SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin
Insulin ist ein Hormon der Bauchspeicheldrüse (Pankreas), das bei Wirbeltieren den Transport
von Glukose aus dem Blut in die Körperzellen reguliert. Bei einem Ausfall (z.B. durch
Autoimmunzerstörung der Insulin bildenden Zellen des Pankreas bei Diabetes mellitus)
kommt es im Blut zu einem Zuckeranstieg und in den Zellen zu einer Unterversorgung.
Insulin wurde erstmalig Anfang der 1920er Jahre von Bantig und Best aus tierischen
Bauchspeicheldrüsen isoliert und kurze Zeit später zur Therapie bei Diabetes eingesetzt. Die
Isolierung des Präparates erfolgte für lange Zeit aus Bauchspeicheldrüsen von Schweinen und
Rindern. Dieses Verfahren ist aufwändig und führte, obwohl sich die Insuline von Schwein
und Rind nur in einer bzw. drei Aminosäuren (siehe Abb. 1) vom Humaninsulin
unterscheiden, bei den Patienten häufig zu Nebenwirkungen (immunologische Reaktion).
Anfang der 1980er Jahre konnte Humaninsulin mit Hilfe einer enzymatischen Umwandlung
aus Schweineinsulin hergestellt werden. Dabei wird die endständige Aminosäure Alanin des
Schweineinsulins durch eine Behandlung mit Trypsin abgespalten und durch die Aminosäure
Threonin ersetzt. Dieses Verfahren hilft zwar die Nebenwirkungen zu verringern, es werden
jedoch nach wie vor große Mengen an Schweineinsulin benötigt. Abhilfe kam durch die
gentechnische Herstellung von Humaninsulin mit Escherichia coli bzw. Saccharomyces
cerevisiae. Mit Hilfe von synthetischen cDNAs können heute große Mengen an Insulin
gewonnen werden. Der Bedarf an Insulin ist stetig steigend, da die Diagnose Diabetes
ansteigt. Weltweit liegt die Zahl bei 370 Millionen, in Deutschland sind 6 Millionen an
Diabetes erkrankt, davon 1,8 Millionen insulinpflichtige (Quelle: Gesundheitsbericht 2013
Deutsche Diabetes Hilfe).
A-Kette
R
S
H
G-I-V-E Q-C-C-A-S-V-C-S-L-Y-Q-L-E-N-Y-C-N
G-I-V-E-Q-C-C-T-S-I-C-S-L-Y-Q-L-E-N-Y-C-N
G-I-V-E-Q-C-C-T-S-I-C-S-L-Y-Q-L-E-N-Y-C-N
B-Kette
R
S
H
F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A
F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A
F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-T
Abb1: Aminosäuresequenz von Rinderinsulin (R), Schweineinsulin (S) und Humaninsulin (H)
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin
Humaninsulin besteht aus 51 Aminosäuren und ist aus zwei verschiedenen Ketten aufgebaut.
Die A-Kette enthält 21 Aminosäuren, die B-Kette besteht aus 30 Aminosäuren (siehe Abb. 2).
Die beiden Ketten sind über zwei Disulfid-Brücken kovalent miteinander verknüpft. Die
Synthese in der Bauchspeicheldrüse erfolgt als Prä-Proinsulin. Es enthält zusätzlich eine
Signalsequenz von 19 Aminosäuren, die die Kette zur Prozessierung in das Endoplasmatische
Reticulum dirigiert und ein 31 Aminosäure großes C-Peptid, das im Zuge der Reifung entfernt
wird.
Abb.2: Sekundärstruktur von Humaninsulin
Durch den Zusatz von Reduktionsmitteln (ß-Mercaptoethanol, Dithiothreitol) können die
Disulfidbrücken gelöst und das Insulin-Molekül in die A- und B-Kette gespalten werden. Der
Nachweis der Spaltung kann über SDS-Gelelektrophorese oder HPLC (high pressure liquid
chromatography) erfolgen.
Humaninsulin hat eine Größe von 5,8 kDa, wobei die A-Kette eine Größe von 2,38 und die BKette von 3,4 kDa aufweist. Die übliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [SDS-PAGE]
(Tris-Glycin-Methode nach Laemmli, 1970) ist für die Auflösung von kleinen
Proteinen/Peptiden nicht geeignet. Schägger (2006) hat eine alternative SDS-PAGE
entwickelt (Tris-Tricin), die im Praktikum zur Anwendung kommt. Mit Hilfe der SDS-PAGE
können die einzelnen Proteine einer Proteinmischung in Abhängigkeit von ihrer Größe
aufgetrennt und anschließend über verschiedene Färbemethoden sichtbar gemacht werden. So
lassen sich sowohl Proteinmuster als auch die Reinheit von einzelnen Proteinen nachweisen.
Die Behandlung der Proteine mit Mercaptoethanol bzw. Dithiotreitol führt zu einer Reduktion
von Disulfiden und damit zu einer Entfaltung der Proteine. Durch den Zusatz von
Sodiumdodecylsulfat (SDS), einem anionischen Detergenz welches an die Proteine bindet,
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin
werden die Proteine unabhängig von ihrer Eigenladung negativ geladen. Die Auftrennung der
nun linearen und in Abhängigkeit von ihrer Größe negativ geladenen Proteine erfolgt über
eine Gelmatrix (Polyacrylamid) im elektrischen Feld (Wanderung der Proteine zur Anode).
Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt dabei nur noch von der Größe der Proteine ab. Durch
den Molekularsiebeffekt des Polyacrylamidgels ergeben sich in Abhängigkeit von der Größe
der Proteine unterschiedliche Wanderungsstrecken. Durch gleichzeitiges Auftragen von
sogenannten Markerproteinen (Proteine mit bekannter Größe) auf das Gel lässt sich die Größe
von unbekannten Proteinen ungefähr bestimmen.
Aufgabenstellung:
Humaninsulin (Actrapid, NovoNordisk) soll zur Größenabschätzung und Beurteilung einmal
reduziert und einmal nicht-reduziert auf einem Tris-/Tricingel aufgetrennt werden.
Abb.3: Versuchsaufbau
Durchführung:
Material: Bechergläser, Gelapparatur (Biometra), Spannungsgeber (Bio-Rad), Thermomixer,
Gelwippe
Lösungen:
Insulin
Humaninsulin Actrapid, NovoNordisk, Penfill, 3 ml (100 IE/ml entspricht 3,5 mg/ml)
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Acrylamid-Lösung (AB-6; 49,5 % T, 6% C -> T ist die Prozent-Gesamtkonzentration der beiden
Monomere, Acrylamid und Bisacrylamid; C ist die Prozentkonzentration des Crosslinkers Bisacrylamid)
Acrylamid
46,5 g
Bisacrylamid
6 g
Ad 100 ml Aqua bidest
Acrylamid und Bisacrylamid sind giftig und können Krebs erzeugen sowie die Fruchtbarkeit beeinträchtigen
oder das Kind im Mutterleib schädigen. Bei der Arbeit IMMER Handschuhe tragen!
Gelpuffer (3fach)
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan TRIS
HCl
Na-Dodecylsulfat (SDS)
pH
3M
1M
0.3 %
8,45
Anodenpuffer (10fach)
TRIS
HCl
pH
1M
0,225 M
8,9
Kathodenpuffer (10fach)
TRIS
Tricin
SDS
pH
1M
1M
1%
ca. 8,25
Das Gelsystem besteht aus einem Trenn-, einem Spacer- und einem Sammelgel, die unterschiedlich
zusammengesetzt sind.
Trenngel (16%, 6 M Harnstoff) Für 2 Gele
AB-6
Gelpuffer (3fach)
Harnstoff
Aqua bidest
Ammoniumpersulfat APS (10%)
TEMED
5 ml
5 ml
5,04 g
0,5 ml
50 µl
5 µl
Spacergel
AB-6
Gelpuffer (3fach) 3,
Aqua bidest
APS (10 %)
TEMED
Für 2 Gele
1,5 ml
1 ml
3,1 ml
35 µl
3,5 µl
Sammelgel
AB-6
Gelpuffer (3fach)
Aqua bidest
APS
TEMED
Für 2 Gele
0,75 ml
2 ml
5,3 ml
60 µl
6 µl
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Reduzierender Probenpuffer
SDS
12%
Mercaptoethanol
6%
Glycerin
30 %
Coomassieblau G-250
0,05%
150 mM Tris/HCl
pH 7,0
Nicht reduzierender Probenpuffer
Wie reduzierender Probenpuffer ohne Mercaptoethanol
Färbelösung
Coomassie Brillinat Blue G-250
Methanol
Eisessig
Aqua bidest.
1,75 g
550 ml
92 ml
ad 1000 ml
Entfärbelösung
9% Eisessig
1) Gießen der Polyacrylamidgele
Während der Arbeit Handschuhe tragen!
Es werden zwei Gelvorrichtungen zusammengesetzt. Dafür je zwei Glasplatten zusammen mit
der Dichtung zusammenbauen und mit den Klammern fixieren. Von der ausgeschnittenen
Glasplattenkante 1,2 cm abmessen und mit einem Edding markieren (Stand des Sammelgels).
Von diesem Strich 1 cm abmessen und markieren (Stand des Spacergels) [siehe Abbildung 3]
Abb.4: Gelvorrichtung
Trenn- und Spacergel können GLEICHZEITIG gegossen werden. Dazu Trenngel und
Sammelgel getrennt in zwei Bechergläser nach Rezept (s.o.) zusammen pipettieren. APS und
TEMED zum Start der Polymerisation als letztes zugeben und zunächst das Trenngel bis zur
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin
zweiten Markierung, dann das Spacergel bis zur ersten Markierung mit Hilfe einer 10 mlGlaspipette zwischen die beiden Gelplatten einpipettieren. Nach dem Gießen werden die Gele
mit ein paar Tropfen Aqua bidest überschichtet.
30 Minuten polymerisieren lassen.
Anschließend das Wasser entfernen.
Das Sammelgel nach Rezept (s.o.) zusammen pipettieren und wie oben beschrieben gießen.
Den Kamm für die Taschen einstecken und 30 Minuten polymerisieren lassen.
Ausgehend von der Lösung in der Insulinampulle (3,5 mg Insulin/ml) 1 ml einer
Stammlösung mit 0,266 mg Insulin/ ml ansetzen (Verdünnung mit Wasser). Von dieser
Stammlösung 30 µl Insulin mit 10 µl Probenpuffer (eine Probe mit reduzierendem und eine
weitere Probe mit nicht-reduzierendem Puffer) versetzen und 15 Minuten bei 37 °C im
Thermomixer inkubieren.
Nach Ablauf der Polymerisationszeit die Dichtung aus dem Gel entfernen und das Gel in die
Apparatur einspannen. Die Gelapparatur mit Kathoden- (OBEN) und Anoden-Puffer
(UNTEN) befüllen. Die Taschen gründlich mit Puffer ausspülen.
Auf das Gel eine Spur mit 5 µl Marker (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Fisher
Scientific), je eine Spur mit 5 µl der denaturierten und der nicht-denaturierten und mit 12,5 µl
der denaturierten und der nicht-denaturierten Probe auftragen.
2) Gellauf
Den Gellauf mit einer konstanten elektrischen Spannung von 30 V starten, bis die Proben in
das Gel eingelaufen sind (ca. 15 min). Dann den Lauf mit einer konstanten elektrischen
Stromstärke von 97 mA fortsetzen (die Spannung wird unter diesen Bedingungen zu Beginn
bei ca. 200 V liegen). Den Gellauf stoppen sobald die Bromphenolblau-Bande das untere
Drittel des Trenngels erreicht hat (ca. 45 min).
Die Gelvorrichtung auseinanderbauen, das Gel vorsichtig in eine Schale geben und mit
Coomassie-Färbelösung überschichten. Nach 5 Minuten Anfärbung auf der Gelwippe die
Farblösung abschütten. Die Entfärbung erfolgt mit warmer 9%iger Essigsäure unter dem
Abzug bis die gewünschten Banden zu sehen sind.
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin
Abb.5: Tris-/Tricin-SDS-Gel. 1: Marker, 2: Insulin denaturiert, 3: Insulin nicht-denaturiert
Eine weitere Methode Insulin auf seine Reinheit zu überprüfen, stellt die Auftrennung mittels
HPLC dar. Dabei lassen sich im Gegensatz zu der SDS-Gelelektrophorese auch nichtproteinogene Verunreinigungen/Zusätze detektieren. Mit Hilfe eines Dioden Array Detektors
können alle Stoffe nachgewiesen werden, die Licht zwischen 200 und 500 nm absorbieren.
Durchführung:
Die Insulinlösung wird mit 0,1 N HCl verdünnt, so dass eine Konzentration von 500 µg/mL
erhalten wird. Diese wird anschließend in ein HPLC Vial überführt und 20 µl dieser Lösung
in die HPLC injiziert.
HPLC: 1260 Infinity (Agilent Technologies)
Säule: Poroshell RP-C18, 100 × 4,6 mm, 2,7 µm particle size (pore size 120 Å) Agilent
Detektor: Diode Array Detector
Wellenlänge: 200-500 nm
Injektionsvolumen: 20µL;
Flußrate: 1,0 mL/min;
Elutionsmodus: isokratisch
Mobile Phase: 62 % KH2PO4 Puffer (0 .1M), 26 % Acetonitril, 12 % MeOH; pH 3,1
Länge des Laufs: 15 min
Da die Vorbereitung und Nachbereitung der HPLC Anlage sehr zeitaufwendig ist, wurde der
Lauf schon im Vorfeld des Praktikums durchgeführt. Die Auswertung dieses Laufes wird aber
während der Laufzeit der SDS_PAGE durchgeführt.
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Insulin
Abb.6: HPLC-Chromatogramm von Insulin
Literatur:
Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227 (1970), 680-685.
Najjar, A., Alawi, M., AbuHeshmeh, N., Sallam, A. A rapid, isocratic HPLC method for
determination of insulin and its degradation product. Advances in pharmaceutics, 2014
(2014), 1-6.
Schägger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols, 1 (2006), 16-22.