Reaktionen der Aminogruppe

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Teil 2 Reaktivität von
Aminosäuren, Nachweismethoden
Reaktionen der Carboxygruppe
 AS sind einer säurekatalysierten Veresterung leicht zugänglich; mit
EtOH und HCl führt sie zu den Ethylesterchloriden
 Die freien Ester sind aus den Salzen durch Einwirkung von Basen
erhältlich und im Vakuum unzersetzt destillierbar. Auf der
fraktionierten Destillation beruht die erste Methode zur Trennung von
AS (Emil Fischer)
Bildung zyklischer Dipeptide
Freie AS-Ester neigen zur Bildung von zyklischen
Dipeptiden bzw. offenkettigen Polypeptide
Reaktionen der Aminogruppe
-AcylierungAls Acylierungsmittel kommen aktivierte
Säurederivate in Frage, z.B. Säurehalogenide oder
Säureanhydride.
N-Acetylaminosäuren
 als Bestandteile chemisch definierter Diäten
 zur Supplementierung von pflanzlichen Proteinen zur
Erhöhung der biologischen Wertigkeit
 Zusatz freier AS zu LM die erhitzt werden nicht
unproblematisch
 Methionin + reduzierende Zucker über Streckerreaktion
Methional (Fehlaroma)
 Lysin und Threonin Verlust biologischer Wertigkeit
 Asparagin : Precursor für Acrylamidbildung
Reaktionen der Aminogruppe
-Acylierung Analytisch von großer Bedeutung ist die Acylierung (Dansylierung) mit
5-Dimethylamino-naphthalensulfonsäurechlorid (Dansylchlorid)
 Stabil gegen Säurehydrolyse
 Ermittlung von N-terminalen AS und von freien ε-Aminogruppen in Peptiden und
Proteine
 Auch Dimethylaminoazobenzsulfonchlorid (DABS-Cl) und 9Fluorenmethylchlorformiat (FMOC) führen zu empfindlich nachweisbaren ASDerivaten, die für säulenchromatographische Trennung und Bestimmung
geeignet sind
Vorkommen von Trimethylaminosäuren (Betaine)
(CH3)3N+-CHR-COO−
β-Alanin
γ-Amino-buttersäure
Glycin
Histidin
β-Hydroxy- γ-aminobuttersäure
4-Hydroxyprolin
Prolin
Homobetain
Actinin
Betain
Herzynin
Fleischextrakt
Muscheln
Zuckerrübe
Champignons
Carnitin
Muskelfleisch,
Hefe, Weizenkeime,
Fisch, Leber, Molke,
Muscheln
Jackbohne
Orangenblätter,
Alfalfa, Luzerne
Betonicin
Stachydrin
Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & Arylierung2,4-Dinitrophenylderivate (DNP-AS) werden durch
Arylierung der Aminofunktion mit
1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB) erzeugt
(Sanger-Reagenz)
 DNP-AS sind gelbe, gut kristallisierbare säurestabile Verbindungen
 Die Reaktion ist wichtig für die Markierung von N-terminalen ASResten und freien -AS-Seitenketten in Peptiden und Proteinen
NO2
O2N
F
+
OH
H2N R
NO2
O2N
N R
H
+
F
+
H2 O
Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & ArylierungEbenfalls analytisch von Bedeutung ist die Reaktion
mit Trinitrobenzolsulfonsäure, die zu gelben
Derivaten führt
photometrische Bestimmung von AS und Proteinen
NO2
O2 N
SO3
NO2
+
H2N R
pH 9.5
O2 N
25°C
NO2
N R
H
NO2
Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & Arylierung-
 Der Meisenheimer Komplex ist ein
Additionsprodukt
 Zwischenprodukt bei nucleophilen
aromatischen Substitutionen unter
milden Bedingungen:
am Benzolring auftretende negative
Ladung wird durch
elektronenanziehende Substituenten
stabilisiert
Nachweis des Komplexes
 Isolierung des
Additionsproduktes bei
der Reaktion von
2,4,6-Trinitroanisol mit
Kaliumethylat
Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & ArylierungAnalog verläuft die Reaktion mit 1,2-Naphtochinon-4sulfonsäure (Folin-Reagenz), bei der ein roter Farbstoff
entsteht
 Es handelt sich um eine
nukleophile aromatische
Substitution, die über ein
Additionsprodukt
(MeisenheimerKomplex) verläuft
Reaktionen der Aminogruppe
-Thiocarbamoylierung AS reagieren mit Isocyanaten zu Carbamoylderivaten
 diese zyklisieren beim Erhitzen im Sauren zu 2,4-Dioxoimidazolidinen
(Hydantoinen)
 Durch Reaktion von Aminogruppen mit Phenylisothiocyanat ist ein
stufenweiser Abbau von Peptiden (Edman-Abbau) möglich
 für Sequenzanalyse von großer Bedeutung
Reaktion mit Phenylisothiocyanat
(Edmanabbau)
Anilinothiazolinon
Phenylthiocarbamoylaminosäure
Reaktionen der Aminogruppe
-Edman-AbbauBeim Edman-Abbau addiert sich die endständige Aminogruppe an das
Reagenz, wobei ein Thioharnstoffderivat entsteht.
Beim Behandeln mit einer schwachen Säure unter Bedingungen, unter denen
die Peptidbindungen nicht hydrolysiert werden, spaltet das Molekül die markierte
Aminosäure als Phenylthiohydantoin ab, der Rest des Polypeptids bleibt
unverändert :
Automatisierter Edmanabbau
meist automatisiert an Proteinen oder Peptiden
vollzogen, die über die C-terminale Carboxylgruppe
an einen Aminogruppen-haltigen Träger gebunden
N-Terminus
C-Terminus
sind
PITC
H2N-a1-a2-a3- - -an-COOH
Polypeptid
Kupplung
Identifizierung
durch HPLC
oder TLC
PITC -HN-a1-a2-a3-
- -an-COOH
PTC-Peptid
Spaltung
Umwandlung
PHT-AS
H
PITC
a1
Thiazolinon
H2N-a2-a3- - -an-COOH
Wdh.
Reaktionen mit Carbonylverbindungen
Strecker-Abbau
Reaktion
mit Dicarbonyl-Verbindungen
aus Maillard-Reaktion (siehe
Kohlenhydrate)
 Aus Dicarbonyl-Verbindungen
entstehen zahlreiche
Folgeprodukte, z.B. Alkyl- u.
Methoxypyrazine als
Aromastoffe und braune
Melanoidine
Reaktionen mit Carbonylverbindungen
-Ninhydrinreaktion-
Ein Spezialfall des Strecker-Abbaus ist die Ninhydrinreaktion, die für
quantitative photometrische Bestimmung (Ruhmanns Violett) von AS von
großer Bedeutung ist.
Die Nachweisgrenze liegt bei ~ 500 pmol.
Formolzahl nach Sörensen
 Bestimmung freier AS durch Titration mit 0,1 N NaOH bei pH
8,1, wobei die Basizität der Aminogruppe durch Formaldehyd
zurückgedrängt wird
 Erfasst werden:

Aminogruppen, NH3, prim. Amine (vollständig), sek. Aminogruppen
und phenolische Hydroxygruppen (teilweise).
 Nicht erfasst werden:
 tert. Amine, Thiol-Gruppen und aliphatische Hydroxygruppen.
 Kennzahl zur Charakterisierung mancher Fruchtsäfte
Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd
(OPA)
 HPLC-Trennung der Isoindolderivate und Fluoreszenzdetektion:
ex= 330 nm; em= 455 nm
 Nachweisgrenze: 1 pmol
Aminosäure-Analytik
 Klassisch werden AS mittels Ionenaustauschchromatographie getrennt
und durch Farbreaktion (Ninhydrin oder Phthalaldehyd) nachgewiesen.
Zunehmend findet heute die HPLC Anwendung, wobei die AS zuvor mit
OPA in Gegenwart einer Thiolverbindung zu fluoreszieren den
Derivaten umgesetzt werden. Beide Methoden erlauben keine
Differenzierung zwischen D- und L-AS, die jedoch nach geeigneter
Derivatisierung mit GC oder HPLC möglich ist









Ninhydrin-Reaktion
Formolzahl nach Sörensen
Gasvolumetrisch nach Sylke
Umsetzung mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol zu N-2,4-Dinitrophenyl-AS
Derivatisierung mit O-Phthalaldehyd
Entstehung von Hydrazinen beim Abbau von Proteinen nach Akabori
Bildung von Dansylderivaten
Reaktion mit Folin-Reagenz
Reaktion mit Trinitrobenzosulfonsäure
Peptid/Protein-Analytik
Hydrolyse (0,1n – 1n HCl)
Enzymatische Hydrolyse
Edman-Abbau
Arylierung mit Sanger-Reagenz
Western-Blot
Biologische Wertigkeit
 Biologische Wertigkeit limitiert durch:




Lysin: Defizit in Getreide- und anderen Pflanzenproteine
Methionin: Defizit in Kuhmilch- und Fleischproteine
Threonin: Defizit bei Weizen und Roggen
Tryptophan: Defizit bei Casein, Mais und Roggen
 Beispiele
 Rice-Fortification (Japan, Thailand und Tunesien)
Zusatz von LLysin und L-Threonin
 Supplementierung von Soja und Erdnuß mit Methionin in Japan
 Bestandteile chemisch definierter Diäten (CDD) z.B. bei
Astronautenkost + Therapie von Maldigestions- und
Malabsorptionssyndromen.
Synthese von Aminosäuren
Chemisch synthetisierte AS und Derivate werden
eingesetzt:
 Futtermittelindustrie (Zusatz zwischen 0,05 und 0,2%)
 Nahrungsmittelindustrie (L-Glutaminsäure als
Geschmacksverstärker aber auch Methionin und Lysin)
 Therapeutika im pharmazeutischen Bereich
 Chemischen Industrie (Tenside, Polymere)
Die Produktion von AS lässt sich in 4 Bereiche einteilen
 Chemische Synthese Problem: Enantiomerenbildung
 Extraktion nat. AS aus Proteinhydrolysaten
Problem: zahlreiche
NP durch Säure und Alkalibehandlung z.B. Bildung von
Dihydroalanin oder Enantiomeren
 AS-Produktion durch Fermentation (mikrobiologisch
Mononatrium-L-glutamat)
 Biotechnologie
Glutamat
Einsatz als „Geschmacksverstärker“
Im Zusammenhang mit Glutamat beschrieben werden:
 MSG (Mono Sodium Glutamate)-Symptomkomplex besser bekannt
als „Chinarestaurant-Syndrom“
 Übergewicht
 Neurodegenerative Erkrankungen (Morbus Alzheimer; Morbus
Parkinson)
Toxikologische Bewertung von Glutamat als Zusatzstoff
John Olney (1960)
 Studien zur möglichen Schädigung des Gehirns durch Glutamat
 Subcutane Injektion (neugeborene Mäuse) Glutamatdosen von 0,5
g/kg bis 4 g/kg Körpergewicht
Schädigungen des Gehirns der
Nagetiere
 Durch die orale Gabe ähnlich hoher Glutamatdosen mit der Nahrung
wurde jedoch keine Schädigung des Gehirns der Mäuse erreicht
Sicherheitsbewertung von Glutamat
 JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) (1987)
 LD50 (Maus, Ratte) = 15 -18 g/kg KG
 Nicht teratogen oder reproduktionstoxisch
 aus technologisch und geschmacklich eingesetzten Mengen an
Glutamat im Lebensmittel resultiert keine Gefährdung für die Gesundheit
 Kein ADI festgelegt
 SCF (1991)
 Kein ADI festgelegt
 FASEB (Federation of American Societies for Experimental Biology) im
Auftrag von FDA (1995)
 Studien zum MSG-Symptomkomplex
keinen wissenschaftlichen
Beweis für nachteilige Effekte auf die meisten Menschen, die hohen
MNG ausgesetzt wurden
 Aufnahme von Glutamat aus Lebensmitteln führt nicht zu
neurodegenerativen Erkrankungen
Biotechnologische Synthese von Aminosäuren
-EMS-Syndrom-
 Tryptophan – Anwendung als Schlafmittel
 Rolle in der Regulation des Wach-Schlaf-Rhythmus
 in USA ohne Rezept als Nahrungsergänzungsmittel und Sportlernahrung
 1989 in der USA mehreren hundert Menschen nach Einnahme eines
Tryptophan- Präparates an EMS (Eosinophilie-Myalgie-Syndrom)
erkrankt
 Eosinophilie, Sklerodermie, schwere Muskelschmerzen
 weltweit über 1500 Fälle, 38 Todesfälle
 Im Dezember 1988 führte Showa Denko einen neuen Stamm von B.
amyloliquefaciens (Stamm V) in den Produktionsprozess ein.
Gleichzeitig vereinfachte das Unternehmen das Reinigungsverfahren
zur Gewinnung von L-Tryptophan (Vorstufe Serotonin) aus den
Fermentationslösungen
Synthese von Aminosäuren
-EMS-Syndrom-
 Ein Filtrationsschritt wurde zeitweise umgangen.
 Die Menge eingesetzter Aktivkohle, die zur Entfernung
unerwünschter Nebenprodukte diente, wurde auf weniger als die
Hälfte der zuvor verwendeten Menge reduziert
 Ein Stoff, der in Verdacht steht, EMS auszulösen, ist das so
genannte EBT (Ethylenbistryptophan), ein Reaktionsprodukt aus
Tryptophan und Acetaldehyd, einem Nebenprodukt der
Fermentation.
 Für die Reaktion sind tiefe Temperaturen
erforderlich. Die verkürzte Tryptophanaufreinigung wurde mittels Kationenaustauscher, welche im Freien standen
(Winter) durchgeführt
EBT
Bucherer-Methode (Methionin)
+
+
-Methylthioethylhydantoin
Aldehyde lassen sich mit Blausäure und
Ammoniumcarbonat in stabile kristallisierbare
Hydantoin-Derivate überführen
mit Alkali unter Druck und höherer Temperatur zu αAminosäuren hydrolysierbar
Industriell modifizierte Strecker-Methode
Herstellung von Methionin aus Acrolein.
Peptide
-Allgemeines & Nomenklatur Peptide entstehen durch Verknüpfung von AS über Säureamidbindungen. Hydrolyse von Peptiden führt zurück zu den AS.
 Je nach Anzahl der AS-Reste unterscheidet man Di-, Tri-, und
Tetrapeptide und fasst diese bis ca. 10 Resten als Oligopeptide
zusammen
 Höhere Peptide werden als Polypeptide bezeichnet, wobei der
Übergang zu den Proteinen fließend ist (Grenze MG = 10.000 Da, ca.
100 AS).
 Peptide werden als acylierte AS aufgefasst (Alanyl-seryl-glycin = AlaSer-Gly oder ASG). D-AS werden durch vorgesetztes D gekennzeichnet
 Bindungen an denen funktionelle Gruppen der Seitenketten beteiligt
sind, werden durch senkrechte Bindestriche wiedergegeben
Glu
Cys
Gly
 Beispiel Tripeptid: Glutathion (γ-Glutamyl-cysteinyl-glycin)
Peptide
-physikalische & sensorische Eigenschaften Gegenüber den entsprechenden AS ist die Acidität der freien
Carboxylgruppe und die Basizität der freien Aminogruppe bei den
Peptiden geringer. Die Sequenz hat darauf Einfluss.
 Während bei den AS eine Abhängigkeit der Geschmacksqualität von
der Konfiguration vorhanden ist Peptiden unabhängig
 Die Intensität des Geschmacks hängt wie von der Hydrophobizität der
Seitenketten ab.
 Bittergeschmack bei Käse als Folge von Fehlreifung.
 Deswegen auch kein Einsatz proteolytischer Enzyme zur Modifizierung von
Nahrungsproteinen.
 L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (Aspartam) ist süß, wie einige
andere Dipeptidester der L-Aminomalonsäure. Bei ihnen haben die
Carboxylgruppe, Aminogruppe und die Seitenkette R die Anordnung für
den süßen Geschmack.
Einzelne Peptide
-GlutathionEs ist in tierischen Organismen, in Pflanzen und
Mikroorganismen weit verbreitet
Bindung der Glutaminsäure über die γ-Carboxylgruppe
Einzelne Peptide
-Glutathion & LebensmitteltechnologieBedeutende Getreideenzyme: Peroxidasen, Katalasen &
Glutathion-Dehydrogenasen
Durch Glutathion-Dehydrogenase wird die Oxidation von
Glutathion (mit Dehydroascorbinsäure als H-Akzeptor)
katalysiert
In Verbindung mit Ascorbinsäure Verbesserung
rheologischer Eigenschaften von Weizenteig:
 Abbau von Disulfidbrücken, der zu Depolymerisation von
Kleberproteinen führt, wird gebremst
2 GSH
Dehydroascorbinsäure
H2O
GlutathionDehydrogenase
GSSG
Ascorbinsäure
½ O2
Einzelne Peptide
-Glutathion & biolog. Eigenschaften Glutathion spielt eine Schlüsselrolle bei der Entgiftung (Phase II
Reaktion)
 Abfangen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)
 Glutathiongehalt von Säugerzellen ~ 5 mM
 Schützt die Zellen vor oxidativer Schädigung
Sulfhydryl Puffer
Wirkung
 Zyklus zwischen reduzierter Thiolform (GSH) und oxidierter Form
(GSSG)
 GSSG wird reduziert durch Glutathion Reduktase:
 Flavoprotein, welchem NADPH als Elektronenquelle dient
 Die Umsetzung von GSH
GSSG ist um ein 500 faches größer
2 GSH + RO-OH
GSSG + H2O + ROH
Einzelne Peptide
-Glutathion-Peroxidase Glutathion-Peroxidase katalysiert folgende Reaktion
2 GSH + RO-OH
GSSG + H2O + ROH
 Enzym besitzt ein Selenocystein-Rest im
aktiven Zentrum
 Die Selenolat-Form (E-Se-) reduziert das
Peroxid zum Alkohol und geht dabei selbst in
die selenische Säure über (E-SeOH)
 Unter Oxidation eines Glutathion entsteht ein
Selenosulfid Addukt (E-Se-S-G)
 Ein weiteres Molekül Glutathion regeneriert
dann die aktive Form des Enzyms, unter
Bildung von GSSG
ROOH
+ H+
E-SeSelenolat
GSSG
+ H+
GSH
ROH
E-SeOH
Selenische Säure
GSH
E-Se-S-G
Selensulfid
H2O
Einzelne Peptide
-Carnosin, Anserin, Balenin Dipeptide der β-Alanins mit L-Histidin (Carnosin) bzw. 1-Methyl-L-Histidin (Anserin)
oder 3-Methyl-L-Histidin (Balenin)
Carnosin
Anserin
 Vorkommen: Muskeln von Wirbeltieren
 Charakterisierung der Herkunft von Fleischextrakten:
 Carnosin
Rindermuskel
 Anserin Hühnerfleisch
 Balenin
Walfleisch
 Physiologische Rolle noch nicht völlig klar, Bedeutung haben:
 Pufferung im pH-Bereich 6-8
 Beteiligung an Wiederherstellung der Erregbarkeit und Kontraktionsfähigkeit
des ermüdeten Skelettmuskels
 für Carnosin: Wirkung als Neurotransmitter des Geruchsnervs
Einzelne Peptide
-Nisin-
Wird von einigen Stämmen des Lactobacillus lactis gebildet
Enthält Dehydroalanin, Dehydro-β-methylalanin, Lanthionin
und β-Methyllanthionin über 5 Thioetherbrücken
In einigen Ländern als Zusatzstoff zugelassen:
E-Nummer: 234
Klasse: Konservierungsmittel
Verwendung zur Konservierung von:
 Grieß- und Tapiokapudding und ähnlichen Erzeugnissen (max. 3
mg/kg)
 Gereiftem Käse, Schmelzkäse (max. 12,5 mg/kg)
 Clotted cream (max. 10 mg/kg)
Infolge der EU-Harmonisierung gehört Nisin zu den
zugelassenen Konservierungsstoffen
Einzelne Peptide
-Nisin-
Wirkung:
 Tötet gram-positive Bakterien (Bacillus, Clostridium, Listeria): Der
Angriff erfolgt durch Porenbildung in der Cytoplasmamembran
unmittelbar nach dem Auskeimen der Sporen
 Gram-negative Bakterien (Escherichia coli, Salmonella,
Campylobacter, Yersinia) werden nicht abgetötet.
Sicherheit:
 keine schädlichen Wirkungen für Menschen bekannt
 wird im menschlichen Verdauungstrakt schnell abgebaut
 Kommt natürlicherweise in Milch und Käse vor, auch in der
humanen Darmflora kann Nisin durch Streptokokken gebildet
werden
 ADI-Wert: 0-13 mg/kg
Einzelne Peptide
-Aspartam-
 Aspartam (Dipeptid,Süßstoff)
 relative Süßkraft 100-200
 durch Kochen, lange Lagerung und Metabolisierung wird Phenylalanin
freigesetzt
bedenklich für Phenylketonuriekranke
verliert an Süßkraft durch
hydrolytische Spaltung
zum Kochen ungeeignet
O
O
O
H
C C
H2
+
NH3
O
OMe
N CH
H
CH2
Aspartam
(L-Aspartylphenylalaninmethylester)
Abbauweg für Phenylalanin
Tetrahydrobiopterin
O2
Dihydrobiopterin
H2O
alpha-Ketoglutarat
COO -
+ NH3
Glutamat
COO Phenylalanin-Hydroxylase
+ NH3
HO
Phenylalanin
COO Aminotransferase
Tyrosin
O
HO
p-Hydroxyphenylpyruvat
Ascorbat + O 2
p-HydroxyphenylpyruvatDioxygenase
Dihydroascorbat +
H2O + CO 2
-OOC
H
H
H2O
Fumarylacetoacetase
H
+
H
COO -
Fumarat
H3C
COO -
H
MaleylacetoacetatO
O
Isomerase
4 - Fumarylacetoacetat
- OOC
OH
COO -
COO -
H
O2
COO -
COO -
O
Acetoacetat
O
O
Homogentisat-Dioxygenase
4 - Maleylacetoacetat
OH
Homogentisat
Phenylketonurie
 angeborene Intoleranzreaktion durch Defizit an
Phenylalaninhydroxylase
Tyrosin ↓
Phenylalanin im Blut ↑
Brenztraubensäure im Harn ↑
schwere geistige Schäden
Opioide Peptide
 körpereigene psychoaktive
Peptide (Endorphine,
Enkephaline, Dynorphine)
 In Gluten und Casein (Weizenund Milchprodukte)
 Abbauprodukte bei Käsereifung
 Rufen Effekte hervor, die denen
des Morphins ähneln und durch
bekannte Morphin-Antagonisten
reversibel sind
 Beeinflussen über spezifische
Rezeptoren (Opioidrezeptoren)
die Schmerzleitung und verarbeitung
 Lange Eliminationszeiten,
physische Abhängigkeit
Opioide Proteine
- -Casomorphinekurzkettige Peptide aus β-Casein der Kuhmilch
zeigen opiatartige Wirkung
 wirken bei Kleinkindern reduzierend auf die
Darmbewegung
β-Casomorphine-7
 Heptapeptide
 alternierende Prolinreste in der Sequenz bedingen hohe Resistenz
gegenüber Proteasen (im Gegensatz zu eigenen Endorphinen)
 entstehen im Gastrointestinaltrakt beim Abbau des Caseins und
werden dort vom Enzymsystem kaum angegriffen
Modifizierung von Casomorphinen
 Einbau von D- statt L-AS kann zum Aktivitätsanstieg führen
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