Gel: 0,03 A
2 Gele: mit 0,03 A beginnen und dann auf 0,05 A erhöhen
Dauer 1 Stunde
Seite 5
10,00
10,00
10,00
10,00
10,00
10,00
10,00
15,00
15,00
8,89
7,78
5,56
3,33
2,22
1,11
0,00
3,89
1,67
8,00
20,00
20,00
20,00
20,00
20,00
20,00
20,00
30,00
30,00
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Schritt 4 - Herstellung des Transfer Puffers
400 ml der 5x Stammlösung
+ 400 ml Methanol
+ 1600 ml ddH2O
1000 ml 1x Transfer-Puffer
Schritt 5 – Transfer
„Sandwich“ in einer Kassette vorbereiten
 Schwamm
 2 Lagen Filterpapier
 Gel
 Membran
 2 Lagen Filterpapier
 Schwamm
 Das „Sandwich“ gut im Transferpuffer einweichen lassen
 Nach der Elektrophorese das Gel in das „Sandwich“ geben
 Wichtig: alle Luftblasen entfernen
 Transferkassette und Eisblock in die Transferkammer geben (umgeben von Eis)
 Transferkammer mit Transferpuffer auffüllen
Einstellung der Stromstärke: 2 h bei 400mA bei 4°C
Schritt 6 – Ponceau Färbung
 Membran für 10 min in einer kleinen Schale mit Ponceau färben
 mit ddH2O waschen
 gefärbte Membran einscannen oder kopieren
Schritt 7 – Blockieren
 die Membran für 2 h bei 4°C (1 h bei Raumtemperatur) mit 5 % Milch blockieren
 2 x 10 min mit Waschpuffer waschen
Schritt 8 – 1. Antikörper
 1.Antikörper mit 0,5 % Milch verdünnen
 Inkubation über Nacht bei 4°C
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Tag 2
Membran mit 3 x 10 min mit Waschpuffer waschen
Schritt 9 – 2. Antikörper
 2. Antikörper mit 0,5% Milch verdünnen
 Inkubation: 50 min / 4°C
 4x 10 min mit Waschpuffer waschen
Schritt 10 – Substrat (Pico, Clarity oder Femto)
 Inkubation: 5 min / Raumtemperatur / lichtgeschützt
 In der Zwischenzeit – Filmkassette mit einer Folie vorbereiten
 Membran nach der Inkubation in die Filmkassette geben (überschüssige Flüssigkeit abtropfen
lassen)
Schritt 11 – Entwicklung der Filme
Optional: Schritt 12 – Membran strippen
 4 min ddH2O
 8 min 0.2 M NaOH (oder Stripping-Puffer)
 4 min ddH20
Nach dem Strippen mit Schritt 6 (Blockieren) beginnen!
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