Aminosäuren und Proteine

Aminosäuren und Proteine
1.
Die Aminosäuren
1.1. Aufbau
1.2. Zwitterion
1.3. Optische Aktivität
1.4. Die 20 Aminosäuren
1.5. Einteilung der Aminosäuren
1.6. Der isoelektrische Punkt (IEP)
AB: Die 20 Aminosäuren
1.7. pH-Abhängigkeit der Aminosäuren
1.8. Die Elektrophorese
Folie: Elektrophorese (Prinzip)
2
2
2
2
3
3
3
4
5
5
6
2.
Dipeptide und Polypeptide
2.1. Kondensationsreaktion
2.2. Die Peptid-Bindung
2.3. Einteilung
2.4. Peptidsynthese im Labor
Folie: Peptidsynthese im Labor
7
7
7
7
8
9
3.
Struktur der Proteine
3.1. Primärstruktur
3.2. Sekundärstruktur
3.3. Tertiärstruktur
3.4. Quartärstruktur
3.5. Denaturierung
3.6. Anhang: vgl. Literaturhinweis
AB: Struktur der Proteine
Folie: Insulin
10
10
10
11
11
11
11
12
13
Folie: Häm
Folie: Tertiärstruktur – stabilisierende Bindungen
13
14
4.
4.1.
4.2.
4.3.
15
15
15
15
Nachweisreaktionen
Die Xanthoproteinreaktion
Die Biuretreaktion
Die Ninhydrinreaktion
5.
Chromatographie
15
5.1. Chromatographie / Grundlagen
15
5.2. Chromatographie von Aminosäuren
15
16
AB: Nachweisreaktionen auf Aminosäuren
Folie: Ninhydrin/Biuret
17
18
AB: Grundlagen: Chromatografie
19
AB: Chromatografie-Versuche
AB: Identifikation durch Chromatografie
20
AB: Chromatografie-Versuche/Ergebnisse 2002 21
AB: Chromatografie-Versuche/Ergebnisse 2005 22
23
AB: Chromatografie-Versuche/Simulation
6.
Bedeutung der Aminosäuren
24
6.1. Komplex: Ernährung/Stoffwechsel/Gesundheit 24
6.2. Komplex: Landwirtschaft
24
6.3. Komplex: Medizin
24
25
AB: Die Bedeutung der Aminosäuren
26
Folie: Proteinbedarf / Funktionen
27
Folie: Mangelfolgen / essentielle Aminosäuren
Anmerkung: es gibt kaum Quellenangaben, diese Materialien sind ausschließlich zur Nachbereitung meines Unterrichts
vorgesehen, nicht für eine weitere Veröffentlichung.
Bei den Seiten mit dem Unterrichtsgang stehen links die Regieanweisungen (Symbole hoffentlich selbsterklärend) und
rechts der Tafelanschrieb.
Aminosäuren und Proteine – 1
– Aufbau von Aminosäuren
– α-Aminosäuren, optische Aktivität
Themen/Lernziele:
B. Aminosäuren und Proteine
1.
Die Aminosäuren
1.1. Aufbau
V
Beis piele
V
Versuch:
Wasser + Mg
Aminosäure-Lsg. + Mg
Beobachtung: schwache Gasentwicklung starke Gasentwicklung
Ergebnis:
Aminosäuren haben Säurecharakter
Versuch:
Eine Aminosäure wird erhitzt
Beobachtung: Geruch nach Ammoniak (NH3), mit HCl bildet
sich ein weißer Rauch (NH4Cl), feuchtes pH-Papier
zeigt eine Base an.
Ergebnis:
Aminosäuren enthalten eine basische NH2-Gruppe
Aminosäuren haben (mind.) zwei funktionelle Gruppen:
Modelle
Aminogruppe:
Carboxylgruppe:
–NH2
–COOH
COOH
alle in der Natur zum Aufbau von Eiweiß
H2N
(Proteinen) vorkommenden und genetisch
codierten Aminosäuren sind α-Aminosäuren:
C*
H
R
1.2. Zwitterion
Einige Eigenschaften der Aminosäuren lassen sich mit dieser
Struktur nicht erklären:
– hohe Schmelztemperatur (z.T. zersetzen sie sich)
– gute Wasserlöslichkeit
– allg. salzartiger Charakter (spröde, kristallin, „Ionengitter“)
Aminosäuren liegen in einer
zwitterionigen Form vor.
Wdh.
1.3. Optische Aktivität
anderes α als bei den
Kohlenhydraten
COO
H3N
C*
H
R
Alle Aminosäuren (bis auf Glycin) haben ein asymetrisches
α-C-Atom, sie sind also optisch aktiv:
In den natürlich vorkommenden Proteinen findet man von den
beiden Spiegelbildisomeren einer Aminosäure nur die L-Form.
Aminosäuren und Proteine – 2
Themen/Lernziele:
– Einteilung der Aminosäuren
– Der Isoelektrische Punkt (IEP)
AB
ArbeitsBlatt
1.4. Die 20 Aminosäuren
1.5. Einteilung der Aminosäuren
Die Seitenkette hat Einfluss auf die chemischen Eigenschaften der Aminosäure. Neutrale Aminosäuren besitzen entweder polare (hydrophil)
oder unpolare (hydrophob) Seitenketten. Saure Aminosäuren tragen
eine zweite Carboxylgruppe, in der Seitenkette der basischen AS befindet sich eine zweite Aminogruppe.
1.6. Der isoelektrische Punkt (IEP)
V
Glycin + Wasser
(dabei den pH-Wert messen)
Versuch: Glycin wird in Wasser gelöst
H3N + -CH2-COO – + H2O
A
H2N-CH2-COO – + H3O +
H3N + -CH2-COO – (aq)
B
H3N + -CH2-COOH + OH–
Beobachtung: Glycin löst sich in Wasser, es reagiert schwach
sauer; der pH-Wert beträgt 6
i
Ampholyt
Erklärung: Glycin ist ein Stoff, der sowohl als Base als auch als
Säure reagieren kann (Ampholyt). Die NH3+ -Gruppe gibt aber
eher ein Proton ab, als die COO – -Gruppe eines aufnimmt.
In wässriger Lösung liegen vor (bei pH-Wert 6):
Zwitterion
Anion
wenig
H2N-CH2-COO –
Es läuft also eher
die Reaktion A ab
Kation
viel
H3N + -CH2-COO – (aq)
fast nichts
H3N + -CH2-COOH
bei Zugabe von etwas Salzsäure verschiebt sich das Gleichgewicht:
Zwitterion
Anion
sehr wenig
H2N-CH2-COO –
(pH-Wert < 6)
Kation
viel
H3N + -CH2-COO – (aq)
sehr wenig
H3N + -CH2-COOH
Bei einem ganz bestimmten pH-Wert ist die Anionen-Konzentration = Kationen-Konzentration und gleichzeitig minimal, es liegen
am meisten Zwitterionen vor. Dieser Punkt heißt isoelektrischer
Punkt. Für Glycin pH bei 5,97.
IEP: pH-Wert, für den gilt cZwitter = max. cAnion = cKation.
Der IEP ist charakteristisch für jede Aminosäure.
Aminosäuren und Proteine – 3
Chemie
AB:
Glycin (Gly, G)
IEP = 6,0
Aminosäuren und Proteine
Die 20 Aminosäuren
L-Alanin (Ala, A)
IEP = 6,1
L-Leucin (Leu, L)*
IEP = 6,0
L-Valin (Val, V)*
IEP = 6,0
L-Isoleucin (Ile, I)*
IEP = 6,0
Neutrale Aminosäuren mit unpolarem Rest
L-Cystein (Cys, C)
IEP = 5,0
L-Tyrosin (Tyr, Y)
IEP = 5,6
L-Asparaginsäure
(Asp, D)
IEP = 2,9
L-Methionin (Met, M)*
IEP = 5,7
L-Asparagin
(Asn, N)
IEP = 5,4
L-Glutamin
(Gln, Q)
IEP = 5,7
L-Glutaminsäure
(Glu, E) IEP = 3,2
Für den Menschen essentielle Aminosäuren*
müssen mit der Nahrung aufgenommen werden!
L-Phenylalanin (Phe, F)*
IEP = 5,5
L-Serin (Ser, S)
IEP = 5,7
Neutrale Aminosäuren mit polarem Rest
Saure Aminosäuren
L-Prolin (Pro, P)
IEP = 6,3
L-Arginin (Arg, R)
IEP = 10,8
L-Threonin (Thr, T)*
IEP = 5,6
L-Tryptophan
(Trp, W)* IEP = 5,9
L-Lysin
(Lys, K)*
IEP = 9,7
Lit.: Elemente Chemie II (Klett), S. 148 - Chemie heute SII (Schroedel), S. 451
L-Histidin
(His, H)
IEP = 7,6
Basische
Aminosäuren
Aminosäuren und Proteine – 4
Themen/Lernziele:
– Die Elektrophorese – eine moderne Trennmethode
AA
!
statistische Verteilung
?
1.7. pH-Abhängigkeit der Aminosäuren
Welche Teilchen liegen bei den Aminosäuren Glycin, Histidin und
Asparaginsäure bei einem pH-Wert von 6 jeweils vor?
Am IEP liegen die Aminosäuren fast ausschließlich in der zwitterionischen Form vor. Bei niedrigeren pH-Werten (also einer höheren H3O + -Konzentrationen) werden die Zwitterionen protoniert
und die AS liegt als Kation vor. Bei höheren pH-Werten (also
höheren OH– -Konzentrationen) wird ein Proton abgegeben und
die AS liegt überwiegend als Anion vor:
Bsp: Glycin:
H3N + -CH2-COO –
Histidin:
H3N + -CH(-C3N2H4 +)-COO –
(insgesamt ein Kation)
Asparaginsäure:
H3N + -CH(-CH2-COO –)-COO –
(insgesamt ein Anion)
1.8. Die Elektrophorese - ein modernes Verfahren um
Aminosäurengemische zu trennen
Was passiert, wenn wir an ein Gemisch der Aminosäuren Glycin,
Histidin und Asparaginsäure bei pH 6 ein elektrisches Feld anlegen?
Gleichspannungsquelle
Folie
Startpunkt des
Aminosäure-Gemisches
feuchtes Filterpapier
Glycin-Zwitterionen
wandern nicht
Wanderung der
Histidin-Kationen
Wanderung der
Asparaginsäure-Anionen
Die positiv geladenen Teilchen (hier die Histidin-Kationen) werden zur Kathode wandern, die negativ geladenen Teilchen (in dem
Gemisch die Asparaginsäure-Anionen) wandern zur Anode, die
Glycin-Zwitterionen werden gar nicht wandern, weil sich die negativen und die positiven Ladungen gegensseitig aufheben.
Unter Elektrophorese wird die Wanderung elektrisch geladener
Moleküle im elektrischen Feld verstanden. Aminosäuren liegen bei
pH-Werten oberhalb ihres isoelektrischen Punktes als Anionen
vor und wandern zur Anode, bei pH-Werten unterhalb des isoelektrischen Punktes wandern sie als Kationen zur Kathode.
Folie
MA
bitte
lesen
Die Elektrophorese stellt ein Verfahren dar Aminosäure-Gemische zu trennen, es findet z.B. bei HIV-Tests Verwendung.
Lit.: Chemie heute SII
Auflage 1999: S.379
Trennung und Identifizierung
von Proteinen.
Aminosäuren und Proteine – 5
Elektrophorese (Prinzip)
Gleichspannungsquelle
Startpunkt des
Aminosäure-Gemisches
feuchtes Filterpapier
Glycin-Zwitterionen
wandern nicht
Wanderung der
Histidin-Kationen
Wanderung der
Asparaginsäure-Anionen
Unter Elektrophorese wird die Wanderung elektrisch geladener Moleküle im elektrischen
Feld verstanden.
Positiv geladenen Teilchen (Kationen) werden zur Kathode wandern, die negativ geladenen
Teilchen (Anionen) wandern zur Anode, ungeladene Teilchen werden gar nicht wandern. Auch
Zwitterionen wandern nicht, weil sich die negativen und die positiven Ladungen gegensseitig
aufheben.
Die Elektrophorese ist eine Möglichkeit solche Stoffgemische zu trennen.
Aminosäuren und Proteine – 6
Themen/Lernziele:
Wdh.
– Peptidbindung, Peptidhydrolyse
– Dipeptide und Tripeptide
– Grenzformeln der Peptidbindung
Wie kommen wir von den Aminosäuren zu den Peptiden und
den Proteinen?
2.
Dipeptide und Polypeptide
2.1. Kondensationsreaktion
Kondensation von Alanin und Glycin:
H
H
O
N
Wdh.
Esterbindung, glycosidische
Bindung, …
H
H
O
H
H
H
N
N
H
H
O
C
C
H
C
H
H
O
H
H
C
O
C
H
H
Achtung:
keine FISCHER-Projektion!
H
H
H
N
C
H
H
O
C
O
H
H
Alanylglycin (AlaGly)
O
H
vgl. aber
H
N
H
?
H
O
C
C
H
H
N
C
H
H
C
H
O
C
H
O
H
Glycylalanin (GlyAla)
2.2. Die Peptid-Bindung
wieso lösen wir uns dann nicht auf?
i
Röntgenstrukturanalyse:
Bindungslänge zwischen einer
Doppel- und einer Einfachbindung!
Die Peptidhydrolyse ist ein exothermer Vorgang,
die Reaktion verläuft trotzdem extrem langsam:
–> sehr hohe Aktivierungsenergie
–> sehr stabile Bindung
=> energiearm,
partieller Doppelbindungscharakter,
ebener Bau.
O
H2N
CH
C
CH3
fiktive Grenzformeln
AA
Val-Ser
Cys-Asn-Thr
Thr-Asn-Cys
CH2
COOH
H
O
H2N
M e so m e r i e
Zeichnen:
N
CH
CH3
C
N
CH2
COOH
H
2.3. Einteilung
- Aminosäuren
- Dipeptide, Tripeptide, …
- Oligopeptide (ca. 2–10 Aminosäuren)
- Polypeptide (bis zu 100 Aminosäuren)
- Proteine (Eiweiße) (über 100 Aminosäuren)
Aminosäuren und Proteine – 7
Themen/Lernziele:
– Proteinsynthese im Labor
– Schutzgruppen; Flüssigphasen- u. Festphasensynthese
2.4. Peptidsynthese im Labor
Problem 1: unkontrollierte Reaktionen der Aminosäuren
Problem 2: Peptidbildung verläuft nicht freiwillig
Lösung 1:
Lösung 2:
Schutzgruppen an alle funktionellen Gruppen, die
nicht reagieren sollen.
Aktivierung der Gruppen, die reagieren sollen.
Zwei Möglichkeiten:
- Flüssigphasensynthese
- Festphasensynthese
���
��
����
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������
��
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��
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�
Aminosäuren und Proteine – 8
���
��
����
Peptidsynthese im Labor
����
���
�
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��
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��
�
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��
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��
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��
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��
�
�
��
��
�����
�������
�
Prinzip: Schutzgruppen an alle funktionellen Gruppen, die nicht reagieren sollen,
Aktivierung der Gruppen, die reagieren sollen.
Aminosäuren und Proteine – 9
Themen/Lernziele:
– Struktur der Proteine
– Zwischenmolekulare Kräfte
3.
Struktur der Proteine
3.1. Primärstruktur
Wdh.
Peptidbindung
EDMAN -Abbau (vom N-terminalen Ende)
„Sequenator“
bei größeren Peptiden bzw. Proteinen
überlappende Spaltung mit Enzymen
(Trypsin, Pepsin)
Gibt die Folge der einzelnen Aminosäurebausteine an (Gly-AlaCys-Leu-Ala-Val-Glu-…). Man kennt heute die Aminosäuresequenz
von vielen wichtigen Proteinen.
Strukturaufklärung erfolgt über einen stufenweisen Abbau der
Peptidkette (z.B. enzymatisch).
Zur Hydrolyse muss man längere Zeit z.B. mit Salzsäure erhitzen
um die stabilen Peptidbindungen zu spalten (z.B. mit verd. Salzsäure 1h bei 120°C).
3.2. Sekundärstruktur
Modelle
Strukturen von Proteinen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen bedingt und stabilisiert werden.
α-Helix
Ko
pie
Jeder A.S.-Strang für sich, HBrücken innerhalb des Stranges. Auch lange Seitenketten
möglich. Elastisch, dehnbar.
Bsp.: Wolle, Haare
β-Faltblatt
Viele Stränge parallel, jew. 2 liegen „antiparallel“ nebeneinander,
H-Brücken zwischen den Strängen. Meist gleichartige A.S. mit
kurzen Seitenketten. Fest, reißfest, biegbar.
Bsp.: Seide.
Aminosäuren und Proteine – 10
– Struktur der Proteine (Fortsetzung)
– Denaturierung
Themen/Lernziele:
3.3. Tertiärstruktur
Wdh.
verschiedene Bindungstypen
Kollagen = Strukturprotein
(Haut, Knorpel, Bindegewebe)
Die Teilchengestalt eines Proteinmoleküls, resultiert aus der
räumlichen Anordnung der α-Helices oder der Faltblattstruktur.
Die Tertiärstruktur wird durch verschiedene Bindungsarten stabilisiert: zwischen unpolaren Gruppen
liegen VAN DER WAALS–Bindungen vor, zwischen
polaren Gruppen werden Wasserstoffbrücken
ausgebildet und zwischen den Seitenketten der
sauren und basischen A.S. treten Ionenbindungen
auf. Von Besonderer Bedeutung für die Tertiärstruktur sind die Disulfidbrücken (–S–S–). Sie entstehen aus den SHGruppen zweier Cystein-Reste in einer Redoxreaktion.
Bsp.: Kollagenfaser aus 3 α-Helices (Triple-Helix) oder Myoglobin.
H
N
O
N
H
O
H
N
CH C
CH2
CH C
O
CH2
C
N
CH2
CH2
H2C
Porphyrin-Gerüst
CH3
N
H3C
H2C
H2C
HOOC
Häm:
R1
CH
H3C
Ko
pie
Tertiärstruktur von Insulin
(Insulin besteht aus zwei Ketten:
30 + 21 = 51 Aminosäuren)
Strukturaufklärung durch SANGER 1954
N
Fe2+
CH
N
CH2
N
R2
R1 = Globin (Protein-A.S.-Kette)
R 2 = Sauerstoff (O2)
CH2
CH3
CH2
C
O
CH N
H
VAN - DER -WAALS -
Kräfte
C
O
N
H
C
O
O
H
N
O–
CH2
C
CH2
CH2
C
CH N
H
Wasserstoffbrückenbindungen
O
CH2
S
H
H
CH N
H
CH C
S
CH2
H
N
O
CH2
CH2
H
H
H
O
CH C
CH2
C
O
CH N
H
Disulfidbrücken
Ionenbindungen
3.4. Quartärstruktur
sind in einem Protein mehrere Polypeptidketten in einer bestimmten räumlichen
Struktur angeordnet, so spricht man von
Quartärstruktur
Bsp.: Hämoglobin
COOH
3.5. Denaturierung
(Veränderung von Eiweiß durch Zerstörung der Ordnung)
- Hitze (Tertiärstruktur)
- Schwermetalle (Tertiärstruktur)
- Strahlung (Sekundärstruktur)
- Säuren/Laugen (Primärstruktur)
- Verdauungsprozesse (enzymatisch, Magensäure)
(Die Aminosäuren bleiben erhalten, Enzyme werden zerstört)
3.6. Anhang: vgl. Literaturhinweis
Der Friseur als Proteinchemiker
Chemie heute SII - S. 378
Schroedel: Chemie heute SII - S. 378 (Der Friseur als Proteinchemiker)
Aminosäuren und Proteine – 11
Chemie
AB:
α-Helix
Aminosäuren und Proteine
Struktur der Proteine
β-Faltblatt
Quartärstruktur
Bindungen, die die
Tertiärstruktur stabilisieren
Aminosäuren und Proteine – 12
Insulin
H2C
Häm
R1
CH
CH3
H3C
N
Porphyrinring
H3C
N
H2C
H2C
HOOC
R1 = Globin (Protein, A.S.-Kette)
R2 = Sauerstoff (O2)
Fe2+
CH
N
CH2
N
R
2
CH2
CH3
CH2
COOH
Aminosäuren und Proteine – 13
Tertiärstruktur – stabilisierende Bindungen
H
N
O
H
N
CH C
CH C
CH2
CH2
CH2
S
CH2
CH2
H
CH N
H
N
O
H
C
N
O–
O
Disulfidbindungen
C
O
H
H
H
N
O
CH2
C
O
CH N
H
O
CH2
C
O
CH N
H
VAN-DER-WAALS-Kräfte
C
O
VAN-DER-WAALS-Kräfte
O
H
N
CH C
C
CH N
H
Wasserstoffbrückenbindungen
O
CH C
O
CH2
N
CH2
H
CH2
N
H
C
O
O
H
N
O–
CH2
C
CH2
CH2
CH N
H
Wasserstoffbrückenbindungen
C
O
CH2
S
H
H
CH N
H
CH C
S
CH2
H
N
CH2
CH2
C
H
H
CH C
O
CH2
CH2
CH C
N
H
C
CH2
Ionenbindungen
O
N
H
H
N
H
CH N
H
H
N
C
O
H
CH2
O
CH C
CH2
CH2
S
C
O
O
CH2
C
O
CH N
H
Disulfidbindungen
Ionenbindungen
Aminosäuren und Proteine – 14
Themen/Lernziele:
V
– Nachweisreaktionen auf Aminosäuren bzw. Polypeptide
– Xanthoprotein, Biuret, Ninhydrin
– Chromatographie
Ein frisch gekochtes Ei wird
mit HNO3(konz.) bemalt.
Gelbe Finger beim Arbeiten
mit HNO3(konz.)
ArbeitsBlatt
4.
Nachweisreaktionen auf Aminosäuren u. Polypeptide
4.1. Die Xanthoproteinreaktion (Gelbfärbung von Eiweiß)
Versuch: Eiweiß wird mit HNO3 betupft
Beobachtung: Es tritt eine Gelbfärbung auf
Ergebnis: Die aromatischen Aminosäuren (Trp, Tyr, Phe) werden
am Benzolkern nitriert.
AB
H3N
CH
+ HNO3
CH2
Salpetersäure
COO
vgl.: SE-Reaktion
am Aromaten
H3N
CH
Phenylalanin (Phe)
NO2 + H2O
CH2
COO
Nitrophenylalanin (gelb)
Die Xanthoprotheinreaktion ist ein Nachweis auf aromatische
Aminosäuren
nach der Biuretgruppe:
H2N-CO-NH-CO-NH2
4.2. Die Biuretreaktion
O
Beim Versetzen einer
alkalischen AminosäureC O
nicht zu stark verdünnt ! Lösung mit einigen Tropfen
verdünnter CuSO4 -Lsg.
CH
tritt eine blauviolette Fär- R
N
H2
bung auf. Es bildet sich ein
Kupferkomplex.
H2
N
Cu2+
MA
bitte
lesen
Beyer / Walter:
Lehrbuch d. Organischen Chemie
S. 626 u. S. 840f.
Chromatographie (Verteilungs- u. Adsorptionschr.)
Chromatographie von Folienstiftfarbstoffen
Chromatographie von A.S. u. A.S.-Gemischen
Beim Erhitzen von Aminosäuren,
Peptiden oder Proteinen mit einer
verdünnten wässrigen Ninhydrinlösung tritt eine Blauviolettfärbung
auf.
C
C
C
Ninhydrin
5.
C
O
O
4.3. Die Ninhydrinreaktion
ERLENMEYERregel
O
CH
R
OH
OH
O
Chromatographie
5.1. Chromatographie / Grundlagen
5.2. Chromatographie von Aminosäuren
Aminosäuren und Proteine – 15
Chemie
Aminosäuren und Proteine
AB:
Nachweisreaktionen auf Aminosäuren
4. Nachweisreaktionen auf Aminosäuren bzw. Polypeptide
4.1. Die Xanthoproteinreaktion (Gelbfärbung von Eiweiß):
Versuch: Ein Stückchen Eiweiß wird in einem Reagenzglas mit konz. Salpetersäure betröpfelt und erwärmt.
Beobachtung:
Ergebnis: Die aromatischen Aminosäuren (Trp, Tyr, Phe) werden am Benzolkern nitriert.
H3N
CH
+ HNO3
CH2
COO
Salpetersäure
Phenylalanin (Phe)
H3N
CH
NO2 + H2O
CH2
COO
Nitrophenylalanin (gelb)
Die Xanthoproteinreaktion ist ein Nachweis auf aromatische Aminosäuren.
4.2. Die Biuretreaktion:
Versuch: Gib zu einigen mL einer leicht alkalischen Eiweißlösung (zur Not: Aminosäurelösung) einige Tropfen
verdünnte CuSO4-Lösung
O
Beobachtung:
O
R
C
H
C
C
C
H
N
N
R
Cu2+
R
N
N
H
C
C
C
H
C
R
O
O
4.3. Die Ninhydrinreaktion:
Versuch: Eine Aminosäurelösung wird mit einigen Tropfen Ninhydrinlösung versetzt und erwärmt. Testet verschiedene Aminosäuren.
O
Beobachtung:
C
C
OH
C
OH
O
Ninhydrin
Aminosäuren und Proteine – 16
Ninhydrin / Biuret
Aminosäuren und Proteine – 17
Chemie
Aminosäuren und Proteine
AB:
Grundlagen: Chromatografie
5. Chromatographie (von griech. chroma: Farbe u. graphëin: schreiben)
5.1. Grundlagen: Chromatographie — Ein Verfahren zur Trennung von Stoffen
Bei der Papier- und Dünnschichtchromatographie wird eine stationäre Phase (Papier, Dünnschichtplatte von einer mobilen Phase (Fließmittel) durchwandert. Dabei werden die einzelnen Komponenten eines Stoffgemisches,
das auf der stationären Phase aufgebracht ist, verschieden schnell transportiert und damit getrennt. Ursache
dafür sind unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und den Gemisch-Bestandteilen
sowie unterschiedliche Löslichkeit im Fließmittel. Je besser die Löslichkeit des Stoffes im Fließmittel ist, desto leichter wird er von diesem mitgeführt. Gleichzeitig mit dem Lösen des Stoffes im Fließmittel tritt dieser in
Wechselwirkung mit der stationären Phase. Er wird mehr oder weniger stark, aber immer reversibel, adsorbiert
(Adsorptionschromatographie).
Adsorption ist aber nicht der einzige Rückhalteeffekt. Häufig befindet sich auf der Oberfläche der stationären
Phase ein Flüssigkeitsfilm (z. B. Wasser). Daher konkurriert die Löslichkeit des wandernden Stoffes in diesem
Flüssigkeitsfilm mit der Löslichkeit im Fließmittel und sorgt durch die unterschiedliche Verteilung in den beiden
Lösungsmitteln für einen weiteren Trenneffekt (Verteilungschromatographie).
schütteln
schütteln
schütteln
schütteln
schütteln
schütteln
z. B. Hexan
z. B. Wasser
Beispiel: Stoffe, die in Hexan gut löslich sind und in Wasser schlecht, werden schnell weitertransportiert, dagegen
werden Stoffe, die in Hexan wenig löslich sind, in Wasser jedoch gut, langsam weitertransportiert. Dadurch lassen
sich solche Stoffe trennen.
Führt man eine Chromatographie unter
immer genau denselben Bedingungen (stationäre Phase [z. B. Aluminiumoxid-Dünnschichtplatte], mobile Phase [Fließmittel, z.
B. Butanol:Eisessig:Wasser = 4:1:1], Temperatur) durch, so ist das Verhältnis der Entfernung des Substanzflecks von der Startlinie
zu der Entfernung der Fließmittelfront von
der Startlinie spezifisch für einen bestimmten
Stoff, für jeden einzelnen also immer gleich.
Diesen Wert nennt man retention factor
(Rückhalte-Faktor):
Rf =
Herstellung eines Chromatogramms. Prinzip:
Entfernung Substanzfleck–Startlinie
Entfernung Fließmittelfront–Startlinie
Aminosäuren und Proteine – 18
Chemie
AB:
Aminosäuren und Proteine
Chromatografie-Versuche
5.2. Chromatographische Trennung eines Aminosäure-Gemisches:
Vorbereitungen:
Von den Aminosäuren Alanin, Glycin, Leucin, Prolin und Valin werden in kleinen Schnappdeckelgläsern Lösungen hergestellt (kleine Spatelspitze auf ca. 5 mL Wasser).
Das Fließmittelgemisch wird vorbereitet (für alle zusammen ca. 120 mL). Als Fließmittel hat sich hier eine Mischung aus Butanol, Eisessig und Wasser (4:1:1) als günstig erwiesen.
Bereitet die Dünnschichtchromatographie-Platten (Cellulose) mit einem weichen Bleistift vor: einen Strich in
ca. 1,5 cm Abstand vom unteren Rand (Achtung: die weiße Beschichtung der Platte darf nicht verletzt werden),
7 Markierungen für die Startpunkte. Einen weiteren Strich ca. 0,5 cm vom oberen Rand. Namen drauf.
Die Trennkammern werden etwa 0,5 cm hoch mit dem Fließmittelgemisch gefüllt, mit einer Glasplatte verschlossen und vorsichtig geschüttelt, damit sich der Innenraum mit Lösungsmitteldämpfen sättigen kann.
Versuch:
Auf die Startlinie werden die Lösungen von 5 Aminosäuren (Alanin, Glycin, Leucin, Prolin, Valin) und 2 Aminosäure-Gemische aufgetragen. Dazu taucht man eine Glaskapillare in die Lösung (sie saugt sich hoch) und setzt diese
kurz auf der Dünnschichtplatte auf. Der aufgetragene
Punkt soll möglichst klein und scharf begrenzt sein.
Nach dem Trocknen kommt die Platte in die Trenn-
Namen der Praktikumsgruppe
kammer. Man nimmt die Platte aus der Trennkammer,
wenn die Fließmittelfront noch ca. 0,5 cm vom oberen Rand entfernt ist.
Damit die Platte nach der Beendigung der Chromatographie schneller trocknet, kann sie mit einem Fön
getrocknet werden.
Da Aminosäuren farblos sind, müssen sie noch
sichtbar gemacht werden. Dafür bietet sich die Ninhydrin-Reaktion an. Die trockenen Platten werden
mit Ninhydrin-Spray eingesprüht und danach zum
„Entwickeln“ in den Trockenschrank gebracht.
Ala Gly Leu Pro Val
Aminosäure-Gemische
Die Aminosäure-Gemische werden durch Vergleich
mit den einzelnen Aminosäuren identifiziert.
Eine weitere Möglichkeit, Stoffgemische zu identifizieren, besteht im Vergleich der experimentell bestimmten
Rf-Werte (retention factor) mit den tabellierten Werten.
Aminosäuren und Proteine – 19
Chemie
AB:
Aminosäuren und Proteine
Identifikation durch Chromatografie
Chromatographie von Alanin,
Glycin, Leucin und Valin sowie
zweier Aminosäuren-gemische.
Fließmittel: n-Butanol, Essigsäure,
Wasser (4:1:1).
Mit Ninhydrin sichtbar gemacht.
Fließmittelfront
Startlinie
Das Chromatogramm entstand im Chemie-LK 12 im November 2000
Aminosäuren und Proteine – 20
Chemie
AB:
Aminosäuren und Proteine
Chromatografie-Versuche / Ergebnisse 2002
SiO2
SiO2
SiO2
Diese Chromatogramme entstanden im Chemie-BF 12 im Oktober 2002
Cellulose
Cellulose
Al2O3
Aminosäuren und Proteine – 21
Chemie
AB:
SiO2
Aminosäuren und Proteine
Chromatografie-Versuche / Ergebnisse 2005
SiO2
SiO2
Al2O3
A
Chromatografiert wurden Alanin, Glycin, Leucin und Valin.
Folgende Aminosäuren-Gemische sollten analysiert werden:
A = Alanin + Glycin
B = Alanin + Glycin + Leucin
C = Glycin
D = Alanin + Leucin + Valin
E = Alanin + Glycin + Valin
SiO2
SiO2
"
"X
a
Al
G
ly
u
Le
SiO2
l
Va
05
20 7
/0
1.
. 1 005
2
14
h
n
ac
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äu ro
os e-P
in
i
m em
h
C
Diese Chromatogramme entstanden im Chemie-PF 12 im November 2005
"
"Y
SiO2
Aminosäuren und Proteine – 22
Chemie
AB:
Aminosäuren und Proteine
Chromatografie-Versuche / Simulation
Chromatographie
- Simulation -
Verteilung
Stoff A
Stoff B
Abstand
Lit.: Vergleiche die Excel-Datei: Chromatografie.xls
Aminosäuren und Proteine – 23
Themen/Lernziele:
– Bedeutung der Aminosäuren
– Ernährung/Stoffwechsel/Gesundheit — Landwirtschaft — Medizin
6. Bedeutung der Aminosäuren
6.1. Komplex: Ernährung/Stoffwechsel/Gesundheit
Folie
Proteinbedarf in Abhängigkeit vom Lebensalter
Folie
Die wichtigsten Funktionen der Aminosäuren
Folie
Gesundheitliche Folgen unzureichender
Aminosäureversorgung
Folie
Bedarf an essentiellen Aminosäuren
• für alle Lebensvorgänge ist Stickstoff unentbehrlich
• für das Stickstoff-GG sind die Aminosäuren verantwortlich (höhere Lebewesen können keinen Stickstoff aus der Luft nutzen)
• Im Stoffwechsel herrscht ein dynamisches GG zwischen Auf- u.
Abbau v. Proteinen
• Vorraussetzung für Wachstum ist eine positive Stickstoffbilanz
Die wichtigsten Funktionen der Aminosäuren
• Synthese körpereigener Proteine
a) Strukturproteine (Muskel, Bindegewebe)
b) Funktionsproteine (Enzyme, Hormone)
• Aufbau von Kohlenhydraten und Lipiden
• Synthese von Heterocyclen (Purinen, Pyrimidinen), Nucleinsäurebasen, Porphyrine (Grundgerüst des roten Blutfarbstoffes)
• Synthese von funktionalen Aminosäurederivaten (z.B. Dopamin,
Noradrenalin, Serotonin, Thyroxin, γ-Aminobuttersäure, Acetylcholin, Folsäure, Biotin, Pantothensäure)
• Spezielle Funktionen (Ausschleusung des im Stoffwechsel gebildeten Harnstoffes über Arginin und Methionin, Arginin: Stimulation des Immunsystems
Mangelfolgen
• negative Stickstofbilanz bedeutet Stagnation, eingeschränkte Enzymfunktionen, Verlust von Körpermasse, Krankheit und führt
über einen längeren Zeitraum schließlich zum Tode
Ernährung
• 8 essentielle Aminosäuren, die der menschl. Körper nicht selbst
synthetisieren kann. Säuglinge auch: Cystein (o.Cystin) u. Tyrosin. Semiessentiell: Arginin u. Histidin.
• ca. 500-600 Mio. Menschen hungern bzw. sind unterernährt
• Proteinzufuhr in den Industrieländern: 100g/Tag u. Person
in Asien u. Afrika: <60g/Tag u. Person
• Problem der Überbevölkerung
• Verbesserung der Aminosäureversorgung ist notwendig
• Zugabe einzelner Aminosäuren zu der Nahrung
• Ausblick: „genetic engineering“ Programmierung der A.S.-Zusammensetzung in den Genen von Tieren u. Pflanzen!
• Geschmacks-, Aroma- u. Süßstoffe (Aspartam®) MAILLARD-Reaktion
6.2. Komplex: Landwirtschaft
• Tierhaltung: Mischfutterproduktion 400 Mio. t A.S.
• Limitierende A.S.
• Analytik des Futters (A.S.-Bestimmung)
• A.S.-Bedarf für die einzelnen Aufzuchtperioden
• Pflanzenschutz
6.3. Komplex: Medizin
• klinische Ernährung
• Therapeutika: z.B. gegen Bluthochdruck
• Antibiotika
• Hormone
Aminosäuren und Proteine – 24
Chemie
AB:
Aminosäuren und Proteine
Die Bedeutung der Aminosäuren
6. Bedeutung der Aminosäuren
6.1. Komplex: Ernährung/Stoffwechsel/Gesundheit
• für alle Lebensvorgänge ist Stickstoff unentbehrlich
• für das Stickstoff-Gleichgewicht sind die Aminosäuren
verantwortlich (höhere Lebewesen können keinen Stickstoff aus der Luft nutzen)
• Im Stoffwechsel herrscht ein dynamisches Gleichgewicht
zwischen Auf- u. Abbau von Proteinen
• Vorraussetzung für Wachstum ist eine positive Stickstoffbilanz
Die wichtigsten Funktionen der Aminosäuren (Abbildung)
Mangelfolgen
• negative Stickstofbilanz bedeutet Stagnation, eingeschränkte Enzymfunktionen, Verlust von Körpermasse, Krankheit und führt über einen längeren Zeitraum
schließlich zum Tode
Ernährung
• 8 essentielle Aminosäuren, die der menschliche Körper
nicht selbst synthetisieren kann. Säuglinge auch: Cystein
(oder Cystin) und Tyrosin. Semiessentiell: Arginin und
Histidin.
• ca. 500-600 Mio. Menschen hungern bzw. sind unterernährt
• Proteinzufuhr in den Industrieländern: 100g/Tag und
Person <––> in Asien und Afrika: <60g/Tag und Person
• Problem der Überbevölkerung
• Verbesserung der Aminosäureversorgung ist notwendig
• Zugabe einzelner Aminosäuren zu der Nahrung
• Ausblick: „genetic engineering“ Programmierung der
Aminosäuren-Zusammensetzung in den Genen von Tieren und Pflanzen!
• Geschmacks-, Aroma- und Süßstoffe (Aspartam®) MAILLARD -Reaktion
6.2. Komplex: Landwirtschaft
• Tierhaltung: Mischfutterproduktion 400 Mio. t Aminosäuren
• Limitierende Aminosäuren
• Analytik des Futters (Aminosäuren-Bestimmung)
• Aminosäuren-Bedarf für die einzelnen Aufzuchtperioden
• Pflanzenschutz
6.3. Komplex: Medizin
• klinische Ernährung
• Therapeutika: z.B. gegen Bluthochdruck
• Antibiotika
• Hormone
Aminosäuren und Proteine – 25
Proteinbedarf / Funktionen
Aminosäuren und Proteine – 26
Mangelfolgen / essentielle Aminosäuren
Aminosäuren und Proteine – 27