Molekulare Analyse der viralen Induktion von Interferon

ZUSAMMENFASSUNG
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Zusammenfassung
Im Rahmen einer Virusinfektion kommt es nach Kontakt des Pathogens oder seiner Komponenten
mit spezialisierten Zellen des Immunsystems zur Freisetzung von Interferon-alpha (IFN-α). Das
IFN-α aktiviert antivirale Mechanismen und hat somit eine Schlüsselfunktion bei der angeborenen
Abwehr viraler Infektionen inne. Darüber hinaus zeichnet sich dieses Zytokin durch ein pleiotropes
Spektrum an immunmodulatorischen Effekten aus, die zur grundlegenden Ausrichtung und
Entwicklung des adaptiven Immunsystems beitragen. Wesentliche Aspekte der IFN-α Induktion
durch Viren sind allerdings bisher nicht aufgeklärt. Ziel dieser Arbeit war es daher, Einblicke in die
molekularen Mechanismen der IFN-α Induktion zu bekommen. Dabei standen die nichtinfektiösen Induktionswege durch virale Bestandteile im Zentrum der Untersuchungen. Die
Analysen der viralen IFN-α Induktionsmechanismen wurden an mononukleären Zellen des
peripheren Blutes (PBMZ), an myeloiden dendritischen Zellen (mDZ) oder an plasmazytoiden
dendritischen Zellen (pDZ) durchgeführt. Dabei wurden die pDZ als Hauptproduzenten des IFN-α
und die mDZ mittels magnetischer Zellsortierung aus PMBZ isoliert. Zur qualitativen und
quantitativen Beurteilung der IFN-α Antworten wurde neben der Konzentrationsbestimmung des
sezernierten IFN-α auch die Messung der transkriptionellen Aktivierung der IFN-α Gene
durchgeführt. Dazu wurden im Rahmen dieser Arbeit quantitative PCR-Assays etabliert, die es
ermöglichten, die Transkriptmengen einiger der hoch homologen IFN-α Isoformen differentiell
und relativ zueinander zu quantifizieren. Auf Grund der Sensitivität der Methodik, war es möglich,
eine basale konstitutive IFN-α Transkription in unstimulierten Zellen zu messen, die Expression
verschiedener IFN-α Isoformen zu frühen Zeitpunkten der Virusstimulation zu erfassen und den
zeitlichen Verlauf der IFN-α Antwort zu verfolgen. Unabhängig von der Art des viralen Induktors
blieb die Zusammensetzung des IFN-α Isoformprofils konstant, wobei sich jedoch signifikante
Unterschiede zwischen den Viruspräparationen im zeitlichen Verlauf und in der Stärke der
induzierten IFN-α Transkription zeigten. Die Mengen an freigesetztem IFN-α waren nicht nur von
der Art des verwendeten Induktors abhängig, sondern konnten durch verschiedene Faktoren
moduliert werden. Einer dieser Einflussfaktoren war das IFN-α selbst, das durch autokrine
Stimulation der Zellen in der frühen Phase einer Virusinfektion zu einer beschleunigten IFN-α
Produktion beitrug. In Abhängigkeit vom viralen Stimulus übte auch natives autologes Blutplasma
als natürliches extrazelluläres Milieu der PBMZ einen entscheidenden Einfluss auf die Menge an
sezerniertem IFN-α aus.
ZUSAMMENFASSUNG
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Die IFN-α produzierenden Zellen sind in der Lage, allein durch die Interaktion mit Hüllproteinen
bestimmter Viren eine IFN-α Freisetzung zu generieren, ohne dass dafür ihre eigene Infektion
notwendig ist. Inwieweit dies auch für das humanpathogene Respiratorische Syncytial Virus
(RSV) zutrifft, sollte in dieser Arbeit gezeigt werden. Mit Kokulturen von PBMZ und fixierten,
RSV-infizierten Epithelzellen, die nachweislich Proteine des Virus auf der Zelloberfläche
exprimierten, konnte eine IFN-α Freisetzung induziert werden, ohne dass infektiöse Virionen
nachweisbar waren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass allein die Detektion von RSVProteinen einen adäquaten Stimulus für die Aktivierung der IFN-α Transkription darstellt.
Die molekularen Voraussetzungen einer IFN-α Induktion allein durch die Interaktion von viralen
Hüllproteinen mit Oberflächenstrukturen der IFN-α produzierenden Zellen sind bis heute wenig
verstanden. Eine funktionelle Beteiligung von Glykostrukturen der Virusproteine bei dieser Art der
Auslösung einer IFN-α Antwort konnte durch Kompetitionsexperimente mit Monosacchariden,
chemische Modifikation von Zuckerseitenketten und der Reduktion von Glykostrukturen an der
Zelloberfläche belegt werden. Neben der nicht-infektiösen IFN-α Induktion durch virale
Hüllproteine konnte die Relevanz von extrazellulärer doppelsträngiger Ribonukleinsäure (dsRNS),
die als Intermediat bei der Virusreplikation entsteht, als IFN-α Induktor belegt werden. Dazu
wurden in dieser Arbeit in vitro dsRNS-Fragmente aus genomischen Sequenzen des Newcastle
Disease Virus (NDV) generiert und extrazellulär den Zellen appliziert. Funktionelle Vergleiche mit
einem synthetischen dsRNS-Analogon zeigten eine überlegene IFN-α Induktionskapazität der in
vitro hergestellten dsRNS-Fragmente, da nur diese Moleküle eine IFN-α Produktion in pDZ
aktivierten. Die Komplexierung der dsRNS mit einem Transfektionsreagenz führte zu einer
Effizienzsteigerung der IFN-α Induktion. Eine Beteiligung der „Toll-like“ Immunrezeptoren
(TLR) an der dsRNS-vermittelten IFN-α Induktion in pDZ war nicht nachweisbar.
Das angeborene Immunsystem verfügt über multiple Erkennungsstrategien, um eine Virusinfektion frühzeitig detektieren zu können. Neben der zellulären Infektion spielt dabei insbesondere
die Erkennung von nicht-infektiösen viralen Komponenten wie Glykoproteinen der Virushülle
oder intra- und extrazelluläre dsRNS als mögliche IFN-α Induktoren eine wichtige Rolle. Dabei
sind die Stärke und der Verlauf der IFN-α Antwort nicht nur von der Art des Induktors abhängig,
sondern auch zusätzlichen modulatorischen Einflüssen des extrazellulären Milieus unterworfen.
Diese komplexen und redundanten IFN-α Induktionsmechanismen versetzen das Immunsystem in
die Lage, schnell und effektiv eine „Verteidigungslinie“ gegen ein breites Spektrum an Viren auf
zellulärer Ebene zu etablieren.