Kohlenhydrate

Katja Rey, Jan Grolmus, Christian Menzel
08.01.2003
Biochemisches Praktikum
Kurstag: Kohlehydrate
Protokoll
Theorie
Kohlehydrate sind für den Organismus der wichtigste Energielieferant und deshalb ein
unbedingt notwendiger Nahrungsbestandteil.
Alle Kohlehydrate sind Aldehyd- oder Ketonabkömmlinge höherer Alkohole. Man
unterscheidet:
 Monosaccharide (=Einfachzucker)
 Disaccharide (=Zweifachzucker – bestehen aus glycosidisch verknüpften
Monosaccharideinheiten)
 Oligosaccharide (bestehen aus 3-10 glycosidisch verknüpften
Monosaccharideinheiten)
 Polysaccharide = Glycane ( 11 und mehr glycosidisch verknüpfte
Monosaccharideinheiten)
Desweiteren teilt man Kohlehydrate nach folgenden Kriterien ein:



→ Aldehydzucker (Aldosen)
→ Ketonzucker (Ketosen)
Nach der Zahl der C-Atome → Triosen, Tetrosen, Pentosen usw.
Nach Art des Ringschlusses → Fünfring: Furanose
→ Sechsring: Pyranose
Nach der Carbonylgruppe:
Funktion der Kohlehydrate:
1. Brennstoff (Energielieferant)
Die wichtigste Funktion der Kohlehydrate ist die Lieferung von Energie.
Vor allem Erythrozyten und das ZNS sind auf den Energielieferanten Glukose
angewiesen. In der Muskulatur oder in der Leber kann Energie in Form von Glykogen
gespeichert werden (bei Pflanzen als Stärke).
 Stärke ist das Reservekohlenhydrat der Pflanzen.
Es besteht zu 80% aus Amylopektin (α-1-4- und α-1-6-glykosidisch verknüpfte
Glukose; ein sehr großes und stark verzweigtes Molekül) und zu 20% aus
Amylose (ein schraubenförmiges Molekül aus 200-300 α-1-4-glykosidisch
verknüpften Glukosemonomeren)
 Glykogen: Reservekohlenhydrat der Tiere.
Es entspricht in der Struktur einem Amylopektinmolekül, ist jedoch noch
stärker verzweigt
2. Baustein des Binde- und Stützgewebes
Cellulose ist ein Homoglycan und spielt bei den Pflanzen eine wichtige Rolle als
Gerüstsubstanz.
Heteroglycane sind als Bausteine von Glykoproteinen, Proteoglykanen und
Glycosaminoglykanen eine wichtige Rolle.
Glykolyse
In der Glykolyse wird Glukose anaerob unter ATP-Gewinn zu Pyruvat bzw. Lactat abgebaut.
Die Bilanzgleichung der Glykolyse lautet:
Glukose + 2 Pi + 2 ADP → 2 Lactat + 2 ATP
Die ersten 5 Reaktionen der Glykolyse führen zu einer Spaltung des Glukosemoleküls in 2
einander äquivalente Triosephosphate. Alle Zwischenprodukte sind mit Phosphorsäure
verestert.
1. Phosphorylierung von Glukose zu Glukose-6-phosphat.
Der Donor der Phosphatgruppe ist ATP.
Das benötigte Enzym ist die Hexokinase bzw Glukokinase in den
Leberparenchymzellen.
2. Isomerisierung von Glukose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat.
Das benötigte Enzym ist die Glukose-6-phosphat-Isomerase
(Hexosephosphat-Isomerase)
3. Phosphorylierung von Fructose-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat
Donor der Phosphatgruppe ist ATP.
Das verantwortliche Enzym ist die Phosphofructokinase, deren Aktivität für die
Geschwindigkeit der Glycolyse bestimmend ist. Die Aktivität diese Enzyms wird
durch zahlreiche Effektoren inhibiert oder stimuliert.
4. Fructose-1,6-bisphosphat wird durch Aldolase zu Glycerinaldehyd-3-phosphat und
Dihydroxyacetonphosphat gespalten.
5. →die Triosephosphate sind äquivalent, da sie durch die Triosephosphat-Isomerase
ineinander überführt werden.
In der zweiten Phase der Glykolyse werden die Triosephosphate unter ATP-Gewinn zu
Pyruvat / Lactat abgebaut. In der ersten Phase der Glykolyse wird ATP verbraucht.
Die Energiebilanz der Glykolyse ist zuletzt dennoch positiv!
6. Die Aldehydgruppe des Glycerinaldehyd-3-phosphats wird in einer exergonen
Reaktion mit NAD+ durch das Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphatDehydrogenase oxidiert.
Es entsteht 1,3-Bisphosphoglycerat (enthält am C1-Atom eine energiereiche
Säureanhydridbindung und am C3-atom einen energiearme
Phosphorsäureesterbindung)
7. Durch die 3-Phosphoglyceratkinase wird das energiereiche Phosphat des
1,3-Bisphosphoglycerates auf ADP übertragen → es entsteht ATP und
3-Phosphoglycerat.
8. Der Phosphatrest im 3-Phosphoglycerat wird auf die Position 2 verschoben. Es
entsteht 2-Phosphoglycerat. Verantwortliches Enzym ist die
Phosphoglyceratmutase.
9. Aus 2-Phosphoglycerat wird durch die Enolase Wasser abgespalten. Es entsteht
Phosphoenolpyruvat.
2
10. Die Phosphatgruppe im Phosphoenolpyruvat wird auf ADP übertragen, es entsteht
ATP und Pyruvat. Das beteiligte Enzym ist die Pyruvatkinase.
11. Pyruvat wird durch Lactatdehydrogenase mit Hilfe von NADH zu Lactat reduziert.
Die Glykolyse ist der Stoffwechselweg, auf dem am raschesten chemische Energie
bereitgestellt werden kann.
Glukoneogenese
→
Umkehrung der Glykolyse unter erheblichem Energieaufwand.
3 irreversible Reaktionen der Glykolyse müssen umgangen werden.
Sie dient bei Kohlenhydratmangel der Versorgung der Zellen, die zwingend auf
Glukose angewiesen sind.
Irreversible Reaktionen der Glykolyse:
1. Phosphoenolpyruvat → Pyruvat (Pyruvatkinase)
2. Fruktose-6-phosphat → Fruktose-1,6-bisphosphat (Phosphofruktokinase)
3. Glukose
→ Glukose-6-phosphat (Hexokinase / Glukokinase)
Die Reaktionen der Phosphofruktokinase und der Hexokinase sind mit Hilfe spezifischer
Enzyme reversibel.

Fruktose-1,6-bisphosphat kann durch Fruktose-1,6-bisphosphatase zu
Fruktose-6-Phosphat umgewandelt werden. Das Enzym kommt in Leber, Niere und
Muskel vor.

Glukose-6-phosphat kann mit Hilfe von Glukose-6-Phosphatase zu Glukose
umgewandelt werden.
Beide Enzyme werden von Insulin gehemmt, so dass der Körper bei ausreichender
Kohlenhydratzufuhr die Glukoneogenese fast vollständig einstellt!

Die Reaktion Phosphoenolpyruvat → Pyruvat ist stark exergon und somit
irreversibel.
Pyruvat kann in den Mitochondrien zu Oxalacetat umgesetzt werden.
Das Enzym ist die Pyruvat-Carboxylase (benötigt Biotin als Coenzym).
Pyruvat + ATP + CO2 → Oxalacetat + ADP + P

Das Oxalacetat wird unter Aufspaltung von GTP zu Phosphoenolpyruvat umgesetzt.
As entsprechende Enzym ist die Phosphoenolpyruvatcarboxykinase.
Oxalacetat + GTP ↔Phosphoenolpyruvat + GDP + CO2
Der Pentosephosphatweg
Im Pentosephosphatweg wird Glukose unter Bildung von NADPH zu Pentosen abgebaut.
Reaktionsschritte des Pentosephosphatweges:
1.
Glukose-6-Phosphat wird unter Bildung von NADPH zu
6-Phosphoglukonolacton dehydriert.
Das Enzym ist die Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (Coenzym NADP+)
2.
6-Phosphoglukonolacton wird zu 6-Phosphoglukonat hydrolysiert.
Das Enzym ist die Glukonolactonhydrolase.
3
3.
In einer weiteren NADP+-abhängigen Oxidation wird das 6-PhosphoGlukonat
am C-Atom 3 oxidiert. Dies führt zur Labilisierung der COO- Gruppe, die als
CO2 abgespalten wird.
Das Reaktionsprodukt ist Ribulose-5-phosphat.
Das verantwortliche Enzym ist 6-PhosphoGlukonat-Dehydrogenase
Durch eine Isomerase kann Ribulose-5-phospat in Ribose-5-phosphat
umgewandelt werden.
4.
Durch diese Reaktionsfolge entsteht aus Glukose-6-Phosphat die Pentose
Ribose-5-phosphat, Co2 und 2 NADPH.
Ribose-5-phosphat ist ein Substrat der Nukleotidbiosynthese, NADPH wird z.B. bei
Fettsäure- und Cholesterinsynthese benötigt.
Die zweite Phase des Pentosephosphatweges dient dem unter Umständen notwendigen
Abbau der durch die beiden ersten Reaktionen des Pentosephosphatweges gebildeten
Pentosephosphate:

Ribulose-5-phosphat wird durch Epimerisierung (Enzym = Epimerase) in
Xylulose-5-phosphat bzw. durch Isomerisierung (Enzym= Ketoisomerase) in
Ribose-5-phosphat umgewandelt.
 Durch Transketolase werden die C-Atome 1 und 2 des Xylulose-5-phosphats
auf Ribose-5-phosphat übertragen.
Dabei entsteht 3-Phosphoglycerinaldehyd und Sedoheptulose-7-phosphat.
 Durch Transaldolase werden die 3 ersten C-Atome des
Sedoheptulose-7-phosphats auf 3-Phosphoglycerinaldehyd übertragen. Es
entsteht Fructose-6-phosphat und die aus 4 C-Atomen bestehende Aldose
Erythrose-4-phosphat.
 Aus einem weiteren Molekül Xylulose-5-phosphat wird wieder durch
Transketolase ein C2-Bruchstück auf Erythrose-4-phosphat übertragen.
Dabei entstehen Glycerinaldehyd-3-phosphat und Fruktose-6-phosphat.
Die Endprodukte des Pentosephosphatweges sind Fruktose-6-Phosphat und
Glycerinaldehyd-3-phospat. Da es sich hierbei um Zwischenprodukte der Glykolyse handelt
können daraus entweder Pyruvat oder der Ausgangsstoff Glukose gebildet werden.
Energieinhalte biochemischer Reaktionen
ΔH (Reaktionsenthalpie) = abgegebene oder verbrauchte Reaktionswärme bei konstantem
Druck und konstanter Temperatur.
→ ist ΔH positiv, ist die Reaktion endotherm.
→ ist ΔH negativ, ist die Reaktion exotherm.
(S) = Entropie ist ein Maß für den Ordnungszustand eines Systems.
ΔG ist ein Maß für die Neigung einer Reaktion, spontan abzulaufen.
Es gilt:
ΔG = ΔH – TΔS
→ ist ΔG negativ, verläuft die Reaktion spontan. Sie ist exergon.
→ ist ΔG positiv, verläuft die Reaktion nicht spontan. Sie ist endergon.
Substratkettenphosphorylierung
→
Es entsteht eine energiereiche Verbindung durch Fixierung von anorganischem
Phosphat.
4
Durch Abspalten dieses Phosphatrestes kann aus ADP ATP aufgebaut werden.
Bsp.: Oxidation des Glycerinaldehyd-3-phosphats zum 1,3-Bisphosphoglycerat.
→
Das Substrat Glycerin-3-phosphat wird als Thiohalbacetal an die SH-Seitenkette des
Enzyms (Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase) gebunden.
Das Thiohalbacetal wird zum Thioester, wobei NAD+ zu NADH+H+ reduziert wird.
→
Anschließend erfolgt die phosphorylytische Abspaltung des Enzyms vom Substrat.
Es entsteht 1,3-Bisphosphoglycerat, das eine energiereiche Säureanhydridbindung
enthält und einen Phosphorsäurerest an ADP abgeben und somit ATP bilden kann.
Durchführung
1. Glycolyse und Substratketten-Phosphorylierung
Mit einem Enzymgemsich aus Aldolase und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GADPH) wird
Fructose 1,6 Bisphosphat in Glycerinaldehyd 3-phosphat und Dihydoryacetonphosphat
(DHAP) gespalten. Das Glycerinaldehyd 3-phosphat wird anschließend mit GAPDH, NAD
und Phosphat (in drei Portionen) zu 1,3 Bisphosphoglcerat umgesetz. Nach Zugabe des
Phospahts wird die Gleichgewichtseinstellung abgewartet und die entsprechenende NADHKonzentration mittels Photometer bestimmt. Nach der dritten Gleichgewichtseinstellung wird
eine Triosephosphatisomerase hinzugegeben, die das Gleichgewicht zwischen
Glycerinaldehyd 3-phosphat und Dihydoryacetonphosphat einstellen soll.
Durchführung
Eine 1M Kaliumphospahtlösung muss zunächst dreimal verdünnt werden auf:
 0,05M Kaliumphospahtlösung
 0,25M Kaliumphospahtlösung
 0,5M Kaliumphospahtlösung
In eine Halbmikroküvette wir pipettiert und anschließend gut durchgemischt:
 100 μl Fructose 1,6 Bisphosphatlösung (100mM)
 100 μl TRIS/HCL-Puffer (1M, pH=8,2)
 1600 μl Wasser
 100 μl NAD-Lösung (25mM)
 Bestimmung von E0 im Photometer bei λ=340nm
 Zugabe von 20 μl Enzymgemisch (Aldolase +GAPDH) und erneutes mischen
 Ablesen der Extinktion alle 30sek bei λ=340nm
 Zugabe von 20 μl 0,05M Phospahtlösung und erneutes mischen
 Ablesen der Extinktion alle 30sek bei λ=340nm
 Zugabe von 20 μl 0,25M Phospahtlösung und erneutes mischen
 Ablesen der Extinktion alle 30sek bei λ=340nm
 Zugabe von 20 μl 0,5M Phospahtlösung und erneutes mischen
 Ablesen der Extinktion alle 30sek bei λ=340nm
 Zugabe von 20 μl Triosephosphatisomerase
 Ablesen der Extinktion alle 30sek
Auswertung
Berechnung der NADH-Konzentrationen:
5
1.: Nach Zugabe von 20µl 0,05 M Phosphatlösung: Extinktion E=0,227
2.: Nach Zugabe von 20µl 0,25 M Phosphatlösung: Extinktion E=0,313
3.: Nach Zugabe von 20µl 0,5 M Phosphatlösung: Extinktion E=0,490
4.: Nach Zugabe von 20µl TIM-Lösung: Extinktion E=0,558
E = * c * d => c = E / * 1
 = 6,22 mM-1 cm-1 =>
1.: c = 0,227 / 6,22 mM = 0,0365 mM NADH
2.: c = 0,313 / 6,22 mM = 0,0503 mM NADH
3.: c = 0,490 / 6,22 mM = 0,0788 mM NADH
4.: c = 0,558 / 6,22 mM = 0,0897 mM NADH
Extinktionsverlauf
0,800
0,700
Extinktion
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Zeit
Durch die unterschiedlichen Verdünnungen ergeben sich folgende Konzentrationen der
Reaktionspartner:
1. + 20µl
0,05 M
PPL
2. + 20µl
0,25 M
PPL
3. + 20µl
0,50 M
PPL
4. + 20µl
TIM
Gesamt- Fructose-1,6menge
bisphosphat
1940µl =100µl/1940µl
*100mM
=5,15mM
1960µl =100µl/1960µl
*100mM
=5,10mM
1980µl =100µl/1980µl
*100mM
=5,05mM
2000µl =100µl/1940µl
*100mM
=5,00mM
NAD-Lösung
Pi
GAP (berechnet)
=100µl/1940µl*25mM
=1,29mM
=20µl/1940µl*50mM
=0,52mM
16,504813µM
=100µl/1960µl*25mM
=1,28mM
=40µl/1960µl*150mM
=3,06mM
16,420389µM
=100µl/1980µl*25mM
=1,26mM
=60µl/1980µl*267mM
=8,08mM
16,337247µM
=100µl/2000µl*25mM
=1,25mM
=60µl/2000µl*267mM
=8,00mM
16,255356µM
Die GAP-Konzentrationen berechnet sich folgendermaßen:
6
G 0 '   R  T  ln( K AldolaseRe aktion )
G 0 '  23,99kJ / mol
R  8,314 J / mol * K
T  293K 
K AldolaseRe aktion  e 9,85  5,28  10 5
K AldolaseRe aktion 
[ DHAP ][GAP]
[GAP]2
=>

[ Fructose  1,6  bisphospha t ] [ Fructose  1,6  bisphospha t ]
[GAP]  K AldolaseRe aktion  [ Fructose  1,6  bisphospha t ]
[GAP]  5,28 10 5  [ Fructose  1,6  bisphospha t ]
Die Gleichgewichtskonstante K berechnet sich nach folgender Formel:
K GAPDH 
[1,3  BPG ][ NADH ][ H  ]
[ NADH ]2 [ H  ]

[GAP][ Pi ][ NAD  ]
[GAP][ Pi ][ NAD  ]
Daraus ergeben sich folgende K-Werte:
1.: 7,60*10^-7
2.: 2,49*10^-7
3.: 2,35*10^-7
Mittelwert: 4,15*10^-7
Daraus lässt sich die Gleichgewichtskonstante bei Standardbedingungen berechnen:
K 'GAPDH  K GAPDH 10 7  4,15
Daraus wird die freie Enthalpie für diese Reaktion berechnet:
G 0   RT ln( K 'GAPDH )  -3464,52J/mol
Nach Zugabe von 20µl TIM wird ein Absinken der Extinktion beobachtet, d.h. die
Konzentration an NADH und GAP geringer ist. Dies beweist, dass normalerweise mehr GAP
als Dihydroxacetonphosphat gebildet wird, also das Gleichgewicht auf der Seite des DHAP
liegt.
7
1.2 Entkopplung und Vergiftung der Substratkettenphosphorylierung
a. Entkopplung mit Arsenat
Die Durchführung entspricht der aus Versuch 1, aber statt dreimaliger Zugabe von Phosphat
erfolgt die einmalige Zugabe von Natriumarsenatlösung. Aufgrund der spontanen Hydrolyse
des gemischten Anhydrids und der Carbonsäure gilt die Reaktionsgleichung:
Glycerinaldehydphosohat +NAD
→ 3-Phosphoglycerat + NADH+H+
Durchführung




100 μl Fructose 1,6 Bisphosphatlösung (100mM)
100 μl TRIS/HCL-Puffer (1M, pH=8,2)
1600 μl Wasser
100 μl NAD-Lösung (25mM)




Zugabe von 20 μl Enzymlösung (Aldolase +GAPDH)
Messung der Extrion E1 bei λ=340nm
Zugabe von 20 μl 0,05m Arsenatlösung
Messung der Extinktion alle 10sek bei λ=340nm
b. Vergiftung mit Hydroxymercuribenzoat
Durch die Zugbae von 4 Hydroxymercuribenzoatlösung wird die GAPDH inaktiviert.
Auch nach Zugabe von Arsenat soll/kann die Reaktion nicht mehr statt finden. Die Vergiftung
des Enzyms wird mit Dithiothreitol (DTT) aufeghoben, imdem das 4 Hydroxymercuribenzoat
aus dem aktiven Zentrum verdrängt wird.
Durchführung











100 μl TRIS/HCL-Puffer (1M, pH=8,2)
1600 μl Wasser
20 μl 4 Hydroxymercuribenzoatlösung (1mM)
Zugabe von 20 μl Aldolase/GAPDH-Lösung und mischen
Zugabe von 100 μl Fructose 1,6 Bisphospahtlösung
Zugabe von 100 μl NAD-Lösung und erneutes mischen
Messung der Extinktion E1 bei λ=340nm
Zugabe von 20 μl 0,05M Arsenatlösung und erneutes mischen
Messen der Extinktion alle 30sek bei λ=340nm (ca.3min)
Zugabe von 20 μl DTT-Lösung
Messen der Extinktion alle 10sek bei λ=340nm (ca.2min)
c. Vergiftung mit Jodacetamid
Durch Zugabe von Jodacetamid soll das aktive Zentrum des GAPDH alkylieren. Durch die
Zugabe von Natriumarsenatlösung soll lediglich die Restaktivität des Enzyms getestet
8
werden. Durch die Zugabe von DTT soll das auch hier das aktive Zentrum wieder frei gesetzt
werden.
Durchführung










100 μl TRIS/HCL-Puffer (1M, pH=8,2)
1600 μl Wasser
20 μl Jodacetamidlösung (20mm in 50% Acetonitril)
Zugabe von 20 μl Aldolase/GAPDH-Lösung und mischen
Messen der Extinktion E1 bei λ=340nm
Inkubation des Ansatzes für 5min
Zugabe von 100 μl Fructose 1,6 Bisphosphatlösung
Zugabe von 100 μl NAD-Lösung und erneutes mischen
Starten der Reaktion durch Zugabe von 20 μl 0,05M Arsenatlösung
Messung der Extinktion bei λ=340nm für 3min (alle 30sek)
d. Vergiftung mit Jodacetamid und Schutz durch
Glycerinaldehydphosphat
Durchführung








100 μl Fructose 1,6 Bisphosphatlösung (100mM)
100 μl TRIS/HCL-Puffer (1M, pH=8,2)
1600 μl Wasser
100 μl NAD-Lösung (25mM)
Zugabe von 20 μl Enzymlösung (Aldolase +GAPDH) und mischen
Messen der Extinktion E1 bei λ=340nm
Starten der Reaktion durch Zugabe von 20 μl 0,05M Arsenatlösung und mischen
Messung der Extinktion bei λ=340nm für 2min (alle 10sek)
e. Vergiftung mit Jodacetamid und Schutz durch NAD
Durchführung










100 μl TRIS/HCL-Puffer (1M, pH=8,2)
1600 μl Wasser
100 μl NAD-Lösung (25mM) und mischen
Zugabe von 20 μl Enzymlösung (Aldolase +GAPDH) und erneutes mischen
Messen der Extinktion E1 bei λ=340nm
Zugabe von 20μl jodacetamidlösung und erneutes mischen
Inkubation des Ansatzes für 5min
Zugabe von 100 μl Fructose 1,6 Bisphosphatlösung (mischen)
Zugabe von 20 μl 0,05M Arsenatlösung
Messung der Extinktion bei λ=340nm für 2min (alle 10sek)
9
Auswertung
Entkopplung mit Arsenat
Zeit [s]
Extinktion
0 10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120
0,208 0,62 0,771 0,89 0,97 1,049 1,125 1,208 1,286 1,356 1,415 1,47 1,53
Extinktionskurve für die Entkopplung
mit Arsenat ohne Inhibitoren
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Entkopplung mit Arsenat
Vergleichskurve nach
Phosphorzugabe
0
20
40
60
80
100
120
140
Der Kurvenverlauf bei der mit Arsenat entkoppelten Reaktion sollte weitgehend mit der
ursprünglichen Kurve vergleichbar sein, da die Entkopplung die Reduzierung des NAD zu
NADH nicht beeinflusst und sich somit die Extinktion gleichermaßen entwickeln müsste.
Vergiftung mit Hydroxymercuribenzoat
E1
Zeit [s]
Extinktion
0,181
0
30
60
90 120
150
180
0,224 0,514 0,662 0,783 0,89 0,994 1,078
Nach Zugabe von 20µl DTT
Zeit [s]
Extinktion
0
10
20
30 40
50
60
70
80
90
0,197 1,286 1,311 1,359 1,41 1,456 1,499 1,541 1,581 1,612
10
Extinktion
Vergiftung mit Hydroxymercuribenzoat
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Arsenatlösung+Que
cksilber
Zusatz von DTT
Arsenatlösung
0
100
200
300
Zeit
Das Hydroxymercuribenzoat bindet an SH-Gruppen des GAPDH und inaktiviert so das
Enzym. Da nicht alle GAPDH-Moleküle inaktiviert sind, findet die Reaktion dennoch zu
einem kleinen Teil statt, zeigt aber ein Grenzwertverhalten zwischen 1 und 1,5 Einheiten
Extinktion. Nach Zugabe von DTT mit vielen SH-Gruppen wird ein großer Teil des GAPDH
wieder reaktiviert, wodurch es zu einem linearen Verlauf der Extinktionskurve, d.h. zu einer
ungehindert ablaufenden Reaktion kommt.
Vergiftung mit Jodacetamid
E1
Zeit [s]
Extinktion
0,127
0
30
60
90
120
150
180
0,218 0,213 0,214 0,216 0,218 0,219 0,221
Nach Zugabe von DTT
Zeit [s]
Extinktion
0
30
60
90
120
150
180
0,233 0,256 0,285 0,312 0,342 0,368 0,389
11
Vergiftung mit Jodacetamit
1,8
1,6
1,4
Extinktion
1,2
Arsenatlösung+J
odacetamit
1
Zusatz von DTT
0,8
Arsenatlösung
0,6
0,4
0,2
0
0
200
400
Zeit
Bei der Vergiftung mit Jodacetamid kommt es wie im vorhergehenden Versuch zu einer
Inaktivierung des GAPDH und damit nur zu einer sehr geringen Bildung von NADH.
Allerdings ist die Vergiftung irreversibel, so dass auch die Zugabe von DTT den
Kurvenverlauf nicht signifikant verändern kann. Insgesamt ist die Extinktion bei diesem
Versuchsteil und damit auch die Reaktionsgeschwindigkeit sehr viel geringer.
Vergiftung mit Jodacetamid und Schutz durch GAP
Zeit [s]
Extinktion
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110 120
0,269 0,311 0,349 0,365 0,385 0,41 0,436 0,457 0,489 0,51 0,543 0,566 0,58
Vergiftung m it Jodacetam id und Schutz
durch Glycerinaldehydphophat
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
Zeit [s]
12
150
In diesem Versuchsteil wird das Toxikon erst zugegeben, nach dem bereits ein Teil der
Reaktion abgelaufen ist. Dadurch kommt es zu einer Konkurrenz zwischen Toxikon und
Substrat, so dass immer ein gewisser Teil der Enzymmenge mit dem Substrat gebunden und
so vor einer Vergiftung geschützt ist.
Vergiftung mit Jodacetamid und Schutz durch NAD
Zeit [s]
Extinktion
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0,2 0,203 0,222 0,243 0,255 0,264 0,275 0,29 0,305 0,318 0,333 0,339 0,348
Vergiftung m it Jodacetam id und Schutz
durch NAD
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
Zeit [s]
Auch hier gilt wieder wie beim Schutz durch GAP, dass durch die Konkurrenz von Substrat
und Toxikon ein Teil des Enzyms nicht durch das Jodacetamid inaktiviert werden kann. Da
die Extinktion im Diagramm des GAP durchweg höher ist als im Diagramm des NAD kann
davon ausgegangen werden, dass NAD als „Schutz-Substrat“ wirkungsvoller ist.
2.Glukosebestimmung im Blut
Die BlutGlukosekonzentration wird von vielen Prozessen im Körper beeinflusst und
sollte bei einem Gesunden aber dennoch zwischen 80-120mg/dl liegen (4-6mmol/l Blut). Die
Hömöostase der BlutGlukose wird über Hormone geregelt und führt dazu, dass sowohl zu
hohe (Hyperglykämie) als auch niedrige Konzentration (Hypoglcämien) schnell abgefangen
werden. Daher spielt die Bestimmung der BlutGlukosekonzentration in der Medizin eine
große Rolle, weil damit Störungen des Kohlenhydratstoffwechsel bzw. Störungen in dessen
Regelung erkannt werden können (Diabetes mellitus).
Durchführung
Bestimmung der der Glukosekonzentration im Serum mit Hilfe von Teststäbchen

Bestimmung der Glukosekonzentration mit dem in der Klinik und von Diabetikern
genutzten BlutGlukose-Meßgerät Accutrend Sensor Comfort.
BlutGlukose vor dem Mittagessen: 76mg/dl
BlutGlukose nach dem Mittagessen: 113mg/dl
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Bestimmung der Glukose im gekoppelten optischen Test
Die Serumprobe wird durch Perchlorsäure enteiweißt und das ausgefallene Protein
abzentrifugiert. Die Glukose wird enzymatisch zu Glukonat-6-P hydolysiert, wobei eine
äquivalente Menge an NADPH entsteht, das photometrisch bestimmt werden kann.
Die Blutentnahme erfolgt auch hier einmal vor dem Mittagessen und einmal nach dem
Mittagessen mittels einer Kapillare (kann 20µl aufnehmen):
 Mischen von 20 μl Blut mit 200µl Perchlorsäure
 Zentrifugation der Proben für 3min (die Überstände ergeben die Probelösungen für die
folgenden Ansätze)
 Pipettieren der Ansätze nach Praktikumsanleitung
 Messen der Extinktion E1 bei λ=340nm
 Messung der Extinktion E2 bei λ=340nm alle 2min
Auswertung:
Ergebnisse der Messungen:
Leerwert Vor Essen Nach Essen Standard
Küvette 1
Küvette 2
Küvette 3
Küvette 4
E1
0,166
0,179
0,217
0,945
0 min
0,224
0,250
0,987
2 min
0,250
0,300
1,100
4 min
0,280
0,330
1,300
6 min
0,300
0,360
1,500
E2
0,160
0,310
0,371
1,698
E
-0,006
0,131
0,154
0,753
C [mM]
4,5895
5,36
25,4265
C [mg%]
82,611
96,48
457,677
0,400
1,800
0,350
1,600
0,300
1,400
0,250
0,200
0,150
1,200
Küvette 1
1,000
Küvette 2
0,800
Küvette 3
0,600
Küvette 4
0,100
0,400
0,050
0,200
0,000
0,000
E1
0 min 2 min 4 min 6 min
E2
Die Formel für die Glukose im Blut lautet: CBlut = (EProbe – ELeerwert) * 33,5 mM
Die Umberechnung in mg% erfolgt durch Multiplikation mit dem MGGlukose = 180g/mol.
Das optische Verfahren zur Messung ist sehr leicht verfälschbar durch Verschmutzungen,
Dosierungsungenauigkeiten etc. So ist auch in diesem Fall der Standardwert deutlich zu hoch
und als Artefakt-behaftet zu bewerten.
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