Zur Titration der Aminosäuren und Proteine gegen Indicatoren. Bei

Zur Titration der Aminosäuren und Proteine gegen
Indicatoren.
Von
K. Felix und H. Müller.
(Aus dem Laboratorium der II. Medizinischen Klinik München.
(Der Redaktion zugegangen am 4. August 1927.)
Bei den elektrometrischen Messungen am Histon der Thymusdrüse, die der eine von uns gemeinsam mit A. Harteneck 2 )
ausgeführt hat, ergab sich, daß der Endpunkt für die Titration
mit Säuren zwischen pH l und 2 und der für die Titration
mit Laugen zwischen pH 11 und 12 liegt; beim Oxyhämoglobin
liegen, nach noch nicht veröffentlichten Versuchen des einen
von uns gemeinsam mit A. Buchner, die Endpunkte bei pir 1,5
bis pH 1,7 bzw. bei pH 11,9—12,2. Es muß demnach die Dissoziationskonstante einzelner dieser Gruppen sehr klein sein.
Wenn man nun Proteine gegen Indicatoren vollständig titrieren
will, so hat man solche Farbstoffe zu wählen, deren Umschlagsbereich in jene p H - Zonen fällt. Von den gebräuchlichen
kommen in erster Linie das Thymolblau, das seinen sauren
Umschlagsbereich zwischen pH 1,2 und 2,8 hat, und das Alizaringelb, das zwischen pH 10,1 und 12,1 umschlägt. Eine
Titration der sauren Gruppen des Histons gegen Alizaringelb
mit 0,1 -Natronlauge hatte denn auch das gleiche Resultat
wie die elektrometrischen Messungen (2) S. 111), und ließ erwarten, daß diese etwas umständliche Methode durch einfache
Indicatorentitration ersetzt werden könne. Wir haben nun
eine Reihe von Aminosäuren und Peptiden gegen diese Indicatoren titriert, um die Brauchbarkeit und den Anwendungsbereich dieser Methode zu prüfen.
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Zur Titration der Aminosäuren und Proteine gegen Indicatoren.
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Die theoretischen Grundlagen für die Titration der Aminosäuren, Polypeptide und Proteine sind bereits ausführlich von
L.J.Harris 8 ) entwickelt worden. Maßgebend für den Endpunkt der Titration sind die Dissoziationskonstanten, sowohl
für Lösungen von Ampholyten, als auch für Gemische von
Säuren und Basen verschiedener Stärke. Je größer die Dissoziationskonstante ist, um so näher liegt der Endpunkt der
neutralen Reaktion, und umgekehrt, je kleiner sie ist, um so
weiter liegt der Endpunkt im alkalischen oder sauren Bereich.
Nach Harris lassen sich die Endpunkte aus den Dissoziationskonstanten berechnen. Man kann sie aber auch experimentell bestimmen, indem man zu einer bekannten Lösung
einer Aminosäure die berechnete Menge Säure oder Lauge zusetzt und dann das pH mißt. So ist z. B. die stark dissoziierte Guanidingruppe des Ärginins bereits bei einem pH über
5,0 titriert, während die schwach dissoziierte Aminogruppe erst
bei pH0,35 vollständig titriert sein soll, die Carboxylgruppe
ist erst bei einem pH über 15,95 ganz dissoziiert. Die Endpunkte für die beiden Aminogruppen des Lysins liegen bei
pH5,0 und 0,05, für die Carboxylgruppe des Lysins bei 12,7
bis 13. Die basischen Gruppen des Histidins sind bei pH 3,76
und —0,3, die Carboxylgruppe bei pH10,65 titriert. Die sauren
Gruppen der Asparaginsäure haben ihren Endpunkt bei pH 5,83
und 11,85, die Aminogruppen bei pH 0,08. Die Dissoziation
der Aminogruppe des Histidins und der Carboxylgruppe des
Ärginins sind wohl die Extreme, mit denen man es bei der
Hydrolyse von Proteinen zu tun haben wird. Über die Dissoziation der Peptone ist noch nichts Genaueres bekannt. Bei
den Peptonen, die aus dem Histon bei der Verdauung mit
Pepsin-Salzsäure entstehen, sind die sauren Gruppen stärker
dissoziiert als die des ursprünglichen Histons(2) S. 118). Diese
Überlegung würde eigentlich Indicatoren verlangen, die zwischen
pH 0 und 1,0 und zwischen 13 und 16 ihre Farbe ändern,
eine Forderung, der unsere Indicatoren nur unvollkommen
gerecht werden. Dazu kommt noch, daß man bei der praktischen Ausführung über die theoretisch oder experimentell
bestimmten Endpunkte hinaus titrieren muß, da infolge der
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K. Felix und H. Müller,
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hydrolytischen Dissoziation ein Teil der Säure und Lauge verbraucht wird, um die Reaktion des Lösungsmittels zu ändern.
Der hei der Titration erhaltene Wert muß jeweils noch korrigiert werden durch die Menge Titrationsmittel, die nötig ist,
dasselbe Volum Wasser auf das gleiche pH zu bringen. Poiriers
Blau hätte einen günstigeren Umschlagspunkt als Alizaringelb,
aber in Gegenwart von Arginin ist es unbrauchbar, da es sich
entfärbt. Auch Methyl violett 6 B extra, Malachitgrün und
Mauvein, die für die Titration mit Säuren verwendet werden
könnten, sind ungeeignet. Wie nun unsere Versuche, deren
Ergebnisse die nachfolgenden Tabellen enthalten, zeigen, lassen
sich jedoch die Aminosäuren mit wenigen Ausnahmen gegen
jene beiden Indicatoren titrieren.
Tabelle 1.
Titration von Aminosäuren und Dipeptiden.
Aminosäure
Leucin
Tryptophan
Prolin
Taurin . . . .
Glutaminsäure . . . .
Asparaginsäure . . . .
Arginin + H C l . . . .
Arginin (+V 2 H 2 C0 3 ) . .
Guanidin -f- H C 1 . . . .
d-Dibenzoyl-arginin
. .
d,l-Dibenzoyl-arginin . .
d-Dibeuzoyl-arginin -f- HCl
Histidin + H C l . . . .
Histidincarbonat . . . .
Ornithin + H C l . . . .
Glvcyl-elycm
Jjeueyl-glycin
Gegen Thymolblau
titrierbare basische
Gruppen,
bezogen auf 1 N
gef.
% d.Th.
1
0.786
0,9
0,205
1,02
0,96
0,25
0,54
0,01
0,45
0,39
0,25
0,34
0,68
0,49
0,55
V, W
0,59
100
(39)
\<JVJ
90
20,5
102
96
100
108
—
—
—
—
103
103
98
110
118
Gegen Alizaringelb
titrierbare COOHGruppen,
bezogen auf 1 N
gef.
{'/o d. Tb.
0,95
0,57
0,67
1
2
2,06
0,25
0,05
—
0,29
—
0,55
0,7
0,40
0,84
0,49
0,52
95
114
67
100
100
103
50
20
—
116
—
—
106
121
42
98
104
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Zur Titration der Aminosäuren und Proteine gegen Indicatoren.
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Mit Ausnahme der Carboxylgruppen des Arginins, des
Ornithins, des Prolins und der Aminogruppe des Taurins sind
die untersuchten Aminosäuren gegen Thymolblau und Alizaringelb mit Säure und Lauge titrierbar. Während die Imidogruppe des Prolins vollständig titriert werden kann, gelingt
es bei der des Tryptophans praktisch gar nicht. Lysin stand
uns nicht zur Verfügung, es wird sich wohl ähnlich verhalten
wie das Ornithin. Bemerkenswert sind die Ergebnisse beim
Dibenzoyl-arginin, Es ist in Wasser schwer löslich und wurde
daher in alkoholischer Lösung titriert; der zur Korrektur notwendige Leerversuch wurde dementsprechend auch mit Alkohol
ausgeführt. Obwohl am Guanidinkern der negative Benzoylrest
sitzt, kann es noch ein Äquivalent Säure binden. Es läßt sich
auch ein salzsaures Salz des Dibenzoylarginins darstellen, worüber in anderem Zusammenhang berichtet werden wird. Der
basische Charakter der Guanidingruppe ist durch den Eintritt des Benzoylrestes nicht geändert worden, umgekehrt
würde bei Abspaltung des Benzoyls ihr Säurebindungsvermögen
nicht zunehmen. Nun haben die gesamten basischen Gruppen
des Histons durch die Verdauung mit Pepsin—Salzsäure einen
stärkeren Zuwachs erfahren als die freien Aminogruppen allein.
Neben diesen müssen noch andere basische Gruppen frei geworden sein. Aus verschiedenen Gründen wurde vermutet,
daß es sich hier um Guanidingruppen handle, und im Eiweiß
eine Guanidin-Carboxylbindung angenommen. Falls eine solche
wirklich vorhanden sein sollte, so müßte sie anderer Art sein,
als die des Dibenzoyl-arginins.
Um unsere Modelle den bei Proteinspaltungen praktisch
vorkommenden Verhältnissen enger anzupassen, haben wir
Aminosäuren und Dipeptide in bekanntem Verhältnis gemischt
und titriert. Tabelle 2 und 3 enthalten die Kesultate.
Solange es sich um Gemische von gewöhnlichen Aminosäuren, Aminodicarbonsäuren, Dipeptiden und Histidin handelt,
entsprechen die Ergebnisse den Erwartungen. Bei den Gemischen aber, die Arginin enthalten, wird mehr Säure verbraucht als die Theorie verlangt.
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K.Felix und H.Müller,
Tabelle 2.
Gemische von Aminosäure und Dipeptide. Titration gegen Thymolblau.
Titrierbare basische Gruppen,
bezogen auf 1 N
Leucin
Arginin-HCl
Arginin-HCl
Glutaminsäure
Leucin
Ornithin-HCl
Glyeyl-glycin
Leucyl-glycin
Arginin-HCl
Leucin
Glutaminsäure
Ornithin-HCl
Leucin
Glutaminsäure
Leucin
Glutaminsäure
Arginin-HCl
Tryptophan
Histidin, H2C03
Leucyl-glycin
Tryptophan
Histidin, H2C03
Leucyl-glycin
Arginin-HCl
gef.
% der Theorie
0,60
150
0,78
195
0.75
113
0,67
178
0,94
94
0,84
112
0,90
180
0,66
93
0,374
83
Bei der Titration mit Lauge sind die Abweichungen des
gefundenen Wertes von dem theoretischen geringer. Aber auch
hier fallen die Gemische mit Arginin auf, insofern als jetzt
die Carboxylgruppe des Arginins, die beim Argininchlorhydrat
und -carbonat kaum nachzuweisen ist, nun fast vollständig
titriert werden kann. Offenbar wird ihre Dissoziationskonstante
in dem Gemisch erhöht.
Die Titration gegen Alizaringelb leistet ähnliches wie die
alkoholische Titration. Unter Umständen lassen sich mit ihr
mehr Carboxyle nachweisen als mit jener, wie der früher mitgeteilte Versuch am Histon zeigt (2) S. 111). Sie ist ihr aber
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Tabelle 3.
Gemische von Aminosäure und Dipeptiden. Titration gegen Alizaringelb.
Titrierbare saure Gruppen,
bezogen auf 1 N
gef.
Leucin
Glutaminsäure
Leucin
Glutaminsäure
Argioin-HCl
Tryptophan
Histidin-HjCOs
Leucyl-glycin
Tryptophan
Leucyl-glycin
Arginin-HCl
Ornithin-HCl
Glutaminsäure
Ornithin-HCl
Glutaminsäure
Arginin-HCl
Leucyl-glycin
Taurin
Leucin
Leucyl-glycin
Leucin
Taurin
Arginin-HCl
Arginin-HCl
Glutaminsäure
% der Theorie
1,42
95
0,7
84
0,49
114
0,35
70
1,55
116
0,94
109
0,75
100
0,53
84
0,68
85
unterlegen, wenn es sich darum handelt, neben Aminosäuren
Peptide nachzuweisen. In manchen Fällen, wo das Protein
durch Alkohol ausgeflockt wird, und, wenn man nicht besondere Vorsichtsmaßregeln trifft, dadurch die Resultate der
alkoholischen Titration unsicher werden, wird man mit Vorteil die Titration gegen Alizaringelb anwenden können. Bei
Hydrolysen gestattet die Titration gegen Thymolblau festzustellen, ob neben Aminogruppen noch andere basische Gruppen
frei werden. Wir haben Gelatine mit Pepsin-Salzsäure verdaut.
Der Zuwachs an basischen und sauren Gruppen betrug 2,2,
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K. Felix und H. Müller,
bezogen auf 100 Atome Stickstoff. Es sind somit gleichviel
basische und saure Gruppen freigelegt worden. Zu demselben
Ergebnis kommen auch E. W a l d s c h m i d t - L e i t z und
G. Künstner in diesem Heft veröffentlichten Versuchen. Die
freien Aminogruppen nehmen nach der Formoltitration um
2,5, nach van Slyke um 3,2 zu, d. L die Zunahme der
freien Aminogruppen beträgt ebenso viel wie die gegen
Thymolblau titrierbaren basischen Gruppen.
In Fällen, wo neben den gewöhnlichen Aminosäuren viel
Arginin frei wird, wie z.B. bei den Protaminen, kann bei der
Titration gegen Thymolblau der Verbrauch an Säure etwas
zu groß werden.
Experimenteller Teil.
Ausführung der Titration. Sie kann in der* üblichen
Weise geschehen, indem in einem Kölbchen ein abgemessenes
Volum der Flüssigkeit bis zur größten Farbtiefe des Indicators
titriert und in einem zweiten Kölbchen dasselbe Volum Wasser
auf die gleiche Farbe gebracht wird. Die Differenz der beiden
Werte gibt die von der Substanz gebrauchten Kubikzentimeter.
Man kann aber viel genauer arbeiten, wenn man sich des
Doppelkeil-Colorimeters nach Bjerrum-Arrhenius*) bedient.
Sein wesentlicher Bestandteil ist eine rechteckige Wanne aus
planparallelem Glas, die durch eine ebenfalls planparallele
Scheibe diagonal in zwei keilförmige Hälften geteilt ist. Beide
Hälften werden mit indicatorhaltigem Wasser gefüllt, zur einen
so viel Säure und zur anderen so viel Alkali gegeben, daß
in dem einen Keil der Indicator vollkommen die saure, in dem
anderen vollkommen die basische Farbe hat. In der Durchsicht hat man dann je nach dem Verhältnis der Schichtdicken
der beiden Keile die verschiedenen Farbnuancen in dem Umschlagsbereich des Indicators. Jede Nuance entspricht einer
bestimmten Wasserstoffionenkonzentration. Durch eine optische
Vorrichtung läßt sich eine bestimmte Farbe einstellen und
*) Hergestellt von F. u. M. Lautenschläger, München.
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Tabelle 4.
1.
Gehalt
der
Lösung
o/
/o
d,l-Dibenzoylarginin . .
d-Dibenzoylarginin . . .
desgl.
. . .
d - Dibenzoylargininchlorhydrat
Argininmonoehlorhydrat .
desgl.
Guanidinchlorbydrat . .
Hißtidinmonocblorbydrat .
Histidincarbonat . . .
Leucin . . . .
. .
Asparaginsäure . . . .
Glycyl-glycin . . . .
Glutaminsäure . . . .
Ornithinmonocblorhydrat
Leucyl-glycin . . . .
Tryptophan . . . .
Prolin
Taurin
Leucin
Glutaminsäure . . . .
d- Argininmonoehlorhydrat
Arginincarbonat . . . .
2.
3.
4.
Thymol- AlizarinKjeldahl
blau
gelb
ccm
ccin
ccm
0,1 n-HCl 0,2 n-HCl 0,2 n-NaOH
0,6605
0,8024
0,6900
3,3
4,2
3,5
0,65
0,925
0,76
0,7532
1,3360
0,5417
0,6777
1,4427
1 1033
0,30004
0,6334
0,7380
0,4012
0,7717
0 15415
0,5157
0,5109
1,0732
0,76535
3,6
12,70
5,15
9,9
10,3
5,00
4 20
1,075
4,75
2,50
2,35
4,10
070
2,00
2,10
4,00
2,55
0,46
1,52
0,70
0,1
1,77
1,70
2 11
0,5
1,30
1,281
0,575
1,275
0,275
0,9
0,215
2,02
1,17
0,83345
0,4361
7,80
4,55
1,02
1,25
0,591
0,525
0,99
1,58
0,65
3,625
1,00
2,00
1,10
1,125
2,50
0,983
1,225
0,20
0,67
1,05
—
0,125
man kann die Versuchslösung, die den Indicator in der gleichen
Konzentration enthalten muß, auf die eingestellte Farbe titrieren,
d. h. auf ein bestimmtes pH bringen. Beim Thymolblau haben
wir auf pH = 1,2, beim Alizaringelb auf p H =ll,6 titriert.
Als Titriergefäße benützten wir Reagenzgläser. Die Konzentration des Indicators muß während der Titration konstant
erhalten werden, entweder durch nachträglichen Zusatz oder
dadurch, daß man Normallösungen benützt, die von vornherein
Indicator enthalten. Wir verwandten 0,2 -Lösungen und ließen
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K. Felix und H. Müller,
Tabelle 5.
Titration von Aminosäuregemischen gegen Thy molblau.
Leucin
Arginin-HCl
Leucin
Arginin-HCl
Arginin-HCl
Glutaminsäure
Leucin
Ornithin-HCl
Glycyl-glycin
Leucyl-glycin
Arginin-HCl
Leucin
Glutaminsäure
Ornithin-HCl
Leucin
Glutaminsäure
Leucin
Glutaminsäure
Arginin-HCl . .
Tryptophan
Histidin-H2C03 . . . .
Leucin-glycin .
.
Tryptophan
Histidin-H2C03 . . . .
Leucyl-glycin
Arerinin-HCl
1.
2.
Kjeldahl
ccm
0,1 n-HCl
ccm
0,2 n-HCl
2,66
2 60
20
3,90
2,57
1,25
2,00
1,175
1,78
2,05
0,64
2,666
0 85
0,784
1,333
0,85
1,5
0,956
1,95
0,35
1,25
1,025
0,175
0,625
0,257
3,9
1,595
1,70
1,50
1,20
1,715
1,653
1,25
2,00
0,875
0,95
sie aus Mikrobüretten zutropfen. Die Versuchslösung und die
Probe mit Wasser allein wurden auf das gleiche pH und Endvolum gebracht. Die Korrektur für das Wasser braucht nicht
jedesmal von neuem bestimmt zu werden. Sondern man
stellt sich ein für allemal eine Kurve her, aus der die Kubikzentimeter 0,2n-Säure oder Lauge abgelesen werden können,
die nötig sind, um das bei der Titration der Versuchslösung
erreichte Endvolum an Wasser allein auf dasselbe pH zu
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13
Tabelle 6.
Titration von Aminosäuregemischen gegen Alizaringelb.
1.
2.
Kjeldahl
ccm
0,1 n-HCl
0,2 n-NaOH
Leucin
Glutaminsäure
Leucin .
. . .
Glutaminsäure .
Arginin-HCl . · . . .
Tryptophan
Histidin-H2CO3 . . . .
Leucyl-glycin .
Tryptopban
Leucyl-glycin
Arginin-HCl
Ornithin-HCl
Glutaminsäure
2,00
1,275
1,33
Ornitnin-HCl
Glutaminsäure
Arginin-HCl
Leucyl-glycin
Leucin
Taurin
Arginin-HCl
GiwtftTTninfliinrp, ,
0,588
1,275
1,95
1,64
0,8
084
3,90
1,275
Leucyl-glycin
Leucin
Taurin
Areinin-HCl
1,171
0,572
0,600
2.228
.
ccm
2,32
0 85
2,60
0,369
1,053
1,078
0 65
0,35
1,025
1,951
0,575
0,783
1,70
1 925
1,90
1,787
1,225
1,775
1.20
bringen. Die Differenz d<er beiden Werte ist dann die Menge
Lauge oder Säure, die den sauren oder basischen Gruppen
äquivalent ist. Ist das Molekulargewicht, wie bei den Produkten partieller Proteinhydrolysen nicht bekannt, oder liegen
Mischungen in unbekanntem Verhältnis vor, so bezieht man
die Ergebnisse zweckmäßig auf den Stickstoff, indem man berechnet wieviel saure und basische Äquivalente auf l oder
100 Atome Stickstoff titrierbar sind. Die Lösung des Thymolblaus wurde nach W. M., Clark und H. A. Lubs 1 ) bereitet,
und vom Alizaringelb B, eine l°/ 0 ige Lösung verwendet.
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14
K. Felix und H. Müller,
Die Tabellen 4—7 briDgen die Beleganalysen.
Bei i
den Versuchen mit Aminosäuren allein haben wir eine Lö-sung von bekanntem Gehalt (Stab l der Tab. 4) bereitet t
und außerdem noch den Stickstoff nach Kjeldahl in 5 ccmi
Versuchslösung bestimmt (Stab 2). Der Verbrauch an Kubik-zentimeter 0,2 -Lösungen (Stab 3 und 4) bezieht sich immer r
auf dasselbe Volum von ccm. Die Mischungen der Amino- säuren wurden aus diesen Stammlösungen bereitet. In dem i
Stab l der Tabb. 5 und 6 sind die Anzahl Kubikzentimeter r
0.1 -Salzsäure angegeben, die bei der Stickstoffbestimmung *
auf die einzelnen Aminosäuren des Gemisches entfallen.
Verdauung von Gelatine durch Pepsin-Salzsäure.
300 ccm einer ungefähr 10°/0igen Lösung von Gelatines
in 0,1 -Salzsäure wurden in zwei Hälften geteilt, zur einen a
2 g Pepsin in Lamellen (Merck) in 2 ccm 0,1 -Salzsäure ge-löst, zugesetzt und beide 20 Tage bei 38° stehen gelassen/i.
Darnach wurde zu der, die kein Pepsin enthielt, die gleiche e
Menge Ferment, das aber durch einstündiges Erhitzen aufif
100° inaktiviert war, gegeben und beide Proben mit der be-;rechneten Menge Natronlauge versetzt. Die Bestimmungen n
wurden jeweils in 10 ccm der Lösungen vorgenommen. Derr
Versuch wurde von Dr. Ing. P. von Dobeneck ausgeführt.
Tabelle 7.
HCl-Gelatine
Gesamt-N ccm 0,ln-HCl
Basische Gruppen (Thymolblau) ccm 0,2n-HCl
NH„N van Slyke mg
Pormoltitration
ccm 0,2n-NaOH
Saure Gruppen (Alizaringelb)
ccm 0,2n-NaOH
65
PepsinGelatine
65
Zunahme
pro 100 N
—
2,32
3,03
2,2
2,85
5,84
3,2
1505
1,85
2,5
1,37
2,10
2,2
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Zur Titration der Aminosäuren und Proteine gegen Indicatoren.
15
Die Arbeit wurde mit Mitteln der Notgemeinschaft der
Deutschen Wissenschaft ausgeführt. Wir möchten dafür auch
an dieser Stelle unseren Dank aussprechen.
Literatur.
1. W. M. Clark, The Determination of Hydrogen Ions, Baltimore 1922.
2. K. Felix u. A. Harteneck, Diese Zs. Bd. 165, S. 103 (1927).
3. L.J.Harris, Proc. of the Royal Soc. of London, Ser. B, Bd. 95,
S. 500 u. 923 (1923); Bd. 97, S. 364 (1925); ferner Jl. of the Chem.
Soc. Bd. 123, S. 3294 (1923).
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