Molekularbiologie von Tumor 1.c

Molekularbiologie von Tumor 1.c
Genaueres über die Rolle von p53
FOLIE 25
Antioxidante Aktivität Das p53 Gen war das erste entdeckte Tumorsuppressorgen und seit der
Entdeckung hat sich herausgestellt, dass in den meissten menschlichen Tumoren der p53Signalisationsweg verändert wird (in 50% der menschlichen Tumoren ist das p53 Gen selbst mutant).
Das p53 Protein steht im Mittelpunkt der Antitumor-Mechanismen und wird daher auch als „der
Wächter des Genoms” bezeichnet. In der Abwesenheit vom zellulären Stress induziert der niedrige p53
Spiegel eine Antioxidant-Aktivität, welche die reaktiven Sauerstoffarten und dadurch die DNA
Beschädigungen senkt. Laut Schätzungen verändern die endogenen reaktiven Sauerstoffarten an einem
Tag 20.000 DNA-Basen pro Zelle. Um die Mutationen zu vermeiden erregt p53 als Transkriptionsfaktor
die Proteine mit Antioxidant-Funktion, wie z.B. Glutationperoxidase 1 und Sestrin.
(A) Reagieren auf Zell-Stress und DANN-Verletzungen
Viele „Gefahr-Signal“ Typen (z.B. Zell-Stress, DNA-Verletzung) können das p53 aktivieren, was
mehrere Antwortmechanismen aktivierend die Tumorbildung hemmt. Unter die „upstream“ Stress
Aktivatoren gehört z.B. Strahlung, DNA-Brechung durch chemische Stoffe, Onkogen-Aktivierung,
Hypoxie und niedriger Ribonukleotid-Anhalt. Diese Faktoren können die Entstehung von Tumoren
induzieren, das Auswehren dessen löst „downstream“ Prozesse aus: stoppen des Zellzyklus, Apoptose,
DNA-Reparatur, Hemmung der Angiogenese. Das Stoppen des Zellzyklus ermöglicht die Reparatur der
DNA-Mutationen. Die Apoptose hemmt, durch das Antreiben der Zellen zum Selbstmord die
Verbreitung der mutanten Zellen. Das p53 entscheidet sich dann für eine Apoptose, wenn der Fehler
(hauptsächlich DNA-Bruch) nicht mehr korrigierbar ist. Im Laufe der Apoptose opfern sich die
mutanten Zellen eigentlich für den Organismus auf. Im Fall bestimmter Stress-Prozesse verfügt p53
über eine prooxidante Wirkung, das heißt, es hilft die Entstehung der freien Radikalen herbei. Ursache
dieses Prozesses ist, dass p53 selbst DNA-Fehler generiert, die die pro-apoptotischen Mechanismen
steigert.
(B) Domänen des p53 Proteins und deren Platzierungen sind am Bild zu sehen.
Die Transaktivationsdomäne ist für die Transkription-aktivierende Wirkung verantwortlich (die
Bindung von MDM2 hierher hat einen hemmenden Effekt), indem die DNA-Bindungsstelle die
DNA bindet. Die Oligomerisationsdomäne ist für das Verknüpfen der p53 Moleküle verantwortlich.
Zur Regulatordomäne können unterschiedliche Faktoren binden, welche die Aktivität von p53
modifizieren können. Die Mutationsheisspunkte bedeuten, dass in diesen Stellen die Häufigkeit der
Mutation höher ist. Im Fall von p53 sind die Heisspunkte vor allem in den 175. und 245.
Basenpositionen. Bemerkungen: (1) wir erkennen die häufigen Mutationen (Heisspunkte) in
anderen Domänen nicht, da sie kein Krebs verursachen. (2) Wenn an einer gegebenen Stelle in
einem Gen die Mutation häufig ist, bedeutet es nicht unbedingt Heisspunkte, sondern es kann auch
durch Vererbung in der Population verbreitet werden (für das p53 Gen ist es nicht wahr, da die
Mutation schwere Krankheit verursacht – siehe Li-Fraumeni Syndrom).
(C) Regulierung durch p53 MDM2 Normalerweise ist der p53-Spiegel in den Zellen niedrig. Die
Aktivität des p53 in den Zellen wird weniger auf der Ebene der Genexpression, als durch ProteinDegradation verwirklicht. Hauptregulator der Proteindegradation ist eine Ubiquitin-Ligase, das MDM2
Protein. Die Ubiquitin-Ligasen sind Enzyme, die ein kurzes Peptid (Ubiquitin) an die Proteine „kleben”,
und diese so zum Abbauen in den Proteasomen markieren. Das MDM2 reguliert außerdem die Aktivität
des p53 Proteins indem es das am Amino-Terminal des p53 platzierten Trans-Aktivierungsdomäne und
den Proteintransport aus dem Zellkern in das Zytoplasma hemmt. Die Bindung des MDM2 an p53 ist
durch ein selbstregulierendes Feedback geregelt, da das p53 Protein die Transkription von MDM2 als
Transkriptionsfaktor antreibt. Das p53 treibt also seinen eigenen negativen Regulator an. Wenn der
p53 Spiegel in der Zelle hoch ist, dann ist die Entstehung von MDM2 schneller und der ursprüngliche
Spiegel kommt wieder zustande. Wenn p53 wenig ist, gibt es keine anregende Wirkung, so wird die
MDM2 Konzentration niedrig, was den Anstieg der p53-Menge ermöglicht.
(D) Upstream: molekularer Weg der Aktivation von p53 Es hängt vom Stress-Signal ab, durch
welchen Mechanismus p53 aktiviert wird. Der Stress wird durch ein Protein wahrgenommen. Von
diesen sind zahlreiche Proteine Kinasen, die das Gefahr-Signal in Phosphorilation verwandeln. Das
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Beenden der Wechselwirkung von p53-MDM2 ist Voraussetzung der Aktivierung von p53. Die upstream
Aktivatoren verwenden 3 unabhängige molekulare Hauptwege zum Signalisieren vom Stress.
(1) Die durch ionisierende Strahlung verursachte DNA-Verletzungen werden durch zwei
unterschiedliche Proteinkinasen vermittelt. Die eine Kinase, durch den zweisträngigen Bruch der DNA
aktiviertes ATM aktiviert eine andere Kinase, das Chk2. Beide Kinasen phosphorylieren den aminoterminalen Abschnitt des p53 Proteins, und dies hemmt die Bindung des MDM2. (2) Die auf
Zellstress gegebene Antwort wird an p53 ebenfalls durch zwei Kinasen vermittelt, diese sind ATR und
Kasein-Kinase II, diese hemmen ebenso die p53-MDM2 Wechselwirkung durch Phosphorylierung. (3)
Die aktivierten Onkogene wie z.B. Ras, aktivieren das p14arf Protein. Dieses Protein knüpft nicht an
p53, die Rolle dessen ist nämlich die Abtrennung des MDM2 im Zellkernchen. Alle drei Wege schützen
das Protein p53 vor der von MDM2 vermittelten Degradation.
(E) Downstream: der molekulare Mechanismus der p53 Wirkung Die wichtigste Tumorsuprimierende Wirkung des p53 Protein basiert auf der Transkriptionsaktivität der Zielgene. Sehen wir,
was für Aufgaben die aktivierten Proteinnetze versehen. (1) Hemmung des Zellzyklus Eine zentrale
Funktion des Proteins p53 ist das Stillegen des Zellzyklus nach einer Verletzung der DNA, dies
ermöglicht eine Korrektur der DNA vor der Replikation. Das p53 Protein erreicht diese Wirkung durch
Aktivierung der Transkription im Gen p21. Das Protein p21 hemmt die komplexe Funktion zahlreicher
Zyklin-CDK (Zyklin-abhängige Kinase), und beendet somit die Übergänge G1→S und G2→M des
Zellzyklus. Weiterhin bindet das Protein p21 das PCNA (proliferating cell nuclear antigen) Protein, was
dazu führt, dass die DNA-Synthese herbeihelfende Funktion des PCNA Proteins nicht mehr anwesend
ist, aber die fehlerkorrigierende Fähigkeit dessen immer noch existiert.
(2) Die Expression vieler Vermittler der Apoptose werden auf der Ebene der Transkription direkt
durch das Protein p53 reguliert. Die Zielgene von p53 kodieren solche Proteine, die in den äußeren und
inneren Signalwegen der Apoptose eine Rolle spielen. Grundprinzip der p53-Regulierung ist, dass dieser
Transkriptionsfaktor die Bildung von pro-apoptotischen Proteinen anregt und die von antiapoptotischen Proteinen hemmt. Das p53 induziert die Bildung von mitochondriellen proapoptotischen Proteinen, diese sind NOXA und PUMA (diese regen zur Cytochrom-Befreiung und
Produktion von Apoptosomen an). Weiterhin verschiebt p53 das durch Proteine Bcl-2 gesicherte
Gleichgewicht in Richtung Apoptose durch Anregung der Expression von Bax (pro-apotptischer Faktor),
bzw. durch Hemmung der Expression der anti-apoptotischen Bcl-2 Proteinen. Der Fas Rezeptor (FASR)
ist ein Transmembranrezeptor, welcher extrazelluläre Todessignale erkennt und so Apoptose stimuliert.
Die Transkription des FASR Gens wird durch p53 induziert. Auch die Blockierung der
Überlebenssignale stimuliert eine Apoptose, diese Aufgabe erledigt Protein IGF-BP3 (insulin-like
growth factor-binding protein 3) indem er die Anknüpfung von IGF-1 an sein Rezeptor verhindert. Das
p53 induziert auch die Transkription des IGF-BP3 Gens. Die oben geschilderten Prozesse müssen
miteinander in Einklang sein um eine Apoptose durchführen zu können. Das Molekül p53 ist fähig auch
durch Transkription-unabhängige Mechanismen eine Apoptose auszulösen (wird hier nicht erläutert).
(3) DNA-Korrektur und Angiogenese Als Beispiel muss das xfc Gen erwähnt werden, die
Expression dessen wird auch durch p53 geregelt, ähnlich wie bei den anderen Zielgenen von p53, durch
Bindungen an, sich im Promoter des xfc Gens befindenden, p53-Antwort Elemente (response elements).
Das XFC Protein nimmt an einem Nukleotid-ausschneidenden Korrekturmechanismus teil. Weiterhin
ist Trombospondin ein, die Angiogenese hemmendes Protein, dessen Expression ebenso durch Protein
p53 stimuliert wird.
(F) Entscheidungen treffen Das p53 verhindert durch zwei unterschiedliche, voneinander
unabhängigen Mechanismen, dass die verletzte DNA in die Nachkommezellen gerät: durch Hemmung
des Zellzyklus und durch Induktion der Apoptose. Zur Zeit hat man damit begonnen, den molekularen
Mechanismus dieser Prozesse zu erkunden. Laut der meist akzeptierten Vorstellung sind
unterschiedliche Kombinationen der als Dimer funktionierenden Transkriptionsfaktoren für die
unterschiedlichen biologischen Antworten verantwortlich. Sehen wir uns als Beispiel die durch p53
ausgelöste Aktivität des Myc Onkogens an. Der Stress-Signal wirkt durch Protein p21 (p21 hemmt das
Zyklin-CDK Komplex und so den Zellzyklus, und auch die Apoptose). Die Regulierung des p21 ist ein
wichtiger Punkt des Entscheidungsmechanismus von p53. Zur Expression von p21 ist sowohl p53
Protein als auch Miz-1 Protein notwendig. Das Myc-Protein wettstreitet mit p53 um die Bindung an
Miz-1 (es entsteht p53-Miz1 oder Myc-Miz1 Heterodimer). Die Myc-Bindung an Miz-1 hemmt
Transkription von p21. Das Myc Protein verhindert durch Hemmung der Expression von p21 nicht nur
die Hemmung des Zellzyklus von p53, sondern auch die durch p21 vermittelte Apoptose-Hemmung. Im
Laufe der oben geschilderten Prozesse ändert sich p53 nicht, es ist so fähig die Produktion von proapoptotischen Proteinen zu induzieren. Zur Induktion einiger Apoptose-anregenden Gene bedarf es
auch an Ko-Faktoren. Eine solche Ko-Faktorfamilie, die p53 Apoptose-stimulierenden Proteine (ASPP)
spielen ebenfalls eine Rolle im Entscheidungsmechanismus von p53. Diese Proteine knüpfen sich an die
DNA-bindende Domäne des p53 Proteins, wodurch die Aktivität von p53 selektiv in Richtung
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Regulierung der Transkription von pro-apoptotischen Genen gewendet wird, im Gegensatz zur
Zellzyklus-stoppenden Funktion.
In der Selektivität zwischen funktionell unterschiedlichen apoptotischen Gene kontra Zellzyklus
(Teilung stoppende) Gene spielen spezifische Promotorsequenzen eine Rolle. Die Mutationen an der
ASPP Bindungsstelle des p53 Proteins und die epigenetische Stillegung des ASPP Gens kann in vielen
Tumorzellen beobachtet werden. Diese Tumorzellen entstehen wahrscheinlich, weil sie das
Apoptoseprogram entkommen konnten, auf welches normalerweise ASPP erregend wirkt.
Mutation im p53 Signalweg und Krebs Charakteristisch für die Zellen mutant im p53 Gen ist die
genomische Instabilität, da die Mutationen in den teilenden Zellen leichter erhalten bleiben, was für die
Tumorbildung vorteilhafte Bedingungen sichert. 75% der Mutationen im p53 Gen sind missenseMutationen, welche durch den Austausch einer Aminosäre verursacht werden. Mehr als 90% der
missense-Mutationen entstehen in der DNA-Bindungsdomäne (102-292 Aminosäuren) und mehr als
30% dieser betreffen nur 6 Codone, welche daher als Heisspunkte (hot spots) genannt werden. Ausser
den das p53 Gen selbst betreffenden Mutationen können auch weitere, die Funktion des p53
Signalweges betreffende Mutationen vorkommen. Mutation des chkl (choline kinase-like) Gens betrifft
z.B. den p53 Weg. In diesen Fällen werden die Stresssignale nicht an das p53 übermittelt. Die erhöhte
Expression des MDM2 Proteins führt zur Inaktivierung des p53 Proteins. Die Inaktivation der
downstream-Effektoren (z.B. Bax und FASR) wirken auch störend auf die Funktion des p53 Signalweges.
Die, den p53 Signalweg störenden Mutationen haben oft keine so grosse Wirkung als die Mutationen die
das p53 Gen selbst betreffen, da das p53 Protein der zentrale Punkt (Hub Protein) bei der Regelung der
oben geschilderten Prozessen ist.
Das Li-Fraumeni Syndrom wird durch die Mutation des p53 Gens verursacht und wichtigste
Eigenschaft dessen ist die Neigung für das Entstehen vieler Tumorarten. Diese ist eine autosomaldominante Krankheit, wird also von einer betroffenen Person mit 50%-iger Wahrscheinlichkeit an den
Nachkommen weitergegeben. Die Mutation des p53 in beiden Kopien resultiert in ein lebensunfähiges
Foetus. Die betroffenen Personen werden mit einer 25-fach erhöhten Wahrscheinlichkeit krebskrank,
als die nicht-Genmutanten Personen. Das Vorkommen folgender Tumoren ist für diese Krankheit
charakteristisch: Sarkomen, Brustkrebs, Leukämien und Hirntumore.
Der Wirkungsmechanismus der Tumorsuppressorgene scheint mehr komplex zu sein, als die
Zweitrefferhypothese es vorschlägt (dieses Problem haben wir auch beim Rb Gen gezeigt). Dieses
Prinzip ist besonders wahr für das p53 Gen, bei dem das Ereignis der Haplo-Insuffizienz vorkommt,
das bedeutet, dass das p53 Gen in einer Kopie ungenügend für das Erfüllen der normalen Funktion
ist. Unterschiedliche Mutationen führen zur unterschiedlichen Expression des Tumorsupressorgens,
so die Konzentration dieses Proteins kann eine wichtige Rolle beim Ablauf der Prozesse spielen,
die Krebs hervorrufen. Untersuchungen, wo mit Hilfe von Tiermodellen Hypomorphen (Tiere, die
nur verminderte Mengen von p53 Protein exprimieren) hergestellt worden sind, unterstützen die
obere Argumentation: je niedriger der Spiegel des p53 Proteins in den Zellen, desto grösser das
Risiko der Krebsentstehung. Einige p53 Mutationstypen haben einen negativen Effekt, da das
mutante p53 Protein das normale p53 Protein binden (Dimerisierung) und es dadurch inaktivieren
kann. In diesem Fall ist der selbstregulierende Effekt von p53 beschädigt, da es die Expression des
MDM2 Gens nicht induzieren kann, so wird das mutante p53 Protein in der Zelle angereichert.
Einige dominant negative Mutationen können auch zu einem Phänotyp mit Funktionsgewinn
führen. In diesem Fall benimmt sich das mutante p53 als Onkogen.
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