Proteine

PROTEINE
Biochemie-Protokoll
Gruppe 1
13.05.16
Julia Gnann & Christoph Hartmann
Einleitung
Peptidbindung
Bezeichnung für die Carbonsäureamid-Gruppierung –CO–NH–, die entsteht, wenn die CarboxyGruppe (–COOH) einer Aminosäure (im folgenden: AS) mit der Amino-Gruppe (–NH2) einer anderen
AS unter Wasserabspaltung reagiert. Die Peptidbindung ist das strukturelle Charakteristikum der
Peptide und Proteine. Wie andere Amid-Bindungen auch, unterliegt die P.-B. folgender Mesomerie:
-O
O
C
N
C
N+
H
Abbildung 1: Mesomerie der Peptidbindung
Daraus resultiert zum einen ihre relative chemische Stabilität und zum andern eine eingeschränkte
Drehbarkeit um die C–N-Achse infolge eines partiellen Doppelbindungscharakters; die 4 an der
Peptidbindung beteiligten Atome liegen in einer Ebene – meist in trans-Konfiguration, außer Aminoseitig von L-Prolin. Diese Beschränkungen sind von Bedeutung für die Sekundärstruktur der Proteine.
Die Knüpfung der Peptidbindung erfolgt bei der Protein-Biosynthese in den Ribosomen, kann aber
auch durch andere Enzyme katalysiert werden.
Die Spaltung der Peptidbindung kann chemisch (z.B. durch halbkonz. Salzsäure, Hydrazin) oder
enzymatisch (durch Peptidhydrolasen) erfolgen.
Peptide
(von griech.: peptos = verdaulich).
Kondensationsprodukte von AS.
H2N
R1
O
CH
C
NH
Bezeichnung
R2
O
CH
C
....
für
durch
NH
Peptid-Bindungen
Rn
O
CH
C
verknüpfte
OH
Abbildung 2: Allg. Strukturformel der Peptide
Bauen sich die Moleküle aus 2 AS-Resten auf, so spricht man von Dipeptiden, bei 3 und mehr von Tri, Tetra-, Pentapeptiden etc.; Proteine mit 2–10 AS-Resten faßt man als Oligopeptide, solche mit 10–
100 als Polypeptide zusammen, doch ist der Übergang von den letzteren zu den makromolekularen
Proteinen fließend. Proteine mit Bindungen zwischen den seitenständigen Aminogruppen von
Diaminocarbonsäuren (z.B. Lys) und seitenständigen Carboxy-Gruppen von Aminodicarbonsäuren
(z.B. Glu, Asp) statt der üblichen Peptid-Bindungen zwischen α-NH2 und α-COOH nennt man
Isopeptide.
Zur Schreibung von Protein-Formeln benutzt man meist die 1- oder 3-Buchstaben-Notationen für die
Aminosäuren. So steht z.B. AG bzw. Ala-Gly für L-Alanylglycin; falls nicht anders gekennzeichnet,
steht links die Amino-Gruppe und rechts die Carboxy-Gruppe.
Bedeutung: Auf die Bedeutung der makromolekularen Proteine für pflanzliche und menschliche
Organismen wird bei Proteinen ausführlich eingegangen.
Eine gleichermaßen spezifische Rolle spielen Oligo- und Polypeptide im menschlichen Organismus
z.B. als Hormone (Peptidhormone) und Neurotransmitter und Neuromodulatoren (Neuropeptide).
Für die physiologische Wirkung der Proteine ist neben der Konfiguration die Konformation und die
Dynamik von Bedeutung , und natürlich benötigen die Proteine, um als Mediatoren wirksam werden zu
können, spezifische Rezeptoren. Bei der zellulären Immunantwort werden Antigene (Fremd-Proteine)
von Antigen-präsentierenden Zellen zu Proteinen abgebaut, und an der Zelloberfläche den TLymphocyten zum „Abtasten“ dargeboten; von außen verabreichte Proteine werden ebenfalls
präsentiert. Protein-Ester können für süßen oder bitteren Geschmack verantwortlich sein, und wieder
andere Proteine treten als Toxine pflanzlichen oder tierischen Ursprungs in Erscheinung. Auch unter
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den Antibiotika finden sich eine Reihe von Proteinen (Peptid-Antibiotika), die z.T. AS der
„unnatürlichen“ D-Konfiguration enthalten. Viele der physiologisch aktiven Proteine liegen als
Cyclopeptide vor. Membran-assoziierte Peptide nehmen amphiphile Sekundärstrukturen (s. Proteine)
an .
Biosynthese: Die Biosynthese von Peptiden geschieht meist durch enzymatisches „Ausschneiden“
aus Proteinen (Propeptiden), die nach Maßgabe des genetischen Codes in den Ribosomen gebildet
werden.
Proteine
(von griech.: proteuein = „der Erste sein“) Sammelbezeichnung für natürlich vorkommende
Copolymere, die sich aus 20 verschiedenen α-Aminosäuren als Monomeren zusammensetzen. Von
den nahe verwandten Polypeptiden werden sie aufgrund ihrer molekularen Größe unterschieden: Ab
etwa 100 Monomer-Einheiten (AS-Resten) spricht man meist von Proteinen. Es ergeben sich
Molmassen von 10000 bis mehrere Millionen.
Nach der Zusammensetzung trifft man die Einteilung in einfache Proteine, deren Hydrolyse nur AS
gibt, und zusammengesetzte Proteine, die außer AS essentielle Nichtproteinkomponenten – die
prosthetischen Gruppen – enthalten: Nucleoproteine (Nucleinsäuren; z.B. Chromatin), Glykoproteine
(Kohlenhydrate;
z.B.
Immunglobuline,
Blutgruppensubstanzen),
Lipoproteine
(Lipide),
Phosphoproteine (Phosphorsäure; z.B. Casein, Vitelline), Chromoproteine (Farbstoffe; z.B.
Hämoglobin, Cytochrome), Metallproteine (Metalle; z.B. Transferrin und auch Eisenproteine) u.v.m.
Bedeutung und Funktion: Proteine sind in der belebten Welt allgegenwärtig. Neben Kohlenhydraten
und Fetten sind sie die dritte große Gruppe von Nahrungs- und Reservestoffen. Auf der Anwesenheit
bestimmter Proteine beruhen Struktur, Funktion und Stoffwechsel aller lebenden Zellen und Gewebe.
Man findet sie gleichermaßen in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, so z.B. in den Muskeln (Actin,
Myoglobin, Myosin), im Blut (Hämoglobin), usw.
Vielfältig sind auch die Funktionen der Proteine im Organismus: Als Enzyme, Transport- und
Speichermoleküle (Ferritin, Hämoglobin), molekulare Motoren (Dynein, Kinesin, Myosin),
Gerüstsubstanzen (Sklerop., Gerüst-Eiweiß), in der Immunabwehr (Immunglobuline, Komplement),
Hormone (Follitropin, Thyreotropin), Hormon- und Neurotransmitter-Rezeptoren, Regulatoren (EnzymInhibitoren, Transkriptionsfaktoren), usw.
Eigenschaften: Die meist gut wasserlöslichen Proteine (Ausnahme: Membran-Proteine) sind gegen
physikalische und chemische Einwirkung im allgemeinen ziemlich empfindlich. So gerinnt z.B. das
Hühner-Eiweiß oberhalb 65°C; man bezeichnet diesen Vorgang als Denaturierung. Er beruht auf einer
Zerstörung der Raumstruktur der Proteine unter Aufbrechen der schwachen innermolekularen
Wechselwirkungen (vgl. unten den Abschnitt zur Struktur). Denaturierende Agentien sind z.B.
Harnstoff, Natriumdodecylsulfat, elektrische Ladungen, Säuren, Schwermetallsalze usw. Schonendere
Ausflockungen ohne bedeutende Denaturierung können z.T. durch Alkohol, Ammoniumsalze erreicht
werden. Bei dieser Ausfällung erfolgt eine Schwächung der Hydrathülle der Proteine. Bei der Quellung
werden Wassermoleküle von den Proteinmolekülen gebunden.
Aufgrund der ionisierbaren Seitenketten der sauren AS Asparaginsäure und Glutaminsäure, der
basischen AS Lysin, Arginin und Histidin, sowie der freien Amino- und Carboxy-Gruppe an den Enden
der Polypeptid-Kette kommt dem Protein ein amphoterer Charakter zu, und es nimmt in Abhängigkeit
vom pH-Wert eine jeweils verschiedene elektrische Gesamtladung an; der pH-Wert, bei dem diese
verschwindet, heißt isoelektrischer Punkt (IP). Bei ihm ist die Wasserlöslichkeit des Proteins am
geringsten.
Struktur: Der für Proteine besonders kennzeichnende Stickstoff-Gehalt ist auf ihre Grundbausteine,
die AS, zurückzuführen. Mit Hilfe von Säuren, Laugen oder Enzymen lassen sich alle Proteine nahezu
restlos hydrolytisch in AS zerlegen. Die Analyse dieser Hydrolysate ergibt, daß Proteine – neben
selteneren AS – immer wieder dieselben sog. proteinogenen 20 AS enthalten, wenn auch in
unterschiedlichen Anteilen und nicht immer alle zugleich, nämlich Glycin (Gly), L-Alanin (Ala), L-Serin
(Ser), L-Cystein (Cys), L-Phenylalanin (Phe), L-Tyrosin (Tyr), L-Tryptophan (Trp), L-Threonin (Thr), LMethionin (Met), L-Valin (Val), L-Prolin (Pro), L-Leucin (Leu), L-Isoleucin (Ile), L-Lysin (Lys), L-Arginin
(Arg), L-Histidin (His), L-Asparaginsäure (Asp), L-Asparagin (Asn), L-Glutaminsäure (Glu) und LGlutamin (Gln). Alle optisch aktiven AS der Proteine haben also L-Konfiguration, was im folgenden bei
Nennung einzelner AS nicht mehr speziell angegeben wird.
Peptid-Bindung (sh.a. dort): Der Zusammenschluß dieser AS zu den hochmolekularen Proteinen
geschieht durch die Bildung von Säureamid-Bindungen zwischen den Carboxy- und Amino-Gruppen
verschiedener AS-Moleküle. Demnach kann man Peptide und Proteine mit der folgenden
gemeinsamen Strukturformel charakterisieren:
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Amino-Terminus
H2N
R1
O
CH
C
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c)
NH
Carboxy-Terminus
R2
O
CH
C
AS-Rest
1
AS-Rest 2
Wassers toffbrück enbindung
NH
R3
O
CH
C
AS-Rest 3
NH
Rn
O
CH
C
OH
AS-Rest n
Abbildung 3: Verknüpfung der AS in Proteine durch Peptidbindung
=C
=H
=N
=O
= Seitenket te
Die Peptidbindung kann auch zum Ring geschlossen werden. Am Aufbau des fortlaufenden Teils der
Peptid-Kette ist also jeder AS-Baustein mit dem gleichen Anteil –CO–C(R)H–NH– beteiligt; nur die
außerhalb der Kette liegenden Reste R variieren. Mit Hilfe von in den Seitenketten enthaltenen Aminound Carboxy-Gruppen bilden einige Proteine jedoch auch sog. Isopeptid-Bindungen aus.
Die Polypeptid-Ketten eines makromolekularen Proteins sind sowohl in Lösung als auch im Kristall in
charakteristischer Weise gewunden und gefaltet und besitzen unter gegebenen Bedingungen eine
ganz bestimmte Konformation. Bei der Struktur der Proteine unterscheidet man zwischen Primär-,
Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Für diesen Strukturaufbau sind nicht nur die SäureamidBindungen, sondern darüber hinaus kovalente Disulfid-Brücken und verschiedene Arten von
Nebenvalenzbindungen (zwischenmolekulare Kräfte) maßgebend, unter diesen besonders die
Wasserstoff-Brückenbindung (in Abb. 3 durch Punktlinien dargestellt).
Die Primärstruktur wird durch das Zusammentreten der AS zum Protein unter Knüpfung der
Peptidbindung ausgebildet und ist durch die jeweilige Reihenfolge (Sequenz) der AS charakterisiert.
Sie wird beginnend mit der AS, die eine freie α-Amino-Gruppe besitzt (Amino-Terminus, s. Abb. 1 u. 2)
unter Benutzung des Drei- oder Einbuchstabencodes angegeben.
sserstoffbrückenbindungen des Typs N–H···O=C zwischen den Atomen des Peptid-Rückgrats sind für
die Ausbildung der Sekundärstruktur verantwortlich. Darunter versteht man gewisse regelmäßige,
d.h. vom „Zufallsknäuel“ abweichende lokale Faltungsmuster, v.a. die schraubenförmige,
rechtsgewundene α-Helix und das durch parallele oder antiparallele Anordnung mehrerer Abschnitte
der Polypeptid-Kette zustande kommende β-Faltblatt (Abb. 3).
Die Struktur der α-Helix ist wie folgt zu charakterisieren: 3,6 Aminosäure-Reste pro Windung, 0,54 nm
Ganghöhe, 1,05 nm Gesamtdurchmesser. Die Seitenketten weisen nach außen, Wasserstoffbrücken
bilden sich ungefähr in Richtung der Helix-Längsachse. Durch Prolin-Reste wird die Konformation der
α-Helix gestört. Beim β-Faltblatt liegen die Peptid-Ketten in nahezu gestreckter Konformation vor,
Seitenreste stehen abwechselnd nach beiden Seiten senkrecht von der Faltblatt-Ebene ab, die
Wasserstoff-Bindungen liegen in dieser.
Abbildung 4: Helix- und Faltblattstruktur
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Unter Tertiärstruktur versteht man die jeweilige räumliche Anordnung der Peptid-Kette sowie der ASSeitenreste, die durch Disulfid-Brücken, durch Wasserstoffbrückenbindungen, durch ionische und
durch hydrophobe Wechselwirkungen, meist zwischen AS-Seitenketten, stabilisiert wird. Die HBrückenbindung zwischen AS-Seitenketten, besitzt ihre größte Bedeutung im Inneren des Proteins.
Dort befinden sich aufgrund hydrophober Bindung v.a. unpolare (hydrophobe) AS-Reste, während
sich die polaren und geladenen Seitenketten in wäßriger Lösung eher nach außen wenden. Auch
ohne Disulfid-Brücken können allein durch Nebenvalenz-Stabilisierung mehrere Polypeptid-Ketten zu
einer funktionellen Einheit verbunden sein.
Eine Quartärstruktur liegt dann vor, wenn ein Protein nicht aus einer einzigen Polypeptid-Kette
besteht, sondern aus einer definierten Anzahl solcher Ketten (Untereinheiten), die untereinander nicht
durch Peptidbindungen, sondern durch intermolekular wirkende Kräfte zusammengehalten werden.
Dabei können sich Konformationsänderungen der einen Untereinheit den übrigen mitteilen und auch
bei diesen zu Veränderungen führen (Kooperativität).
Die vier genannten Strukturniveaus (Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur) sind
voneinander abhängig. So kann man – wenn auch noch mit mangelnder Treffsicherheit – die
Elemente der Sekundärstruktur (Helix, Faltblatt) eines bestimmten Proteins aus dessen AS-Sequenz
ableiten .
Die Raumstruktur der Proteine darf man sich übrigens nicht vollkommen starr vorstellen. Ihre
Flexibilität ermöglicht es erst, ihre Funktionen als Enzyme, Rezeptoren usw. zu erfüllen.
Biosynthese: Die Biosynthese der Proteine aus AS oder Translation findet in eukaryotischen Zellen
an den Ribosomen des Cytoplasmas, des rauhen endoplasmatischen Retikulums (rER) und der
Kernhülle statt.
Der Zyklus für jede AS verläuft in folgenden sich wiederholenden Einzelschritten:
1. Bindung der AS an ihre zugehörigen Transfer-Ribonucleinsäuren (tRNA), unter Katalyse
spezifischer Aminoacyl-tRNA-Synthetasen.
2. Bindung derjenigen Aminoacyl-tRNA an den Nucleoprotein-Komplex des Ribosoms, die mit ihrem
Anticodon zu einem 3 Nucleotide großen Bereich (Codon) der Ribosom-gebundenen MessengerRibonucleinsäure (mRNA) paßt. Letztere bestimmt also die Aufeinanderfolge der AS.
3. Übertragung eines Peptids einer gleichfalls am Ribosom gebundenen Peptidyl-tRNA des
Ribosoms auf die Aminoacyl-tRNA (Elongation).
4. Dissoziation der aus der Peptidyl-tRNA freigesetzten tRNA vom Ribosom, Einnahme ihres Platzes
am Ribosom durch die neue Peptidyl-tRNA und Verschiebung der Messenger-tRNA um 3
Nucleotid-Einheiten (Translokation).
Die Synthese der Proteine beginnt am Amino-Ende und endet am Carboxy-Terminus. Man nimmt an,
daß sie sich schon während des Synthesevorgangs zu falten beginnen . Viele sekretorische Proteine
tauchen auch schon während ihrer Synthese mit ihren aminoterminalen Erkennungssequenzen
(Signalpeptiden) in die Membran des rER ein und werden dort eingeschleust. Im Cytoplasma
synthetisierte, für den Import vorgesehene Proteine besitzen ebenfalls Signalsequenzen.
Während der Translation finden mit der Acetylierung und/oder Entfernung eines Methionin-Rests bei
Eukaryonten bereits Modifizierungen des Amino-Terminus des entstehenden Proteins statt. Im rER, im
Golgi-Apparat aber auch im Cytoplasma erfolgen etliche posttranslationale Modifikationen, (Acylierung
, Carboxylierung, Glykosylierung, usw.). Proteohormone und sekretorische Enzyme müssen
schließlich noch aus Vorstufen (Prohormonen bzw. Proenzymen oder Zymogenen)
„herausgeschnitten“ werden .
Abbau: Von außen mit der Nahrung zugeführte Proteine werden im Verdauungstrakt, körpereigene
dagegen meist intrazellulär zu AS abgebaut. Bei der Verdauung erfolgt im Magen und Darm eine
Aufspaltung in Peptide bzw. AS unter dem Einfluß Eiweißspaltender Enzyme (Proteasen), die
allerdings zuvor erst aus ihren Zymogenen freigesetzt werden müssen. Bei den Proteasen
unterscheidet man zwischen Endopeptidasen, die Proteine nur innerhalb der Peptid-Kette spalten
(Pepsin im Magen, Trypsin und Chymotrypsin im Dünndarm) und Exopeptidasen, die nur am Ende der
Peptid-Ketten angreifen (Carboxypeptidase, Aminopeptidase, Dipeptidase im Darm). Die
Spaltprodukte wandern durch die Darmwand und werden in den arbeitenden Zellen zu CO 2 und H2O
oxidiert (Katabolismus) oder aber mit Hilfe von Nucleinsäuren und Enzymen zu arteigenen
Eiweißstoffen zusammengefügt (Anabolismus). Beim vollständigen Abbau ergibt 1 g Protein die
Energie von etwa 17,2 kJ (4,1 kcal.).
Bei Proteolyse innerhalb von tierischen Zellen spielen auch Lysosomen eine wichtige Rolle. Dabei
werden Proteine, die bestimmte AS-Sequenzen enthalten, schneller abgebaut als andere.
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Versuche
Denaturierung und Löslichkeit von Proteinen
Fällung durch Neutralsalze
Mittels Fällung durch Neutralsalze kann man z.B. verschiedene Proteine des Blutserums
fraktionieren, da sie bei verschiedenen Salzkonzentrationen ausfällen.
2ml Serum + 2ml Ammoniumsulfatlösung  Globuline fallen aus.
Zum Filtrat gibt man 2 Messerspitzen Ammoniumsulfat  Albumin fällt aus.
Diese Art der Denaturierung ist in beiden Fällen reversibel, man benötigt beim GlobulinNiederschlag viel H2O.
Hitzedenaturierung
Irreversible Denaturierung des Serums durch Kochen im Wasserbad.
Alkoholfällung
2ml Serum + 5-10ml 96%iger Alkohol  Niederschlag. Diese Fällung ist reversibel.
Bei der Hitzedenaturierung wird die Tertiärstruktur des Proteins irreversibel zerstört. Bei der
Alkoholfällung kommt es zu einer reversiblen Veränderung der Hydrathülle und bei Fällung mit Salzen
zur Konkurrenz um Hydratwasser.
Bestimmung des isoelektrischen Punktes (IP) von Casein
(Eichgerade sh. Anhang)
RG-Nr.
1
berechneter
3,99
pH-Wert
gemessener
6,01
pH-Wert
beobachtete
0
Fällung
E595nm
Proteingehalt
[μg/ml]
2
3
4
5
6
7
8
9
3,38
3,68
3,53
3,375
3,22
3,07
2,92
2,77
5,7
5,3
5
4,6
4,25
4
3,68
3,35
0
0
0
+++
++
+
0
0
1,288
1,289
1,402
1,367
0,074
0,154
0,849
1,268
1,279
390
391
>400
399
15
27
219
381
384
↑
Isoelektrischer Punkt von Casein
Fragen
Warum weichen die gemessenen pH-Werte von den berechneten ab?

Pufferwirkung von Casein
Welche Werte sind für die Bestimmung des IP relevant?

Der pH, bei dem die geringste Proteinkonzentration gemessen wurde, d.h., bei dem die stärkste
Ausfällung (=schlechteste Löslichkeit) erfolgte, entspricht dem IP des Caseins.
Warum ist die Löslichkeit eines Proteins am IP am niedrigsten?

Aufgrund der ionisierbaren Seitenketten der sauren AS Asparaginsäure und Glutaminsäure, der
basischen AS Lysin, Arginin und Histidin, sowie der freien Amino- und Carboxy-Gruppe an den
Enden der Polypeptid-Kette kommt dem Protein ein amphoterer Charakter zu, und es nimmt in
Abhängigkeit vom pH-Wert eine jeweils verschiedene elektrische Gesamtladung an; der pH-Wert,
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bei dem diese Gesamtladung verschwindet, heißt isoelektrischer Punkt (IP). Bei ihm ist die
Wasserlöslichkeit des Proteins am geringsten, da es ungeladen/hydrophob ist.
Trennung eines Proteingemisches mit der Gelfiltration
Die Gelchromatographie ist eine als Säulenchromatographie
durchgeführte Flüssigkeitschromatographie (s. Abb.4). Die
stationäre Phase besteht aus Perlen mit einem heteroporösen
gequollenen Netzwerk, dessen Porengrößenverteilung über
mehrere Größenordnungen variiert, so daß die Fraktionierung nach
Molekülgröße (Molekularsieb-Effekt) erfolgt. Eine flüssige Phase mit
dem gelösten Polymeren wird durch das Gel gegeben, wobei die
Polymer-Moleküle in alle Teile des Netzwerkes diffundieren, die
ihnen aufgrund ihrer Größe versperrt sind. Folglich dringen die
kleineren Moleküle des Gelösten tiefer ein und werden länger in der
Säule zurückgehalten als die größeren Moleküle. Solche Moleküle,
die größer sind als die größten Poren des gequollenen Gels,
können die Gelkörner nicht durchdringen und wandern an diesen
vorbei; sie verlassen die Säule zuerst. Die Moleküle erscheinen
daher im Eluat in der Reihenfolge abnehmender Größe.
In unserem Fall besteht das aufzutrennende Gemisch aus
Hämoglobin und Fluoreszin, wobei Hb mit 64kDa das große und
Fluoreszin mit 332Da das kleine Molekül ist.
Zuerst verläßt das rotbraune Hb die Säule, da es nicht in die
Gelporen eindringen kann, und zuletzt erreicht das gelbe Fluoreszin
das Ende der Säule (s.Abb.6).
Abbildung 5:Gelchromatographie
Abbildung 6
Bestimmung freier SH-Gruppen im nativen und
denaturierten Ovalbumin
DTNB reagiert im Alkalischen mit SH-Gruppen-haltigen Substanzen unter Freisetzung eines farbigen
Anions. Die Konzentration des freigesetzten Anions ist gleich groß wie die Konzentration der freien
SH-Gruppen in der Analyse und läßt sich bei λ = 412nm mit ε = 13600 moll*cm bestimmen.
E
V
 d
Masse Protein
mol Protein =
Molekulargewicht
mol SH-Gruppen =
Zahl der SH-Gruppen pro Molekül =
mol SH  Gruppen
mol Protein
Häufig liegen SH-Gruppen nicht direkt zugänglich an der Oberfläche des Proteins. Damit möglichst
alle SH-Gruppen mit DTNB reagieren können findet die Reaktion zusätzlich unter denaturierenden
Bedingungen durch Zugabe von Harnstoff, Guanidin und SDS statt.
Berechnung für RG 1:
MGOvalbumin = 44000
Masse Protein = 1mg (0,1ml von 10mg/ml)
0,053  mol  cm
 0,003l = 1,17∙10-8mol
13600l  1cm
0,001g  mol
mol Protein =
= 2,27∙10-8mol
44000 g
mol SH-Gruppen =
SH-Gruppen =
1,17  10 8 mol
= 0,5
2,27  10 8 mol
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RG-Nr.
1
2
3
4
Harnstoff
X
Guanidin
X
SDS
X
H2O
X
Ovalbumin
X
X
X
X
E412nm
0,053
0,136
0,317
0,194
SH-Gruppen
0
1,32
3,08
1,89
Bei Glas 1 ist keine denaturierende Substanz zugegeben und die Zahl der Bindungsstellen ist gering.
Nach Zugabe von denaturierenden Substanzen – RG 2-4 – steigt die Zahl der SH-Gruppen. dies läßt
darauf schließen, daß die meisten SH-Gruppen des Ovalbumins unzugänglich in dessen Inneren
liegen.
Guanidin hat in diesem Fall die Tertiärstruktur des Ovalbumins am meisten zerstört, da in diesem
Ansatz die meisten SH-Gruppen nachzuweisen waren.
Fragen
Welche Effekte sind die treibenden Kräfte für die Faltung einer PolypeptidKette zur nativen Konformation?

Für den Strukturaufbau sind die Säureamid-Bindungen, kovalente Disulfid-Brücken und
verschiedene Arten von Nebenvalenzbindungen (zwischenmolekulare Kräfte) maßgebend, unter
diesen besonders die Wasserstoffbrückenbindung. Zusätzlich falten sich Proteine mit Hilfe sog.
Chaperone.
Welche Funktionen haben SH-Gruppen in Proteinen?

Die SH-Gruppen bilden vornehmlich Disulfid-Brücken aus. Durch Disulfid-Brücken können in der
Sequenz voneinander entfernte Bereiche einer Polypeptid-Kette oder mehrere Polypeptid-Ketten
kovalent miteinander verbunden werden. Im Insulin finden sich z.B. zwei Disulfidbindungen
zwischen den beiden Polypeptid-Ketten und eine dritte zwischen den AS-Resten 6 und 11 der
sog. A-Kette.
Spektrale Titration der Bromkresolgrün-Bindung an Albumin
Gibt man zu einer konstanten Menge Bromkresolgrün steigenden Konzentrationen von BSA
(Rinderalbumin) und mißt die ΔE-Werte (spektrale Titration), so erhält man beim Auftragen von ΔE
gegen cBSA eine Kurve, die den Verlauf der Sättigung einer bestimmten Bromkresolgrün-Menge mit
BSA wiedergibt.
RG-Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
cBSA
0
0,3
0,6
1
1,6
3,3
3,3
6,6
10
16,6
33,3
50
ΔE630nm
0,012 0,044 0,062
0,1
0,163 0,165 0,230 0,251 0,257 0,261 0,27
(Kurve s. Anhang)
Die beiden Geraden schneiden sich bei cBSA = 4,5μmol/l.
cL tot = 12,5μmol/l
Anzahl der Bindungsstellen =
c L tot 12,5
=
= 2,7 ≈ 3 Bindungsstellen.
4,5
c BSA
Fragen
Nennen Sie Beispiele, wo die Bindung niedermolekularer Substanzen an
Serumalbumin beim Transport im Serum eine wichtige Rolle spielt.

Albumin transportiert folgende Substanzen: Fettsäuren, Vitamin B12, Mg2+, Cu2+, Bilirubin,
Cholesterin, Pharmaka, u.v.m.
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Abbildungsverzeichnis:

Abbildung 1: CD-Römpp, Chemielexikon; Thieme

Abbildung 2: CD-Römpp, Chemielexikon; Thieme

Abbildung 3: CD-Römpp, Chemielexikon; Thieme

Abbildung 4: CD-Römpp, Chemielexikon; Thieme

Abbildung 5: ckjh

Abbildung 6: ckjh
Quellen:

CD-Römpp, Chemielexikon; Thieme

Pschyrembel, 258. Auuflage; WdeG

Taschenatlas Biochemie; Thieme
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