Western Blot
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Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ Western Blot Der Western Blot ist eine analytische Methode zum Nachweis bestimmter Proteine in einer Probe. Der Nachweis erfolgt mit spezifischen Antikörpern, die das gesuchte Protein erkennen und daran binden. Zuerst wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Elektrophorese Die Auftrennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit von Teilchen/Stoffen im elektrischen Feld. Elektrisch geladene Teilchen wandern im elektrischen Feld zum entgegengesetzten Pol: Positiv geladene Teilchen (Kationen) wandern zum Minus-Pol (=Katode) Negativ geladene Teilchen (Anionen) wandern zum Plus-Pol (=Anode). Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von der Größe und Ladung eines Teilchens. Es gibt eine Variante der Elektrophorese wodurch Proteine auf einem Gel nur nach ihrer Größe aufgetrennt werden. In der Probenvorbereitung wird zu den Proteinen ein Probenpuffer gegeben. Dieser enthält unter anderem das anionische Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat), welches an die Proteine bindet und ihnen eine konstante und starke negative Ladung gibt. Im Probenpuffer befindet sich außerdem ein Farbstoff, der den Fortschritt der Auftrennung sichtbar macht. Außerdem enthält der Probenpuffer chemische Substanzen, welche die räumliche Struktur (Faltung) des Proteins verändern und Proteine dadurch „entfaltet“ werden. Dies ist wichtig, da ein Antikörper bestimmte Strukturen (Epitope) des Proteins erkennt und diese frei vorliegen müssen. Diese Veränderung des Proteins nennt man auch Denaturierung. Abbildung 1: Nach der Probenvorbereitung liegen Proteine in gestreckter Form dar und besitzen eine konstante negative Ladung. Quelle: http://www200.unigraz.at/ipcwww/Elearning/Appa_PDF/7Elektro phorese.pdf Seite 1 Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ Dadurch wandern die negativ geladenen Proteine im elektrischen Feld zum positiv geladenen Pol (Anode). Kleine Proteine wandern schneller als große Proteine. Am Ende des Vorganges sind alle Proteine nach Größe sortiert (jede Bande stellt ein Protein dar, vgl. Abbildung 2). Abbildung 2: gefärbtes Polyacrylamidgel: die Auftrennung des Proteingemisches erfolgte von oben nach unten (vom negativen zum positiven Pol). Zu sehen sind die aufgetrennten Proteine von 8 Proben. Quelle: http://www.bio-rad.com/enus/product/coomassie-stains Zusätzlich zu den Proben wird ein Größenmarker auf das Gel geladen. Durch vergleich der Proteinbanden mit den Banden des Markers kann ihre Größe abgeschätzt werden. Durch weitere Verfahren können bestimmte Proteine vom Gel nachgewiesen werden z.B mittels Western Blot. Western Blot Western Blot bezeichnet den Vorgang für die Übertragung von Proteinen auf eine Membran. Die Übertragung der Proteine vom Gel auf die Membran macht sie für verschiedene Nachweismethoden zugänglich. Die Übertragung erfolgt ebenfalls mit Hilfe eines elektrischen Feldes, indem die Proteine Richtung Anode (pos. geladen) wandern. In einer Kassette wird die Membran auf das Gel gelegt, und in Filterpapier und Schwämmen eingebettet. Seite 2 Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ Abbildung 3: Darstellung eines Blotvorganges. Die Proteine wandern im elektrischen Feld aus dem Gel in die Membran (von der Katode zur Anode). Quelle: http://www.leinco.com/general_wb Blocken Da die Membran Proteine bindet und der Nachweis mit Antikörpern (ebenfalls Proteinen) erfolgt, müssen alle Stellen der Membran, auf denen kein Protein gebunden hat für die Bindung weiterer Proteine blockiert werden. Dies erfolgt durch Zugabe von z.B. Milch oder einer anderen Proteinlösung. Detektion Die Detektion der Proteine erfolgt mit Hilfe von Antikörpern. Zuerst wird ein Primärantikörper dazugegeben, der gegen das gesuchte Protein gerichtet ist und spezifisch daran bindet. Danach wird ein zweiter Antikörper (= Sekundärantikörper) dazugegeben, der den Primärantikörper erkennt und daran bindet. Wurde der Primärantikörper z.B. in Mäusen hergestellt muss der zweite Antikörper gegen die Spezies Maus gerichtet sein. Dieser zweite Antikörper ist an ein Enzym gekoppelt, das ein Substrat umsetzt, wodurch aufgrund einer chemischen Reaktion sichtbares Licht freigesetzt wird. Diese Reaktion nennt man auch Chemolumineszenz. Diese entstandene Lichtreaktion kann von einem Fotofilm festgehalten werden. Nach der Entwicklung dieses Filmes sind an den Stellen, wo sich die gesuchten Proteine an der Membran befinden, schwarze Banden zu erkennen. Je höher die Konzentration des gesuchten Proteins ist, desto größer und stärker sind die Banden. Abbildung 4: Prinzip des Proteinnachweises Seite 3 Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ Quelle: http://www.leinco.com/general_wb Ergebnis des Western Blots: Abbildung 5: Ergebnis eines Western Blots von 5 verschiedenen Proben. Auf einem Film sind je nach Konzentration des gesuchten Proteins unterschiedlich starke schwarze Banden zu erkennen. Quelle: http://www.piercenet.com/previews/2011articles/western-blotting-enhanced-chemiluminescence/ Seite 4 Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ WESTERN BLOT-PROTOKOLL Tag 1 Schritt 1 – Probenvorbereitung Pipettierschema Western Blot Position Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Marker Probe 1 Probe 1 Probe 1 Probe 1 Probe 1 Probe 1 Probe 1 Probe 1 Probe 1 ProbenKonzentration eingesetzte Probenpuffer Homogenisations- Gesamt volumen µg/µl Menge (µg) (Lämmli) (µl) puffer (µl) (µl) (µl) 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 5,00 10,00 20,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 60,00 1,11 2,22 4,44 6,67 7,78 8,89 10,00 11,11 13,33 gut durchmischen und zentrifugieren Schritt 2 – Herstellung des Elektrophorese-Puffers 200 ml 5x SDS Puffer (Stock-Lösung) + 800 ml ddH2O 1000 ml Elektrophorese-Puffer Schritt 3 – Elektrophorese das Gel in die Gelkammer geben die Gelkammer mit Elektrophorese-Puffer füllen 8 µl All Blue Standard in das erste Well pipettieren 20 bzw. 30 µl Probe in die weiteren Wells pipettieren Einstellung der Stromstärke: 1 Gel: 0,03 A 2 Gele: mit 0,03 A beginnen und dann auf 0,05 A erhöhen Dauer 1 Stunde Seite 5 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 15,00 15,00 8,89 7,78 5,56 3,33 2,22 1,11 0,00 3,89 1,67 8,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 30,00 30,00 Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ Schritt 4 - Herstellung des Transfer Puffers 400 ml der 5x Stammlösung + 400 ml Methanol + 1600 ml ddH2O 1000 ml 1x Transfer-Puffer Schritt 5 – Transfer „Sandwich“ in einer Kassette vorbereiten Schwamm 2 Lagen Filterpapier Gel Membran 2 Lagen Filterpapier Schwamm Das „Sandwich“ gut im Transferpuffer einweichen lassen Nach der Elektrophorese das Gel in das „Sandwich“ geben Wichtig: alle Luftblasen entfernen Transferkassette und Eisblock in die Transferkammer geben (umgeben von Eis) Transferkammer mit Transferpuffer auffüllen Einstellung der Stromstärke: 2 h bei 400mA bei 4°C Schritt 6 – Ponceau Färbung Membran für 10 min in einer kleinen Schale mit Ponceau färben mit ddH2O waschen gefärbte Membran einscannen oder kopieren Schritt 7 – Blockieren die Membran für 2 h bei 4°C (1 h bei Raumtemperatur) mit 5 % Milch blockieren 2 x 10 min mit Waschpuffer waschen Schritt 8 – 1. Antikörper 1.Antikörper mit 0,5 % Milch verdünnen Inkubation über Nacht bei 4°C Seite 6 Zweitbesuch am LBI.HF am 10.02.2014 Projekt „Herzerkrankungen durch Biomarker erKennenLernen“ Tag 2 Membran mit 3 x 10 min mit Waschpuffer waschen Schritt 9 – 2. Antikörper 2. Antikörper mit 0,5% Milch verdünnen Inkubation: 50 min / 4°C 4x 10 min mit Waschpuffer waschen Schritt 10 – Substrat (Pico, Clarity oder Femto) Inkubation: 5 min / Raumtemperatur / lichtgeschützt In der Zwischenzeit – Filmkassette mit einer Folie vorbereiten Membran nach der Inkubation in die Filmkassette geben (überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen) Schritt 11 – Entwicklung der Filme Optional: Schritt 12 – Membran strippen 4 min ddH2O 8 min 0.2 M NaOH (oder Stripping-Puffer) 4 min ddH20 Nach dem Strippen mit Schritt 6 (Blockieren) beginnen! Seite 7
