Regulation des Stoffwechsels
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Block III: Regulation des Stoffwechsels Bacillus subtilis Antibiotika und Sporulation Yvonne Voges und Melanie Thompson Inhalt I. Einleitung ............................................................................................................. 1 II. Material und Methoden ........................................................................................ 9 III. Ergebnisse….. ................................................................................................ 10 IV. Diskussion ...................................................................................................... 32 V. Literatur .............................................................................................................. 44 VI. Anhang ........................................................................................................... 45 I. Einleitung Bacillus subtilis ist ein stäbchenförmiges, Gram-positives Bakterium. Es wird zur Klasse der Bazillen und Clostridien zugeordnet, und weist dementsprechend einen niedrigen G+C-Gehalt auf. B. subtilis ist ubiquitär verbreitet und kann aus Böden, Wasser und auch Luft isoliert werden. Da in der Natur Nährstoffe nicht immer ausreichend vorhanden sind, treten beinah ständig wechselnd Stress- und Hungersituationen auf, hierbei kommen Bacillus subtilis zwei Eigenschaften besonders zu Gute: Zum einen ist er in der Lage antimikrobielle Substanzen zu produzieren. Diese werden ausgeschüttet und können schon in geringen Konzentrationen andere, um Nährstoffe konkurrierende Mikroorganismen im Wachstum hemmen. Antibiotika weisen verschiedenen Angriffsorte auf, so können die Zellwandbiosynthese, Replikation, Transkription oder Translation des Konkurrenten in Mitleidenschaft gezogen werden. B. subtilis stellt einen bestimmten Typus Antibiotika, die sog. Lantionin-haltigen Antibiotika, oder auch: Lantibiotika her. Diese bilden, durch Wechselwirken mit dem Zellwandbestandteil Lipid II, durchlässige Poren in der Cytoplasmamembran Gram-positiver Bakterien, was für den Austritt lebenswichtiger Komponenten um im letzten Schritt den Zusammenbruch des Membranpotentials sorgt. B. subtilis produziert die Lantibiotika Subtilin, Ericin, Sublancin sowie das Peptidantibiotikum Subtilosin, die als Vorläuferpeptide synthetisiert und durch post-translationale Abwandlungen zu aktiven antimikrobiellen Substanzen modifiziert werden. Zum anderen ist B. subtilis in der Lage, bei anhaltendem Stress Überdauerungsformen zu bilden. Diese Endosporen sind widerstandsfähig gegen Hitze, Austrocknung, Strahlung und extreme pH-Werte und können sehr lange in einem ruhenden Stadium überdauern. Endosporen entstehen durch inäquale Teilung der Mutterzelle und Auflagerung mehrerer Wandschichten, sie werden unter Lyse der Mutterzelle entlassen und keimen erst bei einer ausreichenden Nährstoffgrundlage aus. Im ersten Teil des Versuches (1.1) wird die Produktion von Antibiotika untersucht. Verschiedene B. subtilis Stämme, sowie B. licheniformis werden auf ihre Fähigkeit überprüft, Antibiotika zu produzieren. Dies geschieht anhand eines AgarDiffusionstestes, bei welchem die Teststämme in ca. 2cm Länge auf einer 1|Seite Micrococcus luteus-Indikatorplatte aufgebracht werden. Produzieren genannte Stämme antimikrobiell wirksame Substanzen, hemmen diese das Wachstum von M. luteus und Hemmhöfe um die zu untersuchenden Stämme werden sichtbar. Im darauf folgenden Teil des Versuches (1.2) wird die Autoinduktion mittels Subtilin getestet. Subtilin wirkt als Pheromon und induziert die Expression der SubtilinBiosynthese. Als Autoinduktor wird Subtilin durch eine membranständige SensorHistidinkinase erkannt und gebunden. Im nächsten Schritt wird der Histidinrest autophorphoryliert und der Phosphatrest im Anschluss daran auf den ResponseRegulator SpaR übertragen. Dieser ist nun aktiviert und sorgt für die Expression der spa-Gene. Der Test erfolgt, indem ein Subtilin-Reporterstamm in Kontakt mit verschiedenen Teststämmen auf einer 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-DGalactopyranosid (X-Gal)-Platte ausgestrichen wird. Eine auftretende Blaufärbung zeigt die Produktion von Subtilin durch die Teststämme an. Der letzte Abschnitt des ersten Versuchsteils (1.3) dient dazu, die Produktion von Subtilin in Abhängigkeit der Wachstumsphase zu bestimmen. Hierzu werden über einen Zeitraum von acht Stunden hinweg Proben einer Subtilin-Reporterstamm Zellkultur entnommen und anhand der optischen Dichte eine Wachstumskurve erstellt. Zu den einzelnen Zeitpunkten werden zusätzlich Proben entnommen, anhand derer eine Subtilinbestimmung durchgeführt wird. Letztere geschieht mit Hilfe einer Reportergenfusion des spa-Promotors mit dem promotorlosen lacZ-Gen. Die durch das lacZ-Gen codierte β-Galactosidase hat die Fähigkeit das angebotene Substrat ortho-Nitro-Phenol-Galactose (oNPG) zu spalten. Das resultierende Monomer orthoNitro-Phenol weist eine gelbe Färbung auf, die anhand der Messung der optischen Dichte quantifiziert werden kann. Dies lässt Rückschlüsse auf die Promotoraktivität des spaS-Promotors und damit auch auf die Subtilinmenge in der Probe zu. Im zweiten Versuchsteil (2.1) geht es um Zellwandbiosynthesestress induziert durch Lantibiotika und Bacitracin. Ein Bestandteil bakterieller Zellwand ist das sog. Lipid II. Interagiert eine antimikrobielle Substanz mit diesem Komplex, wird ein zweiKomponenten-System - LiaRS - angesprochen, welches die Expression von Genen den lia-Genen - induziert. Diese lia-Gene dienen dem Selbstschutz und werden darum auch als Resistenzgene bezeichnet. Wird eine Reportergenfusion zwischen dem liaI-Promotor und dem promotorlosen lacZ-Gen vorgenommen, so kann dies dem Nachweis von Lipid II-interagierenden Antibiotika dienen. Der, die 2|Seite Reportergenfusion enthaltende, Reporterstamm (Lipid II-Stress-Indikatorstamm) exprimiert bei Lipid II-abhängigem Zellwandbiosynthesestress nebst den lia-Genen auch die β-Galactosidase, codiert durch das lacZ-Gen. Die Spaltungsprodukte letzteren sind dann ein Indikator dafür, dass Lipid II-interagierende Antibiotika vorhanden sind. Im weiteren Verlauf des Versuches wird die Bacitracin-Konzentration ermittelt, bei der das zwei-Komponenten-System LiaRS reagiert (2.2). Hierzu werden dem Lipid II-Stress-Indikatorstamm verschiedene Bacitracin-Konzentrationen zugesetzt und die Aktivität des liaI-Promotors anhand der Spaltungsprodukte der βGalactosidase ermittelt. Einige Bakterienarten sind befähigt in gewissen Stresssituationen (meist Mangel von essenziellen Nährstoffen) Endosporen auszubilden. Die Sporen werden bei dieser Art der Zelldifferenzierung innerhalb der Zelle gebildet, wie bereits der Name – Endospore – verrät. Die Endosporenbildung durchläuft mehrere Stadien (Abb.1), wobei um die Spore mehrere „Hüllen“ gebildet werden. In Phase I haben sich beide Kopien des Chromosoms in der Längsachse der Zelle angeordnet. Der entscheidende Schritt jedoch, der zu der Ausbildung der Spore führt, ist die asymmetrische Teilung (Phase II). So entsteht die kleinere Präspore, welche durch das sich bildende Septum von der größeren Muterzelle getrennt wird. In Phase III umwächst der Mutterzellen-Protoplast die Präspore. Dieser Prozess wird auch als „Engulfment“ bezeichnet, das soviel bedeutet, wie Verschlingen oder Einkapselung. 3|Seite Abbildung 1: Der Sporulationszyklus von Bacillus subtilis (2) Über die Membran der Präspore wird nun nach Außen Peptidoglykan abgegeben und es bildet sich die Sporenrinde (cortex - Phase IV). Die äußere Sporenhülle (spore coat – Phase V) wird als proteinhaltige Schicht von der Mutterzelle gebildet. In Phase VI und VII kommt es zur Reifung der Spore, sowie zu deren Freisetzung durch Lyse der Mutterzelle. Die dormante Spore ist nun in der Lage über einen längeren Zeitraum, sowie unter lebensfeindlichen Bedingungen, wie hohe Temperaturen, Austrocknung oder gar UV-Bestrahlung, zu überdauern. Verbessert sich nach einiger Zeit das Nährstoffangebot, so keimt die Spore aus und steigt wieder in den vegetativen Zellzyklus ein. Verschlechtern sich diese wiederum, so wird ein weiteres Mal der Sporulatonszyklus eingeschlagen. Im Gegensatz zu der „normalen“ Teilung, in der Mitte der Zelle, wird bei der Sporulation eine erhöhte Ansammlung von FtsZ-Protein1, sowie die Synthese von dem sporulationsspezifischen Protein SpoIIE beobachtet. Das FtsZ-Protein ist ebenfalls bei der Zellteilung während des vegetativen Wachstums beteiligt, hierbei 1 FtsZ, auch filamenting temperature sensitive protein Z genannt und ist ein Tubulin Homologon. 4|Seite bildet sich der Z-Ring in der Mitte der Zelle aus. Dieser Ring zeigt die Position der Septumbildung an (siehe Abb. 2). Abbildung 2: Zellteilung während des vegetativen Wachstums (a) und Zellteilung während der Sporulation von Bacillus subtilis (b) (2) Während der Sporulation kommt es zu einer Umorientierung des Z-Ringes (siehe Abb. 2 - b). Hier positionieren sich zwei separate Ringe an beiden Polen der Zelle, wobei nur einer ausgewählt wird, das Septum zu bilden. Die Umstellung der Position des Z-Ringes ist darauf zurückzuführen, dass es zu einer helikalen Umverteilung des FtsZ-Proteins von der Mitte der Zelle, zu den Zell-Polen kommt. Die Expression der spo-Gene2 unterliegt einer zeitlichen, als auch räumlichen Kontrolle. Die entsprechenden spo-Gene werden nur während der Sporulation gebildet, und das in einer strikt vorgegebenen Reihenfolge. Hinzu kommt, dass diese Gene, entweder in der Mutterzelle oder in der Präspore selbst, exprimiert werden. Demzufolge durchlaufen Differenzierungsprogramme, Mutterzelle, wobei als auch alternative Präspore Sigmafaktoren unterschiedliche (-Faktor) eine bedeutende Rolle spielen (siehe Abb. 3) 2 Die spo-Gene sind die Gene, die für die Sporulation essentiell sind. 5|Seite Abbildung 3: Genexpression innerhalb der Kompartimente, sowie interkompartimentale Signale In Abb. 3 ist zunächst erkennbar, dass die beiden Kompartimente miteinander in Verbindung stehen und abwechselnd von Mutterzelle und Präspore verschiedene Signale in Aktion treten. In der Präspore wird der F aktiviert und treibt somit die Expression von SpoIIR und G an. SpoIIR induziert in der Mutterzelle die Umwandlung des inaktiven pro-E, in die aktive Form E über SpoIIGA. E hingegen bewirkt die Expession der inaktive Form pro-K, sowie von SpoIIIA, SpoIVFA 3, SpoIVFB 4 und BofA 5. G 6 wird durch SpoIIIA, über SpoIIIJ, von einem noch unbekannten Inhibitor in der Präspore, gelöst und somit aktiviert (in Abb. 3, als „X“ gekennzeichnet). Die aktive Form von G wiederum, vermittelt die Expression von SpoIVB, wobei dieses Protein als Signal zwischen der Präspore und der Mutterzelle dient. Dieses induziert die Trennung des SpoIVFA-BofA-SpoIVFB-Komplexes und 3 SpoIVFA: Membranprotein SpoIVFB: Membranassoziierte Protease (für K -Prozessierung) 5 BofA: Inhibitor für SpoIVFB 6 G ist Signal zur Ausschleusung der Protease 4 6|Seite mithilfe von SpoIVFB wird der inaktive pro-K in die aktive Form K 7 umgewandelt. K setzt das Signal zur Lyse der Mutterzelle und die Spore wird freigesetzt (3.1). Die Transformation beschreibt die Fähigkeit freie DNA aufzunehmen. Organismen, die dazu befähigt sind, werden auch als natürlich kompetent bezeichnet. Der Sinn hinter der Aufnahme von Fremd-DNA, ist diese als Erweiterung des eigenen Genoms zu integrieren, oder diese gar zu zersetzen und als Nahrungsquelle zu verwenden. B. subtilis ist hinsichtlich der Kompetenz determiniert, so dass die entscheidenden Gene in Stresssituationen induziert werden. Die Ausbildung der Kompetenz ist abhängig von der Wachstumsphase und kann durch ein Umsetzten der B. subtilisKultur von einem reichhaltigen Medium, in ein Minimal-Medium erlangt werden. Die Transformation beginnt mit der Bindung der DNA an spezifische Proteine – den Com-Protein-Komlpex. Im Verlauf werden Endonucleasen sekretiert, diese fragmentieren die DNA-Moleküle, wobei die DNA-Sequenz unspezifisch ist, so dass die Spaltung in festgelegten Abständen erfolgt (10 kBp bis maximal 20 kBp). Die linearisierten Doppelstränge werden mittels membrangebundener DNA.Bindeproteine in die Zelle eingeschleust, wobei nur ein DNA-Strang aufgenommen wird, der andere wird außerhalb der Zelle nukleolytisch abgebaut. Der aufgenommene Strang wird in das Rezipientengenom eingebaut, wobei die Polarität der DNA nicht relevant ist. Die Kompetenz von B. subtilis entsteht in der mittleren bis späten exponentiellen Wachstumsphase, wobei eine Transformationshäufigkeit von durchschnittlich 10 -3 erreicht wird (siehe Skript, sowie Folien zur Vorbesprechung). In diesem Versuch (4.1-4.3) soll die Fähigkeit von B. subtilis, freie DNA aufzunehmen, untersucht werden. Es werden B.subtilis spaS-Zellen verwendet. Diese sind nicht mehr befähigt Subtilin zu produzieren. Experimentell wird nun untersucht, ob B. subtilis durch doppelt homologe Rekombination des SpaS-Gens wieder befähigt wird, dieses Antibiotikum zu synthetisieren. Hierbei wird das Plasmid pMB32 zur Hilfe genommen. Es enthält das Strukturgen von Subtilin unter der Kontrolle des spaS-Promotors. Ebenfalls auf dem Plasmid K ist Signal zur Apoptose, wird in Mutterzelle zuerst in der inaktiven pro-K Form synthetisiert und durch Signal seitens der Präspore wird K zur aktiven Form umgewandelt. 7 7|Seite enthalten, sind Resistenzkassetten für Ampicillin und Neomycin, sowie homologe Sequenzen zum Amylase-Genlocus in B. subtilis. Die Amylase wird synthetisiert, um Stärke zu Glucose zu hydrolysieren, welche wiederum im Bakterium verwertet werden kann. Durch doppelt homologe Rekombination in den AmyE-Locus kann die entsprechende DNA-Sequenzen in das Chromosom von B. subtilis integriert werden, in diesem Fall das funktionale spaS, unter Kontollle des spaS-Promotors. Zusätzlich wird die Neomycin-Resistenzkassette mit eingebaut (siehe Abb. 4). Abbildung 4: Doppelt homologe Rekombination in B. subtilis ATCC 6633 spaS8 Der Einbau in den Amylase-Genlocus, sowie das Einbringen der Neomycinresistenzkassette, kann nun zum einen, bei erfolgter Transformation hinsichtlich der errungenen Neomycinresistenz selektiert werden. Ein weiterer Hinweis zu einer erfolgreichen Transformation, ist darauf zu testen, ob das Bakterium weiterhin in Lage ist das Enzym Amylase zu bilden, und somit ebenso befähigt ist Stärke zu spalten. Ist dies nicht der Fall und das Bakterium zeigt einen Amy—Phänotyp auf, so ist das Teilstück des Plasmiden durch doppelt homologe Rekombination in das Bakteriumchromosom integriert worden. Zeigt sich jedoch weiterhin ein Amy+-Phänotyp, vergleichend zum Wildtyp, so ist der AmyE-Locus weiterhin intakt und es ergeben sich die Möglichkeiten, dass es entweder zu keiner Abb.4 aus Folien zu der Praktikums-Vorbesprechnung 8|Seite Transformation gekommen ist, oder das Teilstück des Plasmids nur durch einfach homologe Rekomination (Campbell-Typ) eingebaut worden ist. II. Material und Methoden Siehe Skript, mit folgenden Änderungen: 1. Produktion von Antibiotika, Regulation der Subtilinbiosynthese 1.1. Qualitativer Nachweis von Antibiotika (Agar-Diffusionstest) Die Stämme spaB und spaC wurden nicht auf der Micrococcus luteusIndikatorplatte ausgestrichen. 2. (L)antibiotika-Wirkung Zellwandbiosynthesestress 2.2. Zellwandbiosynthesestress in Abhängigkeit von der Bacitracin- Konzentration Zur 5ml TY/0,3 M NaCl Vorkultur des Lipid II-Stress-Indikatorstammes BFS2470 wurden 50 µl Erythromycin (0,1 mg/ml in Ethanol) gegeben. Auch die 1:40Verdünnung der Vorkultur in frisches TY/0,3 M NaCl wurden 50 µl Erythromycin (0,1 mg/ml in Ethanol) hinzugefügt. Im Anschluss daran wurden 200 µl dieser Kultur in eine 96-well Mikrotitierplatte aliquotiert. 9|Seite 4. B. subtilis Transformation 4.2. Amylase-Test Es wurden zehn vermutliche Transformanten auf Stärkehaltigen LB-Platten ausplattiert. Jeweils in Doppelbestimmung, da eine Platte für den Amylase-Test mit der Iod-Kaliumiodid-Lösung angefärbt und von der anderen werden die vermeintlichen Transformanten nochmals zur Kontrolle ausgestrichen. Hier wurden als positiv Kontrolle der Wildtyp B. subtilis ATCC 6633 und als negativ Kontrollen B. subtilis 6633: amyE::PspaS-lacZ, sowie B. subtilis 6633: spaSamyE::spaS mitgeführt. III. Ergebnisse 1. Produktion von Antibiotika, Regulation der Subtilinbiosynthese 1.1. Qualitativer Nachweis von Antibiotika (Agar-Diffusionstest) Es werden die folgenden Stämme auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Antibiotika zu produzieren: Tabelle 1: Zusammenfassung der verwendeten Stämme und ihres Genotyps Stamm Wildtyp (WT bzw. a) Genotyp Eigenschaften produziert die AB: Subtilin (Sub+) Subtilosin 10 | S e i t e ATCC 6633 spaS (b) spaS::spec Surfactin Mycosubtilin Sub- SpectinomycinR spaS+spaS spaS::spec SpecR (c) amyE::spaS Sub+ NeomycinR SpecR NeoR Subtilin- spaS::spec Reporterstamm amyE::PspaS-lacZ (f) Bacillus subtilis 168 Produziert die AB: Sublancin Subtilosin besitzt kein SubtilinGencluster Bacillus licheniformis (g) Bacitracin Tabelle 1 fasst neben den verwendeten Stämmen auch deren Genotypen zusammen. Der Wildtyp des Stamms ATCC 6633 besitzt noch den ursprünglichen Subtilin-Gencluster ohne Veränderungen. Die Mutante spaS weist, durch doppelt homologe Rekombination, anstelle des Strukturgens spaS eine Gen-Kassette, die eine Spectinomycin-Resistenz vermittelt auf. Mutante spaS+spaS besitzt die gleiche Mutation, jedoch zusätzlich zu diesem Austausch auch eine Mutation im amyLocus, dem Gencluster, der für die Amylase codiert. Hier wurde das amyE-Gen, ebenfalls durch doppelt homologe Rekombination, mit dem Strukturgen für die Subtilinproduktion spaS ausgetauscht. Außerdem wurde eine Neomycin-Resistenz eingefügt. Der Subtilin-Reporterstamm hat ebenfalls einen Austausch des Strukturgens spaS gegen eine Spectinomycin-Resistenzkassette. Hinzu kommt ebenfalls eine Mutation im amyE-Gen, diesmal jedoch nur durch Einfügen des Promotorbereichs des spaS-Gens in Fusion mit dem promotorlosen lacZ-Gen, welches für die β-Galactosidase codiert. Bacillus subtilis 168 genau wie Bacillus licheniformis sind beide Wildtyp-Stämme, die jedoch unterschiedliche Arten von Antibiotika produzieren. 11 | S e i t e Werden diese Teststämme auf einer M. luteus-Indikatorplatte ausgestrichen, ergibt sich folgendes Bild: Abbildung 5: Agar-Diffusionstests: Anhand der Hemmhöfe kann die Produktion antimikrobieller Substanzen bestätigt werden, die Teststämme d) spaB und e) spaC wurden nicht ausgestrichen Abbildung 5 zeigt deutlich die auf der M. luteus-Indikatorplatte erzeugten Hemmhöfe. Teststamm a) der ATCC 6633 Wildtyp zeigt einen sehr breiten Hemmhof um die Kolonie herum. Die Hemmhofgröße beträgt 4-5mm von der Grenze des Teststammes bis zu den ersten M. luteus Kolonien. Der Gesamtdurchmesser beträgt 1,3-1,5cm. Das Wachstum von M. luteus beschränkt sich auf die Grenze des Hemmhofes. Die Mutante spaS (b) zeigt einen schmalen Hemmhof um die Kolonie herum. Die Größe des Hemmhofes beträgt durchschnittlich 2mm mit einem Durchmesser von 0,8-0,9cm. Auch hier wächst M. luteus nur bis zur Grenze des Hemmhofes. Teststamm c), die Mutante spaS+spaS zeigt einen Hemmhof der Größe 2-3mm um die Kolonie herum, mit einem Gesamtdurchmesser von ca. 0,91,1cm. Vereinzelt wachsen M. luteus Kolonien (vier Stück) auch im Hemmhof. Der Subtilin-Reporterstamm (f) zeigt einen Hemmhof der Größe 3-4mm mit einem Durchmesser von 0,8-0,9mm. Das Wachstum von M. luteus beschränkt sich auf den 12 | S e i t e Rand des Hemmhofes. Der Teststamm B. licheniformis (g) ist sehr breit gewachsen, zeigt jedoch nur einen sehr schmalen Hemmhof um die Kolonie herum. Die Größe des Hemmhofes misst 2-3mm mit einem Durchmesser von 1,4-1,5cm. M. luteus wächst nur bis zur Grenze des Hemmhofes. Der Stamm B. subtilis 168 (168) zeigt einen Hemmhof von 2-4mm Breite mit einem Durchmesser von 1-1,1cm. Es befindet sich eine M. luteus Kolonie innerhalb des Hemmhofes und im oberen Bereich sehr viele kleine Kolonien die bis auf ca. 1mm an die B. subtilis Kolonie heranreichen. 1.2. Qualitativer Nachweis von Subtilin (Subtilin-Autoinduktionstest) Die unter 1.1 (Tab. 1) aufgeführten Teststämme werden orthogonal zum SubtilinReporterstamm B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ auf einer X-GalPlatte ausgestrichen. Die nach zwei Tagen Inkubation bei Raumtemperatur auftretende Blaufärbung gibt Aufschluss über die Autoinduktion durch Subtilinproduktion (Abb. 6). Abbildung 6: Blaufärbung des Subtilin-Reporterstammes nach Autoinduktion durch externes Subtilin, mit freundlicher Genehmigung durch B. Sattler und P. Aderhold 13 | S e i t e Abbildung 6 zeigt die auftretende Blaufärbung (Kreis) bei Autoinduktion. Der Reporterstamm B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ zeigte bereits kurz nach Beginn der Inkubation erste Blaufärbung. Nach weiterer Inkubation zeigte der Wildtyp (a) sowie der Stamm spaS+spaS (c) ebenfalls Blaufärbung. 1.3. Wachstumsphasen-abhängige Produktion von Subtilin In diesem Versuchsteil wurde zunächst, anhand von Messungen der optischen Dichte, über einen Zeitraum von acht Stunden hinweg, eine Wachstumskurve für den Subtilin-Reporterstamm B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ erstellt. Die optische Dichte der Übernachtkultur betrug zu Beginn des Versuchs unverdünnt 8,2. Diese wurde dann 1:50 verdünnt, auf zwei 5ml TY-Röhrchen aufgeteilt (Probe A und Probe B) und stündlich die optische Dichte überprüft (Tab. 2). Tabelle 2: Messungen der optischen Dichte stündlich über einen Zeitraum von acht Stunden bei 620 nm, Inkubation bei 37°C auf dem Schüttler Messung nach OD620 Probe A OD620 Probe B Mittelwert 1h 0,33 0,43 0,38 2h 0,78 0,56 0,67 3h 1,7 1,66 1,68 4h 3,8 3 3,4 5h 5,4 5,7 5,55 6h 8,4 7 7,7 7h 7,7 7,9 7,8 8h 7,4 8,8 8,1 Anhand der ermittelten Werte der optischen Dichte (Tab. 2), konnte für beide Proben eine Wachstumskurve erstellt werden. Abbildung 7 zeigt den Wachstumsverlauf der Proben A und B. 14 | S e i t e Probe A Probe B 10 optische Dichte 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Zeit [std] Abbildung 7: Wachstumskurven der zwei Subtilin-Reporterstamm-Proben Die Proben A und B stammen aus derselben Ausgangskultur, daher kann das Wachstum der beiden Proben gemittelt werden (Abb. 8). Mittelwert 9 8 7 optische Dichte 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Zeit [std] Abbildung 8: Mittleres Wachstum der B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ Kultur bei 37°C auf dem Schüttler 15 | S e i t e Anhand der Wachstumskurve (Abb. 7 und Anhang) kann nun die Wachstumsrate µ und die Verdopplungszeit td der Kultur berechnet werden. Hierzu werden zwei Punkte zu Beginn (= t0) und gegen Ende (= t) exponentiellen Phase (erkennbar an einer nahezu linearen Steigung der Geraden) ausgewählt und die Zelldichte zu diesen Zeitpunkten (= x0 bzw. xt) abgelesen. Diese Werte gehen dann in folgende Formel zur Berechnung der Wachstumsrate µ ein: (A) Hierbei ergab sich die Wachstumsrate µ wie folgt : Für Probe A: Mit Hilfe von µ kann im Anschluss die Verdopplungszeit td berechnet werden: (B) Hierbei ergab sich folgendes Ergebnis: Für Probe A: 16 | S e i t e Die gleichen Berechnungen wurden für Probe B angestellt und anschließend beide Proben gegeneinander gemittelt. Tabelle 3 fasst die Wachstumsrate und Verdopplungszeit der Proben und der Kultur im Mittel zusammen. Tabelle 3: Zusammenfassung der Wachstumsrate µ und der Verdopplungszeit td der einzelnen Proben Probe A Probe B Mittelwert Wachstumsrate µ [min-1] 0,0132 0,0121 0,0127 Verdopplungszeit td [min] 52,5 57,273 54,8 Die Kultur zeigt eine durchschnittliche Zunahme der optischen Dichte von 0,0127 pro Minute. Die Anzahl der Zellen verdoppelte sich in einem Zeitraum von durchschnittlich 54,8 Minuten. Die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommenen Proben9 wurden zentrifugiert und der Überstand für die weiteren Tests verwendet. Die Überstände wurden mit dem Subtilin-Reporterstamm zusammengeführt und das Reaktionsgemisch wurde über sechs Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde die optische Dichte bei 620nm bestimmt (Tab. 4 und Anhang). Tabelle 4: Mittelwerte der Messungen der optischen Dichte bei 620nm der stündlichen Kulturproben A und B von B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ Probe/ A B Kontrolle 1. 0,17 0,169 2. 0,17 0,177 Subtilin 3. 0,2 0,185 0,157 4. 0,181 0,18 5. 0,184 0,187 6. 0,199 0,204 Stunde Ohne 9 Zu jedem Zeitpunkt wurden in Doppelbestimmung zwei Proben von A (A1 und A2) sowie von B (B1 und B2) entnommen, diese Proben wurden erneut auf zwei Aliquots aufgeteilt. Die jeweils vier Proben von A (A1.1, A1.2, A2.1 sowie A2.2) und B (B1.1, B1.2, B2.1 und B2.2) gingen in die Messungen der optischen Dichte ein, die jeweiligen Werte finden sich im Anhang, die hier dargestellte Tabelle 4 fasst die Mittelwerte der Kulturproben A und B zusammen. 17 | S e i t e 7. 0,198 0,198 8. 0,169 0,166 0,196 Die Werte A1, A2, B1 sowie B2 ergeben sich als Mittelwerte aus Doppelbestimmungen der einzelnen Proben. Die Leer-Absorption von durchschnittlich 0,031 wurde von den einzelnen Mittelwerten abgezogen. Bei keiner der Proben kann eine kontinuierliche Zu- oder Abnahme der optischen Dichte beobachtet werden. Im Anschluss daran wurde der β-Galactosidase-Test durchgeführt. Die vom lacZGen codierte β-Galactosidase ist in der Lage ist das Substrat oNPG zu spalten. Eines der resultierenden Monomere, ortho-Nitro-Phenol, weist eine gelbe Färbung auf, und ist damit ein Maß für die Aktivität der β-Galactosidase und im Rückschluss auch auf die Promotoraktivität des fusionierten spa-Promotors. Diese Aktivität lässt sich quantitativ durch Messung der optischen Dichte bei 420nm bzw. 550nm ermitteln (Tab. 5). Die Ergebnisse der Messungen sind in folgender Tabelle zusammengefasst: Tabelle 5: Messung der optischen Dichte bei 420 bzw. 550nm nach Abstoppen des β-Galactosidase-Tests Probe/ Stunde A A B B Kontrolle 420nm 550nm 420nm 550nm 1. 0,047 0,021 0,042 0,019 Subtilin 2. 0,037 0,015 0,035 0,013 420nm 550nm 3. 0,035 0,015 0,036 0,015 0,046 0,019 4. 0,036 0,014 0,035 0,013 5. 0,037 0,016 0,036 0,014 6. 0,036 0,015 0,039 0,016 420nm 550nm 7. 0,039 0,016 0,039 0,016 0,07 0,036 8. 0,043 0,019 0,037 0,015 Ohne Die Proben zeigten nach 20 Minuten rein optisch keine Gelbfärbung, woraufhin die Reaktion durch die Zugabe von 500µl Na2CO3 gestoppt wurde. Auch die 18 | S e i t e fotometrische Untersuchung brachte kein eindeutiges Ergebnis, die optische Dichte zeigte keine signifikante Veränderung über die Zeit. Anhand dieser Werte wurde nun die Aktivität nach Miller berechnet, die Rückschlüsse auf die Induktion des spaS-Promotors zulässt. Die Berechnung der Aktivität nach Miller erfolgte anhand dieser Formel: (C) OD420, OD550: Absorption der Probe nach beendeter Reaktion bei 420, bzw. 550nm OD620: Zelldichte der Bakterienkultur vor dem β-Galactosidase-Test t: Reaktionszeit [min] v: Volumen der Kultur, das für den Test verwendet wurde [ml] Beispielhaft sieht diese Rechnung für Probe A in der ersten Stunde wie folgt aus: Tabelle 6 fasst die Aktivitäten nach Miller für die stündlich genommenen Aliquots der Proben A und B, sowie deren Mittelwert, zusammen. 19 | S e i t e Tabelle 6: Aktivität nach Miller der Kulturproben A und B, sowie deren Mittelwert über einen Zeitraum von 8 Stunden, Inkubation bei 37°C auf dem Schüttler Probe/ A B Mittelwert Kontrolle 1. 3,015 2,589 2,802 Subtilin 2. 3,162 3,460 3,311 3. 3,142 2,635 2,889 4. 3,177 3,403 3,29 5. 2,446 3,075 2,761 6. 2,45 2,696 2,573 7. 2,78 2,78 2,78 8. 2,88 3,238 3,059 Stunde 4,061 Ohne 1,786 Die graphische Auftragung der ermittelten Werte macht eine mögliche Änderung der Aktivität noch deutlicher (Abb. 9). Abbildung 9: Graphische Darstellung der gemittelten Aktivität nach Miller 20 | S e i t e Abbildung 9 zeigt, dass die Subtilin-Produktion über den Zeitraum von acht Stunden keinen signifikanten Schwankungen unterlag. Die Kontrolle „Ohne“ zeigt die Aktivität nach Miller ohne Zugabe eines vorher entnommenen Überstandes. „Ohne“ zeigt die minimal vorhandene Aktivität des Promotors ohne Induktion durch vorhandenes Subtilin. Zieht man diese Grundaktivität von den verbleibenden Aktivitäten ab, ergibt sich die, durch im Überstand vorhandenes Subtilin, induzierte Promotoraktivität des spaS-Promotors (Abb. 10). Abbildung 10: Graphische Darstellung der Aktivität nach Miller abzüglich der Grundaktivität des spaS-Promotors Abbildung 10 zeigt die, durch im Überstand vorhandenes Subitlin, induzierte Aktivität des spaS-Promotors. Die Aktivität liegt Allgemein sehr niedrig, auch die der SubtilinKontrolle, eine Probe, die mit reinem Subtilin beimpft wurde. Wird von einer Standardabweichung von +/- 0,25 ausgegangen und die Werte daraufhin erneut betrachtet, ergibt sich über die acht Stunden keine signifikante Veränderung der Aktivität des spaS-Promotors. Einzig die Induktion mittels reinem Subtilin zeigt eine erhöhte Aktivität des Promotors. 21 | S e i t e Wird nun die ermittelte Subtilinmenge in Bezug zur Wachstumskurve gesetzt, kann auch im Verlauf der einzelnen Wachstumsphasen keine signifikante Veränderung der Subtilinmenge beobachtet werden. optische Dichte 8 8 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 Aktivität nach Miller [MU] Mittleres Wachstum produziertes Subtilin 9 9 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Zeit [std] Abbildung 11: Subtilinmengen während der einzelnen Wachstumsphasen von B. subtilis 6633 bei 37°C auf dem Schüttler In Abbildung 11 ist zu erkennen, dass die Subtilinmenge in direktem Vergleich zur Wachstumskurve keine signifikante Veränderung während der einzelnen Wachstumsphasen erfährt. Nur ausgehend von diesem Ergebnis scheint es keine Wachstumsphasen-abhängige Produktion von Subtilin zu geben. 2. (L)antibiotika-Wirkung Zellwandbiosynthesestress 2.1. Zellwandbiosynthesestress induziert durch Lantibiotika, Bacitracin 22 | S e i t e Die unter 1.1 (Tab. 1) aufgeführten Teststämme werden orthogonal zum Lipid IIStress-Indikatorstamm auf einer X-Gal-Platte ausgestrichen. Die nach zwei Tagen Inkubation bei Raumtemperatur auftretende Blaufärbung gibt Aufschluss über die Produktion von Lipid II-interagierenden Antibiotika. Blaufärbung zeigte sich beim Wildtyp-Stamm (a) sowie dem Subtilin-Reporterstamm (f), hier hat eine Induktion durch die Produktion Lipid II-interagierende Antibiotika stattgefunden. 2.2. Zellwandbiosynthesestress in Abhängigkeit von der Bacitracin- Konzentration In diesem Versuchsteil wurden Proben des Lipid II-Stress-Indikatorstamms B. subtilis BSF2470 mit unterschiedlichen Bacitracin-Konzentrationen versetzt. Dieser Indikatorstamm weist eine Reportergenfusion mit dem promotorlosen lacZ-Gen auf. Über die Zugabe unterschiedlicher Bacitracin-Konzentrationen10 kann so die Reaktion des Zellwandbiosynthesestress-Sensorsystem LiaRS beobachtet, und die Konzentration, bei der es reagiert ermittelt werden. Zunächst wurde die optische Dichte des Gemisches aus Indikatorstamm und unterschiedlichen Bacitracin-Konzentrationen bei 620nm ermittelt (Tab. 7). Tabelle 7: Ermittlung der optischen Dichte bei 620nm, vor Start des β-Galactosidase-Tests BacitracinKonzentration OD620 0 0,127 2 0,131 5 0,139 10 0,139 10 In Doppelbestimmung wurden die Konzentrationen 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 und 1000 µg/ml untersucht, im weiteren Verlauf finden nur die Mittelwerte Beachtung. Die einzelnen Messungen finden sich im Anhang. 23 | S e i t e 20 0,132 50 0,139 100 0,141 200 0,126 500 0,115 1000 0,112 Die in Tabelle 7 zusammengefassten Werte der optischen Dichte bei 620nm gehen in die Berechnung der Aktivität nach Miller ein. Im Anschluss daran wurde der β-Galactosidase-Test durchgeführt. Gestartet wurde die Reaktion über die Zugabe von 200 µl oNPG, gestoppt wurde die Reaktion durch 500 µl Na2CO3. Nach Beendigung der Reaktion wurde die optische Dichte der Proben bei 420 und 550nm gemessen (Tab. 8). Tabelle 8: Ermittlung der optischen Dichte bei 420 und 550nm nach Stoppen der β-Galactosidase-Reaktion BacitracinKonzentration OD420 OD550 0 0,0286 0,0066 2 0,0399 0,0055 5 0,0653 0,0052 10 0,1 0,0057 20 0,1026 0,0054 50 0,138 0,0086 100 0,159 0,0063 200 0,209 0,0069 500 0,2902 0,0073 1000 0,223 0,0066 Zu erkennen ist hier (Tab. 8), dass die optische Dichte beinah kontinuierlich ansteigt. Die Proben wiesen eine, mit höher Konzentration, stärker werdende, Gelbfärbung auf, erzeugt durch das Monomer ortho-Nitrophenol. 24 | S e i t e Anhand der ermittelten Werte kann nun mit Hilfe von Formel (C) (vergl. 1.3), die Aktivität nach Miller bestimmt werden (Tab. 9). Tabelle 9: Aktivität nach Miller für die einzelnen Bacitracin-Konzentrationen Bacitracin- Aktivität nach Konzentration Miller 0 7,34 2 12,63 5 22,09 10 35,39 20 38,56 50 48,34 100 57,35 200 85,44 500 131,82 1000 103,166 Es ist offensichtlich zu erkennen, dass die Aktivität nach Miller bis zu einer Konzentration von 500 µg/ml Bacitracin kontinuierlich ansteigt und zur Konzentration von 1000 µg/ml deutlich abfällt. Abbildung 12 fasst dies graphisch zusammen. 25 | S e i t e Abbildung 12: Graphische Darstellung der Aktivität nach Miller des liaI-Promotors nach Zugabe der einzelnen Bacitracin-Konzentrationen Der Anstieg der Aktivität nach Miller bis zu einer Bacitracin-Konzentration von 500 µg/ml ist Abbildung 12 deutlich zu erkennen. Bei einer Konzentration von 1000 µg/ml fällt die Aktivität deutlich ab. Die Aktivität nach Miller bei einer Bacitracin-Konzentration von 0 µg/ml stellt die Grundaktivität des liaI-Promotors da. Wird diese abgerechnet, stellt die Verbleibende Aktivität, induziert durch die verschiedenen Bacitracin-Konzentrationen, die Reaktion des Zellwandbiosynthesestress-Sensorsystems dar (Abb. 13). 26 | S e i t e Abbildung 13: Graphische Darstellung der Aktivität nach Miller des liaI-Promotors nach Zugabe der einzelnen Bacitracin-Konzentrationen abzüglich der Grundaktivität Nach Abzug der Grundaktivität des liaI-Promotors, ist der Anstieg der Aktivität nach Zugabe der einzelnen Bacitracin-Konzentrationen weiterhin erkennbar (Abb. 13). Auch der Abfall bei Zugabe einer Bacitracin-Lösung von 1000 µg/ml ist noch vorhanden. Da zu 200 µl der Probe des Lipid II-Stress-Indikatorstamms B. subitlis BFS2470 20 µl der einzelnen Bacitracin-Lösungen unterschiedlicher Konzentration gegeben wurden, handelt es sich um eine 1:11-Verdünnung der Bacitracin-Lösungen (Tab. 10). Tabelle 10: Endkonzentration des Bacitracins in den einzelnen Aliquots in µg/ml Konzentration der Bacitracin-Lösung Bacitracin-Konzentration in der Probe [µg/ml] [µg/ml] 2 0,18 5 0,45 10 0,91 20 1,8 50 4,5 27 | S e i t e 100 9,1 200 18,2 500 45,5 1000 90,9 Die schlussendliche Bacitracin-Konzentration in der jeweiligen Probe spiegel die eigentliche Konzentration an Bacitracin, welches auf die Zellen wirkt, wider. 3. Sporulation 3.1. Eigenschaften von B. subtilis Sporen: Resistenz gegen T (80°C), Chloroform In diesem Versuch wurden die Bacillus subtilis-Kulturen zwei unterschiedlichen Stresssituationen ausgesetzt. Probe A1 dient als Kontrolle und wurde keinerlei Behandlung unterzogen. Die A2-Probe wurde für zehn Minuten hitzebehandelt bei 80°C und zu der letzten Probe A3 wurde Chloroform hinzu gegeben. Zusätzlich wurden diese drei Kultur-Proben hinsichtlich ihres Wachstums auf zwei verschiedene Medien untersucht. Hier wurde zum einen das TY-Medium, als Vollmedium verwendet, und zu anderen SSM-Medium, welche auch SchaeffersSporulations-Medium (entspricht einem Minimalmedium) genannt wird. Ziel dieses Versuches, ist es nun mithilfe unterschiedlicher Selektionsvarianten, die Anzahl der Zellen zu ermitteln, die Sporen bildeten. Die optische Dichte (OD600) der Übernachtkultur, welche im flüssigen TY-Medium angezogen wurde, betrug 4,5. Dies entspricht etwa 9 ∙ 108 cfu/ml (cfu/ml beschreibt die Anzahl der Zellen pro Milliliter, die fähig waren, Kolonien zu bilden). 28 | S e i t e Tabelle 11: Kolonien auf TY-Medium ohne Behandlung A1 Verdünnungs- Anzahl der Kolonien Anzahl der Kolonien Mittelwert der stufen (Probe A) (Probe B) Kolonieanzahl Zellen/ml 10-2 Zellrasen – nicht zählbar --- --- -3 Zellrasen – nicht zählbar --- --- 10 10-4 1107 2457 1782 3,56 ∙ 108 10-5 336 406 371 7,42 ∙ 108 10-6 50 43 46 9,2 ∙ 108 In Tabelle 11 sind die ausgezählten Kolonien der A1-Probe zusammengefasst. Hier zu sehen, ist dass die Anzahl der Kolonien mit steigender Verdünnung deutlich abnehmen. Bei Verdünnungsstufen 10-2 und 10-3 sind keine einzelnen Kolonien zählbar, so dass hier keine Werte vorhanden sind. In der letzten Spalte sind die Zellen pro Milliliter angegeben. Hier ist zu beobachten, dass diese Werte mit Erhöhung der Verdünnung zunehmen. Tabelle 12: Kolonien auf TY-Medium Hitzebehandelte Proben A2 Verdünnungs- Anzahl der Kolonien Anzahl der Kolonien Mittelwert der Zellen/ml stufen (Probe A) (Probe B) Kolonieanzahl 10-2 1880 1126 1503 3,01 ∙ 106 10-3 223 234 228 4,57 ∙ 106 10-4 47 33 40 8 ∙ 106 10-5 3 4 3 7 ∙ 106 10-6 1 --- 1 2 ∙ 106 Anhand von Tabelle 12 ist zu beobachten, dass auch bei diesen Proben, mit steigender Verdünnung, die Anzahl der Kolonien sinkt. Hierbei ist jedoch bei der Verdünnungsstufe 10-4, mit 8 ∙ 106 Zellen/ml der höchste Wert erreicht. Die mit Chloroform behandelten Kulturen (A3) sind auf dem TY-Medium, unabhängig von der Verdünnungsstufe, nicht gewachsen. Die Anzahl der sporulierenden Zellen kann anhand der Ergebnisse in Tab. 11 und Tab. 12 ermittelt werden. Hierbei erfolgt die Division von der Anzahl der Kolonien von 29 | S e i t e der hitzebehandelten Proben (A2) durch die Anzahl der Kolonien von den unbehandelten Kulturproben (A1). Durch die Ermittlung der entsprechenden Mittelwerte, ergab sich ein Wert von 1,42 ∙ 10-2. Dies entspricht dem Anteil der Zellen, die Sporen ausbildeten, dies lässt darauf schließen, dass etwa jede hundertste, im TY-Medium angezogene, Zelle sporulierte (etwa 0,01%). Die Ergebnisse des SSM-Mediums (Schaeffers-Sporulations-Medium) sind leider nicht auswertbar, da die TY-Platten starke Kontaminationen aufwiesen. Zum einen waren Mircrococcus-Kulturen erkennbar (gelbliche Kolonien), aber auch andere Kolonien, die eine rote oder weiße Färbung zeigten, waren vorzufinden. Unter diesen Bedingungen ist die Sporulationsauswertung nicht möglich, da somit kein genaues Ergebnis der B.subtilis Kolonien erhältlich ist. Insofern ist nicht gewährleistet, dass die anderen Kulturen das Wachstum der B. subtilis Kolonien eingeschränkt oder diese gar komplett überwachsen haben. 4. B. subtilis Transformation Vorweg ist zu erwähnen, dass auch bei diesem Versuch kein repräsentatives Ergebnis erhalten wurde. Hier wurden aus Versehen die Platten vertauscht, so dass keine Selektion auf Neomycin erfolgte, sondern stattdessen auf den MicrococcusPlatten ausgestrichen wurde. Da hier allerdings dennoch vereinzelte Bacillus Kolonien wuchsen, wurden die nachfolgenden Versuche 4.2 Amylase-Test und 4.3 Test auf Komplementation des Subtilin- Phänotyps („gain of function“), trotz dessen mit den erhaltenen Kolonien fortgesetzt. An dieser Stelle sei anführt, dass unsere Gruppe die vermeintlichen Transfomanten von der Nachbargruppe erhielt, da auf unserer Platte keine Bacillus Kolonien wuchsen. Insgesamt wurden zehn vermutliche Transformanten in Doppelbestimmung auf Stärkehaltigen LB-Medium ausgestrichen. 30 | S e i t e 4.2. Amylase Test Abbildung 14: Ergebnis des Amylase-Tests In Versuch 4.2 (Amylase-Test) wurden mittels der Iod/Kaliumiodid-Lösung die vermeintlichen Transformanten detektiert. Diese, die nicht mehr in der Lage waren die Stärke zu spalten blieben dunkel gefärbt, in diesem Fall Transformanten 1 und 4 (siehe Abb. 14). Die jedoch noch zur Spaltung der Stärke befähigt waren, zeigten eine Art von Hemmhof, wobei sich die bräunliche Lösung um den Kolonieausstrich langsam entfärbte. Die Positivkontrolle (+) stellte der Wildtyp B. subtilis ATCC 6633. Hier ist ebenfalls eine Entfärbung zu sehen (Abb. 14). Als Negativkontrolle (-) diente B. subtilis 6633-Mutante amyE::PspaS-lacZ. Bei Transformant Nummer 10 ist das Ergebnis in Abb. 14 durch die Spiegelung der Petrischale nicht eindeutig erkennbar, hier handelte es sich jedoch nicht um einen Transfomanten. 31 | S e i t e 4.3. Test auf Komplementation des Subtilin- Phänotyps (‚gain-of- function’) Im weitern Verlauf wurden die detektierten Transfomanten (Nummer 1 und 4, aus Abb. 14) auf Indikatorplatten mit Micrococcus luteus selektiert, um somit die Rückgewinnung der Subtilin-Produktion zu untersuchen. Hierbei hat keiner der beiden vermutlichen Transformanten einen Hemmhöf ausgebildet. Was darauf schließen lässt, dass auch bei diesen vermeintlichen Transformanten keine Transformation stattgefunden hat. IV. Diskussion 1. Produktion von Antibiotika, Regulation der Subtilinbiosynthese 1.1. Qualitativer Nachweis von Antibiotika (Agar-Diffusionstest) Der Hemmhoftest mit Hilfe des Indikator-Organismus Micrococcus luteus zeigt anschaulich, die Produktion antimikrobieller Substanzen der Teststämme (Abb. 5). Die Hemmhöfe kommen durch Diffusion der produzierten Antibiotika über den Agar zustande, darum befinden sich die Hemmhöfe auch immer direkt um die Kolonien der Teststämme herum. Da Antibiotika als Sekundärmetabolite meist zu Beginn der stationären Phase produziert werden, lässt dies Rückschlüsse auf das Wachstum der Teststämme und des Indikators M. luteus zu. Die Teststämme weisen eine deutlich höhere Wachstumsrate auf, als der langsam wachsende M. luteus. Da sich letzterer noch in der lag- bzw. der exponentiellen Phase befindet, wird sein Wachstum durch die ausgeschütteten Antibiotika gehemmt und nur in Einzelfällen sind Kolonien innerhalb der Hemmhöfe anzutreffen. 32 | S e i t e Der Wildtyp (a) des Stammes ATCC 6633 zeigt mit 4-5mm den größten Hemmhof, erzeugt durch die Antibiotika Subtilin, Subtilosin, sowie Surfactin und Mycosubtilin, wobei letzteren eine untergeordnete Rolle zukommt. Die Mutante spaS (b) weist einen deutlich kleineren Hemmhof von durchschnittlich 2mm auf. Dies resultiert daher, dass das Strukturgen spaS, verantwortlich für die Produktion von Subtilin, durch eine Spectinomycin-Resistenzkassette ausgetauscht wurde. Der sehr kleine Hemmhof kommt durch die verbleibend produzierten Antibiotika Subtilosin, Surfactin und Mycosubtilin zustande. Die Mutante spaS+spaS (c) weist einen Hemmhof von 2-3mm Breite auf, und rangiert damit über der Mutante spaS (b) und unter dem Wildtyp (a). Zu erwarten wäre gewesen, dass diese Mutante (c) einen ähnlichen Hemmhof aufweist wie der Wildtyp, da sie das Strukturgen spaS aufweist. Eine mögliche Erklärung wäre, dass dieses Gen jedoch an einer anderen Stelle als üblich im Genom anwesend ist, nämlich im amy-Locus, dem Ort, an dem die Amylase codiert wird. Die DNA könnte hier nicht so zugänglich sein, wie sie im eigentlichen Genlocus des spaS-Gens ist. Ein möglicher Versuchsansatz wäre, die Mutante spaS+spaS (c) in ein stärkehaltiges Medium zu bringen, und dann die Hemmhofbildung zu überprüfen. Dieser Versuchsansatz wurde jedoch nicht weiter verfolgt, weshalb hier keine Aussage über den Phänotyp getroffen werden kann. Die Mutanten spaB (d) und spaC (e) wurden nicht auf der M. luteus-Indikatorplatte ausgestrichen, jedoch ist bekannt, dass sie einen ähnlichen Phänotyp wie die Mutante spaS (b) aufweisen. Der Hemmhof des Subtilin-Reporterstammes (f) ist sehr breit (3-4mm), ähnlich dem des Wildtyp-Stammes (a). Dieses Ergebnis ist überraschend da der SubtilinReporterstamm kein intaktes Strukturgen spaS aufweist, und damit am ehesten einen Phänotyp wie die Mutante spaS (b) zeigen sollte. Dieses Ergebnis deutet auf Verunreinigungen der Kultur hin, da anders der sehr breite Hemmhof nicht erklärt werden kann. Der Bacillus subtilis Stamm 168 zeigt eine Hemmhofbreite zwischen 2-4mm. Dieser Hemmhof resultiert aus den produzierten antimikrobiellen Substanzen Sublancin und Subtilosin. Der B. subtilis Stamm 168 weist keinen Subtilin-Gencluster auf. 33 | S e i t e Bacillus licheniformis (g) zeigt einen Hemmhof der Größe 2-3mm. Dieser ist zurückzuführen auf das Antibiotikum Bacitracin. B. licheniformis ist im Allgemeinen sehr breit gewachsen und reicht bis knapp an die Grenze des Hemmhofes heran. Invasives Wachstum von M. luteus war nur zwei Mal, bei der Mutante spaS+spaS (c) sowie bei B. subtilis 168 (168) zu beobachten. Dieses invasive Wachstum könnte auf mehrerlei Ursachen zurückzuführen sein. Zum einen könnten sich vereinzelt Resistenzen von M. luteus gegen die produzierten Antibiotika gebildet haben. Auch eine höhere Toleranz von M. luteus gegenüber den diffundierenden Antibiotika ermöglicht invasives Wachstum. Eine weitere Möglichkeit wäre die Instabilität der Antibiotika. Haben letztere eine sehr kurze Halbwertszeit könnte das Wachstum von M. luteus nur kurzzeitig eingeschränkt sein. Noch vorhandene intakte und teilungsfähige Zellen würden dann von dem Einfluss des Antibiotikums verschont bleiben. Der Subtilin-Gencluster besteht aus den Genen spaS und spaBTC, sowie spaI und spaFEG als auch spaR und spaK (Abb. 15) (1). Abbildung 15: Subtilin-Gencluster Das Gen spaS codiert für das Subtilin-Prepeptid, welches dann durch das Protein SpaBC, codiert durch gleichnamige Gene, post-translational in das fertige Subtilin modifiziert wird. Diese Gene sind essentiell für die Subtilin-Biosynthese, weshalb Mutanten, die einen Defekt in diesen Genen aufweisen einen ähnlichen Phänotyp, nämlich das Fehlen von Subtilin, aufweisen (vergl. 1.1 Abb. 5). SpaT codiert für einen Translokator, der für den Export des modifizierten Subtilins verantwortlich ist. Subtilin Immunität wird durch das Lipoprotein SpaI (codiert durch spaI) sowie den ABCTranslokator SpaFEG (codiert durch spaFEG) vermittelt. Die genetischen Produkte der Gene spaR und spaK bilden ein zwei-Komponenten Sensor-System bestehend 34 | S e i t e aus einer membranständigen Sensor-Histidinkinase (SpaK) und dem ResponseRegulator (SpaR), die externes Subtilin binden und so einen Autoinduktionsvorgang in Gang bringen, der für die Aktivierung des spaB- und spaS-Promotors sorgt und damit die Produktion von Subtilin verstärkt. 1.2. Qualitativer Nachweis von Subtilin (Subtilin-Autoinduktionstest) Der Signalweg von Subtilin in die Zelle beginnt mit dem Erkennen und Binden des Subtilins an eine membranständige Sensor-Histidinkinase (SpaK). Diese wird aktiviert woraufhin auf cytosolischer Seite der Cytoplasmamembran ein spezifischer Histidinrest autophorphoryliert wird. Dieser Phosphatrest wird auf einen ResponseRegulator (SpaR) übertragen, welcher nun aktiviert ist. In aktivierter Form induziert letzterer die Expression der durch den spa-Promotor kontrollierten Gene. Der im Versuch 1.2 verwendete Subtilin-Reporterstamm B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ weist eine Reportergenfusion des spaS-Promotors mit dem promotorlosen lacZ-Gen auf. LacZ codiert für die β-Galactosidase, die in der Lage ist, glykosidische Bindungen hydrolytisch zu spalten. Die Platten, anhand derer die Induktion durch Subtilin ermittelt wurde sind sog. X-Gal-Platten. X-Gal-Platten enthalten 50 µg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-Galactopyranosid in DMF gelöst. Dieses Substrat kann durch die β-Galactosidase in seine Monomere gespalten werden, wobei es sich bei einem von jenen um einen blauen Indigofarbstoff handelt. Findet also eine Induktion durch Subtilin statt, wird, nach Erkennung durch die Sensor-Histidinkinase SpaK, im letzten Schritt der spa-Promotor angesprochen. Dieser sorgt im Falle des Subtilin-Reporterstammes dafür, dass das Reportergen lacZ exprimiert wird. Diese Induktion wird dann durch die blaue Färbung des Agars im Bereich des Reporterstammes sichtbar. Induktion des Reporterstammes fand durch den Wildtyp (a) und den Stamm spaS+spaS (c) statt (Abb. 6). Diese Stämme produzieren Subtilin, der Wildtyp von vornherein, und der Stamm spaS+spaS durch erneute doppelt-homologeRekombination nach Einfügen einer Spectomycin-Resistenz im eigentlichen spaSGen und "Wiedereinfuhr" des spaS-Gens im Bereich des Amylase-Genlocus'. 35 | S e i t e Dieser Versuch ist hoch spezifisch auf die Produktion von, und Autoinduktion durch, Subtilin gerichtet. Durch die Reportergenfusion des lacZ-Gens mit dem Promotor des Subtilin-Genclusters wird ausschließlich die Aktivität des spaS-Promotors nach Induktion durch externes Subtilin betrachtet. Der Hemmhoftest (1.1) ist deutlich unspezifischer, da hier nicht ausnahmslos nur ein Antibiotikum (hier: Subtilin) in die Betrachtung fällt, sondern alle vom jeweiligen Teststamm (Tab. 1) produzierten, antimikrobiellen (und damit Hemmhof-erzeugenden) Substanzen. Werden Mutanten erzeugt, die nicht in der Lage sind ein bestimmtes Antibiotikum zu produzieren (vergl. Mutante spaS (b)), gibt der Hemmhoftest Auskunft über die Produktion weiterer antimikrobieller Substanzen. Auch die Bedeutung der einzelnen Antibiotika kann ermessen werden. Weist eine Mutante bspw. einen kleineren Hemmhof auf, als der Wildtyp des gleichen Stammes, so war das produzierte Antibiotikum von größerer Bedeutung bzw. stabiler als die verbleibenden antimikrobiellen Substanzen. Ist der Hemmhof nach erfolgter Mutation genauso groß wie beim Wildtyp des gleichen Stammes, kommt dem Antibiotikum eine eher untergeordnete Bedeutung zu, oder es ist instabiler als die verbleibenden Antibiotika. Da jedoch das Vorhandensein, oder Fehlen, von Subtilin nur durch vorherige, eigens durchgeführte, Mutation im Hemmhoftest sichtbar ist, ist er für den Nachweis der Subtilin-Produktion einer unbekannten Mutante nicht geeignet. Der Versuch 1.2 bietet die Möglichkeit auch unbekannte Mutanten oder Stämme auf die Produktion von Subtilin zu untersuchen und ist damit universeller in seiner Anwendung. Die Blaufärbung des Reporterstammes kurz nach Inkubation deutet auf eine Verunreinigung selbigen mit einem Subtilin-produzierenden Stamm oder fehlerhafte Insertion des Mutation-vermittelnden Plasmides hin. Da der Reporterstamm durch Einbringen einer Spectinomycin-Resistenz-Kassette in das Strukturgen spaS, eigentlich nicht in der Lage sein sollte selbst Subtilin zu produzieren, dürfte er nur im direkten Kontakt mit einem Subtilin-Produzenten Blaufärbung zeigen. Eine Verunreinigung durch einen Subtilin-Produzenten würde jedoch auf Autoinduktion auch ohne Kontakt mit einem der verwendeten Stämme (Tab. 1) hinauslaufen, und von Beginn an für eine blaue Verfärbung des Reporterstammes sorgen. Eine weitere Möglichkeit wäre eine von Beginn an unzureichende Transformation des Wildtyps und damit ein von vornherein fehlerhafter Reporterstamm. Wird ein Plasmid nicht doppelt, sondern einfach-homolog eingebaut, ist diese Mutation sehr instabil und das 36 | S e i t e Plasmid könnte im Laufe der Zeit, aus dem Genom verworfen werden. Damit wären dann einzelne Organismen des Stammes wieder in der Lage Subtilin zu produzieren und ein ähnliches Bild würde sich ergeben. Auf letztere Fehlerquelle könnte leicht getestet werden, indem auf Spectinomycin selektiert und gleichzeitig ein Autoinduktionstest vollzogen wird. Eine X-Gal-Platte mit Spectinomycin würde zumindest die Spectinomycin-sensiblen Stämme (z.B. der Wildtyp (a) oder aber Reporterstamm-Mutanten, die ihr Plasmid ausgestoßen haben) von der Verunreinigung ausschließen. Bei Verunreinigungen durch Spectinomycin-resistente Mutanten würden wahrscheinlich nur genauere genetische Analysen zu einem Ergebnis führen, wobei alles in allem eine Verunreinigung den Test nur etwas weniger anschaulich macht, er funktioniert dennoch. 1.3. Wachstumsphasen-abhängige Produktion von Subtilin Das mittlere Wachstum von B. subtilis ATCC 6633 (Abb. 8) zeigt anschaulich die einzelnen Wachstumsphasen. In der ersten Stunde befand sich die Kultur in der lagPhase. In dieser Phase findet eine Eingewöhnung an die neuen Kulturbedingungen statt, die Zellen teilen sich zunächst nur langsam. Nach ca. 2 1/2 - 3Stunden ging die Kultur in die exponentielle Phase über. In der exponentiellen Phase ist die Teilungsaktivität maximal, erkennbar an einer nahezu linearen Beziehung zwischen Zunahme der optischen Dichte pro Zeit. Nach 6 Stunden ging die Kultur in die stationäre Phase über. In der stationären Phase werden sowohl Nährstoffe als auch der zur Verfügung stehende Raum knapp. Erkennbar ist diese Phase daran, dass die Steigung der wachstumskurve nahezu 0 ist. Im letzten Schritt kommt die Absterbephase, es sterben mehr Zellen als sich teilen. Erkennbar ist diese Phase am Abfallen der Wachstumskurve, gut erkennbar bei Probe A (Abb. 7). Der mittlere Wachsumsverlauf zeigt bei Stunde Nr. 8 einen leichten Anstieg. Dieser beruht jedoch darauf, dass Probe B noch am Ende der exponentiellen Phase war, als die Messungen beendet wurden. Der letzte Messpunkt sollte also als Ausreißer betrachtet werden und nicht in größere Gewichtung fallen. 37 | S e i t e Der in Versuch 1.2 verwendete Subtilin-Reporterstamm B. subtilis ATCC 6633 spaS amyE::PspaS-lacZ mit der Reportergenfusion des spaS-Promotors und dem promotorlosen lacZ-Gen fand auch in diesem Versuchsteil Anwendung. Ein weiteres Substrat für die, vom lacZ-Gen codierte, β-Galactosidase ist das Polymer orthoNitrophenol-Galactopyranosid (oNPG), wobei die Spaltung in die Monomere Galactose und ortho-Nitrophenol durch die gelbe Färbung letzteren sichtbar wird. Da durch die Fusion des lacZ-Gens mit der spaS-Promotor die Expression der βGalactosidase von der Induktion des spaS-Promotors durch Subtilin abhängig ist, ist die Stärke der Gelbfärbung ein Maß für die Promotoraktivität und damit für die Subtilinmenge, die diesen induziert. Die Menge der β-Galactosidase wird durch die Aktivität des Promotors nach Miller ermessen. Diese β-Galactosidase-Menge lässt Rückschlüsse auf die Menge des eigentlich vom spaS-Promotor codierten Subtilins zu. Nebst dem eigentlich produzierten Subtilin, kann auch auf die Konzentration des im Überstand vorhandenen, die Signalkaskade induzierenden, Subtilins geschlossen werden. Ist viel Subtilin vorhanden, findet eine starke Induktion statt und die Menge an β-Galactosidase nimmt zu, und umgekehrt. Wie zu erkennen ist (Tab. 6 bzw. Abb. 10 sowie Abb. 11) ist die Menge an βGalactosidase, und im Rückschluss die Menge an im Überstand vorhandenen Subtilin, über den Zeitraum von acht Stunden nahezu konstant. Die Proben wiesen nach Beendigung des Tests auch keine sichtbare Gelbfärbung auf. Dieses Ergebnis ist wahrscheinlich auf eine Verunreinigung der Kultur, oder aber auf nichtvollständige Verdunstung des Toluols zurückzuführen. Damit wäre die Reaktion entweder gar nicht erst abgelaufen (bei Kontamination) oder aber massiv gehemmt gewesen (bei mangelnder Verdunstung des Toluols). Das Ergebnis zeigt die immer vorhandene, minimale Grund-Expression des spa-Genlocus, jedoch keine, durch externes Subtilin induzierte, Expression. Dies wird offensichtlich, wenn die hier ermittelten Werte mit der Literatur verglichen werden. Antibiotika sind Sekundärmetabolite, die zumeist zu Beginn der stationären Phase einer Kultur in erhöhter Konzentration expremiert werden. Zu Beginn der stationären Phase nimmt die Bedeutung herrschender Stress- und Hungerzuständen zu. Nährstoffe wie auch der der Kultur zur Verfügung stehende Raum werden knapp. Die Expression von antimikrobiellen Substanzen lindert diese Not durch das Abtöten/Hemmen von andersartigen Konkurrenten kurzzeitig. Zu erwarten wäre also gewesen, dass die 38 | S e i t e Menge an β-Galactosidase und damit die Promotoraktivität des spaS-Promotors durch Induktion des im Überstand vorhandenen Subtilins zu Beginn der stationären Phase sichtbar ansteigt und während der stationären Phase ihren Höhepunkt erreicht. Ansteigen müsste die Aktivität nach Miller zu Beginn der stationären Phase, da hier die Produktion von Subtilin am höchsten ist und damit die Menge an Subtilin (im Überstand) steigt. Der Höhepunkt der Aktivität wäre in der stationären Phase (nach ca. 5-7Stunden) zu erwarten gewesen, da hier die Konzentration an Subtilin (im Überstand) am höchsten ist. Die Produktion von Subtilin wird nach einer gewissen Zeit in der stationären Phase wieder eingestellt, weshalb die Aktivität zunächst konstant und über kurz oder lang abfallend sein sollte. 2. (L)antibiotika-Wirkung Zellwandbiosynthesestress 2.1. Zellwandbiosynthesestress induziert durch Lantibiotika, Bacitracin In diesem Versuchsteil soll die Interaktion von Antibiotika mit dem Zellwandbestandteil Lipid II untersucht werden. Lipid II-interagierende Antibiotika binden an den Phosphat-Rest der Lipid II Komponenten und sorgen für die Bildung einer Pore in der Cytoplasmamembran Gram-positiver Bakterien. Ein Mikroorganismus ist diesem antimikrobiellen Angriff gegenüber jedoch nicht schutzlos ausgeliefert. Bindet ein Antibiotikum an die Lipid II-Bestandteile, wird das zwei Komponentensystem LiaRS angesprochen, welcher als Sensor für solcher Art Antibiotika dient. In der Folge werden durch die Expression von Genen, die unter der Kontrolle des liaI-Promotors stehen, Resistenzgene gebildet, die die Wirkung des Antibiotikums unterbinden. Dies geschieht entweder über den Export des Antibiotikums aus der Zelle, Inaktivierung des Antibiotikums oder Veränderung der Angriffsstelle des Antibiotikums. Dieser Versuch vollzieht sich ebenfalls anhand eines Reporterstammes, ähnlich wie in Versuch 1.2 und 1.3 bereits vorgenommen. In diesem Fall wurde die Reportergenfusion des promotorlosen lacZ-Gens jedoch nicht mit dem spaS-Promotor, sondern dem, für die Expression der Selbstschutzgene verantwortlichen liaI-Promotors vorgenommen. Interagiert also ein Antibiotikum mit 39 | S e i t e den Lipid II-Bestandteilen der Cytoplasmamembran des Reporterstammes B. subtilis BFS2470 wird, nach erfolgter Signalkaskade, der liaI-Promotor angesprochen und anstelle der Selbstschutzgene die vom lacZ-Gen codierte β-Galactosidase exprimiert. Vergleichbar zu Versuch 1.2 wurden auch hier die Teststämme auf einer X-Gal-Platte aufgebracht und eine auftretende Blaufärbung zeigt die Induktion des Promotors (hier: liaI-Promotor) und die Expression der β-Galactosidase an. Induktion des Reporterstammes fand durch den Wildtyp (a) und den SubtilinReporterstamm (f) statt. Diese Stämme produzieren ein (oder mehrere) Lipid IIinteragierendes Antibiotikum. Für den Wildtyp (a) ist dieses Ergebnis nachvollziehbar, denn er produziert das Antibiotikum Subtilin, welches mit Lipid II interagiert. Dass der Subtilin-Reporterstamm ebenfalls das Vorhandensein von Lipid II-interagierenden antimikrobiellen Substanzen anzeigt ist ungewöhnlich, da dieser durch doppelt homologe Rekombination eigentlich nicht mehr in der Lage sein sollte, Subtilin zu produzieren. Dieses Ergebnis ist vermutlich auf eine Verunreinigung des Subtilin-Reporterstammes zurückzuführen, welche auch schon in Versuch 1.2 zum Tragen kam. Zu erwarten wäre gewesen, dass neben dem Wildtyp (a) auch die Mutante spaS+spaS (c) sowie der Stamm Bacillus licheniformis Lipid IIinteragierende Antibiotika anzeigen. Die Mutante spaS+spaS ist, nach erneutem Einfügen des spaS-Gens, jedoch an anderer Stelle, wieder in der Lage Subtilin zu produzieren. Ähnlich wie in Versuch 1.1 könnte jedoch auch hier zum Tragen kommen, dass sich das spaS-Gen nun an einer anderen Stelle im Genom befindet, wo die DNA eventuell nicht so zugänglich ist, wie am eigentlichen Lokalisationsort des Gens. Damit könnte die Subtilin-Konzentration zu gering sein, um vom Lipid IIStress-Indikatorstamm BSF2470 sensiert zu werden. Der Stamm B. licheniformis sollte ebenfalls Lipid II-Interaktion anzeigen, und zwar durch das Antibiotikum Bacitracin. Bacitracin ist ein Polypeptid-Antibiotikum, welches ebenfalls Zellwandbiosynthesestress in Bakterien hervorruft. Es hemmt die Mureinbiosynthese beim Aufbau der bakteriellen Zellwand und wirkt dementsprechend gut gegen Grampositive Bakterien. Da es stark nierenschädigend wirkt, wird es hauptsächlich oberflächlich bei Schürfwunden u.ä. angewendet. 40 | S e i t e 2.2. Zellwandbiosynthesestress in Abhängigkeit von der Bacitracin- Konzentration In diesem Teil des Versuches wurde anhand unterschiedlicher BacitracinKonzentrationen die Reaktion des Zellwandbiosynthesestress-Sensorsystems untersucht. Interagiert ein Antibiotikum mit den Lipid II-Komponenten der bakteriellen Cytoplasmamembran, zeigt der verwendete Reporterstamm B. subtilis BSF2470 (vergl. 2.1) dies durch die Expression des Enzyms β-Galactosidase an, da dieser eine Reportergenfusion des promotorlosen lacZ-Gens mit dem, die Selbstschutzgene kontrollierenden, liaI-Promotor aufweist. Die Spaltungsprodukte der β-Galactosidase, in diesem Fall Galaktose und ortho-Nitrophenol (quantifizierbar durch auftretende Gelbfärbung), lassen Rückschlüsse auf die Promotoraktivität des liaI-Promotors zu und geben so Auskunft über die Bacitracin-Konzentration, bei der das Zellwandbiosynthesestress-Sensorsystem aktiviert wird. Bei Zugabe einer Lösung aus Bacitracin mit der Konzentration 2 µg/ml ist bereits ein Anstieg der Aktivität erkennbar (Abb. 13). Dieser Anstieg setzt sich kontinuierlich fort, bis zu einer Konzentration der Lösung von 500 µg/ml. Bei Zugabe einer Bacitracin-Lösung von 1000 µg/ml fällt die Aktivität abrupt ab. Die jeweilig auf die Proben wirkenden Bacitracin-Konzentrationen sind in Tabelle 10 dargestellt. Das Zellwandbiosynthesestress-Sensorsystem reagiert damit bereits bei einer BacitracinKonzentration von ca. 0,18 µg/ml (Tab. 10 bzw. Abb. 13). Bis zu einer BacitracinKonzentration von ca. 45,5 µg/ml arbeitet das System einwandfrei. Ab einer Konzentration über 45,5 µg/ml, bzw. bei einer Konzentration von 90,9 µg/ml ist ein deutlicher Abfall der Promotoraktivität der Selbtschutzgene (lia-Gene) zu erkennen. Bei dieser Konzentration handelt es sich um die minimale Hemm-Konzentration (MHK oder engl. minimal inhibitory concentration, MIC). Diese spiegel die minimale Konzentration einer antimikrobiellen Substanz wieder, die das Wachstum von Baktieren gerade noch hemmt. Ein Abfall der Promotoraktivität könnte gleichbedeuten mit einem Abfall der Gesamt-Promotoraktivität durch das Absterben eines Teils der Kultur sein. Die Aktivität müsste zunächst konstant bleiben und im letzten Schritt abfallen. Die minimale Hemm-Konzentration wird damit irgendwo zwischen 45,6 und 90,9 µg/ml Bacitracin liegen. 41 | S e i t e 3. Sporulation 3.1. Eigenschaften von B. subtilis Sporen: Resistenz gegen T (80°C), Chloroform Wie bereits im Ergebnisteil erwähnt, zeigten die TY-Platten mit den in SSM angezogenen Kulturen eine starke Kontamination auf. Üblicherweise würde solch ein Ergebnis auf unsaueres oder auch unsteriles Arbeiten zurückzuführen sein, da in diesem Fall jedoch der komplette Praktikumsraum mehr oder weniger starke Kontaminationen der Platten aufwies, könnte diese Verunreinigungen mit den entsprechenden Medien oder der Vorkultur in Verbindung stehen. Theoretisch sollte die Anzahl der sporulierender Zellen auf den Platten mit den, im Minimal-Medium (SSM) angezogenen Kulturen weitaus höher sein, als diese die im Vollmedium (TY) kultiviert wurden. Wie bereits der Name Schaeffers-SporulationsMedium verrät, ist diesem Medium dazu geeignet, B. subtilis dazu zu bewegen Endosporen auszubilden. Im Vollmedium haben die Kulturen ausreichend Nährstoffe zur Verfügung und können somit vegetativ wachsen. Das SSM Medium enthält hingegen nur beschränkte Nährstoffressourcen, so dass diese nach einiger Zeit aufgebraucht sind und das Bakterium unter dieser Hungersituation eine Endospore ausbildet. Durch diese dormante Überdauerungsform ist das Bakterium, in der Lage extreme Stresssituationen, wie Nährstoffmangel oder hohe Temperaturen, zu überstehen und bei einer Verbesserung der Lebensbedingungen wieder als vegetativ aktive Zelle auszukeimen. 4. B. subtilis Transformation Da das in diesem Versuch verwendete Plasmid pMB32 homologe Sequenzen zum Amylase-Genlocus in B. subtilis (amy front und back) aufweist, werden die 42 | S e i t e dazwischen liegenden Sequenzen auf dem Plasmid mit in das Rezipientengenom eingebaut (siehe Abb. 4). Wenn eine doppelt homologe Rekombination erfolgt, ist die amy-Sequenz nicht mehr intakt und es wird somit auch keine Amylase gebildet. Der Transformant ist nicht mehr in der Lage Stärke zu spalten. Erfolgt jedoch der Einbau über einfach homologe Rekombination (Campbell-Typ), so findet nur an einem Teilstück des amyE-Locus (entweder front oder back) die Rekombination statt, so dass wie in Abb. 16 zu sehen ist, ein Großteil des AmyGenlocus weiterhin besteht und infolgedessen auch weiterhin intakt bleibt. Das Bakterium ist weiter befähigt das Enzym Amylase zu bilden, und somit Stärke zu spalten. Dieses Bakterium würde in der Lage sein Stärke zu spalten, aber auch dazu befähigt das Antibiotikum Subtilin zu produzieren (Amy+ und Sub+). Wohingegen bei deiner doppelt homologen Rekombination ein folgender Phänotyp ergeben würde: Amy- und Sub+. Abbildung 16: Einfach homologe Rekombination in B. subtilis ATCC 6633 spaS 43 | S e i t e Das in diesem Versuchsteil erhaltene Ergebnis ist etwas sonderbar. Wie in Abbildung 14 zu sehen ist, erschienen Transformanten 1 und 4 als positiv transfomiert, da beide den selben Phänotyp aufwiesen wie die Negativkontrolle - B. subtilis 6633-Mutante amyE::PspaS-lacZ – Amy-. Die anderen vermeintlichen Transformanten zeigten denselben Phänotyp wie der Wildtyp (Positivkontrolle) – Amy+. Bei erfolgter Transformation wurde das Plasmid, mitsamt seinen Komponenten in das Chromosom, genauer in den amyE-Genlocus von B. subtilis, durch doppelt homologe Rekombination eingebaut. Durch den Einbau ist der amy-Locus nicht mehr intakt, so dass die Transformanten keine Stärke spalten können. Eine erfolgreiche Transformation, lässt ebenfalls auf eine Integration des spaS schließen, wobei spaS zu einer Rückgewinnung der Subtilin-Produktion führt. Die Transformanten zeigten jedoch bei der Selektion auf Micrococcus-Platten keinerlei Hemmhofausbildung. Beide zeigten einen Sub-- Phänotyp. Dies ist etwas sonderbar, da im ersten Versuchsteil die vermeintlichen Transformanten keine Stärkespaltung aufwiesen und somit müsste hierbei eine Transformation stattgefunden haben. Abgesehen von den vertauschten Platten ist dies trotz dessen recht absonderlich. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass es sich bei den verwendeten Kulturen, um Mischkulturen, oder gar einer komplett anderen Kultur handelte. Diese Vermutung könnte man mit weiteren Versuchen bekräftigen, vielleicht mit einer Sequenzierung der Proben, und im Vergleich der 16S rRNA eine phylogenetische Einordnung zu bestätigt oder beziehungsweise auszuschließen. V. Literatur Anleitung „Mikrobiologisches Praktikum, BlockII: Bacillus subtilis Antibiotika und Sporulation“ der Universität Frankfurt am Main (Hauptstudium, WS 2007/2008) 44 | S e i t e Michael T. Madigan, John M. Martinko, Brock – Biology of Microorganisms, 11. Auflage, Pearson Prentice Hall, United States of America, 2006 Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker, Brock - Mikrobiologie, 9.Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg - Berlin, 2003 Hans G. Schlegel, Georg Fuchs, Allgemeine Mikrobiologie, 8.Auflage, Thieme Verlag, Stuttgart, 2006 (1) T Stein, 2005, Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions, Molecular Microbiology, 56(4) : 845-857 (2) Errington, 2003, Regulation of Endospore Formation in Bacillus subtilis, Nature Reviews Microbiology 1 : 117-126 VI. Anhang Wachstumskurven (Versuch 1.3, vergl. Abb. 7) Messung der optischen Dichte in Doppelbestimmung der Proben A und B über einen Zeitraum von acht Stunden bei 620 nm (Versuch 1.3) Messung der optischen Dichte in Doppelbestimmung der Proben A und B nach erfolgtem -Galactosidase-Test bei 420 bzw. 550 nm (Versuch 1.3) Messung der optischen Dichte in Doppelbestimmung der einzelnen mit verschiedenen Bacitracin-Konzentrationen versetzten Proben bei 620 nm (Versuch 2.2) Messung der optischen Dichte in Doppelbestimmung der einzelnen mit verschiedenen Bacitracin-Konzentrationen versetzten Proben bei 420 bzw. 550 nm (Versuch 2.2) 45 | S e i t e
