Proliferationsaktivität, p53-Expression und Angiogenese bei
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Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Philippou Dienstort: Pathologisches Institut an der Augusta-Krankenanstalt Bochum Proliferationsaktivität, p53-Expression und Angiogenese bei pulmonalen Karzinosarkomen und Pulmoblastomen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Matthias Zorn aus Gummersbach 2002 Seite 1 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. Philippou Korreferent: Prof. Dr. med. Müller Tag der mündlichen Prüfung: 20. Januar 2004 Seite 2 Inhaltsverzeichnis Titelblatt................................................................................................ 1 Inhaltsverzeichnis.................................................................................. 3 Einleitung.............................................................................................. 4 Material und Methodik..........................................................................9 Karzinosarkome...................................................................................17 Pulmoblastome.................................................................................... 25 Allgemeine Onkogenese......................................................................30 Spezielle Onkogenese beim Bronchialkarzinom.................................31 Molekular-Pathologie beim Bronchialkarzinom................................. 32 Tumorsuppressorgen (p53)..................................................................34 Proliferation (Mib-1 und PCNA)........................................................ 37 Angiogenese (CD-31)..........................................................................39 Ergebnisse........................................................................................... 42 Diskussion........................................................................................... 54 Literaturnachweis................................................................................ 65 Danksagung......................................................................................... 70 Lebenslauf........................................................................................... 71 Seite 3 Einleitung Karzinosarkome und Pulmoblastome sind selten vorkommende maligne Tumore innnerhalb der Lunge. Da sie jeweils durch ein biphasisches Wachstum charakterisiert sind, werden sie in dieser Arbeit zusammen untersucht. Die Darstellung und Auswertung erfolgt für jede Entität getrennt. Die Untersuchung erfolgt mittels immunhistochemischer Technik in Bezug auf Wachstumsverhalten und Aggressivitätspotential. Außerdem führten wir Untersuchungsergebnisse die zu den Korrelation der TNM-Stadien immunhistochemischen sowie den klinischen Überlebensparametern der jeweiligen Patienten durch. Karzinosarkome sind maligne Tumore, die in nahezu jedem menschlichen Körperorgan auftreten können. Sie sind insgesamt sehr selten. In der Lunge liegt ihre Inzidenz bei 0,1 bis 0,3 % aller hier auftretenden malignen Tumore. Meistens sind männliche Personen betroffen (Verhältnis der Betroffenen: 5 – 9 männliche zu 1 weiblichen). Die Karzinosarkome treten vornehmlich in den Lungenoberlappen auf. Als Varianten gibt es den zentralen und den peripheren Wachstumstyp. Der zentrale Typ liegt zentral in der Lunge, wächst meist endobronchial und nur wenige Milli- bis Zentimeter in das um den Stiel liegende Parenchym hinein. Der periphere Wachstumtyp entsteht in der Peripherie der Lungen und wächst vornehmlich innerhalb des Lungenparenchyms. Insgesamt metastasiert er früher, wächst aggressiver und hat somit eine schlechtere Prognose als der zentrale Typ. Da er zumeist erst spät klinisch auffällig wird, erfolgt seine Diagnosestellung auch zu einem späteren Zeitpunkt als die des zentralen Typs. Karzinosarkome besitzen sowohl einen epithelialen als auch einen mesenchymalen Anteil. Der karzinomatöse Bereich enthält als histologische Form zum Beispiel malignes plattenepitheliales (mit oder ohne Verhornung), adenomatöses oder undifferentiertes Gewebe. Der sarkomatöse Anteil kann malignes Knorpel-, Knochen-, Skelettmuskel- oder undifferenziertes Gewebe sowie eine Mischform daraus enthalten. Die häufigste Kombination besteht aus einem malignen Plattenepithel- und einem spindel-zelligen sarkomatösen Anteil. Die Differenzierungsgrade der einzelnen histologischen Anteile können innerhalb eines Tumors stark variieren. Seite 4 Die Histogenese dieser Tumorart ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Die schlüssigste Theorie besagt, daß der sarkomatöse Anteil aus einer Metaplasie des karzinomatösen Anteils entstehe. Die Metastasierung von pulmonalen Karzinosarkomen entspricht denen anderen maligner Lungentumoren. Am häufigsten werden Leber, Lungen, Nebennieren, Niere, Gehirn, Haut und Knochen befallen. Eine Metastasierung per continuitatem kann in die Pleura, die Rippen und das Medastinum erfolgen und wird am häufigsten durch den peripheren Wachstumstyp verursacht. Als Metastasen werden sowohl isolierte Anteile der karzinomatösen oder sarkomatösen Komponente als auch eine Kombination aus beiden Komponenten gefunden. Pulmoblastome sind hochmaligne Lungentumore, die eine embryonale adenoidtubuläre epitheliale und eine sarkomatöse Stromakomponente enthalten. Es können auch Subformen mit ausschließlich epithelialer oder ausschließlich mesenchymaler Komponente auftreten. Sowohl der biphasische als auch der rein epitheliale Typ finden sich in der Regel bei Erwachsenen, der rein mesenchymale Typ mit über 90 % bei Kindern unter zehn Lebensjahren. Eine mögliche Subklassifizierung der Pulmoblastome unter den Überbegriff der Karzinosarkome wird in der Literatur diskutiert. Pulmoblastome werden in 0,25 % bis 0,5 % aller malignen Lungentumoren diagnostiziert. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Betroffenen beträgt etwa drei zu eins. Der sarkomatöse Anteil ähnelt mikroskopisch dem glykogenreichen tubulären oder embryogenen Bindegewebe, welches in fetalem Lungengewebe in der zehnten bis sechszehnten Woche der Schwangerschaft gefunden wird (pseudoglanduläres Stadium der Lungenentwicklung). Der karzinomatöse Anteil kann als Knorpel-, Knochen- oder Muskulaturgewebe in jeweils unterschiedlichen Reifungsstadien auftreten. Im Gegensatz zum Karzinosarkom, das lediglich aus ausgereiften Zellformen besteht, enthält die sarkomatöse Komponente des Pulmoblastoms mesenchymales Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstufen. Meistens tritt diese Tumorentität in der Peripherie der Lunge auf und verursacht somit nur unspezifische klinische Beschwerden. Die Diagnosestellung ist deshalb Seite 5 erschwert. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit sind diese beiden Tumorentitäten in Bezug auf die Merkmale der Proliferationsaktivität, der Akkumulation von Tumorsuppresorgenen sowie der Fähigkeit zur Neoangiogenese untersucht worden. Sowohl pulmonale Karzinosarkome als auch Pulmoblastome gehören formal in die Gruppe der Non-small-cellular-lung-carcinoma. Innerhalb dieser Gruppe stellt die Proliferationsaktivität der Tumorzellen einen prognostischen Faktor für das Überleben der Patienten dar. Die Proliferationsaktivität kann immunhistochemisch durch monoklonale Antikörper gegen Proliferationsmarker (in unserem Fall PCNAund Mib-1-(Ki-67-)Antigen) bestimmt werden. Proliferationsmarker sind in ihrer Funktion eng mit der Proliferation verknüpft, so daß sie bei jeder Art von Wachstum exprimiert werden. Mittels der ihnen entgegengerichteten Antikörper lassen sich proliferierende Zellen in der G1-, S-, G2- und M-Phase darstellen. Sie können somit als Maß für die Wachstums- und Proliferationsgeschwindigkeit der untersuchten Tumore herangezogen werden. Sie korrelieren sehr gut mit dem Tumorgrading und der Anzahl der Mitosen. Der PCNA-Antikörper ist gegen ein Hilfsprotein der DNA-Polymerase delta und der Mib-1-Antikörper gegen das 1002 Basenpaare lange c-DNA-Fragment des Ki-67Antigens gerichtet. Das Hilfsprotein der DNA-Polymerase delta ist im Kern der Zelle vorhanden. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Initiation der Zellproliferation und dient als Hilfsprotein bei der DNA-Reparatur. Es wird bei einer Vielzahl von malignen Tumoren ohne Mutationen synthetisiert, kann somit mittels Antikörper detektiert werden und eignet sich folglich sehr gut für die Darstellung der Zellproliferation. Das Ki-67-Antigen ist ein Nicht-Histon-Protein und befindet sich hauptsächlich in der Peripherie der Nukleolen. Es besitzt eine regulatorische Funktion bei der Zellproliferation. Ki-67 ist in allen proliferierenden Zellen unabhängig ihrer embryonalen Herkunft vorhanden. Eine Anfärbung mittels Mib-1-Antikörper ist somit ebenfalls zuverlässig gegeben. Seite 6 Das Tumorsuppressorgen p53 spielt eine entscheidende Rolle in der Regulation des Zellzyklus. Es stellt das Expressionsprodukt des Genabschnitts TP53 dar und ist das in menschlichen Geschwülsten am häufigsten mutierte Gen. Seine Quartärstruktur ist durch ein Tetramer oder Oligomer definiert. Selbst wenn nur ein Allel innerhalb einer Zelle mutiert ist, kommt somit statistisch gesehen innerhalb einer solchen Mehrmolekülstruktur jeweils mindestens ein mutiertes p53-Molekül vor. Es kann seine „normale“ Funktion damit nicht mehr wahrnehmen. Als Tumorsuppressorgen hat p53 die Aufgabe, den Zell-Zyklus zu überwachen. Gegebenenfalls hält es diesen an, um Reparaturen innerhalb der DNA zu ermöglichen. Das wird notwendig, wenn Mutationen in bestimmten Genabschnitten aufgetreten sind. Da der Zellzyklus erst nach einer erfolgreichen Reparatur fortgesetzt wird, wird die Vererbung von DNA-Schäden verhindert beziehungsweise auf ein Minimum reduziert. Insgesamt wird eine unkontrollierte Proliferation und eine mitotische Teilung von entarteten Zellen durch p53 verhindert. In dieser Arbeit untersuchen wir die Akkumulation von p53 in den verschiedenen Tumoren. Bis heute sind mehrere p53-Epitope identifiziert worden. Zur Detektion erhöhter p53-Akkumulation steht für jedes identifizierte Epitop ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung. Wir benutzen Antikörper gegen die Epitope Pab 1801 = Ab-2 und DO-1 = Ab-6 für unsere Untersuchungen. Generell kann in Lungenkarzinomen und –sarkomen eine erhöhte Akkumulation von p53 in unterschiedlicher Ausprägung nachgewiesen werden. In biphasischen Tumoren ist das Vorkommen Tumorkomponenten von p53 innerhalb von erhöhtem der Interesse, beiden da dieses unterschiedlichen in Bezug zur Tumorprogression und zum Auftreten von Metastasen gesetzt werden kann. Ein weiterer unabhängiger prognostischer Faktor bei malignen Lungentumoren stellt die Fähigkeit zur Neoangiogenese dar. Ohne diese Fähigkeit wäre ein Tumorwachstum über einen wenige Millimeter umfassenden Bereich hinaus nicht möglich, da eine Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff nicht gegeben wäre. Die Tumorzellen würden somit absterben beziehungsweise könnten nicht proliferieren. Desweiteren synthetisieren Endothelzellen parakrin wirkende Wachstumsfaktoren, die zum schnelleren Tumorwachstum beitragen. Die Neoangiogenesefähigkeit kann über die Anzahl der vorhandenen Mikrogefäße Seite 7 innerhalb eines Tumors ermittelt werden. Zum Nachweis von Mikrogefäßen benutzen wir einen Antikörper gegen CD31-Antigen. Dieser färbt Endothelzellen mit höherer Spezifität als ein anti-Faktor VIII-Antikörper an. Es soll der Bezug zwischen der relativen Quantität der Tumorgefäße innerhalb der verschiedenen Tumoranteile einerseits und der Überlebensprognose des Patienten andererseits dargestellt werden. Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen werden in Korrelation zu TNMStadium, Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten und angewandter Therapie gesetzt, um die Verbindung zur klinischen Anwendung herzustellen. Darüberhinaus werden die Besonderheiten, die das pulmonale Karzinosarkom beziehungsweise das Pulmoblastom im Gegensatz zu den übrigen Tumoren innerhalb der Gruppe der Non-small-cellular-lung-carcinoma auszeichnet, dargestellt. Seite 8 Material und Methodik Untersucht wurden zehn Karzinosarkome und drei Pulmoblastome der Lunge. Die untersuchten und bearbeiteten Präparate stammen aus dem Einsendegut der Abteilung für Allgemeine und spezielle Pathologie der Ruhr-Universität Bochum (Leiter Prof. Dr. med. Morgenroth) aus den Jahren 1987 bis 1995. Die Präparate sind formalinfixiert und in Paraffin eingebettet. Zur Vermeidung des Abschwimmens der Schnitte von den Objektträgern wurden beschichtete Objektträger (Super-FrostPlus der Firma Menzel) benutzt. Zur Trocknung wurden die Präparate in einem Brutschrank mit 37 °C über Nacht aufbewahrt. Vor der Anfärbung mit dem jeweiligen Antikörper wurden die Schnitte entparaffiniert und durch eine absteigende Alkoholkonzentrationsreihe bis zu Aqua dest. hydratisiert. Die Marker gegen Mib-1 und CD31 wurden von der Firma Dianova, die gegen p53 (Pab 1801 = Ab-2 und DO-1 = Ab-6) und PCNA (proliferating cell nuclear antigen; Ab-1) von der Firma Oncogene Science bezogen. Alle Primär-Antikörper waren monoklonale Maus-Antikörper. Zur Verdünnung des jeweiligen Primärantikörpers auf die gewünschte Konzentration wurde „Antibody Diluent“ der Firma Dako verwendet. Hierin waren nicht näher bezeichnete Substanzen zur Verminderung ungewollter Hintergrundaktivität sowie ein Tris-HCl-Puffer mit Proteinen und 0,015 M NaN3 enthalten. Zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurden die Schnitte in einem Waschpuffer (bei uns PBS-Puffer = Phosphate Buffered Saline der Firma Sigma) gespült und so von Lösungsresten der vorhergehenden Arbeitsschritte gesäubert. Der PBS-Puffer enhält 120 mmol/l Natriumchlorid, 2,7 mmol/l Kaliumchlorid und 10 mmol/l Phosphat-Puffer. Der pH ist auf 7,4 bei 25 °C eingestellt. Nach Entparaffinierung und Hydratisierung der Gewebeschnitte durch eine absteigende Alkoholreihe bis zu Aqua dest. verminderten wir die ungewollte Hintergrundaktivität durch zwanzigminütige Inkubation in dreiprozentigem H2O2. Danach folgte die erstmalige Spülung mittels PBS-Puffer. Seite 9 Es folgte eine Vorbehandlung der Gewebeschnitte zur Freilegung der Antigene entsprechend des aufzubringenden Primärantikörpers. Bei dem Antikörper gegen CD31 war eine Vorandauung mit Pronase-Lösung (0,05 %) notwendig. Eine Vorbehandlung über 15 Minuten mit 100°C heißem Zitronensäurepuffer (10 mM, pH = 6,0) war bei den Antikörpern gegen Mib-1 und p53 (Pab 1801 = Ab-2 und DO-1 = Ab-6) notwendig. Die Herstellung dieses Zitronensäurepuffers erfolgte durch Mischung von zwei Stammlösungen. Es wurden 9 ml einer 0,1 M Zitronensäure- und 41 ml einer 0,1 M Natriumzitratlösung mit 450 ml Aqua dest. zu insgesamt 500 ml Puffer zusammengebracht. Die Zitronensäurelösung enthielt 21,01 g C6H8O7 x H20 in 1000 ml Aqua dest. und wurde von der Firma Merck bezogen. Die Lösung mit Natriumzitrat bezogen wir ebenfalls von der Firma Merck und sie enthielt 29,41 g C6H5O7Na3 x 2H20 in 1000 ml Aqua dest. Nach Abschluß der Vorbehandlung erfolgte die Inkubation mittels Normalserum (Teil des LAB-SA System - Histostain Bulk Kits der Firma Zymed, siehe unten) zur weiteren Verminderung der unspezifischen Hintergrundaktivität durch Absättigung unerwünschter Antigene. Nach erneuter Reinigung der Gewebeschnitte mittels PBS-Puffer wurden diese mit der LAB-Methode (= labelled avidin-biotin technique) der Firma Zymed (LAB-SA System - Histostain Bulk Kits) immunhistochemisch angefärbt. Die zur Markierung verwendeten Antikörper wurden nach entsprechender Verdünnung (Mib-1: 1:20; p53 (Ab-2): 1:20; p53 (Ab-6): 1:100; CD31: 1:20; PCNA: 1:10) auf die Gewebeproben aufgebracht und führten ein einstündige Inkubation durch. Bei der von uns verwendeten sogenannten „markierten Avidin-Biotin-Technik“ (labelled avidin-biotin technique (LAB)) wird nach der Reinigung der Gewebeproben in PBS-Puffer der biotinylierte Zweitantikörper zur zehnminütigen Inkubation hinzugegeben. Danach erfolgte eine Spülung mittels PBS-Puffer und die Zugabe des enzymmarkierten Avidins, gefolgt von einer weiteren PBS-Spülung. Nun gaben wir die chromogene Substratlösung zur Anfärbung hinzu. Es folgte eine gründliche Reinigung mittels PBS-Puffer sowie mehrfachem Reinigen Seite 10 in Leitungswasser. Danach erfolgte die Gegenfärbung mittels Hämalaun-Lösung. Zur Überprüfung der Richtigkeit der Ergebnisse wurde jeweils eine positive und eine negative Kontrolle mitgeführt. Auswertung: Zur Auswertung wurde die Zahl der positiv anfärbbaren Zellen in den Zonen der maximalen Expression des jeweiligen Antigens in 10 Gesichtsfeldern bei hoher lichtmikroskopischer Vergrößerung (400x) bestimmt. Diese Zahl wurde in Relation zur Gesamtzahl der vorhandenen Zellen pro Gesichtsfeld gesetzt. Epitheliale und mesenchymale Tumorkomponenten wurden getrennt ausgewertet. Die Auswertung der mit CD31-Antikörpern gefärbten Schnitte (Tumorgefäße) erfolgte nach folgendem Prinzip: Bei geringer mikroskopischer Vergrößerung (40fach) wurde nach dem Areal mit höchster Mikrogefäßdichte, dargestellt mit anti-CD31-Antikörpern, gesucht. Die angefärbten Gefäße wurden danach individuell bei 200facher Vergrößerung gezählt. Als Mikrogefäß wurde jede gefärbte Zelle oder jeder gefärbte Zellverband gewertet, der eindeutig von angrenzenden Mikrogefäßen, Tumorzellen oder anderen Bindegewebselementen abgegrenzt werden konnte. Es wurden auch gefärbte Zellverbände von Endothelzellen, die zu einem Mikrogefäß gehörten, welches aus dem einzelnen histologischen Schnitt heraus und wieder hinein lief, als separates Mikrogefäß gewertet. Für die Wertung als Mikrogefäß mußte kein Lumen vorhanden sein. Erythrozyten wurden nicht zur Definition eines Gefäßlumens herangezogen. Aus der Zählung von zehn verschiedenen Gesichtsfeldern wurde eine durchschnittliche relative Gefäßdichte berechnet. Für das Tumorzentrum und die Tumorfront wurde eine getrennte Auszählung der Gefäßdichte vorgenommen. Seite 11 Arbeitsanleitung: Zeit Lösung 10 min 30 min 15 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 20 min 05 min 15 min Formalin Xylol Alkohol 100 % Alkohol 95 % Alkohol 70 % Alkohol 50 % Alkohol 30 % Aqua dest. 3 % H2O2 in Methanol PBS-Puffer bei CD31: Vorandauung mit Pronase (s. o.) bei p53 (Ab-2 und Ab-6), Mib-1: Zitronensäurepuffer-Vorbehandlung (s. o.) bei PCNA: keine Vorbehandlung notwendig PBS-Puffer Normalserum Primär-Antikörper-Inkubation: - Mib-1: Verdünnung 1:20 - p53 (Ab-2): Verdünnung 1:20 - p53 (Ab-6): Verdünnung 1: 100 - CD31: Verdünnung 1:20 - PCNA: Verdünnung 1:10 PBS-Puffer biotinylierter Sekundärantikörper PBS-Puffer Avidin-Peroxidase-Komplex PBS-Puffer chromogene Substratlösung Spülen in PBS-Puffer und Leitungswasser Färben in Hämalaun Bläuen in Leitungswasser Eindecken mit wasserlöslichem Eindeckmaterial 05 min 10 min 60 min 05 min 10 min 05 min 10 min 05 min 05 min 6x5 min 10 sek. 10 min Seite 12 Statistische Auswertung der vorliegenden Arbeit: Die Einteilung der Tumorstadien erfolgt anhand der internationalen TNMKlassifikation (4. Auflage). Der Tumor (T) wurde nach seiner Größe und den befallenen umgebenden Strukturen eingeteilt. Das Lymphknotenstadium (N) wurde im Rahmen der von Metastasen befallenen Lymphknotenstationen ermittelt. Die Fernmetastasen (M) wurden in vorhanden (M1), nicht vorhanden (M0) oder unbekannten Status (Mx) eingeteilt. Bei den vorhandenen Metastasen wurde eine weitere Differenzierung in die vom Tumor befallenen Gewebe vorgenommen (M oss = ossäre Metastase; M mult = multiple Metastasen in verschiedenen Organen). Falls vorhanden, wurde eine Angabe über den metastasierten Anteil des Karzinosarkoms vorgenommen (cs. = der karzinomatöse Anteil des Tumors ist metastasiert). Die Berechnung des Durchschnittsalters der Patienten erfolgte nach dem arrithmetischen Mittel. Das „follow-up“, sprich die Nachverfolgung der Patienten, wurde wie folgt durchgeführt: in unregelmäßigen Abständen nach Diagnosestellung des malignen Tumors wurden die aktuellen behandelnden Hausärzte der Patienten fernmündlich kontaktiert und nach dem Überleben der Patienten und / oder einem neu diagnostizierten Rezidiv des Tumors beziehungsweise einer neu aufgetretenen Fernmetastase befragt. Die Zeit des follow-up wurde bis zum Tod des Patienten oder dem Ende der Befragungsdauer (33 Monate nach Beginn der Untersuchung, also Juni 1997) festgelegt. Die Angabe der Zeitspanne der Nachverfolgungsdauer erfolgt in Monaten. Bei den Patienten, deren Karzinosarkom erst durch eine Autopsie und somit postmortal diagnostiziert werden konnte, konnte folglicherweise keine Nachbefragung durchgeführt werden. Wir führten eine Klassifikation der überlebenden und verstorbenen Patienten durch. Die Patienten, die im Rahmen oder als Folge des Tumorleidens verstarben, wurden als „dead with evidence of disease“ (DED) eingestuft. Ein Patient (cs. 3) verstarb einen Tag postoperativ nach Tumorresektion an einer Blutungskomplikation („dead of postoperative bleeding“ = DPB). Zwei weitere Patienten (cs. 5; pb. 2) verstarben ohne Hinweise auf das Tumorleiden („dead without evidence of disease“ = DNED). Die am Ende des follow-up überlebenden Patienten ohne Hinweise auf das Seite 13 Tumorleiden wurden als „alive without evidence of disease“ (NED) klassifiziert. Bei der statistischen Auswertung für die durchschnittliche Überlebensdauer konnten lediglich die Patienten mit in die Berechnungen einbezogen werden, die entweder eindeutig bei Tod oder bei Ende des follow-up ohne Hinweise auf ein Tumorrezidiv oder Metastasen waren oder die auf Grund des Tumorleidens verstorben waren. Somit fielen die Patienten mit den Fallnummern cs. 3 und pb. 3 aus der Berechnung heraus. Bei diesen Fällen war entweder eine operative Komplikation für das Versterben verantwortlich oder die Überlebensdauer nach Diagnosestellung konnte nicht herausgefunden werden. Ebenfalls konnten die Patienten, deren Tumorleiden erst durch eine Autopsie, also postmortal, diagnostiziert wurde (cs. 7 und cs. 8) nicht in die Berechnungen mit einbezogen werden. Das „Metastasierungsverhalten“ definierten wir als bei Diagnosestellung vorhandene oder im Verlauf des follow-up neu aufgetretene Metastasen. Dieses Verhalten konnte einen positiven oder negativen Zustand annehmen. Die statistische Auswertung des „Metastasierungsverhaltens“ beinhaltete die Gegenüberstellung der durchschnittlichen Überlebensdauer von Patienten mit und ohne Metastasen (das heißt, Patienten mit M0- gegen M1-Status). Bei vier Patienten (cs. 2, cs. 4, pb. 1 und pb. 3) konnte eine eindeutige Klärung dieses Zustandes anhand der Krankenunterlagen nicht durchgeführt werden. Diese mußten als unbekanntes M-Stadium (Mx) klassifiziert werden und konnten somit nicht in die statistische Auswertung einfließen. Wir berechneten die durchschnittliche Überlebensdauer der Patienten, die einerseits am Tumorleiden verstarben und die andererseits ohne Hinweise auf ein Rezidiv oder eine Metastasierung am Ende der follow-up-Dauer überlebten. Diese Daten wurden einander gegenübergestellt. Wie bereits oben erwähnt, fielen verschiedene Daten aus diesen Berechnungen heraus (cs. 3, cs. 7, cs. 8 und pb. 3). Die errechneten Daten für die durchschnittlichen Überlebensdauern wurden statistisch in Beziehung zu den einzelnen Ergebnissen der immunhistochemisch untersuchten Antikörper, getrennt nach epithelialer und mesenchymaler Komponente beziehungsweise Tumorfront und Tumorzentrum, gesetzt. Die Proliferationsmarker Mib-1 und PCNA wurden von uns zur einfacheren Handhabung in „hohe“ und „niedrige“ Proliferationsaktivität eingeteilt. Den Cut-off Seite 14 setzten wir bei 50 % angefärbter Zellen in der immunhistochemischen Auswertung. Unter 50 % angefärbter Zellen definierten wir als niedrige Proliferation und 50 % oder mehr legten wir als hohe Proliferation fest. Ein statistisch eindeutiges Ergebnis fing bei uns bei einem p-Wert kleiner 0,05 an. Die in Studien wie dieser normalerweise angewandten Methoden der statistischen Berechnungen (zum Beispiel Methode der kumulierten Überlebensraten nach Kaplan-Meier) waren auf Grund der sehr kleinen Fallzahl unserer Untersuchung nicht sinnvoll einzusetzen. Somit wählten wir andere Berechnungsmethoden (MannWhitney-u-Test, T-Test für gepaarte Proben). Seite 15 Tabelle 1 – Auflistung der untersuchten Fälle mit klinischen Daten cs. = Karzinosarkom; pb. = Pulmoblastom; OL = Oberlappen, ML = Mittellappen, UL = Unterlappen; ..L = ..links, ..R = ..rechts; ..+ = Infiltration in die Brustwand; T-, N- und M-Stadien entsprechend der TNM-Klassifikation (4. Auflage); c = karzinomatöse Differenzierung, cs = gemischte Differenzierung, s = sarkomatöse Differenzierung; bilobekt = Bilobektomie, lobekt = Lobektomie, pneum = Pneumektomie, bas.seg.pleu. = Resektion des basalen Segments und Teile der Pleura; rad = Strahlentherapie, chem = Chemotherapie; DED = dead with evidence of disease, NED = alive without evidence of diesease, DNED = dead without evidence of disease, DPB = dead of postoperative bleeding, DIHD = dead probably because of ischemic heart disease, DPE = dead probably because of pulmonary embolism; ? = unbekannt. Fall Alter Geschlecht Lokalisation Tumor Lymphknoten Metastasen Therapie follow-up (Differenzierung) cs. 1 cs. 2 65 Jahre 55 Jahre männlich weiblich ULR OLR 7,2 cm 7 cm N2 (c.) N1 (cs.) M0 M oss (?) cs. 3 cs. 4 54 Jahre 79 Jahre männlich weiblich ULR ULR 12 cm + pT2 N1 (cs.) Nx M0 Mx cs. 5 69 Jahre männlich ULL 6 cm N2 (c.) M0 cs. 6 cs. 7 52 Jahre 80 Jahre männlich weiblich MLR OLL 8 cm 4 cm N2 (cs.) N3 (cs.) cs. 8 70 Jahre männlich OLL 7 cm N3 (cs.) cs. 9 cs. 10 60 Jahre 61 Jahre männlich männlich OLL MLR 4 cm 8,5 cm N0 N2 (c.) M0 M mult. (cs.) M mult. (cs.) M0 M0 pb. 1 pb. 2 65 Jahre 54 Jahre männlich weiblich OLR ULL 7,5 cm 10 cm + N0 N0 M oss (?) M0 lobekt bas.seg.pleu. pb. 3 58 Jahre männlich OLR 7 cm N0 Mx lobekt Raucherstatus ExR, 30 py NichtR bilobekt, rad DED 17 mon lobekt, rad (oss), DED 12 mon chem pneum DPB 1 d ExR, 30 py palliative DED ? mo NichtR Laserabtragung pneum, rad DNED 30 R, 2-3 Zig/d mon (DIHD) pneum NED 33 mo R, 60 Zig/d palliativ DED ? (Autopsie) palliativ DED ? (Autopsie) pneum, chem NED 21 mon ? pneum, rad NED 19 mon ? DED 6 mon DNED 6 mon (DPE) ? ? ? ? Seite 16 Karzinosarkome Ein Karzinosarkom ist ein ungewöhnlicher, sehr seltener, maligner Tumor, bestehend aus einem epithelialen und einem mesenchymalen Anteil. Es wurde und wird auch zum Teil noch als „Pseudosarkom“, „pleomorphes Karzinom“ oder „Spindelzellsarkom“ bezeichnet. Wie Virchow schon 1864 formulierte, gibt es „Mischformen von Sarkom und Carcinom: Geschwülste, in denen gewisse Abschnitte sarkomatös (fibroblastisch), andere carcinomatös sind.“ Er beschrieb es mit den Worten: „ ... es wachsen demnach Sarkom und Carcinom mit einander, wie zwei Aeste desselben Stammes.“53 Theoretisch könnte sich ein solcher Tumor in jedem Organ entwickeln, aber praktisch sind nur wenige Lokalisationen beschrieben. Als wichtigste sind hier zu nennen: Uterus, Hypopharynx, Oesophagus, Pulmo (Häufigkeit in absteigender Reihenfolge). Seltener kommt er auch noch in Vesica urinaria, Pankreas, Magen, Glandula mammaria, Glandula thyroidea, Glandula adrenalis, Glandulae salivariae, Larynx, Sinus maxillaris und Integumentum commune vor. Für die Definition und die Beurteilung der malignen Wertigkeit dieser verschiedenen Lokalisationen gelten dieselben Vorschriften wie für die Karzinosarkome der Lunge. Das Karzinosarkom der Lunge: Bereits 1908 beschrieb Kika als erster ein Karzinosarkom der Lunge. Es ist äußerst selten und kommt nur in ungefähr 0,1 bis 0,3 % aller gefundenen Lungentumore vor25. Definitionsgemäß besitzt das Karzinosarkom sowohl einen epithelialen als auch einen mesenchymalen Anteil. Zur Unterscheidung von anderen Tumoren derselben Lokalisation müssen beide Anteile maligne entartet sein, das heißt, sie müssen jeweils alleine die Fähigkeit zur Metastasierung besitzen. Die offizielle Festlegung der World Health Organisation (WHO) lautet deshalb: „Pulmonary carcinosarcomas are tumors consisting of an admixture of malignant epithelial and mesenchymal elements of the type ordinarily seen in malignancies of adults, i. e., well-defined carcinosarcomas and sarcomas similar to those seen in soft Seite 17 tissues. They should show differentiation of the mesenchymal component into specific heterologous tissues, such as neoplastic bone, cartilage, and striated muscle.“11 Epidemiologie: Das Karzinosarkom der Lunge tritt vorwiegend bei Männern auf. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Betroffenen beträgt: 5 - 9 zu 129. Bei ausschließlicher Betrachtung des zentralen Wachstumstyps beträgt das Verhältnis sogar 15 : 1. Die Gefahr eines Karzinosarkoms ist in der fünften bis sechsten Lebensdekade am größten. Befallen werden überwiegend die Lungenoberlappen. Abbildung 1 – Statistische Verteilung der Karzinosarkome innerhalb der Lunge (aus 153) Der typische Patient mit einem Karzinosarkom der Lunge zeigt also das folgende klinische Profil: männlich, im sechsten Lebensjahrzehnt, lange Raucheranamnese, und der Tumor liegt vorwiegend in den oberen Lungenlappen. Ätiologie: Eine Assoziation von Lungentumoren zum inhalativen Genuß von Tabakprodukten Seite 18 ist für viele verschiedene Entitäten bewiesen und gilt auch beim Karzinosarkom als gesichert. In einem einzigen Fall wird von einer Assoziation mit Asbestexposition berichtet17. Pathologie und Klinik: Innerhalb der Lunge kann man zwei unterschiedliche Lokalisationen der Karzinosarkome differenzieren. Es gibt einen zentralen und einen peripheren Wachstumstyp. Beide Typen treten in etwa 50 % aller beschriebenen Fälle auf. Der zentrale Typ liegt zentral in der Lunge und wächst meist endobronchial. Er entspringt von einer kleinen Fläche der Bronchuswand und ist mit ihr über einen dünnen Stiel verbunden. Er wächst nur wenige Milli- bis Zentimeter in das um den Stiel liegende Parenchym hinein und ist somit in der Regel wesentlich kleiner als der periphere Typ. Man schreibt ihm ein weniger aggressives Wachstum, eine zeitlich spätere Metastasierung und somit insgesamt eine bessere Prognose zu. Die bei dieser Tumorlokalisation auftretenden Symptome sind hauptsächlich durch eine bronchiale Obstruktion bedingt. Sie wird durch eine direkte Verlegung des Bronchus durch das Tumorgewebe hervorgerufen. Distal der partiellen bis kompletten Einengung des luftleitenden Systems finden sich sehr häufig Atelektasen, Bronchiektasen, Abszesse oder Pneumonien, Hämoptysen können auftreten. Außerdem werden Fieber, Gewichtsverlust, Dyspnoe, Müdigkeit, Leistungsknick und ähnliche unspezifische Allgemeinsymptome berichtet. Als peripheren Wachstumstyp bezeichnet man alle Karzinosarkome die in der Peripherie der Lunge entstehen und dort proliferieren. Dieser Typ wächst meist innerhalb des Lungenparenchyms, also nicht endobronchial. Wenn er ausnahmsweise endobronchial wachsen sollte, dann nur in sehr geringem Ausmaße. Er verhält sich wesentlicher aggressiver und kann eine beträchtliche Größe erreichen. Seine Prognose ist schlechter, weil er eine frühere und ausgeprägtere Metastasierungstendenz, besonders zu Fernmetatasen, zeigt. Außerdem wird er in der Regel erst spät diagnostiziert, da die durch ihn verursachten Symptome unspezifisch sind. Sein schnelles Wachstum kann somit bis zur Diagnosestellung und bis zum Therapiebeginn weit fortgeschritten sein. Insgesamt sind aber ungefähr ein Drittel aller Patienten bei Diagnosestellung Seite 19 asymptomatisch, so daß diese Tumore als Zufallsbefunde entdeckt werden. Das makroskopische Erscheinungsbild der Tumore ist überwiegend durch den sarkomatösen Anteil geprägt: es erscheint fest und grau, eventuell grau-weißlich. In Arealen der karzinomatösen Komponente gibt sich der Tumor weich, bröckelig und eher weißlich. In unterschiedlichem Ausmaß können Nekrosen und hämorrhagische Bezirke ausgebildet sein. Histologisch findet man sehr unterschiedliche Kombinationen der epithelialen und mesenchymalen Komponenten vor. Am häufigsten sind Plattenepithelkarzinome mit oder ohne Verhornung kombiniert mit einem spindel-zelligen sarkomatösen Anteil. Es können aber auch Adenokarzinome, entdifferenzierte oder Mischtypen auf der einen und Chondrosarkome, Osteosarkome, Fibrosarkome, Leiomyosarkome, Rhabdomyosarkome, entdifferenzierte oder Mischtypen auf der anderen Seite vorkommen (siehe Tabelle 2). Nappi untersuchte Karzinosarkome mehrerer Lokalisationen und stellte fest, daß der mesenchymale Teil in den allermeisten Fällen osteoklastenähnliche Riesenzellen enthält. Außerdem fiel ihm auf, daß die Tumore in den meisten Fällen unterschiedliche Differenzierungsgrade der jeweiligen Komponenten an verschiedenen Stellen innerhalb desselben Präparates enthielten. An einem Fokus gab es zum Beispiel mittel- bis hochdifferenziertes und an einem anderen niedrig- bis entdifferenziertes Gewebe. Dieses trat sowohl in der epithelialen als auch in der mesenchymalen Komponente auf. Der sarkomatöse Anteil ist immer durch reichlich Retikulin- und Kollagenfasern gekennzeichnet. Seite 20 Tabelle 2 – Histologische Formen des Karzinosarkoms und deren Häufigkeiten (aus 29) Komponente Histologie Häufigkeit in % epithelial Plattenepithelkarzinom Adenokarzinom Adenosquamöses Karzinom undifferenziertes großzelliges Karzinom mesenchymal Rhabdomyosarkom alleine Chondrosarkom alleine Osteosarkom alleine Rhabdomyosarkom + Chondrosarkom Rhabdomyosarkom + Osteosarkom Rhabdomyosarkom + Chondrosarkom + Osteosarkom Chondrosarkom + Osteosarkom 47 32 20 1 26 18 6 11 5 11 24 Als Bestätigung eines echten Karzinosarkoms fordert man heutzutage, daß der spindel-zellige Anteil bei der immunhistochemischen Untersuchung vimentin- oder S100-positiv sein11 oder bei elektronenmikroskopischer Betrachtung eindeutige mesenchymale Filamente enthalten muß. Die Einordnung des Karzinosarkoms innnerhalb der Gruppe aller Lungentumore wird zur Zeit noch kontrovers diskutiert. Die WHO definiert diese Neoplasie als eigenständige Entität und stellt keine Beziehung zu anderen Tumoren her. Andere Forscher wollen dagegen engere Zusammenhänge auf Grund verschiedener Untersuchungen (hauptsächlich der elektronen-mikroskopischen) zwischen Pulmoblastomen, Karzinosarkomen und Spindelzellkarzinomen sehen. Es wären somit unterschiedliche Ausdrucksformen einer einzigen Tumorentität, die ineinander übergehen könnten42. Histogenese: Die histogenetische Entstehung des Karzinosarkoms ist bis heute nicht endgültig geklärt. Es gibt mehrere Theorien, die im Laufe der Zeit aufgestellt wurden: Seite 21 1. Theorie) Kollisionstumor: Hierbei würden beide Komponenten des Tumors unabhängig voneinander entarten und aufeinander zuwachsen, bis sie sich räumlich träfen. Diese Theorie konnte bis heute nicht eindeutig nachgewiesen werden. 2. Theorie) Primäres Karzinom, welches zu einer Hyperproliferation des StromaGewebes führen würde. Wenn dieser Mechanismus richtig wäre, gäbe es nur metastatische Absiedlungen, die ausschließlich karzinomatöses Gewebe oder eventuell noch mit zusätzlichem hyperproliferiertem Stroma enthielten. Dieser Theorie spricht entgegen, daß auch bei einer Reihe von Fällen rein sarkomatöse Metastasen gefunden wurden. 3. Theorie) Das Karzinosarkom entstünde aus einem entarteten Hamartom: Bei Läsionen mit Foci bestehend aus Osteosarkom oder Chondrosarkom ist eine Entartung des epithelialen und mesenchymalen Anteils denkbar49. 4. Theorie) Als entartete Ausgangszelle diene eine pluripotente Stammzelle, die zwei unterschiedliche Zellklone hervorbringe und somit einen biphasischen Tumor entwickeln könne47. 5. Theorie) Ein primäres Karzinom führe zu einer Entartung des mesenchymalen Anteils. 6. Theorie) Das sarkomatöse Gewebe entstehe aus einer Metaplasie des karzinomatösen Anteils. Für diese Theorie sprechen viele Untersuchungen. Man hat z. B. eine Koexpression von Vimentin und Cytokeratinen im mesenchymalen Anteil von Karzinosarkomen festgestellt. Außerdem fanden sich Desmosomen oder desmosomen-ähnliche Strukturen in eindeutig mesenchymalen Zellen. Diese Gegebenheiten wurden als Zeichen für eine Abstammung der mesenchymalen von epithelialen Zellen gedeutet22. Metastasierung: Die hämatogene Metastasierung eines pulmonalen Karzinosarkoms erfolgt, wie bei allen anderen Lungentumoren auch, am häufigsten in Gehirn, Leber, Lunge, Nebenniere, Niere, Haut und Knochen. Außerdem kann es per continuitatem in die Pleura, die Rippenknochen und das Mediastinum einwachsen. Klinisch fällt er Seite 22 hierbei durch Brust- oder Knochenschmerzen auf. Des weiteren kann er im Mediastinum wichtige Leitungsbahnen (z. B. nervale, vaskuläre) infiltrieren oder verdrängen und somit weitreichende Beeinträchtigungen hervorrufen. Bei vielen Patienten mit peripheren Karzinosarkomen können bei Diagnosestellung des Primärtumors schon Fernmetastasen nachgewiesen werden, somit ist von vornherein eine schlechtere Prognose zu erwarten. Bei zentral wachsenden Tumoren gibt es nur selten Metastasen, sogar die regionären Lymphknoten sind in einem großen Prozentsatz (noch) nicht befallen. Da beide Anteile eines Karzinosarkoms maligne entartet sind, kann es rein epitheliale, rein mesenchymale oder gemischte metastatische Absiedlungen geben, der mesenchymalen Komponente wird jedoch die höchste Quantität zugeschrieben. Zusammenfassend kann man sagen, daß der epitheliale Anteil vorwiegend in Lymphknotenmetastasen und der mesenchymale vorwiegend in Fernmetastasen gefunden wird15. Diagnostik: Die artspezifische Diagnosestellung bei Karzinosarkomen im Vorfeld einer chirurgischen Intervention bereitet große Schwierigkeiten. Radiologisch kann man in der Thoraxaufnahme in zwei Ebenen meist nur einen Rundherd erkennen, dessen Dignität nicht genau festgelegt, sondern nur abgeschätzt werden kann. Die Computertomographie erlaubt die Eingrenzung auf einen malignen Prozeß, eine Artdiagnose kann jedoch nicht erreicht werden. Ein geeigneter Tumormarker zur spezifischen Erkennung des Karzinosarkoms existiert nicht. Mit Hilfe der Bronchoskopie kann zwar der zentrale, endobronchial wachsende Anteil eines Tumors nachgewiesen werden. Sollten aber Aussagen über dessen definitive Subtypisierung getroffen werden, ist eine histologische Untersuchung erforderlich. Oft finden sich in der Biopsie jedoch keine Zeichen für ein malignes Geschehen, geschweige denn sind beide Anteile dieses biphasischen Tumors vorhanden. Beim peripheren Typ kann man durch die Bronchoskopie gar keine Biopsie gewinnen, da der Tumor in den wenigsten Fällen in einem Bronchus zu erkennen ist, der eine geeignete Größe für eine bioptische Entnahme bietet. Hier kann eine transthorakale Biopsie nur selten zum richtigen Ergebnis führen, da hierbei noch geringere Gewebemengen als bei anderen Biopsiearten entnommen werden können Seite 23 und somit in der Regel nicht beide Komponenten des biphasischen Tumors erfasst werden. Therapie: Die Behandlung von Karzinosarkomen wird, wenn noch möglich, chirurgisch durchgeführt. Dabei wird entweder eine Lob-, Bilob- oder Pneumektomie durchgeführt. In der Regel folgt eine adjuvante Chemo- oder Strahlentherapie. Eine alleinige Chemo- oder Radiatiotherapie hat nur in vereinzelten Fällen eine prognostische Bedeutung erhalten und ist somit nur zu palliativen Zwecken geeignet. Seite 24 Pulmoblastome Pulmoblastome sind hochmaligne Lungentumore mit embryonaler adenoid-tubulärer Epithel- und / oder sarkomatöser Stromakomponente. Sie wurden 1945 als erstes durch Barret und Bernard als „embryoma of the lung“ beschrieben1. Zum Teil geht man in der Literatur davon aus, daß diese Entität eine Subklassifikation der Karzinosarkome darstellen2. Dieses ist jedoch nicht allgemein anerkannt. Die sarkomatöse Komponente ähnelt histologisch dem glykogenreichen tubulären oder embryogenen Bindegewebe, welches in fetalem Lungengewebe in der zehnten bis sechzehnten Woche der Schwangerschaft gefunden wird (pseudoglanduläres Stadium der Lungenentwicklung). Das mesenchymale Gewebe kann in unterschiedlichen Reifungsstadien vorkommen. Es kann als Knorpel-, Knochen- oder Muskulaturgewebe ausgebildet sein. Im Unterschied zu diesem Tumor enthält das Karzinosarkom der Lunge nur ausgereifte Zellelemente. Synonyma der Pulmoblastome sind: - well-differentiated fetal adenocarcinoma (WDFA) - pulmonary adenocarcinoma of fetal type - well-differentiated adenocarcinoma simulating fetal lung tubules - pulmonary endodermal tumor resembling fetal lung - Embryoma - Karzinosarkom von peripherer Herkunft - maligner teratoider Tumor - Adenosarkom - gemischter embryonaler Tumor - maligner gemischter Tumor - blastomatöser Tumor. In dieser Arbeit werden folgende Definitionen benutzt: - Pulmoblastom: Tumor aus malignem epithelialen und malignem mesenchymalen Anteil (= biphasischer Tumor) - Pulmoblastom, epitheliale Variante: Tumor mit ausschließlich maligner epithelialer Komponente - pleuropulmonales Pulmoblastom: Tumor mit ausschließlich maligner mesenchymaler Komponente Die bei Erwachsenen vorkommenden Tumore müssen von denen bei Kindern Seite 25 vorkommenden abgegrenzt werden. Histologisch sehen sie sehr ähnlich aus. Die bei Kindern vorkommenden sind in ihrem biologischen Verhalten aber eher benigne und somit als eigenständige Entität anzusehen. Epidemiologie: Pulmoblastome sind seltene Tumore, sie sind wahrscheinlich nur in 0,25 % bis 0,5 % aller malignen Lungentumore zu diagnostizieren. Männliche und weibliche Patienten sind etwa im Verhältnis 3 : 1 betroffen. Mit dem Alter nimmt der relative Anteil der männlichen Patienten zu. Die Altersverteilung hängt stark vom Subtyp ab (siehe auch Tabelle 3). Beim Erwachsenen-Typ wird das mittlere Manifestationsalter mit 40 Lebensjahren (Range 0 - 80 Jahre) und beim Kinder-Typ mit drei Lebensjahren (Range 2 - 12 Jahre) angegeben. Tabelle 3 – Klinische und pathologische Merkmale der Subformen der Pulmoblastome (aus 28) Pulmoblastom, epitheliale Variante Klinik Betroffene < 10. Lj. Raucher nur mediastinaler Tumor Ausdehnung asymptomatisch Prognose Pathologie maligner epithelialer Anteil maligner mesenchymaler Anteil solide Zellnester (= Morula) Chromogranin-positiv Pulmoblastom pleuropulmonales Pulmoblastom 0% häufig nie 4,5 cm häufig gut 8% häufig nie 10,1 cm gelegentlich schlecht 91 % nein häufig keine Angaben selten schlecht ja nein ja ja nein ja 86 % häufig 43 % häufig 0% nie Trotz ihres lichtmikroskopisch embryonalen Aussehens kommen weder das epitheliale noch das biphasische Pulmoblastom häufig bei Kindern vor. Ätiologie: Nahezu 80 % der Betroffenen, soweit eine Raucheranamnese vorliegt, sind Rauchen31, so daß man den Schluß ziehen kann, daß, trotz des fetalen Aussehens des Tumors, dieselben kanzerogenen Faktoren wie bei anderen malignen Lungentumoren Seite 26 eine Rolle spielen. Klinik: Gewöhnliche Symptome dieser Tumore sind Fieber, Husten, thorakale Schmerzen, Dyspnoe und Hämoptysen. 25 - 40 % der Patienten sind beschwerdefrei. Patienten mit epithelialen Pulmoblastomen zeigen seltener Symptome als solche mit biphasischen Tumoren. Dieses kann mit der durchschnittlich geringeren Tumorgröße des epithelialen Subtyps zusammenhängen, der auch in der Regel zu einer geringeren Wachstumsgeschwindigkeit neigt30. Diagnostik: Die Röntgen-Thorax-Aufnahme zeigt typischerweise eine solitäre intrapulmonale Masse, gewöhnlich vom Hilus entfernt, welche aber keine Bevorzugung zu einem bestimmten Lungenabschnitt erkennen läßt. Per Bronchoskopie oder Feinnadelbiopsie kann nur in circa einem Drittel der Fälle eine korrekte präoperative Diagnose gestellt werden. Epitheliale und biphasische Pulmoblastome Pathologie: Pulmoblastome sind große Tumore (Variabilität 1-28 cm Durchmesser; mittlerer Durchmesser 6 cm). Sie sind gegenüber ihrer Umgebung gut abgrenzbar, nicht gekapselt und meist peripher innerhalb der Lunge gelegen30. Typischerweise sind sie solitär, gelegentlich können sie als prominenter Primarius mit Satellitenläsionen vorkommen. Epithelial differenzierte Tumore sind signifikant kleiner als biphasische Tumore. Intrabronchiale Tumore kommen in der Regel nicht vor. Die Schnittfläche imponiert fischfleischartig, normalerweise in verschiedenen Farben in einer Kombination von weiß, gelbbraun und braun. Häufig sind zystische Degenerationen vorhanden. Histologisch sind epitheliale Pulmoblastome aus komplexen tubulären Anordnungen aufgebaut, die durch nichtzilientragende hochprismatische Zellen mit klarem oder Seite 27 leicht eosinophilem Zytoplasma begrenzt werden. Die Kerne der glandulären Zellen sind relativ uniform rund oder oval mit leichter Hyperchromasie aufgebaut. Sub- und supranukleär gelegene zytoplasmatische Vakuolen erzeugen eine endometrioide Erscheinungsform. Als glanduläre Muster können Verschiedene beobachtet werden: kribriforme, strangförmige, streifenförmige oder solide Anteile, die zum Teil einen basalen palisadenförmigen Abschluß bilden. Die Basis der Drüsenanteile bilden Zellen mit reichlich eosinophilem Zytoplasma und gelegentlich optisch hellem Kern, welche in Nestern, sogenannten Morula, angeordnet sind. Diese kommen in 43 % der biphasischen Tumore und in 86 – 100 % der epithelialen Tumore vor30. Innerhalb des Drüsengewebes kann schleimiges Sekret vorkommen, hierbei ist jedoch intrazelluläres Muzin ungewöhnlich. Argyrophile Granula können in einzelnen Morula und seltener auch in strangförmig angeordneten Drüsenzellen gefunden werden. Im epithelialen Anteil von Pulmoblastomen können nekrotische Bezirke auftreten. Bei epithelialen Pulmoblastomen kommt zu dem malignen drüsigen Anteil noch ein spärlicher, benigner Stromaanteil von spindelförmigen, myofibroblastischen Zellen hinzu. Bei elektronenmikroskopischer Betrachtung haben die neoplastischen drüsenbildenden Zellen getrennte Basallaminae, apikale junktionale Komplexe, glykogen-freie Kompartimente und Mikrovilli an der apikalen Oberfläche der auskleidenden Zellen. Biphasische Pulmoblastome zeigen maligne Drüsen und ein malignes Stroma von embryonalem oder blastomatösem Erscheinungsbild, welches zur Verdichtung um die Drüsen herum neigt. Bei biphasischen Pulmoblastomen kann der solide epitheliale Anteil in den malignen Stromaanteil hineinreichen. Gelegentlich werden Hornperlen gefunden. Die Stromazellen liegen in einem myxoiden Stroma und sind meistens schmal, oval, spindelförmig; manchmal zeigen sie einen auffallenden Polymorphismus. Ungefähr 25 % der Fälle zeigen histologisch Gewebe von quergestreifter Muskulatur oder von Knorpel. Ossäre Differenzierung findet sich in ungefähr 5 % der Fälle. Kurze Bündel von „fetaler“ glatter Muskulatur wurden in einer Reihe von Fällen beschrieben. Seite 28 Wie bereits oben erwähnt, sind epitheliale und biphasische Pulmoblastome histogenetisch eng verwandt. Hinweise hierfür rühren daher, daß kombinierte Tumore aus beiden Subtypen vorkommen. Hierbei gibt es innerhalb des Tumors Foci mit ausschließlich epithelialer Differenzierung und davon unabhängige Foci mit biphasischer Differenzierung. Häufig findet man eine neuroendokrine Differenzierung innerhalb der Pulmoblastome. Sowohl eine Anfärbbarkeit mit Chromogranin als auch mit Neuronen-spezifischer Enolase ist, besonders in Morula (in 64 - 72 % der Fälle), nachweisbar. Zum Teil können auch andere neuroendokrine Marker wie Kalzitonin, Gastrin-releasing Peptide, Bombesin, Leuzin, Methionin-Enkephalin, Somatostatin und Serotonin30 gezeigt werden. Eine neuroendokrine Differenzierung kann neben der immunhistochemischen Anfärbbarkeit auch elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden. Innerhalb jedes einzelnen Tumors findet sich nur eine geringe Anzahl von Zellen, die mit Markern gegen hormonelle Antigene anfärbbar sind. Dieses läßt eine gewisse differentialdiagnostische Abgrenzung gegenüber Karzinoiden zu, welche lichtmikroskopisch zum Teil sehr ähnlich aussehen können. Der glanduläre Anteil des Pulmoblastoms exprimiert sialogelöstes Lewis-X-Antigen, welches einen endodermalen Ursprung des Epithels nahelegt. Das Vorkommen von Surfactant-Apoprotein innerhalb von Morula wurde weitergehend mit Hilfe des Elektronenmikroskops untersucht. Man kam zu dem Ergebnis, daß Morula sich in Entwicklung befindende Alveolarknospen darstellen41. Die folgenden Merkmale sprechen für eine schlechte Prognose bei Pulmoblastomen: thorakale Lymphknotenschwellung, Fernmetastasen, Tumorrezidiv, Tumorgröße über 5 cm Durchmesser, Kernpolymorphismus, Lymphgefäßinvasion, multifokale Nekrosen, begrenzte neuroendokrine Differenzierung. Die histologische Erscheinungsform des Tumors scheint keinen Einfluß auf die Prognose der Patienten zu haben28. Seite 29 Allgemeine Onkogenese Die Onkogenese kann durch verschiedenste Vorgänge in ihrer Initiation oder ihrer Unterhaltung vorangetrieben werden. In der Regel sind mehrere Veränderungen innerhalb des Genoms einer Zelle notwendig, damit daraus eine maligne Form und somit ein maligner Zellklone und ein metastasierender Tumor entstehen kann. Die Onkogenese wird zum Beispiel von Viren, chemischen Substanzen oder ionisierenden Strahlen ausgelöst. Diese transformierenden Agentien verursachen durch Mutation, Translokation oder Gen-Rearrangement innerhalb der Zelle die Veränderung zum Beispiel eines ProtoOnkogens in ein Onkogen. Des weiteren können Genveränderungen innerhalb von Tumorsuppressorgenen erfolgen, so daß diese ihre Suppressorfunktion nicht mehr ausüben können und ebenfalls eine Transformation erfolgt. In vielen Fällen wird die transformierende Eigenschaft nicht durch die Schädigung an sich, sondern durch den Versuch ihrer Reparatur hervorgerufen. Eine weitere Möglichkeit der Auslösung einer malignen Entartung kann die epigenetische Vererbung darstellen. Das bedeutet, daß die Vererbung der malignen Potenz über Zellanteile außerhalb der Desoxyribonukleinsäure vonstatten geht. Seite 30 Spezielle Onkogenese beim Bronchialkarzinom Bei der Entstehung des Bronchialkarzinoms sind bis heute verschiedene Noxen als Auslöser nachgewiesen worden. Als wichtigste ist das inhalative Zigarettenrauchen anzusehen, welches bei ungefähr 80% aller Bronchialkarzinome als Hauptursache oder zumindest als schwerwiegende Mitursache gefunden wird. Ebenfalls kann „Passivrauchen“ in einigen Fällen als Ursache herausgestellt werden45. Als weitere Substanzen werden radioaktiv strahlende Stoffe (zum Beispiel Radon), Asbest, Metalle und deren Verbindungen (zum Beispiel Arsen, Beryllium, Chrom, Nickel), alkylierende Verbindungen (zum Beispiel Haloether, N-Lost- Verbindungen), Vinylchlorid, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und die Inhaltsstoffe von Diesel-Auspuff-Gasen gefunden. Sie tragen aber nur bei 1 - 5 % der Bronchialkarzinome zu deren Entstehung bei. Eventuell können auch bei vereinzelten Fällen inhalierte Insektizide, Pestizide, Reizgase (zum Beispiel Senfgas) oder Asbestfasern als auslösende Ursache angesehen werden. Als weiteres Agens muß das RNA-Retrovirus Human Immunodeficiency Virus (HIV) als (Mit-)Auslöser von pulmonalen Neoplasien angeschuldigt werden21. Eine familiäre Belastung scheint ebenfalls für die Entstehung einer Geschwulst der Lunge bedeutend zu sein. Dieses muß jedoch für verschiedene histologische Subtypen differenziert werden. Außerdem kann in wenigen Fällen eine Narbe der Lunge als Grundlage der Tumorentstehung dienen. Die oben genannten Stoffe können sich in ihrer Kanzerogenität gegenseitig verstärken, so daß eine additive oder sogar überadditive Wirkung in vielen Fällen durch Zigarettenrauchen hervorgerufen wird. Hierbei ist der inhalative Genuß des Zigarettenrauchens meist entscheidender für die Tumorentstehung als die berufliche Exposition gegenüber einer Noxe34. Seite 31 Molekular-Pathologie des Bronchialkarzinoms In den letzten Jahren wurden viele molekularbiologische Erkenntnisse zur Entstehung des Bronchialkarzinoms gesammelt. Hier sind nur einige von ihnen zusammengestellt. Beim Small-cellular-lung-carcinoma wurden Chromosomenvervielfachungen von Hypodiploid bis zu Oktaploid gefunden. Die meisten strukturellen Veränderungen lagen auf den Chromosomen 1, 2, 3 und 10. Bei einer Untersuchung von vierzehn Small-cellular-lung-carcinoma wurde in allen Fällen eine Deletion der Chromosomen-Region 3p14 bis p23 festgestellt. Außerdem wird sehr häufig der Verlust von Heterozygotie gefunden, der auf den Chromosomen 3p, 13q und 17p lokalisiert und meistens bereits zu Beginn des Tumorwachstums ausgebildet ist. Beim Non-small-cellular-lung-carcinoma tritt eine Deletion meistens auf Chromosom 17p auf, die häufig mit einer Deletion auf Chromosom 11 kombiniert ist. Dieses gilt besonders für die histologische Untereinheit des Plattenepithelkarzinoms, wohingegen bei Adeno- und großzelligen Karzinomen Deletionen auf den oben genannten Chromosomen nur in einem geringeren Ausmaß gefunden werden. Auf den Chromosomen 11p, 13q und 17p sind dominante (Proto-)Onkogene und rezessive Tumorsuppressorgene lokalisiert, die durch die genetischen Veränderungen aktiviert werden und somit zur Neoplasiebildung beitragen. Zu den (Proto-) Onkogenen gehören ras-Gen-Familie, erbB-Gen-Familie, myc-Gen-Familie, mdm-2Gen, raf-Gen-Familie und jun-Gen-Familie. Den Tumorsuppressorgenen gehören Retinoblastom-Gen, P53-Gen, P16-Gen, Interferon-gene-cluster sowie APC/MCCgene-cluster an5. Verlust des kurzen Armes von Chromosom 34: In 90 % bis 100 % von Small-cellular-lung-carcinoma und in 25 % bis 50 % von Non-small-cellular-lung-carcinoma ist ein Verlust des kurzen Armes von Chromosom 3 (= 3p; hierbei ist besonders die Region 3p14 bis p25 betroffen) nachzuweisen. Bei Verlust beider Allele kann ein bis heute noch nicht näher charakterisiertes rezessives Onkogen seine transformierende Wirkung entfalten, welches in allen Arten von Lungenkarzinomen beobachtet werden kann. Seite 32 Chronologische Neogenese des Bronchialkarzinoms: Insgesamt stellt man sich heute eine zeitliche Reihenfolge der molekularen Onkogenese beim Bronchialkarzinom vor. Diese beinhaltet eine multifaktorielle und schrittweise Entartung und somit Ansammlung von molekularen Defekten in der epithelialen Zelle50: normale Epithelzelle 1) Einwirkung eines Karzinogens Basalzell-Hyperplasie 2a) Deletion, Translokation oder 2b) ras-Mutation und Amplifikation cyclin D1-Mutation 3a) Aneuploidie 3b) p53-Mutation milde / moderate Dysplasie milde / moderate Dysplasie (Low Grade Dysplasia) (Low Grade Dysplasia) 4) cyclin E-Mutation schwere Dysplasie / Carcinoma in situ (High Grade Dysplasia) 5) HER-2/neu-Mutation invasives Karzinom 6) ras-Überexpression a) metastasierendes Karzinom b) Rezidiv Seite 33 Tumorsuppressorgen (p53) Das p53-Protein hat seinen Namen bekommen, weil es ein Molekulargewicht von 53.000 Dalton besitzt und als Expressionsprodukt des Genabschnittes TP53 ein Protein (p) ist. TP53 ist das häufigste mutierte Gen in menschlichen Geschwülsten, insgesamt in circa 60% aller Tumore (zum Beispiel in ungefähr 70% aller kolorektalen Tumore, 50% aller Lungentumore, sogar in 100% der kleinzelligen Bronchialkarzinome, in ungefähr 30-40% der Mammatumore33). Bei p53 wirkt sich eine Mutation dramatisch aus, da es als Quartärstruktur ein Tetramer oder Oligomer bildet. Statistisch gesehen befindet sich somit in jedem p53Block, auch bei Mutation nur eines Allels, mindestens ein fehlerhaftes Protein. Der p53-Block kann dadurch seine normale Funktion nicht ausführen. Dieses Verfahren wird als negative Dominanz bezeichnet. Allerdings hat sich gezeigt, daß Homozygotie für TP53-Mutanten schneller zur Geschwulstbildung führt als Heterozygotie. 8% der Mutationen im TP53-Gen sind Deletionen und Insertionen, 5% sind Nonsense- oder Frameshiftmutationen und 1% verhalten sich neutral und verursachen keinen Aminosäurenaustausch im entsprechenden Genprodukt (p53). Die meisten Missense-Mutationen (92%) liegen zwischen den Codons 120 und 290 des 393 Codon langen Proteins. Außerhalb dieses Bereichs finden sich die meisten Nonsense-Mutationen. Bei Tumoren der Lunge gibt es z. B. wesentlich mehr Transversions- als Transitions-Mutationen, welche typisch für die Einwirkung von Benzpyrenen, die sich zum Beispiel im Zigarettenrauch befinden, sind. Am Codon 157, das fast nur bei Lungentumoren mutiert ist, sind ausschließlich Transversionen vorhanden18. TP53: TP53 ist 16-20 kB lang und liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 an der Position 17 p 13.1. Es enthält 11 Exons, die nach dem Spleißen für eine 2,2 bis 2,5 kB lange mRNA kodieren. P53 wird in allen menschlichen Zellen exprimiert. Seine höchste Konzentration erreicht es im Thymus, in der Milz, in den Hoden und in den Ovarien. Seite 34 Als hochkonserviertes Gen enthält es fünf Regionen, die bis zu zwanzig Basenpaare lang sind und ganz genau mit den entsprechenden Regionen aus Mäusezellen übereinstimmen. In den Regionen II (Codons 120-143), III (172-182), IV (238-259) und V (271-290), die für seine Funktion anscheinend unabdingbar sind, befinden sich 68% aller Mutationen33. p53: Die Translation von TP53 wird durch verschiedene Stressoren, unter anderem durch DNA-Schäden, Hypoxämie oder Nukleotidabbau („Deprivation“), gefördert. Es entsteht dann das p53-Protein, welches sich funktionell in drei Bereiche unterteilt: - 75 Aminosäuren am Aminoende sind ausgesprochen acidophil. Wenn man diesen Abschnitt mit einem DNA-bindenden Protein in Verbindung bringt, kann er als Promoter für die Transkription dienen. - Die Region der Aminosäuren 120 bis 290 kann als spezifisches DNA-bindemolekül agieren. Es bindet an die „p53-bindende Sequenz“ 5'-Pu-Pu-Pu-C-A/T-A/T-G-Py-PyPy-3'. - Das Carboxylende zwischen den Aminosäuren 290 und 393 ist sehr basophil und verfügt über verschiedene Funktionen, zum Beispiel eine Stelle zur Phosphorylierung durch eine cyclin-abhängige Kinase. Hier befindet sich auch die Region, die p53 veranlaßt, sich zu Tetra- oder Oligomeren zusammenzuschließen. Funktionen des nicht-mutierten p53: Bei DNA-Schäden muß der Zell-Zyklus so lange angehalten werden, bis die Veränderungen beseitigt sind. Andernfalls kann es zu Replikationsfehlern oder chromosomalen Verteilungsstörungen kommen. Durch DNA-Schäden kann es einerseits zum Absterben der Zelle, aber andererseits auch zu unkontrolliertem Wachstum und Vermehrung der Zelle kommen. p53 ist innerhalb der einzelnen Zelle für das Anhalten des Zell-Zyklus verantwortlich. Bei Schäden im Genom steigt seine Halbwertszeit von normalerweise 20 bis 30 Minuten auf mehrere Stunden an. p53 blockiert die Progression innerhalb der G1- und den Eintritt in die S-Phase bis alle DNA-Schäden behoben sind. Gleichzeitig reduziert es die GTP-Konzentration, die als Schlüsselsubstanz für die Transduktion von Wachstumssignalen gilt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß p53 die Helikase-Aktivität antagonisieren kann. Seite 35 Durch die vorgenannten Funktionen des p53 werden nicht mit letzter Sicherheit alle Replikationsfehler ausgeschlossen, aber die Genauigkeit der fehlerlosen Replikation wird um ein vielfaches heraufgesetzt. P53 kann somit insgesamt als Überwacher der Integrität des Genoms bezeichnet werden33. Aus diesen Erkenntnissen kann man schließen, daß p53 einen Transkriptionsfaktor darstellt, der Genen, die die p53-bindende Sequenz enthalten, als Promoter dient. Gene ohne p53-bindende Sequenz werden durch p53 an ihrer Expression gehindert oder zumindest negativ beeinflußt. Dieses wird sehr wahrscheinlich durch die Bindungseigenschaften von p53 an grundlegende Transkriptionsfaktoren, TATA binding protein (TBP), Transkriptionsfaktor Sp1 und CCAAT-bindender Faktor, bewerkstelligt. Veränderungen bei p53-Mutationen: Mutiertes p53 kann weder die Transkription bestimmter Gene fördern noch anderer Gene inhibieren, da es seine Bindungseigenschaften zur p53-bindenden Sequenz und zum TBP verloren hat. Es kann also seine normale Funktion innerhalb der Zelle nicht mehr ausüben. Beim Li-Fraumeni-Syndrom finden sich Mutationen von TP53 in Keimbahnzellen. Die Zellen sind heterozygot für das veränderte Gen und tragen ein erhöhtes Risiko für maligne Geschwülste verschiedenster Lokalisationen. Alle Veränderungen von p53, seien es Mutationen oder funktionelle, führen zu einem erhöhten Risiko, entartete Zellen und daraus folgend maligne Geschwülste zu entwickeln33. Seite 36 Proliferation (MIB-1 und PCNA) Proliferationsmarker sind Antigene, die einer zellzyklusabhängigen Synthese unterliegen. Die Antigene sind in ihrer Funktion so eng mit dem Zellzyklus verbunden, daß sie bei jeder Art von Proliferation exprimiert werden. Folglich sind sie bei jeder Art von Wachstum, bei benignem und auch bei malignem, nachweisbar. Da Tumorzellen im Gegensatz zu „normalen“ Körperzellen ständig proliferieren, können diese Marker als Anhaltspunkte für die Wachstums- und Vermehrungsgeschwindigkeit der untersuchten Tumorzellen herangezogen werden. Sie können ebenso für die wichtige Untersuchung der Korrelation zwischen biologischem Verhalten und histomorphologischem Bild eines Tumors benutzt werden. Die Anfärbung von Proliferationsmarkern mit immunhistochemischen Methoden, wie wir sie einsetzten, ist gut zu handhaben und sogar bei seit längerem fixierten und eingebetteten Untersuchungsobjekten möglich und somit auch auf ältere Fälle anwendbar8. In unserer Untersuchung benutzten wir die Marker Mib-1 (Ki-67) und PCNA (proliferating cell nuclear antigen) zur Darstellung der Proliferation. Durch DNA-Flowcytometrie wurde eine gute Korrelation zwischen PCNA- und Ki67-Expression einerseits und S-Phasen-Fraktion von malignen Tumoren andererseits beschrieben. Mib-1 (Ki-67): Mib-1 wurde 1992 als paraffingängiger Ki-67-äquivalenter Antikörper eingeführt. Er ist gegen das 1.002 bp c-DNA-Fragment des Ki-67-Antigens gerichtet. Das Ki-67Antigen ist ein Nicht-Histon-Protein bestehend aus zwei Polypeptidketten von 345 kD und 395 kD. Seine höchste Konzentration findet sich in der Peripherie der Nukleolen. Dort ist es wahrscheinlich mit dem dichten fibrillären Netzwerk des Nukleolus eng verknüpft48. Es besitzt anscheinend eine regulatorische Funktion bei der Zellproliferation. Die Expression erfolgt in der G1-, der S-, der G2- und der M-Phase. Allerdings ist die Seite 37 frühe G1-Phase mit diesem Marker nicht anfärbbar und Zellen in diesem Zyklusabschnitt können deshalb nicht als proliferierend identifiziert werden. Eine Expression des Ki-67-Antigens in der G0-Phase erfolgt nicht und wird vom einem idealen Marker auch nicht gewünscht10. Die zugehörige DNA ist auf dem Chromosom 10q25 lokalisiert. Dieser Marker ist für Proliferationsuntersuchungen gut geeignet, da sein Substrat in allen proliferierenden Zellen unabhängig ihrer embryonalen Herkunft vorhanden ist und sie somit angefärbt werden46. PCNA: PCNA ist wohl das am häufigsten verwendete Antigen zur Abschätzung der Proliferationsaktivität. Dieses ist in seiner Expression innerhalb aller an der Proliferation beteiligten Zellzyklusabschnitten begründet. PCNA ist ein Hilfsprotein der DNA-Polymerase delta, welche im Kern der Zellen vorhanden und 36 kD schwer ist. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Initiation der Zellproliferation. Weiterhin dient es als Hilfsprotein bei DNA-Reparaturen. Es wird in der späten G1-, der S-, der G2- und der M-Phase synthetisiert. Zur immunhistochemischen Untersuchungstechnik steht ebenfalls ein paraffingängiger monoklonaler Antikörper zur Verfügung. Der Vorteil des von uns verwendeten Antikörpers liegt darin, daß er ein Epitop des Antigens anfärbt, welches in einer großen Anzahl von Tumoren ohne Mutationen synthetisiert wird und somit ohne Änderung der Aminosäurensequenz zur Expression gelangt. PCNA-Anfärbung ist eine einfache und klinisch hilfreiche Methode zur Bestimmung der Zellproliferation in formalin-fixierten und paraffin-eingebetteten Geweben. Eine enge reziproke Beziehung zwischen PCNA-Aktivität (innerhalb des Tumors selber und innerhalb seiner Metastasen) und Überlebensrate konnte für viele Neoplasien nachgewiesen werden32. Bei gemeinsamen Studien zu PCNA und p53 stellte sich heraus, daß eine Mutation des p53-Gens in den Aminosäurepositionen 175, 248, 273 oder 281 (diese werden am häufigsten in Tumoren gefunden) zu einer 2-11fach und somit signifikant gesteigerten Aktivität des PCNA-Promotors führt. Dieses führt wiederum zu einer erhöhten PCNA-Aktivität innerhalb der Zelle16. Seite 38 Angiogenese (CD 31) In diesem Kapitel sollen die Zusammenhänge zwischen Tumorwachstum und Regulation der Angiogenese dargestellt werden. Angiogenese allgemein ist die Fähigkeit von Zellen oder Zellverbänden Neovaskularisation zu induzieren. Ein wachsender Tumor benötigt ausreichend Blutgefäße innerhalb und außerhalb seiner Tumormasse, um die Versorgung jeder einzelnen seiner Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff sicherzustellen. Je größer der Durchmesser des Tumors ist, desto überproportional mehr Blutgefäße müssen ihm zur Verfügung stehen. Ohne ausreichende Blutversorgung könnte er nicht wachsen oder einzelne Zellen würden sogar absterben. Er könnte in vivo maximal 1-2 mm Durchmesser erreichen und eine effektive Metastasierung wäre somit nicht möglich. Ohne Neovaskularisation könnte keine Tumorzelle in die Blutbahn gelangen und nicht an einer tumorfernen Lokalisation „angehen“, um dort zur Metastase „heranzureifen“. Außerdem sezernieren die Endothelzellen wichtige parakrinwirkende Wachstumssubstanzen, die zur Proliferation der Tumorzellen beitragen können. Hierzu gehören zum Beispiel basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) oder colony-stimulating factors (CSF). Desweiteren produzieren die Endothelzellen degradierende Substanzen (Kollagenasen, Urokinase, Plaminogen-aktivator und andere) die den Tumorzellen das Aussprossen in und durch die sie umgebende Fibrin-Gel-Matrix und das umliegende Bindegewebsstroma hindurch ermöglichen55. Dadurch wird eine schnellere regionale Ausbreitung des Tumors ermöglicht. Angiogenetisch wirkende Faktoren können bei Patienten mit malignen Tumoren in höherem Maße im Urin oder Serum nachgewiesen werden als bei gesunden Kontrollgruppen14. Die Basalmembran von neugebildeten Mikrogefäßen ist fragmentiert. Es können daher Plasminogen, Fibrinogen und Thrombozyten austreten, welche zu einer Fibrinablagerung und Hyperkoagulation führen14. Andersherum kann die fragmentierte Basalmembran leicht von Tumorzellen in Richtung Lumen durchwandert werden. Eine Voraussetzung zur Metastasierung ist damit geschaffen. Durch den Anschluß der neuen Blutgefäße an das bereits bestehende Gefäßsystem können einzelne Tumorzellen in den hämatogenen oder lymphogenen Kreislauf des Seite 39 Wirtes gelangen und in entfernten Organen Metastasen setzen. Neben dem TNM-Stadium eines Tumors wird mittlerweile die AngiogeneseFähigkeit der Tumorzellen als weiterer unabhängiger Faktor für die Prognose des Patienten angesehen6. Onkogene haben neben ihrer Funktion als transformierendes Agens häufig noch eine direkt wirkende angiogenetische Funktion, wie dieses zum Beispiel bei epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGF-alpha) oder basic fibroblast growth factor (bFGF) der Fall ist. Andererseits können Onkogene die Zelle zur Produktion von angiogenetischen Faktoren stimulieren und somit auch indirekt zur Neoangiogenese beitragen. Der Verlust eines Tumorsuppressorgens innerhalb einer Zelle kann ebenfalls eine vermehrte Gefäßneubildung verursachen. Durch das Tumorsuppressorgen wird die Synthetisierung und Sekretion eines Inhibitors der Angiogenese, zum Beispiel Thrombospondin, in hoher Konzentration veranlaßt. Durch Wegfall beziehungsweise genetische Veränderung des Tumorsuppressorgens wird der Inhibitor der Angiogenese nur noch in geringer Konzentration synthetisiert und die Angiogenese somit nicht mehr effektiv gehemmt. P53 ist ein Tumorsuppressorgen, bei dessen Aktivierung die vermehrte Synthese eines Inhibitors der Angiogenese nachgewiesen werden konnte. Dieser Inhibitor seinerseits supprimiert Interleukin 6, welches wahrscheinlich eine angiogenetische Funktion aufweist14. Insgesamt wurde bei erhöhter intratumoraler Gefäßdichte eine erhöhte Tumoraggressivität und somit eine erhöhte Metastaseninzidenz und / oder verminderte Patienten-Überlebensrate gefunden23. Bei Non-small-cellular-lung-carcinoma konnte sogar demonstriert werden, daß Adenokarzinome eine signifikant höhere Gefäßdichte, eine höhere Rezidivrate und eine schlechtere Prognose als Plattenepithelkarzinome besitzen57. Die Gefäßdichte als Ausdruck der Angiogeneseaktivität eines Tumors kann innerhalb histologischer Schnitte mit verschiedenen Methoden bestimmt werden. Im Bereich Seite 40 der Immunhistochemie können Endothelzellen mit anti-Faktor VIII-Antikörpern, anti-CD31-Antikörpern oder anti-PAL-E-Antikörpern selektiert werden. Außerdem können perivaskuläre Stromazellen mit anti-CD34-Antikörpern angefärbt werden, welches aber zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen kann. Bei unseren Studien haben wir zur Bestimmung anti-CD31-Antikörper benutzt, da hiermit eine höhere Anzahl mikrovaskulärer Endothelzellen als mit anti-Faktor VIIIAntikörpern nachgewiesen werden kann. Außerdem ist eine höhere Spezifität vorhanden55. Seite 41 Ergebnisse Bei den durchgeführten Untersuchungen an zehn Karzinosarkomen der Lunge sowie drei Pulmoblastomen konnten wir folgende Ergebnisse erzielen: Bei der epidemiologischen Auswertung fanden sich bei den zehn untersuchten Karzinosarkomen sieben männliche und drei weibliche Patienten. Das Alter betrug im Durchschnitt 64,5 Jahre (52 bis 80 Jahre). Acht von diesen Tumoren waren in den Ober- und Mittellappen lokalisiert, hingegen nur zwei in den Unterlappen (siehe Tabelle 1). Abbildung 2 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 2, zentral wachsend, makroskopisch Seite 42 Abbildung 3 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 8, peripher wachsend, makroskopisch Abbildung 4 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 1, mesenchymaler Anteil, Hämatoxylin-EosinFärbung, Original-Vergrößerung 200x Seite 43 Abbildung 5 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 9, epithelialer Anteil, Hämatoxylin-EosinFärbung, Original-Vergrößerung 200x Bei acht Fällen zeigten die sarkomatösen und karzinomatösen Komponenten innerhalb desselben Tumors jeweils unterschiedlich hohe Proliferationsaktivitäten bei Gebrauch des Mib-1-Antikörpers. Bei den übrigen zwei Fällen war eine gleich hohe Proliferationsaktivität in den histologisch unterschiedlichen Anteilen nachzuweisen. Maximal wurden 90 % der Zellen innerhalb der epithelialen und maximal 90 % der Zellen innerhalb der mesenchymalen Fraktion angefärbt. Bei der Färbung mittels PCNA-Antikörper konnte in fünf Fällen eine gleichmäßige Anfärbung in beiden Tumoranteilen gezeigt werden. Drei Karzinosarkome ließen hingegen keinen Nachweis des PCNA-Antigens zu. Bei den übrigen zwei Tumoren war eine unterschiedlich hohe Proliferationsaktivität in den beiden Fraktionen vorhanden. Hier war jeweils die mesenchymale Komponente mit geringerer Aktivität ausgestattet. Die statistische Auswertung ergab einen signifikanten Unterschied zwischen der Anfärbung innerhalb der mesenchymalen und der epithelialen Komponente bei Benutzung der Ergebnisse aus der Mib-1-Untersuchung (T-Test für gepaarte Proben, p = 0,013). Der Nachweis des Ki-67-Antigens war in der epithelialen Komponente signifikant häufiger. Seite 44 Abbildung 6 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 4, epithelialer Anteil, Mib-1 (Ki-67)Expression, Avidin-Biotin-Methode, Verdünnung 1:20, Original-Vergrößerung 200x Abbildung 7 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 5, mesenchymaler und epithelialer Anteil, PCNA-Expression, Avidin-Biotin-Methode, Verdünnung 1:10, Original-Vergrößerung 400x Seite 45 Bei den Untersuchungen mittels p53-Antikörpern konnte in fünf von zehn Fällen eine Anfärbung in der mesenchymalen und / oder in der epithelialen Komponente der Karzinosarkome nachgewiesen werden. In drei Fällen war eine Anfärbung in beiden Komponenten erreicht worden (epithelial maximal 95 %, mesenchymal maximal 80 %). In den übrigen zwei Fällen war der Nachweis des p53-Antigens lediglich in der epithelialen Komponente (80 bzw. 95 %) möglich. Im Grenzbereich zur mesenchymalen Komponente waren lediglich weniger als 1 % der Zellen positiv gefärbt. Eine statistische Auswertung des Nachweises des p53-Antigens ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Tumoranteilen. Abbildung 8 - Karzinosarkom der Lunge, Fall cs. 2, mesenchymaler Anteil, p53-Akkumulation, Avidin-Biotin-Methode, Verdünnung 1:20, Original-Vergrößerung 200x Die Auswertung der relativen Gefäßdichte (gemessen an der Anfärbbarkeit mittels CD31-Antikörpern) ergab eine Schwankungsbreite von 1,5 bis 11,8 im Bereich der Tumorfront sowie 0,9 bis 12,0 im Tumorzentrum. An der Tumorfront war in sieben von zehn Fällen eine gemischte histologische Differenzierung (= sowohl epitheliale als auch mesenchymale Komponente) Seite 46 vorhanden (relative Gefäßdichte: 1,5 bis 11,8). Bei zwei Tumoren war eine epitheliale Differenzierung vorhanden (relative Gefäßdichte: 5,7 bis 5,8). In einem Fall war eine mesenchymale Komponente angelegt (relative Gefäßdichte: 11,3). Im Bereich des Tumorzentrums konnte in sieben Fällen eine getrennte Auswertung für die mesenchymale und die epitheliale Tumorkomponente durchgeführt werden. Bei der mesenchymalen Differenzierung war eine relative Gefäßdichte von 0,9 bis 12,0 vorhanden. Die epitheliale Komponente zeigte eine Dichte von 1,9 bis 8,7. In den übrigen drei Tumoren war eine gemischte histologische Differenzierung im Tumorzentrum mit einer relativen Gefäßdichte von 1,4 bis 4,2 vorhanden. Die mittlere Dichte von Gefäßen war an der Invasionsfront statistisch signifikant höher als im Tumorzentrum. Dies galt selbst dann, wenn epithelialer und mesenchymaler Anteil getrennt voneinander ausgewertet wurden (T-Test für gepaarte Proben, epithelial: p = 0,009, mesenchymal: p = 0,015). Bei Betrachtung der von uns untersuchten Karzinosarkomfälle in bezug auf ihr Metastasierungverhalten zeigte sich, daß bei Diagnosestellung des Primärtumors bereits bei drei Patienten mindestens eine Fernmetastase nachweisbar war. Bei sechs Patienten waren keine Fernmetastasen vorhanden und bei einem Patienten fehlen hierüber genaue Angaben in den Krankenunterlagen. Bei statistischer Untersuchung des Metastasierungsverhaltens in bezug auf die Mib1-Expression innerhalb der karzinomatösen Komponente zeigte sich eine signifikant längere durchschnittliche Überlebensdauer der Patienten mit einer höheren Proliferationsaktivität (Mann-Whitney-u-Test, p = 0,05). Im Follow-Up zeigt sich für die Patienten mit höherer Proliferationsaktivität eine geringere Wahrscheinlichkeit der Metastasenentwicklung (Mann-Whitney-u-Test, p = 0,013). Die weitere statistische Auswertung konnte keine signifikante Beziehung zwischen der durchschnittlichen Überlebensdauer der Patienten und der p53-Akkumulation oder der relativen Gefäßdichte zeigen. Unter den Pulmoblastomen waren zwei männliche Patienten und eine weibliche Patientin. Das Alter betrug im Durchschnitt 59 Jahre (54 bis 65 Jahre). Zwei dieser Seite 47 Tumore wuchsen in den oberen und einer in den unteren Lungenlappen. Bei einem Patienten konnten keine Follow-Up-Daten erhoben werden. Abbildung 9 - Pulmoblastom der Lunge, Fall pb. 1, peripher wachsend, makroskopisch Seite 48 Abbildung 10 - Pulmoblastom der Lunge, Fall pb. 3, biphasische Anteile, Hämatoxylin-EosinFärbung, Original-Vergrößerung 100x Alle drei untersuchten Pulmoblastome zeigten eine ähnlich hohe Proliferationsaktivität in beiden histologischen Tumorkomponenten. Dieses galt sowohl für die Anfärbung mittels Mib-1- als auch mittels PCNA-Antikörpern. Meistens waren bei der Anfärbung mit PCNA-Antikörpern mehr positive Zellen nachzuweisen. Interindividuelle Schwankungen traten zwischen 30 und 90 % auf. Da nur drei Untersuchungsfälle vorhanden sind, sind statistische Analysen nicht sinnvoll und werden deshalb nicht aufgeführt. Seite 49 Abbildung 11 – Pulmoblastom, Fall pb. 2, epithelialer und mesenchymaler Anteil, Mib-1-(Ki67)-Expression, Avidin-Biotin-Methode, Verdünnung 1:20, Original-Vergrößerung 100x Abbildung 12 – Pulmoblastom, Fall pb. 3, epithelialer Anteil, PCNA-Expression, Avidin-BiotinMethode, Verdünnung 1:10, Original-Vergrößerung 200x Eine Akkumulation von p53 (DO-1) konnte nur in einem einzigen Tumor Seite 50 nachgewiesen werden. Es waren hier 60 % der Zellen in beiden Anteilen anfärbbar. Eine Anfärbung mit p53-Antikörper (Pab 1801) konnte keine positiven Zellen nachweisen. Die übrigen beiden Fälle waren in bezug auf beide Epitope des p53Antigens negativ. Abbildung 13 – Pulmoblastom, Fall pb. 1, epithelialer Anteil, p53-Expression, Avidin-BiotinMethode, Verdünnung 1:20, Original-Vergrößerung 100x Bei zwei untersuchten Pulmoblatom-Fällen fand sich im Bereich der Tumorfront eine gemischte histologische Differenzierung. Die relative Gefäßdichte betrug hier zwischen 7,0 und 12,2. Bei dem übrigen Fall war eine mesenchymale Differenzierung vorhanden. Die relative Gefäßdichte war mit 13,7 zu bestimmen. Das Tumorzentrum konnte bei zwei Fällen getrennt für epithelialen und mesenchymalen Anteil ausgewertet werden (epithelial: 1,8 bis 6,4; mesenchymal: 4,6 bis 5,5). Bei einem Fall waren im Untersuchungsmaterial nur Anteile der Tumorfront vorhanden, so daß keine Auswertung für das Tumorzentrum erfolgen konnte. An der Invasionsfront von Pulmoblastomen konnte insgesamt tendentiell eine höhere mittlere Gefäßdichte als im Tumorzentrum nachgewiesen werden. Seite 51 Abbildung 14 – Pulmoblastom, Fall pb. 1, mesenchymaler Anteil, CD31-Expression, AvidinBiotin-Methode, Verdünnung 1:20, Original-Vergrößerung 100x Seite 52 Tabelle 4 - Ergebnisse in der Übersicht Fall: cs. = Karzinosarkom; pb. = Pulmoblastom e = epitheliale Differenzierung; m = mesenchymale Differenzierung; em = gemischte Differenzierung n. a. = not available Angaben bei Mib-1, PCNA und Pab 1801/DO-1 in Prozent aller Tumorzellen Fall Mib-1 Diff epitheli al eren zier ung Mib-1 PCNA mesench ymal epitheli al p53 p53 (Pab (Pab 1801 1801 und und DO-1) DO-1) mesench epitheli mesench ymal al ymal PCNA CD31 CD31 Tumorfront Tumorzentrum em: 1,4 em: 1,4 em: 4,2 e: 1,9; m: 1,7 e: 2,1; m: 2,2 e: 4,4; m: 3,1 e: 3,4; m: 0,9 e: 7,8; m: 7,5 e: 2,8; m: 7,8 cs. 1 cs. 2 cs. 3 cs. 4 40 % 15 % 15 % 10 % 40 % 5% 0% 2% 0% 70 % 30 % 35 % 0% 5% 30 % 35 % 0% 15 % 90 % 25 % 0% 20 % 0% 80 % em: 5,5 em: 1,5 em: 7,2 m: 11,3 cs. 5 40 % 0% 60 % 60 % 80 % 0% e: 5,7 cs. 6 70 % 2% 80 % 50 % 0% 0% em: 5,4 cs. 7 30 % 0% 0% 0% 0% 0% e: 5,8 cs. 8 10 % 0% 0% 0% 0% 0% em: 8,9 cs. 9 90 % 30 % 90 % 80 % 95 % em: 11,8 cs. 10 90 % 90 % 90 % 90 % 0% 80 % (DO-1) 25 % (Pab180 1) 0% em: 9,4 e: 8,7; m: 12,0 pb. 1 pb. 2 pb. 3 70 % 50 % 60 % 60 % 30 % 70 % 70 % 60 % (DO-1) 0% m: 13,7 30 % 60 % (DO-1) 0% em: 12,2 e: 6,4; m: 4,6 n. a. 60 % 60 % 90 % 80 % 0% 0% em: 7,0 e: 1,8; m: 5,5 Seite 53 Diskussion Karzinosarkome und Pulmoblastome sind relativ seltene maligne Tumore innerhalb der Lunge. Wir haben insgesamt zehn Karzinosarkome und drei Pulmoblastome im Rahmen dieser Arbeit immunhistochemisch auf das Vorkommen von Proliferationsantigenen (Mib-1, PCNA), Tumorsuppressorgen-Akkumulation (p53) und Neoangiogenese (CD31) untersucht. Bei den Karzinosarkomen fand sich ein Verhältnis von 2,3 : 1 zwischen männlichen und weiblichen Betroffenen. Dieses ist im Gegensatz zur allgemeinen Literatur deutlich niedriger (normal 5 – 9 : 1)29. Als Ursache des festgestellten Unterschieds kommt die geringe Fallzahl von lediglich zehn untersuchten Fällen in Betracht. Die bevorzugte Wachstumsregion liegt bei unserer Untersuchung, wie in der allgemeinen Literatur auch, in den oberen Lungenlappen. Das Durchschnittsalter der betroffenen Patienten lag bei Stellung der Erstdiagnose bei 64,5 Jahren. Dieses stimmt mit den gefundenen Literaturangaben überein29. Es bestand kein einheitliches therapeutisches Vorgehen, so daß alle bekannten Therapieverfahren (operative Entfernung des Turmors, Chemotherapie und Strahlentherapie) zur Anwendung gelangten. Eine Vereinheitlichung erscheint auch schwierig, da eine geringe Inzidenz der Karzinosarkome vorliegt und somit größere Studien zur Therapie schwer zu realisieren sind. Besonderheiten bezüglich ihres biphasischen Wachstumsverhaltens können deshalb nicht eindeutig festgestellt werden. Als einzige für den Patienten Erfolg versprechende Therapieoption scheint jedoch, wie bei allen Entitäten der Non-small-cellular-lung-carcinoma, die operative Entfernung zu sein, sofern diese von den äußeren Gegebenheiten her vertretbar ist. Die Prognose dieser Entität von Lungentumoren ist schlecht und hat sich trotz vieler neuerer Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren nicht wesentlich verbessert. Die mittlere Überlebenszeit liegt bei neun bis zwölf Monaten nach Diagnosestellung und nur 25 % der Patienten überleben zwei oder mehr Jahre. Die längste berichtete Überlebenszeit beträgt 6 Jahre3. Beim Vergleich der Überlebenszeiten von pulmonalen Karzinosarkomen mit denen von Adeno- oder Plattenepithelkarzinomen der Lunge kommt Huwer24 zu dem Seite 54 Ergebnis, daß deren Prognose unterschiedlich ist. Er stellt fest, daß die Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten mit Karzinosarkomen hauptsächlich von der Prognose des mesenchymalen Anteils abhängen würde. Bei malignen rein mesenchymalen Geschwülsten, den Sarkomen, ist die Prognose ebenfalls sehr schlecht, da diese Tumore zu frühzeitiger hämatogener Metastasierung und häufigen lokalen Rezidiven neigen. Dieses spezifische Verhalten ist unabhängig von der histologischen Subentität des Sarkoms, dem Ursprungsgewebe und dem anatomischen Sitz der Neoplasie. Die wichtigste Determinierung für das biologische Verhalten und die Gesamtprognose ist der Grad der histo- und cytologischen Differenzierung. Ab einer Tumorgröße von sechs Zentimetern Durchmesser findet sich eine wesentlich schlechtere Prognose als bei kleineren Tumoren29. Tumore in zentraleren Anteilen des bronchialen Systems werden frühzeitig symptomatisch, somit eher entdeckt und therapeutisch zugänglich. Sie haben dadurch eine bessere Prognose als im Bronchialbaum peripherer gelegene Neoplasien. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Pulmoblastome untersucht. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Betroffenen lag bei 2 : 1. Eine statistische Beurteilung erscheint jedoch bei der kleinen Fallzahl nicht sinnvoll. Das durchschnittliche Erkrankungsalter betrug 59 Jahre (54 – 65 Jahre) , so daß hier ausschließlich Tumore des Erwachsenenalters vorliegen. Auch diese Tumore waren überwiegend in den oberen Lungenpartien entwickelt. Als einzige Behandlungsoption kam die operative Entfernung ohne adjuvante Chemo- oder Strahlentherapie zum Einsatz. Auch bei dieser Tumorentität können auf Grund der nur geringen Fallzahl keine statistisch signifikanten Aussagen zu den unterschiedlichen Therapiemöglichkeiten gemacht werden. Die chirurgische Resektion gilt als Therapie der Wahl beim Erwachsenen-Typ des Pulmoblastoms. Hierbei kann eine mittlere Überlebensdauer von 33 Monaten im Gegensatz zu zwei Monaten ohne chirurgische Intervention erreicht werden. Bei einem palliativen Therapieansatz kann eine Polychemotherapie durchgeführt werden, Seite 55 obwohl deren Effektivität nicht bewiesen ist30. Bei biphasischen Pulmoblastomen gibt es in 40 - 50 % ein Rezidiv, welches meistens innerhalb des Thoraxes auftritt. Es kann aber auch an entfernten Stellen gelegen sein. Patienten mit biphasischen Pulmoblastomen weisen eine ähnlich schlechte Überlebensprognose wie gewöhnliche Karzinome der Lunge auf. Zwei Drittel der Patienten mit biphasischen Tumoren versterben innerhalb von zwei Jahren nach Diagnosestellung, 16 % überleben fünf Jahre und nur 8 % überleben zehn Jahre30. Die Überlebensrate hängt vom Ausbreitungsstadium des Tumors ab. Im Stadium I besteht eine 5-Jahres-Überlebensrate von 25 %. Die monophasischen Subtypen des Pulmoblastoms besitzen hierzu unterschiedliche Prognosen. Epitheliale Pulmoblastome rezidivieren in ungefähr 30 % der Fälle, meist als pulmonales Lokalrezidiv. In fortgeschrittenen Stadien kommt es zu Infiltration der Brustwand, Metastasierung in hiläre, periaortale und mediastinale Lymphknoten sowie zu einer zerebralen Metastasierung. Die Gesamtprognose epithelialer Pulmoblastome ist generell besser als die des biphasischen Subtyps. Die tumorbedingte Mortalität beträgt bei epithelialen Pulmoblastomen nur 10 - 14 %. Diese geringere Mortalität kann man auf eine geringere biologische Aggressivität und die vorwiegend pulmonale Rezidivneigung zurückführen, da hier eine leichtere Diagnose und Therapie des Rezidivs möglich ist30. Auch bei den Pulmoblastomen kann davon ausgegangen werden, daß der sarkomatöse Anteil für die insgesamt schlechte Prognose hauptsächlich verantwortlich ist. Eine Aussage zu der Beziehung zwischen Tumorentwicklung und dem inhalativen Genuß von Tabakrauch ist in dieser Arbeit auf Grund fehlender anamnestischer Daten nicht möglich, eine positive Korrelation ist jedoch sehr wahrscheinlich. Tumorsuppressorgen (p53): Die Mutation des Tumorsuppressorgens p53 ist ein entscheidender Schritt bei der Transformation einer gesunden zur malignen Zelle. P53 ist das häufigste veränderte Gen in Tumoren des menschlichen Körpers. In ungefähr 50 % aller Non-smallSeite 56 cellular-lung-carcinoma ist eine Mutation von p53 nachweisbar33. Auf Grund seiner Quartärstruktur setzt sich das p53 zu einem Tetramer oder Oligomer zusammen. Selbst bei nur heterozygoter Mutation des p53 enthält statistisch gesehen somit jeder Quartärkomplex ein mutiertes p53-Protein. Das Tetramer oder Oligomer kann in dieser Zusammensetzung seine „normale“ Funktion nicht ausüben und führt somit zur Transformation der Bronchialepithelzelle (negative Dominanz). Eine gleichmäßig hohe p53-Akkumulation wurde in beiden Anteilen (epithelial bzw. mesenchymal) von acht Karzinosarkomen gefunden (drei positiv, fünf negativ). In zwei Fällen wurde eine p53-Akkumulation der Epitope Pab-1801 und Do-1 nur innerhalb der epithelialen Komponente und in einigen fusiformen Zellen im Bereich der Grenze zu diesem Anteil gefunden. Diese fusiformen Zellen waren im Randbereich zu eindeutig epithelial differenzierten Zellen gelegen. Die übrigen mesenchymalen Zellen waren negativ. Aus diesen Gründen gehen wir davon aus, daß die fusiformen Zellen ebenfalls epithelialen Ursprungs sind. Eine Untersuchung von 74 Karzinosarkomen (= maligner Müller-Mischtumor) des weiblichen Genitaltraktes, einer Unterform des Müller-Epitheltumors, bestätigt unsere Ergebnisse. Es konnte in zwei verschiedenen Epitopen eine ähnlich hohe Ausprägung der p53-Akkumulation gezeigt werden. Der Nachweis der p53Akkumulation konnte in 46 % beziehungsweise 54 % in beiden Anteilen, in 9,5 % beziehungsweise 8,1 % in dem epthelialen und in 5,4 % beziehungsweise 2,7 % in dem mesenchymalen Anteil alleine nachgewiesen werden12. Analoge Resultate wurden auch in weiteren Untersuchungen gefunden36. Im Gegensatz dazu konnten wiederum andere Untersuchungen eine p53-Akkumulation ausschließlich im mesenchymalen Anteil von Karzinosarkomen des Ösophagus nachweisen9. In den von uns untersuchten Pulmoblastomen war die Akkumulation von p53 in beiden Komponenten gleichwertig (einmal positiv, zweimal negativ). Dieses korrespondiert mit einer Untersuchung, in der keine Akkumulation von p53 innerhalb eines Pulmoblastoms nachgewiesen werden konnte56. In der vorgelegten Arbeit konnte keine Korrelation zwischen p53-Akkumulation, Seite 57 Metastasenentwicklung und Tumorprogression für Pulmoblastome nachgewiesen werden. Dieses steht im Einklang zu Untersuchungen von Walker54, der ebenfalls keine Korrelation zwischen p53-Akkumulation (DO-1) und der Überlebensprognose der Patienten finden konnte. Im Gegensatz dazu konnte Morkve39 eine positive Korrelation bei fehlender oder sehr hoher Akkumulation von p53 (Pab 1801) aufstellen, er benutzte allerdings die Methode der Flow-Cytometrie zum Nachweis der p53-Akkumulation. Bei Non-small-cellular-lung-carcinoma unterschiedlicher Tumorstadien besteht eine reziproke Korrelation zwischen p53-Akkumulation und Überlebensprognose sowie eine positive Korrelation zwischen p53-Akkumulation und Metastasierungshäufigkeit. Diese wurde sowohl von Levine als auch von Moldvay gezeigt 33, 38. Bei Stadium I und II Non-small-cellular-lung-carcinoma, die komplett reseziert werden konnten, konnte von Cagini keine Abhängigkeit von p53-Expression und durchschnittlicher Überlebensdauer gezeigt werden6. Die reziproke Korrelation zwischen p53-Akkumulation und Überlebenswahrscheinlichkeit trifft nach unseren Untersuchungen nicht auf Karzinosarkome der Lunge zu. Sie unterscheiden sich deutlich von den übrigen Non-small-cellular-lungcarcinoma und von vielen anderen Tumorentitäten, bei denen eine statistisch schlechtere Therapieeffektivität sowie durchschnittliche Überlebensdauer bei erhöhter p53-Akkumulation nachgewiesen werden konnte33. Eine Hypothese zur schlechteren Therapieoption auf Grund einer p53-Mutation besagt, daß Zellen mit mutiertem p53 die durch Chemotherapeutika oder Strahlentherapie gesetzten DNASchäden schlechter als Tumore mit Wildtyp-p53 reparieren können. Wildtyp-p53 hält den Zellzyklus so lange an, bis die Schäden ausgebessert sind. Falls dieses nicht möglich ist, führen sie die Zelle in die Apoptose. Ein schnelles Wachstum des malignen Tumors kommt folglich in geringerem Ausmaß als bei Zellen mit mutiertem p53 vor. Insgesamt resultiert somit eine bessere Überlebenschance für Patienten mit Wildtyp-p53 in ihren Tumoren. Seite 58 Proliferationsaktivität (Mib-1, PCNA): Die Proliferationsaktivität wird mittels sogenannter Proliferationsantigene bestimmt. Die Antigene werden zyklusabhängig von der Zelle synthetisiert und Antikörper gegen sie können somit immunhistochemisch proliferierende Zellen und Gewebe anfärben. Mib-1 (Ki-67) und PCNA korrelieren in ihrer Expression gut untereinander, so daß sie gleichwertig zum Einsatz kommen können. Die Expression der Antigene Ki-67 (Mib-1) und PCNA erfolgt in der späten G1-, der S-, der G2- und der M-Phase. Sie werden jedoch in der frühen G1-Phase nicht ausgebildet, so daß einige Zellen, die sich in diesem Abschnitt der Proliferationsphase befinden, als falsch-negativ bewertet werden. Außerdem führt eine Unterversorgung der Tumorzellen mit Nährstoffen und Sauerstoff zu einem Verlust des Ki-67-Antigens und die Zellen werden somit ebenfalls als falsch-negativ bewertet52. Es ist vorstellbar, daß die für diese Untersuchung benutzten histologischen Schnitte aus einem Gebiet des Tumors stammen, der in vivo nur vermindert Nährstoffe und Sauerstoff erhalten hat und somit das Ki-67-Antigen nicht nachweisbar ist. Die Bestimmung der Proliferationsaktivität hängt somit auch davon ab, an welcher Lokalisation des Tumors die Proliferation nachgewiesen wird (Tumorfront oder Tumorzentrum), da hier eine unterschiedliche Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff stattfindet. Beide oben genannten Gründe führen dazu, daß die gemessene, im Gegensatz zur tatsächlichen, Proliferationsaktivität geringer ausfällt. Die in der vorgelegten Arbeit bestimmte Proliferationsaktivität mit PCNAAntikörpern tendierte insgesamt zu einem höheren Wert als die mit Mib-1Antikörpern gemessene; ein statistisch signifikanter Unterschied konnte jedoch nicht gezeigt werden. Dieses steht im Einklang zur Literatur, die bereits eine gute Korrelation beider Antigene untereinander beschreibt20. Eine Erklärung dieses Unterschieds ergibt sich aus dem im vorherigen Abschnitt dargelegten. Das Ki-67-Antigen besitzt einen hohen positiven prediktiven Wert für die Entwicklung vieler Arten von malignen Tumoren. In den meisten Tumorentitäten korreliert die Expression von Ki-67 sehr gut mit dem Tumorgrading und der Anzahl der Mitosen. Eine ausgeprägte inverse Korrelation zwischen Expression und Seite 59 Überlebensrate wird bei Mamma-Karzinomen, malignen Melanomen, malignen Lymphomen, multiplen Myelomen, Prostata-Karzinomen, Lungen-Karzinomen und Weichteil-Sarkomen gefunden46. Es gibt auch Tumortypen, bei denen keine Korrelation zwischen Ki-67-Expression und Überlebensrate vorhanden ist. Hierzu gehören zum Beispiel kolorektale Karzinome. Die prognostische Bedeutung der Expression des Ki-67-Antigens liegt in der Abschätzung der kurzfristigen Überlebensrate bei Patienten mit unterschiedlicher Expressionsquantität. Für die ersten zwei Jahre nach Operation eines malignen Lungentumors haben Patienten mit niedriger Expression eine bessere Überlebenschance als Patienten mit mäßiger oder hoher Expression. Die 5-JahresÜberlebensrate ist jedoch alleine von der histologischen Tumorart und deren Ausbreitung (TNM-Stadium) abhängig51. Also kann die Ki-67-Antigen-Quantität als Marker der kurzfristigen Überlebenswahrscheinlichkeit gelten. Sie könnte somit als Unterstützung der Entscheidung für eine adjuvante Chemo- oder Strahlentherapie herangezogen werden. Ähnliche Ergebnisse konnten auch bei Untersuchungen mittels PCNA-Antikörpern erhoben werden7, 8. Eine höhere Proliferationsaktivität (gemessen mit den Markern PCNA und Mib-1) bei pulmonalen Karzinosarkomen zeigte jedoch eine signifikant längere durchschnittliche Überlebensdauer für den jeweiligen Patienten. Dieses steht im Gegensatz zu den oben genannten Angaben und weiteren Studien, die eine reziproke Beziehung zwischen Überlebensdauer und Proliferationsindex auch bei Patienten mit resezierten Non-small-cellular-lung-carcinoma beschreiben32. Wie schon bei der p53-Aktivität gezeigt, treffen bei Karzinosarkomen die allgemeinen Kriterien für die Non-small-cellular-lung-carcinoma auch in bezug auf die Proliferationsaktivität nicht zu. Das Karzinosarkom der Lunge stellt somit in seinem Aggressivitätsverhalten ebenfalls eine Sonderform unter den Lungentumoren dar. In einer Studie über Granulosazelltumore des Ovars wurde, wie auch in unserer Studie, eine positive Korrelation zwischen Proliferationsaktivität und durchschnittlicher Überlebensdauer festgestellt13. Hingegen konnte in Studien über sklerosierende epitheloide Fibrosarkome und extrauterine Leiomyosarkome keine Korrelation zwischen diesen beiden Parametern gezeigt werden37, 44. Das im Gegensatz zu anderen Tumoren unterschiedliche Verhalten in bezug auf Seite 60 Proliferationsaktivität der Karzinosarkome könnte auf ihr biphasisches Wachstum zurückzuführen sein. Da die Karzinosarkome die epitheliale Komponente mit den übrigen Non-small-cellular-lung-carcinoma gemeinsam haben, ist ihr Wachstumsund Aggressivitätsverhalten möglicherweise stark von der zweiten, also der mesenchymalen Komponente beeinflußt. Dieses kann durch die Beobachtung unterstrichen werden, daß sich innerhalb der epithelialen Komponente der Karzinosarkome eine signifikant höhere Proliferationsaktivität als in der mesenchymalen Komponente nachweisen läßt. Da die sarkomatöse Komponente eine geringere Proliferationsaktivität aufweist und sie für die durchschnittliche Überlebensdauer größtenteils verantwortlich scheint, besitzen unseren Untersuchungen zufolge Karzinosarkome bei erhöhter Proliferationsaktivität innerhalb des karzinomatösen und somit relativ gesehen erniedrigter Aktivität innerhalb des sarkomatösen Anteils eine insgesamt bessere Überlebensprognose. Dieses steht im Einklang mit Untersuchungsergebnissen von Nephroblastomen, bei denen die Stroma- und die blastomatösen Zellen ebenfalls eine geringere Proliferationsaktivität bei längerer durchschnittlicher Überlebensdauer aufweisen26. Allerdings steht es im Widerspruch zu der allgemeinen Literatur zur Prognose von Karzinosarkomen. Hierin wird von einer schlechten Prognose auf Grund des beinhaltenden malignen mesenchymalen Anteils berichtet (siehe oben). Im Gegensatz zu Karzinosarkomen findet sich bei Pulmoblastomen kein signifikanter Unterschied hinsichtlich Tumorkomponenten; eine der Proliferationsaktivität gleichmäßigere zwischen Zellproliferation kann beiden hierfür verantwortlich sein. Eine Auswertung in bezug auf die durchschnittliche Überlebensdauer der Patienten konnte bei einer so kleinen Fallzahl (drei Fälle) nicht sinnvoll durchgeführt werden. Angiogenese (CD31): Angiogenese ist die Fähigkeit von Zellen oder Zellverbänden, Neovaskularisation oder Wachstum von Blutgefäßen zu induzieren. Der CD31-Antikörper markiert ein Antigen innerhalb von Endothelzellen und färbt somit Blutgefäße innerhalb von Geweben, auch von malignen, an. Seite 61 Die Tumorgefäßdichte gilt als prognostischer Überlebensindikator sowohl in Smallals auch in Non-small-cellular-lung-carcinoma19. Je höher die Gefäßdichte ist, desto schlechter ist die Überlebenswahrscheinlichkeit. Desweiteren besteht eine erhöhte Metastasierungsrate bei erhöhter Gefäßdichte. Dieses ist unabhängig von anderen Faktoren wie TNM-Stadium, p53-Akkumulation oder Quantität von Proliferationsantigenen6. Bei Non-small-cellular-lung-carcinoma besteht außerdem der signifikante Unterschied, daß Adenokarzinome eine höhere Gefäßdichte, eine höhere Rezidivrate und eine insgesamt schlechtere Prognose als Plattenepithelkarzinome besitzen57. In der vorliegenden Untersuchung über Karzinosarkome und Pulmoblastome der Lunge konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen der durchschnittlichen Überlebensdauer des Patienten und der Mikrogefäßdichte nachgewiesen werden (p > 0,05). Die Gefäßdichte zeigte jedoch einen signifikanten Unterschied zur proliferativen Aktivität der Tumorzellen. Ebenfalls konnte keine Korrelation zwischen der Gefäßdichte in den unterschiedlichen Tumoranteilen und der Differenzierung der Metastasen hergestellt werden. Die Gefäßdichte des Primärtumors scheint somit für die Ausbildung von Metastasen nicht ausschlaggebend zu sein. Somit trifft erneut das für Non-small-cellular-lung-carcinoma nachgewiesene nicht auf Karzinosarkome oder Pulmoblastome zu. Dieses könnte wiederum an der biphasischen Tumorzusammensetzung liegen. Es wurde bei beiden Tumorentitäten insgesamt eine höhere Gefäßdichte im Bereich der Invasionsfront im Gegensatz zur Gefäßdichte im Bereich des Tumorzentrums gefunden. Dieses kann im Rahmen des zentrifugalen Wachstums eines Tumors gesehen werden. Die vom Mittelpunkt weit entfernten Zellen erhalten über die vermehrte Blutversorgung viele Nährstoffe und viel Sauerstoff zum schnellen Wachstum. Der Tumor wächst weiter nach außen und kann somit die Destruktion des umgebenden Gewebes fortsetzen. Im Zentrum des Tumors sind auf Grund der niedrigeren Gefäßversorgung weniger Nährstoffe und Sauerstoff vorhanden, so daß dort ein Zelluntergang stattfindet und Nekroseareale entstehen. Dieses ist ein häufiges Phänomen besonders in größeren Tumoren. Seite 62 Die Neovaskularisation innerhalb maligner Tumoren kann mittlerweile als Angriffspunkt einer spezifischen Therapie eingesetzt werden. Es wird ein sogenanntes Immunotargeting Endotheloberflächenprotein durchgeführt. (hier: Ein Antikörper gegen platelet-endothelial-adhesion-molecule ein 1 = PECAM 1) wird über eine Biotin-Streptavidin-Verbindung mit einem Medikament (z. B. einem Chemotherapeutikum) gekoppelt und somit gezielt an neugebildete Gefäße herangebracht, wo das Medikament seine Wirkung entfalten kann. Tumore mit hoher Gefäßneubildung sind möglicherweise dadurch besser zu erreichen als Tumore mit geringer Neubildung von Gefäßen40. Histogenese: Die histogenetische Entstehung von Karzinosarkomen und Pulmoblastomen ist sehr unterschiedlich (siehe oben), trotzdem wurden bereits Mischformen zwischen beiden Tumoren beschrieben43. Dieses ist auch gut verständlich, da beide Tumorarten biphasisch sind und lediglich der primitive beziehungsweise embryonale Charakter der Pulmoblastome als Unterscheidungsmerkmal vorhanden ist. Da beide Tumorentitäten biphasisch sind, ist es nicht überraschend, daß in bezug auf die Proliferationsaktivität, die p53-Akkumulation oder die Gefäßdichte kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Tumorentitäten nachgewiesen werden konnte. Weitere Untersuchungsmöglichkeiten: Zur weiteren Einschätzung von Prognosefaktoren sind noch folgende Untersuchungen der biphasischen Tumore Karzinosarkome und Pulmoblastome denkbar. Zum Beispiel steht die Auswertung des Apoptose-Indices zur Verfügung. Bei Nonsmall-cellular-lung-carcinoma konnte gezeigt werden, daß dieser unabhängig vom Proliferationsindex als prognostischer Faktor vorhanden ist. Ein hoher ApoptoseIndex spricht für eine gute Überlebenswahrscheinlichkeit des Patienten. Die Bestimmung des Indices könnte sowohl an Karzinosarkomen als auch an Pulmoblastomen durchgeführt werden. Eine Anfärbung der entsprechenden Schnitte Seite 63 mit der TUNEL-Färbung zeigt lichtmikroskopisch apoptotische Zellkerne dunkelbraun und nicht-apoptotische blau-grün an35. MDM2-mRNA-Expression wird weiterhin als unabhängiger prognostischer Faktor bei Non-small-cellular-lung-carcinoma beschrieben. Die Expression läßt sich auch immunhistochemisch nachweisen, so daß diese an Karzinosarkomen und Pulmoblastomen bestimmt werden kann. Es konnte gezeigt werden, daß die hohe Expression von MDM2-mRNA eine bessere Überlebenswahrscheinlichkeit als die geringe oder sogar fehlende Expression bietet27. Diese kann für biphasische Tumore überprüft werden. 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Sept. 1969 in Gummersbach Familienstand verheiratet seit 25. Feb. 2000 Konfession evangelisch Beruf 05/1999 Erteilung der Erlaubnis zur vorübergehenden Ausübung des ärztlichen Berufes 06/1999 bis 11/2000 Arzt im Praktikum in der Medizinischen Abteilung des Evangelischen Krankenhauses in Herne, CA Prof. Dr. Hackenberg 09/2000 Erteilung der Fachkunde im Strahlenschutz 12/2000 Erteilung der Approbation als Arzt 12/2000 bis 03/2002 Assistenzarzt in der Medizinischen Abteilung des Evangelischen Krankenhauses in Herne, CA Prof. Dr. Hackenberg 04/2002 bis 09/2003 Assistenzarzt in der Medizinischen Klinik der Evangelischen Kliniken Gelsenkirchen, CA Prof. Dr. Doberauer seit 10/2003 Assistenzarzt in der Medizinischen Abteilung des St. Vincenz-Krankenhauses in Datteln, CA Prof. Dr. Grün Hochschulausbildung 10/1992 bis 05/1999 Examina 09/1994 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Bestehen der ärztlichen Vorprüfung (Note: gut) 08/1995 Bestehen des ersten Staatsexamens der ärztlichen Prüfung (Note: befriedigend) 04/1998 Bestehen des zweiten Staatsexamens der ärztlichen Prüfung (Note: gut) 05/1999 Bestehen des dritten Staatsexamens der ärztlichen Prüfung (Note: gut) 05/1999 Bestehen der ärztlichen Prüfung (Gesamtnote: gut) Famulaturen 02/1995 bis 03/1995 Abteilung für allgemeine und spezielle Pathologie der Ruhr-Universität Bochum, CA Prof. Dr. Morgenroth 02/1996 bis 03/1996 II. Medizinische Klinik des Klinikums rechts der Isar in München, CA Prof. Dr. Classen 08/1996 bis 09/1996 Kinderklinik der Charité der Humboldt-Universität zu Berlin, CA Prof. Dr. Gaedicke 09/1996 bis 10/1996 Abteilung für Hämatologie und Onkologie der Augusta-Kranken-Anstalt in Bochum, CA Prof. Dr. Bremer Tertiale des Praktischen Jahres 04/1998 bis 08/1998 Neurologische Klinik des Knappschaftskrankenhauses in Recklinghausen, CA Dr. Laubenthal 08/1998 bis 11/1998 Klinik für Allgemein- und Unfallchirurgie des Knappschaftskrankenhauses in Recklinghausen, CA Prof. Dr. Büsing 11/1998 bis 03/1999 Klinik für Innere Medizin des Knappschaftskrankenhauses in Recklinghausen, CA Prof. Dr. Loos Schulausbildung 09/1976 bis 06/1980 Besuch der Grundschule "Auf der Wahr" in Meinerzhagen 08/1980 bis 05/1989 Besuch des evangelischen Gymnasiums "Auf dem Bamberg" in Meinerzhagen 05/1989 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife Sonstige Kenntnisse EDV Betriebssystem Windows Textverarbeitung Word for Windows (inklusive Programmierung in Visual Basic for Applications) Tabellenkalkulation Excel Zeichenprogramm Corel Draw Internet-Recherche Castrop-Rauxel, 13. Oktober 2003 Abstract Zorn Matthias Proliferationsaktivität, p53-Expression und Angiogenese bei pulmonalen Karzinosarkomen und Pulmoblastomen. Problem: Karzinosarkome und Pulmoblastome sind seltene biphasische Tumoren innerhalb der Lunge. Die Karzinogenese ist als ein mehrschrittiges Ereignis entschlüsselt worden. Die Proliferations-Aktivität, die Quantität der Tumorsuppressorgen-Vervielfachung und die Angiogenese leisten einen wichtigen Beitrag zu ihrem Verständnis. Bei biphasischen Tumoren ist die getrennte Auswertung der zuvor genannten Merkmale für die epitheliale und mesenchymale Komponente in Bezug auf die Überlebensprognose, die Entwicklung von Metastasen und Rezidivhäufigkeit von Interesse. Methode: Zehn pulmonale Karzinosarkomen und drei Pulmoblastome wurden mittels monoklonaler Antikörper gegen das Ki-67-Antigen (Mib-1), PCNA, p53 (Pab 1801 und DO-1) sowie gegen CD31 immunhistochemisch untersucht. Ergebnis: Hierbei zeigte sich bei den Mib-1 untersuchten Fällen eine signifikant höhere proliferative Aktivität in der epithelialen im Gegensatz zur mesenchymalen Komponente (p = 0,013). In drei Pulmoblastomen vom biphasischen Subtyp war eine gleichmäßige Proliferation in beiden Subkomponenten zu finden. In fünf von zehn Karzinosarkomen und in einem von drei Pulmoblastomen konnte eine Anhäufung von den p53-Epitopen Pab 1801 und/oder DO-1 nachgewiesen werden. Im Bereich der Tumorfront fand sich eine signifikant höhere Gefäßdichte im Vergleich zur Tumorkernzone (epithelial: p = 0,009; mesenchymal: p = 0,015) bei Gebrauch eines monoklonalen Antikörpers gegen CD31 (Endothel). Diskussion: Eine höhere proliferative Aktivität der Karzinosarkome war mit einer signifikant längeren durchschnittlichen Überlebensdauer (p = 0,05) und geringeren Metastasierungshäufigkeit (p = 0,013) der entsprechenden Patienten während des follow-up vergesellschaftet. Dieses steht im Gegensatz zu sonstigen Untersuchungen über Non-small-cellular-lung-cancer. Dieses Ergebnis deutet auf ein unterschiedliches biologisches Verhalten der untersuchten biphasischen Tumore hin.
