Biochemie-‐Seminar 11

Biochemie-Seminar 10
Erarbeitet von Till, Enno & Leif
Biochemie-‐Seminar 11 Verweise mit [L] bezieht sich auf „Biochemie und Pathobiochemie“ von Löffler, Petrides, Heinrich in 8. Auflage. Verwendete Abkürzungen: AS (Aminosäure); TF (Transkriptionsfaktoren) Zur allgemeinen Einführung in dieses Thema wird die Wiederholung der Transkription (Seminar 10) empfohlen. Proteinbiosynthese (Translation) -‐
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Proteinstruktur auf DNA-‐Ebene festgelegt o als mRNA zum Ort der Synthese transportiert o genetischer Code (Basentripletts der mRNA-‐Sequenz = Codon) verschlüsselt für die Aminosäuren (AS) Translation erfolgt an Ribosomen o Code abgelesen und in Sequenz der AS „übersetzt“  Zellen mit hoher Proteinsyntheserate haben viele Ribosomen (an ER = rER) Translation beginnt am Start-‐Codon (N-‐terminale AS) mit spezifischer Transfer-‐RNAs (tRNA) o jede tRNA erkennt mit ihrem Anticodon die für eine spezifische AS codierenden Codons auf mRNA o tRNA trägt entsprechende „cognate“ AS o tRNA bindet an Codon (über α-‐C-‐Atom der AS)  Kettenverlängerung durch Peptidbindungen am C-‐Terminus  Peptidbindung im Peptidyltransferase-‐Zentrum (PTZ) des Ribosomen hergestelllt Ablauf der Translation durch Transkriptionsfaktoren (TF) reguliert Proteine werden gefaltet, modifiziert und aufgrund von Sortierungs-‐ und Transportsignalen (innerhalb Primärstruktur) in versch. Kompartimente verteilt fehlerhafte Produkte, unbenötigte und geschädigte Proteine durch Proteinase zu AS hydrolysiert Der genetische Code -‐
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= Zuordnung von Codons zu einzelnen AS Codons bestehen aus 3 Nucleotiden Beginn der Codierung am 5´-‐Ende mit Start-‐Codon AUG o bestimmt bei Eukaryoten den Einbau von Methionin Ende der Codierung am 3´-‐Ende mit einem der 3 Stopp-‐Codons (UAA, UAG, UGA) bei zusätzlicher oder fehlender Nucleotide verschiebt sich Leseraster → Sequenz ab mutierter Stelle vollständig verändert Nukleotid-‐Austausch o „missense“ → Veränderung der Codonbedeutung o „still“ → keine Veränderung der Codonbedeutung o „nonsense“ → neues Stopp-‐Codon entsteht offene Leserahmen (= open reading frame -‐ ORF) o potentiell codierende Sequenz o mit Start-‐Codon und über weite Strecken kein Stopp-‐Codon 1 Biochemie-Seminar 10
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mit 4 Basen → 43 = 64 verschiedene Tripletts o 3 für Stopp-‐Codon, 61 für proteinogene AS o Stopp-‐Codon TGA bestimmt zusammen mit SECIS (Selenocystein-‐Insertions-‐Sequenz) den Einbau von Selenocystein Degeneriertheit -‐ die meisten AS werden durch mehr als ein Codon codiert -‐ je nach Häufigkeit der AS ein bis 6 Codons o Bsp: Tryptopan, Methionin (2%) → 1 Codon Leucin, Serin, Arginin (9%) → 6 Codons -‐
Codon-‐Familie = die 4 Codons, die unabhängig von ihrer 3. Base die gleiche AS codieren o Codons je nach Organismus unterschiedlich häufig genutzt (codon usage) Universalität -‐ von allen Organismen genutzt (bis auf wenige Abweichungen) -‐ größere Abweichungen bei post-‐translationalen Modifikationen -‐ Code mitochondrialer DNA weicht stärk von nucleärer DNA ab Transfer-RNA (tRNA) -‐
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dient als Adapter zw. Nukleinsäuren und Proteinen spezifische AS an die tRNA mit zum Codon passenden Anticodon gebunden o durch Aminoacyl-‐tRNA-‐Synthetasen Primärstruktur -‐ tRNAs sind L-‐förmig und bestehen aus 74-‐95 z.T. modifizierten Ribonucleotiden o am häufigsten 76 2 Biochemie-Seminar 10
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Sekundärstruktur -‐ immer 4 komplementäre Bereiche mit intramolekularer Basenpaarung o → antiparallel-‐doppelhelicale Stiele und Schleifen → Kleeblatt-‐Struktur -‐ Anticodon-‐Schleife o enthält Anticodon (zum Codon der mRNA passendes Gegenstück) -‐ D-‐ (Dihydrouridin) und ψ -‐ (Pseudouridin) Schleife o enthalten entsprechende Basen -‐ Extra-‐Arm o variabler Arm zw. ψ-‐ und Anticodon-‐Schleife -‐ Akzeptor-‐Arm o präsentiert ein einzelsträngiges CCA-‐3´-‐Ende  daran passende AS kovalent gebunden o endständige Acylrest als A76 bezeichnet Synthese & Modifizierung -‐ humanes Genom > 600 tRNAs → ausreichend für intensive Proteinsynthese -‐ primäre Transkripte durch Nucleasen, basenmodifizierende Enzyme und Transferasen in reife tRNAs -‐ aus Kern nur vollständig modifizierte tRNAs exportiert Anticodon-‐Codon-‐Wechselwirkung -‐ durch H-‐Brücken zw. komplementären Basenpaaren o Sequenz im jeweiligen Triplet dabei antiparallel -‐ es gibt weniger tRNAs als Triplets (61) o → Paarung der 1. Base (5´des Anticodons) mit 3. Base des Codons oft nicht fest und nicht sehr spezifisch! -‐ Wobble-‐Hypothese (Francis Crick, 1966) o beruht auf der nicht sehr spezifischen Paarung (s.o.) o es gibt 64 verschiedene Triplets → davon 3 für Termination → 61 für AS übrig o mehrere Codons für gleiche AS o minimal 31 tRNAs für die Übersetzung der 61 Codons benötigt  (Mitochondrien brauchen nur 22 tRNAs) o alle Anticodon-‐Codon-‐WW gleich stark  insgesamt aber etwas schwächer als bei klassischen Basenpaarung -‐ schwächere WW für Aufrechterhaltung der hohen Geschwindigkeit der Proteinsynthese bedeutsam (schnelles Erkennen von Anticodon & Codon, schnelles Ablösen) Tertiärstruktur -‐ L-‐förmig o ein Stiel druch D-‐ & Anticodonarm (mit Erkennungsstelle für Codon) o anderer Stiel durch Akzeptorarm mit Bindungsstelle für zu übertragende AS -‐ Struktur durch H-‐Brücken und Mg2+ stbilisiert, der Winkel durch Spermin Beladung der tRNA -‐ die 20 proteinogenen AS durch 20 sehr spezifische Aminoacyl-‐tRNA-‐Synthetasen aktiviert o → mit 3´-‐OH-‐Ende der cognaten tRNA verestert -‐ unter ATP-‐Verbrauch o Zunächst muss unter ATP-‐Verbrauch ein Aminoacyl-‐AMP gebildet werden. Hierbei reagiert eine Aminosäure mit ATP, wobei es zu einer energiereichen Säureanhydridbindung zwischen dem α-‐Phosphat des ATP und der Carboxylgruppe der Aminosäure kommt 3 Biochemie-Seminar 10
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Durch die Spaltung des Pyrophosphates wird das Gleichgewicht auf die Seite der energiereichen Säureanhydridbindung verschoben. o nun reagier Aminoacyl-‐AMP mit der cognaten tRNA und es entstehen Aminoacyl-‐
tRNA und AMP. o Die benötigten Enzyme heißen Aminoacyl-‐tRNA-‐Synthetasen. Es gibt sie in zwei Klassen (Klasse I und II) und sie sind fast für jede Aminosäure spezifisch. o Das hohe Gruppenübertragungspotential der Aminoacyl-‐tRNAs mit einem ΔG°‘ von circa 30 kJ/mol wirkt als Triebkraft der späteren Synthese der Peptidbindungen. o siehe Abb. 18.5 Müller-‐Esterl Seite 234 die Synthetasen arbeiten sehr spezifisch und besitzen zur Kontrolle der korrekten Beladung prä-‐ und posttransferale Editierungsfähigkeiten wird eine tRNA mit falschen Aminosäure beladen wird, dann hat dies in den meisten Fällen die Funktionsunfähigkeit des Proteins zur Folge o Die Synthetasen erkennen „ihre“ tRNAs allerdings aufgrund geringer Unterschiede in den jeweiligen Anticodon-‐ und Akzeptor-‐Stielen nahezu fehlerfrei. o Aufgrund der hohen Ähnlichkeit mancher Aminosäureseitenketten reicht diese Genauigkeit allerdings noch nicht aus. o Deswegen verfügen die Synthetasen über Mechanismen, um fremde Aminosäuren nach der Bildung der gemischten Säureanhydridbindung vor oder nach dem Transfer auf die tRNA zu erkennen und zu hydrolysieren. Dies bezeichnet man als prä-‐ und posttransfer Editierung. o Für dieses Verfahren benutzen die Synthetasen ein zweigeteiltes aktives Zentrum. Der eine Teil dient als Aminoacylierungsstelle und der andere als Editierungsstelle. o Die Gesamtfehlerrate liegt hierdurch bei einem Fehler auf ca. 104 bis 105 Reaktionen. bei tieferem Interesse zur Beladung der tRNA bist du herzlich eingeladen, im Löffler ab S. 291 selbst weiter zu lesen... (mir ist´s zu doof!) o
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Ribosomen und Synthese der Peptidbindung -‐
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Ribosomen aus kleine und große ribosomale Untereinheiten (UE) o bestehen aus rRNA und ribosomale Proteine o in Bakterien nur eine UE (70s) während Proteinsynthese bilden die UE Komplexe mit mRNA und tRNA o mRNA in Kanal der kleinen UE o darüber Hohlraum, durch den tRNA wandert → A-‐ (Aminoacyl-‐), P-‐ (Peptidyl-‐) und E-‐ (Exit-‐) Stellen  A-‐Stelle → Bindung der Aminoacyl-‐tRNA während Elongation  P-‐Stelle → Bindung der Peptidyl-‐tRNA (bzw. Methionyl-‐tRNA im Initiationskomplex  E-‐Stelle → Bindung der deacylierten tRNA vor deren Freisetzung Proteinbiosynthese -‐
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für Biosynthese benötigt: o Ribosomen o Aminoacyl-‐tRNAs o GTP und ATP o etwa 30 Proteinfaktoren Proteinbiosynthese in 3 Phasen o 1. Initiation o 2. Elongation o 3. Termination 4 Biochemie-Seminar 10
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Proteinfaktoren in eukaryotische Zellen entsprechend der Phasen abgekürzt o Initiation → eIF o Elongation →eEF o Termination →eTF (auch eRF = releasing factor) Dauer der Biosynthese i.d.R. wenige Minuten o in Bakterien schneller und mit weniger Faktoren 1. Initiation -
Zusammensetzung des Ribosoms aus einer kleinen und einer großen ribosomalen Untereinheit o bestehen aus ribosomaler RNA (rRNA) und ribosomalen Proteinen 1.
Bildung eines ternären Komplexes • eIF-‐2 • GTP • Methionyl-‐tRNA 2.
Bildung des 43S-‐Komplexes • ternäre Komplex • eIF-‐1A und eIF-‐3 • bindet an die kleine 40S-‐UE der Ribosomen 3.
Bindung der Kappe (durch eIF-‐4E) & Poly-‐A-‐Strang (durch eIF-‐4G) der mRNA an eIF-‐3 • Entspiralisierung der untranslatierten 5´-‐Bereichs der mRNA • Anlegen des Einzelstranges in Kanal an Oberfläche der kleinen Ribosomen-‐UE o Durch eIFs und Anticodonschleife der Initiator-‐tRNA gebildet • eIF-‐4A = ATP-‐abhängige Helikase, löst zusammen mit eIF-‐4B Sekundärstrukturen in mRNA auf 4.
Scanning der mRNA • Suche nach Kozak-‐Konsensussequenz (GCCRCCAUGG; R = A oder G) • Methionyl-‐tRNA befindet sich in P-‐Stelle der kleinen UE • Anticodon mit Start-‐Codon (AUG) verbunden 5. Dissoziation der eIFs von der kleinen UE, Anlagerung der großen UE • Methionyl-‐tRNA durch eIF-‐5B•GTP-‐Komplex an P-‐Stelle gebunden -‐
Kappe von mRNA entfernt sich während Elongation immer weiter von Ribosom o wird durch PABP (Poly-‐A-‐binding protein) und eIF-‐4 an Poly-‐A-‐Ende gebunden → entsteht mRNA-‐Ringstruktur → dadurch gelangt Anfang der mRNA immer wieder zum Ribosomen und kann erneut abgelesen werden (Reinitiation) es können im Abstand von 30 Nucleotiden weitere Ribosomen an mRNA binden (= Polysom) o → parallele Fertigung mehrerer Proteine (Steigerung der Translation) Verkürzung des Poly-‐A-‐Endes behindert Initiation und fördert Abbau der mRNA -‐
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2. Elongation -‐
abhängig von Bereitstellung des ternären Elongationskomplex o alle beladene tRNAs und aktiviertem eEF-‐1A•GTP 1.
Bindung einer Aminoacyl-‐tRNA an A-‐Stelle • ternärer Elongationskomplex findet leere A-‐Stelle neben besetzter P-‐Stelle • Auswahl der richtigen Aminoacyl-‐tRNA durch Basenpaarung des Codons mit Anticodon o richtiger Basenpaarung: Bindung durch H-‐Brücken stabil o falscher Basenpaarung: Bindung schwach → tRNA dissoziiert ab 5 Biochemie-Seminar 10
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2.
3.
Bildung einer Peptidbindung • nucleophiler Angriff der α-‐AS der tRNA in A-‐Stelle auf C-‐Atom der Carbonyl-‐
gruppe der tRNA in P-‐Stelle → es entsteht Methionyl-‐Aminoacyl-‐ bzw. Peptid-‐tRNA-‐Produkt • erste AS bzw. Peptid auf zweite bzw. nachfolgende AS in A-‐Stelle übertragen → Peptidyltransferase-‐Reaktion → entsteht Peptidbindung (ohne ATP-‐/GTP-‐Verbrauch) o durch 28S-‐rRNA katalysiert → = Ribozym Translokation • Ribosom bewegt sich um 3 Nucleotide auf mRNA weiter o Hydrolyse von GTP durch eEF-‐2 (Translokase) liefert Energie • deacylierte tRNA wandert aus P-‐ in E-‐Stelle o dissoziiert ins Cytoplasma ab → tRNA-‐Vorrat • Peptid-‐tRNA aus A-‐Stelle wandert in P-‐Stelle o in P-‐Stelle höhere Affinität zu Peptid als in A-‐Stelle • A-‐Stelle wieder frei für neue Aminoacyl-‐tRNA → neuer Zyklus kann beginnen 3. Termination -‐
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wenn eines der 3 Stopp-‐Codons (UAA, UAG, UGA) an A-‐Stelle erreicht → Freisetzung des Peptids und Ablösen von mRNA o eRFs (releasing factors) erkennen Stopp-‐Codon, besetzen A-‐Stelle o eRFs verändern Aktivität der Peptidyltransferase so, dass ein Wassermolekül anstelle einer AS an Peptidyl-‐tRNA angehängt wird o Ablösung der Peptidkette von tRNA → ins Cytoplasma entlassen Zerfall des Ribosoms in seine UE o können gleich wieder an neue mRNA für neue Biosynthese anlagern Suppression -‐ durch „nonsense“ Mutationen können Stopp-‐Codons erzeugen o → Synthese von Proteinen unterbrochen -‐ zusätzlich kann tRNA so verändert sein, dass Stopp-‐Codon als codierend gelesen wird o → ungenügend funktionstüchtiges Protein synthetisiert o tRNA = Suppressor-‐tRNA Hemmstoffe der Proteinbiosynthese -‐
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Antibiotika wirken auf bakterielle Proteinbiosynthese o → große Bedeutung für Therapie bakterieller Infektionskrankheiten Tetracycline o binden kleine UE prokaryotischer Ribosomen → keine Bindung der Aminoacyl-‐tRNA o in hohen Kozentrationen auch eukaryotische Proteinbiosynthese gehemmt Streptomycin (und andere Aminoglycosid-‐Antibiotika) o interkalieren in 16S-‐rRNA der kleinen prokaryotischen UE o → A-‐Stelle modifiziert (WW zw. Codon und Anticodon) o → Ablesefehler bei Elongation Macrolid-‐Antibiotika (Bsp: Erythromycin) o binden 23S-‐rRNA der großen prokaryotischen UE o → Polypeptidtunnel „verstopft“ Chloramphenicol (Breitband-‐Antibiotikum) o konkurriert mit tRNAs um A-‐ und P-‐Stelle 6 Biochemie-Seminar 10
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Fusidinsäure o hemmt Elongationszyklus o verhindert Ablösen des GDP-‐Komplexes (eEF-‐2) von Ribosomen Cycloheximid o hemmt Translokaseaktivität eukaryotischer Ribosomen o experimentelle Nutzung in Studien Puromycin o bindet an A-‐Stelle in pro-‐ und eukaryotischen Ribosomen o übernimmt Peptidylrest von in P-‐Stelle befindlicher Peptidyl-‐tRNA o → vorzeitiger Abbruch Regulation der Proteinbiosynthese -‐
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größte Bedeutung schon in Regulation der Transkription darüber hinaus kann Translation auf Ebene der Initiation reguliert tRNA-‐Beladungszustand -‐
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wenn eine AS fehlt → gesamter Prozess der Proteinbiosynthese kommt zum erliegen wird bereits auf der Stufe der Initiation gestoppt Regulation durch Modifikation von eEF-‐2 -‐ eEF-‐2 (GTP-‐bindende Protein) für Initiation essentiell → bringt Methionyl-‐tRNA an Startposition der mRNA -‐ eEF-‐2 durch eEF-‐2B aktiviert o eEF-‐2 durch Phosphorylierung-‐Dephospharylierung reguliert o phosphoryliert → von eEF-‐2B fest gebunden und aus Reaktionszyklus entfernt o dephosphoryliert → im Reaktionszyklus aktiv -‐ verschiedene Faktoren greifen in Phosphorylierung-‐Dephospharylierung ein -‐ Häm o hemmt eEF-‐2-‐Kinase o → Steigerung der Globinbiosynthes in Retikulozyten -‐ Interferone (Antwort auf virale Infekte) o aktivieren eEF-‐2-‐Kinase o → hemmen Translation in Virus-‐infizierten Zellen -‐ bei Stress (Bsp: Hitzeschock) oder Mangel an Wachstumsfaktoren und AS → Proteinsynthese durch Phosphorylierung von eEF-‐2 gehemmt (Rückkopplung) 7 Biochemie-Seminar 10
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Zielsteuerung der Proteine Chaperone und ihre Funktion -‐
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wenn neusynthetisierte Polypeptidkette eine Länge von ungefähr 40 Aminosäuren erreicht, verlässt sie den „Tunnel“ der großen ribosomalen Untereinheit und beginnt sich zu falten Während Faltungsprozesses viele thermodynamisch mögliche Bindungen ausgetestet (nicht-‐ionische, ionische, van-‐der-‐Waals und auch covalente intramolekulare Bindungen) kann zu „Fallen“ kommen → = Verbindung, die zwar thermodynamisch günstig ist und hohe Aktivierungsenergie besitzt, aber nicht die native Struktur des Proteins darstellt. deshalb besitzt die Zelle „Hilfssysteme“ o überwachen korrekte Faltung der Proteine o ¼ der Proteine aufgrund einer Fehlfaltung aussortiert Zu diesen Hilfssystem gehören: o Hitzeschock-‐Proteine (auch molekulare Chaperone genannt)  erhöhte Umgebungstemperatur stört die richtige Faltung der Proteine, so dass vermehrt Hitzeschock-‐Proteine exprimiert werden  folgende Funktionen werden ihnen zugeordnet: • Faltungshilfe • Reparaturinstrument • Assistenz bei der Bildung von Proteinkomplexen • Hilfe beim Proteintransfer zwischen Kompartimenten • Unterstützung beim Proteinabbau  ubiquitäres Vorkommen, können kooperieren oder hintereinander arbeiten  mehrere Gruppen von Hitzeschock-‐Proteinen unterschieden: • Hitzeschockprotein 40 o HDJ1-‐ und HDJ2-‐Chaperone o verhindert die Aggregation von hydrophoben Bereichen eines Proteins o Zu dieser Gruppe gehört ebenfalls das Mpp11 Protein. Dieses ist mit dem Rand des ribosomalen Tunnels assoziiert und fängt unter Mitwirkung mehrerer Protein als Ribosom-‐assoziierter Komplex unreife Proteine ab. • HSC 70 (heat shock cognate) o ATP-‐abhängig • Hitzeschock-‐Proteine 90 o ATP-‐abhängig • Hitzeschock-‐Proteine 60 o ATP-‐abhängig • außerdem weitere kleine Familie o Chaperonine  = multimere Faltungskatalysatoren.  ringförmig Untereinheiten bilden kleinere Reaktionskammern  wenn fehlgefaltetes Proteine in Reaktionskammer eingeschlossen wurde → ATP-‐abhängigen Verzerrung → führt dazu, dass sich das Protein neu faltet  hierdurch Proteinen aus ihren „thermodynamischen Fallen“ befreit 8 Biochemie-Seminar 10
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Peptidyl-‐Prolyl-‐cis-‐trans-‐Isomerasen (PPIasen)  Vorkommen ebenfalls ubiquitär  meisten Peptidbindungen zu 100% in gestreckten (trans)-‐Konformation • Ausnahme bilden die Peptidyl-‐Prolyl-‐Peptidbindungen, die zu circa 10% in der cis-‐Konformation vorliegen  PPIasen sind nun in der Lage diese Konformation umzuwandeln, d.h. dass sie trans-‐Bindungen in die seltenen cis-‐Bindungen überführen • Prozess ist reversibel und ermöglicht dem Protein „komplexere“ Faltungen zu vollziehen  spielen sie eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion  Stoffe, die diese Isomerasen hemmen, als Immunsuppressiva eingesetzt Allgemeines Prinzip und Sinn der Zielsteuerung -‐
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Proteine müssen während (cotranslational) und nach der Translation (posttranslational) sortiert bzw. gekennzeichnet werden, damit sie ihren richtigen Bestimmungsort erreichen können. Die Translation beginnt immer an einem freien Ribosom. Im nächsten Schritt kann sich dieses Ribosom entweder an das ER ankoppeln und die weitere Synthese erfolgt in das ER oder das naszierende Protein wird ins Cytoplasma synthetisiert. o Das Protein, welches ins ER synthetisiert wurde, kann nun entweder im ER zurückgehalten oder an den Golgi-‐Apparat verschickt werden. Letztendlich gelangt es dann zu Lysosomen, zu der Plasmamembran oder wird für Sekrektionszwecke verwendet. o Das Protein, welche ins Cytoplasma synthetisiert wurde, kann entweder in den Zellkern, in die Peroxisomen oder in die Mitochondrien gelangen. Entscheidend für die weitere Prozessierung ist eine Signalsequenz. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass ca. 20% der proteincodierenden Gene des humanen Genoms die Information für eine Signalsequenz tragen. Sinn der Zielsteuerung muss es nun sein, die einzelnen Proteine den richtigen „Empfängern“ zuzuordnen. Es wäre schließlich nachteilig, wenn eine lang ersehnte Bestellung beim ungeliebten Nachbarn landet, weil der Postbote keine eindeutige Kennzeichnung erkennen konnte. Cotranslationaler Transport in endosplasmatische Reticulum -
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der Transport erfolgt in das rER parallel zur Synthese o Vorgang verläuft vermutlich ohne zusätzlichen ATP-‐Verbrauch Proteine, die diesen Weg wählen, besitzen eine besondere Erkennungssequenz, o aus etwa 20 Aminosäureresten besteht, die überwiegend hydrophob sind o befindet sich nahe des N-‐Terminus o nach Verlassen der großen ribosomalen Untereinheit von einem Ribonucleoprotein-‐
partikel (SRP = signal recognition paritcle) erkannt und gebunden SRP bindet die Signalsequenz und das Ribosom Bindung mit Ribosom nahe der Austrittstelle des Polypeptidkanals und an Eintrittsstelle der tRNA o hierdurch zunächst Translationsstopp nun bindet SRP an den zugehörigen SRP-‐Rezeptor auf der cytosolischen Seite des rER nach Bindung fungiert SRP als Guaninnucleotidaustauschfaktor o → der Austausch von GDP zu GTP am Rezeptor gefördert wird SRP durch SRP-‐Rezeptor so verändert, dass SRP das Signalpeptid freigibt und in einen Translokator einfädelt o nach kurzer Zeitverzögerung erfolgt Hydrolyse von GTP
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SRP löst sich vom SRP-‐Rezeptor ab und steht erneut zu Verfügung o gleichzeitig löst sich der Translationsstopp weitere Synthese in das Lumen des rER o eine Signalpeptidase schneidet die Signalsequenz am N-‐Terminus noch während der weiteren Translation ab o Translokationsvorgang ist nun irreversibel Translokation durch das ATP-‐spaltende Protein „Bindungsprotein“ (BIP) gefördert o → zieht die Polypeptidkette aktiv ins Lumen o außerdem Hydrolyse an GTP am SRP-‐Rezeptor die Translokation beschleunigt das Translocon besteht aus drei Untereinheiten und bildet einen Kanal durch die Membran, der einen Innendurchmesser von bis zu 15Å aufweist Proteine, welche eine Signalsequenz tragen, werden als Präproteine und, wenn eine weitere proteolytische Reifung notwendig ist, als Präproproteine bezeichnet. siehe Abb. 9.20 im Löffler Seite 304 bzw. Abb. 19.11 im Müller-‐Esterl Seite 252 Proteintransport ins Mitochondrium -
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Besonderheit: mitochondriale DNA codiert für 13 eigene Proteine, restlichen Proteine werden über nucleäre DNA codiert zu importierenden Proteine von Chaperonen zu den Mitochondrien transportiert o verhindern während Transport, dass Protein seine endgültige Faltung einnimmt, da das Protein sonst die Translokation nicht mehr vollziehen kann Translokationssignal liegt in einer N-‐terminalen Sequenz Transport durch die Membranen des Mitochondriums wird durch TOM und TIM (transport complex of the outer bzw. inner membrane) sichergestellt o Proteine meistens erst in den Matrixraum importiert und von da aus zurück in den intramembranären Raum o Vorgang durch elektrochemischen Gradienten über inneren Membran und ATP-‐
Hydrolyse der mitochondrialen HSP70-‐Chaperone im Matrixraum wird Signalsequenz entfernt o durch mitochondriale prozessierende Metalloproteinase MPP o Faltung durch Chaperone (Hsp10 und Hsp60) Proteine, die in den Intramembranraum gelangen sollen, besitzen am C-‐Terminus eine weitere hydrophobe Signalsequenz, die nach Abspaltung der mitochondrialen Importsequenz sichtbar wird o zurück zur inneren Membran geleitet o fädeln sich durch innere Membran o hydrophobe Zielsequenz bleibt in Membran verankert und Polypeptidkette zeigt in den intramembranären Raum Signalpeptidase schneidet die hydrophobe Zielsequenz ab o Vorgang irreversibel. peroxisomale Transportsignale (PTS) -
peroxisomales Transportsignal 1 (PTS1) ist C-‐terminal lokalisiert o besteht aus drei Aminosäuren: Serinyl-‐Lysyl-‐Leucin PTS2 hingegen ist N-‐terminal lokalisiert o enthält eine basisch-‐amphipatische Aminosäuresequenz. cytosolischen Rezeptorproteine Pex5p und Pex7p binden an die PTS-‐Signale und vermitteln den Transport über den PEX-‐Importkomplex insgesamt 32 am Import und Einbau in Membran beteiligte Proteine bekannt (sog. Peroxine) Membran verfügt über weitere Transportsysteme, z.B. Transport von langkettigen FS 10 Biochemie-Seminar 10
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Proteintransport in den Zellkern -
Durchtritt von Proteinen aus Zytosol in den Nucleus ist stark reglementiert kleine unpolare Moleküle sind jedoch können direkt durch die Membran treten o anderen Stoffe über die Kernpore Kernporenkomplex (NPC) besteht aus 2 großen Makromolekülen mit 2 Ringen von Proteinen, die in die äußere und innere Kernmembran eingelassen sind o Ringe sind untereinander verbunden und hierdurch verstärkt o Kernporenkomplexe hat Zentralkanal → durch Transporter „verstöpselt“ o Für den genauen Aufbau siehe Abb. 19.8 im Müller-‐Esterl Seite 250. -
kleine Proteine bis 60kD können passiv durchdringen große Proteine müssen aktiv durch den Zentralkanal transportiert werden -
Translokationssignal sind sog. nucleäre Lokalisationssequenzen Rezeptor Importin (Heterodimer aus α-‐ und β-‐Untereinheiten) erkennt die für den Kern bestimmten Proteine o α-‐Untereinheit bindet das NLS-‐Motiv o β-‐Untereinheit ermöglicht die Translokation durch die Kernpore Im Kern laufen folgende Schritte ab: o Das monomere G-‐Protein Ran bindet in seiner GTP-‐gebundenen Form an β-‐Importin. o Das Kernprotein und α-‐Importin lösen sich ab und β-‐Importin wird durch Ran in Cytosol zurückgeführt. o Durch die Interaktion mit dem cytoplasmatischen GTPase-‐aktivierenden Protein Ran-‐
GAP, dissoziiert Ran ab und β-‐Importin steht wieder zur Verfügung. o Ran-‐GDP (jetzt mit GDP assoziiert) wird im Kern durch den Nucleotidaustauschfaktor Ran-‐GEF wieder in Ran-‐GTP umgewandelt. Der Kernporenkomplex ist ebenfalls eine Austrittspforte. Dies wird durch das Protein Exportin gewährleistet, welches ebenfalls mit Ran interagiert. -
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Proteineinbau in Membranen -
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Membranständige Proteine nicht vollends ins Lumen des ER translatiert, sondern ein Teil verbleibt immer in der Membran des ER o über 20 bis 30 hydrophobe Aminosäurereste, meist in Form einer α-‐Helix wenn neben N-‐terminalen hydrophoben Signalsequenz eine weitere hydrophobe Sequenz → sog. Stopp-‐Transfersequenz o → Translokationskanal geschlossen und Stopp-‐Sequenz lateral verschoben o weitere Proteinsynthese nicht mehr ins Lumen des ER, sondern ins Zytosol bis ein Stopp-‐Codon erreicht ist o → Polypeptid verfügt somit über ein cytosolisches, ein membranständiges und ein luminales Segment 11 Biochemie-Seminar 10
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einige Proteine haben keine N-‐terminale Signalsequenz, aber eine Stopp-‐Transfersequenz Synthese erfolgt bis diese Sequenz am Translokator auftaucht o zwei Optionen:  N-‐Terminus bleibt im Zytoplasma und C-‐Terminus ins Lumen des ER synthetisiert → Orientierung wäre dann C  N  C-‐Terminus bleibt im Zytoplasma und N-‐Terminus ins Lumen des ER synthetisiert → Orientierung wäre dann N  C Membrananker -
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Lipidanker o Proteine können über Lipidanker in Membranen verankert werden  Myristoylanker • N-‐terminale Sequenz, die benötigt wird: Met-‐Gly-‐Xaa-‐Xaa-‐Xaa-‐
Ser/thr-‐Lys-‐Lys (Xaa: beliebige AS)  Prenylanker • Proteine enden auf das Tetrapeptid Cys-‐Aaa-‐Aaa-‐Xaa (Aaa: AS mit aliphatischer Seitenkette)  Palmitoylanker • Signal hierfür nicht bekannt, da die Sequenz möglicherweise nicht linear, sondern diskontinuierlich ist Glykolipidanker o Proteine müssen zunächst in das ER eingeschleust werden  Protein durch Stopp-‐Transfersequenz vorläufig in der Membran befestigt → N-‐Terminus im ER und C-‐Terminus in Membran o anschließend wird Protein über ein Enzym kovalent mit dem Glykolipid Glykosylphosphatidylinositol (GPI) über seine Ethanolamingruppe verknüpft  → Stopp-‐Transfersequenz abgetrennt und in Membran abgebaut  → Protein ist jetzt über einen GPI-‐Anker verknüpft o GPI-‐verankerte Protein meist zur Plasmamembran weitergeleitet → auf Zelloberfläche exponiert o Zur weiteren Faltung des Proteins etc. siehe Abb. 19.16 Müller-‐Esterl Seite 255 Glykosylierungsarten -
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zwei Arten: o N-‐Glykosylierung (an Asparagin) o O-‐Glykosylierung (an Threonin bzw. Serin) im ER wird die Grundvoraussetzung für die N-‐Glykosylierung getroffen, im Golgi-‐Apparat erfolgt die Komplettierung o 1. Schritt: auf lipophilen Träger (Dolicholphosphat) wird Oligosaccharidseitenkette aus 3 verschiedenen Bausteinen aufgebaut (Mannose, Glucose, N-‐Acetylglucosamin)  beginnt auf cytoplasmatischen Seite des ER  Konstruktüber Flippasen gedreht und der luminalen Seite zugewandt  Entsteht ein verzweigtest Gerüst von 14 Kohlenhydratresten • aus 2 N-‐Acetyl-‐glucosamin-‐, 9 Mannose-‐ und 3 Glucoseresten  siehe Abb. 19.18 Müller-‐Esterl Seite 256 o
2. Schritt: Oligosaccharidseitenkette auf die Polypeptidkette übertragen  Oligosaccharidtransferase überträgt Oligosaccharidstruktur vom Dolicholphosphat auf einen Asparaginrest  die 5 Reste (zwei N-‐Acetylglucosamine und drei Mannosen) stellen den Kern (=core) dar → durch weitere Modifikationen nicht mehr verändert! 12 Biochemie-Seminar 10
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core-‐Glycosylierung nur im Lumen des ER • → cytoplasmatische Proteine weisen keine Asparagin-‐verknüpfte Kohlenhydratreste im ER abschließend 3 terminale Glucosereste und 1 Mannoserest entfernt Protein in Vesikel verpackt und an cis-‐Seite des Golgi-‐Apparates geschickt o
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3. Schritt: weitere Prozessierung im ER  im medialen Golgisegment N-‐Acetylglucosaminrest angefügt und weitere 2 Mannosereste entfernt  nacheinander zwei N-‐Acetylglucosaminreste und ein Fucoserest angefügt  im trans-‐Golgi Bereich kommen 3 Galactosereste hinzu  entstehen drei Endstücke, auf die je ein negativ geladener Sialinsäurerest (NANA = N-‐Acetylneuraminsäure) übertragen wird  Endstücke variieren nun je nach Protein und Enzymausstattung  notwendigen Enzyme sind Glykosidasen und Glykosyltransferasen Entstehung der O-‐Glykosylierung o im Golgi-‐Apparat o kurze Ketten aus zwei bis drei Resten werden sukzessive übertragen o Hauptkomponenten sind: N-‐Acetylgalactosamin, Galactose, Sialinsäure und Fucose o typisch für sekretorische Proteine bzw. Plasmamembranproteine  z.B. Blutgruppe eines Menschen determiniert Funktion: o Proteine, wie zum Beispiel das Kollagen, werden durch die polaren und ionischen Gruppen hydrophiler o in Lysosomen schützen die Oligosaccharidketten vor Zerstörung o und weitere 13 Biochemie-Seminar 10
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Zielsteuerung lysosomaler Proteine -
erhalten Sortierungssignal im cis-‐Golgi Bereich o lysosomale Proteine haben hierfür ein Signalepitop, das die Phosphorylierung von Mannoseresten der Oligosaccharidstruktur anweist 1. Schritt: Eine Phosphotransferase decodiert das Signal und überträgt ein Molekül N-‐Acetyl-‐
glucosaminphosphat auf die 6-‐Hydroxylgruppe eines Mannoserestes 2. Schritt: Eine Phosphoglycosidase spaltet sekundär N-‐Acetylglucosamin ab und legt hiermit den Mannose-‐6-‐Phosphatrest frei 3. Schritt: Diese Reaktionsfolge kann erneut stattfinden. -
Mannose-‐6-‐Phosphat → schützt Kette vor Abbau → entscheiden für Transport ins Lysosom -
Klinik: I-‐Zell-‐Erkrankung o Mutation im N-‐Acetylglucosamin-‐Phosphotransferase-‐Gen → Markierung von lysosomalen Enzymen mit Mannose-‐6-‐Phosphat verhindert o wichtige Enzyme (z.B. Hydrolasen) gelangen nicht mehr an ihren Bestimmungsort o infolgedessen akkumulieren Glucosaminoglykane und Glykolipide in den Lysosomen → wegen ihrer Größe und Dichte als Einschlusskörperchen bezeichnet o Enzyme, die für Lysosome bestimmt sind, können nun mittels konstitutiver Sekrektion in Blut und Urin gelangen (ihr Spiegel zur Diagnostik genutzt) o Vererbung ist autosomal-‐rezessiv. -
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Vesikulärer Transport von lysosomalen Proteinen -
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Der vesikuläre Transport wird in vier Teilprozesse unterteilt: o 1. Verpackung von Inhaltsstoffen  im trans-‐Golgi-‐Netzwerk werden Proteine mit Mannose-‐6-‐Phosphat-‐
Markierung gesammelt bis ihre Anzahl ausreichend ist o 2. Abschnürung aus der Donormembran  Wenn genug Proteine vorhanden und somit genug Rezeptoren beladen sind → auf cytosolischen Seite des trans-‐Golgi über Adapterproteinkomplexe (Adaptine) ein Kranz von Clathrinmolekülen rekrutiert  Clathrin formieren sich zu Netzwerk, dass Membran einstülpt → Vesikelknospung • Protein Dynamin (ATPase) löst das Vesikel aus Membranverbund  kurz nach Ablösen löst sich Clathrinmantel ab → Vesikel wandert zum späten Endosom. o 3. Verschmelzung mit der Akzeptormembran o 4. Entladung der Inhaltsstoffe  ATP-‐getriebene Protonenpumpe pumpt Protonen in das Lysosom → senkt pH-‐Wert auf 6,0 ab → Proteine dissoziieren vom Mannose-‐6-‐Rezeptor ab  endosomale Phosphatase spaltet Mannose-‐6-‐Phosphatrest ab → Prozess irreversibel  entladene Rezeptoren kehren daraufhin zum trans-‐Golgi-‐Netzwerk zurück. siehe Abb. 19.26 und Abb. 19.27 Müller-‐Esterl Seite 262 14 Biochemie-Seminar 10
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Allgemeine Mechanismen des vesikulären Transportes -
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neben dem Clathrin-‐vermittelten Transport gibt es noch weitere Mechanismen ER und Golgi-‐Apparat über das sog. COP-‐Gerüstprotein (coat protein) o Hier werden zwei Systeme unterschieden:  COP I: Golgi → ER  COP II: ER →Golgi funktioniert ähnlich dem Clathrin-‐Modell COP-‐I-‐System arbeitet mit G-‐Protein Arf (ADP-‐ribosylierender Faktor) zusammen o Arf wechselt zwischen GTP-‐ (aktiv) und GDP-‐gebundenen (inaktiv) Zustand Spross-‐bereite Membran verfügt über Guaninnucleotidaustauschfaktor (GEF) → inaktive Arf-‐GDP in das aktive Arf-‐GTP überführt Arf-‐GTP bindet an Donormembran o → rekrutiert Netzwerk aus COP-‐I-‐Proteinen o → Ventrikelsprossung eingeleitet an Akzeptormembran ist GTPase-‐aktivierendes-‐Protein (GAP) o Arf-‐GTP in Arf-‐GDP umgewandelt → COP-‐I fällt ab o → Membran zum Andocken freigegeben Für die korrekte Adressierung stehen weitere kleine G-‐Proteine zur Verfügung: o Rab – benötigt Rab-‐Effektoren an der Akzeptormembran o v-‐SNARE (vesikulär) und t-‐SNARE (target membrane) müssen gemäß Schlüssel-‐
Schloß-‐Prinzip passen siehe Abb.19.28 und Abb. 19.29 Müller-‐Esterl Seiten 263 und 264 Stabilität von Proteinen (N-End-Regel) -
Halbwertszeit der Proteine durch Struktur des N-‐Terminus bestimmt o enger Zusammenhang zwischen Funktion und Halbwertszeit der Proteine Anheftung von Arginin an N-‐Terminus (bei posttranslationalen Elongation) verkürzt HWZ Anheftung von Methionin an N-‐Terminus verlängert HWZ (seltenes Beispiel für eine posttranslationale Elongation ohne mRNA-‐Matrize) siehe Abb. 19.33 und Abb. 19.34 Müller-‐Esterl Seite 267 Abbau von Proteinen: Ubiquitinierung -
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alte und fehlgefaltete Proteine werden markiert und somit ihrem Abbau zugeführt Markierung erfolgt durch Ubiquitin, ein kleines Protein, welches aus 76 Aminosäuren Vorgang erfordert drei enzymatische Reaktionen: o E1: Ubiquitinaktivierung o E2: Ubiquitinkonjugation o E3: Ubiquitinligase Im Ergebnis wird eine Isopeptidbindung zwischen einem Lysylrest des abzubauenden Proteins und dem Ubiquitin hergestellt. Diese seltene posttranslationale Verlängerung eines Proteins führt zu einem Polyprotein. Das so entstandene polyubiquitinierte, cytoplasmatische Protein wird nun im Proteasom abgebaut (ca. 30.000 Proteasome / Zelle). Die proteolytischen Zentren sind sind hermetisch gegen das Cytosol abgeschirmt und das Zugang wird beiderseits über haubenförmige Proteinpartikel kontrolliert. Ubiquitin wird dann recycelt siehe Abb. 19.32 Müller-‐Esterl Seite 266 15 Biochemie-Seminar 10
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Antibiotika: Wirkungsweise und Resistenzmechanismen Definition -‐
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Antibiotika o dienen der Bekämpfung bakterieller Infektionen und sollen selektiv nur die Bakterien schädigen o Stoffe natürlichen Ursprungs, die entweder von Pilzen oder Bakterien produziert werden. Chemotherapeutika o künstlich hergestellte Substanzen, die ebenfalls gegen Bakterien gerichtet sind o Im üblichen klinischen Sprachgebrauch meint man mit Chemotherapeutika eher Zytostatika, die zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden. bakterizid und bakteriostatisch -‐
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Bakteriostatikum o eine Substanz, die Bakterien in ihrer Vermehrung hemmt o die Wirkung erfolgt durch Beeinflussung von Replikations-‐, Translationsfaktoren und von Parametern der Stoffwechselwege Bakterizid o eine Substanz, die Bakterien abtötet o per definitionem müssen 99% der Bakterien in den ersten 4 Stunden abgetötet werden  Bakteriolytikum ist ein Medikament, welches die Zellen durch Zerstörung der Zellmembran abtötet (z.B. hemmt Penicillin die Membransynthese und wirkt somit bakteriolytisch) Beachte: Bakteriostatika in einer hohen Dosis können bakterizid und Bakterizide in einer niedrigen Dosis bakteriostatisch wirken. Wirkungsweise von Antibiotika -
Membransynthese o Penicillin [entdeckt 1928 von Alexander Fleming]  hemmt die Biosynthese der bakteriellen Zellwand. Diese wird auch als Murein bezeichnet und stellt ein Netz-‐ bis käfigartiges Makromolekül mit Glycopeptidstruktur dar.  Penicillin hemmt nun das Enzym Glycopeptid-‐Transpeptidase, welches einen für die Reaktion essentiellen Serylrest besitzt. Dieses Enzym ist entscheidend für die Ausbildung von Quervernetzungen zwischen den Zuckerketten im Murein. (genauer Mechanismus siehe Löffler, Seite 550)  Der für Penicillin charakteristische β-‐Lactamring ähnelt in seiner Raumstruktur der terminalen D-‐Ala-‐D-‐Ala-‐Einheit, an die die Glycopeptid-‐
Transpeptidase normalerweise bindet. Somit reagiert die sehr reaktive OH-‐
Gruppe des Enzyms mit dem β-‐Lactamring und es entsteht ein Penicilloyl-‐
Enzym-‐Komplex. Die ursprüngliche Glycopeptid-‐Transpeptidase ist hierdurch irreversibel inaktiviert. o Cephalosporine  gleiches Wirkprinzip wie Penicillin, allerdings andere molekulare Struktur. -
Nukleotid-‐Biosynthese [= Folsäure-‐Antagonisten] o hemmen selektiv Bakterien weil diese Folsäure nur synthetisieren, aber nicht aufnehmen können [beim Menschen umgekehrt] 16 Biochemie-Seminar 10
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Sulfonamide  hemmen kompetetiv den Einbau von 4-‐Aminobenzoesäure in Pteroinsäure. [Hemmstoff der Pteridin-‐Synthetase]; Folsäure besteht aus Pteroinsäure und Glutamat (Glutaminsäure)  selten eingesetzt, da es besser verträgliche Substanzen gibt, deren Resistenzlage deutlich günstiger ist; strenggenommen ein Chemotherapeutikum, kein Antibiotikum Trimethoprim  Hemmstoff der bakteriellen Dehydrofolat-‐Reduktase, die 7,8-‐Dihydrofolat in 5,6,7,8-‐Tetrahydrofolat umwandelt  ebenfalls selten eingesetzt, Gründe siehe Sulfonamide -
Transkription o Actinomycin D  bildet einen Komplex mit den Guaninresten der DNA  schiebt sich wie ein interkalierender [=Einlagerung von Molekülen oder Ionen in eine chemische Verbindung] Farbstoff zwischen GC-‐Paare doppelsträngiger DNA → verhindert so die Bildung von RNA; in hohen Konzentrationen wird auch die DNA-‐Replikation gestört.  Anwendungsgebiete: Tumortherapie, experimentelle Fragestellungen. o Gyrase-‐Hemmer  Gyrase ist ein Enzym [Sonderfall der Topoisomerase II] – kann bei Prokaryoten unter ATP-‐Verbrauch negative Superhelices in ringförmige DNA-‐
Moleküle einzubauen → Voraussetzung für die Replikation und Transkription [Ursache hierfür ist möglicherweise die erleichterte Strangtrennung]  Gyrasehemmstoffe sind einfache Verbindungen, die von der 4-‐Oxo-‐chinolin-‐
3-‐carbonsäure abstammen; behindern die Replikation und die Transkription  Anwendungsgebiet: bakterielle Infekten o Rifampicin  hemmt selektiv die RNA-‐Polymerase von Prokaryoten, indem es an die β-‐
Untereinheit bindet; nur wirksam bei Prokaryoten, das entsprechende Enzym bei Eukaryoten bleibt unbeeinflusst.  Anwendungsgebiet: Therapie von Tuberkulose und Lepra  leichte Ausbildung von Resistenzen! -
Translation o Angriff an die 30S-‐Untereinheiten der bakteriellen Ribosomen:  Tetrazykline  Aminoglykoside  [Herkunft dieser Antibiotika wird unterschieden je nachdem, von welcher Bakterienart sie gebildet werden: • Streptomyces: erhalten ein „y“ am Ende (z.B. Streptomycin) • Micromonospora: erhalten ein „i“ am Ende (z.B. Gentamicin)] o Angriff an die 50S-‐Untereinheiten der bakteriellen Ribosomen:  Makrolide  Chloramphenicol o
Tetrazykline  binden die kleine Untereinheit (30S) von prokaryoten Ribosomen → verhindern die Bindung der Aminoacyl-‐tRNA an die mRNA  in hohen Konzentrationen wird auch eukaryote Proteinbiosynthese blockiert 17 Biochemie-Seminar 10
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Aminoglycosid-‐Antibiotika (z.B. Streptomycin)  interkalieren in die 16S rRNA der prokaryoten kleinen ribosomalen Untereinheit → A-‐Halbstelle wird modifiziert und die Wechselwirkung zwischen Codon und Anticodon verhindert → Fehler bei der Elongation Makrolid-‐Antibiotika (Erythromycin)  binden die 23S rRNA der großen ribosomalen Untereinheit der Prokaryoten → verstopfen den Proteintunnel. Chloramphenicol  konkurriert mit den tRNAs um die A-‐ und P-‐Stellen im Bereich des Peptidyltransferase-‐Zentrums prokaryoter Ribosomen Fusidinsäure  hemmt den Elongationszyklus. Die Manipulation erfolgt nach der Hydrolyse von GTP und der Translokation der Peptidyl-‐tRNA. Es wird hierdurch verhindert, dass sich der GDP-‐Komplex des eEF-‐2 von den Ribosomen ablöst. Cycloheximid  hemmt die Translokaseaktivität von Eukaryoten und wird nur experimentell angewendet. Puromycin  wirkt sowohl bei pro-‐ als auch bei eukaryoten Ribosomen. Es bindet an die A-‐
Stelle des Ribosoms. Durch die strukturelle Ähnlichkeit zum Aminoacyl-‐Ende der Aminoacyl-‐tRNA kann es den Peptidylrest von der in der P-‐Stelle befindlichen Peptydil-‐tRNA übernehmen. → Abbruch der Proteinbiosynthese. Replikation o Gyrase-‐Hemmer  siehe „Transkription“ o Mitomycin  verursacht die Bildung von covalenten Quervernetzungen zwischen den komplementären DNA-‐Strängen → verhindert die Trennung und unterbindet somit die Replikation  bei Mikroorganismen und auch bei Eukaryoten wirksam → Bedeutung nur in der Tumortherapie Resistenzmechanismen -
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natürliche Resistenzen o Antibiotika sind spezifisch gegen eine oder mehrere Zielstrukturen gerichtet → wirken gegen bestimmtes Spektrum an Erregern o Beispiel Penicillin:  inhibiert die Zellwandsynthese von Gram-‐positiven Bakterien  kann nicht gegen die zellwandlosen Mycoplasmen eingesetzt werden  völlig unwirksam gegen Bakterin, die β-‐Lactamase-‐Gene besitzen [z.B. Pseudomonas aeruginosa] o Wirkmechanismus muss also immer speziell auf die Art der Bakterien abgestimmt sein, sonst haben sie einen natürlichen Schutz erworbene Resistenzen o Bakterien können durch Mutationen oder Austausch von DNA (Plasmide) resistent gegen bestimmte Antibiotika werden → können sich somit aktiv anpassen o bei den Plasmid-‐codierten Resistenzgenen handelt es sich meist um Proteine, welche das Antibiotikum angreifen und dadurch inaktivieren; sie können aber auch „nur“ die Aufnahme verhindern 18 Biochemie-Seminar 10
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unterschieden werden drei grundsätzliche Resistenzmechanismen:  Inaktivierung des Antibiotikums durch z.B. Hydrolyse, Phosphat-‐Transfer, Acetylierung etc.  Veränderung der Zielstruktur: zum Beispiel können Punktmutationen in Untereinheiten von Ribosomen dazu führen, dass ein Antibiotikum, welches normalerweise die Translation inhibiert, nicht mehr suffizient an das bakterielle Ribosom binden kann  verstärkter Abbau, erhöhter Export oder verminderte Aufnahme des Antibiotikums ist ein weiterer Mechanismus. Dies erfolgt z.B. über Kapselbildung oder Schleimhüllen. Antibiotikum (AB) Aminoglycoside (Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin) Beispiel Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin Wirkort Ribosom β-‐Lactam-‐Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine) Penicilline, Cephalosporine Zellwand Chloramphenicol Chloramphenicol Ribosom Gyrase-‐Hemmer (Norfloxacin, Ciprofloxacin) Tetracycline (Minocyclin, Doxycyclin) Trimethoprim, Sulfonamide (Sulfadiazin, Sulfalen) Norfloxacin, Ciprofloxacin DNA-‐Gyrasen Minocyclin, Doxycyclin Ribosom Sulfadiazin, Sulfalen Folat-‐Synthese Resistenzmechanismus Ribosom bindet das AB nicht mehr, die Zellen sind für das AB nicht mehr permeabel oder Synthese von Enzymen, die das AB inaktivieren. Penicillin-‐Bindeprotein mutiert, die Zellen sind für das AB nicht mehr permeabel oder Bakterien synthetisieren β-‐Lactamasen. Ribosom bindet das AB nicht mehr, die Zellen sind für das AB nicht mehr permeabel oder Bakterien synthetisieren Chloramphenicol-‐
Acetyltransferasen. Resistenz der DNA-‐Gyrase oder aktives Ausschleusen des AB. Ribosomen-‐Resistenz oder Synthese von aktiven Efflux-‐
Pumpen. Dihydrofolat-‐Reduktase-‐Resistenz oder Zellen sind für das AB nicht mehr permeabel. Quelle: http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/biotoxine/antibiotika.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/biotoxine/ab_resistenz3.vscml.html … weitere wissenswerte Informationen über Antibiotika1 Tetracycline: Aus dieser Gruppe wird nur noch Doxycyclin eingesetzt, wegen der Resistenzsituation gegenüber den meisten typischen Erregern jedoch nicht mehr als Initialtherapie. Empfehlenswert aber bei den sogenannten atypischen Erregern wie Chlamydien, Mycoplasmen, Rickettsien und Borrelien (Lyme Borreliose im Frühstadium). Makrolide: Makrolide sind mit ihrem günstigen Wirkspektrum bei gleichzeitug sehr guter Verträglichkeit vor allem für Kinder reserviert. Vom breiten Einsatz auch im Erwachsenen-‐Bereich ist wegen der alarmierend steigenden Zahl Makrolid-‐resistenter Stämme eher zu warnen. Makrolide sollten für pädiatrische Fälle vorbehalten werden, denn bei Kindern sind nur wenige therapeutische Alternativen verfügbar! Penicilline: Nach wie vor ist Pen V gut wirksam bei der Tonsillitis/Pharyngitis, egal ob beim Kind, Jugendlichen oder Erwachsenen. 1
http://www.dieterhassler.de/index.php?id=81
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Cephalosporine: Hier ist die unterschiedliche Wirksamkeit zu bedenken. Die alten Cephalosporine (Gruppe 1, z.B. Panoral®) haben eine gute Wirksamkeit im grampositiven Bereich, wirken jedoch nicht bei gramnegativen Erregern wie z.B. Haemophilus, Moraxella oder E. coli. Einige Cephalosporine der Gruppe 3 (z. B. Keimax®) sind nicht sicher wirksam im grampositiven Bereich, z.B. gegen Pneumokokken, dafür aber stärker im gramnegativen Bereich. Atypische Erreger werden von keinem Cephalosporin erfasst. Zu empfehlen bei Atem-‐ und Harnwegsinfektionen im pädiatrischen Bereich sowie bei Haut-‐ und Weichteilinfektionen. Auch die Otitis media ist eine Einsatzindikation. Ketolide: Bisher ist nur Telithromycin (Ketek®) auf dem Markt. Die Gruppe erfasst die relevanten Erreger bei Atemwegsinfektionen (Sinusitis, Otitis, Bronchitis, Pneumonie) einschließlich der atypischen Erreger wie Chlamydien, Mycoplasmen und Legionellen. Es ist auch bei makrolidresistenten Keimen in der Regel noch wirksam. Co-‐trimoxazol: Noch gute Wirksamkeit im gramnegativen Bereich, daher bei unkomplizierten Harnwegsinfektionen gut geeignet. Allerdings ist der lokal unterschiedliche Anstieg der Resistenz von Escherichia coli (15 -‐ 20%) zu berücksichtigen. Fluor-‐Chinolone: Breit wirksame Antibiotika: Achtung: Ältere Chinolone z.B. Ofloxacin oder Ciprofloxacin zeigen lediglich eine gute Wirksamkeit im gramnegativen Bereich (Harnwegsinfektionen), aber eine ausgeprägte Pneumokokken-‐Lücke (Leitkeim bei Atemwegsinfektionen)! Levofloxacin und Moxifloxacin haben eine verbesserte Wirksamkeit im grampositiven Bereich; ebenso bei atypischen Erregern. Bei Patienten mit internistischen Begleiterkrankungen eignet sich besonders vom Spektrum her Levofloxacin (Tavanic®), das zusätzlich auch gut verträglich mit Co-‐ oder Grundmedikation dieser Patienten ist. 20