Protokoll - Goethe

Johann Wolfgang Goethe-Universität
Frankfurt am Main
Protokoll
Biochemie Praktikum – Teil 2
Sommersemester 2005
Leitung: Hammelmann, Soppa, Zaman
Enzymkinetik
Kai Scheiffele
Florian Schwarte
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ............................................................................................................................................. 3
2
MATERIAL & METHODEN .................................................................................................................... 4
3
2.1
VERSUCH E1: SALZABHÄNGIGKEIT DER ADH ...................................................................................... 6
2.2
VERSUCH E2: KM-WERT FÜR ETOH UND NAD+ .................................................................................. 6
2.3
VERSUCH E3: SUBSTRAT-/COENZYMSPEZIFITÄT .................................................................................. 6
2.4
VERSUCH E4: REVERSIBLE/IRREVERSIBLE HEMMUNG ......................................................................... 7
2.5
VERSUCH E5: BESTIMMUNG DES HEMMTYPS VON VERSCHIEDENEN HEMMSTOFFEN ........................... 7
2.6
VERSUCH E6: HEXOKINASEBESTIMMUNG MIT EINEM GEKOPPELTEN TEST ........................................... 8
ERGEBNISSE ........................................................................................................................................... 10
3.1
BASISTESTS ........................................................................................................................................ 10
3.2
VERSUCH E1: SALZABHÄNGIGKEIT DER ADH .................................................................................... 11
3.3
VERSUCH E2: KM-WERT FÜR ETOH UND NAD+ ................................................................................ 12
3.3.1
3.4
4
Berechnung der Wechselzahl der ADH ......................................................................................... 16
VERSUCH E3: SUBSTRAT-/COENZYMSPEZIFITÄT ................................................................................ 17
3.4.1
Substratspezifität ........................................................................................................................... 17
3.4.2
Coenzymspezifität .......................................................................................................................... 18
3.5
VERSUCH E4: REVERSIBLE/IRREVERSIBLE HEMMUNG ....................................................................... 18
3.6
VERSUCH E5: BESTIMMUNG DES HEMMTYPS VON VERSCHIEDENEN HEMMSTOFFEN ......................... 19
3.7
VERSUCH E6: HEXOKINASEBESTIMMUNG MIT EINEM GEKOPPELTEN TEST ......................................... 20
DISKUSSION ............................................................................................................................................ 22
4.1
VERSUCH E1: SALZABHÄNGIGKEIT DER ADH .................................................................................... 22
4.2
VERSUCH E2: KM-WERT FÜR ETOH UND NAD+ ................................................................................ 22
4.3
VERSUCH E3: SUBSTRAT-/COENZYMSPEZIFITÄT ................................................................................ 23
4.4
VERSUCH E4: REVERSIBLE/IRREVERSIBLE HEMMUNG ....................................................................... 23
4.5
VERSUCH E5: BESTIMMUNG DES HEMMTYPS VON VERSCHIEDENEN HEMMSTOFFEN ......................... 24
4.6
VERSUCH E6: HEXOKINASEBESTIMMUNG MIT EINEM GEKOPPELTEN TEST ......................................... 24
5
ANHANG ................................................................................................................................................... 25
6
QUELLEN ................................................................................................................................................. 25
-2-
1 Einleitung
Kenntnisse über die Kinetik eines Enzyms sind notwendig um Untersuchungen über
den Enzymmechanismus anzustellen sowie auch zur quantitativen Bestimmung von
Enzym und Substrat.
In diesem Praktikumsteil geht es in erster Linie um die Enzymkinetik der
Alkoholdehydrogenase sowie um die Hexokinase. Es werden einige enzymkinetische
Parameter charakterisiert (z.B. KM-Werte, Substratspezifität, Eigenschaften von
Inhibitoren).
Versuche mit der Alkoholdehydrogenase werden anhand von optischen Tests
verfolgt, da NADH (ein Produkt der von der Alkoholdehydrogenase katalysierten
Reaktion) Licht zwischen 300 und 380 nm absorbiert. Der Hexokinase-Versuch
(Versuch E6) dient dem Kennen lernen von gekoppelten Enzymtests (da die
katalysierte Reaktion nicht direkt durch einen photometrischen Test verfolgt werden
kann).
-3-
2 Material & Methoden
Benötigte Lösungen für die gesamte Praktikumsgruppe werden angesetzt nach
Tabelle 1. Alle nachfolgend beschriebenen Enzymtests mit ADH werden nach dem
Schema in Tabelle 2 angesetzt.
Tabelle 1.
Lösungen für Enzymkinetik-Untersuchungen
Reagenz
Menge
Testpuffer, bestehend aus…
500 ml
200 mM Na4P2O7 x 10 H2O
44,606 g
200 mM Glycin
7,507 g
40 mM Semicarbacidhydrochlorid
2,2306 g
0,4 M Ethanol
250 ml
0,4 M Methanol
10 ml
0,4 M n-Propanol
10 ml
0,4 M iso-Propanol
10 ml
0,4 M n-Butanol
10 ml
0,4 M iso-Butanol
10 ml
0,4 M n-Pentanol
10 ml
5 M NaCl
0,5 l
10 mM Natriumphosphat pH 7,5
1l
Tabelle 2.
Pipettierschema für Basistest
Reagenz
Menge
Testpuffer
250 µl
A. dest
400 µl
EtOH
250 µl
NAD+
50 µl
Enzym (ADH)
50 µl
Der Reaktionsverlauf wird in einem Photometer bei 340 nm verfolgt. Gemessen wird
die Bildung von NADH, das sowohl bei 366 nm wie bei 340 nm Wellenlängen
absorbiert. Bei der verwendeten Wellenlänge von 340 nm hat NADH den folgenden
Extinktionskoeffizienten: ε340 = 6220 M-1 cm-1. Der Test wird bei Raumtemperatur
durchgeführt, genullt wird das Photometer vor jedem Test mit der Gesamtlösung in
der Küvette ohne das Enzym.
-4-
Zu Beginn wird empirisch ermittelt, wie viel Enzym eingesetzt werden muss, um den
Test gut auszuwerten zu können. Die entsprechende Konzentration wird dann für alle
weiteren Enzymtests verwendet. Die Enzymstammlösung besitzt eine Konzentration
von 1 mg ADH pro ml. Getestet worden sind die Verdünnungen 1:100 und 1:500. Mit
der in allen weiteren Versuchen verwendeten Verdünnung von 1:500 (siehe
Ergebnisse) sind drei Basistests mit gesättigten Enzym- und Substratkonzentrationen
durchgeführt worden. Über die entsprechend abgeleiteten Anfangsgeschwindigkeiten
des Enzyms wird dann gemittelt.
Allerdings ist hier der Fehler begangen worden, eine normale Lampe (sichtbares
Wellenspektrum) mit 340 nm (UV-Bereich) einzusetzen statt der UV-Lampe, mit der
das Photometer ebenfalls ausgestattet ist. Deshalb wird der Basistest zweimal mit
UV-Lampe wiederholt.
Das Schreiberpapier besitzt (neben horizontalen Markierungen) vertikale Achsen, die
im Abstand von 2 cm zueinander angeordnet sind. In regelmäßigen Abständen, in
denen der Stift des Schreibers diese vertikalen Achsen während des Experiments
passiert, werden die zugehörigen Extinktionswerte bestimmt. Die entsprechende
Skalierung ist abhängig von der eingestellten Schreibergeschwindigkeit und der
Empfindlichkeit. Die Schreibergeschwindigkeit wird für alle Tests bei 3 cm/min
belassen, die Empfindlichkeit jedoch abhängig von der Enzymaktivität angepasst, um
jeweils genaue Ergebnisse zu bekommen.
-5-
2.1 Versuch E1: Salzabhängigkeit der ADH
Wie im Skript beschrieben werden Enzymtests bei unterschiedlichen NaClKonzentrationen von 0 bis 2 M in Schritten von 0,4 M durchgeführt. Die in der
Küvette eingesetzten 400 µl a. dest. werden, entsprechend der Menge an NaClLösung, reduziert, um auf eine Gesamtmenge von 1 ml in einem Ansatz zu kommen.
2.2 Versuch E2: KM-Wert für EtOH und NAD+
Bei diesen Tests werden jeweils die KM-Werte der ADH mit EtOH und NAD+ als
Substrat getestet. Das eine Substrat des zu untersuchenden Enzyms wird für
insgesamt 15 Tests in bestimmten Schritten soweit herunter verdünnt, bis die ADH
nur noch 20% ihrer Maximalgeschwindigkeit arbeitet. Das jeweils andere Substrat
wird dabei immer in sättigender Konzentration zugeführt, da für die KM-WertBestimmung nur von einem Substrat die Abhängigkeit der Enzym-Geschwindigkeit
von der Substrat-Konzentration ermittelt wird.
Die Messdaten werden wie im Skript beschrieben ausgewertet und in drei
verschiedenen Diagrammen pro Substrat (direkt: [S] gegen [∆E/min], Auftragung
nach Lineweaver/Burk und Hanes) aufgetragen. Außerdem wird die Wechselzahl
(Anzahl umgesetzter Substratmoleküle pro Enzymmolekül pro Sekunde) für EtOH
wie für NAD+ bestimmt.
2.3 Versuch E3: Substrat-/Coenzymspezifität
Wie im Skript beschrieben, wird die Reaktionsgeschwindigkeit der ADH mit
unterschiedlichen Substraten und Coenzymen getestet, um dann Rückschlüsse auf
die Substrat- bzw. Coenzymspezifität ziehen zu können. Die verwendeten Substrate
sind Ethanol, Methanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol, iso-Butanol, nPentanol, Glykol, Glykolsäure und Ethanolamin.
-6-
Dazu wird von den aufgeführten Substanzen jeweils 100 mM eingesetzt, während
NAD+ in sättigender Konzentration hinzu gegeben wird. Im Coenzymspezifitätstest
werden dann bei gesättigter Konzentration von Ethanol als Primärsubstrat sowohl 5
mM NAD+ als auch 5 mM NADP+ eingesetzt.
2.4 Versuch E4: Reversible/irreversible Hemmung
Zwei Inhibitoren der ADH werden dahingehend getestet, ob sie das Enzym reversibel
oder irreversibel hemmen. Etwa 2 bis 3 Minuten nachdem der Inhibitor zur Probe
gegeben worden ist, wird über eine erhöhte Zugabe von Substrat versucht, den
Inhibitor wieder zu verdrängen. Bei reversibler Hemmung ist dies auch zu erwarten,
d.h. das Enzym sollte nach erhöhter Zugabe von EtOH wieder schneller arbeiten. Bei
der irreversiblen Hemmung jedoch sollte die Aktivität nach wie vor gehemmt sein.
Als Hemmstoffe werden eingesetzt 0,1 ml 0,1 M Hydroxylamin und 0,1 ml 10 mM
Hg(II)-Acetat. In einem Kontrollansatz ohne Hemmstoff werden 80 mM Ethanol
eingesetzt. Die Versuche mit Hemmstoff sehen wie folgt aus:
Zunächst wird etwa eine Minute die Geschwindigkeit des Ansatzes ohne Hemmstoff
registriert. Dann wird der Hemmstoff in entsprechender Konzentration hinzu
gegeben, wobei die Extinktionsänderung etwa zwei bis drei Minuten aufgezeichnet
wird. Abschließend werden 0,3 ml 0,8 M Ethanol hinzu gegeben und die
Geschwindigkeit registriert.
2.5 Versuch E5: Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen
Hemmstoffen
Wie im Skript beschrieben kann der Hemmtyp eines Enzym-Inhibitor-Komplexes
bestimmt
werden,
unterschiedlichen
indem
Inhibitor-
Scharen
wie
von
Graphen
erzeugt
Substratkonzentrationen.
Bei
werden
bei
verschiedenen
Inhibitorkonzentrationen soll nun bestimmt werden, wie sich die Lage der Kurve in
-7-
der direkten Auftragung (v gegen s), im linearisierten Lineweaver-Burk- wie im
Hanes-Diagramm ändern.
Getestet werden vier unterschiedliche Konzentrationen (0 mM, 1 mM, 3 mM und 4
mM) des vermeintlichen Inhibitors Aspirin bei jeweils zehn unterschiedlichen
Substratkonzentrationen.
2.6 Versuch E6: Hexokinasebestimmung mit einem gekoppelten
Test
Die Hexokinase überträgt eine Phosphatgruppe von ATP sowohl auf Glukose wie
auch Fruktose am C6-Atom. Da die Enzymreaktion der Hexokinase nicht direkt über
einen photometrischen Test verfolgt werden kann, wird die Enzymreaktion an eine
weitere gekoppelt. Diese zweite, gekoppelte Indikatorreaktion ergibt als Produkt
NADPH, welches wiederum bei 340 nm absorbiert und somit dessen Bildung am
Photometer zurückverfolgt werden kann. Von der Geschwindigkeit der NADPHBildung kann man dann Rückschlüsse auf die Hexokinaseaktivität ziehen, insofern
diese erste Reaktion geschwindigkeitsbestimmend ist. Dies wird durch das passende
Verhältnis von der Hexokinase- zur Substratkonzentration erreicht.
Als gekoppeltes Enzym wird die Glukose-6-phosphat Dehydrogenase eingesetzt,
welches das zuvor durch die Hexokinase gebildete Glukose-6-phosphat zusammen
mit NADP+ zu 6-Phosphoglukonolakton und NADPH umsetzt. Da nicht nur mit
Glukose als Substrat getestet wird, sondern auch mit Fruktose, wird durch Zugabe
von
Phosphoglukose-Iosmerase
aus
Frukose-6-phosphat
Glukose-6-phosphat
gebildet, um dann vom gekoppelten Enzym weiterverarbeitet werden zu können.
Damit die gemessene Geschwindigkeit von dem getesteten Enzym begrenzt ist
(s.o.), wird die Konzentration der eingesetzten Hexokinase im Verhältnis zur
Glukose-6-phosphat Dehydrogenase so gering gewählt, dass letzteres Enzym
deutlich schneller ihr Substrat umsetzt als ersteres. Andernfalls würde sich nämlich
trotz
unterschiedlicher
Geschwindigkeit
-8-
der
Hexokinase
die
gemessene
Geschwindigkeit durch das Photometer nicht ändern, da das gekoppelte Enzym
gesättigt wäre.
Wie im Skript beschrieben soll von einer Hexokinaselösung die Volumenaktivität
bestimmt werden, sowohl mit Glukose wie auch mit Fruktose als Substrat. Bei
letzterem wird auch ein Negativtest ohne Phosphoglukose-Isomerase durchgeführt.
Jedes der beiden Substrate wird bei zwei unterschiedlichen Verdünnungen von
Hexokinase jeweils zweimal getestet. Von diesen vier Tests pro Substrat wird die
Geschwindigkeit des Enzyms berechnet und Mittelwert wie Standardabweichung
bestimmt.
-9-
3 Ergebnisse
3.1 Basistests
Nach Testen der Enzymverdünnungen 1:100 und 1:500 ist letztere für alle
nachfolgenden Tests verwendet worden, da die resultierende Aufzeichnung einen
ebenmäßig-linearen Anstieg ergeben hat. In Tabelle 3 sind die Änderungen der OD
pro 2 cm Schreiberpapier (= Abstand der vertikalen Achsen auf dem Papier; siehe
auch S. 6, letzter Absatz) abhängig von der gewählten Empfindlichkeit aufgeführt. Mit
anderen Worten ist hier aufgeführt, welche OD-Änderung bei der entsprechenden
Spannung den Stift 2 cm bewegen lässt. Im Anhang sind die in verschiedenen Tests
gemessenen OD-Änderungen pro 2 cm aufgeführt, über die gemittelt worden ist. Die
Differenzen der an den 2-cm-Achsen des Schreiberpapiers abgelesenen Werte aus
Tabelle 4 und 5 korrelieren mit Tabelle 3.
Tabelle 3.
Abhängigkeit der OD-Wert-Änderung pro 2 cm Schreiberpapier von der
eingestellten Empfindlichkeit des Photometers
Tabelle 4.
Empfindlichkeit [V]
∆OD / 2 cm
0,1
0,02
0,2
0,04
0,5
0,1
1
0,2
Basistest 1: Abgelesene OD-Werte bei Passieren des Stifts von entsprechenden
2-cm-Achsen; Schreiber-Parameter: 3 cm/min, 0,2V
Achsbeschriftung
OD-Wert
60 %
0,207
70 %
0,244
80 %
0,283
90 %
0,323
Die abgelesene Geschwindigkeit beträgt 0,228 ∆E/min.
- 10 -
Tabelle 5.
Abgelesene OD-Werte bei Passieren des Stifts von entsprechenden 2-cmAchsen; Schreiber-Parameter: 3 cm/min, 0,2V
Achsbeschriftung
OD-Wert
50
0,166
60
0,203
70
0,244
80
0,284
Die abgelesene Geschwindigkeit beträgt 0,220 ∆E/min.
Die
durchschnittliche
Geschwindigkeit
von
ADH
bei
gesättigten
Versuch
verwendeten
Substratkonzentrationen beträgt 0,224 ∆E/min (±0,004).
3.2 Versuch E1: Salzabhängigkeit der ADH
Die
folgende
Tabelle
zeigt
die
im
beschriebenen
Salzkonzentrationen und die jeweils gemessenen Geschwindigkeiten. Darunter
befindet sich ein Diagramm, dass die Aktivität als Funktion der Salzkonzentration
zeigt.
Tabelle 6.
Salzkonzentrationen und Geschwindigkeiten
NaCl [mM]
∆E/min
0
0,036
0,4
0,032
0,8
0,024
1,2
0,016
1,6
0,011
2
0,008
- 11 -
0,040
0,035
0,030
V
0,025
Salzabhängigkeit der
ADH
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0
0,5
1
1,5
2
2,5
NaCl [mM]
Abbildung 1.
Aktivität als Funktion der Salzkonzentration
3.3 Versuch E2: KM-Wert für EtOH und NAD+
Die folgenden zwei Tabellen zeigen die im Versuch verwendeten Konzentrationen
von EtOH und NAD+ sowie die jeweiligen Messdaten. Jeder Tabelle schließen sich
drei verschiedene Auftragungen für die graphische Auswertung (direkte Auftragung,
Lineweaver/Burk, Hanes) an. Die KM und VMax Werte der verschiedenen
Auftragungen werden zusammengefasst und abschließend die Wechselzahl der
ADH bestimmt.
Tabelle 7.
Messdaten bei versch. EtOH-Konzentrationen
EtOH-Konz.
[mM]
[∆E/min]
v
1/s
[µMol/min]
[1/mM]
1/V[min/µMol]
s/v [mM *
min/µMol]
0,25
0,022
0,0035
4,00
282,73
70,68
0,5
0,030
0,0048
2,00
207,33
103,67
0,75
0,036
0,0058
1,33
172,78
129,58
1
0,039
0,0063
1,00
159,49
159,49
1,25
0,040
0,0064
0,80
155,50
194,38
1,75
0,064
0,0103
0,57
97,19
170,08
2
0,080
0,0129
0,50
77,75
155,50
2,5
0,086
0,0138
0,40
72,33
180,81
5
0,100
0,0161
0,20
62,20
311,00
7,5
0,102
0,0164
0,13
60,98
457,35
10
0,128
0,0206
0,10
48,59
485,94
12,5
0,136
0,0219
0,08
45,74
571,69
15
0,144
0,0232
0,07
43,19
647,92
20
0,160
0,0257
0,05
38,88
777,50
- 12 -
25
0,160
0,0257
0,04
38,88
971,88
50
0,168
0,0270
0,02
37,02
1851,19
100
0,168
0,0270
0,01
37,02
3702,38
direkte Auftragung
0,0350
v [μmol/min]
0,0300
0,0250
0,0200
0,0150
0,0100
0,0050
0,0000
0
20
40
60
80
100
120
EtOH [mM]
Abbildung 2.
Direkte Auftragung für den EtOH Versuch
Lineweaver / Burk
350,00
1/v [1/(μmol/min)]
300,00
250,00
200,00
150,00
100,00
50,00
-2,00
-1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
1/s [1/(mM)]
Abbildung 3.
Auftragung nach Lineweaver/Burk für den EtOH Versuch
- 13 -
Hanes
s/v [mM*min/µmol]
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0
20
40
60
80
100
120
s [mM]
Abbildung 4.
Tabelle 8.
NAD+-Konz.
[mM]
Auftragung nach Hanes für den EtOH Versuch
Messdaten bei versch. NAD+ Konzentrationen
[∆E/min]
v
1/s
1/v
s/v [mM *
[µMol/min]
[1/mM]
[min/µMol]
min/µMol]
0,03
0,10
0,015
33,33
64,79
1,94
0,04
0,09
0,014
25,00
70,68
2,83
0,05
0,09
0,014
20,00
70,68
3,53
0,1
0,11
0,018
10,00
55,54
5,55
0,15
0,10
0,016
6,67
62,20
9,33
0,2
0,14
0,023
5,00
43,19
8,64
0,25
0,14
0,023
4,00
43,19
10,80
0,3
0,15
0,024
3,33
42,03
12,61
0,5
0,17
0,027
2,00
37,02
18,51
0,75
0,19
0,030
1,33
33,09
24,81
1
0,21
0,033
1,00
29,90
29,90
2
0,25
0,041
0,50
24,68
49,37
3,5
0,29
0,046
0,29
21,60
75,59
4
0,28
0,044
0,25
22,54
90,14
5
0,29
0,047
0,20
21,30
106,51
- 14 -
v[µMol/min]
direkte Auftragung
0,050
0,045
0,040
0,035
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0
1
2
3
4
5
6
s[mM]
Abbildung 5.
Direkte Auftragung für den NAD+ Versuch
Lineweaver/Burk
100,00
1/v[min/µMol]
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00
-10,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
1/s[1/mM]
Abbildung 6.
Auftragung nach Lineweaver/Burk für den NAD+ Versuch
Hanes
s/v[mM * min/µMol]
6
5
4
3
2
1
0
-10,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
s[mM]
Abbildung 7.
Auftragung nach Hanes für den NAD+ Versuch
- 15 -
Tabelle 9.
KM und VMax Werte (in [µMol/min]) für versch. Auftragungen
Substrat
KM(direkt)
VMax(direkt)
KM(LB)
VMax(LB)
KM(Hanes)
VMax(Hanes)
EtOH
3,49
0,027
1,32
0,020
(-107)*
0,028
NAD+
0,1586
0,047
0,046
0,031
(-5,13)*
0,048
*
praktisch unmögliche Werte, abgeleitet durch Berechnen des X-Achsen-Schnittpunkts (mit
invertiertem Vorzeichen) der interpolierten Gerade im Hanes Diagramm. Siehe auch
Diskussion.
3.3.1 Berechnung der Wechselzahl der ADH
Molekulargewicht der Alkoholdehydrogenase:
40 kDa ≡ 6,64 * 10-14 µg
Menge an ADH in der Stammlösung:
1 mg / ml
Menge an ADH in verdünnter Lösung (1 : 500): 2 µg / ml
Menge an ADH pro Ansatz:
0,1 µg / 50 µl
Anzahl an ADH-Molekülen pro Ansatz:
0,1 µg / 6,64 * 10-14 µg = 1,51 * 1012
vmax in mol/s ≡
v max [µmol/min]
60 * 1000000
Anzahl an umgesetzten Substrat-Molekülen pro Ansatz und Sekunde:
vmax [mol/s] * 6,022*1023 (Avogadro’sche Zahl)
Die Wechselzahl errechnet sich somit folgendermaßen:
v max [mol/s] * 6,022 *10 23
.
1,51*1012
Tabelle 10 zeigt die berechneten Wechselzahlen anhand der, abhängig von der
gewählten Auftragungsart, abgeleiteten Variablen vmax.
Tabelle 10.
Berechnete Wechselzahlen abhängig von drei verschiedenen Auftragungsarten.
Substrat
direkt
Lineweaver/Burk
Hanes
Ethanol
179,46
132,94
185,92
NAD+
313,22
206,6
319,05
- 16 -
3.4 Versuch E3: Substrat-/Coenzymspezifität
3.4.1 Substratspezifität
Die folgende Tabelle enthält neben den relativen gemessenen Geschwindigkeiten
(mit EtOH ≡ 100%) auch die Strukturformeln des jeweiligen Substrats.
Tabelle 11.
Spezifische Aktivität und Struktur der Substrate
Substrat
Rel. Aktivität
EtOH
100%
MeOH
3,7%
n-Propanol
56%
Iso-Propanol
8,2%
Struktur
H3C
H2
C
H3C
H2
C
H3C
H3C
OH
OH
H2
C
OH
H
C
OH
CH3
n-Butanol
20%
Iso-Butanol
3,7%
H3C
H2
C
H3C
H2
C
H2
C
OH
H2
C
H
C
OH
CH3
n-Pentanol
7,4%
Glykol
5%
Glykolsäure
-
H3C
H2
C
H2
C
H2
C
H2
C
HO
H2
C
HO
C
H2
C
H2
C
H2
C
H2
C
OH
OH
OH
O
Ethanolamin
8,9%
H2N
- 17 -
OH
3.4.2 Coenzymspezifität
Die folgende Tabelle vergleicht die Reaktionsgeschwindigkeit unterschiedlicher
Coenzyme, wobei NAD+ ≡ 100%.
Tabelle 12.
Spezifische Aktivität abhängig von verschiedenen Coenzymen NAD+ bzw.
NADP+.
Coenzym
Rel.
Geschwindigkeit
NAD+
100%
NADP+
0%
3.5 Versuch E4: Reversible/irreversible Hemmung
Die folgende Tabelle zeigt die Aktivität bei Verwendung verschiedener Hemmstoffe
zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
Tabelle 13.
Spezifische Aktivität zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei verschiedenen
Hemmstoffen
Hemmstoff
Vor Hemmung
Zugabe –
Zugabe – Ethanol
Hemmstoff
Hydroxylamin
100%
28%
56%
Hg(II)-Acetat
100%
0%
0%
- 18 -
3.6 Versuch E5: Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen
Hemmstoffen
Die folgenden Abbildungen zeigen die drei graphischen Auftragungen zur
Auswertung des Geschwindigkeitsverlaufs bei verschiedenen Konzentrationen von
ASS. Darunter sind in einer Tabelle die jeweiligen K M und VMax Werte
zusammengefasst.
v [µMol/min]
Direkte Auftragung
0,04
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
0 mM ASS
1 mM ASS
3 mM ASS
4 mM ASS
Logarithmisch (0 mM ASS)
Logarithmisch (1 mM ASS)
Logarithmisch (3 mM ASS)
0
20
40
60
80
100
Logarithmisch (4 mM ASS)
s [mM]
Abbildung 8.
Direkte Auftragung der Geschwindigkeit unterschiedlicher ASS Konzentrationen
LB
1/V
300
250
0 mM ASS
200
1 mM ASS
3 mM ASS
150
4 mM ASS
100
Linear (3 mM ASS)
50
Linear (4 mM ASS)
0
-0,2
Linear (0 mM ASS)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Linear (1 mM ASS)
1/[S]
Abbildung 9.
Auftragung nach Lineweaver/Burk für unterschiedliche ASS Konzentrationen
- 19 -
Hanes
5000
0 mM ASS
[S]/V
4000
1 mM ASS
3000
3 mM ASS
2000
4 mM ASS
Linear (0 mM ASS)
1000
Linear (1 mM ASS)
0
-20
Linear (3 mM ASS)
0
20
40
60
80
100
120
Linear (4 mM ASS)
[S]
Abbildung 10. Auftragung nach Hanes für verschiedene ASS Konzentrationen
Tabelle 14.
Zusammenfassung der KM und VMax Werte des ASS Versuchs.
direkt
LB
Hanes
Km
Vmax
Km
Vmax
Km
Vmax
0mM
6,33
0,032
2,81
0,025
8,16
0,029
1mM
5,43
0,03
2,05
0,023
7,3
0,031
3mM
6
0,028
5,63
0,028
8
0,033
4mM
6,54
0,026
4,01
0,022
7,76
0,035
3.7 Versuch E6: Hexokinasebestimmung mit einem gekoppelten
Test
Tabelle 15.
∆E340/min bei verschiedenen Substraten und unterschiedlicher Verdünnung.
Substrat
Verdünnung
1 : 50
1 : 100
Glucose
0,28
0,14
Glucose
0,28
0,14
Ø
0,28
0,14
(Standardabweichung)
(0,00)
(0,00)
Fructose
0,32
0,16
Fructose
0,30
0,15
Ø
0,31
0,155
(Standardabweichung)
(0,00)
(0,00)
Fructose
0,00
(ohne Phosphoglukose-Isomerase)
- 20 -
Die Gesamtaktivität U in [µmol/min] berechnet sich nach dem Lambert/Beerschen
Gesetz
durch
folgende
Formel:
U
E 340 / min
.
 340 * d
Dabei
beträgt
der
Extinktionskoeffizient ε340 für NADPH 6300 M-1 cm-1 und der Durchmesser d der
getesteten Flüssigkeit 1 cm. Der jeweilige Verdünnungsfaktor von 50 bzw. 100 muss
vorher
mit
der
gemessenen
Extinktion
multipliziert
werden.
Da
0,1
ml
Hexokinaselösung eingesetzt werde, erhält man die spezifische Aktivität in [U/ml]
durch U*10.
Tabelle 16.
Umsatz der verschiedenen Substrate
Substrat (Verdünnung)
U [µmol / min]
U / ml
Glucose 1:50
2,25
22,5
Glucose 1:100
2,25
22,5
Ø
2,25
22,5
(Standardabweichung)
(0,00)
(0,00)
Fructose 1:50
2,49
24,9
Fructose 1:100
2,49
24,9
Ø
2,49
24,9
(Standardabweichung)
(0,00)
(0,00)
Fructose
0,00
0,00
(ohne PhosphoglukoseIsomerase)
- 21 -
4 Diskussion
4.1 Versuch E1: Salzabhängigkeit der ADH
Tabelle 6 und Abbildung 1 zeigen eindeutig einen negativen Zusammenhang
zwischen Salzkonzentration und Geschwindigkeit des Enzyms auf. Je höher man die
Salzkonzentration wählt, desto weniger Produkt wird gebildet.
4.2 Versuch E2: KM-Wert für EtOH und NAD+
Aus den Abbildungen 2 und 5 lässt sich unmittelbar folgern, dass die ADH der
Michaelis-Menten-Kinetik folgt. So nähert sich für beide Substrate bei steigender
Substratkonzentration
die
Geschwindigkeit
asymptotisch
der
Maximalgeschwindigkeit VMax.
Im
Idealfall
ist
zu
erwarten,
dass
bei
allen
drei
unterschiedlichen
Auftragungsmethoden gleiche KM- und VMax-Werte aus den Auftragungen ableiten
ließen. Die unterschiedlichen KM- und VMax-Werte sind vermutlich dadurch zu
begründen, dass diese Werte jeweils nur Schätzwerte sind, welche von der je nach
Auftragungsart geschätzten Funktion abhängen. Die jeweilige Geradenfunktion wird
über Interpolation der experimentellen Daten gewonnen, und je nach Auftragungsart
wirkt sich ein Abweichen dieser Daten von einer idealen Geradenfunktion
unterschiedlich auf die abgeleiteten KM- und VMax-Werte aus.
Bei der Auftragungsart nach Hanes kommt noch hinzu, dass der Parameter s einen
höheren Einfluss auf den Funktionsverlauf hat wie der Parameter v, da s in beiden
Dimensionen bzw. Achsen enthalten ist. Durch diesen Umstand sind vermutlich auch
die sehr stark abweichenden und darüber hinaus praktisch unmöglichen, nach Hanes
abgeleiteten, KM-Werte zu erklären.
- 22 -
4.3 Versuch E3: Substrat-/Coenzymspezifität
Vergleicht man die gemessenen spezifischen Aktivitäten mit den entsprechenden
Strukturformeln der verwendeten Substrate, so lässt dies Rückschlüsse auf die
Substratspezifität zu.
Man erkennt, dass die Raumerfüllung des aktiven Zentrums durch das Substrat sehr
wohl eine Rolle spielt. Außerhalb des aktiven Zentrums allerdings offensichtlich nicht,
mit der Einschränkung, dass die Kette hydrophob sein muss.
Die Coenzymspezifität zeigt sich ganz klar in der Nichtaktivität des Enzyms bei
Verwendung von NADP+ anstatt NAD+ als Coenzym. Dies lässt sich darauf
zurückführen, dass die Phosphatgruppe des NADP+ sowohl aufgrund der Größe als
auch der immensen negativen Ladung nicht in die für NAD + vorgesehene
Bindetasche passt.
4.4 Versuch E4: Reversible/irreversible Hemmung
Die aufgeführten spezifischen Aktivitäten in Tabelle 13 lassen eindeutige Aussagen
über den Hemmtyp der beiden eingesetzten Hemmstoffe zu.
Bei Hydroxylamin handelt es sich ganz offensichtlich um eine reversible Hemmung,
da nach Zugabe von Ethanol die Geschwindigkeit wieder ansteigt. Dies spricht für
eine Konkurrenzreaktion zwischen Ethanol und Hydroxylamin.
Bei Hg(II)-Acetat ist die Hemmung ganz eindeutig irreversibel. Die Aktivität
verschwindet unmittelbar nach Zugabe des Hemmstoffs und lässt sich auch nicht
durch Zugabe von Ethanol wieder regenerieren. Das Enzym scheint also dauerhaft
geschädigt und damit irreversibel gehemmt zu sein.
- 23 -
4.5 Versuch E5: Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen
Hemmstoffen
Abbildung 8 lässt den Schluss zu, dass ASS für die ADH ein kompetitiver Inhibitor ist.
Diese Art der Hemmung ist dadurch charakterisiert, dass das Substrat sich mit dem
Inhibitor Konkurrenz um das aktive Zentrum befindet. Zu erkennen ist dieser
Umstand
daran,
dass
Maximalgeschwindigkeit
mit
in
steigender
etwa
Konzentration
gleichbleibt.
Die
des
Inhibitors
beobachteten
die
kleinen
Schwankungen von vmax bei unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen
sind
möglicherweise dadurch zu erklären, dass die Maximalgeschwindigkeit bei den
eingesetzten Substratkonzentrationen nicht erreicht worden ist. Man hätte vielleicht
mit noch höheren Substratkonzentrationen von mehr als 100 mM experimentieren
sollen.
Der KM-Wert dagegen steigt im Großen und Ganzen an. Tatsächlich sind hier
deutliche Schwankungen zu erkennen, vor allem die nach Hanes abgeleiteten K MWerte fallen hier raus. Der Trend zu einem ansteigenden KM-Wert ist jedoch bei den
zwei anderen Auftragungsarten zu erkennen.
4.6 Versuch E6: Hexokinasebestimmung mit einem gekoppelten
Test
Es fällt bei der Betrachtung der Ergebnisse auf, dass der Umsatz der verschiedenen
Substrate etwas von einander abweicht. Es ist also zu diskutieren, ob dafür ein
sterischer oder ein sonstiger Grund vorliegt. Bei genauerer Betrachtung des
Mechanismus ist allerdings von Messungenauigkeiten auszugehen, da die
Hexokinase Glucose bzw. Fructose jeweils in der offenkettigen Form verarbeitet.
Der Versuchsansatz, bei dem Fructose ohne die Zugabe der PhosphoglukoseIsomerase als Substrat verwendet wurde, zeigt wie erwartet keine Aktivität der
Hexokinase. Tatsächlich ist Enzymaktivität seitens der Hexokinase zu erwarten, kann
jedoch nicht detektiert werden, da hier das Produkt Fruktose-6-phosphat nicht in
- 24 -
Glukose-6-phosphat umgewandelt wird und somit die Indikatorreaktion nicht ablaufen
kann.
5 Anhang
Tabelle 17.
Testlauf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, bestimmt durch die Korrelation der
Achsbeschriftung des Schreiberpapiers mit den gemessenen OD-Werten;
gemessen wird die Menge an NADH, welche bei der Umsetzung von EtOH
mittels ADH-Dehydrogenase entsteht; Geschwindigkeit des Schreibers = 3
cm/min.
Empfindl.
[EtOH]
[V]
Achsbeschriftung
10
0,1
20
30
40
50
60
80 mM
0,021
0,040
0,062
0,080
0,100
60 mM
0,018
0,042
0,059
0,080
0,100
4 mM
0,019
0,040
0,059
0,080
0,099
2 mM
0,019
0,040
0,060
0,080
0,100
1 mM
70
80
90
0,120
0,140
0,161
-0,0015
0,018
Ø
-0,0015
0,019
0,041
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,161
(Standardabweichung)
(0,000)
(0,001)
(0,001)
(0,001)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
0,080
0,122
0,161
0,201
0,242
0,281
0,080
0,122
0,162
0,202
0,242
0,283
0,080
0,120
0,161
0,200
0,240
0,040
0,080
0,121
0,162
Ø
0,041
0,080
0,121
0,162
0,201
0,241
0,282
(Standardabweichung)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
(0,000)
0,2
100 mM
50 mM
0,041
10 mM
5 mM
6 Quellen
[1] Molecular Structure Database, http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/msdlite/index.html,
(lv 09.05.2005)
[2] Informationsportal zur angewandten Geophysik: http://www.geophysik.de, (lv
13.05.2005)
[3] Umrechnung Maßeinheiten, http://molbiol.ru/ger/scripts/01_08.html#a414, (lv
14.05.2005)
- 25 -