Real-time-PCR - Institut für Pathologie, Neuropathologie und

Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch
Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow,
Dr. med. Richter-Sadocco
Institut für Pathologie,
Hannover Zentrum
Rezepturhandbuch
Auswertung PCR
Übersicht Nachweise mittels PCR
Lfd.-Nr.
Nachweis von:
Elektrophorese/Photometrie/
Luminometrie/ Fragmentanalyse/Sequenzierung/
Restriktionsanalyse
1.
Beta-Globin
267 bp
(zum Nachweis der DNAQualität)
2.
3.
B-Lymphome
-
(Immunglobulin-SchwerkettenRearrangement)
mit dem Primer Fr2A: Bande oder Schmier im
Bereich zwischen 240 und 280 bp
-
mit dem Primer Fr3A: Bande oder Schmier im
Bereich zwischen 60 und 160 bp
Borrelien
Pos. bei Cp-Wert unter 40
Real-time-PCR
(Flagellin-Gen-Sequenz von B.
burgdorferi sensu stricto, B.
afzelii, B. garinii, B. valaisiana))
4.
BRAF (real-time-PCR AMP)
Pos. bei Cp-Werten unter 37
(Nachweis von Mutation V600 im
BRAF-Gen auf Chromosom 7)
5.
6.
Chlamydien (cryptic plasmid
von Chlamydia trachomatis)
241 bp
c-KIT
Ex 9, 11, 13, 17, 18: ca. 120 – 200 bp
Sequenzierung
Sequenzierung zum Mutationsnachweis
- zum Spezifitätsnachweis sequenzieren
(Nachweis von Mutationen
Exon 9,11,13,17,18)
7.
8.
CMV
Real time-PCR (Tib Molbiol)
Pos. bei Cp unter 37
(Fragment des Glykoprotein B
Genes)
Optimal bei Cp zwischen 18 und 35
Darmparasiten
Giardia lamblia: Filter465/510: Ktr Cp25+/-1
Entam. hist.: Filter 533/610: Ktr. Cp 26+/-1
Cryptosp.parv.: Filter 618/660: Ktr. Cp 27+/-1
Real-time-PCR von RIDA Gene
von r-biopharm
(Nachweis von Giardia lamblia,
entamoeba histolytica,
Cryptosporidium parvum,
Dientamoeba fragilis)
04.13/rev. 11
Dientam. frag.: Filter 533/580: Schmelzkurve:
Peak bei 85°C +/-1°C
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Auswertung PCR
9.
EBV
1. real-time-PCR (TibMolbiol)
2. Nested PCR
1. pos. Bei Cp bis 37
(Bam HI W-Fragment)
1. Lauf: 400 bp
2.:
2. Lauf: 249 bp
10. E. coli
VT1: 130 bp
(Verotoxine, enteroinvasive E.
coli, hitzelabiles und
hitzestabiles Toxin)
VT2: 285 bp
VT2v: 385 bp
-
zur Abgrenzung von VT2-Vatianten kann das
Amplifikat von VT2 einer Restriktionsanalyse
unterworfen werden (siehe Anhang S. 5)
EIEC: 424 bp
LT: 708 bp
ST: 182 bp
11. EGFR
(Exon 18 – 21 auf Chr. 7)
1. real-time-PCR (AMP)
2. Sequenzeirung
1. Pos. bei Cp zwischen 20 und 37
2.Sequenzierung
Zum Mutationsnachweis
12. Endopredict (Sividon)
Der Cp-Wert von RPL37A des QC-Streifens
sollte unter 24 liegen
RT-qPCR, Gen-Expression
Prognose Mamma-CA
13. Entamoeba histolytica und
dispar
Real-time-PCR:
Pos. bei Cp bis 40
(18S rRNA-Gen)
14. GNAS1
Amplifikatlänge: je ca. 372 bp
(Nachweis von Wildtyp und
Mutationen am Codon 210 am
GNAS1-Gen [Guanine-nucleotidebinding protein] bei polyostotischer
und monoostotischer fibröser
Dysplasie)
WT-1:
WT-2:
gnasCys/R201C
gnasGly/R201G
gnasHis/R201H
04.13/rev. 11
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Auswertung PCR
15. Hämochromatose
C282Y: 164 bp,
(Nachweis von Mutation C282Y
– Cystein zu Tyrosin – und
H63D – Histidin zu
Asparaginsäure – am HFEGen, einem zur MHC Klasse I
gehörenden Protein)
Restriktion mit SnaBI:
164 bp (Wildtyp)
72 bp und 92 bp (Mutation)
H63D: 161 bp
Restriktion mit BclI:
94 bp und 67 bp ( Wildtyp)
161 bp (Mutation)
16. Helicobacter pylori
real-time-PCR
(23S rRNA-Gen)
sicher pos. bei Cp unter 40
17. Herpes-1 u. 2
Real-time-PCR
(Nachweis des Glykoprotein D
(gD)-Genes von HSV-1 und des
Glykoprotein G (gG)-Genes von
HSV-2)
sicher pos. bei Cp unter 40
18. Herpes zoster
Real-time-PCR
sicher pos. bei Cp unter 40
(Nachweis Polymerase-Gens
von Varizella zoster))
19. HPV nach LCD Array 3.5 C
von Chipron
(Primer MY09/11 und Mix 125)
Hybridisierung nach PCR
20. HPV
(L1-Region,
Mit dem Chipron-Test werden folgende HPVTypen nachgewiesen:
6,11,16,18,31,33,35,39,42,44,45,51,52,53,54,56,5
8,59,61,62,66,67,68,70,72,73,81,82,83,84,90,91
Ca. 450 bp (MY09/11)
Ca. 150 bp (GP5+/6+9
Primer MY09/11 und
Primer GP5+/6+)).
04.13/rev. 11
Sequenzierung zur Differenzierung der
verschiedenen HPV-Typen
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Auswertung PCR
21. HPV 16, 18 oder 33
1.Lauf: 307 bp
(als nested PCR, E6 ORF)
2. Lauf:
HPV 16: 124 bp
HPV 18: 188 bp
HPV 33: 145 bp
22. HPV Haut
480 bp
L1 ORF, Consensus PCR für viele (ggf. Sequenzierung)
Haut-HPV´s)
23. Hypermethylierung des
MGMT-Promotors (Gliome)
Methylierung und
quantitative real-time-PCR
(Promotor-Hypermethylierung der
O6-Methylguanine-DNAMethyltransferase)
24. IDH1-Mutationen (Gliome)
Cp sollte unter 40 liegen,
Anteil der methylierten DNA sollte über 1%
liegen.
Sequenzierung (129 bp)
(Codon 132, Chromosom 2)
25. JC-Virus
Real-Time-PCR:
(Large T-Antigen)
Pos. bei Cp unter 40
26. Kaposi-Sarkome (HHV-8)
(nested PCR für ORF26 des
humanen Herpes-Virus 8)
1.Lauf (KS-1 u. KS-2): 233 bp
2. Lauf (WH-1 u. WH-2): ca. 180 bp
27. k-ras-Mutations-Nachweis
1. real-time-PCR (AMP)
1. Real-time-PCR:
(Codon 12, 13 und 61 vom Exon 1
Pos. bei Cp zwischen 15 und 32
k-ras-Gen)
2. Nested PCR
2. Nested PCR:
(Codon 12/13 von Exon 1 k-rasGen)
1. Lauf: 179 bp
2. Lauf: 114 bp
Sense- und Antisense-Strang sequenzieren
28. Leishmania ssp.
116 bp
(Nachweis konservierte Region
der Minicircle kDNA)
Sequenzierung
29. Listeria monocytogenes und
Listeria sp.
04.13/rev. 11
Listeria-genus-spezifisches Gen; PCR und
Hybridisierung auf einem Teststreifen (blau = pos.)
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30. Mikrosatellitenanalyse
(Screening HNPCC)
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1.Satz Primer:
BAT26: 80 – 100 bp (Mononucleotid Repeat)
BAT40 : 80 – 100 bp (Mononucleotid Repeat)
MfD15 (D17S250): ca. 150 bp (DinucleotidRepeat)
D2S123: 197 – 227 bp (Dinucleotid-repeat)
APC: 96 – 122 bp (Dinucleotid-Repeat)
2. Satz Primer:
Bat25: ca. 90 bp (Mononucleotid-Repeat)
D10S197: 161 – 173 bp (Dinucleotid-Repeat)
D18S58: 144 – 160 bp (Dinucleotid-Repeat)
D18S69: ca. 110 bp (Dinucleotid-Repeat)
MYCL1: 140 – 209 bp (Tetranucleotid-Repeat)
- Amplifikate jeweils von „Normal“ (Blut- ) und
Tumor- Probe gepaart vergleichen
31. Mykobakterien-Nachweis nach
Chipron LCD MYCO-Direkt 1.7
a) Nachweis von M. tuberculosis-Komplex
IS6110: 123 bp
(Nachweise von M. tuberculosis b) Nachweis von M. genus
komplex, atyp. Mykobakterien
c) Nachweis von
mittels Multiplex-PCR)
M. avium/intracellulare (MAI)
M. kansasii
M. xenopi
M. abscessus
M. gordonae
M. peregrinum
M. szulgai
M. haemophilum
M. xenopi
M. marium/ulcerans
M. simiae
M. smegmatis
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32. Mykobakterien
b) Nachweis von M. tuberculosis-Komplex
IS6110: 123 bp
(Nachweise von M. tuberculosis
komplex und atyp.
Evt. zusätzlich Sequenzierung bei Vorhandensein
Mykobakterien)
eines Amplifikates
Hybridisierung nach PCR
c) Multiplex-PCR für M. gordonae (221 bp), M
kansasii (292 bp) und M. fortuitum (144 bp)
= Set A
d) Multiplex-PCR für M. avium (216 bp), M.
malmoense (236 bp) und weitere atypische
Mykobakterien (16 SrRNA) ( 147 bp)
= Set B
33. Mykobakterien
(65 kDa-Antigen)
1. Lauf: 310 oder 231 bp
2. Lauf: 133 bp
- zum Nachweis der Mykobakterien-Art dient eine
Restriktionsanalyse (siehe Anhang S. 5)
34. Mykobakterien BCG
(Nachweis Spacer-Region 33-34
der Direct Repeat Region)
99bp + 172 bp: M. bovis BCG
99bp: M. bovis, M. africanum I
Keine Bande: M. tuberculosis, M. africanum II
35. Oligodendrogliome
(Nachweis on 1p- und 19qDeletionen)
Primer:
D1S468, D1S508, D1S489, D1S200, D1S514;
D1S507, D1S199, D1S2734, D1S211, D1S2696:
D19S210, D19S219, D19S596, D19S1182,
D19S412, D19S572
36. Parvovirus B19
1. Lauf: 241 bp
(NS1-Gen)
2. Lauf: 217 bp
- zum Spezifitätsnachweis ggf. sequenzieren
37. SV-40 (Nachweis des der
retinoblastoma (Rb-) pocket
binding domain des SV-40Virus
Sicher positiv bei Cp unter 40
(real-time-PCR)
04.13/rev. 11
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38.
„Nested PCR“ (Nachweis der Gamma-RezeptorFamilien V 1 - 11 nach Lorenzen et al. 1994):
T-Lymphome
(Gamma-Rezeptor)
1. Lauf: 260 bp
2.Lauf: Bande oder Schmier im Bereich von 120
bp
„Mix PCR“ (Nachweis der Gamma-RezeptorFamilien V 2 – 5, V 8 – 9, V 10 – 12 nach
Trainor et al. 1991):
Bande oder Schmier im Bereich von 170 – 230 bp
28.
29.
Toxoplasma gondii
162 bp
(Nachweis eines multicopy
genomic fragmentes [529 bp DNA
repetitive Region])
- zum Spezifitätsnachweis sequenzieren
Tropheryma whipplei
Positiv bei Cp unter 40
(Nachweis Morbus whipple mittels
real-time-PCR)
30. Yersinia enterocolitica
(16 SrRNA)
210 bp
- zum Spezifitätsnachweis sequenzieren
Erläuterungen:
Bei der Beschreibung „1. Lauf“ und „2. Lauf“ handelt es sich jeweils um eine nested PCR,
wobei der „2. Lauf“ der auszuwertende ist.
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Anhang Restriktionsanalyse für E. coli und Mykobakterien:
Erstellt: Dr. K. Henneicke
Geprüft: Dr. med. Schreiber
Freigegeben: Dr. med. Schreiber
Datum / Unterschrift
Datum / Unterschrift
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